コラーゲン−ポリビニルピロリドンから調製された慢性関節炎症を変調する組成物
本発明は、コラーゲン−ポリビニルピロリドンから調製された慢性関節炎症のダウンモジュレーター組成物に関する。ＲＡまたはＯＡの患者におけるコラーゲンの代謝回転は、本生体複合体がコラーゲン溶解活性をダウンレギュレートし、正常滑膜組織において観察されるレベルに類似してＩＩＩ型コラーゲン含量および組織ＴＩＭＰ−１をアップレギュレートするために、コラーゲン−ＰＶＰによって変調される。そこで、慢性炎症性プロセスは、コラーゲン−ＰＶＰ作用によるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８および細胞接着分子のダウンレギュレーションによって変化させられるが、これは以前に記載されたように、これらの分子全部がコラーゲン溶解酵素の活性化および発現ならびに細胞接着分子、およびＣｏｘ−１の活性化および誘導を含む接着機序を通して滑膜細胞の増殖および移動を誘導できるためである。さらに、細胞固定については、細胞外マトリックスタンパク質−インテグリンの相互作用がＭＭＰ発現を調節するシグナルを生成し、これは細胞接着分子がＲＡに関連する組織破壊に関係する可能性があることを示唆している。他方、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β合成のダウンレギュレーションは、滑膜細胞中でのアポトーシスを刺激すると思われる。これは、滑膜細胞増殖およびパンヌス形成ならびに関節組織破壊の阻害に寄与すると思われる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン−ポリビニルピロリドンから調製された関節炎症を変調する組成物に関し、メキシコ人集団における関節炎症の発生率、および本組成物が免疫を変調すると考えられる理由ならびにそれ自体が免疫を変調する組成物であると考えられるために試験されたパラメータについて精査する。
【０００２】
結果として、適用分野は、医学に適用される生物学的製剤の領域と決定される。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ:Rheumatoid arthritis）は、メキシコ人集団における罹患率が高い（０．３％；範囲０．１〜０．６）自己免疫疾患である。ＲＡは、慢性炎症性浸潤、滑膜過形成、線維症ならびに最終的には関節軟骨変性および肋軟骨下骨侵食の存在を特徴とする。その病理は、滑膜組織に浸潤する様々な種類や量の活性化細胞、細胞接着分子（ＣＡＭ）を通しての直接的細胞−細胞接触、およびこの疾患の破壊的特性に関連する関節組織成分の過剰な分解に向かう不均衡を作り出す前炎症性サイトカイン過剰発現の産物である（Feldmann M,Brennan FM,Maini RN,Role of cytokines in rheumatoid arthritis.Ann Rev Immunol 1996;14:397-9）。
【０００４】
免疫学的には、ＲＡ滑膜組織は、相乗作用的に作用して「関節炎原性(arthritogenic)サイトカイン」と見なされているインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（Cooper WO,Fava RA,Gates CA,et al.Acceleration of onset of collagen-induced arthritis by intra-articular injection of tumour necrosis factor or transforming growth factor-beta.Clin Exp Immunol 1992;89:244-50）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む前炎症性サイトカインの過剰産生を特徴とする（Gowen M,Wood DD,Ihrie EJ,McGuire MKB,Russell RG.An interleukin-I like factor stimulates bone resorption in vitro.Nature 1983;306:378-81;Moreland LW.Inhibitors of tumor necrosis factor for rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1999;26Suppl57:7-15;Manicourt DH,Triki R,Fukuda K,et al.Levels of circulating tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1993;36:490-9;Dolhain RJEM,Tak PP,Brennan FM,Chantry D,Turner M,et al.Inhibitory effect of TNF-α antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 1989;2:244-7;Brennan FM,Maini RN,Feldmann M.Cytokine expression in chronic inflammatory disease.Br Med Bull 1995;51:368-84;Hildner K,Finotto S,Becker C,et al.Tumour necrosis factor(TNF)production by T cell receptor-primed T lymphocytes is a target for low dose methotrexate in rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 1999;118:137-46;Minghetti PP,Blackburn WD Jr.Effects of sulfasalazine and its metabolites on steady state messenger RNA concentrations for inflammatory cytokines,matrix metalloproteinases,and tissue inhibitors of metalloproteinase,in rheumatoid synovial fibroblasts.J Rheumatol 2000;27:653-60;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scand J Immunol 1999;50:215-22）。
【０００５】
関節炎原性サイトカインは、ＲＡ滑液中だけではなく滑膜組織中でも検出されている（Gowen M,Wood DD,Ihrie EJ,McGuire MKB,Russell RG.An interleukin-I like factor stimulates bone resorption in vitro.Nature 1983;306:378-81;Beutler BA.The role of tumor necrosis factor in health and disease.J Rheumatol 1999;26Suppl57:16-21;Black RA,Rauch ChT,Kozlosky CJ.A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells.Nature 1997;385:729-33;Moreland LW.Inhibitors of tumor necrosis factor for rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1999;26Suppl57:7-15;Wakisaka S,Suzuki N,Takeba Y,et al.Modulation by proinflammatory cytokines of Fas/Fas ligand-mediated apoptotic cell death of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis(RA).Clin Exp Immunol 1998;114:119-28;Kiener HP,Hofbauer R,Tohidast-Adrad M,et al.Tumor necrosis factor α promotes the expression of stem cell factor in synovial fibroblasts and their capacity to induce mast cell chemotaxis.Arthritis Rheum 2000;43:164-74;Manicourt DH,Triki R,Fukuda K,et al.Levels of circulating tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1993;36:490-9;Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8;Manicourt D-H,Poilvache P,Van Egeren A,et al.Synovial fluid levels of tumor necrosis factor α and oncostatin M correlate with levels of markers of the degradation of crosslinked collagen and cartilage aggrecan in rheumatoid arthritis but not in osteoarthritis.Arthritis Rheum 2000;43:281-8;Brennan FM,Chantry D,Turner M,et al.Inhibitory effect of TNF-α antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 1989;2:244-7;Brennan FM,Maini RN,Feldmann M.Cytokine expression in chronic inflammatory disease.Br Med Bull 1995;51:368-84;Hildner K,Finotto S,Becker C,et al.Tumour necrosis factor(TNF)production by T cell receptor-primed T lymphocytes is a target for low dose methotrexate in rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 1999;118:137-46;Minghetti PP,Blackburn WD Jr.Effects of sulfasalazine and its metabolites on steady state messenger RNA concentrations for inflammatory cytokines,matrix metalloproteinases,and tissue inhibitors of metalloproteinase,in rheumatoid synovial fibroblasts.J Rheumatol 2000;27:653-60;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scand J Immunol 1999;50:215-22;Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8）。
【０００６】
他方、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γなどの抗炎症性リンホカインは、関節内では検出されていない（Firestein GS,Xu W-D,Townsend K,et al.Cytokines in chronic inflammatory arthritis.I.Failure to detect T cell lymphokines(interleukin 2 and interleukin 3)and presence of macrophage colony-stimulating factor(CSF-1)and a novel mast cell growth factor in rheumatoid synovitis.J Exp Med 1988;168:1573-86;Salmon M,Gaston JSH.The role of T-lymphocytes in rheumatoid arthritis.Br Med Bulletin 1995;51:332-45）。
【０００７】
ところで前炎症性サイトカインは、これらのサイトカインが細胞表面膜上の特異的受容体発現に直接的作用を及ぼすために、炎症性病巣に関連する傷害およびパンヌス形成のメカニズムを調節する。これらの受容体には、特にセレクチンファミリー（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）、インテグリンファミリーのメンバー：β1サブファミリーもしくはＶＬＡもしくは超遅発活性化抗原、β2サブファミリーもしくはロイコインテグリンおよびβ3サブファミリー（El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21）またはサイトアドヘシン（cytoadhesin）ファミリーならびに免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）が含まれる。
【０００８】
ＲＡのＢ型滑膜細胞または滑膜組織についての免疫組織化学的アッセイは、一部の接着分子の発現における変化を証明した：セレクチンファミリーからはＥＬＡＭ−１およびＰＥＸＣＡＭの増加が証明されている。それらは関節炎原性サイトカインによってアップレギュレートされる（Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8;Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311;El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21;Youssef PP,Triantafillou S,Parker A,et al.Variability in cytokine and cell adhesion molecule staining in arthroscopic synovial biopsies:quantification using color video image analysis.J Rheumatol 1997;24:2291-8）。
【０００９】
インテグリンファミリーからは、おそらくはＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの過剰発現に起因するα6β1の減少が決定されている；αvβ5インテグリンは発現せず、α1-5β1インテグリンならびにαL、αM、αXおよびαdロイコインテグリンは正常滑膜組織に関連して増加していた（El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21;Youssef PP,Triantafillou S,Parker A,et al.Variability in cytokine and cell adhesion molecule staining in arthroscopic synovial biopsies:quantification using color video image analysis.J Rheumatol 1997;24:2291-8;Pirila L,Heino J.Altered integrin expression in rheumatoid synovial lining type B cells:In vitro cytokine regulation of α1β1,α6β1,and αvβ5 integrins.J Rheumatol 1996;23:1691-8;Cicuttini FM,Martin M,Boyd AW.Cytokine induction of adhesion molecules on synovial type B cells.J Rheumatol 1994;21:406-12）。
【００１０】
免疫グロブリンスーパーファミリーからは、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１発現の増加が証明されている。増加した細胞接着分子発現は、前炎症性サイトカインによって調節される（Cicuttini FM,Martin M,Boyd AW.Cytokine induction of adhesion molecules on synovial type B cells.J Rheumatol 1994;21:406-12）。
【００１１】
同様に、ＲＡの生理病理学では、カルシウム非依存性および依存性プロテアーゼ（ＭＭＰ）が、関節破壊現象およびパンヌス形成において重要な役割を果たす。リウマチ様滑膜中で高濃度で測定されたカルシウム非依存性プロテアーゼには、システインプロテアーゼ（カテプシンＬ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）および好中球エラスターゼが含まれる。他方、ＭＭＰ−１、−２、−３および１３は滑膜組織中で過剰発現するが、ＭＭＰ−９および−１０は過剰発現しない（Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Owen CA,Campbell MA,Boukedes SS,Campbell EJ.Inducible binding of bioactive cathepsin G to the cell surface of neutrophils.J Immunol 1995;155:5803-10;Koolwijk P,Miltenburg AMM,Van Erck MGM,et al.Activated gelatinase-B(MMP-9)and urokinase-type plasminogen activator in synovial fluids of patients with arthritis.Correlation with clinical and experimental variables of inflammation.J Rheumatol 1995;22:385-93;Maeda S,Sawai T,Uzuki M,et al.Determination of interstitial collagenase(MMP-1)in patients with rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:970-5;Hembry RM,Bagga MR,Reynolds JJ,Hamblen DL.Immunolocalisation studies on six matrix metalloproteinases and their inhibitors,TIMP-1 and TIMP-2,in synovia from patients with osteo- and rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:25-32;Tetlow LC,Woolley DE.Mast cells,cytokines,and metalloproteinases at the rheumatoid lesion:dual immunolocalisation studies.Ann Rheum Dis 1995;54:896-903）。
【００１２】
ＲＡ患者由来の滑液および血清中で実施されたアッセイは、対照被験者から入手した滑液および血清中に比較して、主としてＭＭＰ−３、−１および−９が重大な量で見いだされることを証明している。プロテアーゼの濃度は、滑膜炎症強度と直接的に相関付けることができる（Ishiguro N,Ito T,Obata K-I,et al.Determination of stromelysin-1,and 92 kDa type IV collagenase,Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1(TIMP-1),and TIMP-2 in synovial fluid and serum from patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1996;23:1599-604;Watanabe Y,Shimamori N,Yamaguchi R,et al.Correlation between the appearance of gelatinases in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis and polymorphonuclear elastase,stromelysin-1,and the tissue inhibitor of metalloproteinase-1.Clin Exp Rheumatol 1997;15:255-61）。
【００１３】
プロテアーゼの発現は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαなどの前炎症性サイトカイン（Shingu M,Miyauchi S,Nagai Y,et al.The role of IL-4 and IL-6 in IL-1-dependent cartilage matrix degradation.Br J Rheumatol 1995;34:101-6;West-Mays JA,Strissel KJ,Sadow PM,Fini ME.Competence for collagenase gene expression by tissue fibroblasts requires activation of an interleukin 1β autocrine loop.Proc Natl Acad Sci 1995;92:6768-72;Migita K,Eguchi K,Kawabe Y,et al.TNF-α-mediated expression of membrane-type matrix metalloproteinase in rheumatoid synovial fibroblasts.Immunol 1996;89:553-7;Cawston TE,Curry VA,Summers CA,et al.The role of oncostatin M in animal and human connective tissue collagen turnover and its localization within the rheumatoid joint.Arthritis Rheum 1998;41:1760-9）ならびにインテグリンについてはそれらのリガンドとの相互作用、例えばαvもしくはα4とフィブロネクチン、β2−マイクログロブリンと主要組織適合複合体、ＶＣＡＭ−１とＶＬＡ−４などの相互作用によってアップレギュレートされる（Larjava H,Lyons J,Salo R,et al.Anti-integrin antibodies induce type IV collagenase gene expression in keratinocytes.J Cell Physiol 1993;157:190-200;Romanic AM,Madri JA.The induction of 72 kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent.J Cell Biol 1994;125:1165-78;Tremble P,Chiquet-Ehrismann R,Werb Z.The extracellular matrix ligands fibronectin and tenascin collaborate in regulating collagenase gene expression in fibroblasts.Mol Biol Cell 1994;5:4390-3;Rukonen T,Westermarck J,Koivisto L,et al.Integrin α2β1 is a positive regulator of collagenase(MMP-1)and collagen α1(I)gene expression.J Biol Chem 1995;270:13548-52;Migita K,Eguchi K,Tominaga M,et al.α2-Microglobulin induces stromelysin production by human synovial fibroblasts.Biochem Biophys Res Comm 1997;239:621-5;Sarkissian V,Lafyatis R.Integrin engagement proliferation and collagenase expression of rheumatoid synovial fibroblasts.J Immunol 1999;162:1772-9）。プロテアーゼの発現および／または活性における阻害は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−γ（Prontera C,Crescenzi G,Rotilio D.Inhibition by interleukin-4 of stromelysin expression in human skin fibroblasts:role of PKC.Exp Cell Res 1996;224:183-8;Lacraz S,Nicod LP,Chicheportiche R,et al.IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclear phagocytes.J Clin Invest 1995;96:2304-10;Busiek DF,Baragi V,Nehring LC,et al.Matrilysin expression by human mononuclear phagocytes and its regulation by cytokines and hormones.J Immunol 1995;159:6484-91;Overall ChM.Regulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editores:Greenwald RA,Golub LM 1994;732:59-64）またはα1−アンチトリプシンもしくはα2−マクログロブリンなどの非特異的阻害剤およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）（Hayakawa T,Yamashita K,Tanzawa K,et al.Growth-promoting activity of tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1)for a wide range of cells.A possible new growth factor in serum.FEBS Lett 1992;298:29-32）などの特異的阻害剤によって調節される。ＴＩＭＰは、高度の親和性で結合しており、非共有的かつ不可逆性方法でＭＭＰプロフォームおよび活性形との化学量論的複合体（１：１）を形成している（Bodden MK,Windsor LJ,Caterina NM,et al.Analysis of the TIMP-1/FIB-CL complex.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editors:Greenwald RA,Golub LM.1994;85-95）。ＴＩＭＰ−１および−３は全ＲＡ滑膜組織中に分布しているが、ＴＩＭＰ−２は検出されない（Hembry RM,Bagga MR,Reynolds JJ,Hamblen DL.Immunolocalisation studies on six matrix metalloproteinases and their inhibitors,TIMP-1 and TIMP-2,in synovia from patients with osteo- and rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:25-32）。
【００１４】
骨関節症（ＯＡ:osteoarthritis）もしくは変形性関節症は、最も一般的なリウマチ性障害である。変形性関節症の罹患率は男女どちらについても類似であり、症状を伴う、または伴わない放射線学的特性は、６０または７０年以上前から全世界で周知である。メキシコ人集団の２．３％（範囲１．７〜２．９％）がＯＡに罹患している。世界保健機構および米国整形外科アカデミーは、変形性関節症についての提案基準において、この疾患を次のように規定した：「変形性関節症は、関節軟骨および肋軟骨下骨の分解および合成の正常な結び付きを不安定化させる機械的および生物学的両方の事象の結果である。この疾患は、遺伝性、発達性、代謝性および外傷性を含む複数の因子によって開始される可能性があるが；ＯＡは可動関節の組織の全てを含んでいる。最終的に、ＯＡは、関節軟骨の軟化、線維化、潰瘍化および消失、肋軟骨下骨の硬化および象牙質化、骨増殖体、ならびに肋軟骨下嚢胞を引き起こす、細胞および基質両方の形態学的、生化学的、分子学的、および生体力学的変化によって発現する。臨床的に明らかになった時点で、ＯＡは関節痛、圧痛、運動制限、摩擦音、時折の浸出液、および程度の様々な局所的炎症を特徴とする」（Ramos NF.Enfermedad articular degenerativa.In:Enfermedades Reumaticas.Criterios y Diagnostico.Editorial McGraw-Hill Interamericana.1a.Edicion,Tomo II;1999,pags:437-63;Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47）。
【００１５】
臨床的には、ＯＡは、関節痛、圧力を受けた場合の疼痛、作業不能、摩擦音、時折の滑液の増大および全身性障害を伴わない数段階の局所的炎症を特徴とする。
【００１６】
病理学的には、ＯＡは、体重を支える領域でより頻回に発生する不規則な軟骨損傷、肋軟骨下骨の硬化症、肋軟骨下嚢胞、限界的骨増殖体、骨幹端血液流入および程度の様々な滑膜炎の増加を特徴とする。
【００１７】
組織学的には、ＯＡは、関節面の早期断裂、軟骨細胞凝集、軟骨の縦の破断、ならびに様々な結晶沈着および後期の血管による継目侵害を特徴とする。ＯＡは、さらにまた特に骨増殖体の創傷治癒、および次に完全軟骨損傷、硬化症および肋軟骨下骨の限局性骨壊死を特徴とする。
【００１８】
生体力学的には、ＯＡは、引っ張り特性、圧縮および滑りの変化ならびに軟骨水力学的透過性、水分蓄積および過度の体積を特徴とする。軟骨の変化には骨の硬直の増大が付随する。
【００１９】
生化学的には、ＯＡは、プロテオグリカン濃度の減少、プロテオグリカンのサイズおよび凝集が変化する可能性、コラーゲンのサイズおよび組織の変化、基質高分子の代謝回転の増加を特徴とする（Lark MW,Bayne EK,Flanagan J,et al.Aggrecan degradation in human cartilage.Evidence for both matrix metalloproteinase and aggrecanase activiy in normal,osteoarthritic and rheumatoid joints.J Clin Invest 1997;100:93-106;Ramos NF.Enfermedad articular degenerativa.In Enfermedades Reumaticas.Criterios y Diagnostico.Editorial McGraw-Hill Interamericana.1a.Edicion,Tomo II;1999,pags:437-63;Rowan AD,Koshy PJT,Shingleton WD,et al.Synergistic effects of glycoprotein 130 binding cytokines in combination with interleukin-1 on cartilage collagen breakdown.Arthritis Rheum 44:1620-32）。
【００２０】
治療学的には、ＯＡは、特定の療法がないことを特徴とする（Felson DT.The veredict favors nonsteroidal antiinflammatory drugs for treatment of osteoarthritis and a plea for more evidence on other treatments.Arthritis Rheum 2001;44:1477-80）。
【００２１】
免疫学的には、ＯＡは、前炎症性サイトカイン、接着分子およびプロテアーゼの過剰発現と結び付いており、これらは定性的にはＲＡにおいて検出されるものに類似するが、定量的にはリウマチ性関節におけるより低濃度であると思われる（Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scan J Immunol 1999;50:215-22;Rowan AD,Koshy PJT,Shingleton WD,et al.Synergistic effects of glycoprotein 130 binding cytokines in combination with interleukin-1 on cartilage collagen breakdown.Arthritis Rheum 44:1620-32;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scan J Immunol 1999;50:215-22;;Cronstein BN,Weissman R.The adhesion molecules of inflammation.Arthritis Rheum 1993;36:147-57;Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47;Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Okada Y,Naka K,Kawamura K,et al.Localization of matrix metalloproteinase 9(92-kilodalton gelatinase/type IV collagenase = gelatinse B)in osteoclasts:Implications for bone resorption.Lab Invest 1995;72:311-22;Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Okada Y,Naka K,Kawamura K,et al.Localization of matrix metalloproteinase 9(92-kilodalton gelatinase/type IV collagenase = gelatinse B)in osteoclasts:Implications for bone resorption.Lab Invest 1995;72:311-22;Prontera C,Crescenzi G,Rotilio D.Inhibition by interleukin-4 stromelysin production by human synovial fibroblasts.Biochem Biophys Res Comm 1997;239:621-5;Lacraz S,Nicod LP,Chicheportiche R,et al.IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclear phagocytes.J Clin Invest 1995;96:2304-10;Overall ChM.Regulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editores:Greenwald RA,Golub LM,1994;732:59-64;Haywood L,McWilliams DF,Pearson CI,Gill SE,Ganesan A,Wilson D,Walsh DA.Inflammation and angiogenesis in osteoarthritis.Arthritis Rheum 2003;48:2173-7）。
【００２２】
ＯＡは、６５歳以上のヒトにおける病的状態の原因の第１位を占めていて他の１０倍以上頻回に発生するので、集団の社会経済学的局面に重要な影響を及ぼす疾患である。そのような疾患に対する特定の治療法が存在せず、最も重要な療法薬は症状をコントロールするには実際上有用であるパラセタモールおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるが、どちらもこの疾患の自然展開を変えることはない。そこで、ＯＡに罹患している患者における生活の質を改善するために、そしてＰＶＰ−コラーゲン（一部の前炎症性サイトカイン、接着分子およびプロテアーゼの陰性対照）の薬理学的背景を考慮して、本生物薬剤は、付随作用もしくは有害作用を産生せずに、しかし関節腔の粘性を改善して生体力学的損傷による軟骨変性を防止する、炎症性プロセスを変調する作用を通して持続性寛解の誘導を補助できると提案されている。
【００２３】
ＯＡに対する現在の治療は、主として症状の緩和を目標にしている。減量、筋肉増強運動、ブレイシング、および関節保護などの非薬理学的アプローチは、構造を変化させる可能性を有する。単純な鎮痛剤、非選択的非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）特異的阻害剤、関節内（ＩＡ）グルココルチコイドを含む薬理学的治療様式は、疼痛および炎症の緩和を目指している。ＩＡヒアルロナン（ヒアルロン酸塩、ヒアルロン酸）もしくは高分子量ヒアルロナン注射（粘性補充療法）は、膝関節置換術を受けるのを遅らせたい、または避けたいと望む患者における従来型方策に非応答性の膝ＯＡのためのまた別の治療アプローチである。ＯＡの病理生理学の理解におけるここ数十年間に及ぶ進歩は、変性性プロセスに関係している経路を標的とするより合理的な機会を提供する2,3。
【００２４】
炎症の抑制および慢性リウマチ様滑膜炎のために使用される複数の療法の中で、ＮＳＡＩＤなどの薬物は、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびプロスタサイクリンを変化させ、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキンおよびクロロキン）はリソソーム膜を安定化させ、シクロホスファミドはアルキル化剤と一緒になって増殖細胞死を誘導する。アザチオプリンは、ＮＫおよびＢ細胞機能ならびにＩＬ−６合成を阻害する抗炎症作用を備える細胞毒性免疫抑制剤である（Choy E,Kingsley G.How Do Second-Line Agents work?.Br Med Bulletin 1995;51:472-92）。低用量のメトトレキセートは、内皮細胞、好中球および損傷した線維芽細胞によるアデノシン放出をβ2インテグリン接着阻害によって増加させ、結果として白血球遊走を変化させる。さらに、メトトレキセートは、チミジレート・シンテターゼおよびカルボキシアミドリボヌクレオチド・トランスホルミラーゼのコントロールによって分裂細胞の細胞増殖を阻害する。プレドニゾンおよびデキサメタゾンなどのコルチコイド剤は、ＩＬ−１合成ならびに他の前炎症性サイトカインの阻害を含むメカニズムを通して、活性化内皮中でのＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの発現を間接的に阻害する（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）。
【００２５】
生物学的療法には、関節腔に向かう炎症細胞遊走を回避する、マウス抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体などの内皮への白血球の接着を阻害することに向けられた抗ＣＡＭ抗体が含まれる（Kavanaugh A,Nichols L,Davis L,Rothlein R,Lipsky P.Anti-CD54(Intercellular Adhesion Molecule-1;ICAM-1)Monoclonal Antibody Therapy in Refractory Rheumatoid Arthritis.Arthritis Rheum 1993;49:48-51）。それらの療法は、サイトカイン作用を回避する、すなわちＩＬ−６、ＴＧＦ−β１またはＴＮＦ−αに対する中和抗体を使用する（Paleolog EM,Hunt M,Elliott MJ,Feldmann M,Maini RN,Woody JN.Deactivation of vascular endothelium by monoclonal anti-tumor necrosis factor α antibody in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1996;39:1082-91;Brennan FM,Browne KA,Green PA,Jaspar J-M,Maini RN,Feldmann M.Reduction of serum MMP-1 and MMP-3 in rheumatoid arthritis patients following anti-tumour necrosis factor-α(cA2)therapy.Br J Rheumatol 1997;36:643-50;Perkins DJ,St Clair EW,Misukonis MA,Weinberg B.Reduction of NOS2 overexpression in rheumatoid arthritis patients treated with anti-tumor necrosis factor α monoclonal antibody(cA2).Arthritis Rheum 1998;41:2205-10;Breedveld FC,Van del Lubbe P.Monoclonal Antibody Therapy of Inflammatory Rheumatic Diseases.Br Med Bulletin 1995;51:493-502）。
【００２６】
それでも、それらの療法についての長期臨床試験の結果は、治療の費用、付随する様々な副作用および不良な薬物動態（ｃＡ２投与の時機の減少）、ｃＡ２に対する抗グロブリンの生成、ならびに他のサイトカインの不必要な性質がそれらの抗体の治療価値に影響を及ぼすので、理想的ではなかった。
【００２７】
前炎症性サイトカイン産生を減少させる生物療法には、抗Ｔ細胞、モノクローナル抗体、抗主要組織適合複合体−ＤＲまたはＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ５、もしくはＩＬ−２Ｒなどの抗Ｔ細胞アクセサリー分子が含まれる（Breedveld FC,Van del Lubbe P.Monoclonal Antibody Therapy of Inflammatory Rheumatic Diseases.Br Med Bulletin 1995;51:493-502）。
【００２８】
３カ月間にわたる朝夕の食前２０分における、主として非ラチリスム鶏胸骨軟骨もしくはサメ軟骨から単離して０．１Ｍ酢酸中に溶解させたＩＩ型コラーゲン（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30）、またはＩおよびＩＩＩ型コラーゲン（Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94）であるタンパク質の経口投与による生物療法でさえ、これらのタンパク質が、３つの型のコラーゲン中に存在する共有エピトープによって、または自己反応性細胞を不活化するサイトカイン放出に好都合な活性化関節細胞由来のＩもしくはＩＩ型主要組織適合複合体の制限によって自己反応性ＣＤ４＋細胞アネルギーを通して機能する場合は、末梢免疫寛容を生じさせる（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30;Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94;Barinaga M.Treating Arthritis With Tolerance.Science 1993;261:1669-70）。
【００２９】
最後に、人工関節による関節置換術または血漿フェレーシス、白血球フェレーシスもしくは全リンパ系照射を含む様々な他の治療法がある。
【発明の開示】
【００３０】
上述した薬物のために、免疫療法、生物学的療法または代替法は、満足できない結果を生じるだけではなく、有害な作用または重大な二次副作用を発生させる。この理由から、本発明者らは、ＲＡもしくはＯＡ患者において生物薬剤であるコラーゲン−ポリビニルピロリドン（Fibroquel（登録商標）、登録番号210M95 SSA）を評価することを提案する。Ｔリンパ球培養への細胞外マトリックスタンパク質の添加はＴ細胞応答を変調させることができる（Easter DW,Hayt DB,Ozkan AN.Immunosuppression by a peptide from the gelatin binding domain of human fibronectin.J Surg Res 1988;45:370-5;Rybski JA,Lause DB,Reese AC.Effect of fibronectin on antigen-induced lymphoproliferation and antibody synthesis in rats.J Leuk Biol 1989;45:35-45;Rueg CR,Chiquet-Ehrismann R,Alkan SS.Tenascin,an extracellular matrix protein,exerts immunomodulatory activities.Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:7437-41;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J,Diaz de Leon L.Collagen-PVP decreases collagen turnover in synovial tissue cultures from rheumatoid arthritis patients.Ann NY Acad Sci 1999;878:508-602）；ＩＩ型コラーゲン（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30）またはＩもしくはＩＩＩ型コラーゲン（Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94）の経口投与はＲＡにおける末梢免疫系を変調させるという事実に基づくと、コラーゲン−ＰＶＰは、以下で説明するように、抗炎症特性を有する。
【００３１】
コラーゲン−ＰＶＰは、ｐＨを安定化させたクエン酸緩衝液中のペプシン化ブタＩ型コラーゲンとＰＶＰとのγ線照射混合物である。３７℃および中性ｐＨの培養培地中では、コラーゲン−ＰＶＰは他のコラーゲンのようにゲルを形成することはなく、その電気泳動的、物理化学的および薬理学的特性はタンパク質とＰＶＰとの共有結合によって変化させられている。インビトロおよびインビボにおいて、これらの成分（コラーゲンおよびＰＶＰ）が単独ではコラーゲン−ＰＶＰとは同一特性を有していないことが証明されている（Chimal-Monroy J,Bravo-Ruiz T,Krotzsch-Gomez FE,Diaz de Leon L.Implantes de Fibroquel aceleran la formacion de hueso nuevo en defectos oseos inducidos experimentalmente en craneos de rata:un estudio histologico.Rev Biomed 1997;8:81-8）。本生物薬剤は、コラーゲン代謝および前炎症性サイトカイン発現を変調して、皮膚創傷治癒ならびに他の組織を改善することが証明されている。
【００３２】
以前の試験データは、Wistar系ラットおよびヒトにおいて実施された実験によって決定されており、外科創傷に対するコラーゲン−ＰＶＰによる病変内治療は手術７日後の顆粒形成組織の増加を刺激し、第２８日には、組織は非処置群に比較して、より良好な皮膚構造を示した。改善には、正常皮膚様のコラーゲン束の配列を伴う、創傷ゾーンにおける皮膚付属器の存在が含まれる（Krotzsch-Gomez FE,Guerrero-Padilla E,Diaz de Leon L.Morphological studies on the effects of Fibroquel during wound of surgical wounds in rats.J Cell Biochem 1993;Suppl,17E:137R506）。
【００３３】
［骨の修復、前臨床試験および臨床試験による評価］
〔ラットの骨折モデル〕
Wistar系ラットにおいて大腿骨幹骨折が作製され、損傷後最初の３日間にわたりインサイチューで０．２ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰが投与された。骨硬化パラメータが評価され、３０日後に完全骨修復を示したのは治療群動物では６７％であったのに対して、対照群では２０％に過ぎなかった。組織学的分析は、最初は軟骨組織、および後には骨芽細胞および骨梁骨による（第１６および２３日）、コラーゲン−ＰＶＰ治療群における間葉細胞の早期代謝回転を証明した。さらに、より高度のオステオポンチンおよびオステオネクチンの発現が測定されたが、他方Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンは実験群および対照群において類似であった。この結果は、コラーゲン−ＰＶＰが間葉細胞の増殖因子および細胞外マトリックスタンパク質の発現を変調させ、軟骨形成細胞および骨形成細胞の移動、増殖および分化を刺激し、骨修復を改善することを示唆している（Almazan Diaz A,de la Cruz Garcia JC,Lira Romero JM,Arrellin G,Chimal Monroy J,Diaz de Leon L,Furuzawa- Carballeda J,Krotzsch Gomez F:Investigacion experimental de la regeneracion osea en femures de rata despues de la aplicacion de colagena I polimerizada:Estudio radiologico,histologico e inmunohistoquimico.Rev Mex Ortop Traum 1996;10:142-52;Chimal-Monroy J,Bravo-Ruiz T,Furuzawa-Carballeda GJ.Lira RJM,De la Cruz GJC,Almazan DA,Krotzsch-Gomez FE,Arrellin RG,Diaz de Leon L.Collagen-PVP accelerates new bone formation of experimentally induced bone defects in rat skull and promotes the expression of osteopontin and SPARC during bone repair of rat femora fractures.Ann NY Acad Sci 1998;857:232-6）。
【００３４】
〔ヒトにおける骨修復〕
さらに、患者２０例（実験群１０例およびプラセボ群１０例）を対照とする第Ｉ相臨床試験において頸骨の骨幹骨折におけるコラーゲン−ＰＶＰの作用が評価された。この試験は、早期閉鎖骨折を含んでおり、全例が初期７日間にわたり固定された。コラーゲン−ＰＶＰまたはプラセボ（０．２ｍＬ）は、外科創傷へ手術中の第１日、第７および３０日に病変内投与された。第３０日に、コラーゲン−ＰＶＰで治療された患者の８０％は疼痛がないと報告しており、残り２０％には軽度の疼痛がみられた。これとは対照的に、対照群患者の５０％は中等度の疼痛、そして残り５０％は軽度の疼痛を示した。さらに、コラーゲン−ＰＶＰ治療群は、損傷領域において炎症徴候を示さなかったが、対照群の５０％は炎症徴候を示した。その上に、コラーゲン−ＰＶＰ治療群では、対照群と比較して、血清アルカリホスファターゼが上昇していた。
【００３５】
第３０日に、Meller尺度によるＸ線的骨修復は、コラーゲン−ＰＶＰ治療群患者の１００％において第３０日および９０日に各々グレードＩおよびＩＩであった；これとは相違して、対照群では第３０日および９０日に各々５０％および１００％がグレードＩであった。
【００３６】
コラーゲン−ＰＶＰ治療群の骨修復は適切であり、全患者が二足歩行移動に耐えることができ、膝または足関節の可動制限はみられなかった。これらの患者は全例が第１２週前に漸進的歩行を示し、特別のリハビリテーションを必要とした例はなかった。対照群もまた骨修復を示したが、彼らは同一の第１２週には外側からの支持なしで二足歩行移動には耐えられなかった。彼らのうちの４例は、筋萎縮に起因する特別なリハビリテーションを必要とした。
【００３７】
これらをまとめると、コラーゲン−ＰＶＰは、軟骨、後には肥厚性軟骨および最終的には骨組織に向けて間葉組織が分化するのを助けるオステオポンチン、オステオネクチンおよびアルカリホスファターゼのアップレギュレーションにより骨修復プロセスを促進する。おそらく、この調節の原因は、前炎症性サイトカイン発現（主としてＩＬ−１およびＴＮＦ−α）、接着分子（ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）ならびに一部のプロテイナーゼのダウンモジュレーション、そしてその結果としてプロスタグランジン合成の調節による早期の疼痛コントロールにあった（De la Cruz Garcia JC.Efecto de la colagena tipo I polimerizada al 1% inyectable en la consolidacion osea(reporte preliminar).Tesis.Hospital de Traumatologia y Ortopedia de 「Lomas Verdes」.UNAM.1997）。
【００３８】
〔頸骨偽関節症に及ぼすコラーゲン−ＰＶＰの作用〕
頸骨偽関節症を有する年齢６〜７２歳の患者に、６週間にわたり１ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰまたはプラセボを摂取させた。治療後、コラーゲン−ＰＶＰ治療群の患者１６例（５１．６％）は極めて良好な（Meller尺度によるグレードＩＩＩ）、患者１２例（３８．７％）は良好な（グレードＩＩ）の骨修復を示し、不適切（グレードＩ）であったのは３例（９．６８％）だけであった。他方、プラセボ治療した群では、治療した患者中で骨修復は１例も観察されなかった。組織学的分析は、コラーゲン−ＰＶＰ治療群における適切な骨芽細胞活性を証明した。さらに、コポリマーを用いて治療された患者においては疼痛が減少しており、これはおそらくＣｏｘ（プロスタグランジン産生）による炎症因子変調によるものであり、その結果として患者は罹患した肢における強度および筋肉の正常な緊張を示した（Bermudez-Hickey R,Nesme-Avila W,Ruiz-Flores L,Suarez E.Tratamiento de la pseudoartrosis de tibia con colageno-polivinilpirrolidona.Rev Mex Ortop Traum 1999;13:148-51）。
【００３９】
［慢性炎症に結び付いた線維性疾患における臨床経験］
〔肥厚性瘢痕または強皮症に対するコラーゲン−ＰＶＰ治療〕
ヒト肥厚性瘢痕または強皮症病変における１〜３カ月間にわたる本生物薬剤の週１回の病変内注射は、掻痒症、疼痛、紅斑、体積、および炎症性浸潤を減少させる。本生物薬剤は、組織構造を正常な皮膚に近付ける。さらに、本生物薬剤は、ＥＣＭ、主としてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの代謝回転を変調し、そしてＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦおよびＶＣＡＭ−１の発現レベルをダウンレギュレートする（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E and Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol,1998;111:828-834.Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch E,Espinosa-Morales R,Alcala M,Barile-Fabris L.Subcutaneous administration of collagen-polyvinylpyrrolidone down-regulates IL-1β,TNF-α,TGF-β1,ELAM-1 and VCAM-1 expression in scleroderma skin lesions.Clinical and Experimental Dermatology.2005;30:83-86）。
【００４０】
〔強皮症皮膚病変の治療に及ぼすコラーゲン−ＰＶＰの作用〕
コラーゲン−ＰＶＰの免疫変調作用は、３カ月間中に上述したものと同一薬量で治療され、皮膚の組織および外観が改善された強皮症皮膚病変においても観察された。組織学的には、コラーゲン−ＰＶＰ治療は、皮膚付属器、真皮乳頭層におけるＩＩＩ型コラーゲンおよびＩ／ＩＩＩ型コラーゲンの比率を回復させ、他方Ｉ型コラーゲンの厚い束を減少させた。免疫組織化学検査によって、コラーゲン−ＰＶＰがＩＬ−１βおよびＥＬＡＭ−１発現をダウンレギュレートすることも決定された（Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs.triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）。
【００４１】
コラーゲン−ＰＶＰが、慢性炎症に結び付いている皮膚線維性障害における一部の前炎症性サイトカイン、接着分子およびコラーゲンの代謝回転をダウンレギュレートするという試験結果に基づいて、本発明者らは、本生物薬剤はＲＡ患者からの炎症性滑膜組織培養にも同一作用をもたらすであろうと推測した。
【００４２】
［安全性試験］
〔リンパ球増殖試験〕
アッセイによって、血清無含有培養系中のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはＰＨＡおよびコラーゲン−ＰＶＰを含有するプレート内で培養した場合に、精製リンパ球の顕著な増殖が証明された。さらに、細胞をコラーゲン−ＰＶＰ単独を含有するプレート内で培養した場合には、ベースライン時を越える増殖は観察されなかった。これらの結果は、本生物薬剤がリンパ球増殖を刺激できないことを示唆している。
【００４３】
〔遺伝毒性および骨髄毒性試験〕
ＳＣＧＥアッセイもしくは「コメットアッセイ」は、顕微鏡スライド上の寒天ゲルサンドイッチ内に包埋し、溶解させ、アルカリ性条件下で短時間にわたり電気泳動にかけたリンパ球の細胞懸濁液を用いて実施した。溶解は核物質以外の細胞含有物を除去し、ＤＮＡを少量の非ヒストンタンパク質の存在下で高度に超らせん状で維持する；アルカリの中に入れると、ＤＮＡはストランド破損部位かららせんを巻き戻し始める。ＤＮＡ損傷が増加した細胞は、電流下では核から陽極に向かうＤＮＡの移動の増加を示し、「コメットテール」の外観を呈する。この研究では、ＤＮＡ損傷の分析は、コラーゲン−ＰＶＰを含めて、または含めずにインキュベートした培養がリンパ様細胞培養中でのＤＮＡ移動の変化を全く誘導しないことを証明した。このため、これらのデータはコラーゲン−ＰＶＰへの曝露が遺伝毒性作用を有していないことを示唆している。
【００４４】
〔検査室試験〕
健常志願者および肥厚性瘢痕または強皮症を有する患者において、安全性試験、フォローアップ試験、臨床評価試験および検査室試験を実施した。血液学的検査（白血球指数、血液化学検査、血清カルシウムレベル）、尿分析、肝機能検査は、コラーゲン−ＰＶＰの投与前後に相違を示さなかった。これらの所見は、この治療が有害な直接的臨床反応を全く誘導しなかったことを示唆している。
【００４５】
〔抗ブタコラーゲンまたは抗コラーゲン−ＰＶＰ抗体〕
全血清サンプルのブタＩ型コラーゲンまたはコラーゲン−ＰＶＰに対する反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。反応性のベースライン時レベルを確定するために、本生物薬剤を用いた治療を受けていない健常志願者１１０例からの血清サンプルを陰性対照として使用した。ＳＳｃ患者３７例からの血清サンプルを、以前の報告により数例の患者において循環中ヒト抗コラーゲン抗体が同定されていたので、陽性対照として使用した。コラーゲン−ＰＶＰに対する血清学的反応性を試験するためにコラーゲン−ＰＶＰにより治療された４４例からの血清サンプルを使用し、これらのサンプルをコラーゲン−ＰＶＰの投与回数（５回未満、６〜１０回、１１〜２０回、２１〜１００回および１００回を超える投与）にしたがってプロットした。さらに、血清サンプルの反応性は、少なくとも２種の希釈率で、Dunnett検査による平均群分析を用いて比較した。健常ドナーとＳＳｃ患者群との間でブタＩ型コラーゲンに対する抗体の存在による有意差が観察された（ｐ＜０．０５）；コラーゲン−ＰＶＰに対しては（用量、投与回数または患者の年齢などの因子を考慮に入れた場合でさえ）陽性相関は決定できなかった（Furuzawa-Carballeda J,Castillo I,Rojas E,Valverde M,Diaz de Leon E,Krotzsch E.Cellular and humoral responses to collagen-polyvinylpyrrolidone administered during short and long periods in humans.Can J Pharmacol Physiol 2003;81.1029-35）。
【００４６】
他方、ポリマーであるＰＶＰの安全性は、特定の物理的および科学的特性のために、多数の医薬調製物、食品、化粧品および洗浄用品ならびに工業用途において有用である（Ｎ−ビニル−２−ピロリドンのホモポリマーは、生物学的に不活性かつ安全なポリマーである）。多くの試験が、その無害性を証明している。コラーゲン−ＰＶＰに使用されるＰＶＰは、低分子量である（Robinson et al.1990）。
【００４７】
コラーゲン−ＰＶＰを製造するために使用されるＰＶＰは、腎臓によって排泄されるので低分子量物質である。血漿増量剤として静脈内投与された後の、または高用量で経口、皮下または筋肉内投与された後の有害作用は報告されていない（Robinson BV,Sullivan FM,Bazelleca JF,Schwartz SL.PVP.A critical review of the kinetics and toxicology of polyvinylpyrrolidone(Povidone).Lewis Publishers,Inc.1990）。
【００４８】
［関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の滑膜組織培養中での前臨床試験］
ＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のコラーゲン−ＰＶＰの作用。コラーゲン−ＰＶＰが細胞代謝または細胞濃度のいずれかに影響を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者らはＤＮＡ含量を測定した。処置群および対照群培養を比較した場合に、ＤＮＡ含量における統計的有意差はみられなかった（表１）。重要にも、非ＲＡ滑膜中のＤＮＡ含量はＲＡ滑膜組織で測定した含量の８〜１０分の１であったことに注目されたい。対照群およびコラーゲン−ＰＶＰ処置群培養間で有意差はみられなかった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中の組織学的所見。１％コラーゲン−ＰＶＰを含めて培養した非ＲＡ滑膜の形態学的評価は、培養３および７日目に組織構造が変化していないことを証明した（図１Ａ）。非ＲＡ滑膜培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加は、組織構造、線維性コラーゲン厚さまたはＩ／ＩＩＩ型コラーゲン比率を変化させなかった（図１Ｂ）。しかしＲＡ対照群培養由来の滑膜組織についての組織学的評価は、培養３および７日目の様々な含量の炎症性細胞およびＩ型コラーゲン（図１Ｃにおける赤色線維）が大量な線維症を証明した。これとは対照的に、対にした１％コラーゲン−ＰＶＰ処置群培養は、正常滑膜組織に類似して、ＩＩＩ型コラーゲンの回復を示した（培養７日目における、図１Ｄの青色線維）。
【００５１】
【化１】
【００５２】
図１．培養中の滑膜の組織構造にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。Herovici法を用いて染色した、１％コラーゲン−ＰＶＰを含有する、または含有しない滑膜組織培養の顕微鏡写真。（Ａ）培養０、３および７日目の、非ＲＡ滑膜対照群培養。（Ｂ）培養３および７日目の、非ＲＡ滑膜コラーゲン−ＰＶＰ処置群培養。（Ｃ）各々０、３および７日目の、処置をせずにインキュベートしたＲＡ滑膜組織。優勢な細胞外マトリックス成分はＩ型コラーゲンである（赤色線維）。（Ｄ）各々３および７日目の、コラーゲン−ＰＶＰ処置群のＲＡ滑膜。ＩＩＩ型コラーゲンの増加がみられる（青色線維）。スケールバー：１００μｍ。非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの相対比率における変化を確証するために、各培養時点に２片ずつの滑膜ホモジネートを断続的ゲル電気泳動法およびデンシトメトリー分析によって評価した。還元条件下で、連鎖間ジスルフィド結合は開裂され、Ｉ型コラーゲンのα1（Ｉ）鎖より緩徐に移動するコラーゲンのα1（ＩＩＩ）モノマーを遊離する。図２Ａは、滑膜組織対照群培養中でのα1（ＩＩＩ）の細いバンドを示している。デンシトメトリー分析は、非ＲＡ滑膜培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加がＩもしくはＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）において何の変化も生じさせなかったことを証明した（図２Ｂ）。しかし、処置群のＲＡ滑膜培養は、７日目に時間依存方法で、α1（ＩＩＩ）バンドにおける１．７倍の増大を示した（ｐ＜０．００９、処置群対未処置群培養；図２Ｃ）。これとは対照的に、細いＩ型コラーゲンバンドが観察された。
【００５３】
【化２】
【００５４】
図２．滑膜組織培養中のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン含量にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）各々培養３、５および７日目の、（＋）コラーゲン−ＰＶＰを含有する、または（−）含有しない代表的なＲＡ滑膜組織のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＭＷ：Ｉ型コラーゲンの標準。（Ｂ）非ＲＡ滑膜組織培養中でのＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。（Ｃ）ＲＡ滑膜組織培養中でのＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。培養５日目（*ｐ＝０．００９）および７日目（*ｐ＝０．００００７）に、対照群とコラーゲン−ＰＶＰ処置群との間で統計的有意差が得られた。データは、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００５５】
ＲＡ患者の滑膜組織由来の上清のコラーゲン溶解活性。ＲＡの進行中、炎症部位でのタンパク質溶解活性は上昇する。そこで、ＭＭＰ−１に対する特異的抗血清を使用して、ＲＡ患者１０例および非ＲＡ患者５例由来の滑膜を免疫組織化学的に詳細に試験した。ＲＡ滑膜は、非ＲＡ滑膜と比較してＭＭＰ−１分布において相当に広い範囲を示した。処置群対対照群の間で差は生じなかった（図３Ｄ、Ｅ）。他方、コラーゲン−ＰＶＰ処置培養由来のＲＡ上清中では、全コラーゲン溶解活性のレベルは対照群培養中のレベルの１．６分の１以下であった（ｐ＜０．０５；図３Ａ）。滑膜組織処置群培養由来の上清中のカルシウム依存性コラゲナーゼ（ＭＭＰ）は、ＣａＣｌ2緩衝液中およびＥＤＴＡ緩衝液中の3Ｈ−コラーゲンの分解間の差によって測定した（全コラーゲン溶解活性−カルシウム非依存性コラゲナーゼ）。このタンパク質溶解活性は、生体化合物処置群培養由来の上清中で未処置群培養に比してわずかに低いレベルを示した（図３Ｂ）。それらの安定性のためにカルシウムを必要としないプロテイナーゼ（おそらく、エラスターゼおよび／またはＧカテプシン）のコラゲナーゼ活性は、未処置群組織培養の２．２分の１であった（ｐ＜０．００８；図３Ｃ）。カルシウム依存性ならびにカルシウム非依存性コラーゲン溶解性プロテアーゼが類似の活性レベルを有することを強調することは重要である。これは、ＲＡの病因において、カルシウム非依存性酵素がカルシウム依存性酵素について観察されるものと同様の重要性を有することを示唆している。
【００５６】
【化３】
【００５７】
図３．滑膜組織培養中のコラゲナーゼ活性およびＴＩＭＰ−１発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）全コラーゲン溶解活性。データは、各々培養３、５および７日目について*ｐ＝０．００８、*ｐ＝０．０５５および*ｐ＝０．０５で統計的有意であった。（Ｂ）カルシウム依存性コラーゲン溶解活性。（Ｃ）カルシウム非依存性コラーゲン溶解活性。コラーゲン−ＰＶＰ処置群を未処置群培養と比較し、各々培養３、５および７日目について*ｐ＝０．００８、*ｐ＝０．００６および*ｐ＝０．００２で統計的有意であった。コラゲナーゼ活性は、３５℃でｃｐｍ／２４時／μｇのＤＮＡとして表示した。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｄ）非ＲＡ滑膜組織上のＭＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｅ）ＲＡ滑膜組織上のＭＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｆ）非ＲＡ滑膜組織上のＴＩＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｇ）ＲＡ滑膜組織上のＴＩＭＰ−１免疫反応性細胞。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｈ）コラーゲン−ＰＶＰ処置を行った、または行わない滑膜組織上清中でのＴＩＭＰ−１濃度（*培養７日目にｐ＝０．０４）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００５８】
ＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のＴＩＭＰ−１濃度。抗ＴＩＭＰ−１で染色したＲＡ滑膜の切片は、ＲＡ患者由来のコラーゲン−ＰＶＰ処置滑膜組織中の血管および間質細胞中で強度の免疫反応性を示した（図３Ｇ）。コラーゲン−ＰＶＰは、非ＲＡ患者由来の滑膜に何の影響も及ぼさなかった（図３Ｆ）。しかし、対照群培養中由来の上清中のＴＩＭＰ−１レベルは、７日目の処置群培養の１．７倍のレベルの糖タンパク質を含有していた（ｐ＝０．０４；図３Ｈ）。
【００５９】
非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中の接着分子の発現。炎症性マーカーであるＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１分子がコラーゲン−ＰＶＰ処置によって変化させられるかどうかを確定するために、それらを滑膜中で検出した。非ＲＡ患者由来の培養中でのＩＣＡＭ−１発現は、対照群とコラーゲン−ＰＶＰ処置群間で類似であった（１１〜１７％；表２）。しかし、ＲＡ患者由来の処置群培養では、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１分子はどちらも、対照群培養と比較して低いレベルの強度および免疫反応性を示した（表２）。これらのレベルは、ＩＣＡＭ−１については血管細胞（ｐ＝０．０３）および間質細胞（ｐ＝０．０４）中で培養７日目に統計的有意であり、処置群培養由来の陽性ＩＣＡＭ−１細胞の比率（％）は正常滑膜組織培養について決定された比率（％）と類似であった（表２）［３０］。さらに、処置群培養由来の血管および間質細胞中でのＶＣＡＭ−１発現もまた実質的なダウンレギュレーションを示した（ｐ＜０．０５；表２）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
滑膜組織培養による前炎症性サイトカインの産生。ＲＡでは、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカインが特に重要な調節因子として明らかになっている。滑膜炎症には、多数の因子が関係しており、コラーゲン−ＰＶＰがこれらのサイトカインの発現に及ぼす影響を確立するために、本発明者らは滑膜中のこれらのタンパク質を免疫組織化学的に決定した。結果は、ＩＬ−８が、非ＲＡおよびＲＡ処置群培養中に比較して、ＲＡ患者由来の非処置滑膜組織培養中で統計的有意に高いレベルで発現することを証明した（図４Ａ、Ｂ）。他方、ＩＬ−６は、ＲＡ処置群培養と対照群培養間で有意差を示さなかった（表２）。
【００６２】
コラーゲン溶解活性、ＣＡＭおよびＴＩＭＰ−１発現レベルがコラーゲン−ＰＶＰ処置によってダウンレギュレートされたので、本発明者らは、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α1の産生が変化させられたと推測した。非ＲＡ組織培養への生物薬剤の外因性添加は、血管細胞においても間質細胞においてもＴＮＦ−α発現に作用を及ぼさなかった（図４Ｃ）。ＴＮＦ−α発現は、ＲＡ患者由来の組織中では、非処置群培養と比較して統計的有意なレベルでコラーゲン−ＰＶＰによってダウンレギュレートされた（ｐ＜０．０５；図４Ｄ）。さらに、コラーゲン−ＰＶＰは、上清中のＴＮＦ−αタンパク質濃度をダウンレギュレートした（４分の１）（ｐ＜０．０２；図４Ｅ）。同様にコラーゲン−ＰＶＰ処置されたＲＡ組織（ｐ＜０．０５；図４Ｆ）および上清（３分の１；ｐ＜０．０３；図４Ｇ）中ではダウンレギュレートされたＩＬ−１βの発現パターンが観察された。
【００６３】
【化４】
【００６４】
図４．滑膜組織培養中の前炎症性サイトカイン発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）非ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＩＬ−８免疫反応性細胞。（Ｂ）ＲＡ患者由来の滑膜組織中のＩＬ−８免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。（Ｃ）非ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＴＮＦ−α免疫反応性細胞。（Ｄ）ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＴＮＦ−α免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｅ）７日目のＴＮＦ−α産生（*ｐ＝０．０３）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｆ）ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＩＬ−β免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｇ）ＲＡ滑膜培養由来の上清中のＩＬ−１β濃度（*ｐ＝０．０５）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００６５】
Ｃｏｘ−１発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。Ｃｏｘ−１は、プロスタグランジン経路アラキドン酸代謝を合成した構成的酵素である。プロスタグランジンは、局所血流量を増加させ、血管透過性を誘導するブラジキニンおよびＩＬ−１などのメディエーターの作用を増強することによって、滑膜炎症に寄与する可能性が高い。静脈では、免疫組織化学検査は、コラーゲン−ＰＶＰが未処置群培養に比較してＲＡ組織内でのＣｏｘ−１の発現にマイナスの変調を誘導することを証明した（表２）。しかし、本生物薬剤は、非ＲＡ組織への作用を示さなかった（表２）。
【００６６】
インサイチューニックトランスレーションによるアポトーシス性滑膜細胞内のＦａｓ／Ａｐｏ９５の発現およびＤＮＡストランドの破断の検出。Ｆａｓ抗原が、滑膜細胞の表面上で発現し、作用性抗Ｆａｓを用いて刺激するとＦａｓ発現滑膜細胞の細胞死を媒介することは証明されている。欠陥性アポトーシスはＲＡと密接に関連しているので、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系の機能は増殖性ＲＡ滑膜中の細胞を排除できないと思われる。そのため、本発明者らは、Ｆａｓ抗原が滑膜上で発現するかどうか、ならびにアポトーシス細胞の存在について試験した。本発明者らは、Ｆａｓ／Ａｐｏ９５が、ＲＡ滑膜コラーゲン−ＰＶＰ処置群由来の血管細胞上で優勢にアップレギュレートされることを見いだした（表２）。本発明者らがアポトーシス細胞を検出するためにＲＡ滑膜組織についてのインサイチュー細胞死検出アッセイを適用すると、ＴＵＮＥＬ技術は、コラーゲン−ＰＶＰを用いて処置された大部分の血管細胞および間質細胞中でのアップレギュレーションを証明した（５０％）（表２）（Furuzawa-Carballeda J,Rodriguez-Calderon R,Diaz de Leon L,Alcocer-Varela J.Mediators of inflammation are down-regulated while apoptosis is up-regulated in rheumatoid arthritis synovial tissue by polymerized collagen.Clin Exp Immunol 2002;130:140-9）。
【００６７】
［関節リウマチ（ＲＡ）患者における第Ｉ相臨床試験］
患者。基礎来院時およびコラーゲン−ＰＶＰの最終投与時における患者の人口統計学的および臨床的特徴は表３に要約した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
安全性。コラーゲン−ＰＶＰは安全であり、長期治療中に良好に容認され、注射部位での５分間の疼痛以外に有害事象は検出されなかった。
【００７０】
有効性および臨床的有益性。８例の疼痛のある関節内での３カ月間中のコラーゲン−ＰＶＰの皮下投与は、膨張して敏感な疼痛関節点数（Ritchie指数もしくはＲＩ）（図５）が急速に改善されたことを証明した（ＲＩ：Δ−１０．２≒−４６．４％；膨張した疼痛関節点数：Δ−１０．７≒−７１．８％）。この改善は、長期療法中にわたり維持された。
【００７１】
さらに、早朝硬直および目視アナログスケールによる疼痛などの疾患活動度の他の変量における変化において極めて類似する高度の有意差がみられた（早朝硬直：Δ−３２．３≒−６８．６％；ＶＡＳ：Δ−３９．９≒−６３．８％；図５）。
【００７２】
【化５】
【００７３】
図５．コラーゲン−ＰＶＰを用いた治療進行中の臨床的発現における変化。１．７ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰの用量は、活性関節の持続性減少を生成した。疼痛関節点数：* ｐ＝０．０２、１対１３週間；腫れ上がった関節点数：* ｐ＝０．００７、１対７週間；* ｐ＝０．００１、１対１３週間；早朝硬直：* ｐ＜０．００９、１対７週間および* ｐ＜０．０２、１対１３；疼痛：* ｐ＝０．００７、１対７週間；* ｐ＝０．００１、１対１３週間。１＝初回来院もしくはベースライン時；３＝第３回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第２回皮下投与；７＝第７回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第６回皮下注射；１３＝第１３回来院および第１２回皮下投与。
【００７４】
患者は、さらに疾患活動度スコア（ＤＡＳ）における統計的有意な改善を示した（ＤＡＳ：Δ−１．３５≒−７０．５％、ｐ＜０．０２）。改善は、さらにまた２０、５０および７０％の米国リウマチ学会反応基準（ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０）を用いて決定した。ＡＣＲ２０は、３カ月後に８０．０％の患者によって達成された（患者１０例中８例）。同様に、６０．０％の患者がＡＣＲ５０（患者１０例中６例）を達成し、２０．０％はこの時点にＡＣＲ７０（患者１０例中２例）を達成した（図６）。身体的機能状態（Spanish-HAD-DI）は、さらにまたベースライン値と３カ月間のコラーゲン−ＰＶＰ治療との変化における統計的有意差を示した（ＨＡＱ−ＤＩ：Δ−０．５≒−４８．５％；ｐ＜０．０５、１対１３週間；図６）。
【００７５】
【化６】
【００７６】
図６．疾患活動度スコア（ＤＡＳ）、健康評価質問票−作業不能指数（ＨＡＱ−ＤＩ）および米国リウマチ学会（ＡＣＲ）基準により評価した治療法への応答。ＤＡＳ：* ｐ＝０．０１５、１対１３週間およびＨＡＱ−ＤＩ：* ｐ＝０．０４５、１対１３週間。１＝初回来院もしくはベースライン時；３＝第３回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第２回皮下投与；７＝第７回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第６回皮下注射；１３＝第１３回来院および第１２回皮下投与。
【００７７】
併用薬。全患者が、試験３カ月間中の経口メトトレキセートおよび併用ＮＳＡＩＤの用量を変更しなかった（表３）。
【００７８】
検査室評価。赤血球沈降速度、血液学的定数（ヘモグロビン、ヘマトクリット、血液化学、赤血球数、白血球および血小板）、Ｃ反応性タンパク質またはリウマチ因子における変化は生じなかった。ベースライン時および試験終了後のＤＮＡの二本鎖に対する抗体およびリボ核タンパク質に対して陽性の患者は１例もいなかった。
【００７９】
放射線による分析では、ベースライン時および試験終了後に有意差はみられなかった。しかし、重要にも、狭小化関節間腔、骨侵害または軟骨変性のいずれも生じなかったことに注目されたい（Furuzawa-Carballeda J,Cabral AR,Zapata-Zuniga M,Alcocer-Varela J.Subcutaneous administration of polymerized-type I collagen for the treatment of patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 2003;30:256-9）。
【００８０】
インビトロ試験は、重合化Ｉ型コラーゲン（コラーゲン−ＰＶＰ）の抗炎症性およびアポトーシス作用、ならびにＲＡ患者由来の滑膜組織中のコラーゲン代謝回転について評価した。
【００８１】
これらの試験結果に基づいて、本発明者らは、本生物薬剤がコラーゲン溶解活性、ならびにＴＩＭＰ−１産生を減少させ、ＩＩＩ型コラーゲンおよびＴＩＭＰ−１の量を正常滑膜中で観察される類似レベルへ増加させるので、ＲＡ滑膜培養に加えられたコラーゲン−ＰＶＰがコラーゲン代謝回転を変調させると提案する。慢性炎症性プロセスは、以前にKrotzsch-Gomez et al.およびBarile L et al.によって報告されたように（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E,Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol 1998;111:828-34;Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs..triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）、おそらくＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８ならびに細胞接着分子のダウンレギュレーションおよびＣｏｘ−１活性化を誘導するために、コラーゲン−ＰＶＰ作用によって変化させられる。その上インテグリン−細胞外マトリックス相互作用を通しての細胞結合は、ＭＭＰ発現を調節するシグナルを生成し（Larjava H,Lyons J,Salo R,Makela M,Koivisto L,Birkedal-Hansen H,Akiyama SK,Yamada KM,Heino J.Anti-integrin antibodies induce type IV collagenase gene expression in keratinocytes.J Cell Physiol 1993;157:190-200;Romanic AM,Madri JA.The induction of 72 kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent.J Cell Biol 1994;125:1165-78;Tremble P,Chiquet-Ehrismann R,Werb Z.The extracellular matrix ligands fibronectin and tenascin collaborate in regulating collagenase gene expression in fibroblasts.Mol Biol Cell 1994;5:4390-3;Rukonen T,Westermarck J,Koivisto L,Broberg A,Kahari VM,Heino.Integrin α2β1 is a positive regulator of collagenase(MMP-1)and collagen α1(I)gene expression.J Biol Chem 1995;270:13548-52）、これは、細胞接着分子がＲＡ組織破壊にも関係する可能性があることを示唆している。同様に、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生減少は、滑膜培養中のアポトーシスを介して滑膜細胞死を刺激すると思われ、後者は最終的に過形成もしくはパンヌス形成およびＲＡ関節の破壊を引き起こす滑膜細胞の増殖を阻害することに寄与する可能性がある（Furuzawa-Carballeda J,Rodriguez-Calderon R,Diaz de Leon L,Alcocer-Varela J.Mediators of inflammation are down-regulated while apoptosis is up-regulated in rheumatoid arthritis synovial tissue by polymerized collagen.Clin Exp Immunol 2002;130:140-9）。
【００８２】
結論として、本発明者らは、滑膜組織培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加がリウマチ様滑膜中のダウンモジュレーションを誘導するが、炎症パラメータの阻害を誘導しないことを証明した。
【００８３】
本試験は、コラーゲン−ＰＶＰをＲＡ治療のための補助剤と見なすために大きな意味を有していた。最後の確認は、Ｉ型コラーゲンが系統発生学的に最も古い細胞外マトリックスタンパク質の１つであるという知識に基づいていた。コラーゲン−ＰＶＰは極めて低い抗原性を有しており、相当容易に代謝される。さらに、細胞が新規組織を形成するように刺激することができ、これはコラーゲンが情報に関する特性を有することを意味している（Pohunlova H,Adam M.Reactivity and the fate of some composite bioimplants based on collagen in connective tissue.Biomaterials 1995;16:67-71）。1981年に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、軟組織の容積を強化するための医療用具としての再構成された精製ウシコラーゲンの注射製剤（Zyderm;Collagen Corp.，カリフォルニア州パロ・アルト）の使用を承認した（Clark DP,Hanke CW,Swanson NA.Dermal implants:Safety of products injected for soft tissue agumentation.J Am Acad Dermatol 1989;21:992-8）。この注射形のコラーゲンに関する現在の関心は、より広範囲の臨床適用を規定すること、そして新規製品の開発に集中している。
【００８４】
現在まで、注射可能なコラーゲンまたはコラーゲンインプラントの大多数はウシ皮膚もしくは腱アテロペプチドコラーゲン（Zyderm、ZyplastおよびAtelocollagen）から引き出された（Soo Ch,Rahbar G,Moy RL.The immunogenicity of bovine collagen implants.J Dermatol Surg Oncol 1993;19:431-434;Charriere G,Bejot M,Schnitzler L,Ville G,Hartmann DJ.Reactions to a bovine collagen implant.J Am Acad Dermatol 1989;21:1203-1208）。しかし、本試験では重合化ブタＩ型コラーゲンを使用した。これは、抗炎症特性を有する（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E,Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol 1998;111:828-34;Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs..triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）。コラーゲン−ＰＶＰは、弱い免疫原であるためにペプシン化ブタＩ型皮膚コラーゲン（アテロペプチド）から製造される。本発明者らは、ブタが特に、ヒトコラーゲンとの高相同性を含む様々な実際的、倫理的、および安全性の理由において異種移植片の起源として提案された主要動物種であるために、ブタＩ型コラーゲンを好んだ（Weiss RA.Xenografts and retroviruses.Science 1999;285:1221-1222;Paradis K,Langford G,Long Z,Heneine W,Sandstrom P,Switzer WM,Chapman LE,Lockey Ch,Onions D,Otto E.Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue.Science 1999;1236-1241;Beard HK,Faulk WP,Conochie LB,Glynn LE.Some immunological aspects of collagen.Progr Allergy 1977;22:45-106）。
【００８５】
他方、電気泳動データは、コラーゲン−ＰＶＰがＰＶＰへ共有結合することを示唆している。ＰＶＰとの共有結合は、増加したコラーゲン安定性および減少したコラーゲン抗原性の両方を有している。固有の化学的性質のために、低分子量はＰＶＰを生物学的に不活性および安全にさせる（Clark DP,Hanke CW,Swanson NA.Dermal implants:Safety of products injected for soft tissue agumentation.J Am Acad Dermatol 1989;21:992-8;Soo Ch,Rahbar G,Moy RL.The immunogenicity of bovine collagen implants.J Dermatol Surg Oncol 1993;19:431-434）。その上に、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンのホモポリマーもしくはＰＶＰは、本生物薬剤にコラーゲンまたはＰＶＰ単独において観察される医薬特性とは相違する医薬特性を付与する。
【００８６】
ウシコラーゲンインプラントとは対照的に、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰを用いた場合に以前に記載された副作用（過敏性反応、軽度の紅斑、蕁麻疹、局所的腫脹、および特異的抗Ｉ型コラーゲン抗体産生）などの有害な副作用を見いださなかった（McClelland M,DeLustro F.Evaluation of antibody class in response to bovine collagen treatment in patients with urinary incontinence.J Urol 1996;155:2068-73;DeLustro F,Fries J,Kang A.Immunity to injectable collagen and autoimmune disease:a summary of current understanding.J Dermatol Surg Oncol 1988;14(Suppl I):57-65;Singh G,Fries JF.Autoimmune disease and collagen dermal implants.Ann Int Med 1994;120:524;Lewy RI.Autoimmune disease and collagen dermal implants.Ann Int Med 1994;120:525）。コラーゲン投与を行ったSieper,et al.,(1996)の試験とは相違して、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰの投与後に有害な作用も検査室検査結果（Ｃ反応性タンパク質、赤血球沈降速度またはリウマチ因子）における上昇も見いださなかった（Sieper J,Kary S,Sorensen H,Alten R,Eggens U,Huge W,Hiepe F,Kuhne A,Listing J,Ulbrich N,Braun J,Zink A,Mitchison NA.Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis.A double-blind,placebo-controlled,randomized trial.Arthritis Rheum 1996;39:41-9）。
【００８７】
コラーゲン−ＰＶＰ投与スキームは、マウスにおける疾患誘導後第７、１４、２１日における同等量のコレラ毒素Ｂサブユニット−ＩＩ型コラーゲンコンジュゲートを用いた１日１回の３回の投与対週１回の３回の投与の作用が非コンジュゲート化ＩＩ型コラーゲンまたは対照コレラ毒素Ｂを用いて１日１回治療されたマウスと比較して関節炎の発生率を有意に減少させることを証明したTarkowskiのスキーム（1999）と一致していた（Tarkowski A,Sun J-B,Holmdahl R,Holmgren J,Czerkinsky C.Treatment of experimental autoimmune arthritis by nasal administration of a type II collagen-cholera toxoid conjugate vaccine.Arthritis Rheum 1999;42:1628-34）。
【００８８】
用量（１．７ｍｇのコラーゲン）、投与経路（皮下）、および投与頻度によって、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰが、寛容誘導分子のように他の投与経路より有効であり、低い毒性作用を伴って機能できると提案する。コラーゲン−ＰＶＰの背景に基づいて、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰがアネルギーよりもサイトカイン分泌調節細胞を生成すると考える（Furuzawa-Carballeda J,Cabral AR,Zapata-Zuniga M,Alcocer-Varela J.Subcutaneous administration of polymerized-type I collagen for the treatment of patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 2003;30:256-9）。
【００８９】
ＡＣＲ基準を用いると、１．６ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰを用いた２０％の応答率は３カ月後に８０．０％であった。より厳しい基準を用いても良好な結果が得られた（ＡＣＲ５０で６０．０％の応答率およびＡＣＲ７０での２０．０％の応答率）。これらの数値は、第２相臨床試験においてetanerceptによって入手された数値と類似であった（Moreland LW,Baumgartner S,Schiff MH,et al.Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human tumor necrosis factor receptor(p75)-Fc fusion protein.N Engl J Med 1997;337:141-7）。
【００９０】
大多数のケースで、１２週間にわたり連続的な改善がみられ、これは治療期間が長いほど好都合であるという証拠と見なすことができよう。
【００９１】
これらの有望な結果そしてこの療法が知られている副作用を有していないという事実を前提にして、その有効性、至適用量、作用機序、プラセボ対照試験およびその他の投与経路を評価する詳細な試験が必要とされる。
【００９２】
［関節リウマチの患者を治療するためのコラーゲン−ＰＶＰ。二重盲験プラセボ対照試験における筋肉内投与の作用］
本試験は、プロスペクティブの長期二重盲験プラセボ対照試験であり、活動性ＲＡ（ＡＣＲ）の患者３０例を含んでいた。安定性用量のメトトレキセートを摂取していた患者を、６カ月間に渡り０．４ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰ（３．３３ｍｇのコラーゲン）または０．４ｍＬのプラセボの筋肉内注射を行うFreybergスキームで治療した。主要エンドポイントには、疾患活動度スコア（ＤＡＳ）が含まれ、改善はRitchie指数（ＲＩ）、腫れ上がった関節点数、スペイン健康評価質問票（ＨＡＱ−ＤＩ）、目視アナログスケール上の疼痛強度（ＶＡＳ）および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む５種中３種の評価における平均変化を意味する米国リウマチ学会応答基準（ＡＣＲ２０、５０および７０）を用いて決定した。統計的分析は、両側Mann Whitney U検定を用いて実施した。コラーゲン−ＰＶＰは安全で良好に容認された。患者は６カ月間の治療でコラーゲン−ＰＶＰ治療群対プラセボ群において統計的有意な改善を示した（ｐ＜０．０５）：腫れ上がった関節点数（８．１±３．７対１７．９±４．８）、ＲＩ（１０．７±３．３対１７．８±５．４）、早朝硬直（９．４±４．６対３７．８±６．７）、リウマチ因子（２０７．７±１７９．１対５１８．８±２９３．２）、Ｃ反応性タンパク質（２．７±３．９対２８．１±２４．５）、ＨＡＱ（４６．７±１５．６対１８．８±１３．７）、ＤＡＳ（３．５±０．７対４．８±０．９）、ＡＣＲ２０（１００対７７．８％）、ＡＣＲ５０（６７．６対１１．１％）、ＡＣＲ７０（３３．３対０％）。血清学的または血液学的パラメーターは変化しないままであった。有害事象は生じなかった。
【００９３】
［結論］
コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、おそらく末梢免疫寛容を通して、ＲＡに罹患している患者の滑膜組織中で炎症、アポトーシス誘導、ならびにコラーゲン代謝回転に重要なダウンモジュレーション作用を示す。
【００９４】
このコポリマーは、増殖よりむしろ細胞代謝を変化させる。これは、ＩＩＩ型コラーゲン相対速度が上昇し、他方この薬物で治療された滑膜中のＩ型コラーゲンが減少するので、コラーゲンの総含量は変化させられないことで示唆されている。同様に、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、カルシウム非依存性コラゲナーゼ、ＥＣＭタンパク質、主としてコラーゲンの代謝回転を変化させ、そしてＩＩＩ型コラーゲンの含量を再確立するためにタンパク質溶解活性を減少させる。
【００９５】
上記に示した情報は、コラーゲン−ポリビニルピロリドンによるコラーゲン溶解活性減少の誘導がリウマチ性滑膜炎続発症、炎症性細胞による軟骨および骨侵襲ならびにそれらの侵害および分解を減少させることに寄与できることを示唆している。
【００９６】
さらにその上、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、ＲＡ組織中のＴＩＭＰ−１の増加を誘導するが、これはＥＣＭ代謝回転がＴＩＭＰ−１によるＭＭＰ遮断に関係する機序によって減少させられることを示唆している。
【００９７】
結果として、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、本薬剤が細胞接着分子をダウンモジュレートし、この作用が細胞―細胞結合を予防するために、炎症性細胞侵襲および線維症を回避する。
【００９８】
この情報によって、本発明者らは、コラーゲン−ポリビニルピロリドン免疫変調作用が、滑膜関節への白血球遊走の減少を通して間質細胞および内皮細胞中での接着分子発現を変調することに集中していると提案する。
【００９９】
最後に、ＲＡにおいて、本コポリマーはこれらの前炎症性サイトカイン：ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−βをダウンモジュレートする。生理学的に、それらはＣｏｘ−１活性化を誘導できる結果として、ＰＧＥ2合成ならびに関節軟骨および骨吸収を増加させることができる。
【０１００】
同様に、以前に言及したサイトカインは、マウスモデルにおけるインビトロおよびインビボでのＲＡの開始および疾患バーストと関連付けられてきた。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８などの数種の他のサイトカインの合成および遊離を誘導することができ、それらは全部がＭＭＰの産生および活性を増加させ、ＲＡ患者由来の滑膜中のＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１毛細管発現を減少させることは周知である。
【０１０１】
結論として、ＲＡを罹患している、低用量のメトトレキセートおよび／またはＮＳＡＩＤを摂取していた患者へのコラーゲン−ポリビニルピロリドンを用いた８例のより疼痛性の関節に対する皮下治療は、疾患指数（ＤＡＳ）を改善し、以下のRitchie指数（疼痛性関節）、炎症性関節評価、疾患活動度（ＨＡＱ）に関する患者の一般的な評価、相対疼痛尺度（ＥＶＡ）、ならびに急性期タンパク質の５種中３種の尺度（ＡＣＲ２０）における重要な変化を生じさせた。コラーゲン−ポリビニルピロリドン治療は血液もしくは血清中の変化を刺激せず、このコポリマーはこれが生物学的コポリマーであり、現在までは、患者が長期間（１２カ月より多く）にわたり治療された場合でさえ、患者にとってのリスクを産生しない、抗Ｉ型コラーゲンも抗コラーゲン−ポリビニルピロリドン抗体も抗ＳＳＡ／ＳＳＢもしくは抗ＤＮＡ抗体を刺激しないという利点を示す。コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、短期間ＲＡ療法のために安全かつ有効な生体分子である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
記載なし。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン−ポリビニルピロリドンから調製された関節炎症を変調する組成物に関し、メキシコ人集団における関節炎症の発生率、および本組成物が免疫を変調すると考えられる理由ならびにそれ自体が免疫を変調する組成物であると考えられるために試験されたパラメータについて精査する。
【０００２】
結果として、適用分野は、医学に適用される生物学的製剤の領域と決定される。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ:Rheumatoid arthritis）は、メキシコ人集団における罹患率が高い（０．３％；範囲０．１〜０．６）自己免疫疾患である。ＲＡは、慢性炎症性浸潤、滑膜過形成、線維症ならびに最終的には関節軟骨変性および肋軟骨下骨侵食の存在を特徴とする。その病理は、滑膜組織に浸潤する様々な種類や量の活性化細胞、細胞接着分子（ＣＡＭ）を通しての直接的細胞−細胞接触、およびこの疾患の破壊的特性に関連する関節組織成分の過剰な分解に向かう不均衡を作り出す前炎症性サイトカイン過剰発現の産物である（Feldmann M,Brennan FM,Maini RN,Role of cytokines in rheumatoid arthritis.Ann Rev Immunol 1996;14:397-9）。
【０００４】
免疫学的には、ＲＡ滑膜組織は、相乗作用的に作用して「関節炎原性(arthritogenic)サイトカイン」と見なされているインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（Cooper WO,Fava RA,Gates CA,et al.Acceleration of onset of collagen-induced arthritis by intra-articular injection of tumour necrosis factor or transforming growth factor-beta.Clin Exp Immunol 1992;89:244-50）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む前炎症性サイトカインの過剰産生を特徴とする（Gowen M,Wood DD,Ihrie EJ,McGuire MKB,Russell RG.An interleukin-I like factor stimulates bone resorption in vitro.Nature 1983;306:378-81;Moreland LW.Inhibitors of tumor necrosis factor for rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1999;26Suppl57:7-15;Manicourt DH,Triki R,Fukuda K,et al.Levels of circulating tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1993;36:490-9;Dolhain RJEM,Tak PP,Brennan FM,Chantry D,Turner M,et al.Inhibitory effect of TNF-α antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 1989;2:244-7;Brennan FM,Maini RN,Feldmann M.Cytokine expression in chronic inflammatory disease.Br Med Bull 1995;51:368-84;Hildner K,Finotto S,Becker C,et al.Tumour necrosis factor(TNF)production by T cell receptor-primed T lymphocytes is a target for low dose methotrexate in rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 1999;118:137-46;Minghetti PP,Blackburn WD Jr.Effects of sulfasalazine and its metabolites on steady state messenger RNA concentrations for inflammatory cytokines,matrix metalloproteinases,and tissue inhibitors of metalloproteinase,in rheumatoid synovial fibroblasts.J Rheumatol 2000;27:653-60;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scand J Immunol 1999;50:215-22）。
【０００５】
関節炎原性サイトカインは、ＲＡ滑液中だけではなく滑膜組織中でも検出されている（Gowen M,Wood DD,Ihrie EJ,McGuire MKB,Russell RG.An interleukin-I like factor stimulates bone resorption in vitro.Nature 1983;306:378-81;Beutler BA.The role of tumor necrosis factor in health and disease.J Rheumatol 1999;26Suppl57:16-21;Black RA,Rauch ChT,Kozlosky CJ.A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells.Nature 1997;385:729-33;Moreland LW.Inhibitors of tumor necrosis factor for rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1999;26Suppl57:7-15;Wakisaka S,Suzuki N,Takeba Y,et al.Modulation by proinflammatory cytokines of Fas/Fas ligand-mediated apoptotic cell death of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis(RA).Clin Exp Immunol 1998;114:119-28;Kiener HP,Hofbauer R,Tohidast-Adrad M,et al.Tumor necrosis factor α promotes the expression of stem cell factor in synovial fibroblasts and their capacity to induce mast cell chemotaxis.Arthritis Rheum 2000;43:164-74;Manicourt DH,Triki R,Fukuda K,et al.Levels of circulating tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1993;36:490-9;Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8;Manicourt D-H,Poilvache P,Van Egeren A,et al.Synovial fluid levels of tumor necrosis factor α and oncostatin M correlate with levels of markers of the degradation of crosslinked collagen and cartilage aggrecan in rheumatoid arthritis but not in osteoarthritis.Arthritis Rheum 2000;43:281-8;Brennan FM,Chantry D,Turner M,et al.Inhibitory effect of TNF-α antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 1989;2:244-7;Brennan FM,Maini RN,Feldmann M.Cytokine expression in chronic inflammatory disease.Br Med Bull 1995;51:368-84;Hildner K,Finotto S,Becker C,et al.Tumour necrosis factor(TNF)production by T cell receptor-primed T lymphocytes is a target for low dose methotrexate in rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 1999;118:137-46;Minghetti PP,Blackburn WD Jr.Effects of sulfasalazine and its metabolites on steady state messenger RNA concentrations for inflammatory cytokines,matrix metalloproteinases,and tissue inhibitors of metalloproteinase,in rheumatoid synovial fibroblasts.J Rheumatol 2000;27:653-60;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scand J Immunol 1999;50:215-22;Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8）。
【０００６】
他方、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γなどの抗炎症性リンホカインは、関節内では検出されていない（Firestein GS,Xu W-D,Townsend K,et al.Cytokines in chronic inflammatory arthritis.I.Failure to detect T cell lymphokines(interleukin 2 and interleukin 3)and presence of macrophage colony-stimulating factor(CSF-1)and a novel mast cell growth factor in rheumatoid synovitis.J Exp Med 1988;168:1573-86;Salmon M,Gaston JSH.The role of T-lymphocytes in rheumatoid arthritis.Br Med Bulletin 1995;51:332-45）。
【０００７】
ところで前炎症性サイトカインは、これらのサイトカインが細胞表面膜上の特異的受容体発現に直接的作用を及ぼすために、炎症性病巣に関連する傷害およびパンヌス形成のメカニズムを調節する。これらの受容体には、特にセレクチンファミリー（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）、インテグリンファミリーのメンバー：β1サブファミリーもしくはＶＬＡもしくは超遅発活性化抗原、β2サブファミリーもしくはロイコインテグリンおよびβ3サブファミリー（El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21）またはサイトアドヘシン（cytoadhesin）ファミリーならびに免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）が含まれる。
【０００８】
ＲＡのＢ型滑膜細胞または滑膜組織についての免疫組織化学的アッセイは、一部の接着分子の発現における変化を証明した：セレクチンファミリーからはＥＬＡＭ−１およびＰＥＸＣＡＭの増加が証明されている。それらは関節炎原性サイトカインによってアップレギュレートされる（Dolhain RJEM,Tak PP,Dijkmans BAC,et al.Methotrexate reduces inflammatory cell numbers,expression of monokines and of adhesion molecules in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis.Br J Rheumatol 1998;37:502-8;Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311;El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21;Youssef PP,Triantafillou S,Parker A,et al.Variability in cytokine and cell adhesion molecule staining in arthroscopic synovial biopsies:quantification using color video image analysis.J Rheumatol 1997;24:2291-8）。
【０００９】
インテグリンファミリーからは、おそらくはＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの過剰発現に起因するα6β1の減少が決定されている；αvβ5インテグリンは発現せず、α1-5β1インテグリンならびにαL、αM、αXおよびαdロイコインテグリンは正常滑膜組織に関連して増加していた（El-Gabalawy H,Canvin J,Gouping M,et al.Synovial distribution of αd/CD18,a novel leukointegrin.Arthritis Rheum 1996;39:1913-21;Youssef PP,Triantafillou S,Parker A,et al.Variability in cytokine and cell adhesion molecule staining in arthroscopic synovial biopsies:quantification using color video image analysis.J Rheumatol 1997;24:2291-8;Pirila L,Heino J.Altered integrin expression in rheumatoid synovial lining type B cells:In vitro cytokine regulation of α1β1,α6β1,and αvβ5 integrins.J Rheumatol 1996;23:1691-8;Cicuttini FM,Martin M,Boyd AW.Cytokine induction of adhesion molecules on synovial type B cells.J Rheumatol 1994;21:406-12）。
【００１０】
免疫グロブリンスーパーファミリーからは、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１発現の増加が証明されている。増加した細胞接着分子発現は、前炎症性サイトカインによって調節される（Cicuttini FM,Martin M,Boyd AW.Cytokine induction of adhesion molecules on synovial type B cells.J Rheumatol 1994;21:406-12）。
【００１１】
同様に、ＲＡの生理病理学では、カルシウム非依存性および依存性プロテアーゼ（ＭＭＰ）が、関節破壊現象およびパンヌス形成において重要な役割を果たす。リウマチ様滑膜中で高濃度で測定されたカルシウム非依存性プロテアーゼには、システインプロテアーゼ（カテプシンＬ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）および好中球エラスターゼが含まれる。他方、ＭＭＰ−１、−２、−３および１３は滑膜組織中で過剰発現するが、ＭＭＰ−９および−１０は過剰発現しない（Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Owen CA,Campbell MA,Boukedes SS,Campbell EJ.Inducible binding of bioactive cathepsin G to the cell surface of neutrophils.J Immunol 1995;155:5803-10;Koolwijk P,Miltenburg AMM,Van Erck MGM,et al.Activated gelatinase-B(MMP-9)and urokinase-type plasminogen activator in synovial fluids of patients with arthritis.Correlation with clinical and experimental variables of inflammation.J Rheumatol 1995;22:385-93;Maeda S,Sawai T,Uzuki M,et al.Determination of interstitial collagenase(MMP-1)in patients with rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:970-5;Hembry RM,Bagga MR,Reynolds JJ,Hamblen DL.Immunolocalisation studies on six matrix metalloproteinases and their inhibitors,TIMP-1 and TIMP-2,in synovia from patients with osteo- and rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:25-32;Tetlow LC,Woolley DE.Mast cells,cytokines,and metalloproteinases at the rheumatoid lesion:dual immunolocalisation studies.Ann Rheum Dis 1995;54:896-903）。
【００１２】
ＲＡ患者由来の滑液および血清中で実施されたアッセイは、対照被験者から入手した滑液および血清中に比較して、主としてＭＭＰ−３、−１および−９が重大な量で見いだされることを証明している。プロテアーゼの濃度は、滑膜炎症強度と直接的に相関付けることができる（Ishiguro N,Ito T,Obata K-I,et al.Determination of stromelysin-1,and 92 kDa type IV collagenase,Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1(TIMP-1),and TIMP-2 in synovial fluid and serum from patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 1996;23:1599-604;Watanabe Y,Shimamori N,Yamaguchi R,et al.Correlation between the appearance of gelatinases in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis and polymorphonuclear elastase,stromelysin-1,and the tissue inhibitor of metalloproteinase-1.Clin Exp Rheumatol 1997;15:255-61）。
【００１３】
プロテアーゼの発現は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαなどの前炎症性サイトカイン（Shingu M,Miyauchi S,Nagai Y,et al.The role of IL-4 and IL-6 in IL-1-dependent cartilage matrix degradation.Br J Rheumatol 1995;34:101-6;West-Mays JA,Strissel KJ,Sadow PM,Fini ME.Competence for collagenase gene expression by tissue fibroblasts requires activation of an interleukin 1β autocrine loop.Proc Natl Acad Sci 1995;92:6768-72;Migita K,Eguchi K,Kawabe Y,et al.TNF-α-mediated expression of membrane-type matrix metalloproteinase in rheumatoid synovial fibroblasts.Immunol 1996;89:553-7;Cawston TE,Curry VA,Summers CA,et al.The role of oncostatin M in animal and human connective tissue collagen turnover and its localization within the rheumatoid joint.Arthritis Rheum 1998;41:1760-9）ならびにインテグリンについてはそれらのリガンドとの相互作用、例えばαvもしくはα4とフィブロネクチン、β2−マイクログロブリンと主要組織適合複合体、ＶＣＡＭ−１とＶＬＡ−４などの相互作用によってアップレギュレートされる（Larjava H,Lyons J,Salo R,et al.Anti-integrin antibodies induce type IV collagenase gene expression in keratinocytes.J Cell Physiol 1993;157:190-200;Romanic AM,Madri JA.The induction of 72 kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent.J Cell Biol 1994;125:1165-78;Tremble P,Chiquet-Ehrismann R,Werb Z.The extracellular matrix ligands fibronectin and tenascin collaborate in regulating collagenase gene expression in fibroblasts.Mol Biol Cell 1994;5:4390-3;Rukonen T,Westermarck J,Koivisto L,et al.Integrin α2β1 is a positive regulator of collagenase(MMP-1)and collagen α1(I)gene expression.J Biol Chem 1995;270:13548-52;Migita K,Eguchi K,Tominaga M,et al.α2-Microglobulin induces stromelysin production by human synovial fibroblasts.Biochem Biophys Res Comm 1997;239:621-5;Sarkissian V,Lafyatis R.Integrin engagement proliferation and collagenase expression of rheumatoid synovial fibroblasts.J Immunol 1999;162:1772-9）。プロテアーゼの発現および／または活性における阻害は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−γ（Prontera C,Crescenzi G,Rotilio D.Inhibition by interleukin-4 of stromelysin expression in human skin fibroblasts:role of PKC.Exp Cell Res 1996;224:183-8;Lacraz S,Nicod LP,Chicheportiche R,et al.IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclear phagocytes.J Clin Invest 1995;96:2304-10;Busiek DF,Baragi V,Nehring LC,et al.Matrilysin expression by human mononuclear phagocytes and its regulation by cytokines and hormones.J Immunol 1995;159:6484-91;Overall ChM.Regulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editores:Greenwald RA,Golub LM 1994;732:59-64）またはα1−アンチトリプシンもしくはα2−マクログロブリンなどの非特異的阻害剤およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）（Hayakawa T,Yamashita K,Tanzawa K,et al.Growth-promoting activity of tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1)for a wide range of cells.A possible new growth factor in serum.FEBS Lett 1992;298:29-32）などの特異的阻害剤によって調節される。ＴＩＭＰは、高度の親和性で結合しており、非共有的かつ不可逆性方法でＭＭＰプロフォームおよび活性形との化学量論的複合体（１：１）を形成している（Bodden MK,Windsor LJ,Caterina NM,et al.Analysis of the TIMP-1/FIB-CL complex.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editors:Greenwald RA,Golub LM.1994;85-95）。ＴＩＭＰ−１および−３は全ＲＡ滑膜組織中に分布しているが、ＴＩＭＰ−２は検出されない（Hembry RM,Bagga MR,Reynolds JJ,Hamblen DL.Immunolocalisation studies on six matrix metalloproteinases and their inhibitors,TIMP-1 and TIMP-2,in synovia from patients with osteo- and rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 1995;54:25-32）。
【００１４】
骨関節症（ＯＡ:osteoarthritis）もしくは変形性関節症は、最も一般的なリウマチ性障害である。変形性関節症の罹患率は男女どちらについても類似であり、症状を伴う、または伴わない放射線学的特性は、６０または７０年以上前から全世界で周知である。メキシコ人集団の２．３％（範囲１．７〜２．９％）がＯＡに罹患している。世界保健機構および米国整形外科アカデミーは、変形性関節症についての提案基準において、この疾患を次のように規定した：「変形性関節症は、関節軟骨および肋軟骨下骨の分解および合成の正常な結び付きを不安定化させる機械的および生物学的両方の事象の結果である。この疾患は、遺伝性、発達性、代謝性および外傷性を含む複数の因子によって開始される可能性があるが；ＯＡは可動関節の組織の全てを含んでいる。最終的に、ＯＡは、関節軟骨の軟化、線維化、潰瘍化および消失、肋軟骨下骨の硬化および象牙質化、骨増殖体、ならびに肋軟骨下嚢胞を引き起こす、細胞および基質両方の形態学的、生化学的、分子学的、および生体力学的変化によって発現する。臨床的に明らかになった時点で、ＯＡは関節痛、圧痛、運動制限、摩擦音、時折の浸出液、および程度の様々な局所的炎症を特徴とする」（Ramos NF.Enfermedad articular degenerativa.In:Enfermedades Reumaticas.Criterios y Diagnostico.Editorial McGraw-Hill Interamericana.1a.Edicion,Tomo II;1999,pags:437-63;Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47）。
【００１５】
臨床的には、ＯＡは、関節痛、圧力を受けた場合の疼痛、作業不能、摩擦音、時折の滑液の増大および全身性障害を伴わない数段階の局所的炎症を特徴とする。
【００１６】
病理学的には、ＯＡは、体重を支える領域でより頻回に発生する不規則な軟骨損傷、肋軟骨下骨の硬化症、肋軟骨下嚢胞、限界的骨増殖体、骨幹端血液流入および程度の様々な滑膜炎の増加を特徴とする。
【００１７】
組織学的には、ＯＡは、関節面の早期断裂、軟骨細胞凝集、軟骨の縦の破断、ならびに様々な結晶沈着および後期の血管による継目侵害を特徴とする。ＯＡは、さらにまた特に骨増殖体の創傷治癒、および次に完全軟骨損傷、硬化症および肋軟骨下骨の限局性骨壊死を特徴とする。
【００１８】
生体力学的には、ＯＡは、引っ張り特性、圧縮および滑りの変化ならびに軟骨水力学的透過性、水分蓄積および過度の体積を特徴とする。軟骨の変化には骨の硬直の増大が付随する。
【００１９】
生化学的には、ＯＡは、プロテオグリカン濃度の減少、プロテオグリカンのサイズおよび凝集が変化する可能性、コラーゲンのサイズおよび組織の変化、基質高分子の代謝回転の増加を特徴とする（Lark MW,Bayne EK,Flanagan J,et al.Aggrecan degradation in human cartilage.Evidence for both matrix metalloproteinase and aggrecanase activiy in normal,osteoarthritic and rheumatoid joints.J Clin Invest 1997;100:93-106;Ramos NF.Enfermedad articular degenerativa.In Enfermedades Reumaticas.Criterios y Diagnostico.Editorial McGraw-Hill Interamericana.1a.Edicion,Tomo II;1999,pags:437-63;Rowan AD,Koshy PJT,Shingleton WD,et al.Synergistic effects of glycoprotein 130 binding cytokines in combination with interleukin-1 on cartilage collagen breakdown.Arthritis Rheum 44:1620-32）。
【００２０】
治療学的には、ＯＡは、特定の療法がないことを特徴とする（Felson DT.The veredict favors nonsteroidal antiinflammatory drugs for treatment of osteoarthritis and a plea for more evidence on other treatments.Arthritis Rheum 2001;44:1477-80）。
【００２１】
免疫学的には、ＯＡは、前炎症性サイトカイン、接着分子およびプロテアーゼの過剰発現と結び付いており、これらは定性的にはＲＡにおいて検出されるものに類似するが、定量的にはリウマチ性関節におけるより低濃度であると思われる（Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scan J Immunol 1999;50:215-22;Rowan AD,Koshy PJT,Shingleton WD,et al.Synergistic effects of glycoprotein 130 binding cytokines in combination with interleukin-1 on cartilage collagen breakdown.Arthritis Rheum 44:1620-32;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J.IL-8,IL-10,ICAM-1 and VCAM-1 expression levels are higher in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis than in osteoarthritis.Scan J Immunol 1999;50:215-22;;Cronstein BN,Weissman R.The adhesion molecules of inflammation.Arthritis Rheum 1993;36:147-57;Pelletier J-P,Martel-Pelletier J,Abramson SB.Osteoarthritis,an inflammatory disease.Arthritis Rheum 2001;44:1237-47;Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Okada Y,Naka K,Kawamura K,et al.Localization of matrix metalloproteinase 9(92-kilodalton gelatinase/type IV collagenase = gelatinse B)in osteoclasts:Implications for bone resorption.Lab Invest 1995;72:311-22;Keyszer GM,Heer AH,Kriegsmann J,et al.Comparative analysis of cathepsin L,cathepsin D,and collagenase messenger RNA expression in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis,by in situ hybridization.Arthritis Rheum 1995;38:976-84;Okada Y,Naka K,Kawamura K,et al.Localization of matrix metalloproteinase 9(92-kilodalton gelatinase/type IV collagenase = gelatinse B)in osteoclasts:Implications for bone resorption.Lab Invest 1995;72:311-22;Prontera C,Crescenzi G,Rotilio D.Inhibition by interleukin-4 stromelysin production by human synovial fibroblasts.Biochem Biophys Res Comm 1997;239:621-5;Lacraz S,Nicod LP,Chicheportiche R,et al.IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclear phagocytes.J Clin Invest 1995;96:2304-10;Overall ChM.Regulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases.In:Inhibition of matrix metalloproteinases.Therapeutic potential.Editores:Greenwald RA,Golub LM,1994;732:59-64;Haywood L,McWilliams DF,Pearson CI,Gill SE,Ganesan A,Wilson D,Walsh DA.Inflammation and angiogenesis in osteoarthritis.Arthritis Rheum 2003;48:2173-7）。
【００２２】
ＯＡは、６５歳以上のヒトにおける病的状態の原因の第１位を占めていて他の１０倍以上頻回に発生するので、集団の社会経済学的局面に重要な影響を及ぼす疾患である。そのような疾患に対する特定の治療法が存在せず、最も重要な療法薬は症状をコントロールするには実際上有用であるパラセタモールおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるが、どちらもこの疾患の自然展開を変えることはない。そこで、ＯＡに罹患している患者における生活の質を改善するために、そしてＰＶＰ−コラーゲン（一部の前炎症性サイトカイン、接着分子およびプロテアーゼの陰性対照）の薬理学的背景を考慮して、本生物薬剤は、付随作用もしくは有害作用を産生せずに、しかし関節腔の粘性を改善して生体力学的損傷による軟骨変性を防止する、炎症性プロセスを変調する作用を通して持続性寛解の誘導を補助できると提案されている。
【００２３】
ＯＡに対する現在の治療は、主として症状の緩和を目標にしている。減量、筋肉増強運動、ブレイシング、および関節保護などの非薬理学的アプローチは、構造を変化させる可能性を有する。単純な鎮痛剤、非選択的非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）特異的阻害剤、関節内（ＩＡ）グルココルチコイドを含む薬理学的治療様式は、疼痛および炎症の緩和を目指している。ＩＡヒアルロナン（ヒアルロン酸塩、ヒアルロン酸）もしくは高分子量ヒアルロナン注射（粘性補充療法）は、膝関節置換術を受けるのを遅らせたい、または避けたいと望む患者における従来型方策に非応答性の膝ＯＡのためのまた別の治療アプローチである。ＯＡの病理生理学の理解におけるここ数十年間に及ぶ進歩は、変性性プロセスに関係している経路を標的とするより合理的な機会を提供する2,3。
【００２４】
炎症の抑制および慢性リウマチ様滑膜炎のために使用される複数の療法の中で、ＮＳＡＩＤなどの薬物は、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびプロスタサイクリンを変化させ、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキンおよびクロロキン）はリソソーム膜を安定化させ、シクロホスファミドはアルキル化剤と一緒になって増殖細胞死を誘導する。アザチオプリンは、ＮＫおよびＢ細胞機能ならびにＩＬ−６合成を阻害する抗炎症作用を備える細胞毒性免疫抑制剤である（Choy E,Kingsley G.How Do Second-Line Agents work?.Br Med Bulletin 1995;51:472-92）。低用量のメトトレキセートは、内皮細胞、好中球および損傷した線維芽細胞によるアデノシン放出をβ2インテグリン接着阻害によって増加させ、結果として白血球遊走を変化させる。さらに、メトトレキセートは、チミジレート・シンテターゼおよびカルボキシアミドリボヌクレオチド・トランスホルミラーゼのコントロールによって分裂細胞の細胞増殖を阻害する。プレドニゾンおよびデキサメタゾンなどのコルチコイド剤は、ＩＬ−１合成ならびに他の前炎症性サイトカインの阻害を含むメカニズムを通して、活性化内皮中でのＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの発現を間接的に阻害する（Chapman PT,Haskard DO.Leukocyte adhesion molecules.Br Med Bull 1995;51:296-311）。
【００２５】
生物学的療法には、関節腔に向かう炎症細胞遊走を回避する、マウス抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体などの内皮への白血球の接着を阻害することに向けられた抗ＣＡＭ抗体が含まれる（Kavanaugh A,Nichols L,Davis L,Rothlein R,Lipsky P.Anti-CD54(Intercellular Adhesion Molecule-1;ICAM-1)Monoclonal Antibody Therapy in Refractory Rheumatoid Arthritis.Arthritis Rheum 1993;49:48-51）。それらの療法は、サイトカイン作用を回避する、すなわちＩＬ−６、ＴＧＦ−β１またはＴＮＦ−αに対する中和抗体を使用する（Paleolog EM,Hunt M,Elliott MJ,Feldmann M,Maini RN,Woody JN.Deactivation of vascular endothelium by monoclonal anti-tumor necrosis factor α antibody in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 1996;39:1082-91;Brennan FM,Browne KA,Green PA,Jaspar J-M,Maini RN,Feldmann M.Reduction of serum MMP-1 and MMP-3 in rheumatoid arthritis patients following anti-tumour necrosis factor-α(cA2)therapy.Br J Rheumatol 1997;36:643-50;Perkins DJ,St Clair EW,Misukonis MA,Weinberg B.Reduction of NOS2 overexpression in rheumatoid arthritis patients treated with anti-tumor necrosis factor α monoclonal antibody(cA2).Arthritis Rheum 1998;41:2205-10;Breedveld FC,Van del Lubbe P.Monoclonal Antibody Therapy of Inflammatory Rheumatic Diseases.Br Med Bulletin 1995;51:493-502）。
【００２６】
それでも、それらの療法についての長期臨床試験の結果は、治療の費用、付随する様々な副作用および不良な薬物動態（ｃＡ２投与の時機の減少）、ｃＡ２に対する抗グロブリンの生成、ならびに他のサイトカインの不必要な性質がそれらの抗体の治療価値に影響を及ぼすので、理想的ではなかった。
【００２７】
前炎症性サイトカイン産生を減少させる生物療法には、抗Ｔ細胞、モノクローナル抗体、抗主要組織適合複合体−ＤＲまたはＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ５、もしくはＩＬ−２Ｒなどの抗Ｔ細胞アクセサリー分子が含まれる（Breedveld FC,Van del Lubbe P.Monoclonal Antibody Therapy of Inflammatory Rheumatic Diseases.Br Med Bulletin 1995;51:493-502）。
【００２８】
３カ月間にわたる朝夕の食前２０分における、主として非ラチリスム鶏胸骨軟骨もしくはサメ軟骨から単離して０．１Ｍ酢酸中に溶解させたＩＩ型コラーゲン（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30）、またはＩおよびＩＩＩ型コラーゲン（Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94）であるタンパク質の経口投与による生物療法でさえ、これらのタンパク質が、３つの型のコラーゲン中に存在する共有エピトープによって、または自己反応性細胞を不活化するサイトカイン放出に好都合な活性化関節細胞由来のＩもしくはＩＩ型主要組織適合複合体の制限によって自己反応性ＣＤ４＋細胞アネルギーを通して機能する場合は、末梢免疫寛容を生じさせる（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30;Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94;Barinaga M.Treating Arthritis With Tolerance.Science 1993;261:1669-70）。
【００２９】
最後に、人工関節による関節置換術または血漿フェレーシス、白血球フェレーシスもしくは全リンパ系照射を含む様々な他の治療法がある。
【発明の開示】
【００３０】
上述した薬物のために、免疫療法、生物学的療法または代替法は、満足できない結果を生じるだけではなく、有害な作用または重大な二次副作用を発生させる。この理由から、本発明者らは、ＲＡもしくはＯＡ患者において生物薬剤であるコラーゲン−ポリビニルピロリドン（Fibroquel（登録商標）、登録番号210M95 SSA）を評価することを提案する。Ｔリンパ球培養への細胞外マトリックスタンパク質の添加はＴ細胞応答を変調させることができる（Easter DW,Hayt DB,Ozkan AN.Immunosuppression by a peptide from the gelatin binding domain of human fibronectin.J Surg Res 1988;45:370-5;Rybski JA,Lause DB,Reese AC.Effect of fibronectin on antigen-induced lymphoproliferation and antibody synthesis in rats.J Leuk Biol 1989;45:35-45;Rueg CR,Chiquet-Ehrismann R,Alkan SS.Tenascin,an extracellular matrix protein,exerts immunomodulatory activities.Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:7437-41;Furuzawa-Carballeda J,Alcocer-Varela J,Diaz de Leon L.Collagen-PVP decreases collagen turnover in synovial tissue cultures from rheumatoid arthritis patients.Ann NY Acad Sci 1999;878:508-602）；ＩＩ型コラーゲン（Thompson HSG,Staines NA.Gastric Administration of Type II Collagen Delays the Onset and Severity of Collagen-Induced Arthritis in Rats.Clin Exp Immunol 1985;64:581-6;Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,Combitchi D,Lorenzo C,Sewell KL,Hafler DA,Weiner HL.Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis.Science 1993;261:1727-30）またはＩもしくはＩＩＩ型コラーゲン（Zhang ZJ,Lee ChSY,Lider O,Weiner HL.Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen.J Immunol 1990;145:2489-94）の経口投与はＲＡにおける末梢免疫系を変調させるという事実に基づくと、コラーゲン−ＰＶＰは、以下で説明するように、抗炎症特性を有する。
【００３１】
コラーゲン−ＰＶＰは、ｐＨを安定化させたクエン酸緩衝液中のペプシン化ブタＩ型コラーゲンとＰＶＰとのγ線照射混合物である。３７℃および中性ｐＨの培養培地中では、コラーゲン−ＰＶＰは他のコラーゲンのようにゲルを形成することはなく、その電気泳動的、物理化学的および薬理学的特性はタンパク質とＰＶＰとの共有結合によって変化させられている。インビトロおよびインビボにおいて、これらの成分（コラーゲンおよびＰＶＰ）が単独ではコラーゲン−ＰＶＰとは同一特性を有していないことが証明されている（Chimal-Monroy J,Bravo-Ruiz T,Krotzsch-Gomez FE,Diaz de Leon L.Implantes de Fibroquel aceleran la formacion de hueso nuevo en defectos oseos inducidos experimentalmente en craneos de rata:un estudio histologico.Rev Biomed 1997;8:81-8）。本生物薬剤は、コラーゲン代謝および前炎症性サイトカイン発現を変調して、皮膚創傷治癒ならびに他の組織を改善することが証明されている。
【００３２】
以前の試験データは、Wistar系ラットおよびヒトにおいて実施された実験によって決定されており、外科創傷に対するコラーゲン−ＰＶＰによる病変内治療は手術７日後の顆粒形成組織の増加を刺激し、第２８日には、組織は非処置群に比較して、より良好な皮膚構造を示した。改善には、正常皮膚様のコラーゲン束の配列を伴う、創傷ゾーンにおける皮膚付属器の存在が含まれる（Krotzsch-Gomez FE,Guerrero-Padilla E,Diaz de Leon L.Morphological studies on the effects of Fibroquel during wound of surgical wounds in rats.J Cell Biochem 1993;Suppl,17E:137R506）。
【００３３】
［骨の修復、前臨床試験および臨床試験による評価］
〔ラットの骨折モデル〕
Wistar系ラットにおいて大腿骨幹骨折が作製され、損傷後最初の３日間にわたりインサイチューで０．２ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰが投与された。骨硬化パラメータが評価され、３０日後に完全骨修復を示したのは治療群動物では６７％であったのに対して、対照群では２０％に過ぎなかった。組織学的分析は、最初は軟骨組織、および後には骨芽細胞および骨梁骨による（第１６および２３日）、コラーゲン−ＰＶＰ治療群における間葉細胞の早期代謝回転を証明した。さらに、より高度のオステオポンチンおよびオステオネクチンの発現が測定されたが、他方Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンは実験群および対照群において類似であった。この結果は、コラーゲン−ＰＶＰが間葉細胞の増殖因子および細胞外マトリックスタンパク質の発現を変調させ、軟骨形成細胞および骨形成細胞の移動、増殖および分化を刺激し、骨修復を改善することを示唆している（Almazan Diaz A,de la Cruz Garcia JC,Lira Romero JM,Arrellin G,Chimal Monroy J,Diaz de Leon L,Furuzawa- Carballeda J,Krotzsch Gomez F:Investigacion experimental de la regeneracion osea en femures de rata despues de la aplicacion de colagena I polimerizada:Estudio radiologico,histologico e inmunohistoquimico.Rev Mex Ortop Traum 1996;10:142-52;Chimal-Monroy J,Bravo-Ruiz T,Furuzawa-Carballeda GJ.Lira RJM,De la Cruz GJC,Almazan DA,Krotzsch-Gomez FE,Arrellin RG,Diaz de Leon L.Collagen-PVP accelerates new bone formation of experimentally induced bone defects in rat skull and promotes the expression of osteopontin and SPARC during bone repair of rat femora fractures.Ann NY Acad Sci 1998;857:232-6）。
【００３４】
〔ヒトにおける骨修復〕
さらに、患者２０例（実験群１０例およびプラセボ群１０例）を対照とする第Ｉ相臨床試験において頸骨の骨幹骨折におけるコラーゲン−ＰＶＰの作用が評価された。この試験は、早期閉鎖骨折を含んでおり、全例が初期７日間にわたり固定された。コラーゲン−ＰＶＰまたはプラセボ（０．２ｍＬ）は、外科創傷へ手術中の第１日、第７および３０日に病変内投与された。第３０日に、コラーゲン−ＰＶＰで治療された患者の８０％は疼痛がないと報告しており、残り２０％には軽度の疼痛がみられた。これとは対照的に、対照群患者の５０％は中等度の疼痛、そして残り５０％は軽度の疼痛を示した。さらに、コラーゲン−ＰＶＰ治療群は、損傷領域において炎症徴候を示さなかったが、対照群の５０％は炎症徴候を示した。その上に、コラーゲン−ＰＶＰ治療群では、対照群と比較して、血清アルカリホスファターゼが上昇していた。
【００３５】
第３０日に、Meller尺度によるＸ線的骨修復は、コラーゲン−ＰＶＰ治療群患者の１００％において第３０日および９０日に各々グレードＩおよびＩＩであった；これとは相違して、対照群では第３０日および９０日に各々５０％および１００％がグレードＩであった。
【００３６】
コラーゲン−ＰＶＰ治療群の骨修復は適切であり、全患者が二足歩行移動に耐えることができ、膝または足関節の可動制限はみられなかった。これらの患者は全例が第１２週前に漸進的歩行を示し、特別のリハビリテーションを必要とした例はなかった。対照群もまた骨修復を示したが、彼らは同一の第１２週には外側からの支持なしで二足歩行移動には耐えられなかった。彼らのうちの４例は、筋萎縮に起因する特別なリハビリテーションを必要とした。
【００３７】
これらをまとめると、コラーゲン−ＰＶＰは、軟骨、後には肥厚性軟骨および最終的には骨組織に向けて間葉組織が分化するのを助けるオステオポンチン、オステオネクチンおよびアルカリホスファターゼのアップレギュレーションにより骨修復プロセスを促進する。おそらく、この調節の原因は、前炎症性サイトカイン発現（主としてＩＬ−１およびＴＮＦ−α）、接着分子（ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）ならびに一部のプロテイナーゼのダウンモジュレーション、そしてその結果としてプロスタグランジン合成の調節による早期の疼痛コントロールにあった（De la Cruz Garcia JC.Efecto de la colagena tipo I polimerizada al 1% inyectable en la consolidacion osea(reporte preliminar).Tesis.Hospital de Traumatologia y Ortopedia de 「Lomas Verdes」.UNAM.1997）。
【００３８】
〔頸骨偽関節症に及ぼすコラーゲン−ＰＶＰの作用〕
頸骨偽関節症を有する年齢６〜７２歳の患者に、６週間にわたり１ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰまたはプラセボを摂取させた。治療後、コラーゲン−ＰＶＰ治療群の患者１６例（５１．６％）は極めて良好な（Meller尺度によるグレードＩＩＩ）、患者１２例（３８．７％）は良好な（グレードＩＩ）の骨修復を示し、不適切（グレードＩ）であったのは３例（９．６８％）だけであった。他方、プラセボ治療した群では、治療した患者中で骨修復は１例も観察されなかった。組織学的分析は、コラーゲン−ＰＶＰ治療群における適切な骨芽細胞活性を証明した。さらに、コポリマーを用いて治療された患者においては疼痛が減少しており、これはおそらくＣｏｘ（プロスタグランジン産生）による炎症因子変調によるものであり、その結果として患者は罹患した肢における強度および筋肉の正常な緊張を示した（Bermudez-Hickey R,Nesme-Avila W,Ruiz-Flores L,Suarez E.Tratamiento de la pseudoartrosis de tibia con colageno-polivinilpirrolidona.Rev Mex Ortop Traum 1999;13:148-51）。
【００３９】
［慢性炎症に結び付いた線維性疾患における臨床経験］
〔肥厚性瘢痕または強皮症に対するコラーゲン−ＰＶＰ治療〕
ヒト肥厚性瘢痕または強皮症病変における１〜３カ月間にわたる本生物薬剤の週１回の病変内注射は、掻痒症、疼痛、紅斑、体積、および炎症性浸潤を減少させる。本生物薬剤は、組織構造を正常な皮膚に近付ける。さらに、本生物薬剤は、ＥＣＭ、主としてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの代謝回転を変調し、そしてＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦおよびＶＣＡＭ−１の発現レベルをダウンレギュレートする（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E and Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol,1998;111:828-834.Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch E,Espinosa-Morales R,Alcala M,Barile-Fabris L.Subcutaneous administration of collagen-polyvinylpyrrolidone down-regulates IL-1β,TNF-α,TGF-β1,ELAM-1 and VCAM-1 expression in scleroderma skin lesions.Clinical and Experimental Dermatology.2005;30:83-86）。
【００４０】
〔強皮症皮膚病変の治療に及ぼすコラーゲン−ＰＶＰの作用〕
コラーゲン−ＰＶＰの免疫変調作用は、３カ月間中に上述したものと同一薬量で治療され、皮膚の組織および外観が改善された強皮症皮膚病変においても観察された。組織学的には、コラーゲン−ＰＶＰ治療は、皮膚付属器、真皮乳頭層におけるＩＩＩ型コラーゲンおよびＩ／ＩＩＩ型コラーゲンの比率を回復させ、他方Ｉ型コラーゲンの厚い束を減少させた。免疫組織化学検査によって、コラーゲン−ＰＶＰがＩＬ−１βおよびＥＬＡＭ−１発現をダウンレギュレートすることも決定された（Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs.triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）。
【００４１】
コラーゲン−ＰＶＰが、慢性炎症に結び付いている皮膚線維性障害における一部の前炎症性サイトカイン、接着分子およびコラーゲンの代謝回転をダウンレギュレートするという試験結果に基づいて、本発明者らは、本生物薬剤はＲＡ患者からの炎症性滑膜組織培養にも同一作用をもたらすであろうと推測した。
【００４２】
［安全性試験］
〔リンパ球増殖試験〕
アッセイによって、血清無含有培養系中のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはＰＨＡおよびコラーゲン−ＰＶＰを含有するプレート内で培養した場合に、精製リンパ球の顕著な増殖が証明された。さらに、細胞をコラーゲン−ＰＶＰ単独を含有するプレート内で培養した場合には、ベースライン時を越える増殖は観察されなかった。これらの結果は、本生物薬剤がリンパ球増殖を刺激できないことを示唆している。
【００４３】
〔遺伝毒性および骨髄毒性試験〕
ＳＣＧＥアッセイもしくは「コメットアッセイ」は、顕微鏡スライド上の寒天ゲルサンドイッチ内に包埋し、溶解させ、アルカリ性条件下で短時間にわたり電気泳動にかけたリンパ球の細胞懸濁液を用いて実施した。溶解は核物質以外の細胞含有物を除去し、ＤＮＡを少量の非ヒストンタンパク質の存在下で高度に超らせん状で維持する；アルカリの中に入れると、ＤＮＡはストランド破損部位かららせんを巻き戻し始める。ＤＮＡ損傷が増加した細胞は、電流下では核から陽極に向かうＤＮＡの移動の増加を示し、「コメットテール」の外観を呈する。この研究では、ＤＮＡ損傷の分析は、コラーゲン−ＰＶＰを含めて、または含めずにインキュベートした培養がリンパ様細胞培養中でのＤＮＡ移動の変化を全く誘導しないことを証明した。このため、これらのデータはコラーゲン−ＰＶＰへの曝露が遺伝毒性作用を有していないことを示唆している。
【００４４】
〔検査室試験〕
健常志願者および肥厚性瘢痕または強皮症を有する患者において、安全性試験、フォローアップ試験、臨床評価試験および検査室試験を実施した。血液学的検査（白血球指数、血液化学検査、血清カルシウムレベル）、尿分析、肝機能検査は、コラーゲン−ＰＶＰの投与前後に相違を示さなかった。これらの所見は、この治療が有害な直接的臨床反応を全く誘導しなかったことを示唆している。
【００４５】
〔抗ブタコラーゲンまたは抗コラーゲン−ＰＶＰ抗体〕
全血清サンプルのブタＩ型コラーゲンまたはコラーゲン−ＰＶＰに対する反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。反応性のベースライン時レベルを確定するために、本生物薬剤を用いた治療を受けていない健常志願者１１０例からの血清サンプルを陰性対照として使用した。ＳＳｃ患者３７例からの血清サンプルを、以前の報告により数例の患者において循環中ヒト抗コラーゲン抗体が同定されていたので、陽性対照として使用した。コラーゲン−ＰＶＰに対する血清学的反応性を試験するためにコラーゲン−ＰＶＰにより治療された４４例からの血清サンプルを使用し、これらのサンプルをコラーゲン−ＰＶＰの投与回数（５回未満、６〜１０回、１１〜２０回、２１〜１００回および１００回を超える投与）にしたがってプロットした。さらに、血清サンプルの反応性は、少なくとも２種の希釈率で、Dunnett検査による平均群分析を用いて比較した。健常ドナーとＳＳｃ患者群との間でブタＩ型コラーゲンに対する抗体の存在による有意差が観察された（ｐ＜０．０５）；コラーゲン−ＰＶＰに対しては（用量、投与回数または患者の年齢などの因子を考慮に入れた場合でさえ）陽性相関は決定できなかった（Furuzawa-Carballeda J,Castillo I,Rojas E,Valverde M,Diaz de Leon E,Krotzsch E.Cellular and humoral responses to collagen-polyvinylpyrrolidone administered during short and long periods in humans.Can J Pharmacol Physiol 2003;81.1029-35）。
【００４６】
他方、ポリマーであるＰＶＰの安全性は、特定の物理的および科学的特性のために、多数の医薬調製物、食品、化粧品および洗浄用品ならびに工業用途において有用である（Ｎ−ビニル−２−ピロリドンのホモポリマーは、生物学的に不活性かつ安全なポリマーである）。多くの試験が、その無害性を証明している。コラーゲン−ＰＶＰに使用されるＰＶＰは、低分子量である（Robinson et al.1990）。
【００４７】
コラーゲン−ＰＶＰを製造するために使用されるＰＶＰは、腎臓によって排泄されるので低分子量物質である。血漿増量剤として静脈内投与された後の、または高用量で経口、皮下または筋肉内投与された後の有害作用は報告されていない（Robinson BV,Sullivan FM,Bazelleca JF,Schwartz SL.PVP.A critical review of the kinetics and toxicology of polyvinylpyrrolidone(Povidone).Lewis Publishers,Inc.1990）。
【００４８】
［関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の滑膜組織培養中での前臨床試験］
ＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のコラーゲン−ＰＶＰの作用。コラーゲン−ＰＶＰが細胞代謝または細胞濃度のいずれかに影響を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者らはＤＮＡ含量を測定した。処置群および対照群培養を比較した場合に、ＤＮＡ含量における統計的有意差はみられなかった（表１）。重要にも、非ＲＡ滑膜中のＤＮＡ含量はＲＡ滑膜組織で測定した含量の８〜１０分の１であったことに注目されたい。対照群およびコラーゲン−ＰＶＰ処置群培養間で有意差はみられなかった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中の組織学的所見。１％コラーゲン−ＰＶＰを含めて培養した非ＲＡ滑膜の形態学的評価は、培養３および７日目に組織構造が変化していないことを証明した（図１Ａ）。非ＲＡ滑膜培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加は、組織構造、線維性コラーゲン厚さまたはＩ／ＩＩＩ型コラーゲン比率を変化させなかった（図１Ｂ）。しかしＲＡ対照群培養由来の滑膜組織についての組織学的評価は、培養３および７日目の様々な含量の炎症性細胞およびＩ型コラーゲン（図１Ｃにおける赤色線維）が大量な線維症を証明した。これとは対照的に、対にした１％コラーゲン−ＰＶＰ処置群培養は、正常滑膜組織に類似して、ＩＩＩ型コラーゲンの回復を示した（培養７日目における、図１Ｄの青色線維）。
【００５１】
【化１】
【００５２】
図１．培養中の滑膜の組織構造にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。Herovici法を用いて染色した、１％コラーゲン−ＰＶＰを含有する、または含有しない滑膜組織培養の顕微鏡写真。（Ａ）培養０、３および７日目の、非ＲＡ滑膜対照群培養。（Ｂ）培養３および７日目の、非ＲＡ滑膜コラーゲン−ＰＶＰ処置群培養。（Ｃ）各々０、３および７日目の、処置をせずにインキュベートしたＲＡ滑膜組織。優勢な細胞外マトリックス成分はＩ型コラーゲンである（赤色線維）。（Ｄ）各々３および７日目の、コラーゲン−ＰＶＰ処置群のＲＡ滑膜。ＩＩＩ型コラーゲンの増加がみられる（青色線維）。スケールバー：１００μｍ。非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの相対比率における変化を確証するために、各培養時点に２片ずつの滑膜ホモジネートを断続的ゲル電気泳動法およびデンシトメトリー分析によって評価した。還元条件下で、連鎖間ジスルフィド結合は開裂され、Ｉ型コラーゲンのα1（Ｉ）鎖より緩徐に移動するコラーゲンのα1（ＩＩＩ）モノマーを遊離する。図２Ａは、滑膜組織対照群培養中でのα1（ＩＩＩ）の細いバンドを示している。デンシトメトリー分析は、非ＲＡ滑膜培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加がＩもしくはＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）において何の変化も生じさせなかったことを証明した（図２Ｂ）。しかし、処置群のＲＡ滑膜培養は、７日目に時間依存方法で、α1（ＩＩＩ）バンドにおける１．７倍の増大を示した（ｐ＜０．００９、処置群対未処置群培養；図２Ｃ）。これとは対照的に、細いＩ型コラーゲンバンドが観察された。
【００５３】
【化２】
【００５４】
図２．滑膜組織培養中のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン含量にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）各々培養３、５および７日目の、（＋）コラーゲン−ＰＶＰを含有する、または（−）含有しない代表的なＲＡ滑膜組織のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＭＷ：Ｉ型コラーゲンの標準。（Ｂ）非ＲＡ滑膜組織培養中でのＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。（Ｃ）ＲＡ滑膜組織培養中でのＩＩＩ型コラーゲンの相対比率（％）。培養５日目（*ｐ＝０．００９）および７日目（*ｐ＝０．００００７）に、対照群とコラーゲン−ＰＶＰ処置群との間で統計的有意差が得られた。データは、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００５５】
ＲＡ患者の滑膜組織由来の上清のコラーゲン溶解活性。ＲＡの進行中、炎症部位でのタンパク質溶解活性は上昇する。そこで、ＭＭＰ−１に対する特異的抗血清を使用して、ＲＡ患者１０例および非ＲＡ患者５例由来の滑膜を免疫組織化学的に詳細に試験した。ＲＡ滑膜は、非ＲＡ滑膜と比較してＭＭＰ−１分布において相当に広い範囲を示した。処置群対対照群の間で差は生じなかった（図３Ｄ、Ｅ）。他方、コラーゲン−ＰＶＰ処置培養由来のＲＡ上清中では、全コラーゲン溶解活性のレベルは対照群培養中のレベルの１．６分の１以下であった（ｐ＜０．０５；図３Ａ）。滑膜組織処置群培養由来の上清中のカルシウム依存性コラゲナーゼ（ＭＭＰ）は、ＣａＣｌ2緩衝液中およびＥＤＴＡ緩衝液中の3Ｈ−コラーゲンの分解間の差によって測定した（全コラーゲン溶解活性−カルシウム非依存性コラゲナーゼ）。このタンパク質溶解活性は、生体化合物処置群培養由来の上清中で未処置群培養に比してわずかに低いレベルを示した（図３Ｂ）。それらの安定性のためにカルシウムを必要としないプロテイナーゼ（おそらく、エラスターゼおよび／またはＧカテプシン）のコラゲナーゼ活性は、未処置群組織培養の２．２分の１であった（ｐ＜０．００８；図３Ｃ）。カルシウム依存性ならびにカルシウム非依存性コラーゲン溶解性プロテアーゼが類似の活性レベルを有することを強調することは重要である。これは、ＲＡの病因において、カルシウム非依存性酵素がカルシウム依存性酵素について観察されるものと同様の重要性を有することを示唆している。
【００５６】
【化３】
【００５７】
図３．滑膜組織培養中のコラゲナーゼ活性およびＴＩＭＰ−１発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）全コラーゲン溶解活性。データは、各々培養３、５および７日目について*ｐ＝０．００８、*ｐ＝０．０５５および*ｐ＝０．０５で統計的有意であった。（Ｂ）カルシウム依存性コラーゲン溶解活性。（Ｃ）カルシウム非依存性コラーゲン溶解活性。コラーゲン−ＰＶＰ処置群を未処置群培養と比較し、各々培養３、５および７日目について*ｐ＝０．００８、*ｐ＝０．００６および*ｐ＝０．００２で統計的有意であった。コラゲナーゼ活性は、３５℃でｃｐｍ／２４時／μｇのＤＮＡとして表示した。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｄ）非ＲＡ滑膜組織上のＭＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｅ）ＲＡ滑膜組織上のＭＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｆ）非ＲＡ滑膜組織上のＴＩＭＰ−１免疫反応性細胞。（Ｇ）ＲＡ滑膜組織上のＴＩＭＰ−１免疫反応性細胞。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｈ）コラーゲン−ＰＶＰ処置を行った、または行わない滑膜組織上清中でのＴＩＭＰ−１濃度（*培養７日目にｐ＝０．０４）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００５８】
ＲＡ患者由来の滑膜組織培養中のＴＩＭＰ−１濃度。抗ＴＩＭＰ−１で染色したＲＡ滑膜の切片は、ＲＡ患者由来のコラーゲン−ＰＶＰ処置滑膜組織中の血管および間質細胞中で強度の免疫反応性を示した（図３Ｇ）。コラーゲン−ＰＶＰは、非ＲＡ患者由来の滑膜に何の影響も及ぼさなかった（図３Ｆ）。しかし、対照群培養中由来の上清中のＴＩＭＰ−１レベルは、７日目の処置群培養の１．７倍のレベルの糖タンパク質を含有していた（ｐ＝０．０４；図３Ｈ）。
【００５９】
非ＲＡおよびＲＡ患者由来の滑膜組織培養中の接着分子の発現。炎症性マーカーであるＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１分子がコラーゲン−ＰＶＰ処置によって変化させられるかどうかを確定するために、それらを滑膜中で検出した。非ＲＡ患者由来の培養中でのＩＣＡＭ−１発現は、対照群とコラーゲン−ＰＶＰ処置群間で類似であった（１１〜１７％；表２）。しかし、ＲＡ患者由来の処置群培養では、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１分子はどちらも、対照群培養と比較して低いレベルの強度および免疫反応性を示した（表２）。これらのレベルは、ＩＣＡＭ−１については血管細胞（ｐ＝０．０３）および間質細胞（ｐ＝０．０４）中で培養７日目に統計的有意であり、処置群培養由来の陽性ＩＣＡＭ−１細胞の比率（％）は正常滑膜組織培養について決定された比率（％）と類似であった（表２）［３０］。さらに、処置群培養由来の血管および間質細胞中でのＶＣＡＭ−１発現もまた実質的なダウンレギュレーションを示した（ｐ＜０．０５；表２）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
滑膜組織培養による前炎症性サイトカインの産生。ＲＡでは、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカインが特に重要な調節因子として明らかになっている。滑膜炎症には、多数の因子が関係しており、コラーゲン−ＰＶＰがこれらのサイトカインの発現に及ぼす影響を確立するために、本発明者らは滑膜中のこれらのタンパク質を免疫組織化学的に決定した。結果は、ＩＬ−８が、非ＲＡおよびＲＡ処置群培養中に比較して、ＲＡ患者由来の非処置滑膜組織培養中で統計的有意に高いレベルで発現することを証明した（図４Ａ、Ｂ）。他方、ＩＬ−６は、ＲＡ処置群培養と対照群培養間で有意差を示さなかった（表２）。
【００６２】
コラーゲン溶解活性、ＣＡＭおよびＴＩＭＰ−１発現レベルがコラーゲン−ＰＶＰ処置によってダウンレギュレートされたので、本発明者らは、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α1の産生が変化させられたと推測した。非ＲＡ組織培養への生物薬剤の外因性添加は、血管細胞においても間質細胞においてもＴＮＦ−α発現に作用を及ぼさなかった（図４Ｃ）。ＴＮＦ−α発現は、ＲＡ患者由来の組織中では、非処置群培養と比較して統計的有意なレベルでコラーゲン−ＰＶＰによってダウンレギュレートされた（ｐ＜０．０５；図４Ｄ）。さらに、コラーゲン−ＰＶＰは、上清中のＴＮＦ−αタンパク質濃度をダウンレギュレートした（４分の１）（ｐ＜０．０２；図４Ｅ）。同様にコラーゲン−ＰＶＰ処置されたＲＡ組織（ｐ＜０．０５；図４Ｆ）および上清（３分の１；ｐ＜０．０３；図４Ｇ）中ではダウンレギュレートされたＩＬ−１βの発現パターンが観察された。
【００６３】
【化４】
【００６４】
図４．滑膜組織培養中の前炎症性サイトカイン発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。（Ａ）非ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＩＬ−８免疫反応性細胞。（Ｂ）ＲＡ患者由来の滑膜組織中のＩＬ−８免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。（Ｃ）非ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＴＮＦ−α免疫反応性細胞。（Ｄ）ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＴＮＦ−α免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｅ）７日目のＴＮＦ−α産生（*ｐ＝０．０３）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｆ）ＲＡ患者由来の血管細胞および間質細胞上のＩＬ−β免疫反応性細胞（*ｐ＜０．０５）。データは、各組織について少なくとも２片の標本を評価して、各々を２回ずつ実施した、非ＲＡ患者５例およびＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。（Ｇ）ＲＡ滑膜培養由来の上清中のＩＬ−１β濃度（*ｐ＝０．０５）。データは、各々を２回ずつ実施した、ＲＡ患者１０例由来の滑膜組織培養の平均値±ＳＥＭである。
【００６５】
Ｃｏｘ−１発現にコラーゲン−ＰＶＰが及ぼす作用。Ｃｏｘ−１は、プロスタグランジン経路アラキドン酸代謝を合成した構成的酵素である。プロスタグランジンは、局所血流量を増加させ、血管透過性を誘導するブラジキニンおよびＩＬ−１などのメディエーターの作用を増強することによって、滑膜炎症に寄与する可能性が高い。静脈では、免疫組織化学検査は、コラーゲン−ＰＶＰが未処置群培養に比較してＲＡ組織内でのＣｏｘ−１の発現にマイナスの変調を誘導することを証明した（表２）。しかし、本生物薬剤は、非ＲＡ組織への作用を示さなかった（表２）。
【００６６】
インサイチューニックトランスレーションによるアポトーシス性滑膜細胞内のＦａｓ／Ａｐｏ９５の発現およびＤＮＡストランドの破断の検出。Ｆａｓ抗原が、滑膜細胞の表面上で発現し、作用性抗Ｆａｓを用いて刺激するとＦａｓ発現滑膜細胞の細胞死を媒介することは証明されている。欠陥性アポトーシスはＲＡと密接に関連しているので、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系の機能は増殖性ＲＡ滑膜中の細胞を排除できないと思われる。そのため、本発明者らは、Ｆａｓ抗原が滑膜上で発現するかどうか、ならびにアポトーシス細胞の存在について試験した。本発明者らは、Ｆａｓ／Ａｐｏ９５が、ＲＡ滑膜コラーゲン−ＰＶＰ処置群由来の血管細胞上で優勢にアップレギュレートされることを見いだした（表２）。本発明者らがアポトーシス細胞を検出するためにＲＡ滑膜組織についてのインサイチュー細胞死検出アッセイを適用すると、ＴＵＮＥＬ技術は、コラーゲン−ＰＶＰを用いて処置された大部分の血管細胞および間質細胞中でのアップレギュレーションを証明した（５０％）（表２）（Furuzawa-Carballeda J,Rodriguez-Calderon R,Diaz de Leon L,Alcocer-Varela J.Mediators of inflammation are down-regulated while apoptosis is up-regulated in rheumatoid arthritis synovial tissue by polymerized collagen.Clin Exp Immunol 2002;130:140-9）。
【００６７】
［関節リウマチ（ＲＡ）患者における第Ｉ相臨床試験］
患者。基礎来院時およびコラーゲン−ＰＶＰの最終投与時における患者の人口統計学的および臨床的特徴は表３に要約した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
安全性。コラーゲン−ＰＶＰは安全であり、長期治療中に良好に容認され、注射部位での５分間の疼痛以外に有害事象は検出されなかった。
【００７０】
有効性および臨床的有益性。８例の疼痛のある関節内での３カ月間中のコラーゲン−ＰＶＰの皮下投与は、膨張して敏感な疼痛関節点数（Ritchie指数もしくはＲＩ）（図５）が急速に改善されたことを証明した（ＲＩ：Δ−１０．２≒−４６．４％；膨張した疼痛関節点数：Δ−１０．７≒−７１．８％）。この改善は、長期療法中にわたり維持された。
【００７１】
さらに、早朝硬直および目視アナログスケールによる疼痛などの疾患活動度の他の変量における変化において極めて類似する高度の有意差がみられた（早朝硬直：Δ−３２．３≒−６８．６％；ＶＡＳ：Δ−３９．９≒−６３．８％；図５）。
【００７２】
【化５】
【００７３】
図５．コラーゲン−ＰＶＰを用いた治療進行中の臨床的発現における変化。１．７ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰの用量は、活性関節の持続性減少を生成した。疼痛関節点数：* ｐ＝０．０２、１対１３週間；腫れ上がった関節点数：* ｐ＝０．００７、１対７週間；* ｐ＝０．００１、１対１３週間；早朝硬直：* ｐ＜０．００９、１対７週間および* ｐ＜０．０２、１対１３；疼痛：* ｐ＝０．００７、１対７週間；* ｐ＝０．００１、１対１３週間。１＝初回来院もしくはベースライン時；３＝第３回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第２回皮下投与；７＝第７回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第６回皮下注射；１３＝第１３回来院および第１２回皮下投与。
【００７４】
患者は、さらに疾患活動度スコア（ＤＡＳ）における統計的有意な改善を示した（ＤＡＳ：Δ−１．３５≒−７０．５％、ｐ＜０．０２）。改善は、さらにまた２０、５０および７０％の米国リウマチ学会反応基準（ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０）を用いて決定した。ＡＣＲ２０は、３カ月後に８０．０％の患者によって達成された（患者１０例中８例）。同様に、６０．０％の患者がＡＣＲ５０（患者１０例中６例）を達成し、２０．０％はこの時点にＡＣＲ７０（患者１０例中２例）を達成した（図６）。身体的機能状態（Spanish-HAD-DI）は、さらにまたベースライン値と３カ月間のコラーゲン−ＰＶＰ治療との変化における統計的有意差を示した（ＨＡＱ−ＤＩ：Δ−０．５≒−４８．５％；ｐ＜０．０５、１対１３週間；図６）。
【００７５】
【化６】
【００７６】
図６．疾患活動度スコア（ＤＡＳ）、健康評価質問票−作業不能指数（ＨＡＱ−ＤＩ）および米国リウマチ学会（ＡＣＲ）基準により評価した治療法への応答。ＤＡＳ：* ｐ＝０．０１５、１対１３週間およびＨＡＱ−ＤＩ：* ｐ＝０．０４５、１対１３週間。１＝初回来院もしくはベースライン時；３＝第３回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第２回皮下投与；７＝第７回来院およびコラーゲン−ＰＶＰの第６回皮下注射；１３＝第１３回来院および第１２回皮下投与。
【００７７】
併用薬。全患者が、試験３カ月間中の経口メトトレキセートおよび併用ＮＳＡＩＤの用量を変更しなかった（表３）。
【００７８】
検査室評価。赤血球沈降速度、血液学的定数（ヘモグロビン、ヘマトクリット、血液化学、赤血球数、白血球および血小板）、Ｃ反応性タンパク質またはリウマチ因子における変化は生じなかった。ベースライン時および試験終了後のＤＮＡの二本鎖に対する抗体およびリボ核タンパク質に対して陽性の患者は１例もいなかった。
【００７９】
放射線による分析では、ベースライン時および試験終了後に有意差はみられなかった。しかし、重要にも、狭小化関節間腔、骨侵害または軟骨変性のいずれも生じなかったことに注目されたい（Furuzawa-Carballeda J,Cabral AR,Zapata-Zuniga M,Alcocer-Varela J.Subcutaneous administration of polymerized-type I collagen for the treatment of patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 2003;30:256-9）。
【００８０】
インビトロ試験は、重合化Ｉ型コラーゲン（コラーゲン−ＰＶＰ）の抗炎症性およびアポトーシス作用、ならびにＲＡ患者由来の滑膜組織中のコラーゲン代謝回転について評価した。
【００８１】
これらの試験結果に基づいて、本発明者らは、本生物薬剤がコラーゲン溶解活性、ならびにＴＩＭＰ−１産生を減少させ、ＩＩＩ型コラーゲンおよびＴＩＭＰ−１の量を正常滑膜中で観察される類似レベルへ増加させるので、ＲＡ滑膜培養に加えられたコラーゲン−ＰＶＰがコラーゲン代謝回転を変調させると提案する。慢性炎症性プロセスは、以前にKrotzsch-Gomez et al.およびBarile L et al.によって報告されたように（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E,Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol 1998;111:828-34;Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs..triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）、おそらくＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８ならびに細胞接着分子のダウンレギュレーションおよびＣｏｘ−１活性化を誘導するために、コラーゲン−ＰＶＰ作用によって変化させられる。その上インテグリン−細胞外マトリックス相互作用を通しての細胞結合は、ＭＭＰ発現を調節するシグナルを生成し（Larjava H,Lyons J,Salo R,Makela M,Koivisto L,Birkedal-Hansen H,Akiyama SK,Yamada KM,Heino J.Anti-integrin antibodies induce type IV collagenase gene expression in keratinocytes.J Cell Physiol 1993;157:190-200;Romanic AM,Madri JA.The induction of 72 kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent.J Cell Biol 1994;125:1165-78;Tremble P,Chiquet-Ehrismann R,Werb Z.The extracellular matrix ligands fibronectin and tenascin collaborate in regulating collagenase gene expression in fibroblasts.Mol Biol Cell 1994;5:4390-3;Rukonen T,Westermarck J,Koivisto L,Broberg A,Kahari VM,Heino.Integrin α2β1 is a positive regulator of collagenase(MMP-1)and collagen α1(I)gene expression.J Biol Chem 1995;270:13548-52）、これは、細胞接着分子がＲＡ組織破壊にも関係する可能性があることを示唆している。同様に、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生減少は、滑膜培養中のアポトーシスを介して滑膜細胞死を刺激すると思われ、後者は最終的に過形成もしくはパンヌス形成およびＲＡ関節の破壊を引き起こす滑膜細胞の増殖を阻害することに寄与する可能性がある（Furuzawa-Carballeda J,Rodriguez-Calderon R,Diaz de Leon L,Alcocer-Varela J.Mediators of inflammation are down-regulated while apoptosis is up-regulated in rheumatoid arthritis synovial tissue by polymerized collagen.Clin Exp Immunol 2002;130:140-9）。
【００８２】
結論として、本発明者らは、滑膜組織培養へのコラーゲン−ＰＶＰの添加がリウマチ様滑膜中のダウンモジュレーションを誘導するが、炎症パラメータの阻害を誘導しないことを証明した。
【００８３】
本試験は、コラーゲン−ＰＶＰをＲＡ治療のための補助剤と見なすために大きな意味を有していた。最後の確認は、Ｉ型コラーゲンが系統発生学的に最も古い細胞外マトリックスタンパク質の１つであるという知識に基づいていた。コラーゲン−ＰＶＰは極めて低い抗原性を有しており、相当容易に代謝される。さらに、細胞が新規組織を形成するように刺激することができ、これはコラーゲンが情報に関する特性を有することを意味している（Pohunlova H,Adam M.Reactivity and the fate of some composite bioimplants based on collagen in connective tissue.Biomaterials 1995;16:67-71）。1981年に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、軟組織の容積を強化するための医療用具としての再構成された精製ウシコラーゲンの注射製剤（Zyderm;Collagen Corp.，カリフォルニア州パロ・アルト）の使用を承認した（Clark DP,Hanke CW,Swanson NA.Dermal implants:Safety of products injected for soft tissue agumentation.J Am Acad Dermatol 1989;21:992-8）。この注射形のコラーゲンに関する現在の関心は、より広範囲の臨床適用を規定すること、そして新規製品の開発に集中している。
【００８４】
現在まで、注射可能なコラーゲンまたはコラーゲンインプラントの大多数はウシ皮膚もしくは腱アテロペプチドコラーゲン（Zyderm、ZyplastおよびAtelocollagen）から引き出された（Soo Ch,Rahbar G,Moy RL.The immunogenicity of bovine collagen implants.J Dermatol Surg Oncol 1993;19:431-434;Charriere G,Bejot M,Schnitzler L,Ville G,Hartmann DJ.Reactions to a bovine collagen implant.J Am Acad Dermatol 1989;21:1203-1208）。しかし、本試験では重合化ブタＩ型コラーゲンを使用した。これは、抗炎症特性を有する（Krotzsch-Gomez FE,Furuzawa-Carballeda J,Reyes-Marquez R,Quiroz-Hernandez E,Diaz de Leon L.Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars.J Invest Dermatol 1998;111:828-34;Barile L,Furuzawa-Carballeda J,Krotzsch-Gomez FE,Espinosa-Morales R,Alcala M,Diaz de Leon L.Comparative study of collagen-polyvinylpyrrolidone vs..triamcinolone acetate in systemic sclerosis.Clin Exp Rheumatol 1998;16:370）。コラーゲン−ＰＶＰは、弱い免疫原であるためにペプシン化ブタＩ型皮膚コラーゲン（アテロペプチド）から製造される。本発明者らは、ブタが特に、ヒトコラーゲンとの高相同性を含む様々な実際的、倫理的、および安全性の理由において異種移植片の起源として提案された主要動物種であるために、ブタＩ型コラーゲンを好んだ（Weiss RA.Xenografts and retroviruses.Science 1999;285:1221-1222;Paradis K,Langford G,Long Z,Heneine W,Sandstrom P,Switzer WM,Chapman LE,Lockey Ch,Onions D,Otto E.Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue.Science 1999;1236-1241;Beard HK,Faulk WP,Conochie LB,Glynn LE.Some immunological aspects of collagen.Progr Allergy 1977;22:45-106）。
【００８５】
他方、電気泳動データは、コラーゲン−ＰＶＰがＰＶＰへ共有結合することを示唆している。ＰＶＰとの共有結合は、増加したコラーゲン安定性および減少したコラーゲン抗原性の両方を有している。固有の化学的性質のために、低分子量はＰＶＰを生物学的に不活性および安全にさせる（Clark DP,Hanke CW,Swanson NA.Dermal implants:Safety of products injected for soft tissue agumentation.J Am Acad Dermatol 1989;21:992-8;Soo Ch,Rahbar G,Moy RL.The immunogenicity of bovine collagen implants.J Dermatol Surg Oncol 1993;19:431-434）。その上に、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンのホモポリマーもしくはＰＶＰは、本生物薬剤にコラーゲンまたはＰＶＰ単独において観察される医薬特性とは相違する医薬特性を付与する。
【００８６】
ウシコラーゲンインプラントとは対照的に、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰを用いた場合に以前に記載された副作用（過敏性反応、軽度の紅斑、蕁麻疹、局所的腫脹、および特異的抗Ｉ型コラーゲン抗体産生）などの有害な副作用を見いださなかった（McClelland M,DeLustro F.Evaluation of antibody class in response to bovine collagen treatment in patients with urinary incontinence.J Urol 1996;155:2068-73;DeLustro F,Fries J,Kang A.Immunity to injectable collagen and autoimmune disease:a summary of current understanding.J Dermatol Surg Oncol 1988;14(Suppl I):57-65;Singh G,Fries JF.Autoimmune disease and collagen dermal implants.Ann Int Med 1994;120:524;Lewy RI.Autoimmune disease and collagen dermal implants.Ann Int Med 1994;120:525）。コラーゲン投与を行ったSieper,et al.,(1996)の試験とは相違して、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰの投与後に有害な作用も検査室検査結果（Ｃ反応性タンパク質、赤血球沈降速度またはリウマチ因子）における上昇も見いださなかった（Sieper J,Kary S,Sorensen H,Alten R,Eggens U,Huge W,Hiepe F,Kuhne A,Listing J,Ulbrich N,Braun J,Zink A,Mitchison NA.Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis.A double-blind,placebo-controlled,randomized trial.Arthritis Rheum 1996;39:41-9）。
【００８７】
コラーゲン−ＰＶＰ投与スキームは、マウスにおける疾患誘導後第７、１４、２１日における同等量のコレラ毒素Ｂサブユニット−ＩＩ型コラーゲンコンジュゲートを用いた１日１回の３回の投与対週１回の３回の投与の作用が非コンジュゲート化ＩＩ型コラーゲンまたは対照コレラ毒素Ｂを用いて１日１回治療されたマウスと比較して関節炎の発生率を有意に減少させることを証明したTarkowskiのスキーム（1999）と一致していた（Tarkowski A,Sun J-B,Holmdahl R,Holmgren J,Czerkinsky C.Treatment of experimental autoimmune arthritis by nasal administration of a type II collagen-cholera toxoid conjugate vaccine.Arthritis Rheum 1999;42:1628-34）。
【００８８】
用量（１．７ｍｇのコラーゲン）、投与経路（皮下）、および投与頻度によって、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰが、寛容誘導分子のように他の投与経路より有効であり、低い毒性作用を伴って機能できると提案する。コラーゲン−ＰＶＰの背景に基づいて、本発明者らは、コラーゲン−ＰＶＰがアネルギーよりもサイトカイン分泌調節細胞を生成すると考える（Furuzawa-Carballeda J,Cabral AR,Zapata-Zuniga M,Alcocer-Varela J.Subcutaneous administration of polymerized-type I collagen for the treatment of patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol 2003;30:256-9）。
【００８９】
ＡＣＲ基準を用いると、１．６ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰを用いた２０％の応答率は３カ月後に８０．０％であった。より厳しい基準を用いても良好な結果が得られた（ＡＣＲ５０で６０．０％の応答率およびＡＣＲ７０での２０．０％の応答率）。これらの数値は、第２相臨床試験においてetanerceptによって入手された数値と類似であった（Moreland LW,Baumgartner S,Schiff MH,et al.Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human tumor necrosis factor receptor(p75)-Fc fusion protein.N Engl J Med 1997;337:141-7）。
【００９０】
大多数のケースで、１２週間にわたり連続的な改善がみられ、これは治療期間が長いほど好都合であるという証拠と見なすことができよう。
【００９１】
これらの有望な結果そしてこの療法が知られている副作用を有していないという事実を前提にして、その有効性、至適用量、作用機序、プラセボ対照試験およびその他の投与経路を評価する詳細な試験が必要とされる。
【００９２】
［関節リウマチの患者を治療するためのコラーゲン−ＰＶＰ。二重盲験プラセボ対照試験における筋肉内投与の作用］
本試験は、プロスペクティブの長期二重盲験プラセボ対照試験であり、活動性ＲＡ（ＡＣＲ）の患者３０例を含んでいた。安定性用量のメトトレキセートを摂取していた患者を、６カ月間に渡り０．４ｍＬのコラーゲン−ＰＶＰ（３．３３ｍｇのコラーゲン）または０．４ｍＬのプラセボの筋肉内注射を行うFreybergスキームで治療した。主要エンドポイントには、疾患活動度スコア（ＤＡＳ）が含まれ、改善はRitchie指数（ＲＩ）、腫れ上がった関節点数、スペイン健康評価質問票（ＨＡＱ−ＤＩ）、目視アナログスケール上の疼痛強度（ＶＡＳ）および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む５種中３種の評価における平均変化を意味する米国リウマチ学会応答基準（ＡＣＲ２０、５０および７０）を用いて決定した。統計的分析は、両側Mann Whitney U検定を用いて実施した。コラーゲン−ＰＶＰは安全で良好に容認された。患者は６カ月間の治療でコラーゲン−ＰＶＰ治療群対プラセボ群において統計的有意な改善を示した（ｐ＜０．０５）：腫れ上がった関節点数（８．１±３．７対１７．９±４．８）、ＲＩ（１０．７±３．３対１７．８±５．４）、早朝硬直（９．４±４．６対３７．８±６．７）、リウマチ因子（２０７．７±１７９．１対５１８．８±２９３．２）、Ｃ反応性タンパク質（２．７±３．９対２８．１±２４．５）、ＨＡＱ（４６．７±１５．６対１８．８±１３．７）、ＤＡＳ（３．５±０．７対４．８±０．９）、ＡＣＲ２０（１００対７７．８％）、ＡＣＲ５０（６７．６対１１．１％）、ＡＣＲ７０（３３．３対０％）。血清学的または血液学的パラメーターは変化しないままであった。有害事象は生じなかった。
【００９３】
［結論］
コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、おそらく末梢免疫寛容を通して、ＲＡに罹患している患者の滑膜組織中で炎症、アポトーシス誘導、ならびにコラーゲン代謝回転に重要なダウンモジュレーション作用を示す。
【００９４】
このコポリマーは、増殖よりむしろ細胞代謝を変化させる。これは、ＩＩＩ型コラーゲン相対速度が上昇し、他方この薬物で治療された滑膜中のＩ型コラーゲンが減少するので、コラーゲンの総含量は変化させられないことで示唆されている。同様に、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、カルシウム非依存性コラゲナーゼ、ＥＣＭタンパク質、主としてコラーゲンの代謝回転を変化させ、そしてＩＩＩ型コラーゲンの含量を再確立するためにタンパク質溶解活性を減少させる。
【００９５】
上記に示した情報は、コラーゲン−ポリビニルピロリドンによるコラーゲン溶解活性減少の誘導がリウマチ性滑膜炎続発症、炎症性細胞による軟骨および骨侵襲ならびにそれらの侵害および分解を減少させることに寄与できることを示唆している。
【００９６】
さらにその上、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、ＲＡ組織中のＴＩＭＰ−１の増加を誘導するが、これはＥＣＭ代謝回転がＴＩＭＰ−１によるＭＭＰ遮断に関係する機序によって減少させられることを示唆している。
【００９７】
結果として、コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、本薬剤が細胞接着分子をダウンモジュレートし、この作用が細胞―細胞結合を予防するために、炎症性細胞侵襲および線維症を回避する。
【００９８】
この情報によって、本発明者らは、コラーゲン−ポリビニルピロリドン免疫変調作用が、滑膜関節への白血球遊走の減少を通して間質細胞および内皮細胞中での接着分子発現を変調することに集中していると提案する。
【００９９】
最後に、ＲＡにおいて、本コポリマーはこれらの前炎症性サイトカイン：ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−βをダウンモジュレートする。生理学的に、それらはＣｏｘ−１活性化を誘導できる結果として、ＰＧＥ2合成ならびに関節軟骨および骨吸収を増加させることができる。
【０１００】
同様に、以前に言及したサイトカインは、マウスモデルにおけるインビトロおよびインビボでのＲＡの開始および疾患バーストと関連付けられてきた。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８などの数種の他のサイトカインの合成および遊離を誘導することができ、それらは全部がＭＭＰの産生および活性を増加させ、ＲＡ患者由来の滑膜中のＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１毛細管発現を減少させることは周知である。
【０１０１】
結論として、ＲＡを罹患している、低用量のメトトレキセートおよび／またはＮＳＡＩＤを摂取していた患者へのコラーゲン−ポリビニルピロリドンを用いた８例のより疼痛性の関節に対する皮下治療は、疾患指数（ＤＡＳ）を改善し、以下のRitchie指数（疼痛性関節）、炎症性関節評価、疾患活動度（ＨＡＱ）に関する患者の一般的な評価、相対疼痛尺度（ＥＶＡ）、ならびに急性期タンパク質の５種中３種の尺度（ＡＣＲ２０）における重要な変化を生じさせた。コラーゲン−ポリビニルピロリドン治療は血液もしくは血清中の変化を刺激せず、このコポリマーはこれが生物学的コポリマーであり、現在までは、患者が長期間（１２カ月より多く）にわたり治療された場合でさえ、患者にとってのリスクを産生しない、抗Ｉ型コラーゲンも抗コラーゲン−ポリビニルピロリドン抗体も抗ＳＳＡ／ＳＳＢもしくは抗ＤＮＡ抗体を刺激しないという利点を示す。コラーゲン−ポリビニルピロリドンは、短期間ＲＡ療法のために安全かつ有効な生体分子である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
記載なし。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前炎症性サイトカインの発現をダウンレギュレートするコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体。
【請求項２】
前炎症性細胞接着分子の発現をダウンレギュレートする、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項３】
コラーゲン代謝を調節する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項４】
アポトーシスをアップレギュレートする、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項５】
末梢免疫応答を調節する寛容誘導分子のように作用する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項６】
慢性再発性炎症を調節する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項７】
短期ＲＡ療法のために有効である、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項８】
ＲＡ患者の生活の質を改善する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項９】
骨関節症を治療するための請求項１〜９に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
骨関節症を治療するための薬剤を調製するためのコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体の使用。
【請求項１１】
関節リウマチを治療するための薬剤を調製するための請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体の使用。
【請求項１】
前炎症性サイトカインの発現をダウンレギュレートするコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体。
【請求項２】
前炎症性細胞接着分子の発現をダウンレギュレートする、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項３】
コラーゲン代謝を調節する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項４】
アポトーシスをアップレギュレートする、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項５】
末梢免疫応答を調節する寛容誘導分子のように作用する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項６】
慢性再発性炎症を調節する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項７】
短期ＲＡ療法のために有効である、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項８】
ＲＡ患者の生活の質を改善する、請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン。
【請求項９】
骨関節症を治療するための請求項１〜９に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
骨関節症を治療するための薬剤を調製するためのコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体の使用。
【請求項１１】
関節リウマチを治療するための薬剤を調製するための請求項１に記載のコラーゲン−ポリビニルピロリドン生体複合体の使用。
【公表番号】特表２００８−５００３３４（Ｐ２００８−５００３３４Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４９３５（Ｐ２００７−５１４９３５）
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＸ２００５／００００４１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５４４３
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３９４１５３）アスピド，ソシエダ・アノニマ・デ・カピタル・バリアブレ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＸ２００５／００００４１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５４４３
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３９４１５３）アスピド，ソシエダ・アノニマ・デ・カピタル・バリアブレ (1)
【Ｆターム（参考）】
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