ケラチノサイトによるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用
ケラチノサイト（ＫＣ）からのインターロイキン１８（ＩＬ−１８）の産生の誘導現象を利用して、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な各種方法とその利用方法とを提供する。例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）をマウス等の皮膚に塗布したり、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片をマウス等に移植したりすることで、ＡＤ様の病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を再現することができる。これにより、例えば、ＫＣによるＩＬ−１８産生誘導の阻害剤をスクリーニングすることが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用に関するものであり、特に、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能なスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
皮膚は体のなかで最も大きな器官であり、生体防御の最前線である。表皮はケラチノサイト（ＫＣ、角化細胞）、メラニン細胞、表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）および上皮内Ｔ細胞等からなる。
ＬＣは未成熟な樹状細胞（ＤＣ）であり、その機能は局部的に暴露されたタンパク質抗原を捕獲して、獲得的免疫反応が一般的に行われる領域リンパ節に運搬することである。リンパ節への移動の間に、ＬＣは抗原提示能を有する成熟ＤＣに変化する。その結果、ＬＣ／ＤＣが運ぶ抗原に対して特異的な全身性免疫応答が引き起こされる。このように、皮膚の抗原特異的な免疫応答は、同じ抗原に対する全身性免疫応答と密接に関連する。したがって、皮膚と免疫臓器は、ＬＣ／ＤＣの循環と抗原特異的な免疫細胞を通して相互に密接に関連していると考えられる。これに対して、ＫＣとメラニン細胞は皮膚に定住し、基本的には獲得免疫応答にあずからない。
しかしながら、ＫＣは皮膚局所における自然免疫応答と炎症の誘導に寄与する可能性が示唆される。微生物が皮膚に感染すると、ホストは炎症反応、ついで獲得免疫反応を皮膚限局性に展開する。その際、皮膚を構成するＫＣおよびＬＣが、それぞれの応答に深く関与すると考えられる。したがって、微生物や化学試薬による刺激に対してさまざまなサイトカインを産生するというユニークな性質に基づき、ＫＣはＬＣに影響を与え、その結果獲得免疫応答を変化させる可能性が考えられる（非特許文献１・２参照）。これらの事実を踏まえると、ＫＣが引き起こした皮膚の炎症が全身性免疫反応にも影響するかを決定することは重要である。
本発明者は、以前に、ＫＣ特異的にｃａｓｐａｓｅ−１を発現し、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β）に依存する方法でアトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）様の皮膚炎症（掻痒性慢性炎）を発症する、ｃａｓｐａｓｅ−１−トランスジェニックマウス（ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス）を確立している（非特許文献３・４参照）。また、本発明者は、ＩＬ−１βが、ＩＬ−１８のＡＤ様の皮膚炎症を誘導する能力を増強させることも示している（非特許文献４参照）。これらの結果から、ＫＣはＩＬ−１８およびＩＬ−１βを含めた多くのサイトカインの産生により全身性免疫応答にも寄与する可能性があることが示唆される。
ところで、上記ＩＬ−１８およびＩＬ−１βは、生物学的に不活性な前駆体として産生され、ｃａｓｐａｓｅ−１のような適切な細胞内酵素により切断された後活性型として放出される（非特許文献５〜９参照）。
上記ＩＬ−１８は共存するサイトカインの種類に応じて、多様な生理活性を示す。特に、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の存在下で、ＩＬ−１８は強い炎症誘導性のサイトカインであるＩＦＮ−γを誘導し、その結果炎症反応を促進する（非特許文献１０）。これとは対照的に、ＩＬ−１２が存在しない場合、ＩＬ−１８は、Ｔｈ２サイトカインの産生の誘導を通してアトピー応答を誘導する（非特許文献１１〜１４参照）。
上記ＡＤは、外的刺激に対する炎症性皮膚病変で、慢性反復性の強い掻痒を伴う疾患である。発症には、遺伝的背景があり、患者はその血清中に高いレベルのＩｇＥを有するが、その発症機序については不明な点が多い。ＡＤ発症のメカニズムについては、活性化Ｔ細胞、好塩基球、肥満細胞が深く関与する。
特に、アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化の結果、Ｔｈ２サイトカインとケミカルメディエーターの産生が起こり、その結果、ＡＤが発症すると考えられている。上記アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化は、これら細胞上のＦｃεＲ（好塩基球のＩｇＥ抗体に対するＦｃ受容体（ＦｃＲ））に結合したＩｇＥ分子の架橋による。上記Ｔｈ２サイトカインとして重要なものは、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）等が挙げられる。ケミカルメディエーターとして重要なものとしては、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトルエン等が挙げられる。
ところで、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の感染が、状況によってはＡＤ患者の皮膚の炎症変化を悪化させること（非特許文献１５・１６参照）、さらには、一部のＡＤ患者では血清ＩＬ−１８濃度が上昇する（非特許文献１７参照）ことが知られている。すなわち、黄色ブドウ球菌の感染が、ＡＤの誘引あるいは増悪因子であることはこれまで知られている。しかしながら、ＡＤの発症に黄色ブドウ球菌がどのように関与するのかについては不明な点が多い。
【非特許文献１】 Ｊａｍｏｒａ，Ｃ．ａｎｄ Ｆｕｃｈｓ，Ｅ．２００２．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：Ｅ１０１．
【非特許文献２】 Ｇｒｏｎｅ，Ａ．２００２．Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｏ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８８：１．
【非特許文献３】 Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｕｐｐｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ａｓａｈｉ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．，Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｓｋｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｓｐａｓｅ−１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｈｏｗ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｓｈｏｃｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＩＬ−１８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：９９７．
【非特許文献４】 Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｙｕｍｉｋｕｒａ−Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ，Ｓ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｉｗａｋｕｒａ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｈ．２００２．ＩＬ−１８ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＩｇＥ／ｓｔａｔ６ ｕｎｄｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１１３４０．
【非特許文献５】 Ｇｕ，Ｙ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｕ，Ｇ．，Ｈｓｉａｏ，Ｋ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：２０６．
【非特許文献６】 Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ．Ｋ．，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈａｄａ，Ｔ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｃａｓｐａｓｅ−１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｆａｓ／Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＩＬ−１８ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｃａｕｓｅｓ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：３５９．
【非特許文献７】 Ｓｅｋｉ，Ｅ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｔｓｕｊｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ，Ｓ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．２００１．ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＬ−１８ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＭｙＤ８８ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１２ ａｎｄ ＩＬ−１β．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３８６３．
【非特許文献８】 Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．１９９８．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５６：１．
【非特許文献９】 Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．１９９９．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ｔｗｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ＩＣＥ（ｃａｓｐａｓｅ−１）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１．
【非特許文献１０】 Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｙｕｔｓｕｄｏ，Ｍ．，Ｈａｋｕｒａ，Ａ．，Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｏｒｉｇｏｅ，Ｋ．，Ｏｋｕｒａ，Ｔ．，Ｎｕｋａｄａ，Ｙ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋ．，Ａｋｉｔａ，Ｈ．，Ｎａｍｂａ，Ｍ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｆ．，Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，Ｍ．１９９５ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＮＦ−γ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８８．
【非特許文献１１】 Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｋ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．１９９９．ＩＬ−１８，ａｌｔｈｏｕｇｈ ａｎｔｉ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｗｈｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＩＬ−４ ａｎｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１３９６２．
【非特許文献１４】 Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，２００１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｏｔｈ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：４２３．
【非特許文献１５】 Ｔｈｅｓｔｒｕｐ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．２０００．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２５：５３５．
【非特許文献１６】 Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｋｒａｆｔ，Ｓ．，Ｏｐｐｅｌ，Ｔ．ａｎｄ Ｂｉｅｂｅｒ，Ｔ．２０００．Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：ｐａｔｈｏｇｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｍａｔｏｌ．２５：５３０．
【非特許文献１７】 Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｋｏｔａｎｉ，Ｍ．，Ｍａｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｈｉｇａ，Ｓ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｆｒｏｍ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ，ＮＣ／Ｎｇａ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２３６．
現状では、ＡＤの発症機構については不明な点が多く、それゆえ、ＡＤの有効な治療薬剤の開発には、多くの困難が伴っている。
上記のように、表皮を構成する各種細胞が、様々な免疫応答に関与することが知られており、例えば、近年、樹状細胞が抗原提示細胞として獲得免疫応答を誘導することが報告されている。しかしながら、表皮を構成する最も主たる細胞であるＫＣについては、ホストの免疫応答にどのように関与するかについては明らかになっていない。
任意の疾患について有効な治療薬剤を開発する場合、その発症機構を解明し、それを利用して薬理作用のある物質をスクリーニングすることは重要な手法の一つである。しかしがなら、ＡＤの発症においては、ＫＣの関与や黄色ブドウ球菌の感染も含めて不明な点が多く、それゆえ、スクリーニングも含めたＡＤの治療薬剤の開発にこれらを応用する技術については、これまでほとんど知られていなかった。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであって、その目的は、ＫＣからのＩＬ−１８の産生の誘導現象を利用して、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な各種方法とその利用方法とを提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡがＫＣを刺激してＩＬ−１８の産生を誘導することを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の系で実証し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記の課題を解決するために、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて、刺激剤による刺激でケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含むことを特徴としている。
上記スクリーニング方法においては、上記刺激剤として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることが好ましい。さらに、上記刺激剤として、プロテインＡに加えてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を併用することがより好ましい。
また、上記スクリーニング方法において、上記環境形成工程がインビトロにて実施される場合、ケラチノサイトの培養細胞の培養液に上記プロテインＡを添加して培養することにより、上記環境の形成を実現してもよいし、上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記プロテインＡをホストとなる生物の皮膚に塗布することで、上記環境の形成を実現してもよい。
さらに、上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤として、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、当該皮膚片をホストとなる生物に移植することで、上記環境の形成を実現してもよい。
ここで、上記ホストとなる生物は、少なくとも、ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現、ｓｔａｔ６の発現、およびＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現という各形質を何れも具備していることが好ましい。上記ホストとなる生物は、例えばマウスが好ましく用いられる。
また、本発明には、上記クリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む免疫疾患治療薬剤が含まれる。さらに、本発明には、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を抑制する方法であって、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、上記免疫疾患治療薬剤を用いて、ケラチノサイトから産生されたインターロイキン１８の局所的な集積によっておこる、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制する方法も含まれる。
本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法は、モデル生物に、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法であって、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布することを特徴としている。
上記誘導方法においては、上記プロテインＡとして、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかを用いることができる。さらに、上記プロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布するときには、ＳＤＳを併用することが好ましい。
また、本発明には、上記誘導方法により得られる、炎症性皮膚病変を発症したモデル生物が含まれ、このモデル生物の一例としてマウスを挙げることができる。
本発明の利用方法としては、例えば、上記スクリーニング方法を行うためのスクリーニングキットや、上記誘導方法を行うためのアトピー性皮膚炎様症状の誘導キットを挙げることができる。
上記各方法によれば、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）様の炎症性皮膚病変において、ケラチノサイトから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こすことを利用している。それゆえ、上記各方法は、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能となる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植することによる、ホストでのＩｇＥ誘導の結果をコントロールの結果とともに示す図である。
図２のＡ〜Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＩＬ−１８の集積を、コントロールの結果とともに示す図である。
図３のＡ〜Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の集積を、コントロールの結果とともに示す図である。
図４は、病変皮膚を移植されたホストにおいてＴｈ２細胞の選択的な分化が欠失することを、コントロールの結果とともに示す図である。
図５のＡおよびＢは、ＩｇＥ誘導のためのホストＣＤ４＋Ｔ細胞、ホストｓｔａｔ６およびホストＩＬ−１８応答性、並びにＴｈ１／Ｔｈ２細胞の発生の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図６のＡ〜Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＡ処理によるＩＬ−１８およびＩｇＥの誘導の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図７のＡ〜Ｄは、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣから、ＩＬ−１２ではなくＩＬ−１８のみが放出される結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図８のＡ〜Ｄは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図９のＡ〜Ｄは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚の経時変化を顕微鏡で観察した結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明者らは、ケラチノサイトから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こし、これがアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変につながることを見出した。本発明では、上記知見を利用して、特に、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用方法を実現した。以下、本発明について具体的に説明する。
（１）本発明にかかるスクリーニング方法
本発明にかかるスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて、刺激剤による刺激でケラチノサイト（ＫＣ）からの局所的なＩＬ−１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ＫＣによるインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含んでいる。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）様の炎症性皮膚病変では、皮膚のＫＣからＩＬ−１８が局所的に過剰に産生され、これにより血清中において高レベルのＩｇＥの発現が見られる場合もある。そこで、上記環境形成工程および阻害剤同定工程を含むスクリーニング方法を用いることにより、ＩＬ−１８の分泌を阻害する物質を得ることが可能になる。得られた物質（阻害剤）は、ＡＤの有効な治療薬剤となり得る。
なお、本発明でいうところのＡＤ様の炎症性皮膚病変とは、ＩＬ−１８依存的に発症する免疫疾患で、皮膚に炎症が現れる症状を広く指すものとし、厳密にＡＤと認識される掻痒性慢性炎のみを指すものではない。
また、本発明における「ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ）」とは、培養細胞により人工的に再現される反応系を指すものとし、「ｉｎ ｖｉｖｏ（インビボ）」とは、完全な個体における反応系を指すものとする。
さらに、本発明でいうところの「阻害剤」は、ＫＣからのＩＬ−１８の分泌を阻害する物質であればよく、その阻害の具体的なメカニズムは特に限定されるものではない。したがって、本発明にかかるスクリーニング方法で得られる阻害剤は、上記ＫＣからのＩＬ−１８の分泌の過程を可逆的に阻害するものであってもよいし、不可逆的に阻害するものであってもよい。また、可逆的に阻害する阻害剤の場合、競合型（拮抗型）の阻害剤（拮抗剤）であってもよいし、非競合型の阻害剤であってもよい。換言すれば、本発明にかかるスクリーニング方法では、拮抗剤を含む等の様々な種類の阻害剤をスクリーニングすることができる。
＜環境形成工程＞
上記環境形成工程は、刺激剤による刺激でＫＣからのＩＬ−１８の産生を誘導する環境を形成する工程であればよく、環境形成に関する詳細な条件については特に限定されるものではない。つまり、上記ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現できれば、ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。
上記刺激剤としては、ＫＣを刺激することが可能な各種タンパク質（ＫＣ刺激タンパク質）を挙げることができる。当該ＫＣ刺激タンパク質としては、ＫＣを刺激することが可能なタンパク質であれば特に限定されるものではないが、代表的なものとして、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）が挙げられる。
前述したように、黄色ブドウ球菌の感染が、ＡＤの誘引あるいは増悪因子であることはこれまで知られており、さらに、本発明者らによって、ＳｐＡをマウスにＳＤＳとともに塗布すると短期間のうちにＡＤ様の掻痒性慢性皮膚炎を誘導できることが見出された（実施例参照）。したがって、ＫＣ刺激タンパク質として、上記ＳｐＡを特に好ましく用いることができる。
上記ＳｐＡは、黄色ブドウ球菌から得られる完全タンパク質（完全なアミノ酸配列を有するタンパク質）であってもよいが、ケラチノサイトを刺激することが可能であれば、ＳｐＡの部分タンパク質や、完全タンパク質または部分タンパク質の改変体であってもよい。
上記改変体とは、公知のＳｐＡのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質を指すものとする。また、上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘導法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記改変体は、上記ＳｐＡの変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、上記ＳｐＡの改変体は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
また、上記刺激剤としては、ＳｐＡに加えてＳＤＳを併用することがより好ましい。ＳＤＳとプロテインＡとを併用することにより、より激しいＡＤ様の掻痒性慢性皮膚炎を誘導することができる（実施例参照）。ＳｐＡとＳＤＳとの併用方法については特に限定されるものではないが、ＳｐＡを溶解する溶媒にＳＤＳを加えた、ＳｐＡ−ＳＤＳ溶液を調製し、これをモデル生物の皮膚に塗布すればよい。
＜ＫＣの刺激手法＞
上記ＫＣ刺激タンパク質によるＫＣの刺激手法については特に限定されるものではなく、ＫＣを刺激してＩＬ−１８の産生を誘導できる手法であればよい。具体的には、例えば、上記環境形成工程がｉｎ ｖｉｔｒｏにて実施される場合、ＫＣの培養細胞の培養液に上記ＳｐＡを添加して培養すればよい。このとき用いられるＫＣの培養細胞については特に限定されるものではなく、公知の培養細胞を好適に用いることができる。例えば、後述する実施例６では、ＰＡＭ２１２細胞を用いている。
上記ＫＣの培養細胞の培養条件、すなわち培養液や培養温度、ＳｐＡの添加の仕方等についても特に限定されるものではなく、用いられる培養細胞の種類に応じて適当な条件を設定すればよい。
一方、上記環境形成工程がｉｎ ｖｉｖｏにて実施される場合、上記ＳｐＡをホストとなる生物の皮膚に塗布すればよい。ＳｐＡを塗布する条件は特に限定されるものではなく、ＳｐＡによるＫＣの刺激を妨げない方法であればよい。例えば、後述する実施例では、ＳｐＡを５０％グリセロールのＰＢＳ溶液として用いているが、もちろん、本発明はこれに限定されるものではない。また、上述したように、ＳｐＡにＳＤＳを加えたＳｐＡ−ＳＤＳ溶液を調製し、これをホスト生物の皮膚に塗布してもよい。なお、塗布条件、例えば塗布方法やホスト生物に塗布する部位についても特に限定されるものではない。
このとき用いられるホスト生物としては、特に限定されるものではないが、通常は、一般的に各種実験に用いられている哺乳動物を用いればよい。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の実験動物を挙げることができる。例えば、後述する実施例では、ホスト生物としてマウスを用いている。特に、マウスは実験動物として広く用いられており、種々の突然変異体の系統が入手容易である等の実績があること、個体が小さいために飼育用のスペースを比較的小さくできること、等の利点があるため好ましい。
＜皮膚片の移植＞
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤としてＳｐＡ等のＫＣ刺激タンパク質以外のものを用いることができる。代表的なものとして、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚（病変皮膚）を用いることができる。この病変皮膚の皮膚片をホスト生物に移植することによっても、ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現することができる。
上記病変皮膚は、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じている皮膚であれば特に限定されるものではないが、移植の関係から、ホスト生物と同種の生物の皮膚であることが非常に好ましい。異種の生物の場合、拒絶反応のようなＡＤ様の炎症性皮膚病変以外の原因で免疫応答が生じるため好ましくない。上記ホスト生物としては、ＫＣ刺激タンパク質に関する説明でも述べたように、各種実験動物を挙げることができるが、例えば、ホスト生物としてマウスを用いる場合、移植される病変皮膚の皮膚片もマウス由来であることが非常に好ましい（後述する実施例参照）。
ここで、上記ホスト生物は、少なくとも、（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現、（ｉｉ）ｓｔａｔ６の発現、および（ｉｉｉ）ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現という各形質を何れも具備している必要がある。後述する実施例４の結果から明らかなように、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウス、ＩＬ−１８Ｒα鎖欠失マウスは、何れもＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスから得られる病変皮膚の皮膚片を移植してもＩｇＥの産生が誘導されなかった。すなわち、ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現するためには、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の各形質が必要な条件となる。
なお、上記ＣＤ４＋Ｔ細胞とは、抗原ＣＤ４（ヘルパー細胞の細胞膜糖タンパク質の一つ）を発現するＴ細胞を示す。ＣＤ４の発現の有無については、右上付きのプラスまたはマイナスで示す。それゆえ、ＣＤ４については、発現している場合には「ＣＤ４＋」で示し、発現していない場合には「ＣＤ４−」で示す。また、上記ｓｔａｔ６（ＳＴＡＴ６）は、サイトカインの作用機構に関与する細胞内シグナル伝達分子で、ＩＬ−４で特異的に活性化されるものであり、上記ＩＬ−１８Ｒα鎖は、Ｔ細胞に発現しＩＬ−１８の応答に関与する構造である。
＜阻害剤同定工程＞
上記阻害剤同定工程では、上記環境形成工程で形成されたＩＬ−１８の産生を誘導できる環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトによるインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を同定する工程であれば特に限定されるものではない。この工程で同定された物質が、ＩＬ−１８の分泌の誘導を阻害する阻害剤となり得る。
上記候補物質を投与する手法は特に限定されるものではない。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏであれば、ＫＣの培養細胞を培養している培養液に候補物質を投与すればよい。また、ｉｎ ｖｉｖｏであれば、ホスト生物における炎症部位に候補物質を塗布してもよいし、ホスト生物に候補物質を内服させてもよい。また、上記阻害剤を同定する手法も特に限定されるものではなく、ＫＣによるＩＬ−１８の産生誘導が阻害されていることが確実に確認できるような方法であればよい。ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境がｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであっても、ＥＬＩＳＡを用いたｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ等を用いることができる。
なお、本発明にかかるスクリーニング方法は、上述した環境形成工程および阻害剤同定工程を含んでいればその具体的な手法は特に限定されるものではなく、もちろんその他の工程を含んでいてもよい。
＜免疫疾患治療薬剤・高レベルＩｇＥ発現の抑制方法＞
さらに、本発明には、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む免疫疾患治療薬剤が含まれる。この免疫疾患治療薬剤の具体的な組成等については特に限定されるものではなく、スクリーニングされた阻害剤の種類と、投与対象となる生物（ヒトも含む）の状態に応じて、適切なバッファーや添加剤を含んでいればよい。
さらに、本発明には、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、上記免疫疾患治療薬剤を用いた高レベルＩｇＥ発現の抑制方法も含まれる。この方法では、上記阻害剤または免疫疾患治療薬剤を用いることで、ＫＣから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積により、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制する。その結果、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現という現象を抑制または阻害することができる。
ＫＣからのＩＬ−１８の産生誘導は、ダイレクトにＡＤの発症につながる場合もあれば、高レベルのＩｇＥ発現を導いてＡＤの発症につながる場合もある。本発明では、上記何れの場合であっても、ＡＤの病状を有効に治療または緩和することができる。
（２）本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法
上記（１）では、本発明のうち、ＡＤやその類似症状の治療薬剤を候補物質からスクリーニングする方法について詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＡＤやその類似症状の発症機構を解明する目的で、モデル生物に、ＡＤ様の炎症性皮膚病変を発症させるＡＤ様症状の誘導方法も含まれる。
本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法は、上記（１）の環境形成工程にて、ＫＣ刺激タンパク質を刺激剤として用いた場合について説明したように、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをホスト生物の皮膚に塗布する方法であればよい。このときの塗布条件等についても上記（１）と同様特に限定されるものではない。
さらに、上記プロテインＡとしては、上記（１）でも述べたように、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかであればよい。
また、上記ホスト生物としても、上述したように、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の実験動物、特にマウス等を好適に用いることができる。換言すれば、本発明には、上記誘導方法により得られた炎症性皮膚病変を発症したモデル生物が含まれる。
（３）本発明の利用
本発明にかかるスクリーニング方法、およびＡＤ様症状の誘導方法は、上述したように、ＡＤやその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることができる。ここで、本発明にかかる上記各方法は、キットにより実現されてもよい。すなわち、本発明には、上記スクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットまたは上記ＡＤ様症状の誘導方法を実施するための誘導キットが含まれていてもよい。
上記スクリーニングキットの具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、少なくとも、刺激剤（特にＫＣ刺激タンパク質、促進物質）と、阻害剤同定工程で用いられる各種マテリアル類（例えばＳｐＡの結合タンパク質とシグナル伝達分子等）を含む構成を挙げることができる。同じく、ＡＤ様症状の誘導キットの具体的な構成も特に限定されるものではないが、ＳｐＡ溶液とＳｐＡを効率的に塗布できるような塗布手段とを含む構成を挙げることができる。
本発明にかかるスクリーニング方法は、ＡＤ様の炎症性皮膚病変を治療する免疫疾患治療薬剤のスクリーニングに好適に用いられる。また、本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法は、ＡＤ様症状をモデル動物に人工的に発症させることで、ＡＤ様症状の発症機構の解明に用いることが可能であるが、さらには、本発明にかかるスクリーニング方法により得られた阻害剤の効果を検証するために用いることもできる。
例えば、本発明にかかるスクリーニング方法として、環境形成工程をｉｎ ｖｉｔｒｏで実現する手法により、ある阻害剤（例えば、物質Ｘとする）が得られたとする。この場合では、ＫＣの培養細胞における物質Ｘの効果を見ていることになる。そこで、本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法を用いてＡＤ様症状が発症したマウスを作製し、これを用いて物質Ｘの効果をｉｎ ｖｉｖｏで検証することができる。
なお、本発明の利用方法は、上記の例に限定されるものではなく、他の種々の用途にも用いることが可能であることはいうまでもない。
このように、本実施の形態では、具体的な例を挙げて本発明を詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者が有する知識に基づいて、種々の改良、変更、修正を加えた態様で実施することができる。
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例において用いられたマウスおよび試薬、並びに、具体的な実験方法の詳細を次に示す。
〔マウス〕
メスのＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型マウス（６−１０週）はＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ社から購入した。Ｂ６背景ＣＤ４欠失マウス（メス、６−１０週）は東京大学のＤｒ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの好意により提供を受けた。Ｂ６背景ｓｔａｔ ６欠失マウス（メス、６−１０週）は大阪大学のＤｒ．Ｔａｋｅｄａの好意により提供された（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｈｉ，Ｗ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｍ．，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ．Ｓ．，１９９６．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＴＡＴ６ ｉｎ ＩＬ−４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６２７参照）。
Ｂ６マウスとＦ１０マウス（メス、６−１０週）とを交配したＩＬ−１８Ｒα欠失マウスは、大阪大学のＤｒ．Ｈｏｓｈｉｎｏより提供を受けた（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｉ，Ｔ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ，Ｓ．１９９９．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＩＬ−１８ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５０４１参照）。
皮膚移植片のドナーとしては、高い血清中ＩｇＥ濃度（１０−１２μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１８濃度（５−７ｎｇ／ｍｌ）を有する慢性皮膚疾患を患うメスのマウスを選択して用いた。ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスをＢ６野生型マウスと交配して得られたＦ６マウス（メス、６−１０週）を用いた（Ｓｅｋｉ，Ｅ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｔ ｓｕｊｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ−Ｙｕｍｉｋｕｒａ，Ｓ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．２００２．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ８８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３８６３参照）。Ｂ６／１２９背景の骨髄分化ファクター８８（ＭｙＤ８８）欠失マウス、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）２欠失マウスのＦ４マウス（メス）は、大阪大学のＤｒ．Ａｋｉｒａから提供を受けた（Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ参照）。全てのマウスは無菌状態の下においた。
〔試薬〕
黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１から精製したＳｐＡは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。大腸菌（０５５；Ｂ５）からのリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｄｉｆｃｏ社より購入した。Ｍｕｒｉｎｅ Ｆａｓリガンドトランスフェクタント（ｍＦａｓＬ）については、非特許文献６を参照。広い範囲で活性を阻害するｃａｓｐａｓｅ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）と、ｃａｓｐａｓｅ−１の特異的な阻害剤であるＡｃ−ＹＣＡＤ−ＣＭＫ（ＹＶＡＤ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入した。本実施例では、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０を通常の培養液として用いた。マウスのケラチノサイト細胞株ＰＡＭ２１２は、東京大学のＤｒ．Ｔａｍａｋｉから提供された。
〔皮膚移植〕
皮膚標本（１ｃｍ２）は、野生型Ｂ６マウスの正常皮膚またはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変を発症した皮膚（病変皮膚）あるいは発症していない皮膚（非病変皮膚）から得た上で、野生型Ｂ６マウス、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウス、またはＩＬ−１８Ｒα欠失Ｂ６マウスの背中に移植した。皮膚標本としては、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの病変皮膚あるいは非病変皮膚については、２片の移植片を得た。
皮膚移植の後、レシピエントは、可能なすべての感染を防ぐために、１ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）および１０００Ｕ／ｍｌの硫酸ｐｏｌｙｍｉｘｉｎＢ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた飲用水を与えた。適宜、ＩｇＥ濃度を決定するために血清をサンプリングした。
移植されたそれぞれのホストにおける移植皮膚の生着率は４８日目まで観察した。組織学的な研究のために、ヘマトキシリンとエオジンで皮膚標本を染色した（非特許文献３・４参照）。
〔皮膚溶解物〕
皮膚標本（１ｃｍ２）は、野生型のＢ６マウスまたはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスから得た上で、当該皮膚標本から調製した表皮のシートはＰＢＳ（リン酸緩衝整理食塩水）中、４℃でホモジナイズし、濾過した。それぞれの溶解物中に含まれる各種サイトカインおよびタンパク質の濃度を、サイトカイン用試薬およびタンパク質評価試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、ＥＬＩＳＡキットにより測定した。
〔Ｔｈ１／Ｔｈ２分化〕
脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて様々な手法で処理したマウスから単離した。新たに単離した脾臓細胞は抗ＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともにインキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は９８％超であった。細胞（１×１０６／ｍｌ）は、固相化された抗ＣＤ３ε（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とともに４８時間インキュベートし、それぞれの上清のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。
〔サイトカインおよびＩｇＥの評価〕
ＩＬ−１８濃度はＭＢＬ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１βは、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−５のＥＬＩＳＡキットは、Ｅｎｄｏｇｅｎ社から購入した。血清ＩｇＥ濃度は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−１８のＩＦＮ−γ誘導能は、ＬＮＫシリーズと名づけられたＩＬ−１８応答性のマウスＮＫ細胞クローンを用いてバイオアッセイにより決定した（非特許文献６他参照）。
具体的には、ＬＮＫ５Ｅ６細胞は、ＬＮＫ５Ｅ３細胞よりも、ＩＦＮ−γ産生に関してはＩＬ−１８刺激に対してより高い応答性を有しており（非特許文献６参照）、この細胞を各種サンプルおよび１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２とともに、抗ＩＬ−１８抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で４８時間インキュベートした。ＩＬ−１８の活性度は、次式に示すように、ＩＬ−１８に対する応答において、細胞によって産生されるＩＦＮ−γの濃度として定義される（非特許文献６参照）。
ＩＬ−１８活性度＝（抗ＩＬ−１８抗体の不存在下における上清中のＩＦＮ−γ）−（抗ＩＬ−１８抗体の存在下における上清中のＩＦＮ−γ）。
〔ＳｐＡの塗布〕
種々の量のＳｐＡを、５μｌの溶媒（５０％グリセロールのＰＢＳ溶液）に溶かしたもの（ＳｐＡ溶液）を調製し、このＳｐＡ溶液を野生型の耳の皮膚に、１４日間毎日塗布した。コントロールとして、ＳｐＡを含まない５μｌの溶媒を用いた。他のマウスの影響を避けるため、マウスを個別のケージに入れた。
〔ＫＣの調製〕
ＫＣは、Ｄｒ．Ｔａｍａｋｉ他により示された方法（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｕｒａｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｔａｍａｋｉ，Ｋ．，Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｉｍａｉ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｅ，Ｏ．，Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎ ＮＣ／Ｎｇａ ｍｉｃｅ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１０９７，または，Ｔａｍａｋｉ，Ｋ．，Ｓｔｉｎｇｌ，Ｇ．，Ｇｕｌｌｉｎｏ，Ｍ．，Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ Ｋａｔｚ，Ｓ．Ｉ．１９７９．ｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ａｒｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：７８４参照）にしたがって、各種遺伝子型のマウスから調製し、表面分子の発現を正常に回復させるために、一晩培養液中でインキュベートした。ＤＣを除去するために、ＫＣをＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともにインキュベートした後、ＣＤ１１ｃ＋細胞はＡｕｔｏＭＡＣＳを用いて除去した。
ＫＣ（５×１０５／ｍｌ）またはＰＡＭ２１２細胞（２×１０５／ｍｌ）は、様々な量のＳｐＡと、１μｇ／ｍｌのＬＰＳまたはｍＦａｓＬ（１×１０６／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートした。一部の実施例では、野生型のＫＣを、２０μＭのＺＶＡＤまたはＹＶＡＤの存在下で、１００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。それぞれの上清におけるＩＬ−１８濃度およびその活性度は、ＥＬＩＳＡとバイオアッセイによりそれぞれ決定した。一部の実施例では、ＫＣは５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに４時間インキュベートし、総ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｋａｗａｄａ，Ｎ．，Ｈｙｏｄｏ，Ｙ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ，Ｋ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．１９９７．ＩＬ−１８ ａｃｃｏｕｎｔｓ ｆｏｒ ｂｏｔｈ ＴＮＦ−α−ａｎｄ Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３９６１参照）を行った。ＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０またはβ−アクチンのためのプライマー及びそれぞれのサイトカインについてのＰＣＲの条件については、上記Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．を参照。
〔Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の調製〕
Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（クッパー細胞）の調製は、非特許文献６にしたがって行った。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（１×１０６／ｍｌ）は、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポ多糖類）とともに４時間インキュベートし、それらのＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０およびβ−アクチンの発現をＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ濃度として決定した。
〔ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器）分析〕
ＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は、非特許文献６にしたがって調製したＫＣを、フィコエリトリン（ＰＥ）を結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した抗Ｉ−Ａｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）と、あるいはＰＥを結合した抗ＣＤ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ８抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とインキュベートした後、二色フローサイトメトリー分析により決定した。
〔統計量〕
全てのデータは３個の組の平均と標準偏差として示した。対照群と処置群の間の有意性は、独立したスチューデントテストにより行った。Ｐ＜０．０５が有意であるとした。
〔実施例１：ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからの皮膚移植片の移植によるＩｇＥの誘導〕
最初に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚が同系統の正常な野生型マウスに移植されると、血清ＩｇＥ濃度の上昇を誘導する可能性を有するかを調べた。具体的には、それぞれの移植における皮膚移植片の条件を標準化するために、耳、顔および胴体に慢性皮膚炎を発症し、血清中に一定のＩＬ−１８およびＩｇＥ濃度を有するＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスをドナーとして選択した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚片または非病変皮膚片を、正常なＢ６マウスに移植し、宿主の血清ＩｇＥ濃度を測定した。その結果を図１に示す。
図１では、グラフ中の塗りつぶされた円および右側の上の写真が、正常なＢ６マウスにＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した結果を示し、グラフ中の斜線を引いた円および右側の中央の写真が、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚を移植した結果を示し、グラフ中の正方形および右側の下の写真が、野生型マウスの正常な皮膚を移植した結果を示す。グラフに示された時点でＥＬＩＳＡによるＩｇＥ測定のために血清をサンプリングするとともに、移植した皮膚の生着率を観察した（図１の上方：移植皮膚の生着率）。データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。移植した皮膚の生着率は上方のパネルに示す。
図１に示すように、非病変皮膚を移植したＢ６マウスが、遅延した弱いＩｇＥ応答を示したのに対して、病変皮膚を移植したマウスの場合は、その血清中のＩｇＥ濃度は早期に上昇した。野生型マウスの皮膚移植片を移植したコントロールのＢ６マウスでは、ＩｇＥの上昇は見られなかった。病変皮膚を移植したＢ６マウスは、高い血清ＩｇＥ濃度を示すが、移植片を脱離した後には濃度が低下する。一方、非病変皮膚を移植したＢ６マウスは、低いＩｇＥ濃度を維持する。さらに、病変皮膚を移植したＢ６マウスは、病変皮膚の拒否反応後であっても血清ＩｇＥ濃度は再度上昇を始める。
なお、データは示さないが、血清ＩＬ−１８濃度はどのタイプの皮膚移植片による刺激の後も上昇しなかった。同じくデータは示さないが、血清ＩＬ−４またはＩＬ−６濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットでは検出されなかった。これらの結果から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚は、正常なＢ６マウスに移植されたときに、全身性のＩｇＥ上昇を持続的に誘導することが示される。これは、ＩＬ−１８の投与を停止した後に直ちに停止する、外因性のＩＬ−１８依存性のＩｇＥ産生（未公開データ）と対照的である。
〔実施例２：ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＩＬ−１８−及びＴｈ２−関連サイトカインの集積〕
病変皮膚の移植のみが、ホストにおけるＩｇＥ応答を効果的に誘導するメカニズムを解明するために、病変皮膚の移植片と非病変皮膚の移植片とにおけるＩＬ−１８濃度を比較した。各皮膚の移植片は、それぞれ前述したように溶解物とした上で、ＩＬ−１８の濃度を測定した。その結果を図２Ａ〜Ｆに示す。
図２Ａ〜Ｆでは、塗りつぶした棒グラフが、２匹のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからサンプリングされた病変皮膚の標本の結果を示し、斜線を引いた棒グラフが、２匹のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからサンプリングされた非病変皮膚の標本の結果を示し、白抜きの棒グラフが、３匹の野生型マウスからサンプリングしたコントロールとしての皮膚標本の結果を示す。また、図２Ａは、上記各皮膚標本の溶解物中におけるＩＬ−１８の濃度を示し、同じく図２Ｂは、ＩＬ−１８の活性度（ＩＬ−１８応答性のＬＮＫ５Ｅ６細胞によるＩＦＮ−γ産生）を示し、図２ＣはＩＬ−１βの濃度を示し、図２ＤはＩＦＮ−γの濃度を示し、図２ＥはＩＬ−４の濃度を示し、図２ＦはＩＬ−５の濃度を示す。各結果は、それぞれのサンプルにおける３つの独立した実験結果の平均と標準偏差とを示す。なお、ＮＤは検出されないことを示す。
図２Ａに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物はＥＬＩＳＡで高いＩＬ−１８濃度を示し、ＩＬ−１８の前駆体および成熟型の両方が検出された。一方、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚の溶解物では、低いＩＬ−１８濃度しか示さず、野生型マウスの皮膚の溶解物においては、ＩＬ−１８の濃度は最も低かった。
ここで、ＩＬ−１８に対する免疫ブロット分析から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚の病変部位は、生理活性を有する１８ｋＤａのＩＬ−１８と２４ｋＤａのＩＬ−１８前駆体との双方を発現し、野生型マウスの皮膚およびＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚は２４ｋＤａのＩＬ−１８前駆体のみを発現することが知られている。そこで、これを確かめるために、ＩＬ−１８に対するバイオアッセイを行った。その結果、図２Ｂに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚はＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ誘導の活性度の力価が高いことを示した。一方、非病変皮膚はほとんど活性を示さなかった。また、Ｂ６マウスの正常な皮膚には、そのような生理活性を有するＩＬ−１８は存在しない。
また、図２Ｃに示すように、ＩＬ−１βも病変皮膚においてのみＫＣに濃縮されていた。なお、ＩＬ−１８、ＩＬ−１βに加えて、他のｃａｓｐａｓｅ−１産生物も、病変皮膚においてのみＫＣに濃縮されることが知られている。このようにホスト中のＩｇＥ濃度は、移植された移植片におけるＩＬ−１８およびＩＬ−１βの濃度と対応している。
次に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物中におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の濃度を測定した。その結果、図２Ｄ〜Ｆに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物中では、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の濃度は、野生型マウスやＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚の溶解物と比較しても、すべて上昇していた。このように、病変皮膚の移植片は大量のＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−４を蓄積している。
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚にはどのタイプの細胞が集積しているのかを調べるために、ＦＡＣＳにより、ＫＣ標本中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞の比率を測定した。その結果を図３Ａ〜Ｆに示す。
図３Ａ・Ｄは、野生型マウスの正常な皮膚、図３Ｂ・Ｅは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚、図３Ｃ・Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚から得られたＫＣ標本の結果を示す。
図３Ａ〜Ｃは、各ＫＣ標本とＰＥを結合した抗ＣＤ４抗体およびＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ８抗体とをインキュベートした結果であり、図３Ｄ〜Ｆは、各ＫＣ標本とＰＥを結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体とＦＩＴＣを結合した抗Ｉ−Ａｂ抗体とをインキュベートした結果を示す。また、図３Ａ〜Ｆのそれぞれにおいては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の比率と、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＩ−Ａｂ＋ＤＣの比率を示す。各結果は、それぞれの実験群における３匹のマウスのうち、１匹の結果のみを示す。
図３Ａ〜Ｆに示すように、病変皮膚では、野生型マウスと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が実質的に上昇していた。また、これら３タイプのレシピエントの間では、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＤＣの比率には違いがなかった。
データは示さないが、肥満細胞の数は、野生型マウスと比較して、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは、病変皮膚において顕著に上昇し、非病変皮膚でにおいては上昇しなかった。この結果は、本発明者らによる以前の報告（非特許文献４）と一致する。このように、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚において優先的に集積される。また、病変皮膚には肥満細胞も多数集積している。
〔実施例３：病変皮膚を移植されたマウスにおけるＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の誘導〕
ＩｇＥ応答は通常Ｔｈ２細胞の活性化を必要とするため、次に、病変皮膚の移植後にホスト中のＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ２細胞に分化するかを調べた。具体的には、正常なＢ６マウスに対して、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚、非病変皮膚または野生型マウスの正常な皮膚を移植し、２１日後に脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を固相化された抗ＣＤ３とともに４８時間インキュベートし、上清におけるＩＬ−４濃度（塗りつぶした棒グラフ）とＩＦＮ−γ濃度（白抜きの棒グラフ）とをＥＬＩＳＡで決定した。その結果を図４に示す。
図４では、ＩＬ−４濃度を塗りつぶした棒グラフに示し、ＩＦＮ−γ濃度を白抜きの棒グラフに示す。それぞれのデータは、３個の組の平均と標準偏差とを示す。３の独立した実験から類似の結果が得られた。なお、ＮＳは有意性なしを示す。
図４に示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した後、２１日目のホストにおける脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、正常なＢ６マウスの皮膚を移植したホストと比較して、固相化された抗ＣＤ３に応答してＩＬ−４およびＩＦＮ−γの双方を多量に産生した。
これに対して、非病変皮膚を移植したレシピエントでは、脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ６野生型マウスの皮膚を移植したレシピエントのものに匹敵する程度の量のＩＬ−４とＩＦＮ−γを産生した（プレート結合抗ＣＤ３に対する応答）。しかしながら、データは示さないが、移植後７日目では、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚または非病変皮膚を移植したレシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型マウスの正常な皮膚を移植したコントロールのレシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞と同程度の量のＩＬ−４とＩＦＮ−γしか分泌しなかった。
これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２細胞に分化するためには、病変皮膚の移植片の移植による刺激から２−３週間必要であることを示す。
〔実施例４：ＩＬ−１８、ＣＤ４およびｓｔａｔ６に依存するＩｇＥの誘導〕
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚が、ＩｇＥを誘導するメカニズムを細胞レベルで分析した。ところで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除いたマウスはＩＬ−１８を投与されても血清ＩｇＥ濃度の上昇が見られないことが知られている。そのため、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞が本来必要とされるのか、あるいは、病変皮膚に浸潤したＩＬ−４を産生するドナーＴ細胞（図２Ｅ参照）が、ＩｇＥ誘導に必要な条件を備えているのかを調べた。
具体的には、野生型マウス、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウスまたはＩＬ−１８Ｒα欠失マウスに、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した。０日目と２１日目に、ＩｇＥ測定のために血清をサンプリングした。その結果を図５Ａに示す。白抜きの棒グラフが０日目の結果であり、塗りつぶした棒グラフが２１日目の結果を示す。各データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。
まず、ＣＤ４欠失マウスは、図５Ａに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した後でさえもＩｇＥを産生しなかった。この結果から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の移植片中のＩＬ−４産生細胞あるいはＩＬ−１８は、ホストのＣＤ４＋Ｔ細胞なしにはＩｇＥの全身性の上昇を誘導することができないことを示唆している。
また、ｓｔａｔ６がＩＬ−４のシグナル伝達に不可欠であることから、次に、ホストのｓｔａｔ６の活性化がＩｇＥ誘導に決定的かを分析したところ、図５Ａに示すように、ｓｔａｔ６欠失マウスは、病変皮膚を移植した後、いかなるＩｇＥの上昇も示さない。この結果は、病変皮膚の移植片により誘導されたＩｇＥ応答は、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６に依存的であることを示唆している。データは示さないが、Ｂ６マウスの正常な皮膚の移植もＣＤ４＋Ｔ細胞またはｓｔａｔ６が欠失した宿主において、ＩｇＥ産生を誘導しなかった。したがって、皮膚移植によるＩｇＥの誘導は、ホストが完全なＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６を供えているときだけに起こる。
さらに、移植片中のＩＬ−１８が、ホスト中でＩｇＥの誘導を引き起こすか否かを調べた。この目的のために、ホストとして、ＩＬ−１８に応答することができないＩＬ−１８Ｒα欠失マウスを用いた。図５Ａに示すように、ＩＬ−１８Ｒα欠失マウスでは、ＩｇＥの上昇は見られなかった。また、データは示さないが、Ｂ６マウスの正常な皮膚を移植したＩＬ−１８Ｒα欠失マウスはＩｇＥの上昇を示さなかった。
総合すると、これらの結果は、皮膚の病変部位における少量のＩＬ−１８の持続的な集積は、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６に依存的な、全身性のＩｇＥの上昇を誘導する。
また、病変皮膚を移植された野生型マウスが、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞への分化を伴うＩｇＥ応答を示したことから（図４参照）、このＴｈ１／Ｔｈ２細胞への分化も、病変皮膚の移植片に存在するＩＬ−１８に依存するかを調べた。
具体的には、ＩＬ−１８Ｒα欠失マウスに、Ｂ６野生型マウスの正常な皮膚またはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した。２１日目にレシピエントから脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、固定化された抗ＣＤ３で刺激し、産生されたＩＬ−４とＩＦＮ−γとをＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図５Ｂに示す。
白抜きの棒グラフがＩＦＮ−γの結果であり、塗りつぶした棒グラフがＩＬ−４の結果である。各データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。なお、ＮＳは有意性がないことを示す。
図５Ｂに示すように、病変皮膚の移植片を移植されたＩＬ−１８Ｒα欠失マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型マウスの正常な皮膚を移植されたＩＬ−１８Ｒα欠失マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、そのＩＬ−４あるいはＩＦＮ−γの産生量に関して相違を認めなかった。この結果から、病変皮膚の移植片を介したＴｈ１／Ｔｈ２細胞の分化は、移植片から放出されたＩＬ−１８に依存している可能性が示される。
〔実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳｐＡによるＩＬ−１８およびＩｇＥの誘導〕
黄色ブドウ球菌の感染は、時にはＡＤの患者において、皮膚の炎症変化を悪化させ、いくらかのＡＤ患者では血清ＩＬ−１８濃度が上昇することが知られている。そのため、黄色ブドウ球菌の産生物が、正常なＢ６マウスにおけるＩＬ−１８の全身的な上昇を引き起こすことができるかを調べた。
具体的には、正常なＢ６マウスの耳の皮膚に、１日１回様々な用量のＳｐＡまたは溶媒のみを２週間塗布した。その後、１４日目にＩＬ−１８またはＩｇＥの濃度を測定するために血清および脾臓をサンプリングした。さらに、溶媒またはＳｐＡ（１００μｇ／日）を塗布したマウスの脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３とともに４８時間インキュベートし、それぞれの上清におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図６Ａ〜Ｃに示す。
図６ＡはＩＬ−１８の結果を示し、図６ＢはＩｇＥの結果を示す。さらに、図６Ｃにおける白抜きの棒グラフはＩＦＮ−γの結果を示し、塗りつぶした棒グラフはＩＬ−４の結果を示す。図６Ａ・Ｂのデータは、それぞれの群において、３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。図６Ｃのデータは３つのサンプルの平均と標準偏差とを示し、それぞれの群における３匹のマウスのうち、１匹のデータを示す。なお、ＮＤは検出されないことを示し、ＮＳは有意性がないことを示す。
図６Ａに示すように、ＳｐＡを塗布したマウスでは、血清中のＩＬ−１８のレベルは、投与量依存的に上昇したが、溶媒のみを塗布したマウスでは上昇しなかった。データは示さないが、ＳｐＡまたは溶媒を塗布したマウスにおける血清中のＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０は、ＥＬＩＳＡでは検出されなかった。また、図６Ｂに示すように、ＩｇＥレベルも投与量依存的に上昇した。加えて、図６Ｃに示すように、ＳｐＡで処理されたマウスは、Ｔｈ２細胞優位な分化を示さなかった。これらの結果は、ＩＬ−１８処理と同様に、ＳｐＡがＴｈ１／Ｔｈ２細胞どちらかの優先的な分化なしに、全身性のＩｇＥを誘導する可能性を示す。
〔実施例６：ＳｐＡに応答してＫＣはＩＬ−１８を分泌するが、ＩＬ−１２は分泌しない〕
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２がなければＩｇＥを誘導することができ、ＩＬ−１２があれば逆にＩｇＥ誘導を阻害する。これまで、ＩＬ−１８の分泌を誘導するＬＰＳ（リポ多糖類）を含めた刺激剤は常にＩＬ−１２の産生を引き起こすことが知られている。そこで、次に、ＳｐＡに応答して、どのタイプの細胞がＩＬ−１８を分泌し、これらの細胞がＩＬ−１２の産生を伴わずにＩＬ−１８を分泌するかを調べた。
具体的には、ＰＡＭ２１２細胞（マウスのＫＣの培養株）をＳｐＡとともに、またはＳｐＡなしで２４時間インキュベートし、それぞれの上清中のＩＬ−１８濃度とＩＬ−１８のＩＦＮ−γを誘導する生物活性をＥＬＩＳＡとバイオアッセイでそれぞれ測定した。その結果を図７Ａに示す。図７Ａでは、左側がＩＬ−１８の濃度を示し、右側がＩＦＮ−γを誘導する活性度を示す。なお、図７Ａのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。また、ＮＤは検出されないことを示す。
図７Ａから明らかなように、ＳｐＡによる刺激の後、ＰＡＭ２１２細胞は、ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる活性型のＩＬ−１８を分泌している。
さらに、新たに単離したＫＣがＳｐＡに応答してＩＬ−１８を分泌するか実証するために、野生型Ｂ６マウスのＫＣをいろいろな用量のＳｐＡと２４時間インキュベートした。
具体的には、野生型Ｂ６マウスの皮膚から調製したＫＣまたはＣＤ１１＋細胞を除いたＫＣについて、ＣＤ１１ｃとＭＨＣクラスＩＩ（１−Ａｂ）の発現をフローサイトメトリーで分析した。これらの細胞はＳｐＡ存在下、またはＳｐＡのない状態で２４時間インキュベートし、上清のＩＬ−１８濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図７Ｂに示す。図７Ｂでは、野生型Ｂ６マウスの皮膚から調製したＫＣを塗りつぶした棒グラフで示し、ＣＤ１１ｃ＋細胞を除いたＫＣを白抜きの棒グラフで示す。
図７Ｂの左側に示すように、新たに単離されたＫＣはＳｐＡに応答して用量依存的にＩＬ−１８を放出した。ＬＣ／ＤＣはＩＬ−１８を放出することができるので、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＫＣ標本から除いて、それらをＳｐＡとインキュベートした。ＣＤ１１ｃ＋細胞を除去した後であっても、図７Ｂの右側に示すように、ＫＣはＳｐＡの刺激を受けるとＩＬ−１８を分泌した。なお、図７Ｂのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。また、ＮＤは検出されないことを示す。
次に、ＳｐＡに誘導されるＫＣからのＩＬ−１８分泌の分子的なメカニズムを解明するため、ｃａｓｐａｓｅ−１がＬＰＳ（リポ多糖類）の誘導によるＩＬ−１８分泌に必要であることから、ＳｐＡによる刺激を受けたｃａｓｐａｓｅ−１欠失ＫＣからのＩＬ−１８分泌を調べた。
具体的には、ＫＣは、野生型マウス、ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウス、ＴＬＲ２欠失マウス、またはＭｙＤ８８欠失マウスから調製し、野生型マウスのＫＣは２０μＭＺＶＡＤ、２０μＭＹＶＡＤまたは同じ体積のＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）の存在下、５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。同時に、上記各突然変異体のＫＣを５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。それぞれの上清中のＩＬ−１８をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図７Ｃに示す。
図７Ｃでは、ＷＴが野生型マウスを、ＫＯが上記各突然変異体（ノックアウトタイプ）のマウスを示し、白抜きの棒グラフがｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスを、網掛けの棒グラフがＴＬＲ２欠失マウスを、斜線で示す棒グラフがＭｙＤ８８欠失マウスを示す。
図７Ｃに示すように、ＤＭＳＯを加えずに５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとインキュベートした野生型マウスのＫＣは、２８．４±３．５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１８を産生した。また、ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスのＫＣは野生型マウスのＫＣに匹敵するレベルのＩＬ−１８を分泌する。そのため、ＳｐＡの刺激に対するｃａｓｐａｓｅ−１に依存しないＩＬ−１８の分泌を示唆している。なお、図７Ｃのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。
ｃａｓｐａｓｅ−１阻害剤であるＹＶＡＤや、広い範囲のｃａｓｐａｓｅを阻害するＺＶＡＤは、ＬＰＳまたは膜結合型のＦａｓリガンド刺激による肝臓の組織マクロファージであるＫｕｐｆｆｅｒ細胞からのＩＬ−１８分泌を強力に阻害する。そこで、ＳｐＡの刺激を受けたＫＣについても、ＩＬ−１８の分泌がＹＶＡＤまたはＺＶＡＤで影響されるかを調べた。図７Ｃに示すように、これらの２種類のｃａｓｐａｓｅ阻害剤はＳｐＡの刺激を受けた野生型マウスのＫＣからのＩＬ−１８分泌を阻害しなかった。この結果は、ＳｐＡの刺激を受けたＫＣからのＩＬ−１８分泌において、ｃａｓｐａｓｅは不必要であることを示す。データは示さないが、これはｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスのＫＣの場合についても同様のことが言える。
さらに、多くの微生物がＴＬＲ／ＭｙＤ８８シグナル経路を刺激することから、ＫＣが、グラム陽性菌に対する信号レセプターであるＴＬＲ２または全てのＴＬＲメンバーによってシェアされる不可欠なアダプター分子であるＭｙＤ８８に依存してＩＬ−１８を分泌するのかを調べた。図７Ｃに示すように、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８の両者ともに、ＳｐＡ刺激で誘導されるＫＣからのＩＬ−１８分泌に不必要であることから、ＳｐＡによるＩＬ−１８の分泌誘導は、ＴＬＲに依存しないＩＬ−１８分泌であることを示唆している。
また、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞がＬＰＳまたは膜表現型のＦａｓリガンドによる刺激に応答してＩＬ−１８を分泌することから、これらの刺激剤がＫＣからのＩＬ−１８分泌を誘導するかを調べた。具体的には、野生型Ｂ６マウスからのＫＣ（５×１０５／ｍｌ）を、５００μｇ／ｍｌのＳｐＡ、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、または１×１０６／ｍｌのｍＦａｓＬとともに２４時間インキュベートした。得られた上清に含まれるＩＬ−１８は、ＥＬＩＳＡで測定した。その結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞とは反対に、ＫＣはＬＰＳまたはＦａｓリガンドによる刺激を受けた後もＩＬ−１８を分泌しなかった。なお、表１では、ＮＤは検出されなかったことを示す。
次に、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣが同時にＩＬ−１２を分泌するかを調べた。微量のＩＬ−１２を確認するために、ＳｐＡと４時間インキュベートしたＫＣから総ＲＮＡを得、これを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的には、野生型のＢ６マウスのＫＣとＫｕｐｆｆｅｒ細胞とを５００μｇ／ｍｌのＳｐＡの存在下または非存在下、並びに、１μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下または非存在下で、それぞれ４時間インキュベートした。抽出した総ＲＮＡ中のＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ３５およびβ−アクチンのｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。その結果を図７Ｄに示す。
図７Ｄに示すように、ＬＰＳで刺激されたＫｕｐｆｆｅｒ細胞がＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０との双方を発現したのに対し、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣでは、ＩＬ−１２ｐ３５もＩＬ−１２ｐ４０も検出されなかった。８時間または１６時間ＳｐＡとインキュベートしたＫＣから得た、総ＲＮＡを用いてＩＬ−１２に対するＲＴ−ＰＣＲを行ったが、それらの中にはＩＬ−１２の何れも検出されなかった。データは示さないが、ＥＬＩＳＡでもＩＬ−１２を測定したが、２４時間インキュベートした後のＳｐＡによる刺激を受けたＫＣの上清にはＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−１２ｐ７０は検出されなかった。
これに対して、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のＫＣは、ＩＬ−１８を恒常的に発現し、ＳｐＡによる刺激を受けた後も発現のレベルは変わらなかった。また、データは示さないが、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞はＳｐＡに対する応答としてＩＬ−１２またはＩＬ−１８を分泌しなかった。
これらの結果から、皮膚に塗布されたＳｐＡの刺激により、局部的にＫＣがＩＬ−１８を分泌するが、ＩＬ−１２は分泌せず、これがＩｇＥの誘導につながることが示される。
〔実施例７：ＳＤＳとＳｐＡの混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変〕
ＮＣ／Ｎｇａマウスは、アトピー性皮膚炎好発マウスで、ＳＰＦでは発症しないが、コンベンショナルな環境下に移すと発症する。ＮＣ／Ｎｇａマウスに４％のＳＤＳあるいはＳｐＡ（２００μｇ／日）を単独で塗布しても発症しないが、両者を混合してＮＣ／Ｎｇａマウスの剃毛した背部に塗布すると、ＡＤ様の皮膚病変が観察される。
図８のＡないしＤは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。図８Ｃに示すように、４％ＳＤＳのみを塗布した場合は２８日後でも発症は見られないが、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布した場合は、図８Ｂ、図８Ｄに示すように、１４日後、２８日後にＡＤ様の皮膚病変が観察された。
図９のＡないしＤは、は４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚の経時変化をコントロールの結果とともに示したものである。図９のＡないしＣは、ヘマトキシリン・エオジンで染色したＡＤ様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結果を示すものである。図９Ａは倍率２５倍、図９Ｂは倍率５０倍、図９Ｃは倍率１００倍の観察結果を表す。図９Ｄはアルシアン・ブルーで染色したＡＤ様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結果である。図９Ｄに示したように、組織学的には、病変部において表皮の肥厚が著明となり、アルシアン・ブルーで染色される肥満細胞の浸潤が認められるようになる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明では、ＫＣからのＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こし、これがＡＤ様の炎症性皮膚病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現という現象を導くという知見に基づいて実現されたスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用である。
それゆえ、本発明は、微生物刺激で誘導されるＫＣからのＩＬ−１８産生の重要性を示し、未知の抗原によるアレルギー疾患の病因に関連するであろうメカニズムに新しい見識を提供するとともに、ＡＤの治療薬剤等の開発に有効に利用することができる。
したがって、本発明は、各種医薬品産業や研究用試薬産業に好適に利用できるだけでなく、医療分野にも応用することができる。それゆえ、本発明は、微生物刺激で起こるＫＣからのＩＬ−１８産生の重要性を示し、未知の抗原によるアレルギー疾患の病因に関連するであろうメカニズムに新しい見識を提供するとともに、ＡＤの治療薬剤等の開発に有効に利用することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用に関するものであり、特に、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能なスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
皮膚は体のなかで最も大きな器官であり、生体防御の最前線である。表皮はケラチノサイト（ＫＣ、角化細胞）、メラニン細胞、表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）および上皮内Ｔ細胞等からなる。
ＬＣは未成熟な樹状細胞（ＤＣ）であり、その機能は局部的に暴露されたタンパク質抗原を捕獲して、獲得的免疫反応が一般的に行われる領域リンパ節に運搬することである。リンパ節への移動の間に、ＬＣは抗原提示能を有する成熟ＤＣに変化する。その結果、ＬＣ／ＤＣが運ぶ抗原に対して特異的な全身性免疫応答が引き起こされる。このように、皮膚の抗原特異的な免疫応答は、同じ抗原に対する全身性免疫応答と密接に関連する。したがって、皮膚と免疫臓器は、ＬＣ／ＤＣの循環と抗原特異的な免疫細胞を通して相互に密接に関連していると考えられる。これに対して、ＫＣとメラニン細胞は皮膚に定住し、基本的には獲得免疫応答にあずからない。
しかしながら、ＫＣは皮膚局所における自然免疫応答と炎症の誘導に寄与する可能性が示唆される。微生物が皮膚に感染すると、ホストは炎症反応、ついで獲得免疫反応を皮膚限局性に展開する。その際、皮膚を構成するＫＣおよびＬＣが、それぞれの応答に深く関与すると考えられる。したがって、微生物や化学試薬による刺激に対してさまざまなサイトカインを産生するというユニークな性質に基づき、ＫＣはＬＣに影響を与え、その結果獲得免疫応答を変化させる可能性が考えられる（非特許文献１・２参照）。これらの事実を踏まえると、ＫＣが引き起こした皮膚の炎症が全身性免疫反応にも影響するかを決定することは重要である。
本発明者は、以前に、ＫＣ特異的にｃａｓｐａｓｅ−１を発現し、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β）に依存する方法でアトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）様の皮膚炎症（掻痒性慢性炎）を発症する、ｃａｓｐａｓｅ−１−トランスジェニックマウス（ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウス）を確立している（非特許文献３・４参照）。また、本発明者は、ＩＬ−１βが、ＩＬ−１８のＡＤ様の皮膚炎症を誘導する能力を増強させることも示している（非特許文献４参照）。これらの結果から、ＫＣはＩＬ−１８およびＩＬ−１βを含めた多くのサイトカインの産生により全身性免疫応答にも寄与する可能性があることが示唆される。
ところで、上記ＩＬ−１８およびＩＬ−１βは、生物学的に不活性な前駆体として産生され、ｃａｓｐａｓｅ−１のような適切な細胞内酵素により切断された後活性型として放出される（非特許文献５〜９参照）。
上記ＩＬ−１８は共存するサイトカインの種類に応じて、多様な生理活性を示す。特に、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の存在下で、ＩＬ−１８は強い炎症誘導性のサイトカインであるＩＦＮ−γを誘導し、その結果炎症反応を促進する（非特許文献１０）。これとは対照的に、ＩＬ−１２が存在しない場合、ＩＬ−１８は、Ｔｈ２サイトカインの産生の誘導を通してアトピー応答を誘導する（非特許文献１１〜１４参照）。
上記ＡＤは、外的刺激に対する炎症性皮膚病変で、慢性反復性の強い掻痒を伴う疾患である。発症には、遺伝的背景があり、患者はその血清中に高いレベルのＩｇＥを有するが、その発症機序については不明な点が多い。ＡＤ発症のメカニズムについては、活性化Ｔ細胞、好塩基球、肥満細胞が深く関与する。
特に、アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化の結果、Ｔｈ２サイトカインとケミカルメディエーターの産生が起こり、その結果、ＡＤが発症すると考えられている。上記アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化は、これら細胞上のＦｃεＲ（好塩基球のＩｇＥ抗体に対するＦｃ受容体（ＦｃＲ））に結合したＩｇＥ分子の架橋による。上記Ｔｈ２サイトカインとして重要なものは、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）等が挙げられる。ケミカルメディエーターとして重要なものとしては、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトルエン等が挙げられる。
ところで、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の感染が、状況によってはＡＤ患者の皮膚の炎症変化を悪化させること（非特許文献１５・１６参照）、さらには、一部のＡＤ患者では血清ＩＬ−１８濃度が上昇する（非特許文献１７参照）ことが知られている。すなわち、黄色ブドウ球菌の感染が、ＡＤの誘引あるいは増悪因子であることはこれまで知られている。しかしながら、ＡＤの発症に黄色ブドウ球菌がどのように関与するのかについては不明な点が多い。
【非特許文献１】 Ｊａｍｏｒａ，Ｃ．ａｎｄ Ｆｕｃｈｓ，Ｅ．２００２．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：Ｅ１０１．
【非特許文献２】 Ｇｒｏｎｅ，Ａ．２００２．Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｏ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８８：１．
【非特許文献３】 Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｕｐｐｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ａｓａｈｉ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．，Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｓｋｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｓｐａｓｅ−１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｈｏｗ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｓｈｏｃｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＩＬ−１８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：９９７．
【非特許文献４】 Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｙｕｍｉｋｕｒａ−Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ，Ｓ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｉｗａｋｕｒａ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｈ．２００２．ＩＬ−１８ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＩｇＥ／ｓｔａｔ６ ｕｎｄｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１１３４０．
【非特許文献５】 Ｇｕ，Ｙ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｕ，Ｇ．，Ｈｓｉａｏ，Ｋ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：２０６．
【非特許文献６】 Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ．Ｋ．，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈａｄａ，Ｔ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｃａｓｐａｓｅ−１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｆａｓ／Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＩＬ−１８ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｃａｕｓｅｓ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：３５９．
【非特許文献７】 Ｓｅｋｉ，Ｅ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｔｓｕｊｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ，Ｓ．，Ｋｕｉｄａ，Ｋ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．２００１．ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＬ−１８ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＭｙＤ８８ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１２ ａｎｄ ＩＬ−１β．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３８６３．
【非特許文献８】 Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．１９９８．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５６：１．
【非特許文献９】 Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．１９９９．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ｔｗｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ＩＣＥ（ｃａｓｐａｓｅ−１）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１．
【非特許文献１０】 Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｙｕｔｓｕｄｏ，Ｍ．，Ｈａｋｕｒａ，Ａ．，Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｏｒｉｇｏｅ，Ｋ．，Ｏｋｕｒａ，Ｔ．，Ｎｕｋａｄａ，Ｙ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋ．，Ａｋｉｔａ，Ｈ．，Ｎａｍｂａ，Ｍ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｆ．，Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，Ｍ．１９９５ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＮＦ−γ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８８．
【非特許文献１１】 Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｋ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．１９９９．ＩＬ−１８，ａｌｔｈｏｕｇｈ ａｎｔｉ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｗｈｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＩＬ−４ ａｎｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１３９６２．
【非特許文献１４】 Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，２００１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｏｔｈ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：４２３．
【非特許文献１５】 Ｔｈｅｓｔｒｕｐ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．２０００．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２５：５３５．
【非特許文献１６】 Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｋｒａｆｔ，Ｓ．，Ｏｐｐｅｌ，Ｔ．ａｎｄ Ｂｉｅｂｅｒ，Ｔ．２０００．Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：ｐａｔｈｏｇｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｍａｔｏｌ．２５：５３０．
【非特許文献１７】 Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｋｏｔａｎｉ，Ｍ．，Ｍａｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｈｉｇａ，Ｓ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｆｒｏｍ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ，ＮＣ／Ｎｇａ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２３６．
現状では、ＡＤの発症機構については不明な点が多く、それゆえ、ＡＤの有効な治療薬剤の開発には、多くの困難が伴っている。
上記のように、表皮を構成する各種細胞が、様々な免疫応答に関与することが知られており、例えば、近年、樹状細胞が抗原提示細胞として獲得免疫応答を誘導することが報告されている。しかしながら、表皮を構成する最も主たる細胞であるＫＣについては、ホストの免疫応答にどのように関与するかについては明らかになっていない。
任意の疾患について有効な治療薬剤を開発する場合、その発症機構を解明し、それを利用して薬理作用のある物質をスクリーニングすることは重要な手法の一つである。しかしがなら、ＡＤの発症においては、ＫＣの関与や黄色ブドウ球菌の感染も含めて不明な点が多く、それゆえ、スクリーニングも含めたＡＤの治療薬剤の開発にこれらを応用する技術については、これまでほとんど知られていなかった。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであって、その目的は、ＫＣからのＩＬ−１８の産生の誘導現象を利用して、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な各種方法とその利用方法とを提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡがＫＣを刺激してＩＬ−１８の産生を誘導することを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の系で実証し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記の課題を解決するために、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて、刺激剤による刺激でケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含むことを特徴としている。
上記スクリーニング方法においては、上記刺激剤として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることが好ましい。さらに、上記刺激剤として、プロテインＡに加えてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を併用することがより好ましい。
また、上記スクリーニング方法において、上記環境形成工程がインビトロにて実施される場合、ケラチノサイトの培養細胞の培養液に上記プロテインＡを添加して培養することにより、上記環境の形成を実現してもよいし、上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記プロテインＡをホストとなる生物の皮膚に塗布することで、上記環境の形成を実現してもよい。
さらに、上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤として、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、当該皮膚片をホストとなる生物に移植することで、上記環境の形成を実現してもよい。
ここで、上記ホストとなる生物は、少なくとも、ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現、ｓｔａｔ６の発現、およびＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現という各形質を何れも具備していることが好ましい。上記ホストとなる生物は、例えばマウスが好ましく用いられる。
また、本発明には、上記クリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む免疫疾患治療薬剤が含まれる。さらに、本発明には、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を抑制する方法であって、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、上記免疫疾患治療薬剤を用いて、ケラチノサイトから産生されたインターロイキン１８の局所的な集積によっておこる、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制する方法も含まれる。
本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法は、モデル生物に、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法であって、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布することを特徴としている。
上記誘導方法においては、上記プロテインＡとして、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかを用いることができる。さらに、上記プロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布するときには、ＳＤＳを併用することが好ましい。
また、本発明には、上記誘導方法により得られる、炎症性皮膚病変を発症したモデル生物が含まれ、このモデル生物の一例としてマウスを挙げることができる。
本発明の利用方法としては、例えば、上記スクリーニング方法を行うためのスクリーニングキットや、上記誘導方法を行うためのアトピー性皮膚炎様症状の誘導キットを挙げることができる。
上記各方法によれば、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）様の炎症性皮膚病変において、ケラチノサイトから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こすことを利用している。それゆえ、上記各方法は、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能となる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植することによる、ホストでのＩｇＥ誘導の結果をコントロールの結果とともに示す図である。
図２のＡ〜Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＩＬ−１８の集積を、コントロールの結果とともに示す図である。
図３のＡ〜Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の集積を、コントロールの結果とともに示す図である。
図４は、病変皮膚を移植されたホストにおいてＴｈ２細胞の選択的な分化が欠失することを、コントロールの結果とともに示す図である。
図５のＡおよびＢは、ＩｇＥ誘導のためのホストＣＤ４＋Ｔ細胞、ホストｓｔａｔ６およびホストＩＬ−１８応答性、並びにＴｈ１／Ｔｈ２細胞の発生の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図６のＡ〜Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＡ処理によるＩＬ−１８およびＩｇＥの誘導の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図７のＡ〜Ｄは、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣから、ＩＬ−１２ではなくＩＬ−１８のみが放出される結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図８のＡ〜Ｄは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
図９のＡ〜Ｄは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚の経時変化を顕微鏡で観察した結果を、コントロールの結果とともに示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明者らは、ケラチノサイトから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こし、これがアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変につながることを見出した。本発明では、上記知見を利用して、特に、アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用方法を実現した。以下、本発明について具体的に説明する。
（１）本発明にかかるスクリーニング方法
本発明にかかるスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて、刺激剤による刺激でケラチノサイト（ＫＣ）からの局所的なＩＬ−１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ＫＣによるインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含んでいる。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）様の炎症性皮膚病変では、皮膚のＫＣからＩＬ−１８が局所的に過剰に産生され、これにより血清中において高レベルのＩｇＥの発現が見られる場合もある。そこで、上記環境形成工程および阻害剤同定工程を含むスクリーニング方法を用いることにより、ＩＬ−１８の分泌を阻害する物質を得ることが可能になる。得られた物質（阻害剤）は、ＡＤの有効な治療薬剤となり得る。
なお、本発明でいうところのＡＤ様の炎症性皮膚病変とは、ＩＬ−１８依存的に発症する免疫疾患で、皮膚に炎症が現れる症状を広く指すものとし、厳密にＡＤと認識される掻痒性慢性炎のみを指すものではない。
また、本発明における「ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ）」とは、培養細胞により人工的に再現される反応系を指すものとし、「ｉｎ ｖｉｖｏ（インビボ）」とは、完全な個体における反応系を指すものとする。
さらに、本発明でいうところの「阻害剤」は、ＫＣからのＩＬ−１８の分泌を阻害する物質であればよく、その阻害の具体的なメカニズムは特に限定されるものではない。したがって、本発明にかかるスクリーニング方法で得られる阻害剤は、上記ＫＣからのＩＬ−１８の分泌の過程を可逆的に阻害するものであってもよいし、不可逆的に阻害するものであってもよい。また、可逆的に阻害する阻害剤の場合、競合型（拮抗型）の阻害剤（拮抗剤）であってもよいし、非競合型の阻害剤であってもよい。換言すれば、本発明にかかるスクリーニング方法では、拮抗剤を含む等の様々な種類の阻害剤をスクリーニングすることができる。
＜環境形成工程＞
上記環境形成工程は、刺激剤による刺激でＫＣからのＩＬ−１８の産生を誘導する環境を形成する工程であればよく、環境形成に関する詳細な条件については特に限定されるものではない。つまり、上記ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現できれば、ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。
上記刺激剤としては、ＫＣを刺激することが可能な各種タンパク質（ＫＣ刺激タンパク質）を挙げることができる。当該ＫＣ刺激タンパク質としては、ＫＣを刺激することが可能なタンパク質であれば特に限定されるものではないが、代表的なものとして、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）が挙げられる。
前述したように、黄色ブドウ球菌の感染が、ＡＤの誘引あるいは増悪因子であることはこれまで知られており、さらに、本発明者らによって、ＳｐＡをマウスにＳＤＳとともに塗布すると短期間のうちにＡＤ様の掻痒性慢性皮膚炎を誘導できることが見出された（実施例参照）。したがって、ＫＣ刺激タンパク質として、上記ＳｐＡを特に好ましく用いることができる。
上記ＳｐＡは、黄色ブドウ球菌から得られる完全タンパク質（完全なアミノ酸配列を有するタンパク質）であってもよいが、ケラチノサイトを刺激することが可能であれば、ＳｐＡの部分タンパク質や、完全タンパク質または部分タンパク質の改変体であってもよい。
上記改変体とは、公知のＳｐＡのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質を指すものとする。また、上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘導法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記改変体は、上記ＳｐＡの変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、上記ＳｐＡの改変体は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
また、上記刺激剤としては、ＳｐＡに加えてＳＤＳを併用することがより好ましい。ＳＤＳとプロテインＡとを併用することにより、より激しいＡＤ様の掻痒性慢性皮膚炎を誘導することができる（実施例参照）。ＳｐＡとＳＤＳとの併用方法については特に限定されるものではないが、ＳｐＡを溶解する溶媒にＳＤＳを加えた、ＳｐＡ−ＳＤＳ溶液を調製し、これをモデル生物の皮膚に塗布すればよい。
＜ＫＣの刺激手法＞
上記ＫＣ刺激タンパク質によるＫＣの刺激手法については特に限定されるものではなく、ＫＣを刺激してＩＬ−１８の産生を誘導できる手法であればよい。具体的には、例えば、上記環境形成工程がｉｎ ｖｉｔｒｏにて実施される場合、ＫＣの培養細胞の培養液に上記ＳｐＡを添加して培養すればよい。このとき用いられるＫＣの培養細胞については特に限定されるものではなく、公知の培養細胞を好適に用いることができる。例えば、後述する実施例６では、ＰＡＭ２１２細胞を用いている。
上記ＫＣの培養細胞の培養条件、すなわち培養液や培養温度、ＳｐＡの添加の仕方等についても特に限定されるものではなく、用いられる培養細胞の種類に応じて適当な条件を設定すればよい。
一方、上記環境形成工程がｉｎ ｖｉｖｏにて実施される場合、上記ＳｐＡをホストとなる生物の皮膚に塗布すればよい。ＳｐＡを塗布する条件は特に限定されるものではなく、ＳｐＡによるＫＣの刺激を妨げない方法であればよい。例えば、後述する実施例では、ＳｐＡを５０％グリセロールのＰＢＳ溶液として用いているが、もちろん、本発明はこれに限定されるものではない。また、上述したように、ＳｐＡにＳＤＳを加えたＳｐＡ−ＳＤＳ溶液を調製し、これをホスト生物の皮膚に塗布してもよい。なお、塗布条件、例えば塗布方法やホスト生物に塗布する部位についても特に限定されるものではない。
このとき用いられるホスト生物としては、特に限定されるものではないが、通常は、一般的に各種実験に用いられている哺乳動物を用いればよい。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の実験動物を挙げることができる。例えば、後述する実施例では、ホスト生物としてマウスを用いている。特に、マウスは実験動物として広く用いられており、種々の突然変異体の系統が入手容易である等の実績があること、個体が小さいために飼育用のスペースを比較的小さくできること、等の利点があるため好ましい。
＜皮膚片の移植＞
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤としてＳｐＡ等のＫＣ刺激タンパク質以外のものを用いることができる。代表的なものとして、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚（病変皮膚）を用いることができる。この病変皮膚の皮膚片をホスト生物に移植することによっても、ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現することができる。
上記病変皮膚は、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じている皮膚であれば特に限定されるものではないが、移植の関係から、ホスト生物と同種の生物の皮膚であることが非常に好ましい。異種の生物の場合、拒絶反応のようなＡＤ様の炎症性皮膚病変以外の原因で免疫応答が生じるため好ましくない。上記ホスト生物としては、ＫＣ刺激タンパク質に関する説明でも述べたように、各種実験動物を挙げることができるが、例えば、ホスト生物としてマウスを用いる場合、移植される病変皮膚の皮膚片もマウス由来であることが非常に好ましい（後述する実施例参照）。
ここで、上記ホスト生物は、少なくとも、（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現、（ｉｉ）ｓｔａｔ６の発現、および（ｉｉｉ）ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現という各形質を何れも具備している必要がある。後述する実施例４の結果から明らかなように、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウス、ＩＬ−１８Ｒα鎖欠失マウスは、何れもＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスから得られる病変皮膚の皮膚片を移植してもＩｇＥの産生が誘導されなかった。すなわち、ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境を実現するためには、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の各形質が必要な条件となる。
なお、上記ＣＤ４＋Ｔ細胞とは、抗原ＣＤ４（ヘルパー細胞の細胞膜糖タンパク質の一つ）を発現するＴ細胞を示す。ＣＤ４の発現の有無については、右上付きのプラスまたはマイナスで示す。それゆえ、ＣＤ４については、発現している場合には「ＣＤ４＋」で示し、発現していない場合には「ＣＤ４−」で示す。また、上記ｓｔａｔ６（ＳＴＡＴ６）は、サイトカインの作用機構に関与する細胞内シグナル伝達分子で、ＩＬ−４で特異的に活性化されるものであり、上記ＩＬ−１８Ｒα鎖は、Ｔ細胞に発現しＩＬ−１８の応答に関与する構造である。
＜阻害剤同定工程＞
上記阻害剤同定工程では、上記環境形成工程で形成されたＩＬ−１８の産生を誘導できる環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトによるインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を同定する工程であれば特に限定されるものではない。この工程で同定された物質が、ＩＬ−１８の分泌の誘導を阻害する阻害剤となり得る。
上記候補物質を投与する手法は特に限定されるものではない。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏであれば、ＫＣの培養細胞を培養している培養液に候補物質を投与すればよい。また、ｉｎ ｖｉｖｏであれば、ホスト生物における炎症部位に候補物質を塗布してもよいし、ホスト生物に候補物質を内服させてもよい。また、上記阻害剤を同定する手法も特に限定されるものではなく、ＫＣによるＩＬ−１８の産生誘導が阻害されていることが確実に確認できるような方法であればよい。ＩＬ−１８の産生を誘導できる環境がｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであっても、ＥＬＩＳＡを用いたｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ等を用いることができる。
なお、本発明にかかるスクリーニング方法は、上述した環境形成工程および阻害剤同定工程を含んでいればその具体的な手法は特に限定されるものではなく、もちろんその他の工程を含んでいてもよい。
＜免疫疾患治療薬剤・高レベルＩｇＥ発現の抑制方法＞
さらに、本発明には、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む免疫疾患治療薬剤が含まれる。この免疫疾患治療薬剤の具体的な組成等については特に限定されるものではなく、スクリーニングされた阻害剤の種類と、投与対象となる生物（ヒトも含む）の状態に応じて、適切なバッファーや添加剤を含んでいればよい。
さらに、本発明には、上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、上記免疫疾患治療薬剤を用いた高レベルＩｇＥ発現の抑制方法も含まれる。この方法では、上記阻害剤または免疫疾患治療薬剤を用いることで、ＫＣから産生されたＩＬ−１８の局所的な集積により、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制する。その結果、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現という現象を抑制または阻害することができる。
ＫＣからのＩＬ−１８の産生誘導は、ダイレクトにＡＤの発症につながる場合もあれば、高レベルのＩｇＥ発現を導いてＡＤの発症につながる場合もある。本発明では、上記何れの場合であっても、ＡＤの病状を有効に治療または緩和することができる。
（２）本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法
上記（１）では、本発明のうち、ＡＤやその類似症状の治療薬剤を候補物質からスクリーニングする方法について詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＡＤやその類似症状の発症機構を解明する目的で、モデル生物に、ＡＤ様の炎症性皮膚病変を発症させるＡＤ様症状の誘導方法も含まれる。
本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法は、上記（１）の環境形成工程にて、ＫＣ刺激タンパク質を刺激剤として用いた場合について説明したように、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをホスト生物の皮膚に塗布する方法であればよい。このときの塗布条件等についても上記（１）と同様特に限定されるものではない。
さらに、上記プロテインＡとしては、上記（１）でも述べたように、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかであればよい。
また、上記ホスト生物としても、上述したように、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の実験動物、特にマウス等を好適に用いることができる。換言すれば、本発明には、上記誘導方法により得られた炎症性皮膚病変を発症したモデル生物が含まれる。
（３）本発明の利用
本発明にかかるスクリーニング方法、およびＡＤ様症状の誘導方法は、上述したように、ＡＤやその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることができる。ここで、本発明にかかる上記各方法は、キットにより実現されてもよい。すなわち、本発明には、上記スクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットまたは上記ＡＤ様症状の誘導方法を実施するための誘導キットが含まれていてもよい。
上記スクリーニングキットの具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、少なくとも、刺激剤（特にＫＣ刺激タンパク質、促進物質）と、阻害剤同定工程で用いられる各種マテリアル類（例えばＳｐＡの結合タンパク質とシグナル伝達分子等）を含む構成を挙げることができる。同じく、ＡＤ様症状の誘導キットの具体的な構成も特に限定されるものではないが、ＳｐＡ溶液とＳｐＡを効率的に塗布できるような塗布手段とを含む構成を挙げることができる。
本発明にかかるスクリーニング方法は、ＡＤ様の炎症性皮膚病変を治療する免疫疾患治療薬剤のスクリーニングに好適に用いられる。また、本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法は、ＡＤ様症状をモデル動物に人工的に発症させることで、ＡＤ様症状の発症機構の解明に用いることが可能であるが、さらには、本発明にかかるスクリーニング方法により得られた阻害剤の効果を検証するために用いることもできる。
例えば、本発明にかかるスクリーニング方法として、環境形成工程をｉｎ ｖｉｔｒｏで実現する手法により、ある阻害剤（例えば、物質Ｘとする）が得られたとする。この場合では、ＫＣの培養細胞における物質Ｘの効果を見ていることになる。そこで、本発明にかかるＡＤ様症状の誘導方法を用いてＡＤ様症状が発症したマウスを作製し、これを用いて物質Ｘの効果をｉｎ ｖｉｖｏで検証することができる。
なお、本発明の利用方法は、上記の例に限定されるものではなく、他の種々の用途にも用いることが可能であることはいうまでもない。
このように、本実施の形態では、具体的な例を挙げて本発明を詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者が有する知識に基づいて、種々の改良、変更、修正を加えた態様で実施することができる。
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例において用いられたマウスおよび試薬、並びに、具体的な実験方法の詳細を次に示す。
〔マウス〕
メスのＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型マウス（６−１０週）はＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ社から購入した。Ｂ６背景ＣＤ４欠失マウス（メス、６−１０週）は東京大学のＤｒ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの好意により提供を受けた。Ｂ６背景ｓｔａｔ ６欠失マウス（メス、６−１０週）は大阪大学のＤｒ．Ｔａｋｅｄａの好意により提供された（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｈｉ，Ｗ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｍ．，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ．Ｓ．，１９９６．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＴＡＴ６ ｉｎ ＩＬ−４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６２７参照）。
Ｂ６マウスとＦ１０マウス（メス、６−１０週）とを交配したＩＬ−１８Ｒα欠失マウスは、大阪大学のＤｒ．Ｈｏｓｈｉｎｏより提供を受けた（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｉ，Ｔ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ，Ｓ．１９９９．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＩＬ−１８ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５０４１参照）。
皮膚移植片のドナーとしては、高い血清中ＩｇＥ濃度（１０−１２μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１８濃度（５−７ｎｇ／ｍｌ）を有する慢性皮膚疾患を患うメスのマウスを選択して用いた。ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスをＢ６野生型マウスと交配して得られたＦ６マウス（メス、６−１０週）を用いた（Ｓｅｋｉ，Ｅ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｔ ｓｕｊｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ−Ｙｕｍｉｋｕｒａ，Ｓ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．２００２．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ８８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３８６３参照）。Ｂ６／１２９背景の骨髄分化ファクター８８（ＭｙＤ８８）欠失マウス、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）２欠失マウスのＦ４マウス（メス）は、大阪大学のＤｒ．Ａｋｉｒａから提供を受けた（Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ参照）。全てのマウスは無菌状態の下においた。
〔試薬〕
黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１から精製したＳｐＡは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。大腸菌（０５５；Ｂ５）からのリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｄｉｆｃｏ社より購入した。Ｍｕｒｉｎｅ Ｆａｓリガンドトランスフェクタント（ｍＦａｓＬ）については、非特許文献６を参照。広い範囲で活性を阻害するｃａｓｐａｓｅ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）と、ｃａｓｐａｓｅ−１の特異的な阻害剤であるＡｃ−ＹＣＡＤ−ＣＭＫ（ＹＶＡＤ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入した。本実施例では、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０を通常の培養液として用いた。マウスのケラチノサイト細胞株ＰＡＭ２１２は、東京大学のＤｒ．Ｔａｍａｋｉから提供された。
〔皮膚移植〕
皮膚標本（１ｃｍ２）は、野生型Ｂ６マウスの正常皮膚またはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変を発症した皮膚（病変皮膚）あるいは発症していない皮膚（非病変皮膚）から得た上で、野生型Ｂ６マウス、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウス、またはＩＬ−１８Ｒα欠失Ｂ６マウスの背中に移植した。皮膚標本としては、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの病変皮膚あるいは非病変皮膚については、２片の移植片を得た。
皮膚移植の後、レシピエントは、可能なすべての感染を防ぐために、１ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）および１０００Ｕ／ｍｌの硫酸ｐｏｌｙｍｉｘｉｎＢ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた飲用水を与えた。適宜、ＩｇＥ濃度を決定するために血清をサンプリングした。
移植されたそれぞれのホストにおける移植皮膚の生着率は４８日目まで観察した。組織学的な研究のために、ヘマトキシリンとエオジンで皮膚標本を染色した（非特許文献３・４参照）。
〔皮膚溶解物〕
皮膚標本（１ｃｍ２）は、野生型のＢ６マウスまたはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスから得た上で、当該皮膚標本から調製した表皮のシートはＰＢＳ（リン酸緩衝整理食塩水）中、４℃でホモジナイズし、濾過した。それぞれの溶解物中に含まれる各種サイトカインおよびタンパク質の濃度を、サイトカイン用試薬およびタンパク質評価試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、ＥＬＩＳＡキットにより測定した。
〔Ｔｈ１／Ｔｈ２分化〕
脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて様々な手法で処理したマウスから単離した。新たに単離した脾臓細胞は抗ＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともにインキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は９８％超であった。細胞（１×１０６／ｍｌ）は、固相化された抗ＣＤ３ε（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とともに４８時間インキュベートし、それぞれの上清のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。
〔サイトカインおよびＩｇＥの評価〕
ＩＬ−１８濃度はＭＢＬ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１βは、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−５のＥＬＩＳＡキットは、Ｅｎｄｏｇｅｎ社から購入した。血清ＩｇＥ濃度は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製ＥＬＩＳＡキットにより決定した。ＩＬ−１８のＩＦＮ−γ誘導能は、ＬＮＫシリーズと名づけられたＩＬ−１８応答性のマウスＮＫ細胞クローンを用いてバイオアッセイにより決定した（非特許文献６他参照）。
具体的には、ＬＮＫ５Ｅ６細胞は、ＬＮＫ５Ｅ３細胞よりも、ＩＦＮ−γ産生に関してはＩＬ−１８刺激に対してより高い応答性を有しており（非特許文献６参照）、この細胞を各種サンプルおよび１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２とともに、抗ＩＬ−１８抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で４８時間インキュベートした。ＩＬ−１８の活性度は、次式に示すように、ＩＬ−１８に対する応答において、細胞によって産生されるＩＦＮ−γの濃度として定義される（非特許文献６参照）。
ＩＬ−１８活性度＝（抗ＩＬ−１８抗体の不存在下における上清中のＩＦＮ−γ）−（抗ＩＬ−１８抗体の存在下における上清中のＩＦＮ−γ）。
〔ＳｐＡの塗布〕
種々の量のＳｐＡを、５μｌの溶媒（５０％グリセロールのＰＢＳ溶液）に溶かしたもの（ＳｐＡ溶液）を調製し、このＳｐＡ溶液を野生型の耳の皮膚に、１４日間毎日塗布した。コントロールとして、ＳｐＡを含まない５μｌの溶媒を用いた。他のマウスの影響を避けるため、マウスを個別のケージに入れた。
〔ＫＣの調製〕
ＫＣは、Ｄｒ．Ｔａｍａｋｉ他により示された方法（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｕｒａｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｔａｍａｋｉ，Ｋ．，Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｉｍａｉ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｅ，Ｏ．，Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎ ＮＣ／Ｎｇａ ｍｉｃｅ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１０９７，または，Ｔａｍａｋｉ，Ｋ．，Ｓｔｉｎｇｌ，Ｇ．，Ｇｕｌｌｉｎｏ，Ｍ．，Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ Ｋａｔｚ，Ｓ．Ｉ．１９７９．ｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ａｒｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：７８４参照）にしたがって、各種遺伝子型のマウスから調製し、表面分子の発現を正常に回復させるために、一晩培養液中でインキュベートした。ＤＣを除去するために、ＫＣをＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともにインキュベートした後、ＣＤ１１ｃ＋細胞はＡｕｔｏＭＡＣＳを用いて除去した。
ＫＣ（５×１０５／ｍｌ）またはＰＡＭ２１２細胞（２×１０５／ｍｌ）は、様々な量のＳｐＡと、１μｇ／ｍｌのＬＰＳまたはｍＦａｓＬ（１×１０６／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートした。一部の実施例では、野生型のＫＣを、２０μＭのＺＶＡＤまたはＹＶＡＤの存在下で、１００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。それぞれの上清におけるＩＬ−１８濃度およびその活性度は、ＥＬＩＳＡとバイオアッセイによりそれぞれ決定した。一部の実施例では、ＫＣは５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに４時間インキュベートし、総ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｋａｗａｄａ，Ｎ．，Ｈｙｏｄｏ，Ｙ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ，Ｋ．ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．１９９７．ＩＬ−１８ ａｃｃｏｕｎｔｓ ｆｏｒ ｂｏｔｈ ＴＮＦ−α−ａｎｄ Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３９６１参照）を行った。ＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０またはβ−アクチンのためのプライマー及びそれぞれのサイトカインについてのＰＣＲの条件については、上記Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．を参照。
〔Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の調製〕
Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（クッパー細胞）の調製は、非特許文献６にしたがって行った。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（１×１０６／ｍｌ）は、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポ多糖類）とともに４時間インキュベートし、それらのＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０およびβ−アクチンの発現をＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ濃度として決定した。
〔ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器）分析〕
ＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は、非特許文献６にしたがって調製したＫＣを、フィコエリトリン（ＰＥ）を結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した抗Ｉ−Ａｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）と、あるいはＰＥを結合した抗ＣＤ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ８抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）とインキュベートした後、二色フローサイトメトリー分析により決定した。
〔統計量〕
全てのデータは３個の組の平均と標準偏差として示した。対照群と処置群の間の有意性は、独立したスチューデントテストにより行った。Ｐ＜０．０５が有意であるとした。
〔実施例１：ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからの皮膚移植片の移植によるＩｇＥの誘導〕
最初に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚が同系統の正常な野生型マウスに移植されると、血清ＩｇＥ濃度の上昇を誘導する可能性を有するかを調べた。具体的には、それぞれの移植における皮膚移植片の条件を標準化するために、耳、顔および胴体に慢性皮膚炎を発症し、血清中に一定のＩＬ−１８およびＩｇＥ濃度を有するＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスをドナーとして選択した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚片または非病変皮膚片を、正常なＢ６マウスに移植し、宿主の血清ＩｇＥ濃度を測定した。その結果を図１に示す。
図１では、グラフ中の塗りつぶされた円および右側の上の写真が、正常なＢ６マウスにＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した結果を示し、グラフ中の斜線を引いた円および右側の中央の写真が、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚を移植した結果を示し、グラフ中の正方形および右側の下の写真が、野生型マウスの正常な皮膚を移植した結果を示す。グラフに示された時点でＥＬＩＳＡによるＩｇＥ測定のために血清をサンプリングするとともに、移植した皮膚の生着率を観察した（図１の上方：移植皮膚の生着率）。データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。移植した皮膚の生着率は上方のパネルに示す。
図１に示すように、非病変皮膚を移植したＢ６マウスが、遅延した弱いＩｇＥ応答を示したのに対して、病変皮膚を移植したマウスの場合は、その血清中のＩｇＥ濃度は早期に上昇した。野生型マウスの皮膚移植片を移植したコントロールのＢ６マウスでは、ＩｇＥの上昇は見られなかった。病変皮膚を移植したＢ６マウスは、高い血清ＩｇＥ濃度を示すが、移植片を脱離した後には濃度が低下する。一方、非病変皮膚を移植したＢ６マウスは、低いＩｇＥ濃度を維持する。さらに、病変皮膚を移植したＢ６マウスは、病変皮膚の拒否反応後であっても血清ＩｇＥ濃度は再度上昇を始める。
なお、データは示さないが、血清ＩＬ−１８濃度はどのタイプの皮膚移植片による刺激の後も上昇しなかった。同じくデータは示さないが、血清ＩＬ−４またはＩＬ−６濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットでは検出されなかった。これらの結果から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚は、正常なＢ６マウスに移植されたときに、全身性のＩｇＥ上昇を持続的に誘導することが示される。これは、ＩＬ−１８の投与を停止した後に直ちに停止する、外因性のＩＬ−１８依存性のＩｇＥ産生（未公開データ）と対照的である。
〔実施例２：ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚におけるＩＬ−１８−及びＴｈ２−関連サイトカインの集積〕
病変皮膚の移植のみが、ホストにおけるＩｇＥ応答を効果的に誘導するメカニズムを解明するために、病変皮膚の移植片と非病変皮膚の移植片とにおけるＩＬ−１８濃度を比較した。各皮膚の移植片は、それぞれ前述したように溶解物とした上で、ＩＬ−１８の濃度を測定した。その結果を図２Ａ〜Ｆに示す。
図２Ａ〜Ｆでは、塗りつぶした棒グラフが、２匹のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからサンプリングされた病変皮膚の標本の結果を示し、斜線を引いた棒グラフが、２匹のＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスからサンプリングされた非病変皮膚の標本の結果を示し、白抜きの棒グラフが、３匹の野生型マウスからサンプリングしたコントロールとしての皮膚標本の結果を示す。また、図２Ａは、上記各皮膚標本の溶解物中におけるＩＬ−１８の濃度を示し、同じく図２Ｂは、ＩＬ−１８の活性度（ＩＬ−１８応答性のＬＮＫ５Ｅ６細胞によるＩＦＮ−γ産生）を示し、図２ＣはＩＬ−１βの濃度を示し、図２ＤはＩＦＮ−γの濃度を示し、図２ＥはＩＬ−４の濃度を示し、図２ＦはＩＬ−５の濃度を示す。各結果は、それぞれのサンプルにおける３つの独立した実験結果の平均と標準偏差とを示す。なお、ＮＤは検出されないことを示す。
図２Ａに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物はＥＬＩＳＡで高いＩＬ−１８濃度を示し、ＩＬ−１８の前駆体および成熟型の両方が検出された。一方、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚の溶解物では、低いＩＬ−１８濃度しか示さず、野生型マウスの皮膚の溶解物においては、ＩＬ−１８の濃度は最も低かった。
ここで、ＩＬ−１８に対する免疫ブロット分析から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの皮膚の病変部位は、生理活性を有する１８ｋＤａのＩＬ−１８と２４ｋＤａのＩＬ−１８前駆体との双方を発現し、野生型マウスの皮膚およびＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚は２４ｋＤａのＩＬ−１８前駆体のみを発現することが知られている。そこで、これを確かめるために、ＩＬ−１８に対するバイオアッセイを行った。その結果、図２Ｂに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚はＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ誘導の活性度の力価が高いことを示した。一方、非病変皮膚はほとんど活性を示さなかった。また、Ｂ６マウスの正常な皮膚には、そのような生理活性を有するＩＬ−１８は存在しない。
また、図２Ｃに示すように、ＩＬ−１βも病変皮膚においてのみＫＣに濃縮されていた。なお、ＩＬ−１８、ＩＬ−１βに加えて、他のｃａｓｐａｓｅ−１産生物も、病変皮膚においてのみＫＣに濃縮されることが知られている。このようにホスト中のＩｇＥ濃度は、移植された移植片におけるＩＬ−１８およびＩＬ−１βの濃度と対応している。
次に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物中におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の濃度を測定した。その結果、図２Ｄ〜Ｆに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の溶解物中では、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の濃度は、野生型マウスやＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚の溶解物と比較しても、すべて上昇していた。このように、病変皮膚の移植片は大量のＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−４を蓄積している。
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚にはどのタイプの細胞が集積しているのかを調べるために、ＦＡＣＳにより、ＫＣ標本中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞の比率を測定した。その結果を図３Ａ〜Ｆに示す。
図３Ａ・Ｄは、野生型マウスの正常な皮膚、図３Ｂ・Ｅは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの非病変皮膚、図３Ｃ・Ｆは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚から得られたＫＣ標本の結果を示す。
図３Ａ〜Ｃは、各ＫＣ標本とＰＥを結合した抗ＣＤ４抗体およびＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ８抗体とをインキュベートした結果であり、図３Ｄ〜Ｆは、各ＫＣ標本とＰＥを結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体とＦＩＴＣを結合した抗Ｉ−Ａｂ抗体とをインキュベートした結果を示す。また、図３Ａ〜Ｆのそれぞれにおいては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の比率と、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＩ−Ａｂ＋ＤＣの比率を示す。各結果は、それぞれの実験群における３匹のマウスのうち、１匹の結果のみを示す。
図３Ａ〜Ｆに示すように、病変皮膚では、野生型マウスと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が実質的に上昇していた。また、これら３タイプのレシピエントの間では、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＤＣの比率には違いがなかった。
データは示さないが、肥満細胞の数は、野生型マウスと比較して、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスでは、病変皮膚において顕著に上昇し、非病変皮膚でにおいては上昇しなかった。この結果は、本発明者らによる以前の報告（非特許文献４）と一致する。このように、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚において優先的に集積される。また、病変皮膚には肥満細胞も多数集積している。
〔実施例３：病変皮膚を移植されたマウスにおけるＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の誘導〕
ＩｇＥ応答は通常Ｔｈ２細胞の活性化を必要とするため、次に、病変皮膚の移植後にホスト中のＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ２細胞に分化するかを調べた。具体的には、正常なＢ６マウスに対して、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚、非病変皮膚または野生型マウスの正常な皮膚を移植し、２１日後に脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を固相化された抗ＣＤ３とともに４８時間インキュベートし、上清におけるＩＬ−４濃度（塗りつぶした棒グラフ）とＩＦＮ−γ濃度（白抜きの棒グラフ）とをＥＬＩＳＡで決定した。その結果を図４に示す。
図４では、ＩＬ−４濃度を塗りつぶした棒グラフに示し、ＩＦＮ−γ濃度を白抜きの棒グラフに示す。それぞれのデータは、３個の組の平均と標準偏差とを示す。３の独立した実験から類似の結果が得られた。なお、ＮＳは有意性なしを示す。
図４に示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した後、２１日目のホストにおける脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、正常なＢ６マウスの皮膚を移植したホストと比較して、固相化された抗ＣＤ３に応答してＩＬ−４およびＩＦＮ−γの双方を多量に産生した。
これに対して、非病変皮膚を移植したレシピエントでは、脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ６野生型マウスの皮膚を移植したレシピエントのものに匹敵する程度の量のＩＬ−４とＩＦＮ−γを産生した（プレート結合抗ＣＤ３に対する応答）。しかしながら、データは示さないが、移植後７日目では、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚または非病変皮膚を移植したレシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型マウスの正常な皮膚を移植したコントロールのレシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞と同程度の量のＩＬ−４とＩＦＮ−γしか分泌しなかった。
これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２細胞に分化するためには、病変皮膚の移植片の移植による刺激から２−３週間必要であることを示す。
〔実施例４：ＩＬ−１８、ＣＤ４およびｓｔａｔ６に依存するＩｇＥの誘導〕
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚が、ＩｇＥを誘導するメカニズムを細胞レベルで分析した。ところで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除いたマウスはＩＬ−１８を投与されても血清ＩｇＥ濃度の上昇が見られないことが知られている。そのため、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞が本来必要とされるのか、あるいは、病変皮膚に浸潤したＩＬ−４を産生するドナーＴ細胞（図２Ｅ参照）が、ＩｇＥ誘導に必要な条件を備えているのかを調べた。
具体的には、野生型マウス、ＣＤ４欠失マウス、ｓｔａｔ６欠失マウスまたはＩＬ−１８Ｒα欠失マウスに、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した。０日目と２１日目に、ＩｇＥ測定のために血清をサンプリングした。その結果を図５Ａに示す。白抜きの棒グラフが０日目の結果であり、塗りつぶした棒グラフが２１日目の結果を示す。各データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。
まず、ＣＤ４欠失マウスは、図５Ａに示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した後でさえもＩｇＥを産生しなかった。この結果から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚の移植片中のＩＬ−４産生細胞あるいはＩＬ−１８は、ホストのＣＤ４＋Ｔ細胞なしにはＩｇＥの全身性の上昇を誘導することができないことを示唆している。
また、ｓｔａｔ６がＩＬ−４のシグナル伝達に不可欠であることから、次に、ホストのｓｔａｔ６の活性化がＩｇＥ誘導に決定的かを分析したところ、図５Ａに示すように、ｓｔａｔ６欠失マウスは、病変皮膚を移植した後、いかなるＩｇＥの上昇も示さない。この結果は、病変皮膚の移植片により誘導されたＩｇＥ応答は、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６に依存的であることを示唆している。データは示さないが、Ｂ６マウスの正常な皮膚の移植もＣＤ４＋Ｔ細胞またはｓｔａｔ６が欠失した宿主において、ＩｇＥ産生を誘導しなかった。したがって、皮膚移植によるＩｇＥの誘導は、ホストが完全なＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６を供えているときだけに起こる。
さらに、移植片中のＩＬ−１８が、ホスト中でＩｇＥの誘導を引き起こすか否かを調べた。この目的のために、ホストとして、ＩＬ−１８に応答することができないＩＬ−１８Ｒα欠失マウスを用いた。図５Ａに示すように、ＩＬ−１８Ｒα欠失マウスでは、ＩｇＥの上昇は見られなかった。また、データは示さないが、Ｂ６マウスの正常な皮膚を移植したＩＬ−１８Ｒα欠失マウスはＩｇＥの上昇を示さなかった。
総合すると、これらの結果は、皮膚の病変部位における少量のＩＬ−１８の持続的な集積は、ホスト由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびｓｔａｔ６に依存的な、全身性のＩｇＥの上昇を誘導する。
また、病変皮膚を移植された野生型マウスが、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞への分化を伴うＩｇＥ応答を示したことから（図４参照）、このＴｈ１／Ｔｈ２細胞への分化も、病変皮膚の移植片に存在するＩＬ−１８に依存するかを調べた。
具体的には、ＩＬ−１８Ｒα欠失マウスに、Ｂ６野生型マウスの正常な皮膚またはＫＣＡＳＰ１Ｔｇマウスの病変皮膚を移植した。２１日目にレシピエントから脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、固定化された抗ＣＤ３で刺激し、産生されたＩＬ−４とＩＦＮ−γとをＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図５Ｂに示す。
白抜きの棒グラフがＩＦＮ−γの結果であり、塗りつぶした棒グラフがＩＬ−４の結果である。各データはそれぞれの実験群における３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。なお、ＮＳは有意性がないことを示す。
図５Ｂに示すように、病変皮膚の移植片を移植されたＩＬ−１８Ｒα欠失マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型マウスの正常な皮膚を移植されたＩＬ−１８Ｒα欠失マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、そのＩＬ−４あるいはＩＦＮ−γの産生量に関して相違を認めなかった。この結果から、病変皮膚の移植片を介したＴｈ１／Ｔｈ２細胞の分化は、移植片から放出されたＩＬ−１８に依存している可能性が示される。
〔実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳｐＡによるＩＬ−１８およびＩｇＥの誘導〕
黄色ブドウ球菌の感染は、時にはＡＤの患者において、皮膚の炎症変化を悪化させ、いくらかのＡＤ患者では血清ＩＬ−１８濃度が上昇することが知られている。そのため、黄色ブドウ球菌の産生物が、正常なＢ６マウスにおけるＩＬ−１８の全身的な上昇を引き起こすことができるかを調べた。
具体的には、正常なＢ６マウスの耳の皮膚に、１日１回様々な用量のＳｐＡまたは溶媒のみを２週間塗布した。その後、１４日目にＩＬ−１８またはＩｇＥの濃度を測定するために血清および脾臓をサンプリングした。さらに、溶媒またはＳｐＡ（１００μｇ／日）を塗布したマウスの脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３とともに４８時間インキュベートし、それぞれの上清におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図６Ａ〜Ｃに示す。
図６ＡはＩＬ−１８の結果を示し、図６ＢはＩｇＥの結果を示す。さらに、図６Ｃにおける白抜きの棒グラフはＩＦＮ−γの結果を示し、塗りつぶした棒グラフはＩＬ−４の結果を示す。図６Ａ・Ｂのデータは、それぞれの群において、３匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。図６Ｃのデータは３つのサンプルの平均と標準偏差とを示し、それぞれの群における３匹のマウスのうち、１匹のデータを示す。なお、ＮＤは検出されないことを示し、ＮＳは有意性がないことを示す。
図６Ａに示すように、ＳｐＡを塗布したマウスでは、血清中のＩＬ−１８のレベルは、投与量依存的に上昇したが、溶媒のみを塗布したマウスでは上昇しなかった。データは示さないが、ＳｐＡまたは溶媒を塗布したマウスにおける血清中のＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０は、ＥＬＩＳＡでは検出されなかった。また、図６Ｂに示すように、ＩｇＥレベルも投与量依存的に上昇した。加えて、図６Ｃに示すように、ＳｐＡで処理されたマウスは、Ｔｈ２細胞優位な分化を示さなかった。これらの結果は、ＩＬ−１８処理と同様に、ＳｐＡがＴｈ１／Ｔｈ２細胞どちらかの優先的な分化なしに、全身性のＩｇＥを誘導する可能性を示す。
〔実施例６：ＳｐＡに応答してＫＣはＩＬ−１８を分泌するが、ＩＬ−１２は分泌しない〕
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２がなければＩｇＥを誘導することができ、ＩＬ−１２があれば逆にＩｇＥ誘導を阻害する。これまで、ＩＬ−１８の分泌を誘導するＬＰＳ（リポ多糖類）を含めた刺激剤は常にＩＬ−１２の産生を引き起こすことが知られている。そこで、次に、ＳｐＡに応答して、どのタイプの細胞がＩＬ−１８を分泌し、これらの細胞がＩＬ−１２の産生を伴わずにＩＬ−１８を分泌するかを調べた。
具体的には、ＰＡＭ２１２細胞（マウスのＫＣの培養株）をＳｐＡとともに、またはＳｐＡなしで２４時間インキュベートし、それぞれの上清中のＩＬ−１８濃度とＩＬ−１８のＩＦＮ−γを誘導する生物活性をＥＬＩＳＡとバイオアッセイでそれぞれ測定した。その結果を図７Ａに示す。図７Ａでは、左側がＩＬ−１８の濃度を示し、右側がＩＦＮ−γを誘導する活性度を示す。なお、図７Ａのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。また、ＮＤは検出されないことを示す。
図７Ａから明らかなように、ＳｐＡによる刺激の後、ＰＡＭ２１２細胞は、ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる活性型のＩＬ−１８を分泌している。
さらに、新たに単離したＫＣがＳｐＡに応答してＩＬ−１８を分泌するか実証するために、野生型Ｂ６マウスのＫＣをいろいろな用量のＳｐＡと２４時間インキュベートした。
具体的には、野生型Ｂ６マウスの皮膚から調製したＫＣまたはＣＤ１１＋細胞を除いたＫＣについて、ＣＤ１１ｃとＭＨＣクラスＩＩ（１−Ａｂ）の発現をフローサイトメトリーで分析した。これらの細胞はＳｐＡ存在下、またはＳｐＡのない状態で２４時間インキュベートし、上清のＩＬ−１８濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図７Ｂに示す。図７Ｂでは、野生型Ｂ６マウスの皮膚から調製したＫＣを塗りつぶした棒グラフで示し、ＣＤ１１ｃ＋細胞を除いたＫＣを白抜きの棒グラフで示す。
図７Ｂの左側に示すように、新たに単離されたＫＣはＳｐＡに応答して用量依存的にＩＬ−１８を放出した。ＬＣ／ＤＣはＩＬ−１８を放出することができるので、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＫＣ標本から除いて、それらをＳｐＡとインキュベートした。ＣＤ１１ｃ＋細胞を除去した後であっても、図７Ｂの右側に示すように、ＫＣはＳｐＡの刺激を受けるとＩＬ−１８を分泌した。なお、図７Ｂのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。また、ＮＤは検出されないことを示す。
次に、ＳｐＡに誘導されるＫＣからのＩＬ−１８分泌の分子的なメカニズムを解明するため、ｃａｓｐａｓｅ−１がＬＰＳ（リポ多糖類）の誘導によるＩＬ−１８分泌に必要であることから、ＳｐＡによる刺激を受けたｃａｓｐａｓｅ−１欠失ＫＣからのＩＬ−１８分泌を調べた。
具体的には、ＫＣは、野生型マウス、ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウス、ＴＬＲ２欠失マウス、またはＭｙＤ８８欠失マウスから調製し、野生型マウスのＫＣは２０μＭＺＶＡＤ、２０μＭＹＶＡＤまたは同じ体積のＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）の存在下、５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。同時に、上記各突然変異体のＫＣを５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとともに２４時間インキュベートした。それぞれの上清中のＩＬ−１８をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図７Ｃに示す。
図７Ｃでは、ＷＴが野生型マウスを、ＫＯが上記各突然変異体（ノックアウトタイプ）のマウスを示し、白抜きの棒グラフがｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスを、網掛けの棒グラフがＴＬＲ２欠失マウスを、斜線で示す棒グラフがＭｙＤ８８欠失マウスを示す。
図７Ｃに示すように、ＤＭＳＯを加えずに５００μｇ／ｍｌのＳｐＡとインキュベートした野生型マウスのＫＣは、２８．４±３．５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１８を産生した。また、ｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスのＫＣは野生型マウスのＫＣに匹敵するレベルのＩＬ−１８を分泌する。そのため、ＳｐＡの刺激に対するｃａｓｐａｓｅ−１に依存しないＩＬ−１８の分泌を示唆している。なお、図７Ｃのデータは、３つの値の平均と標準偏差とを示している。
ｃａｓｐａｓｅ−１阻害剤であるＹＶＡＤや、広い範囲のｃａｓｐａｓｅを阻害するＺＶＡＤは、ＬＰＳまたは膜結合型のＦａｓリガンド刺激による肝臓の組織マクロファージであるＫｕｐｆｆｅｒ細胞からのＩＬ−１８分泌を強力に阻害する。そこで、ＳｐＡの刺激を受けたＫＣについても、ＩＬ−１８の分泌がＹＶＡＤまたはＺＶＡＤで影響されるかを調べた。図７Ｃに示すように、これらの２種類のｃａｓｐａｓｅ阻害剤はＳｐＡの刺激を受けた野生型マウスのＫＣからのＩＬ−１８分泌を阻害しなかった。この結果は、ＳｐＡの刺激を受けたＫＣからのＩＬ−１８分泌において、ｃａｓｐａｓｅは不必要であることを示す。データは示さないが、これはｃａｓｐａｓｅ−１欠失マウスのＫＣの場合についても同様のことが言える。
さらに、多くの微生物がＴＬＲ／ＭｙＤ８８シグナル経路を刺激することから、ＫＣが、グラム陽性菌に対する信号レセプターであるＴＬＲ２または全てのＴＬＲメンバーによってシェアされる不可欠なアダプター分子であるＭｙＤ８８に依存してＩＬ−１８を分泌するのかを調べた。図７Ｃに示すように、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８の両者ともに、ＳｐＡ刺激で誘導されるＫＣからのＩＬ−１８分泌に不必要であることから、ＳｐＡによるＩＬ−１８の分泌誘導は、ＴＬＲに依存しないＩＬ−１８分泌であることを示唆している。
また、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞がＬＰＳまたは膜表現型のＦａｓリガンドによる刺激に応答してＩＬ−１８を分泌することから、これらの刺激剤がＫＣからのＩＬ−１８分泌を誘導するかを調べた。具体的には、野生型Ｂ６マウスからのＫＣ（５×１０５／ｍｌ）を、５００μｇ／ｍｌのＳｐＡ、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、または１×１０６／ｍｌのｍＦａｓＬとともに２４時間インキュベートした。得られた上清に含まれるＩＬ−１８は、ＥＬＩＳＡで測定した。その結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞とは反対に、ＫＣはＬＰＳまたはＦａｓリガンドによる刺激を受けた後もＩＬ−１８を分泌しなかった。なお、表１では、ＮＤは検出されなかったことを示す。
次に、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣが同時にＩＬ−１２を分泌するかを調べた。微量のＩＬ−１２を確認するために、ＳｐＡと４時間インキュベートしたＫＣから総ＲＮＡを得、これを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的には、野生型のＢ６マウスのＫＣとＫｕｐｆｆｅｒ細胞とを５００μｇ／ｍｌのＳｐＡの存在下または非存在下、並びに、１μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下または非存在下で、それぞれ４時間インキュベートした。抽出した総ＲＮＡ中のＩＬ−１８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ３５およびβ−アクチンのｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。その結果を図７Ｄに示す。
図７Ｄに示すように、ＬＰＳで刺激されたＫｕｐｆｆｅｒ細胞がＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０との双方を発現したのに対し、ＳｐＡによる刺激を受けたＫＣでは、ＩＬ−１２ｐ３５もＩＬ−１２ｐ４０も検出されなかった。８時間または１６時間ＳｐＡとインキュベートしたＫＣから得た、総ＲＮＡを用いてＩＬ−１２に対するＲＴ−ＰＣＲを行ったが、それらの中にはＩＬ−１２の何れも検出されなかった。データは示さないが、ＥＬＩＳＡでもＩＬ−１２を測定したが、２４時間インキュベートした後のＳｐＡによる刺激を受けたＫＣの上清にはＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−１２ｐ７０は検出されなかった。
これに対して、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のＫＣは、ＩＬ−１８を恒常的に発現し、ＳｐＡによる刺激を受けた後も発現のレベルは変わらなかった。また、データは示さないが、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞はＳｐＡに対する応答としてＩＬ−１２またはＩＬ−１８を分泌しなかった。
これらの結果から、皮膚に塗布されたＳｐＡの刺激により、局部的にＫＣがＩＬ−１８を分泌するが、ＩＬ−１２は分泌せず、これがＩｇＥの誘導につながることが示される。
〔実施例７：ＳＤＳとＳｐＡの混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変〕
ＮＣ／Ｎｇａマウスは、アトピー性皮膚炎好発マウスで、ＳＰＦでは発症しないが、コンベンショナルな環境下に移すと発症する。ＮＣ／Ｎｇａマウスに４％のＳＤＳあるいはＳｐＡ（２００μｇ／日）を単独で塗布しても発症しないが、両者を混合してＮＣ／Ｎｇａマウスの剃毛した背部に塗布すると、ＡＤ様の皮膚病変が観察される。
図８のＡないしＤは、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の結果を、コントロールの結果とともに示す図である。図８Ｃに示すように、４％ＳＤＳのみを塗布した場合は２８日後でも発症は見られないが、４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布した場合は、図８Ｂ、図８Ｄに示すように、１４日後、２８日後にＡＤ様の皮膚病変が観察された。
図９のＡないしＤは、は４％ＳＤＳとＳｐＡ（２００μｇ／日）の混合物を塗布したＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚の経時変化をコントロールの結果とともに示したものである。図９のＡないしＣは、ヘマトキシリン・エオジンで染色したＡＤ様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結果を示すものである。図９Ａは倍率２５倍、図９Ｂは倍率５０倍、図９Ｃは倍率１００倍の観察結果を表す。図９Ｄはアルシアン・ブルーで染色したＡＤ様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結果である。図９Ｄに示したように、組織学的には、病変部において表皮の肥厚が著明となり、アルシアン・ブルーで染色される肥満細胞の浸潤が認められるようになる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明では、ＫＣからのＩＬ−１８の局所的な集積が、抗原への暴露なしに全身性のＩｇＥ応答を引き起こし、これがＡＤ様の炎症性皮膚病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現という現象を導くという知見に基づいて実現されたスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用である。
それゆえ、本発明は、微生物刺激で誘導されるＫＣからのＩＬ−１８産生の重要性を示し、未知の抗原によるアレルギー疾患の病因に関連するであろうメカニズムに新しい見識を提供するとともに、ＡＤの治療薬剤等の開発に有効に利用することができる。
したがって、本発明は、各種医薬品産業や研究用試薬産業に好適に利用できるだけでなく、医療分野にも応用することができる。それゆえ、本発明は、微生物刺激で起こるＫＣからのＩＬ−１８産生の重要性を示し、未知の抗原によるアレルギー疾患の病因に関連するであろうメカニズムに新しい見識を提供するとともに、ＡＤの治療薬剤等の開発に有効に利用することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法であって、
インビボまたはインビトロにて、刺激剤による刺激でケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、
当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
上記刺激剤として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記刺激剤として、プロテインＡに加えてＳＤＳを併用することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記環境形成工程がインビトロにて実施される場合、ケラチノサイトの培養細胞の培養液に上記プロテインＡを添加して培養することにより、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記プロテインＡをホストとなる生物の皮膚に塗布することで、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤として、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、当該皮膚片をホストとなる生物に移植することで、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
上記ホストとなる生物は、少なくとも、ＣＤ４＋Ｔ細胞が正常に存在し、ｓｔａｔ６も発現しており、ＮＫＴ細胞が構成的にＩＬ−１８Ｒα鎖を発現するという各形質を何れも具備していることを特徴とする請求の範囲第５項または第６項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記ホストとなる生物として、マウスが用いられることを特徴とする請求の範囲第５項、第６項または第７項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第８項の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含むことを特徴とする免疫疾患治療薬剤。
【請求項１０】
アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を抑制する方法であって、
請求の範囲第１項〜第８項の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、請求の範囲第９項に記載の免疫疾患治療薬剤を用いて、ケラチノサイトからのインターロイキン１８の局所的な集積により、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制することを特徴とする高レベルＩｇＥ発現の抑制方法。
【請求項１１】
モデル生物に、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法であって、
黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布することを特徴とするアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１２】
上記プロテインＡとしては、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１３】
プロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布するときに、さらにＳＤＳを併用することを特徴とする請求の範囲第１１項または第１２項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法により得られる、炎症性皮膚病変を発症したモデル生物。
【請求項１５】
上記モデル生物がマウスであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のモデル生物。
【請求項１６】
請求の範囲第１項〜第８項に記載のスクリーニング方法を行うためのスクリーニングキット。
【請求項１７】
請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項に記載の誘導方法を行うためのアトピー性皮膚炎様症状の誘導キット。
【請求項１】
アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法であって、
インビボまたはインビトロにて、刺激剤による刺激でケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、
当該環境の下にて候補物質を投与して、上記ケラチノサイトからのインターロイキン１８の産生誘導を阻害する物質を、上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
上記刺激剤として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記刺激剤として、プロテインＡに加えてＳＤＳを併用することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記環境形成工程がインビトロにて実施される場合、ケラチノサイトの培養細胞の培養液に上記プロテインＡを添加して培養することにより、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記プロテインＡをホストとなる生物の皮膚に塗布することで、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、上記刺激剤として、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、当該皮膚片をホストとなる生物に移植することで、上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
上記ホストとなる生物は、少なくとも、ＣＤ４＋Ｔ細胞が正常に存在し、ｓｔａｔ６も発現しており、ＮＫＴ細胞が構成的にＩＬ−１８Ｒα鎖を発現するという各形質を何れも具備していることを特徴とする請求の範囲第５項または第６項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記ホストとなる生物として、マウスが用いられることを特徴とする請求の範囲第５項、第６項または第７項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第８項の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含むことを特徴とする免疫疾患治療薬剤。
【請求項１０】
アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を抑制する方法であって、
請求の範囲第１項〜第８項の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、または、請求の範囲第９項に記載の免疫疾患治療薬剤を用いて、ケラチノサイトからのインターロイキン１８の局所的な集積により、抗原への暴露なしに引き起こされる全身性のＩｇＥ応答を抑制することを特徴とする高レベルＩｇＥ発現の抑制方法。
【請求項１１】
モデル生物に、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法であって、
黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布することを特徴とするアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１２】
上記プロテインＡとしては、当該プロテインＡの完全タンパク質、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡの部分タンパク質、または、ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテインＡまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１３】
プロテインＡをモデル生物の皮膚に塗布するときに、さらにＳＤＳを併用することを特徴とする請求の範囲第１１項または第１２項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項に記載のアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法により得られる、炎症性皮膚病変を発症したモデル生物。
【請求項１５】
上記モデル生物がマウスであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のモデル生物。
【請求項１６】
請求の範囲第１項〜第８項に記載のスクリーニング方法を行うためのスクリーニングキット。
【請求項１７】
請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項に記載の誘導方法を行うためのアトピー性皮膚炎様症状の誘導キット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５７８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６３１５（Ｐ２００５−５０６３１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５７４７
【国際出願日】平成１６年４月２１日（２００４．４．２１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５７４７
【国際出願日】平成１６年４月２１日（２００４．４．２１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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