ゲル状細胞組成物およびその製造方法
【課題】シート状細胞組成物に代わる、従来のシート状細胞組成物の不利な点を有さず、簡便に製造可能であり、単離、移送、移植、保存も容易に可能である新規な細胞組成物を提供する。
【解決手段】血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である骨格筋芽細胞。
【解決手段】血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である骨格筋芽細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養基材から単離可能な、細胞が包埋されたゲル状細胞組成物およびその製造方法に関する
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。しかしながら、移植細胞を細胞懸濁液の状態で組織へと投与した場合には、移植細胞の注入効率の低さ、レシピエント組織を穿刺により損傷する危険性、広範囲な組織修復の困難性といった問題が指摘されたため、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成した細胞シートが開発されてきた。細胞シートの治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮細胞シートの利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜細胞シートの利用などの検討が進められている。
【０００３】
細胞シートは、一般に細胞を培養基材上でシート状に培養して形成するが、実際に治療に用いる際には、形成された細胞シートを培養基材から単離する必要がある。具体的な単離手法としては、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を利用する手法や、スクレーパーやピペットなどにより機械的に剥離する手法が一般的である。しかしながら、これらの手法では、細胞シートの損傷や、細胞生存率の低下などの問題があった。
【０００４】
さらに、シート状細胞組成物は脆弱であり、単離後に皺、破れなどを生じやすいことから、培養基材と接着した状態で保存、移送されることが多く、その場合、細胞の鮮度を保つために液体培地中に保存される。したがって、移送、保存が困難であるという問題もある。加えて、かかるシート状細胞培養物を移植に用いた場合、培養物を移植部位へ確実に接着させるため、フィブリンでスプレーするなどの工程が必要であった。
【０００５】
代表的な移植用細胞組成物としては、人工皮膚が挙げられる。特許文献１には、繊維芽細胞が凝集ヒト血漿蛋白または凝集ヒトフィブリンのシート内に包埋され、該シート上に扁平上皮細胞が付着した移植片が開示されている。また、特許文献２には、血小板を含む血漿を凝血して得られた基質中に真皮細胞が埋設された人工真皮が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２７７１４３号公報
【特許文献２】特表２００４−５２２５４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、シート状細胞組成物に代わる、従来のシート状細胞組成物の不利な点を有さず、簡便に製造可能であり、単離、移送、移植、保存も容易に可能である新規な細胞組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、細胞を、血漿を含む培地に懸濁してインキュベートすると、細胞が培地ごとゲル化することを見出し、鋭意研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材より単離可能な、前記ゲル状細胞組成物に関する。
本発明はまた、ゲル化剤が添加されていない、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、骨格筋芽細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
【００１０】
本発明はさらにまた、（１）血漿を含む溶液と、カルシウムイオンを放出する細胞に分化する細胞とを混合する工程、
（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。
さらにまた、本発明は、インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、上記の方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のゲル状細胞組成物は、血漿を含むゲルに細胞が分散包埋された状態である。ゲル状細胞組成物は、培養基材から単離可能な支持強度を有するため、単離、移植、輸送、保存などの取扱いが容易である。また、血小板を含まず、ゲル化剤の添加もせず、血漿を含む培地に細胞を添加し、培養（インキュベート）するだけで製造可能であるため、簡便に製造できる。ゲル状細胞組成物は治療などの目的で生体内へ移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１ａ）はゲル化した状態の細胞の写真である。通常、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物は比較的脆弱であり、培養基材と接着しているためピンセットで剥離させることはできず、ピンセットでつまむことも困難である。しかしながら、本発明のゲル状細胞組成物は、培養基材から単離する操作を一切行わずに、ピンセットで持ち上げても形状が維持されていることがわかる。ｂ）はゲル化した状態の細胞の顕微鏡写真である。
【図２】図２ａ）は骨格筋芽細胞を混合した培地、ｂ）は骨格筋芽細胞を混合しないネガティブコントロール、ｃ）はカルシウムイオンを添加してゲル化させたポジティブコントロールの写真である。
【図３】図３ａ）は実験の模式図である。ｂ）は得られたゲル状細胞組成物の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物に関する。
本発明のゲル状細胞組成物は、ゲルの中に細胞が包埋された三次元構造を有し、細胞間隙がゲルで充填されることにより、細胞同士が三次元的に分散包埋された構造体を形成する。そして、培養基材から剥離すると培養基材表面にほぼ細胞を残さずに、ゲル状になった細胞を培養基材表面から剥離することが可能である。そのため従来のシート状細胞培養物と同様の性質を有しながら、従来のシート状細胞培養物と比較して強度、操作、輸送、保存の容易性などを兼ね備えるものである。
【００１４】
本発明のゲル状細胞組成物において、ゲル中に包埋される細胞の量は、対象に移植された際、治療上有効な量含まれていればよい。治療上有効な量は、細胞種、使用用途などによって異なる。また、含まれる細胞の量は、ゲルの硬度に影響し得る。含まれる細胞が少なすぎると、ゲルの軟性が高くなり、剥離、移植などの操作が困難となる。含まれる細胞量は、例えば骨格筋芽細胞において、好ましくは５．０×１０５〜９．３×１０６個／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０６〜９．３×１０６個／ｍｌ、さらに好ましくは１．０×１０６〜６．０×１０６個／ｍｌである。当業者であれば、骨格筋芽細胞以外の細胞について、本発明に適した細胞密度を、本明細書の教示に従い、実験により適宜決定することができる。
【００１５】
本発明のゲル状細胞組成物には、線維芽細胞以外であればいかなる細胞を用いてもよい。ゲル化の容易さの観点から、好ましくはカルシウムイオンを保持および／もしくは放出する細胞または該細胞に分化する細胞、より好ましくは骨格筋芽細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞、最も好ましくは骨格筋芽細胞である。
本発明のゲル状細胞組成物には血漿がゲル化した状態で含まれている。血漿の含有量は、１０〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）である。本発明のゲル状細胞組成物に含まれる血漿は凝固因子の活性を維持するため、好ましくは非働化されていない。
【００１６】
本発明のゲル状細胞組成物に含まれる血漿は、ゲル状細胞組成物の使用目的に応じて適宜選択され、血小板を含んでも含まなくてもよい。組成物の保存性の観点からは、好ましくは実質的に血小板を含まない。本発明において、「実質的に含まない」とは、組成物の特性に影響を与えない程度の量は含み得るが、意図的には含有せしめないことをいう。これに限定されるものではないが、例えば、分離の際に分離しきれない程度の量含むことや、血球測定装置の検出限界以下の量を含むことは、「実質的に含まない」に該当する。
【００１７】
本発明において、ゲル状細胞組成物が「培養基材から単離可能」であるとは、ゲル状細胞組成物が培養基材に接着した状態から、ゲル状細胞組成物を剥離して、ゲル状細胞組成物と培養基材とに分離することができることを指す。剥離方法は特に限定されないが、特別な剥離工程を含まずに短時間で剥離できることが好ましい。本発明の一態様において、本発明のゲル状細胞組成物は、ピンセットでつまんで引っ張ることで、培養基材から容易に剥離することが可能である。
【００１８】
本発明の一態様において、ゲル状細胞組成物はゲル化剤を実質的に含まない。本発明において「ゲル化剤」とは、例えば界面活性剤、高分子ゲル、増粘剤など、液体をゲル化させる目的で用いられるものだけでなく、例えばカルシウムイオンやトロンビンなど、血漿の凝血作用を促進するために添加されるものも含まれる。したがって、本態様のゲル状細胞組成物は、外来性のゲル化剤が添加されていない。
【００１９】
また、本発明は、（１）血漿を含む溶液と、細胞とを混合する工程、および（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法にも関する。
【００２０】
混合は、細胞に悪影響を与えない限りいかなる方法を用いてもよく、例えば、続くインキュベート用の培養基材中で混合しても、別の容器で混合した後培養基材に移し替えてもよい。細胞は懸濁液の状態で混合されてもよいし、細胞ペレットに血漿を含む溶液を加えて懸濁してもよい。細胞が混合液中で均一に分散するように、混合後、細胞に悪影響を与えない程度に、例えば振とうやピペッティングなどにより懸濁するのが好ましい。
【００２１】
血漿を含む溶液と、細胞とを混合した後、該混合液をインキュベートしてゲル化する。インキュベートすることにより、細胞が混合液に懸濁された状態のままゲル化する。インキュベート条件は、細胞培養に適した条件として当業者に知られた条件でよく、例えば３７℃、５％ＣＯ２などでよい。インキュベート時間は、ゲル化が起こる時間であれば特に限定されない。ゲル化までの時間は、血漿の含有量や混合した細胞種、細胞量に依存して変化するが、好ましくは３０分以上、より好ましくは３０分〜３６時間、さらに好ましくは３０分〜２４時間である。培養時間が長いほうが、細胞同士の接着が進む傾向にあるが、長すぎると培地中の栄養分の枯渇及びｐＨの上昇が起こり、細胞死が引き起こされる。
【００２２】
インキュベートに用いられる培養基材は、特に限定されず、培養基材として当業者に知られたいかなる培養基材も用いることができる。通常シート状細胞培養物を培養する場合、該培養物をシート状のまま培養基材から剥離する必要があることから、培養物を剥離しやすい性質を持つ培養基材が好ましい。一般に、細胞間接着力は、培養基材と細胞との接着力よりも弱いため、剥離は困難である。そのため、シート状のまま培養物を剥離するために、例えば温度によって親水性、疎水性が変化する温度応答性ポリマーをコーティングした培養基材などが用いられる。しかし、本発明のゲル状細胞組成物においては、細胞間で直接接着している代わりに、細胞間に存在するゲルが細胞を支持している。そして、細胞を含むゲル化した組成物と培養基材との接着力よりも、ゲル化した組成物自体の構造を支持する強度の方が大きい。したがって、培養基材は温度応答性ポリマーをコーティングしていなくともよい。そして、ゲル状組成物を培養基材から剥離する際に、特別な剥離工程を含まずに物理的に容易に剥離することが可能となる。
【００２３】
本発明のゲル状細胞組成物がゲル化するメカニズムとして、溶液中に含まれる血漿中のフィブリノーゲンが、カルシウムイオンの影響によりフィブリンポリマー化することによって起こることが一因として推測される。
【００２４】
上記推測されるメカニズムに鑑みれば、混合する細胞としてカルシウムイオンを保持および／または放出する細胞を用いることができ、またかかる細胞に分化する細胞を用いてもよい。カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞は、例えば骨格筋細胞、神経細胞などが挙げられる。カルシウムイオンを放出する細胞に分化する細胞は、これに限定するものではないが、例えば骨格筋芽細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞などが挙げられる。また、混合する細胞は、培養直後の細胞であってもよいし、凍結保存後に融解した細胞であってもよい。
【００２５】
血漿は、いかなるものを用いてもよい。製造するゲル状細胞組成物の使用目的に鑑みて、好ましくは移植対象から採取した血液から単離した血漿を用いる。血漿の単離は、例えば遠心分離法、膜分離法など、当業者に知られたいかなる方法を用いて行ってもよい。血漿には、例えばヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸などの抗凝血因子が含まれていてもよい。さらに、血漿には、血小板が含まれていてもよいが、保存性、操作性などの観点から、好ましくは血小板を含まない。
【００２６】
本発明の混合液をゲル化するために、さらにゲル化剤を添加してもよい。しかしながら、本発明においては血漿が細胞を含む培地をゲル化する作用の他に、好ましくは外からゲル化剤を加えない。
【００２７】
インキュベート中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエント（培養基材上で細胞が平面を埋め尽くした状態）になると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、治療上有効な量ではあるが、分化に移行しない密度でインキュベートされる。本発明の一態様において、インキュベートによって細胞数が実質的に増加しない。「実質的に細胞数が増加しない」とは、例えば、ほぼコンフルエントな細胞濃度でインキュベートが行われるなどにより、インキュベート前とインキュベート後において細胞数の有意な増加が見られないことをいう。細胞が増殖したか否かは、例えば、混合時の細胞数と、細胞組成物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本態様において、インキュベート後の細胞数は、好ましくはインキュベート前の１２５％以下、より好ましくは約１００％である。
【００２８】
本発明の方法において、本発明の目的の範囲内において、当業者に知られたあらゆる追加の工程、および改変が行われてよい。例えば、細胞を血漿を含む液体と混合する前に、細胞を含まない状態で培養基材を血清含有培地でプレインキュベートしてもよい。
【００２９】
本発明の方法によって、非常に簡便な工程のみで、単離、移植、保存、輸送などに適したゲル状細胞組成物を製造することが可能となる。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、かかる実施例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
【００３１】
実施例１：細胞の調製
液体窒素で凍結保存した骨格筋芽細胞を、３７℃のウォーターバス中で２分間融解した。細胞３．０×１０７個あたり３０ｍｌの洗浄液（ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ（−））に０．５％ヒト血清アルブミンを混合したもの）を加え、２４０×ｇ、４℃で７分間遠心した。上清を廃棄し、再び細胞３．０×１０７個あたり３０ｍｌの洗浄液を加えて、２４０×ｇ、４℃で７分間遠心した。再び上清を廃棄し、細胞３．０×１０７個あたり１０ｍｌの洗浄液を加えて細胞を懸濁し、血球計算盤を用いて生細胞濃度を算出した。再び２４０×ｇ、４℃で７分間遠心し、上清を廃棄して細胞ペレットを得た。
【００３２】
実施例２：ヒト血漿混合培地の調製
ＡＣＤ−Ａ液で抗凝固されたヒト血漿を、成分採血装置（テルシス（登録商標）S；テルモ社製）により調製した。自動血球測定装置（XE-2100；シスメックス社製）を用いて血小板濃度を測定し、血小板が検出されないことを確認した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen社製）にヒト血漿を２０％混合し、孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、ヒト血漿混合培地を得た。
【００３３】
実施例３：細胞含有ゲルの作製
細胞濃度が４．６×１０６個／ｍｌになるように細胞ペレットにヒト血漿混合培地を加え、懸濁した。この懸濁液２ｍｌを、３．５ｃｍの細胞培養皿（Becton Dickinson社製）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１８時間インキュベートした。インキュベート後、ゲル状シートの周辺部を、注射針を使用して剥がし、シート状に形成されたゲル状細胞組成物を観察した。
【００３４】
インキュベート後に、培地と細胞が一体的にゲル状に固まったゲルの培養皿の側壁との境界付近を注射針で剥がすと、液体の培地がしみ出してくるのが観察された。また、培養皿との境界部を剥離した後、ピンセットでゲルをつまんで培養皿から剥離させることが可能であった。結果を図１に示す。ａ）はゲル化した状態の細胞の写真である。通常、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物は脆弱であり、ピンセットで剥離させることはできず、ピンセットでつまむことも困難であるが、本発明のゲル状細胞組成物は、ピンセットで持ち上げても形状が維持されていることがわかる。ｂ）はゲル化した状態の細胞の顕微鏡写真を表す。
【００３５】
実施例４：ゲル化実験
細胞濃度を ４．６×１０６個／ｍｌとし、インキュベート時間を２時間とした以外は実験例３と同様にゲル状細胞培養物を作製した。ポジティブコントロールとしてヒト血漿混合培地２ｍｌに０．４７ｍＭのＣａイオンを添加したもの、ネガティブコントロールとしてヒト血漿混合培地２ｍｌのみを同様に準備した。
【００３６】
結果を図２に示す。ａ）は骨格筋芽細胞を混合した培地であり、ゲル化が起こった。ｂ）はネガティブコントロールであり、液状のまま、ゲル化は起こらなかった。ｃ）はポジティブコントロールであり、ａ）と同様ゲル化が起こった。したがって、骨格筋芽細胞を血漿を含む培地と混合してインキュベートするだけで、血漿を含む培地にカルシウムイオンを添加して凝固させるのと同様の結果が得られることが分かった。
【００３７】
実施例５：培養皿比較実験
下記Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの細胞を準備した。
Ａ：温度応答性培養皿のUPCELL（登録商標）（セルシード社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血清混合培地（実施例２において、ヒト血漿の代わりにヒト血清を用いて同様に調製）に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｂ： UPCELL（登録商標）（セルシード社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｃ：通常の培養皿（Becton Dickinson社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｄ：通常の培養皿（Becton Dickinson社製）に、プレインキュベートなしで、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
【００３８】
図３のａ）は本実施例の実験の模式図である。ｂ）は得られたゲル状細胞組成物の写真である。Ａでは従来通り、シート状細胞培養物が形成された。Ｂでは、培地全体はゲル化しなかったものの、フィブリンの薄い膜上にゲル状細胞組成物が形成されたようになり、このゲル状細胞組成物は自然と剥離した。ＣとＤでは培地と細胞ごとゲル化し、周辺部の剥離によって培地がしみ出し、ピンセットでつまんで簡単に培養皿から剥離することが可能であった。また、Ｃと比較するとＤは、培養皿表面の細胞の接着が少なかった。Ｂ、Ｃ、Ｄの細胞から形成されたゲルはいずれもフィブリンを含んでいるため、粘着性が強く、移植には有利であると考えられた。
【００３９】
実施例６：細胞濃度の比較
細胞濃度をそれぞれ５×１０５、１．５５×１０６、３．１×１０６、４．６５×１０６、６×１０６とし、インキュベート時間を３０分とした以外は実施例３と同様にゲル状細胞組成物を形成し、ゲル化の度合いを比較した。
【００４０】
全ての細胞濃度でゲル状細胞組成物が形成され、回収可能であった。細胞濃度５×１０５では、回収可能ではあったものの、やや軟性があるゲル状細胞組成物であった。結果を表１に示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のゲル状細胞組成物は、従来のシート状細胞培養物と比較して、好適な強度および操作、輸送、保存の容易性などを兼ね備えるものであり、移殖などの際に非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養基材から単離可能な、細胞が包埋されたゲル状細胞組成物およびその製造方法に関する
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。しかしながら、移植細胞を細胞懸濁液の状態で組織へと投与した場合には、移植細胞の注入効率の低さ、レシピエント組織を穿刺により損傷する危険性、広範囲な組織修復の困難性といった問題が指摘されたため、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成した細胞シートが開発されてきた。細胞シートの治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮細胞シートの利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜細胞シートの利用などの検討が進められている。
【０００３】
細胞シートは、一般に細胞を培養基材上でシート状に培養して形成するが、実際に治療に用いる際には、形成された細胞シートを培養基材から単離する必要がある。具体的な単離手法としては、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を利用する手法や、スクレーパーやピペットなどにより機械的に剥離する手法が一般的である。しかしながら、これらの手法では、細胞シートの損傷や、細胞生存率の低下などの問題があった。
【０００４】
さらに、シート状細胞組成物は脆弱であり、単離後に皺、破れなどを生じやすいことから、培養基材と接着した状態で保存、移送されることが多く、その場合、細胞の鮮度を保つために液体培地中に保存される。したがって、移送、保存が困難であるという問題もある。加えて、かかるシート状細胞培養物を移植に用いた場合、培養物を移植部位へ確実に接着させるため、フィブリンでスプレーするなどの工程が必要であった。
【０００５】
代表的な移植用細胞組成物としては、人工皮膚が挙げられる。特許文献１には、繊維芽細胞が凝集ヒト血漿蛋白または凝集ヒトフィブリンのシート内に包埋され、該シート上に扁平上皮細胞が付着した移植片が開示されている。また、特許文献２には、血小板を含む血漿を凝血して得られた基質中に真皮細胞が埋設された人工真皮が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２７７１４３号公報
【特許文献２】特表２００４−５２２５４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、シート状細胞組成物に代わる、従来のシート状細胞組成物の不利な点を有さず、簡便に製造可能であり、単離、移送、移植、保存も容易に可能である新規な細胞組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、細胞を、血漿を含む培地に懸濁してインキュベートすると、細胞が培地ごとゲル化することを見出し、鋭意研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材より単離可能な、前記ゲル状細胞組成物に関する。
本発明はまた、ゲル化剤が添加されていない、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、骨格筋芽細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
【００１０】
本発明はさらにまた、（１）血漿を含む溶液と、カルシウムイオンを放出する細胞に分化する細胞とを混合する工程、
（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。
さらにまた、本発明は、インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、上記の方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のゲル状細胞組成物は、血漿を含むゲルに細胞が分散包埋された状態である。ゲル状細胞組成物は、培養基材から単離可能な支持強度を有するため、単離、移植、輸送、保存などの取扱いが容易である。また、血小板を含まず、ゲル化剤の添加もせず、血漿を含む培地に細胞を添加し、培養（インキュベート）するだけで製造可能であるため、簡便に製造できる。ゲル状細胞組成物は治療などの目的で生体内へ移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１ａ）はゲル化した状態の細胞の写真である。通常、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物は比較的脆弱であり、培養基材と接着しているためピンセットで剥離させることはできず、ピンセットでつまむことも困難である。しかしながら、本発明のゲル状細胞組成物は、培養基材から単離する操作を一切行わずに、ピンセットで持ち上げても形状が維持されていることがわかる。ｂ）はゲル化した状態の細胞の顕微鏡写真である。
【図２】図２ａ）は骨格筋芽細胞を混合した培地、ｂ）は骨格筋芽細胞を混合しないネガティブコントロール、ｃ）はカルシウムイオンを添加してゲル化させたポジティブコントロールの写真である。
【図３】図３ａ）は実験の模式図である。ｂ）は得られたゲル状細胞組成物の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物に関する。
本発明のゲル状細胞組成物は、ゲルの中に細胞が包埋された三次元構造を有し、細胞間隙がゲルで充填されることにより、細胞同士が三次元的に分散包埋された構造体を形成する。そして、培養基材から剥離すると培養基材表面にほぼ細胞を残さずに、ゲル状になった細胞を培養基材表面から剥離することが可能である。そのため従来のシート状細胞培養物と同様の性質を有しながら、従来のシート状細胞培養物と比較して強度、操作、輸送、保存の容易性などを兼ね備えるものである。
【００１４】
本発明のゲル状細胞組成物において、ゲル中に包埋される細胞の量は、対象に移植された際、治療上有効な量含まれていればよい。治療上有効な量は、細胞種、使用用途などによって異なる。また、含まれる細胞の量は、ゲルの硬度に影響し得る。含まれる細胞が少なすぎると、ゲルの軟性が高くなり、剥離、移植などの操作が困難となる。含まれる細胞量は、例えば骨格筋芽細胞において、好ましくは５．０×１０５〜９．３×１０６個／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０６〜９．３×１０６個／ｍｌ、さらに好ましくは１．０×１０６〜６．０×１０６個／ｍｌである。当業者であれば、骨格筋芽細胞以外の細胞について、本発明に適した細胞密度を、本明細書の教示に従い、実験により適宜決定することができる。
【００１５】
本発明のゲル状細胞組成物には、線維芽細胞以外であればいかなる細胞を用いてもよい。ゲル化の容易さの観点から、好ましくはカルシウムイオンを保持および／もしくは放出する細胞または該細胞に分化する細胞、より好ましくは骨格筋芽細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞、最も好ましくは骨格筋芽細胞である。
本発明のゲル状細胞組成物には血漿がゲル化した状態で含まれている。血漿の含有量は、１０〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）である。本発明のゲル状細胞組成物に含まれる血漿は凝固因子の活性を維持するため、好ましくは非働化されていない。
【００１６】
本発明のゲル状細胞組成物に含まれる血漿は、ゲル状細胞組成物の使用目的に応じて適宜選択され、血小板を含んでも含まなくてもよい。組成物の保存性の観点からは、好ましくは実質的に血小板を含まない。本発明において、「実質的に含まない」とは、組成物の特性に影響を与えない程度の量は含み得るが、意図的には含有せしめないことをいう。これに限定されるものではないが、例えば、分離の際に分離しきれない程度の量含むことや、血球測定装置の検出限界以下の量を含むことは、「実質的に含まない」に該当する。
【００１７】
本発明において、ゲル状細胞組成物が「培養基材から単離可能」であるとは、ゲル状細胞組成物が培養基材に接着した状態から、ゲル状細胞組成物を剥離して、ゲル状細胞組成物と培養基材とに分離することができることを指す。剥離方法は特に限定されないが、特別な剥離工程を含まずに短時間で剥離できることが好ましい。本発明の一態様において、本発明のゲル状細胞組成物は、ピンセットでつまんで引っ張ることで、培養基材から容易に剥離することが可能である。
【００１８】
本発明の一態様において、ゲル状細胞組成物はゲル化剤を実質的に含まない。本発明において「ゲル化剤」とは、例えば界面活性剤、高分子ゲル、増粘剤など、液体をゲル化させる目的で用いられるものだけでなく、例えばカルシウムイオンやトロンビンなど、血漿の凝血作用を促進するために添加されるものも含まれる。したがって、本態様のゲル状細胞組成物は、外来性のゲル化剤が添加されていない。
【００１９】
また、本発明は、（１）血漿を含む溶液と、細胞とを混合する工程、および（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法にも関する。
【００２０】
混合は、細胞に悪影響を与えない限りいかなる方法を用いてもよく、例えば、続くインキュベート用の培養基材中で混合しても、別の容器で混合した後培養基材に移し替えてもよい。細胞は懸濁液の状態で混合されてもよいし、細胞ペレットに血漿を含む溶液を加えて懸濁してもよい。細胞が混合液中で均一に分散するように、混合後、細胞に悪影響を与えない程度に、例えば振とうやピペッティングなどにより懸濁するのが好ましい。
【００２１】
血漿を含む溶液と、細胞とを混合した後、該混合液をインキュベートしてゲル化する。インキュベートすることにより、細胞が混合液に懸濁された状態のままゲル化する。インキュベート条件は、細胞培養に適した条件として当業者に知られた条件でよく、例えば３７℃、５％ＣＯ２などでよい。インキュベート時間は、ゲル化が起こる時間であれば特に限定されない。ゲル化までの時間は、血漿の含有量や混合した細胞種、細胞量に依存して変化するが、好ましくは３０分以上、より好ましくは３０分〜３６時間、さらに好ましくは３０分〜２４時間である。培養時間が長いほうが、細胞同士の接着が進む傾向にあるが、長すぎると培地中の栄養分の枯渇及びｐＨの上昇が起こり、細胞死が引き起こされる。
【００２２】
インキュベートに用いられる培養基材は、特に限定されず、培養基材として当業者に知られたいかなる培養基材も用いることができる。通常シート状細胞培養物を培養する場合、該培養物をシート状のまま培養基材から剥離する必要があることから、培養物を剥離しやすい性質を持つ培養基材が好ましい。一般に、細胞間接着力は、培養基材と細胞との接着力よりも弱いため、剥離は困難である。そのため、シート状のまま培養物を剥離するために、例えば温度によって親水性、疎水性が変化する温度応答性ポリマーをコーティングした培養基材などが用いられる。しかし、本発明のゲル状細胞組成物においては、細胞間で直接接着している代わりに、細胞間に存在するゲルが細胞を支持している。そして、細胞を含むゲル化した組成物と培養基材との接着力よりも、ゲル化した組成物自体の構造を支持する強度の方が大きい。したがって、培養基材は温度応答性ポリマーをコーティングしていなくともよい。そして、ゲル状組成物を培養基材から剥離する際に、特別な剥離工程を含まずに物理的に容易に剥離することが可能となる。
【００２３】
本発明のゲル状細胞組成物がゲル化するメカニズムとして、溶液中に含まれる血漿中のフィブリノーゲンが、カルシウムイオンの影響によりフィブリンポリマー化することによって起こることが一因として推測される。
【００２４】
上記推測されるメカニズムに鑑みれば、混合する細胞としてカルシウムイオンを保持および／または放出する細胞を用いることができ、またかかる細胞に分化する細胞を用いてもよい。カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞は、例えば骨格筋細胞、神経細胞などが挙げられる。カルシウムイオンを放出する細胞に分化する細胞は、これに限定するものではないが、例えば骨格筋芽細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞などが挙げられる。また、混合する細胞は、培養直後の細胞であってもよいし、凍結保存後に融解した細胞であってもよい。
【００２５】
血漿は、いかなるものを用いてもよい。製造するゲル状細胞組成物の使用目的に鑑みて、好ましくは移植対象から採取した血液から単離した血漿を用いる。血漿の単離は、例えば遠心分離法、膜分離法など、当業者に知られたいかなる方法を用いて行ってもよい。血漿には、例えばヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸などの抗凝血因子が含まれていてもよい。さらに、血漿には、血小板が含まれていてもよいが、保存性、操作性などの観点から、好ましくは血小板を含まない。
【００２６】
本発明の混合液をゲル化するために、さらにゲル化剤を添加してもよい。しかしながら、本発明においては血漿が細胞を含む培地をゲル化する作用の他に、好ましくは外からゲル化剤を加えない。
【００２７】
インキュベート中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエント（培養基材上で細胞が平面を埋め尽くした状態）になると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、治療上有効な量ではあるが、分化に移行しない密度でインキュベートされる。本発明の一態様において、インキュベートによって細胞数が実質的に増加しない。「実質的に細胞数が増加しない」とは、例えば、ほぼコンフルエントな細胞濃度でインキュベートが行われるなどにより、インキュベート前とインキュベート後において細胞数の有意な増加が見られないことをいう。細胞が増殖したか否かは、例えば、混合時の細胞数と、細胞組成物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本態様において、インキュベート後の細胞数は、好ましくはインキュベート前の１２５％以下、より好ましくは約１００％である。
【００２８】
本発明の方法において、本発明の目的の範囲内において、当業者に知られたあらゆる追加の工程、および改変が行われてよい。例えば、細胞を血漿を含む液体と混合する前に、細胞を含まない状態で培養基材を血清含有培地でプレインキュベートしてもよい。
【００２９】
本発明の方法によって、非常に簡便な工程のみで、単離、移植、保存、輸送などに適したゲル状細胞組成物を製造することが可能となる。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、かかる実施例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
【００３１】
実施例１：細胞の調製
液体窒素で凍結保存した骨格筋芽細胞を、３７℃のウォーターバス中で２分間融解した。細胞３．０×１０７個あたり３０ｍｌの洗浄液（ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ（−））に０．５％ヒト血清アルブミンを混合したもの）を加え、２４０×ｇ、４℃で７分間遠心した。上清を廃棄し、再び細胞３．０×１０７個あたり３０ｍｌの洗浄液を加えて、２４０×ｇ、４℃で７分間遠心した。再び上清を廃棄し、細胞３．０×１０７個あたり１０ｍｌの洗浄液を加えて細胞を懸濁し、血球計算盤を用いて生細胞濃度を算出した。再び２４０×ｇ、４℃で７分間遠心し、上清を廃棄して細胞ペレットを得た。
【００３２】
実施例２：ヒト血漿混合培地の調製
ＡＣＤ−Ａ液で抗凝固されたヒト血漿を、成分採血装置（テルシス（登録商標）S；テルモ社製）により調製した。自動血球測定装置（XE-2100；シスメックス社製）を用いて血小板濃度を測定し、血小板が検出されないことを確認した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen社製）にヒト血漿を２０％混合し、孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、ヒト血漿混合培地を得た。
【００３３】
実施例３：細胞含有ゲルの作製
細胞濃度が４．６×１０６個／ｍｌになるように細胞ペレットにヒト血漿混合培地を加え、懸濁した。この懸濁液２ｍｌを、３．５ｃｍの細胞培養皿（Becton Dickinson社製）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１８時間インキュベートした。インキュベート後、ゲル状シートの周辺部を、注射針を使用して剥がし、シート状に形成されたゲル状細胞組成物を観察した。
【００３４】
インキュベート後に、培地と細胞が一体的にゲル状に固まったゲルの培養皿の側壁との境界付近を注射針で剥がすと、液体の培地がしみ出してくるのが観察された。また、培養皿との境界部を剥離した後、ピンセットでゲルをつまんで培養皿から剥離させることが可能であった。結果を図１に示す。ａ）はゲル化した状態の細胞の写真である。通常、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物は脆弱であり、ピンセットで剥離させることはできず、ピンセットでつまむことも困難であるが、本発明のゲル状細胞組成物は、ピンセットで持ち上げても形状が維持されていることがわかる。ｂ）はゲル化した状態の細胞の顕微鏡写真を表す。
【００３５】
実施例４：ゲル化実験
細胞濃度を ４．６×１０６個／ｍｌとし、インキュベート時間を２時間とした以外は実験例３と同様にゲル状細胞培養物を作製した。ポジティブコントロールとしてヒト血漿混合培地２ｍｌに０．４７ｍＭのＣａイオンを添加したもの、ネガティブコントロールとしてヒト血漿混合培地２ｍｌのみを同様に準備した。
【００３６】
結果を図２に示す。ａ）は骨格筋芽細胞を混合した培地であり、ゲル化が起こった。ｂ）はネガティブコントロールであり、液状のまま、ゲル化は起こらなかった。ｃ）はポジティブコントロールであり、ａ）と同様ゲル化が起こった。したがって、骨格筋芽細胞を血漿を含む培地と混合してインキュベートするだけで、血漿を含む培地にカルシウムイオンを添加して凝固させるのと同様の結果が得られることが分かった。
【００３７】
実施例５：培養皿比較実験
下記Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの細胞を準備した。
Ａ：温度応答性培養皿のUPCELL（登録商標）（セルシード社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血清混合培地（実施例２において、ヒト血漿の代わりにヒト血清を用いて同様に調製）に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｂ： UPCELL（登録商標）（セルシード社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｃ：通常の培養皿（Becton Dickinson社製）に、０．７７５ｍｌの培地（２０％ヒト血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
Ｄ：通常の培養皿（Becton Dickinson社製）に、プレインキュベートなしで、骨格筋芽細胞を細胞濃度４．６×１０６個／ｍｌでヒト血漿混合培地に懸濁したものを１．６ｍｌ入れ、２４時間インキュベートした。
【００３８】
図３のａ）は本実施例の実験の模式図である。ｂ）は得られたゲル状細胞組成物の写真である。Ａでは従来通り、シート状細胞培養物が形成された。Ｂでは、培地全体はゲル化しなかったものの、フィブリンの薄い膜上にゲル状細胞組成物が形成されたようになり、このゲル状細胞組成物は自然と剥離した。ＣとＤでは培地と細胞ごとゲル化し、周辺部の剥離によって培地がしみ出し、ピンセットでつまんで簡単に培養皿から剥離することが可能であった。また、Ｃと比較するとＤは、培養皿表面の細胞の接着が少なかった。Ｂ、Ｃ、Ｄの細胞から形成されたゲルはいずれもフィブリンを含んでいるため、粘着性が強く、移植には有利であると考えられた。
【００３９】
実施例６：細胞濃度の比較
細胞濃度をそれぞれ５×１０５、１．５５×１０６、３．１×１０６、４．６５×１０６、６×１０６とし、インキュベート時間を３０分とした以外は実施例３と同様にゲル状細胞組成物を形成し、ゲル化の度合いを比較した。
【００４０】
全ての細胞濃度でゲル状細胞組成物が形成され、回収可能であった。細胞濃度５×１０５では、回収可能ではあったものの、やや軟性があるゲル状細胞組成物であった。結果を表１に示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のゲル状細胞組成物は、従来のシート状細胞培養物と比較して、好適な強度および操作、輸送、保存の容易性などを兼ね備えるものであり、移殖などの際に非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿を含むゲルに細胞（線維芽細胞を除く）が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物。
【請求項２】
ゲル化剤が添加されていない、請求項１に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項３】
細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である、請求項１または２に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項４】
細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項５】
（１）血漿を含む溶液と、細胞（線維芽細胞を除く）とを混合する工程、
（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法。
【請求項６】
インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、請求項５に記載の方法。
【請求項１】
血漿を含むゲルに細胞（線維芽細胞を除く）が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物。
【請求項２】
ゲル化剤が添加されていない、請求項１に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項３】
細胞が、カルシウムイオンを保持および／または放出する細胞に分化する細胞である、請求項１または２に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項４】
細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲル状細胞組成物。
【請求項５】
（１）血漿を含む溶液と、細胞（線維芽細胞を除く）とを混合する工程、
（２）（１）で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法。
【請求項６】
インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、請求項５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２２９５０８（Ｐ２０１１−２２９５０８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０５７２３（Ｐ２０１０−１０５７２３）
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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