ゲノムＤＮＡコピー数の測定方法
【課題】簡便かつ高精度なゲノムDNAコピー数の測定方法の提供。
【解決手段】以下のステップ：（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、（ｄ）前記の標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、（ｅ）前記の混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、（ｆ）前記の産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、（ｇ）前記で得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、（ｈ）前記の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップを含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【解決手段】以下のステップ：（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、（ｄ）前記の標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、（ｅ）前記の混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、（ｆ）前記の産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、（ｇ）前記で得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、（ｈ）前記の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップを含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムDNAのコピー数の測定方法に関する。また本発明は、染色体数を測定する方法、及び神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法に関する。さらに本発明は、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムDNAコピー数を測定するには、一般にtwo-color fluorescence in situ hybridization（FISH）法をベースにしたcomparative genomic hybridization（CGH）法（例えば、非特許文献１）、マイクロアレイを利用したアレイCGH法（例えば非特許文献２及び３）、マイクロサテライトマーカー部位のloss of heterozygosity（LOH）を利用したpolymerase chain reaction（PCR）による検出（例えば非特許文献４及び５）などが広く用いられている。
【０００３】
FISHベースのCGH法では、染色体に直接DNA（プローブ）をハイブリダイゼーションさせそれを顕微鏡で観察するという手法のため感度に限界があり、また実験的誤差が生じやすいなどの欠点がある。また近年、マイクロアレイを利用したアレイCGH法による網羅的な染色体異常を調べる手法（非特許文献３）が使われているが、この手法は試料DNAを増幅しなくてはならず、まだ難易度の高い手法であり、限られた研究室のみでしか行えない状況である。前記２つの手法はハイブリダイゼーションを基本にした手法であり、非特異的結合によるバックグラウンドや蛍光による感度の統一など、課題も多い。マイクロサテライトマーカーを利用したPCRによる検出では、PCRを利用した手法のため簡便であるが、マイクロサテライトマーカーの存在する染色体部位でのLOHのみしか検出が可能ではなく、またそのマイクロサテライト長が母由来DNAと父由来DNAとで同じDNA長であれば解析ができないなど、測定に限界がある。
【０００４】
一方、核酸にアダプターを付加した後に競合的にPCR反応を行う技術として、今までにadaptor-tagged competitive PCR法（ATAC-PCR法）（特許文献１）が報告されており、これは標準曲線や内部標準の作製などの煩雑なステップを必要としないで、遺伝子の相対的な発現量比を測定することができるため注目されているが、これは遺伝子の3’末端にポリＡ鎖を持つcDNA特有の手法であり、ゲノムDNAの検出には用いることができない。
【０００５】
ゲノムコピー数の測定は、例えば染色体数異常を検出したり、特定の状態において遺伝子のゲノムコピー数が増幅されていることが知られている場合にその状態を検出するために必要である。従って、ゲノムDNAコピー数を測定するための簡便かつ高精度の方法が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３３７２００号公報
【非特許文献１】Kallioniemi, A. et al. Science第258巻, 第818-821頁, 1992年
【非特許文献２】Pollack J.R., et al. Nature Genetics 第23巻, 第41-46頁, 1999年
【非特許文献３】インビトロジェン社ホームページ（http://www.invitrogen.com/）におけるBioPrime(登録商標)アレイCGHゲノムラベリングシステムの説明
【非特許文献４】「PCR法最前線 基礎技術から応用まで」における「STSの解析−マイクロサテライトマーカー」の章, 蛋白質 核酸 酵素, 第41巻（1996年4月号増刊）, 第618-622頁, 1996年
【非特許文献５】Morimoto O., et al. Journal of Hepatology 第39巻, 第215-221項, 2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ高精度なゲノムDNAコピー数の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、被験試料のゲノムDNA及び標準のゲノムDNAをそれぞれ制限酵素切断し、それらを区別可能なように異なるアダプターを付加し、得られたアダプター付加ゲノムDNAを混合し、再度制限酵素切断を行ってから増幅反応を行うことによって、増幅産物の量に基づいて被験試料ゲノムDNAの標準ゲノムDNAに対する量比を測定することができ、またその測定結果からゲノムDNAコピー数を測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の１〜４である。
１．以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【００１０】
上記方法において、第１の制限酵素としては、メチル化の影響を受けないものを用いる。また、第１の制限酵素としては、付着末端切断型の６塩基認識酵素を用いることが好ましく、例えば、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRI等からなる群より選択することができる。さらに第２の制限酵素としては、４塩基認識酵素を用いることが好ましく、例えば、MboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaI等からなる群より選択することができる。
【００１１】
上記方法において、種類の異なるアダプターとして、互いに長さの異なるヌクレオチドを用いることができる。また、アダプターにはビオチンが付加されていてもよい。
【００１２】
上記方法においては、ステップ（ｅ）でゲノムDNAを切断した後、アダプターが付加されているDNA断片を回収し、ステップ（ｆ）の増幅反応を行ってもよい。
【００１３】
また上記方法のステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加することができる。
上記方法のステップ（ｄ）において、標準DNAの濃度及び測定用DNAの濃度を調整して混合することができる。
【００１４】
またステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加し、ステップ（ｄ）において、少なくとも２群の標準DNAの濃度を段階的に調整して混合することが可能である。
【００１５】
さらに上記方法のステップ（ｆ）においては、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いて増幅反応を行う。ここで使用するプライマーは蛍光標識することが好ましい。また、ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の蛍光量に基づいてゲノムDNAのコピー数を測定することができる。
上記方法においては、ゲノムDNAのコピー数が正常であるか否かを測定することができ、好ましくはゲノムDNAのコピー数が１、２、３、４又はそれ以上であることを測定する。
【００１６】
上記方法において、被験試料としては、染色体数異常が疑われる被験体又は被験細胞を用いることができる。
また、コピー数を測定する対象となるゲノムDNAとしては、Ｘ染色体のゲノムDNA、MYCN遺伝子のゲノムDNA、癌組織由来のゲノムDNAなどが挙げられる。
【００１７】
２．以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと測定対象染色体に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から該染色体のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、染色体数を測定する方法。
【００１８】
３．以下のステップ：
（ａ）被験体由来のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーとMYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、被験体の神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法。
【００１９】
４．以下のステップ：
（ａ）特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと、ゲノムDNA上のある領域を増幅できるように設計されたプライマーとを用いて増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定するステップ
を含む、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法。
【００２０】
上記方法において、特定の状態としては、限定されるものではないが、癌及びゲノムコピー数異常に起因する遺伝性疾患が挙げられる。
【００２１】
また、ステップ（ｆ）においては、プライマーをゲノムDNA上に４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計することが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ゲノムDNAコピー数の測定方法が提供される。本発明は、ゲノムDNAの標的領域のコピー数を、ゲノムDNAコピー数（染色体数）が正常か異常かだけではなく、コピー数そのものを高精度に検出することができるため、特定の疾患に関与する遺伝子の検出等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コントロールとして使用される標準のゲノムDNA（「標準DNA」という）と、被験試料に由来するゲノムDNA（「測定用DNA」という）とを混合して同一の反応系で増幅させることにより、標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定し、得られる測定結果を指標としてゲノムDNAのコピー数を測定することを特徴とするものである。ここで「ゲノムDNAのコピー数」とは、被験試料（被験体、被験組織、被験細胞など）の細胞１つ当たりの、測定対象の領域のゲノムDNAのコピー数を意味し、例えば、ヒトの正常細胞における常染色体のゲノムDNAは２コピーである。また、例えば繊維芽細胞腫の細胞株の一部においてはMYCN遺伝子のゲノムDNAのコピー数が増幅されることが知られており、その場合、繊維芽細胞腫の細胞株においては、MYCN遺伝子のゲノムDNAのコピー数は２以上となる。
【００２４】
上述の通り、PCRによる遺伝子発現の検出を行う場合は、内部基準として標的分子と同様の増幅効率を有するDNA断片を用いて、標的分子とは別の反応系で検量線を作成する対照実験を行わなければならない。この操作を、標的分子が含まれる単一の反応系で行うことができれば、簡単に、かつ少ない誤差で検出結果を得ることができる。本発明は、標準DNA及び測定用DNAのそれぞれに種類の異なるアダプター配列を付加し、このアダプター配列が付加されたゲノムDNAを混合した後、測定しようとするゲノムDNA領域以外の非特異的な配列を除去し、続いてゲノムDNAを増幅し、増幅されたDNA量比を求めることを特徴とするものであり、いわゆる競合ゲノムPCRと呼ばれる。
【００２５】
１．ゲノムDNAのコピー数の測定方法
以下、本発明の方法の各ステップについて説明する。
（ａ）ゲノムDNAの調製
図１に示すとおり、まず、ゲノムDNA試料を少なくとも２種類調製する。具体的には、少なくとも１種の測定用DNAと少なくとも１種の標準DNAを調製する。
【００２６】
測定用DNAは、被験試料から調製したゲノムDNA、すなわちそのコピー数の測定が望まれる被験試料のゲノムDNAであれば特に限定されるものではない。例えば測定用DNAは、各種疾患臓器由来のDNAまたは各疾患血液由来のDNA等が挙げられる。また、測定用DNAは１種類でもよいし、又は２種以上でもよいが、１〜５種を使用することが好ましい。２種以上の測定用DNAを用いる場合は、それらは異なる組織又は細胞由来のものであってもよいし、同一の組織又は細胞由来のものでもよい。例えば、同一種のDNAであるが時期の異なるもの（例えば原発癌由来のゲノムDNAと転移癌由来のゲノムDNA等）を測定DNAとして選択することができる。
【００２７】
一方、標準DNAは、測定用DNAとは異なる種類のゲノムDNAであり、測定用DNAの種類に応じて適宜選択されるが、本発明においては、ゲノムのコピー数（染色体数）が正常のものであるのが好ましい。従って、例えば測定用DNAをヒト神経芽細胞腫細胞株抽出液由来のものとした場合は、標準DNAはヒト正常血液抽出液由来のものを使用することができる。また測定用DNAを、Ｘ染色体数異常を有する細胞又は組織から調製する場合には、標準DNAは染色体異常を有しない正常女性に由来するDNA（Ｘ染色体のコピー数２）又は男性に由来するDNA（Ｘ染色体のコピー数１）を用いることができる。
【００２８】
ゲノムDNAの調製は、当技術分野で公知の方法、例えばフェノール・クロロホルム法等を用いて行うことができる。
【００２９】
上述の通り、本ステップでは、複数種のゲノムDNAを用いることができるが、以下のステップについては、便宜上、被験試料に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準のゲノムDNA（標準DNA）のそれぞれ１種類、合計２種類を使用する場合を例に説明する。
【００３０】
（ｂ）ゲノムDNAの切断
次に、特定の制限酵素（制限酵素Ａ）で標準DNA試料及び測定用DNA試料中のゲノムDNAをそれぞれ切断する。ただし、制限酵素Ａは、試料（特に哺乳動物由来の試料）によってはゲノムDNAが生物種特有のメチラーゼによってメチル化されている場合もあるため、メチル化の影響を受けない制限酵素が好ましい。また、制限酵素Ａは、ステップ（ｃ）におけるアダプター付加反応を簡便にするため、付着末端切断型のものが好ましい。具体的には、付着末端切断型の６塩基認識酵素として、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRIを例示することができる。また、メチル化の影響を受けず、付着末端切断型の６塩基認識酵素として、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、及びKpnIを例示することができる。ただし、本発明においては、ゲノムDNAを断片化することのできる制限酵素であれば、特に限定されるものではない。なお、哺乳動物以外のゲノムDNAを使用する場合でも、DNAのメチル化に留意して、制限酵素選択をするのが望ましい。
【００３１】
（ｃ）アダプターの調製と付加
本発明は、前記の通り、種類の異なるアダプターが付加されたDNAを同一の反応系、すなわち同一の反応試験管内において一度に測定することを特徴とするものである。異なる種類のアダプターとは、増幅を行った際に増幅されたゲノムDNAを区別することができるように設計されたオリゴヌクレオチドを意味する。このアダプターは、ゲノムDNAの制限酵素Ａ切断部位に連結できるように二本鎖として設計されることが好ましい。そのため該アダプターは、標準DNAに付加するアダプターと測定用DNAに付加するアダプターの種類が異なるように設計する。
【００３２】
これらのアダプターは、アダプターが付加されたゲノムDNAを用いた増幅反応により得られる増幅断片を互いに区別し得るものであればアダプターの種類に限定されるものではなく、例えばオリゴヌクレオチド長の異なるもの等が挙げられる。なお、アダプターは、化学合成により得ることができ、また、アダプターを蛍光標識又は放射性同位元素により標識しておくこともできる。
【００３３】
本発明において使用されるアダプターの一例は、互いに共通する配列を作製し（共通配列１；図１の（ｃ）のアダプターにおいて太く「−」で示した部分）、次に、一方の配列に、さらに３〜15塩基の配列（スペーサー）を付加して両アダプターを長さにより区別できるようにする。この場合、付加する配列は、増幅に用いられるアダプタープライマーが付加する位置とゲノムDNAの付着末端（ステップ（ｂ）の制限酵素処理により得ることができる）とアニーリングすることができる突出部の一本鎖の配列（付着末端配列という）との間に位置するように作製する（図１の（ｃ）において、アダプターAP2及びAP3において太く破線（・・・）で示した部分）。
【００３４】
なお、アダプターが付加した試料のみを回収できるようにするため、アダプターには、ある特定の物質が特異的に反応する物質を付加しておくことが好ましい（図１）。例えば、抗原と抗体、酵素と基質、ビオチンとアビジンのような特異的に反応する物質の一方を付加する。図１には、ビオチン（「b-」）が付加されているアダプターを例示した。
【００３５】
本発明において同一の反応系に使用することのできるアダプターの数（種類）は特に限定されるものではないが、２〜７種類、好ましくは６種類までである。従って、使用するアダプターの種類の範囲内で、標準DNAに付加すべきアダプターの種類と、測定用DNAに付加すべきアダプターの種類とを適宜選択することができる。例えば、１種類の測定用DNAを測定の対象とする場合は、測定用DNAに付加すべきアダプターは１種類となる。
【００３６】
本発明の一実施形態において、標準曲線を作成するには少なくとも２つのデータを得ることが必要であり、また測定用DNAと標準DNAを完全に区別することを考慮して、標準DNAは少なくとも２つの群を用いることが好ましい。ここで、標準DNAの群は、濃度が異なる群であることが好ましく、特に段階的に濃度調整された群であることが好ましい。ここで、「段階的に濃度調整された」とは、それぞれ１倍量及び0.5倍量、又は２倍量及び１倍量などのように、段階的に濃度を調整した標準DNAを意味する。
【００３７】
従って、１種類の測定用DNAと濃度が異なる２群の標準DNA（種類は１種類）を使用する場合、アダプターの種類は少なくとも３種類必要となる。また、標準DNAを段階的に濃度調整した２以上の群として用いる場合には、各濃度のゲノムDNAのそれぞれに、種類の異なるアダプターを付加する。例えば、図１においては１倍量及び0.5倍量に段階的に調整した標準DNA（それぞれP1及びP3）に、それぞれ長さの異なるアダプターAP1及びAP3を付加する（図１の（ｃ））。但し、ゲノムDNAの各群の濃度調整は特定の濃度比に限定されるものではなく、標準曲線を作成するため、又は測定用のDNAと区別するために最も良い条件（濃度比）を設定することができる。従って、アダプターの種類が２種類の場合は、１：1.5、１：２などのように、任意に濃度を設定することができる。一方、アダプターAP2が付加された測定用DNAは、通常は１倍量に調製する。なお、「１倍量」とは、段階的に濃度調整するときの基準量をいう。
【００３８】
本発明において、アダプターにおける共通配列は30〜40塩基を最小単位とする。従って、上記スペーサーの配列を変えることにより、種々の長さのアダプターを作製することができる。例えば、３種類のアダプターを使用する場合は、最小のアダプターの長さは30〜40塩基とし、これに適当な長さのスペーサーヌクレオチド（２〜４塩基）を順次付加しながら、付着末端配列を除く最短の配列を有するアダプターとして塩基数30〜40のものを、付着末端配列を除く最長の配列を有するアダプターとして34〜48塩基のものを作製することができる。その結果、上記スペーサーの配列の長さに応じて全体の長さの異なるアダプターを得ることができ、これにより後述のPCR産物を区別することができる。これらのアダプターは、公知の手法により、例えばApplied Biosystems社のDNA合成装置を用いた化学合成により得ることができる。なお、上記したアダプター数、オリゴヌクレオチド数等によって本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３９】
次に、測定用DNAにアダプターを付加する。２種以上の測定用DNAを用いる場合には、測定用DNAそれぞれに、それぞれ異なる種類のアダプターを付加する。同様に、標準DNAの各群にも互いに異なる種類のアダプターをそれぞれ付加する（図１の（ｃ））。本発明においては、測定用DNAに付加するアダプターの量が不足しないようにするため、アダプターを各試料に過剰に混合するが、過剰なアダプターが後の増幅反応を阻害しないために、DNAとアダプターの比を1:50〜500（モル比）にするのが望ましい。
【００４０】
アダプターとゲノムDNAとの連結、及びその後のステップを、標準DNAとして１種類を選択し、その濃度が異なる２群を用い、測定用DNAとして１種類を選択した場合を例として以下に説明する（図１）。
【００４１】
（ｄ）アダプター付加測定用DNAとアダプター付加標準DNAの混合
前記のようにしてアダプターが付加されたゲノムDNAを含む標準DNAと測定用DNAとをそれぞれ混合する。ここで、混合する標準DNAと測定用DNAとの比は、その比を認識している限り、特に限定されるものではない。例えば、１種類の標準DNA（１群）と１種類の測定用DNAを用いる場合には、それらを１：１、１：0.5、0.5：１など、任意の比で混合することができる。また、１種類の標準DNAの濃度が異なる２群と１種類の測定用DNAを用いる場合には、標準DNAを用いて標準曲線を作成することを考慮すると、２群の標準DNAの混合濃度を段階的に調整し、測定用DNAと混合することが好ましい。
【００４２】
（ｅ）アダプター付加されたゲノムDNAの切断
続いて、ステップ（ｄ）で混合した標準DNAと測定用DNAを制限酵素（制限酵素Ｂ）で切断する（図１の（ｅ））。このときに使用する制限酵素Ｂは、制限酵素Ａの場合と同様に、試料によってはゲノムDNAがメチラーゼによってメチル化されている場合もあるため、メチル化の影響を受けない制限酵素が好ましい。また、制限酵素Ｂは、前記の制限酵素Ａの認識配列よりも認識配列の短いものが好ましい。例えば、前記の制限酵素Ａにおいて６塩基認識酵素を使用した場合（例えばPstIの認識配列は６塩基（CTGCAG）である）、当該制限酵素Ｂは認識配列が４塩基のもの（例えばMboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaIなど）を使用する。これは、ゲノムDNAがcDNAに比べて長く、その分、後述する増幅反応において類似配列が多いために増加すると予想されるプライマーの非特異的結合を防ぐためである。
【００４３】
ステップ（ｃ）においてゲノムDNAにアダプターを付加する際、アダプターに、ある特定の物質及びその物質と特異的に反応する物質のうちいずれか一方（例えば抗体に対する抗原、酵素に対するその基質、ストレプトアビジンに対するビオチン等）を付加する。そのようなゲノムDNAを制限酵素Ｂで切断した場合、アダプターが付加されたゲノムDNA断片と、アダプターが付加されていないゲノムDNA断片に切断されることになる。そして、上記物質の他方を用いて（例えば、図１のようにビオチンをアダプターに付加した場合にはストレプトアビジンを反応容器の固相に固定しておく等）、アダプターが付加されたゲノムDNA断片のみを回収することができる。すなわち、制限酵素Ｂ−制限酵素ＢのDNA断片が特異的に取り除かれる。これは制限酵素Ｂの認識配列が制限酵素Ａの認識配列よりも短いため、ゲノムDNA中に含まれる頻度が高くなり（概算認識配列出現頻度（平均）；制限酵素Ａ：制限酵素Ｂ＝１／4096：１／256）、ゲノムコピー数の測定対象となる制限酵素Ａの認識配列近傍のみを残しやすいからである。
【００４４】
（ｆ）ゲノムDNAの増幅
前記のようにしてアダプター付加された後に切断されたゲノムDNAを含む標準DNAと測定用DNAの混合物を鋳型として競合的に増幅反応を行う（図１の（ｆ））。増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により行うことができるが、プライマーを用いる増幅反応であれば特に限定されるものではない。
【００４５】
プライマーとしては、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いることができる（図１の（ｆ））。「アダプターに特異的なプライマー」とは、前記設計されたアダプターの配列と相補的な配列を有し、かつハイブリダイズすることができるプライマーである。また、「測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマー」とは、コピー数測定の対象となるゲノムDNA上の領域にハイブリダイズすることができるプライマーである。例えば、Ｘ染色体のゲノムDNAコピー数を測定する場合には、Ｘ染色体上の任意の領域の配列に相補的な配列を有し、当該領域にハイブリダイズすることができるようにプライマーを設計する。またMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定する場合には、MYCN遺伝子を増幅することができるように該遺伝子の両末端に基づいてプライマーを設計する。
【００４６】
プライマーの設計は、当技術分野の公知のプライマー設計法に従って行うことができる。その際、標的に特異的なプライマーは、下記の条件を満たすことが好ましい：
（１）制限酵素Ａの切断部位から５〜100塩基以内、好ましくは15〜65塩基以内の領域にハイブリダイズするプライマーであること；
（２）プライマーのハイブリダイズする領域がゲノムDNA上で特異的であること、すなわちプライマーの少なくとも3’末端が測定対象領域以外の他の領域にハイブリダイズしないこと；
（３）プライマーによって増幅される測定対象領域又は制限酵素Ａの認識配列内に多型（例えばSNP）が存在しないこと；
（４）プライマーのハイブリダイズする領域及び制限酵素Ａの認識配列と上記領域の間が制限酵素Ｂの認識配列内ではないこと。
【００４７】
また本発明においては、増幅反応後の増幅産物の長さをそろえるために、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーの5'末端にGTという塩基をつけることが望ましい。これは、増幅の伸長工程の際に、プライマーの5'末端のGTに相補的なACにまで伸長が進むと、DNA ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性が最も強く働き、最後にAを付加して伸長反応が停止するという作用があるためである。それにより増幅産物の長さが安定し、後述するステップにおいて増幅産物の区別が容易になる（Clark JM. Nucleic Acids Research. 第16巻, 第9677-9686頁,1988 年, Brownstein MJ, et al. Biotechniques. 第20巻, 第1004-1010頁,1996 年）。
【００４８】
各プライマーは、15〜50塩基、好ましくは20〜25塩基の長さを有するものであり、例えば化学合成により得ることができる。
【００４９】
本発明においては、増幅反応後の増幅産物が検出機により検出されるように、アダプター特異的なプライマーに適当な標識をしておくことが好ましい。標識物質としては、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン等）、放射性物質（例えば32P、35S等）、酵素標識などが挙げられる。これらの標識物質のプライマーへの標識は、公知手法に従って行うことができる。標識は、上記のアダプターに特異的なプライマー及び測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーのいずれに付加してもよく、又は両方のプライマーに付加してもよいが、図１の（ｆ）に示すようにアダプターに特異的なプライマーを標識することが好ましい。
【００５０】
なお、増幅反応のサイクル数や温度条件等は適宜定めることができる。例えば、PCRにより増幅反応を行う場合、増幅の条件は、90℃〜98℃で15秒〜１分、好ましくは94℃で20秒の変性工程、37℃〜72℃で15秒〜１分、好ましくは50℃で40秒のアニーリング工程、及び50℃〜75℃で15秒〜１分、好ましくは72℃で40秒の伸長工程を１サイクルとしてこれを30〜40サイクル、好ましくは35サイクル行う。但し、Taq Gold（Perkin-Elmer社）を使用する場合は、上記増幅サイクルの前に95℃で10分の活性化工程を加えることが好ましく、また、増幅されたDNAのうち未伸長断片を完全に伸長させるために、増幅サイクルの後に72℃で10〜30分の伸長工程を加えることが望ましい。さらに、測定を別の日に行うことができるようにするために、増幅産物を凍結保存（例えば−20℃）することもできる。
【００５１】
（ｇ）増幅産物の検出
得られた増幅産物の検出は、種々の方法により行うことができる。例えば、PCRに使用するプライマーに予め蛍光色素等を標識したときは蛍光強度として検出することができ、放射性物質で標識したときはＸ線フィルムに感光後デンシトメーターで検出することができる。また、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物のバンドの強度を測定することもできる。例えば、増幅産物が蛍光標識されている場合には、Applied Biosystems社製シークエンサーを用いて検出することができる。
【００５２】
標準DNAと測定用DNAに基づく増幅産物は、ステップ（ｃ）において付加したアダプターの種類に基づいて区別することができる。例えば、ステップ（ｃ）において、長さが異なるヌクレオチドからなるアダプターを使用した場合には、得られる増幅産物の長さに基づいて標準DNAと測定用DNAの増幅産物を区別する。
【００５３】
また、段階的に濃度調整した標準DNAの各群にそれぞれ異なる種類のアダプターを連結（付加）した場合、アダプターが付加された標準cDNAの各群は、増幅反応後の測定ステップにおいて、アダプターの種類に対応して区別して検出することができる。本発明の方法は、この標準DNAの区別された各測定値に基づいて標準曲線（例えば１次関数、２次関数等の数学的関数）を作成し、その標準曲線と測定用DNAの測定値を比較することにより、標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定することができる。
【００５４】
（ｈ）ゲノムDNAコピー数への変換
上記ステップ（ｇ）において標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定した後、その結果に基づいて、ゲノムDNAのコピー数を測定する。例えば、１倍量及び0.5倍量に濃度調整した標準DNAの測定結果（蛍光強度）が、図２Ａに示すように、アダプター長の違いによりピークの位置を異にしてそれぞれP1及びP3のように表れたとすると（図２のＡ、白色の２つのピーク）、標準曲線は図２Ｂに示すように作成することができる。図２Ｂのグラフは１次関数として表すことができるので、測定用DNAの蛍光強度を当該関数の式に代入することにより、測定用DNAは標準DNAに対して何倍量存在しているかを知ることができる。例えば、図２Ｂにおいて、P2について得られた蛍光強度値が12000であるとすると、図２Ｂの標準曲線により、倍率は１となる。従って、測定用DNAは、標準DNAに対して１倍量で存在していることが分かる。標準DNAを調製した細胞の１細胞当たりの染色体DNA、すなわちゲノムDNAは既知であるため、それに基づいて測定用DNAのゲノムDNAのコピー数を求めることができる。例えば標準DNAのゲノムDNAコピー数が２コピーの場合には、図２Ａ及びＢに示す結果に基づいて、測定用DNAのゲノムDNAのコピー数は２コピーと測定することができる。本発明の方法により、測定対象のゲノムDNAのコピー数が、０、１、２、３、４、又はそれ以上であることを測定することができる。
【００５５】
２．ゲノムDNAコピー数の測定の応用
（１）染色体数の測定
染色体数は、種々の疾患に関与することが知られている。例えば、２１番染色体が３本存在する場合（正常は２本）はダウン症候群に関与している。また、Ｘ染色体（正常女性は２本）が１本存在する場合はターナー症候群に関与し、Ｘ染色体が１〜３本とＹ染色体（正常男性は１本）が１〜２本存在して、合計の性染色体数が３本以上の場合はトリプルＸ症候群やクラインフェルター症候群に関与する。
【００５６】
従って、本発明において、ステップ（ｆ）の増幅反応において、コピー数を測定しようとする測定対象染色体に特異的なプライマーを用いることによって、染色体数を測定することができる。このように染色体数を測定できることによって、遺伝性疾患の診断を補助したり、染色体数異常と特定の状態との相関を調べることが可能となる。
【００５７】
（２）神経芽細胞腫の予後予測の判定
MYCN遺伝子は、神経芽細胞腫の一部の細胞株においてそのゲノムDNAのコピー数が増幅されることが報告されている（Schwab M. Pathological Oncology Research 第3巻,第3-7頁, 1997年, Zanzen Y., et al. Journal of Pediatric Surgery 第33巻,第1765-70頁, 1998年）。また、MYCN遺伝子のゲノムDNAが増幅している症例では神経芽細胞腫の予後が悪いことが知られ、そのためMYCN遺伝子は予後予測のマーカーとして使用されている（Schwab M. Annals of the New York Academy of Science.第963巻,第63-73頁, 2002 年）。従って、ステップ（ｆ）の増幅反応において、MYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いることによって、MYCN遺伝子のコピー数を測定し、その結果から神経芽細胞腫の予後リスクを予測することが可能となる。
【００５８】
（３）ゲノムDNAのコピー数と特定の状態との相関
本明細書の実施例２に示すように、ゲノムDNA上にプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準DNAとを増幅することにより、そのプライマーにより増幅された領域のゲノムDNAコピー数が増大しているか又は低減しているかを判定することができる。従って、例えば、ゲノムDNA上に一定の間隔をおいて複数のプライマーを設計し、それらのプライマーを用いて、特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準DNAとを増幅し、増幅産物量に基づいて、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定することによって、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定することが可能となる。
【００５９】
プライマーは、ゲノムDNA上に、例えば４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計することができる。また例えば、１〜２Mbpの間隔をおいて設計したプライマーを用いて増幅反応を行い、ゲノムDNAのコピー数の増大又は低減が存在する可能性があると判断した領域において、再度、１〜２Mbpより狭い間隔（例えば４kbp〜１Mbp間隔）でプライマーを設計し、そのコピー数の変化が存在する領域を絞り込んでもよい。
【００６０】
ゲノムDNAのコピー数の変化と相関を判定する特定の状態は、任意の状態でよく、例えば限定されるものではないが、疾患又は障害（癌、遺伝性疾患等）などが挙げられる。
【００６１】
被験体又は被験細胞は、特定の状態を示すものであれば特に限定されるものではなく、動物、植物、真菌、細菌などが含まれる。また、被験細胞も、天然に存在する細胞（動物、植物、真菌、細菌由来の細胞）だけではなく、天然に存在する細胞の変異株、人工的に確立した細胞系統・細胞株などであってよい。被験体及び被験細胞からゲノムDNAを調製する方法は当技術分野で周知である。
【００６２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
Ｘ染色体数異常の症例のゲノムコピー数の測定
本実施例においては、Ｘ染色体数の異常細胞株由来DNAを用いて、ゲノムコピー数の測定を行った。
（ａ）ゲノムDNAの調製
目的とするＸ染色体数の異常細胞株由来DNA（以下に示す核型のもの）をCoriell Cell Repositories（URL; http://locus.umdnj.edu/ccr/）より購入し、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝25：24：１混合液（Giboco-BRL）を用いてゲノムDNAを抽出した：
異常細胞株由来DNA核型
47,XXX（Ｘ染色体数３：アクセッション番号NA04626）、
48,XXXX（Ｘ染色体数４：アクセッション番号NA01416）、
49,XXXXX（Ｘ染色体数５：アクセッション番号NA06061）
（以下それぞれを47,XXX、48,XXXX、49,XXXXXと称する）。
【００６４】
また、正常男性由来の血液（46,XY：Ｘ染色体数１）10例と正常女性由来の血液（46,XX：Ｘ染色体数２）10例からそれぞれゲノムDNAをフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝25：24：１混合液（Giboco-BRL）で抽出し、それぞれ等量ずつ混合して、正常女性由来DNA混合試料（Fmix）と正常男性由来DNA混合試料（Mmix）を作製した。DNA試料はそれぞれ0.1μg/μlに調製した。
【００６５】
（ｂ）ゲノムDNAの切断
次にDNAを制限酵素（PstI）で切断した。具体的には、下記表１に示す反応組成液を37℃で１時間〜４時間加熱して酵素反応を行った後、70℃で20分間加熱し、酵素を失活させた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（ｃ）アダプター付加反応
氷上に移した後、得られたDNA ４μlに以下の表２に示すアダプター付加反応用試薬を加えた。また、使用した試料（DNA）とアダプターの組み合わせは、表３に示す通りである。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
なお、アダプターの配列は以下の通りであり、アダプターにビオチン標識を付加した：
PT-5: biotin- 5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖；配列番号１）
5'-AGTATGGATTGACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号２）
PT-6:biotin-5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖；配列番号３）
5'-AGTATGGATTGAGTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号４）
PT-7:biotin-5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCTATACTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖;配列番号５）
5'-AGTATGGATTGAGTATAGCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号６）
【００７１】
（ｄ）混合
（ｃ）で調製した反応液を16℃で一晩保温し、その後各試料を上記の表３の通り、濃度を調整して、すなわち試料P1：P2：P3が１：１：0.5となるように混合した。
【００７２】
（ｅ）アダプター付加されたゲノムDNAの切断
（ｄ）で調製した混合物をカラム精製（QIAGEN社；QIAquick PCR Purification Kit, Cat. No.28104）にて２回精製し、得られた各DNA混合溶液50μlに対して以下の表４に示す組成の溶液を加え、37℃で１時間保温して、制限酵素切断反応を行った。
【００７３】
【表４】
【００７４】
（ｆ）PCR反応
それぞれの試料に、５M NaCl 25μlを加え、さらに１×B&Wバッファー（10mM TrisHCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA）にてあらかじめ洗っておいた10mg/mlストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ400μlを加えて20分間静置し、試料をビーズに吸着させた。その後、ビーズを蒸留水で洗浄し、蒸留水を400μl加えた後、以下の表５に示す組成の反応液を加えた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
なお、表５におけるC1S-FAMプライマーの配列は5'-6FAM -GTACATATTGTCGTTAGAACGC-3'（配列番号７）である。
【００７７】
96ウェルマイクロタイタープレートにあらかじめ１μl（10 pmol/μl）の標的特異的プライマー（第17番染色体に基づいて設計した60プライマーとＸ染色体に基づいて設計した132プライマー（約1.3 Mbp毎に１プライマー）を計192プライマー）を分注しておいた。なお、標的特異的プライマーの配列は、第17番染色体に基づいて設計した60プライマーは図１０Ａ及びＢに示すプライマー番号１〜６０のプライマーセット（配列番号８〜67に示される塩基配列を有する）であり、Ｘ染色体に基づいて設計した132プライマーは図１１Ａ〜Ｄに示すプライマー番号１〜１３２のプライマーセット（配列番号68〜199に示される塩基配列を有する）である。
【００７８】
その96ウェルマイクロタイタープレートに、前記反応液をそれぞれ９μlずつ分注し、PCR反応を行った。PCR反応は以下の条件で行った。すなわち、TaqGold 活性化のため95℃で10分反応させた後、95℃で30秒、65℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして５サイクル、次に95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして５サイクル、次に95℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして10サイクル、最後に95℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で１分のサイクルを１サイクルとして30サイクル行った。反応終了後、72℃で30分保温した。
【００７９】
上記反応液に蒸留水をくわえて80μlにし、さらに希釈したサンプルにマーカーミックス（DNAシークエンサー3730用のサイズマーカーを蒸留水で希釈したもので、そのサイズマーカーはGeneScanTM-500LIZTM SizeStandard（Applied Biosystems社; Cat.No. 4322682）を使用）を20μlずつ加え、95℃で５分加熱した。加熱後、DNAシークエンサー3730（Applied Biosystems社）にかけた。
【００８０】
その結果、図２Ａに示す蛍光強度のピークが得られた。図２Ａにおいて、白色のピークは標準DNA（Fmix）のもの、黒色のピークはＸ染色体数異常DNAのものである。このピークの蛍光強度に基づいて以下の式に当てはめて、それぞれの染色体部位におけるDNAコピー数を求めた。
【００８１】
測定用DNAのコピー数＝
２×試料P2の蛍光強度/（試料P1の蛍光強度＋２×試料P3の蛍光強度）
【００８２】
図３に、FmixのFmixに対する比とMmixのFmixに対する比を示す結果を示す。この結果から、Fmix：Fmixではゲノムコピー数が１：１であるＸ染色体が、Fmix：Mmixの場合は１：0.5になっていることがわかる。
【００８３】
同様にMmix、47,XXX、48,XXXX、49,XXXXX（表３の(a)(b)(c)(d)(e)）のそれぞれのDNAコピー数を、図１０Ａ及びＢ、並びに図１１Ａ〜Ｄに示される配列番号８〜199のプライマーを用いて測定し、第17番染色体由来の標準DNAに対する測定用DNAのDNAコピー数に対して、Ｘ染色体由来の標準DNAに対する測定用DNAのDNAコピー数の平均を算出すると、それぞれ図４のようにコピー数の増加に伴い、蛍光強度が一次関数的に増加した。
【実施例２】
【００８４】
MYCN 遺伝子DNA増幅例における、増幅領域の絞り込み
以下の表６に示す神経芽細胞腫の細胞株（いずれも千葉がんセンターより供与を受けた）のうち、MYCN遺伝子（第２番染色体短腕（2p24.3）に位置）のゲノムDNAに増幅の見られない細胞株（A群）とMYCN遺伝子のゲノムDNAの増幅が分かっているもの（B群）について、その近傍のゲノムコピー数を測定した。まずMYCN遺伝子の近傍である第２染色体短腕（2p25.3）から長腕（2q14.3）に約1.3メガ塩基（Mbp）ごとに１箇所ずつ、全部で96セットのプライマーを作成した（図５）。これらのプライマーセットの配列は、図１２Ａ〜Ｃにおけるプライマー番号１〜96（配列番号200〜295）に示す。アダプターは実施例１と同様のもの（配列番号１〜６）を用い、標準DNAとして実施例１で調製したMmixを用いた。アダプター連結、PCR及び検出は実施例１と同様に行った。
【００８５】
【表６】
【００８６】
その結果、Ａ群では見られなかったMYCN 遺伝子のゲノムDNAの増幅をＢ群の細胞株全てにおいて、主にMYCN近傍の狭い範囲で増幅が見られた（図６に例を示す）。ここで、範囲を2p24.3から2p24.2までの3.1 Mbpに絞り（図７）、約48 kbpごとに１箇所ずつ、全部で72プライマーを設計し、同様の解析を行った。このプライマーの配列を図１３Ａ及びＢにおけるプライマー番号１〜72（配列番号296〜367）に示す。
【００８７】
その結果、Ｂ群の細胞株において、MYCN近傍でのゲノムDNA増幅は同様に見られたが、細胞株によってその増幅範囲が異なっていることがわかった（図８Ａ及び８Ｂ）。またこのような増幅領域の絞り込みを行うことによって、神経芽細細胞腫Ｂ群の全てに共通する増幅領域はMYCN遺伝子のみであることが確認された。そのまとめを図９に示す。このことから、MYCN遺伝子ゲノムDNAの増幅が神経芽細胞腫において、重要な役割を果たしているということが示唆される。
【００８８】
また、本実施例のように、染色体上に一定間隔をおいてプライマーを設計し、標準DNAと特定の状態にある被験体又は被験細胞（本実施例においては繊維芽細胞腫の細胞株）由来のゲノムDNAとを用いて本発明の方法を実施することにより、ゲノムDNAのコピー数が増幅又は低減されているゲノム上の領域を特定することができる。従って、本発明の方法を用いて、特定の状態とゲノムDNAのコピー数との相関を調べることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、ゲノムDNAコピー数の測定方法が提供される。本発明は、染色体の標的領域のコピー数を高精度に測定することができるため、特定の疾患に関与する遺伝子の検出等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の方法において、蛍光強度として増幅産物量を表わした場合のグラフ（Ａ）と、蛍光強度に基づいて標準曲線を作成し、ゲノムDNAのコピー数を求める概要（Ｂ）を示す図である。
【図３】正常女性のDNAと正常男性のDNAとの比較を行った結果を示すグラフである。
【図４】Ｘ染色体数異常を有する測定用DNAと標準DNAとを比較して、常染色体とＸ染色体の比較値平均を表した結果を示すグラフである。
【図５】第２番染色体上の最初にプライマーを設計した実験領域を示した図である。
【図６】第２番染色体上に最初に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図７】第２番染色体上の２回目にプライマーを設計した実験領域を示した図である。
【図８Ａ】第２番染色体上に２回目に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】第２番染色体上に２回目に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図９】MYCN遺伝子付近のゲノムDNAのコピー数の増幅領域を、細胞株毎にまとめた図である。
【図１０Ａ】第17番染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１０Ｂ】第17番染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ａ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｂ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｃ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｄ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ａ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ｂ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ｃ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１３Ａ】第２番染色体上の一定領域（2p24.3から2p24.2までの3.1Mbpの領域）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１３Ｂ】第２番染色体上の一定領域（2p24.3から2p24.2までの3.1Mbpの領域）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１〜３６７：合成オリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムDNAのコピー数の測定方法に関する。また本発明は、染色体数を測定する方法、及び神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法に関する。さらに本発明は、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムDNAコピー数を測定するには、一般にtwo-color fluorescence in situ hybridization（FISH）法をベースにしたcomparative genomic hybridization（CGH）法（例えば、非特許文献１）、マイクロアレイを利用したアレイCGH法（例えば非特許文献２及び３）、マイクロサテライトマーカー部位のloss of heterozygosity（LOH）を利用したpolymerase chain reaction（PCR）による検出（例えば非特許文献４及び５）などが広く用いられている。
【０００３】
FISHベースのCGH法では、染色体に直接DNA（プローブ）をハイブリダイゼーションさせそれを顕微鏡で観察するという手法のため感度に限界があり、また実験的誤差が生じやすいなどの欠点がある。また近年、マイクロアレイを利用したアレイCGH法による網羅的な染色体異常を調べる手法（非特許文献３）が使われているが、この手法は試料DNAを増幅しなくてはならず、まだ難易度の高い手法であり、限られた研究室のみでしか行えない状況である。前記２つの手法はハイブリダイゼーションを基本にした手法であり、非特異的結合によるバックグラウンドや蛍光による感度の統一など、課題も多い。マイクロサテライトマーカーを利用したPCRによる検出では、PCRを利用した手法のため簡便であるが、マイクロサテライトマーカーの存在する染色体部位でのLOHのみしか検出が可能ではなく、またそのマイクロサテライト長が母由来DNAと父由来DNAとで同じDNA長であれば解析ができないなど、測定に限界がある。
【０００４】
一方、核酸にアダプターを付加した後に競合的にPCR反応を行う技術として、今までにadaptor-tagged competitive PCR法（ATAC-PCR法）（特許文献１）が報告されており、これは標準曲線や内部標準の作製などの煩雑なステップを必要としないで、遺伝子の相対的な発現量比を測定することができるため注目されているが、これは遺伝子の3’末端にポリＡ鎖を持つcDNA特有の手法であり、ゲノムDNAの検出には用いることができない。
【０００５】
ゲノムコピー数の測定は、例えば染色体数異常を検出したり、特定の状態において遺伝子のゲノムコピー数が増幅されていることが知られている場合にその状態を検出するために必要である。従って、ゲノムDNAコピー数を測定するための簡便かつ高精度の方法が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３３７２００号公報
【非特許文献１】Kallioniemi, A. et al. Science第258巻, 第818-821頁, 1992年
【非特許文献２】Pollack J.R., et al. Nature Genetics 第23巻, 第41-46頁, 1999年
【非特許文献３】インビトロジェン社ホームページ（http://www.invitrogen.com/）におけるBioPrime(登録商標)アレイCGHゲノムラベリングシステムの説明
【非特許文献４】「PCR法最前線 基礎技術から応用まで」における「STSの解析−マイクロサテライトマーカー」の章, 蛋白質 核酸 酵素, 第41巻（1996年4月号増刊）, 第618-622頁, 1996年
【非特許文献５】Morimoto O., et al. Journal of Hepatology 第39巻, 第215-221項, 2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ高精度なゲノムDNAコピー数の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、被験試料のゲノムDNA及び標準のゲノムDNAをそれぞれ制限酵素切断し、それらを区別可能なように異なるアダプターを付加し、得られたアダプター付加ゲノムDNAを混合し、再度制限酵素切断を行ってから増幅反応を行うことによって、増幅産物の量に基づいて被験試料ゲノムDNAの標準ゲノムDNAに対する量比を測定することができ、またその測定結果からゲノムDNAコピー数を測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の１〜４である。
１．以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【００１０】
上記方法において、第１の制限酵素としては、メチル化の影響を受けないものを用いる。また、第１の制限酵素としては、付着末端切断型の６塩基認識酵素を用いることが好ましく、例えば、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRI等からなる群より選択することができる。さらに第２の制限酵素としては、４塩基認識酵素を用いることが好ましく、例えば、MboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaI等からなる群より選択することができる。
【００１１】
上記方法において、種類の異なるアダプターとして、互いに長さの異なるヌクレオチドを用いることができる。また、アダプターにはビオチンが付加されていてもよい。
【００１２】
上記方法においては、ステップ（ｅ）でゲノムDNAを切断した後、アダプターが付加されているDNA断片を回収し、ステップ（ｆ）の増幅反応を行ってもよい。
【００１３】
また上記方法のステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加することができる。
上記方法のステップ（ｄ）において、標準DNAの濃度及び測定用DNAの濃度を調整して混合することができる。
【００１４】
またステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加し、ステップ（ｄ）において、少なくとも２群の標準DNAの濃度を段階的に調整して混合することが可能である。
【００１５】
さらに上記方法のステップ（ｆ）においては、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いて増幅反応を行う。ここで使用するプライマーは蛍光標識することが好ましい。また、ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の蛍光量に基づいてゲノムDNAのコピー数を測定することができる。
上記方法においては、ゲノムDNAのコピー数が正常であるか否かを測定することができ、好ましくはゲノムDNAのコピー数が１、２、３、４又はそれ以上であることを測定する。
【００１６】
上記方法において、被験試料としては、染色体数異常が疑われる被験体又は被験細胞を用いることができる。
また、コピー数を測定する対象となるゲノムDNAとしては、Ｘ染色体のゲノムDNA、MYCN遺伝子のゲノムDNA、癌組織由来のゲノムDNAなどが挙げられる。
【００１７】
２．以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと測定対象染色体に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から該染色体のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、染色体数を測定する方法。
【００１８】
３．以下のステップ：
（ａ）被験体由来のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーとMYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、被験体の神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法。
【００１９】
４．以下のステップ：
（ａ）特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと、ゲノムDNA上のある領域を増幅できるように設計されたプライマーとを用いて増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定するステップ
を含む、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法。
【００２０】
上記方法において、特定の状態としては、限定されるものではないが、癌及びゲノムコピー数異常に起因する遺伝性疾患が挙げられる。
【００２１】
また、ステップ（ｆ）においては、プライマーをゲノムDNA上に４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計することが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ゲノムDNAコピー数の測定方法が提供される。本発明は、ゲノムDNAの標的領域のコピー数を、ゲノムDNAコピー数（染色体数）が正常か異常かだけではなく、コピー数そのものを高精度に検出することができるため、特定の疾患に関与する遺伝子の検出等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コントロールとして使用される標準のゲノムDNA（「標準DNA」という）と、被験試料に由来するゲノムDNA（「測定用DNA」という）とを混合して同一の反応系で増幅させることにより、標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定し、得られる測定結果を指標としてゲノムDNAのコピー数を測定することを特徴とするものである。ここで「ゲノムDNAのコピー数」とは、被験試料（被験体、被験組織、被験細胞など）の細胞１つ当たりの、測定対象の領域のゲノムDNAのコピー数を意味し、例えば、ヒトの正常細胞における常染色体のゲノムDNAは２コピーである。また、例えば繊維芽細胞腫の細胞株の一部においてはMYCN遺伝子のゲノムDNAのコピー数が増幅されることが知られており、その場合、繊維芽細胞腫の細胞株においては、MYCN遺伝子のゲノムDNAのコピー数は２以上となる。
【００２４】
上述の通り、PCRによる遺伝子発現の検出を行う場合は、内部基準として標的分子と同様の増幅効率を有するDNA断片を用いて、標的分子とは別の反応系で検量線を作成する対照実験を行わなければならない。この操作を、標的分子が含まれる単一の反応系で行うことができれば、簡単に、かつ少ない誤差で検出結果を得ることができる。本発明は、標準DNA及び測定用DNAのそれぞれに種類の異なるアダプター配列を付加し、このアダプター配列が付加されたゲノムDNAを混合した後、測定しようとするゲノムDNA領域以外の非特異的な配列を除去し、続いてゲノムDNAを増幅し、増幅されたDNA量比を求めることを特徴とするものであり、いわゆる競合ゲノムPCRと呼ばれる。
【００２５】
１．ゲノムDNAのコピー数の測定方法
以下、本発明の方法の各ステップについて説明する。
（ａ）ゲノムDNAの調製
図１に示すとおり、まず、ゲノムDNA試料を少なくとも２種類調製する。具体的には、少なくとも１種の測定用DNAと少なくとも１種の標準DNAを調製する。
【００２６】
測定用DNAは、被験試料から調製したゲノムDNA、すなわちそのコピー数の測定が望まれる被験試料のゲノムDNAであれば特に限定されるものではない。例えば測定用DNAは、各種疾患臓器由来のDNAまたは各疾患血液由来のDNA等が挙げられる。また、測定用DNAは１種類でもよいし、又は２種以上でもよいが、１〜５種を使用することが好ましい。２種以上の測定用DNAを用いる場合は、それらは異なる組織又は細胞由来のものであってもよいし、同一の組織又は細胞由来のものでもよい。例えば、同一種のDNAであるが時期の異なるもの（例えば原発癌由来のゲノムDNAと転移癌由来のゲノムDNA等）を測定DNAとして選択することができる。
【００２７】
一方、標準DNAは、測定用DNAとは異なる種類のゲノムDNAであり、測定用DNAの種類に応じて適宜選択されるが、本発明においては、ゲノムのコピー数（染色体数）が正常のものであるのが好ましい。従って、例えば測定用DNAをヒト神経芽細胞腫細胞株抽出液由来のものとした場合は、標準DNAはヒト正常血液抽出液由来のものを使用することができる。また測定用DNAを、Ｘ染色体数異常を有する細胞又は組織から調製する場合には、標準DNAは染色体異常を有しない正常女性に由来するDNA（Ｘ染色体のコピー数２）又は男性に由来するDNA（Ｘ染色体のコピー数１）を用いることができる。
【００２８】
ゲノムDNAの調製は、当技術分野で公知の方法、例えばフェノール・クロロホルム法等を用いて行うことができる。
【００２９】
上述の通り、本ステップでは、複数種のゲノムDNAを用いることができるが、以下のステップについては、便宜上、被験試料に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準のゲノムDNA（標準DNA）のそれぞれ１種類、合計２種類を使用する場合を例に説明する。
【００３０】
（ｂ）ゲノムDNAの切断
次に、特定の制限酵素（制限酵素Ａ）で標準DNA試料及び測定用DNA試料中のゲノムDNAをそれぞれ切断する。ただし、制限酵素Ａは、試料（特に哺乳動物由来の試料）によってはゲノムDNAが生物種特有のメチラーゼによってメチル化されている場合もあるため、メチル化の影響を受けない制限酵素が好ましい。また、制限酵素Ａは、ステップ（ｃ）におけるアダプター付加反応を簡便にするため、付着末端切断型のものが好ましい。具体的には、付着末端切断型の６塩基認識酵素として、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRIを例示することができる。また、メチル化の影響を受けず、付着末端切断型の６塩基認識酵素として、PstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、及びKpnIを例示することができる。ただし、本発明においては、ゲノムDNAを断片化することのできる制限酵素であれば、特に限定されるものではない。なお、哺乳動物以外のゲノムDNAを使用する場合でも、DNAのメチル化に留意して、制限酵素選択をするのが望ましい。
【００３１】
（ｃ）アダプターの調製と付加
本発明は、前記の通り、種類の異なるアダプターが付加されたDNAを同一の反応系、すなわち同一の反応試験管内において一度に測定することを特徴とするものである。異なる種類のアダプターとは、増幅を行った際に増幅されたゲノムDNAを区別することができるように設計されたオリゴヌクレオチドを意味する。このアダプターは、ゲノムDNAの制限酵素Ａ切断部位に連結できるように二本鎖として設計されることが好ましい。そのため該アダプターは、標準DNAに付加するアダプターと測定用DNAに付加するアダプターの種類が異なるように設計する。
【００３２】
これらのアダプターは、アダプターが付加されたゲノムDNAを用いた増幅反応により得られる増幅断片を互いに区別し得るものであればアダプターの種類に限定されるものではなく、例えばオリゴヌクレオチド長の異なるもの等が挙げられる。なお、アダプターは、化学合成により得ることができ、また、アダプターを蛍光標識又は放射性同位元素により標識しておくこともできる。
【００３３】
本発明において使用されるアダプターの一例は、互いに共通する配列を作製し（共通配列１；図１の（ｃ）のアダプターにおいて太く「−」で示した部分）、次に、一方の配列に、さらに３〜15塩基の配列（スペーサー）を付加して両アダプターを長さにより区別できるようにする。この場合、付加する配列は、増幅に用いられるアダプタープライマーが付加する位置とゲノムDNAの付着末端（ステップ（ｂ）の制限酵素処理により得ることができる）とアニーリングすることができる突出部の一本鎖の配列（付着末端配列という）との間に位置するように作製する（図１の（ｃ）において、アダプターAP2及びAP3において太く破線（・・・）で示した部分）。
【００３４】
なお、アダプターが付加した試料のみを回収できるようにするため、アダプターには、ある特定の物質が特異的に反応する物質を付加しておくことが好ましい（図１）。例えば、抗原と抗体、酵素と基質、ビオチンとアビジンのような特異的に反応する物質の一方を付加する。図１には、ビオチン（「b-」）が付加されているアダプターを例示した。
【００３５】
本発明において同一の反応系に使用することのできるアダプターの数（種類）は特に限定されるものではないが、２〜７種類、好ましくは６種類までである。従って、使用するアダプターの種類の範囲内で、標準DNAに付加すべきアダプターの種類と、測定用DNAに付加すべきアダプターの種類とを適宜選択することができる。例えば、１種類の測定用DNAを測定の対象とする場合は、測定用DNAに付加すべきアダプターは１種類となる。
【００３６】
本発明の一実施形態において、標準曲線を作成するには少なくとも２つのデータを得ることが必要であり、また測定用DNAと標準DNAを完全に区別することを考慮して、標準DNAは少なくとも２つの群を用いることが好ましい。ここで、標準DNAの群は、濃度が異なる群であることが好ましく、特に段階的に濃度調整された群であることが好ましい。ここで、「段階的に濃度調整された」とは、それぞれ１倍量及び0.5倍量、又は２倍量及び１倍量などのように、段階的に濃度を調整した標準DNAを意味する。
【００３７】
従って、１種類の測定用DNAと濃度が異なる２群の標準DNA（種類は１種類）を使用する場合、アダプターの種類は少なくとも３種類必要となる。また、標準DNAを段階的に濃度調整した２以上の群として用いる場合には、各濃度のゲノムDNAのそれぞれに、種類の異なるアダプターを付加する。例えば、図１においては１倍量及び0.5倍量に段階的に調整した標準DNA（それぞれP1及びP3）に、それぞれ長さの異なるアダプターAP1及びAP3を付加する（図１の（ｃ））。但し、ゲノムDNAの各群の濃度調整は特定の濃度比に限定されるものではなく、標準曲線を作成するため、又は測定用のDNAと区別するために最も良い条件（濃度比）を設定することができる。従って、アダプターの種類が２種類の場合は、１：1.5、１：２などのように、任意に濃度を設定することができる。一方、アダプターAP2が付加された測定用DNAは、通常は１倍量に調製する。なお、「１倍量」とは、段階的に濃度調整するときの基準量をいう。
【００３８】
本発明において、アダプターにおける共通配列は30〜40塩基を最小単位とする。従って、上記スペーサーの配列を変えることにより、種々の長さのアダプターを作製することができる。例えば、３種類のアダプターを使用する場合は、最小のアダプターの長さは30〜40塩基とし、これに適当な長さのスペーサーヌクレオチド（２〜４塩基）を順次付加しながら、付着末端配列を除く最短の配列を有するアダプターとして塩基数30〜40のものを、付着末端配列を除く最長の配列を有するアダプターとして34〜48塩基のものを作製することができる。その結果、上記スペーサーの配列の長さに応じて全体の長さの異なるアダプターを得ることができ、これにより後述のPCR産物を区別することができる。これらのアダプターは、公知の手法により、例えばApplied Biosystems社のDNA合成装置を用いた化学合成により得ることができる。なお、上記したアダプター数、オリゴヌクレオチド数等によって本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３９】
次に、測定用DNAにアダプターを付加する。２種以上の測定用DNAを用いる場合には、測定用DNAそれぞれに、それぞれ異なる種類のアダプターを付加する。同様に、標準DNAの各群にも互いに異なる種類のアダプターをそれぞれ付加する（図１の（ｃ））。本発明においては、測定用DNAに付加するアダプターの量が不足しないようにするため、アダプターを各試料に過剰に混合するが、過剰なアダプターが後の増幅反応を阻害しないために、DNAとアダプターの比を1:50〜500（モル比）にするのが望ましい。
【００４０】
アダプターとゲノムDNAとの連結、及びその後のステップを、標準DNAとして１種類を選択し、その濃度が異なる２群を用い、測定用DNAとして１種類を選択した場合を例として以下に説明する（図１）。
【００４１】
（ｄ）アダプター付加測定用DNAとアダプター付加標準DNAの混合
前記のようにしてアダプターが付加されたゲノムDNAを含む標準DNAと測定用DNAとをそれぞれ混合する。ここで、混合する標準DNAと測定用DNAとの比は、その比を認識している限り、特に限定されるものではない。例えば、１種類の標準DNA（１群）と１種類の測定用DNAを用いる場合には、それらを１：１、１：0.5、0.5：１など、任意の比で混合することができる。また、１種類の標準DNAの濃度が異なる２群と１種類の測定用DNAを用いる場合には、標準DNAを用いて標準曲線を作成することを考慮すると、２群の標準DNAの混合濃度を段階的に調整し、測定用DNAと混合することが好ましい。
【００４２】
（ｅ）アダプター付加されたゲノムDNAの切断
続いて、ステップ（ｄ）で混合した標準DNAと測定用DNAを制限酵素（制限酵素Ｂ）で切断する（図１の（ｅ））。このときに使用する制限酵素Ｂは、制限酵素Ａの場合と同様に、試料によってはゲノムDNAがメチラーゼによってメチル化されている場合もあるため、メチル化の影響を受けない制限酵素が好ましい。また、制限酵素Ｂは、前記の制限酵素Ａの認識配列よりも認識配列の短いものが好ましい。例えば、前記の制限酵素Ａにおいて６塩基認識酵素を使用した場合（例えばPstIの認識配列は６塩基（CTGCAG）である）、当該制限酵素Ｂは認識配列が４塩基のもの（例えばMboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaIなど）を使用する。これは、ゲノムDNAがcDNAに比べて長く、その分、後述する増幅反応において類似配列が多いために増加すると予想されるプライマーの非特異的結合を防ぐためである。
【００４３】
ステップ（ｃ）においてゲノムDNAにアダプターを付加する際、アダプターに、ある特定の物質及びその物質と特異的に反応する物質のうちいずれか一方（例えば抗体に対する抗原、酵素に対するその基質、ストレプトアビジンに対するビオチン等）を付加する。そのようなゲノムDNAを制限酵素Ｂで切断した場合、アダプターが付加されたゲノムDNA断片と、アダプターが付加されていないゲノムDNA断片に切断されることになる。そして、上記物質の他方を用いて（例えば、図１のようにビオチンをアダプターに付加した場合にはストレプトアビジンを反応容器の固相に固定しておく等）、アダプターが付加されたゲノムDNA断片のみを回収することができる。すなわち、制限酵素Ｂ−制限酵素ＢのDNA断片が特異的に取り除かれる。これは制限酵素Ｂの認識配列が制限酵素Ａの認識配列よりも短いため、ゲノムDNA中に含まれる頻度が高くなり（概算認識配列出現頻度（平均）；制限酵素Ａ：制限酵素Ｂ＝１／4096：１／256）、ゲノムコピー数の測定対象となる制限酵素Ａの認識配列近傍のみを残しやすいからである。
【００４４】
（ｆ）ゲノムDNAの増幅
前記のようにしてアダプター付加された後に切断されたゲノムDNAを含む標準DNAと測定用DNAの混合物を鋳型として競合的に増幅反応を行う（図１の（ｆ））。増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により行うことができるが、プライマーを用いる増幅反応であれば特に限定されるものではない。
【００４５】
プライマーとしては、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いることができる（図１の（ｆ））。「アダプターに特異的なプライマー」とは、前記設計されたアダプターの配列と相補的な配列を有し、かつハイブリダイズすることができるプライマーである。また、「測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマー」とは、コピー数測定の対象となるゲノムDNA上の領域にハイブリダイズすることができるプライマーである。例えば、Ｘ染色体のゲノムDNAコピー数を測定する場合には、Ｘ染色体上の任意の領域の配列に相補的な配列を有し、当該領域にハイブリダイズすることができるようにプライマーを設計する。またMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定する場合には、MYCN遺伝子を増幅することができるように該遺伝子の両末端に基づいてプライマーを設計する。
【００４６】
プライマーの設計は、当技術分野の公知のプライマー設計法に従って行うことができる。その際、標的に特異的なプライマーは、下記の条件を満たすことが好ましい：
（１）制限酵素Ａの切断部位から５〜100塩基以内、好ましくは15〜65塩基以内の領域にハイブリダイズするプライマーであること；
（２）プライマーのハイブリダイズする領域がゲノムDNA上で特異的であること、すなわちプライマーの少なくとも3’末端が測定対象領域以外の他の領域にハイブリダイズしないこと；
（３）プライマーによって増幅される測定対象領域又は制限酵素Ａの認識配列内に多型（例えばSNP）が存在しないこと；
（４）プライマーのハイブリダイズする領域及び制限酵素Ａの認識配列と上記領域の間が制限酵素Ｂの認識配列内ではないこと。
【００４７】
また本発明においては、増幅反応後の増幅産物の長さをそろえるために、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーの5'末端にGTという塩基をつけることが望ましい。これは、増幅の伸長工程の際に、プライマーの5'末端のGTに相補的なACにまで伸長が進むと、DNA ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性が最も強く働き、最後にAを付加して伸長反応が停止するという作用があるためである。それにより増幅産物の長さが安定し、後述するステップにおいて増幅産物の区別が容易になる（Clark JM. Nucleic Acids Research. 第16巻, 第9677-9686頁,1988 年, Brownstein MJ, et al. Biotechniques. 第20巻, 第1004-1010頁,1996 年）。
【００４８】
各プライマーは、15〜50塩基、好ましくは20〜25塩基の長さを有するものであり、例えば化学合成により得ることができる。
【００４９】
本発明においては、増幅反応後の増幅産物が検出機により検出されるように、アダプター特異的なプライマーに適当な標識をしておくことが好ましい。標識物質としては、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン等）、放射性物質（例えば32P、35S等）、酵素標識などが挙げられる。これらの標識物質のプライマーへの標識は、公知手法に従って行うことができる。標識は、上記のアダプターに特異的なプライマー及び測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーのいずれに付加してもよく、又は両方のプライマーに付加してもよいが、図１の（ｆ）に示すようにアダプターに特異的なプライマーを標識することが好ましい。
【００５０】
なお、増幅反応のサイクル数や温度条件等は適宜定めることができる。例えば、PCRにより増幅反応を行う場合、増幅の条件は、90℃〜98℃で15秒〜１分、好ましくは94℃で20秒の変性工程、37℃〜72℃で15秒〜１分、好ましくは50℃で40秒のアニーリング工程、及び50℃〜75℃で15秒〜１分、好ましくは72℃で40秒の伸長工程を１サイクルとしてこれを30〜40サイクル、好ましくは35サイクル行う。但し、Taq Gold（Perkin-Elmer社）を使用する場合は、上記増幅サイクルの前に95℃で10分の活性化工程を加えることが好ましく、また、増幅されたDNAのうち未伸長断片を完全に伸長させるために、増幅サイクルの後に72℃で10〜30分の伸長工程を加えることが望ましい。さらに、測定を別の日に行うことができるようにするために、増幅産物を凍結保存（例えば−20℃）することもできる。
【００５１】
（ｇ）増幅産物の検出
得られた増幅産物の検出は、種々の方法により行うことができる。例えば、PCRに使用するプライマーに予め蛍光色素等を標識したときは蛍光強度として検出することができ、放射性物質で標識したときはＸ線フィルムに感光後デンシトメーターで検出することができる。また、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物のバンドの強度を測定することもできる。例えば、増幅産物が蛍光標識されている場合には、Applied Biosystems社製シークエンサーを用いて検出することができる。
【００５２】
標準DNAと測定用DNAに基づく増幅産物は、ステップ（ｃ）において付加したアダプターの種類に基づいて区別することができる。例えば、ステップ（ｃ）において、長さが異なるヌクレオチドからなるアダプターを使用した場合には、得られる増幅産物の長さに基づいて標準DNAと測定用DNAの増幅産物を区別する。
【００５３】
また、段階的に濃度調整した標準DNAの各群にそれぞれ異なる種類のアダプターを連結（付加）した場合、アダプターが付加された標準cDNAの各群は、増幅反応後の測定ステップにおいて、アダプターの種類に対応して区別して検出することができる。本発明の方法は、この標準DNAの区別された各測定値に基づいて標準曲線（例えば１次関数、２次関数等の数学的関数）を作成し、その標準曲線と測定用DNAの測定値を比較することにより、標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定することができる。
【００５４】
（ｈ）ゲノムDNAコピー数への変換
上記ステップ（ｇ）において標準DNAに対する測定用DNAの量比を測定した後、その結果に基づいて、ゲノムDNAのコピー数を測定する。例えば、１倍量及び0.5倍量に濃度調整した標準DNAの測定結果（蛍光強度）が、図２Ａに示すように、アダプター長の違いによりピークの位置を異にしてそれぞれP1及びP3のように表れたとすると（図２のＡ、白色の２つのピーク）、標準曲線は図２Ｂに示すように作成することができる。図２Ｂのグラフは１次関数として表すことができるので、測定用DNAの蛍光強度を当該関数の式に代入することにより、測定用DNAは標準DNAに対して何倍量存在しているかを知ることができる。例えば、図２Ｂにおいて、P2について得られた蛍光強度値が12000であるとすると、図２Ｂの標準曲線により、倍率は１となる。従って、測定用DNAは、標準DNAに対して１倍量で存在していることが分かる。標準DNAを調製した細胞の１細胞当たりの染色体DNA、すなわちゲノムDNAは既知であるため、それに基づいて測定用DNAのゲノムDNAのコピー数を求めることができる。例えば標準DNAのゲノムDNAコピー数が２コピーの場合には、図２Ａ及びＢに示す結果に基づいて、測定用DNAのゲノムDNAのコピー数は２コピーと測定することができる。本発明の方法により、測定対象のゲノムDNAのコピー数が、０、１、２、３、４、又はそれ以上であることを測定することができる。
【００５５】
２．ゲノムDNAコピー数の測定の応用
（１）染色体数の測定
染色体数は、種々の疾患に関与することが知られている。例えば、２１番染色体が３本存在する場合（正常は２本）はダウン症候群に関与している。また、Ｘ染色体（正常女性は２本）が１本存在する場合はターナー症候群に関与し、Ｘ染色体が１〜３本とＹ染色体（正常男性は１本）が１〜２本存在して、合計の性染色体数が３本以上の場合はトリプルＸ症候群やクラインフェルター症候群に関与する。
【００５６】
従って、本発明において、ステップ（ｆ）の増幅反応において、コピー数を測定しようとする測定対象染色体に特異的なプライマーを用いることによって、染色体数を測定することができる。このように染色体数を測定できることによって、遺伝性疾患の診断を補助したり、染色体数異常と特定の状態との相関を調べることが可能となる。
【００５７】
（２）神経芽細胞腫の予後予測の判定
MYCN遺伝子は、神経芽細胞腫の一部の細胞株においてそのゲノムDNAのコピー数が増幅されることが報告されている（Schwab M. Pathological Oncology Research 第3巻,第3-7頁, 1997年, Zanzen Y., et al. Journal of Pediatric Surgery 第33巻,第1765-70頁, 1998年）。また、MYCN遺伝子のゲノムDNAが増幅している症例では神経芽細胞腫の予後が悪いことが知られ、そのためMYCN遺伝子は予後予測のマーカーとして使用されている（Schwab M. Annals of the New York Academy of Science.第963巻,第63-73頁, 2002 年）。従って、ステップ（ｆ）の増幅反応において、MYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いることによって、MYCN遺伝子のコピー数を測定し、その結果から神経芽細胞腫の予後リスクを予測することが可能となる。
【００５８】
（３）ゲノムDNAのコピー数と特定の状態との相関
本明細書の実施例２に示すように、ゲノムDNA上にプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準DNAとを増幅することにより、そのプライマーにより増幅された領域のゲノムDNAコピー数が増大しているか又は低減しているかを判定することができる。従って、例えば、ゲノムDNA上に一定の間隔をおいて複数のプライマーを設計し、それらのプライマーを用いて、特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と標準DNAとを増幅し、増幅産物量に基づいて、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定することによって、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定することが可能となる。
【００５９】
プライマーは、ゲノムDNA上に、例えば４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計することができる。また例えば、１〜２Mbpの間隔をおいて設計したプライマーを用いて増幅反応を行い、ゲノムDNAのコピー数の増大又は低減が存在する可能性があると判断した領域において、再度、１〜２Mbpより狭い間隔（例えば４kbp〜１Mbp間隔）でプライマーを設計し、そのコピー数の変化が存在する領域を絞り込んでもよい。
【００６０】
ゲノムDNAのコピー数の変化と相関を判定する特定の状態は、任意の状態でよく、例えば限定されるものではないが、疾患又は障害（癌、遺伝性疾患等）などが挙げられる。
【００６１】
被験体又は被験細胞は、特定の状態を示すものであれば特に限定されるものではなく、動物、植物、真菌、細菌などが含まれる。また、被験細胞も、天然に存在する細胞（動物、植物、真菌、細菌由来の細胞）だけではなく、天然に存在する細胞の変異株、人工的に確立した細胞系統・細胞株などであってよい。被験体及び被験細胞からゲノムDNAを調製する方法は当技術分野で周知である。
【００６２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
Ｘ染色体数異常の症例のゲノムコピー数の測定
本実施例においては、Ｘ染色体数の異常細胞株由来DNAを用いて、ゲノムコピー数の測定を行った。
（ａ）ゲノムDNAの調製
目的とするＸ染色体数の異常細胞株由来DNA（以下に示す核型のもの）をCoriell Cell Repositories（URL; http://locus.umdnj.edu/ccr/）より購入し、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝25：24：１混合液（Giboco-BRL）を用いてゲノムDNAを抽出した：
異常細胞株由来DNA核型
47,XXX（Ｘ染色体数３：アクセッション番号NA04626）、
48,XXXX（Ｘ染色体数４：アクセッション番号NA01416）、
49,XXXXX（Ｘ染色体数５：アクセッション番号NA06061）
（以下それぞれを47,XXX、48,XXXX、49,XXXXXと称する）。
【００６４】
また、正常男性由来の血液（46,XY：Ｘ染色体数１）10例と正常女性由来の血液（46,XX：Ｘ染色体数２）10例からそれぞれゲノムDNAをフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝25：24：１混合液（Giboco-BRL）で抽出し、それぞれ等量ずつ混合して、正常女性由来DNA混合試料（Fmix）と正常男性由来DNA混合試料（Mmix）を作製した。DNA試料はそれぞれ0.1μg/μlに調製した。
【００６５】
（ｂ）ゲノムDNAの切断
次にDNAを制限酵素（PstI）で切断した。具体的には、下記表１に示す反応組成液を37℃で１時間〜４時間加熱して酵素反応を行った後、70℃で20分間加熱し、酵素を失活させた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（ｃ）アダプター付加反応
氷上に移した後、得られたDNA ４μlに以下の表２に示すアダプター付加反応用試薬を加えた。また、使用した試料（DNA）とアダプターの組み合わせは、表３に示す通りである。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
なお、アダプターの配列は以下の通りであり、アダプターにビオチン標識を付加した：
PT-5: biotin- 5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖；配列番号１）
5'-AGTATGGATTGACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号２）
PT-6:biotin-5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖；配列番号３）
5'-AGTATGGATTGAGTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号４）
PT-7:biotin-5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCTATACTCAATCCATACTTGCA-3'（+鎖;配列番号５）
5'-AGTATGGATTGAGTATAGCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'（-鎖；配列番号６）
【００７１】
（ｄ）混合
（ｃ）で調製した反応液を16℃で一晩保温し、その後各試料を上記の表３の通り、濃度を調整して、すなわち試料P1：P2：P3が１：１：0.5となるように混合した。
【００７２】
（ｅ）アダプター付加されたゲノムDNAの切断
（ｄ）で調製した混合物をカラム精製（QIAGEN社；QIAquick PCR Purification Kit, Cat. No.28104）にて２回精製し、得られた各DNA混合溶液50μlに対して以下の表４に示す組成の溶液を加え、37℃で１時間保温して、制限酵素切断反応を行った。
【００７３】
【表４】
【００７４】
（ｆ）PCR反応
それぞれの試料に、５M NaCl 25μlを加え、さらに１×B&Wバッファー（10mM TrisHCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA）にてあらかじめ洗っておいた10mg/mlストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ400μlを加えて20分間静置し、試料をビーズに吸着させた。その後、ビーズを蒸留水で洗浄し、蒸留水を400μl加えた後、以下の表５に示す組成の反応液を加えた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
なお、表５におけるC1S-FAMプライマーの配列は5'-6FAM -GTACATATTGTCGTTAGAACGC-3'（配列番号７）である。
【００７７】
96ウェルマイクロタイタープレートにあらかじめ１μl（10 pmol/μl）の標的特異的プライマー（第17番染色体に基づいて設計した60プライマーとＸ染色体に基づいて設計した132プライマー（約1.3 Mbp毎に１プライマー）を計192プライマー）を分注しておいた。なお、標的特異的プライマーの配列は、第17番染色体に基づいて設計した60プライマーは図１０Ａ及びＢに示すプライマー番号１〜６０のプライマーセット（配列番号８〜67に示される塩基配列を有する）であり、Ｘ染色体に基づいて設計した132プライマーは図１１Ａ〜Ｄに示すプライマー番号１〜１３２のプライマーセット（配列番号68〜199に示される塩基配列を有する）である。
【００７８】
その96ウェルマイクロタイタープレートに、前記反応液をそれぞれ９μlずつ分注し、PCR反応を行った。PCR反応は以下の条件で行った。すなわち、TaqGold 活性化のため95℃で10分反応させた後、95℃で30秒、65℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして５サイクル、次に95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして５サイクル、次に95℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で45秒のサイクルを１サイクルとして10サイクル、最後に95℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で１分のサイクルを１サイクルとして30サイクル行った。反応終了後、72℃で30分保温した。
【００７９】
上記反応液に蒸留水をくわえて80μlにし、さらに希釈したサンプルにマーカーミックス（DNAシークエンサー3730用のサイズマーカーを蒸留水で希釈したもので、そのサイズマーカーはGeneScanTM-500LIZTM SizeStandard（Applied Biosystems社; Cat.No. 4322682）を使用）を20μlずつ加え、95℃で５分加熱した。加熱後、DNAシークエンサー3730（Applied Biosystems社）にかけた。
【００８０】
その結果、図２Ａに示す蛍光強度のピークが得られた。図２Ａにおいて、白色のピークは標準DNA（Fmix）のもの、黒色のピークはＸ染色体数異常DNAのものである。このピークの蛍光強度に基づいて以下の式に当てはめて、それぞれの染色体部位におけるDNAコピー数を求めた。
【００８１】
測定用DNAのコピー数＝
２×試料P2の蛍光強度/（試料P1の蛍光強度＋２×試料P3の蛍光強度）
【００８２】
図３に、FmixのFmixに対する比とMmixのFmixに対する比を示す結果を示す。この結果から、Fmix：Fmixではゲノムコピー数が１：１であるＸ染色体が、Fmix：Mmixの場合は１：0.5になっていることがわかる。
【００８３】
同様にMmix、47,XXX、48,XXXX、49,XXXXX（表３の(a)(b)(c)(d)(e)）のそれぞれのDNAコピー数を、図１０Ａ及びＢ、並びに図１１Ａ〜Ｄに示される配列番号８〜199のプライマーを用いて測定し、第17番染色体由来の標準DNAに対する測定用DNAのDNAコピー数に対して、Ｘ染色体由来の標準DNAに対する測定用DNAのDNAコピー数の平均を算出すると、それぞれ図４のようにコピー数の増加に伴い、蛍光強度が一次関数的に増加した。
【実施例２】
【００８４】
MYCN 遺伝子DNA増幅例における、増幅領域の絞り込み
以下の表６に示す神経芽細胞腫の細胞株（いずれも千葉がんセンターより供与を受けた）のうち、MYCN遺伝子（第２番染色体短腕（2p24.3）に位置）のゲノムDNAに増幅の見られない細胞株（A群）とMYCN遺伝子のゲノムDNAの増幅が分かっているもの（B群）について、その近傍のゲノムコピー数を測定した。まずMYCN遺伝子の近傍である第２染色体短腕（2p25.3）から長腕（2q14.3）に約1.3メガ塩基（Mbp）ごとに１箇所ずつ、全部で96セットのプライマーを作成した（図５）。これらのプライマーセットの配列は、図１２Ａ〜Ｃにおけるプライマー番号１〜96（配列番号200〜295）に示す。アダプターは実施例１と同様のもの（配列番号１〜６）を用い、標準DNAとして実施例１で調製したMmixを用いた。アダプター連結、PCR及び検出は実施例１と同様に行った。
【００８５】
【表６】
【００８６】
その結果、Ａ群では見られなかったMYCN 遺伝子のゲノムDNAの増幅をＢ群の細胞株全てにおいて、主にMYCN近傍の狭い範囲で増幅が見られた（図６に例を示す）。ここで、範囲を2p24.3から2p24.2までの3.1 Mbpに絞り（図７）、約48 kbpごとに１箇所ずつ、全部で72プライマーを設計し、同様の解析を行った。このプライマーの配列を図１３Ａ及びＢにおけるプライマー番号１〜72（配列番号296〜367）に示す。
【００８７】
その結果、Ｂ群の細胞株において、MYCN近傍でのゲノムDNA増幅は同様に見られたが、細胞株によってその増幅範囲が異なっていることがわかった（図８Ａ及び８Ｂ）。またこのような増幅領域の絞り込みを行うことによって、神経芽細細胞腫Ｂ群の全てに共通する増幅領域はMYCN遺伝子のみであることが確認された。そのまとめを図９に示す。このことから、MYCN遺伝子ゲノムDNAの増幅が神経芽細胞腫において、重要な役割を果たしているということが示唆される。
【００８８】
また、本実施例のように、染色体上に一定間隔をおいてプライマーを設計し、標準DNAと特定の状態にある被験体又は被験細胞（本実施例においては繊維芽細胞腫の細胞株）由来のゲノムDNAとを用いて本発明の方法を実施することにより、ゲノムDNAのコピー数が増幅又は低減されているゲノム上の領域を特定することができる。従って、本発明の方法を用いて、特定の状態とゲノムDNAのコピー数との相関を調べることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、ゲノムDNAコピー数の測定方法が提供される。本発明は、染色体の標的領域のコピー数を高精度に測定することができるため、特定の疾患に関与する遺伝子の検出等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の方法において、蛍光強度として増幅産物量を表わした場合のグラフ（Ａ）と、蛍光強度に基づいて標準曲線を作成し、ゲノムDNAのコピー数を求める概要（Ｂ）を示す図である。
【図３】正常女性のDNAと正常男性のDNAとの比較を行った結果を示すグラフである。
【図４】Ｘ染色体数異常を有する測定用DNAと標準DNAとを比較して、常染色体とＸ染色体の比較値平均を表した結果を示すグラフである。
【図５】第２番染色体上の最初にプライマーを設計した実験領域を示した図である。
【図６】第２番染色体上に最初に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図７】第２番染色体上の２回目にプライマーを設計した実験領域を示した図である。
【図８Ａ】第２番染色体上に２回目に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】第２番染色体上に２回目に設計したプライマーを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図９】MYCN遺伝子付近のゲノムDNAのコピー数の増幅領域を、細胞株毎にまとめた図である。
【図１０Ａ】第17番染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１０Ｂ】第17番染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ａ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｂ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｃ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１１Ｄ】Ｘ染色体のゲノムDNAを増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ａ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ｂ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１２Ｃ】第２番染色体上の一定領域（2p25.3から2q14.3まで）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１３Ａ】第２番染色体上の一定領域（2p24.3から2p24.2までの3.1Mbpの領域）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【図１３Ｂ】第２番染色体上の一定領域（2p24.3から2p24.2までの3.1Mbpの領域）を増幅するためのプライマー情報を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１〜３６７：合成オリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【請求項２】
第１の制限酵素が付着末端切断型の６塩基認識酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の制限酵素がPstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRIからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
第１の制限酵素がメチル化の影響を受けないものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第２の制限酵素が４塩基認識酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第２の制限酵素がMboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaIからなる群より選択される、請求項１又は５記載の方法。
【請求項７】
種類の異なるアダプターが互いに長さの異なるヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アダプターにビオチンが付加されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）でゲノムDNAを切断した後、アダプターが付加されているDNA断片を回収し、ステップ（ｆ）の増幅反応を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加するものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）において、標準DNAの濃度及び測定用DNAの濃度を調整して混合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加し、ステップ（ｄ）において、少なくとも２群の標準DNAの濃度を段階的に調整して混合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｆ）において、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いて増幅反応を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｆ）の増幅反応が、蛍光標識したプライマーを用いたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の蛍光量に基づいてゲノムDNAのコピー数を測定するものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムDNAのコピー数が正常であるか否かを測定する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ゲノムDNAのコピー数が０、１、２、３、４又はそれ以上であることを測定する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
被験試料が、染色体数異常が疑われる被験体又は被験細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
測定対象ゲノムDNAが、Ｘ染色体のゲノムDNA、MYCN遺伝子のゲノムDNA、癌組織由来のゲノムDNA、又は遺伝性疾患由来のゲノムDNAである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと測定対象染色体に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から該染色体のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、染色体数を測定する方法。
【請求項２１】
以下のステップ：
（ａ）被験体由来のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーとMYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、被験体の神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法。
【請求項２２】
以下のステップ：
（ａ）特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと、ゲノムDNA上のある領域を増幅できるように設計されたプライマーとを用いて増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定するステップ
を含む、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法。
【請求項２３】
特定の状態が、癌及びゲノムコピー数異常に起因する遺伝性疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｆ）において、プライマーをゲノムDNA上に４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計する、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、ゲノムDNAのコピー数を測定する方法。
【請求項２】
第１の制限酵素が付着末端切断型の６塩基認識酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の制限酵素がPstI、SacI、SphI、XhoI、BamHI、HindIII、KpnI、XbaI、BclI、HgiAI、SacII、SalI、AvaII、BglII、ClaI、及びEcoRIからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
第１の制限酵素がメチル化の影響を受けないものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第２の制限酵素が４塩基認識酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第２の制限酵素がMboI、TaqI、NlaIII、HpaII、AluI、HaeIII、RsaI(AfaI)、及びHhaIからなる群より選択される、請求項１又は５記載の方法。
【請求項７】
種類の異なるアダプターが互いに長さの異なるヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アダプターにビオチンが付加されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）でゲノムDNAを切断した後、アダプターが付加されているDNA断片を回収し、ステップ（ｆ）の増幅反応を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加するものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）において、標準DNAの濃度及び測定用DNAの濃度を調整して混合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）において、濃度が異なる少なくとも２群の標準DNAにそれぞれ種類の異なるアダプターを付加し、ステップ（ｄ）において、少なくとも２群の標準DNAの濃度を段階的に調整して混合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｆ）において、アダプターに特異的なプライマーと、測定対象ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いて増幅反応を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｆ）の増幅反応が、蛍光標識したプライマーを用いたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の蛍光量に基づいてゲノムDNAのコピー数を測定するものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムDNAのコピー数が正常であるか否かを測定する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ゲノムDNAのコピー数が０、１、２、３、４又はそれ以上であることを測定する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
被験試料が、染色体数異常が疑われる被験体又は被験細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
測定対象ゲノムDNAが、Ｘ染色体のゲノムDNA、MYCN遺伝子のゲノムDNA、癌組織由来のゲノムDNA、又は遺伝性疾患由来のゲノムDNAである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップ：
（ａ）被験試料のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと測定対象染色体に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から該染色体のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、染色体数を測定する方法。
【請求項２１】
以下のステップ：
（ａ）被験体由来のゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーとMYCN遺伝子に特異的なプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果からMYCN遺伝子のゲノムDNAコピー数を測定するステップ
を含む、被験体の神経芽細胞腫の予後リスクを判定する方法。
【請求項２２】
以下のステップ：
（ａ）特定の状態の被験体又は被験細胞に由来するゲノムDNA（測定用DNA）と、標準ゲノムDNA（標準DNA）を調製するステップ、
（ｂ）前記測定用DNA及び標準DNAをそれぞれ第１の制限酵素で切断するステップ、
（ｃ）標準DNAにアダプターを付加し、かつ測定用DNAに該アダプターとは別の種類のアダプターを付加するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）により得られた標準DNAのアダプター付加DNAと測定用DNAのアダプター付加DNAを混合するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）により得られた混合物に含まれるゲノムDNAを第２の制限酵素で切断するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）により得られた産物を鋳型として、アダプターに特異的なプライマーと、ゲノムDNA上のある領域を増幅できるように設計されたプライマーとを用いて増幅反応を行うステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）により得られる増幅産物の量に基づいて、測定用DNAの標準DNAに対する量比を測定するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）の測定結果から、ゲノムDNAコピー数が増大又は低減しているゲノム上の領域を特定するステップ
を含む、被験体又は被験細胞の特定の状態とゲノムDNAのある領域のコピー数の増大又は低減との相関を判定する方法。
【請求項２３】
特定の状態が、癌及びゲノムコピー数異常に起因する遺伝性疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｆ）において、プライマーをゲノムDNA上に４kbp〜２Mbpの間隔をおいて設計する、請求項２２又は２３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【公開番号】特開２００７−１５１４０９（Ｐ２００７−１５１４０９Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４６６８７（Ｐ２００５−３４６６８７）
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【出願人】（５０５４４４０１９）
【出願人】（５９９０７１９９１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【出願人】（５０５４４４０１９）
【出願人】（５９９０７１９９１）
【Ｆターム（参考）】
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