コンセンサス／先祖免疫原
【課題】幅広いＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する免疫原を提供する。
【解決手段】コンピュータモデルを使用して、中心化されたＨＩＶ−１遺伝子のコンセンサス配列を作製することによって、ワクチン株と現在の流行ウイルス間の配列の不一致の程度を最小限に抑えるような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法。さらに、前記免疫原となるコンセンサス配列からなるタンパク質のアミノ酸配列、並びに、前記タンパク質をコードする核酸配列。
【解決手段】コンピュータモデルを使用して、中心化されたＨＩＶ−１遺伝子のコンセンサス配列を作製することによって、ワクチン株と現在の流行ウイルス間の配列の不一致の程度を最小限に抑えるような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法。さらに、前記免疫原となるコンセンサス配列からなるタンパク質のアミノ酸配列、並びに、前記タンパク質をコードする核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年９月１７日に出願された仮出願第６０／５０３，４６０号及び２００４年８月２７日に出願された仮出願第６０／６０４，７２２号の優先権を主張するものであり、これらの内容全体は、参照により、本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、概括的には免疫原に関し、具体的には、幅広いＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する免疫原に関する。本発明は、このような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法にも関する。本発明は、さらに、本発明の免疫原をコードする核酸配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１の高レベルの遺伝的変異性は、ＡＩＤＳワクチン開発にとって大きな障害となっている。ＨＩＶ−１のグループＭ、Ｎ及びＯ間の遺伝的差異は大きく、ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子では、それぞれ３０％から５０％にわたる(Gurtler et al, J.Virol. 68:1581-1585(1994), Vanden Haesevelde et al, J. Virol. 68: 1586-1596(1994), Simon et al, Nat. Med. 4:1032-1037(1998), Kuiken et al, Human retroviruses and AIDS 2000: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico))。グループＭに属するウイルスは、さらに、遺伝的に異なる９つのサブタイプ（Ａ−Ｄ、Ｆ−Ｈ、Ｊ及びＫ）に分類される(Kuiken et al, Human retroviruses and AIDS 2000: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, Robertson et al, Science 288:55-56(2000), Robertson et al, Human retroviruses and AIDS 1999: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Kuiken et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. 492-505(2000))。ＨＩＶ−１サブタイプ間のｅｎｖ遺伝子中の遺伝的変動が３０％にも達するため、全てのＨＩＶ−１サブタイプに対して、異なるサブタイプにわたり、Ｔ及びＢ細胞免疫応答を一貫して惹起することは困難であった。ＨＩＶ−１は、しばしば、異なるサブタイプ間で組換えを行い、組換え型流行株（ＣＲＦ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｒｍ）を作り出す(Robertson et al, Science 288:55-56(2000), Robertson et al, Human retroviruses and AIDS 1999: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Kuiken et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. 492-505 (2000), Carr et al, Human retroviruses and AIDS 1998: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Korber et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. III-10-III-19(1998))。複数のサブタイプが一般的な地理的領域では、ＨＩＶ−１単離株の２０％超が組換え体であり(Robertson et al, Nature 374:124-126(1995), Cornelissen et al, J. virol.70:8209-8212(1996), Dowling et al, AIDS 16:1809-1820(2002))、組換えウイルスの発生頻度が高いことが、実験的なＨＩＶ−１免疫原の設計をさらに複雑にし得る。
【０００４】
ＡＩＤＳワクチン開発におけるこれらの困難な課題を克服するために、３つのコンピュータモデル（コンセンサス、先祖及び樹形中心（ＣＯＴ；ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅｅ））を使用して、中心化されたＨＩＶ−１遺伝子（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ＨＩＶ−１ ｇｅｎｅ）が生成されている(Gaschen et al, Science 296:2354-2360(2002), Gao et al, Science 299:1517-1518(2003), Nickle et al, Science 299:1515-1517 (2003), Novitsky et al, J. Virol. 76:5435-5451(2002), Ellenberger et al, Virology 302:155-163(2002), Korber et al, Science 288:1789-1796(2000))。ＨＩＶの生物学は、星状の系統発生を生じ、この結果、３種類の配列は互いに２から５％異なる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：５１７−１５１８ （２００３））。３つの中心化された遺伝子戦略は何れも、免疫原と野生ウイルス株間のタンパク質距離を少なくするであろう。コンセンサス配列は、アラインメント中の各位置において最も一般的なアミノ酸を基礎として、人工配列を作製することによって、ワクチン株と現在の流行ウイルス間の配列の不一致の程度を最小限に抑える（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２））。先祖配列は、コンセンサス配列と類似するが、最大確率系統発生分析法を用いて作製される（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。このようにする際には、本方法は、分析された現行の野生型配列の仮定的な先祖遺伝子を再現する（図２６）。Ｎｉｃｋｌｅらは、樹形中心（ＣＯＴ）という、先祖配列と似ているが、外れ値による影響が先祖配列より低い中心化されたＨＩＶ−１配列を作製するための別の方法を提案した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。
【０００５】
本発明は、中心化された免疫原がＴ及びＢの両細胞免疫応答を動物に誘導できるかどうかを決定するために設計された研究の結果から、少なくとも部分的にはもたらされる。これらの研究では、人工のグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製、並びにＣＯＮ６エンベロープを可溶性ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質として発現するためのＤＮＡプラスミド及び組換えワクシニアウイルスの構築を行う。この結果は、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であり、野生型ＨＩＶの線形、高次構造及びグリカン依存性エピトープを有しており、ＨＩＶサブタイプＢ及びＣの両方のＴ細胞エピトープを認識するサイトカイン産生Ｔ細胞を誘導する。重要なことは、ＣＯＮ６、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質は、サブタイプＢ及びＣのＨＩＶ−１初代単離株のサブセットを中和する抗体を誘導するということである。
【０００６】
中心化されたＨＩＶ−１遺伝子アプローチの研究の反復的性質は、ＨＩＶ−１配列の急速に拡大する進化、及びＨＩＶ配列データベース（すなわち、 ｔｈｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ）に集められた配列は、毎年、継続的に新たな配列で更新されているという事実に由来する。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０エンベロープ遺伝子は、Ｙｅａｒ １９９９ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅの配列に由来し、Ｃｏｎ−ｓはＹｅａｒ ２０００ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅの配列に由来する。さらに、ＣＯＮ６は、チャイニーズサブタイプＣ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４及びＶ５ Ｅｎｖ配列を有するのに対して、Ｃｏｎ−Ｓは全て、最小長の可変ループへと短縮されたグループＭコンセンサスＥｎｖ定常領域及び可変領域を有する。ＨＩＶ−１初代単離株に対して幅広い反応性があるＴ及びＢ細胞応答を誘導するのに使用するために、野生型ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ遺伝子の対応する系列を比較用に有するように、一連のＹｅａｒ ２００３グループＭ及びサブタイプコンセンサス配列に対するコドン最適化遺伝子が設計されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、幅広いＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する免疫原ならびに前記免疫原をコードする核酸配列に関する。本発明は、このような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法にも関する。
【０００８】
本発明の目的及び利点は、以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製及び発現。ＣＯＮ６ ｇｐ１６０の完全なアミノ酸配列が示されている。
【００１０】
（図１Ａ）野生型ＣＲＦ０８＿ＢＣ（９８ＣＮ００６）ｅｎｖ遺伝子から得られる５つの領域は、下線を付した文字によって記されている。可変領域は、配列の上にある括弧によって記されている。Ｎ結合型グリコシル化部位の候補は、太字で強調されている。
【図１−２】グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製及び発現。
【００１１】
（図１Ｂ）ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの構築。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦプラスミドは、それぞれ、ｇｐ１２０切断部位の後、又は膜貫通ドメインの前に停止コドンを導入することによって作製された。ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位及びｇｐ４１の融合ドメインは、ｇｐ１４０ＣＦタンパク質では欠失した。
【００１２】
（図１Ｃ）ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの発現。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦは、ｇａｌａｎｔｈｕｓ Ｎｉｖａｌｉｓアルガロース−レクチンカラムを用いて、ｒＷを感染させた２９３Ｔ細胞の細胞培養上清から精製された。ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの両者を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅブルーで染色した。
【００１３】
（図１Ｄ．）高度に発現されるヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を最適化した。
【図２−１】ＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ｇｐ１４０ ＣＦの、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）及び抗Ｅｎｖ ｍＡｂへの結合。
【００１４】
（図２Ａ−２Ｂ）ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）に、表記の各ｍａｂ及びｓＣＤ４を共有結合によって固定し、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０（図２Ａ）又はｇｐ１４０ＣＦ（図２Ｂ）（それぞれ、１００ｇ／ｍＬ及び３００μｇ／ｍＬ）を各表面に注射した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦへの結合が無視できる程度であったｆｏｒ１７ｂ ｍａｂを除き、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ両タンパク質は、検査した各抗ｇｐ１２０ｍａｂと反応した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦへの１７ｂ ｍａｂ結合の誘導を測定するために、ｓＣＤ４又はｍａｂ Ａ３２若しくはＴ８が固定化された各フローセル上にＣＯＮ６ ｇｐ１２０（図２Ｃ）又はｇｐ１４０ＣＦ（図２Ｄ）タンパク質を捕捉した（４００から５８０ＲＵ）。各表面の安定化を行った後、ｍＡｂ １７ｂを注入し、固定化された各フローセルの上に流した。曲線の重ね合わせにより、ｍａｂ １７ｂのＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質への結合が、ｓＣＤ４及びｍａｂ Ａ３２表面の両者で顕著に増加しているが、Ｔ８表面上では増加していないことが明らかである（図２Ｃ−２Ｄ）。
【図２−２】ＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ｇｐ１４０ ＣＦの、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）及び抗Ｅｎｖ ｍＡｂへの結合。
【００１５】
ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦのヒト ｍａｂへの結合をＥＬＩＳＡで決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦに対するｍａｂ ４４７、Ｆ３９Ｆ、Ａ３２、ＩｇＧ１ｂ１２及び２Ｆ５の２０μｇ／ｍＬの原溶液を滴定した（図２Ｅ）。Ｍａｂ ４４７（Ｖ３）、Ｆ３９Ｆ（Ｖ３）Ａ３２（ｇｐ１２０）及びＩｇＧ１ｂ１２（ＣＤ４結合部位）は、それぞれ、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及び１４０ウェルの両方に結合したのに対して、２Ｆ５（抗ｇｐ４１ ＥＬＤＫＷＡＳ）はｇｐ１４０ＣＦのみを結合した。ｇｐ１２０に対するｍａｂ ４４７及びＦ３９Ｆの結合の終末点力価における濃度は、それぞれ、０．００３μｇ／ｍＬ未満及び０．００６μｇ／ｍＬ未満であり、ｍａｂ Ａ３２については、０．１２５μｇ／ｍＬ未満、ＩｇＧ１ｂ１２については、０．００２μｇ／ｍＬ未満、２Ｆ５については、０．０１６ｇ／ｍＬであった。
【図３】ＣＯＮ６エンベロープの感染性及び共同受容体使用。
【００１６】
（図３Ａ）ＣＯＮ６及び対照ｅｎｖプラスミドを、ＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖ骨格とともに、ヒト２９３Ｔ細胞中に同時形質移入して、Ｅｎｖ擬ビリオンを作製した。ＪＣ５３−ＢＬ細胞を感染させるために、等量の各擬ビリオン（５ｎｇ ｐ２４）を使用した。β−ｇａｌ発現について感染細胞を染色した後、１μｇの擬ビリオンのｐ２４（ＩＵ／μｇ ｐ２４）当たりの青い細胞（感染単位、ＩＵ）の数を数えることによって、感染性を決定した。
【００１７】
（図３Ｂ）ＡＭＤ３１００及び／又はＴＡＫ−７９９により、１時間（３７℃）で処理した後、等量の各Ｅｎｖ擬ビリオンのｐ２４（５ｎｇ）に感染させたＪＣ５３ＢＬ細胞に対して、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子の共同受容体の使用を決定した。対照グループにおける感染性（遮断剤なし）を１００％として設定した。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来のＩＵのパーセントとして表した。示されているデータは、平均±ＳＤである。
【図４】複数サブタイプの抗血清に対する複数サブタイプのＥｎｖタンパク質のウェスタンブロット分析。等量のＥｎｖタンパク質（１００ｎｇ）を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬニトロセルロース膜に転写し、ＨＩＶ−１感染した患者から得た血清（１：１，０００）、又はＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ＤＮＡ初回刺激、ｒＷ追加刺激で免疫したモルモット（１：１，０００）から得た血清（１：１，０００）と反応させた。タンパク質が結合された抗体を、蛍光標識した二次抗体でプローブし、画像をスキャンし、赤外線撮像装置Ｏｄｙｓｓｅｙ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ．ＮＥ．）上に記録した。サブタイプは、Ｅｎｖタンパク質及び血清ＩＤの後に、一文字で表記されている。各サブタイプに対して４から６個の血清を検査し、反応パターンは、同じサブタイプから得た全ての血清間で類似していた。各サブタイプの血清に対して一つの代表的な結果が示されている。
【図５】マウス中のＣＯＮ６ Ｅｎｖ 免疫原によって誘導されたＴ細胞免疫応答。免疫化された各マウスから脾細胞を単離した（５匹のマウス／群）。ＣＯＮ６（黒のカラム）、サブタイプＢ（斜線入りカラム）、サブタイプＣ（白のカラム）及び溶媒（ペプチドなし；灰色のカラム）の重複するＥｎｖペプチドプールで、脾細胞をインビトロで刺激した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＩＮＦ−γ産生細胞を決定した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦによって誘導されたＴ細胞ＩＦＮ−γ応答を、サブタイプ特異的なＥｎｖ免疫原（ＪＲＦＬ及び９６ＺＭ６５１）によって誘導された応答と比較した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、百万個の脾細胞当たりのＳＦＣとして表される。各カラムに対する値は、ＩＦＮ−γ ＳＦＣの平均±ＳＥＭである（ｎ＝５匹のマウス／群）。
【図６Ａ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｂ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｃ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｄ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｅ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図７】ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、高レベルのＣＤ４並びにＨＩＶ−１共同受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞から派生した細胞である。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、それぞれ、ＨＩＶ−１ ＬＴＲから発現されるルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を２４又は９６ウェルプレート中に播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、３７℃で３０分間、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎで処理した。１％ ＤＭＥＭ中にウイルスを系列希釈し、ＤＥＡＥ−デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、さらに細胞培地を各ウェルに添加する。３７℃で４８時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼを発現している青色の病巣を可視化するために、Ｘ−Ｇａｌを用いて染色するか、又はルシフェラーゼ活性を測定するために３回凍結融解した。
【図８】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ遺伝子の配列アラインメント。９５．５％の配列相同性を示すサブタイプＣ先祖（下の線）及びコンセンサス（上の線）ｅｎｖ配列のアラインメント；アミノ酸配列の差が記されている。一つの顕著な差は、Ｖ１ループの基部にあるＣ先祖ｅｎｖ遺伝子中にグリコシル化部位が追加されていることである。プラスの符号は、表記位置におけるアミノ酸がクラス内で異なることを表しており、バーは、アミノ酸のクラスが変化していることを表している。Ｎ−グリコシル化部位の候補は、青でマークされている。ｇｐ１４０遺伝子に対する末端切断の位置も示されている。
【図９】２９３Ｔ細胞中でのサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープの発現。コドンを最適化されたｇｐ１６０、ｇｐ１４０又はｇｐ１２０サブタイプＣ先祖及びコンセンサス遺伝子を含有するプラスミドを２９３Ｔ細胞中に形質移入し、細胞可溶化液のウェスタンブロット分析によって、タンパク質発現を調べた。形質移入から４８時間後に、細胞可溶化液を集め、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、総タンパク質含量を測定し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２μｇの総タンパク質を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、サブタイプＣに感染した患者から得たＨＩＶ−１血漿でプローブした。
【図１０】図１０Ａ。コドン最適化されたサブタイプ先祖Ｃ及びコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４０による、ｅｎｖ欠失ＨＩＶ−１のトランス相補性。コドン最適化された、サブタイプＣ先祖又はコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０遺伝子を含有するプラスミドを、ＨＩＶ−１ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、偽型ウイルスを含有する細胞上清を採集し、遠心によって清澄にし、０．２μＭのフィルターを通してろ過し、２０％のスクロースクッションを通して沈降させる。各ウイルスペレット中のｐ２４の定量は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原アッセイを用いて決定した。コドン最適化されたエンベロープを含有する粒子については、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２５ｎｇのｐ２４を載せた。ｒｅｖ依存性野生型サブタイプＣ ９６ＺＡＭ６５１ｅｎｖ遺伝子の同時形質移入によって作製された粒子については、レーン当たり２５０ｎｇのｐ２４を載せた。レーン当たりに載せられたｐ２４の量の差は、ウェスタンブロットによるｒｅｖ依存性エンベロープの可視化を確保するために必要であった。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢ及びサブタイプＣに感染した個体から得た、プールされた血漿でプローブした。
【００１８】
図１０Ｂ。サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス粒子の感染性。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを用いて、先祖又はコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０エンベロープを含有する偽型ウイルスの感染性を決定した。Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって、スクロースクッションで精製されたウイルス粒子をアッセイし、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともに、各ペレットの５倍系列希釈をインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を可視化するために染色した。導入した擬ビリオンの濃度差を標準化するために、感染性は、１ｎｇのｐ２４当たりの感染単位として表されている。
【図１１】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープの共同受容体の使用。先祖又はコンセンサスエンベロープを含有する偽型粒子を、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４の特異的阻害剤）、ＴＡＫ７７９（ＣＣＲ５の特異的阻害剤）又はＡＭＤ３０００＋ＴＡＫ７７９の存在下で、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともにインキュベートして、共同受容体の使用を測定した。ＣＸＣＲ４を使用することが知られた単離株ＮＬ４．３及びＣＣＲ５を使用する公知の単離株ＹＵ−２を対照として含めた。
【図１２】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質の中和感受性。先祖、コンセンサス又は９６ＺＡＭ６５１ ｇｐ１６０エンベロープ（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、ＨＩＶ−１サブタイプＣに感染した患者から得た血漿試料のパネルとともに、プレインキュベートし、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出する。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出する。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認する。
【図１３−１】２９３Ｔ細胞への形質移入後のコンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ（図１３Ａ）とＮｅｆ（図１３Ｂ）のタンパク質発現。コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆアミノ酸配列は、それぞれ、図１３Ｃ及び１３Ｄに記されており、コードしている配列は、図１３Ｅ及び１３Ｆに記されている。
【図１３−２】２９３Ｔ細胞への形質移入後のコンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ（図１３Ａ）とＮｅｆ（図１３Ｂ）のタンパク質発現。コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆアミノ酸配列は、それぞれ、図１３Ｃ及び１３Ｄに記されており、コードしている配列は、図１３Ｅ及び１３Ｆに記されている。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖのアミノ酸配列及びコード配列を示している。図１４Ｃは、インビトロ転写及び翻訳系を用いたグループＭコンセンサスＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現を示している。
【図１４−２】図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖのアミノ酸配列及びコード配列を示している。図１４Ｃは、インビトロ転写及び翻訳系を用いたグループＭコンセンサスＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現を示している。
【図１５】哺乳類細胞中でのＣｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子の発現。（図１５Ａ−細胞可溶化液、図１５Ｂ−上清）
【図１６】ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子の感染性（図１６Ａ）及び共同受容体の使用（図１６Ｂ）。
【図１７】ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ擬ビリオンへのＥｎｖタンパク質の取り込み。（図１７Ａ−可溶化液、図１７Ｂ−上清、図１７Ｃ−ペレット。）
【図１８−１】図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、サブタイプＡのコンセンサスＥｎｖアミノ酸配列及びこれをコードする核酸配列を示している。
【図１８−２】図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、サブタイプＡのコンセンサスＥｎｖアミノ酸配列及びこれをコードする核酸配列を示している。
【図１８−３】図１８Ｃ及び１８Ｄは、哺乳類細胞中でのＡ． ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子発現を示している（図１８Ｃ−細胞可溶化液、図１８Ｄ−上清）。
【図１９−１】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−２】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−３】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−４】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−５】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図２０−１】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２０−２】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２０−３】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２１】２９３Ｔ細胞中でのサブタイプＢコンセンサスｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子の発現。コドンを最適化されたサブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０、ｇｐ１４０及びｇａｇ遺伝子を含有するプラスミドを２９３Ｔ細胞中に形質移入し、細胞可溶化液のウェスタンブロット分析によって、タンパク質発現を調べた。形質移入から４８時間後に、細胞可溶化液を集め、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、総タンパク質含量を測定し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２μｇの総タンパク質を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血清で探索した。
【図２２】サブタイプＢコンセンサスエンベロープの共同受容体の使用。サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０ Ｅｎｖを含有する偽型粒子を、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４の特異的阻害剤）、ＴＡＫ７７９（ＣＣＲ５の特異的阻害剤）及びＡＭＤ３０００＋ＴＡＫ７７９の存在下で、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともにインキュベートして、共同受容体の使用を測定した。ＣＸＣＲ４を使用することが知られた単離株ＮＬ４．３及びＣＣＲ５を使用する公知の単離株ＹＵ−２を対照として含めた。
【図２３】コドン最適化されたサブタイプＢ並びにコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４０遺伝子による、ｅｎｖ欠失ＨＩＶ−１のトランス相補性。コドン最適化された、サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０遺伝子を含有するプラスミドを、ＨＩＶ−１ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、偽型ウイルスを含有する細胞上清を採集し、卓上遠心機で清澄にし、０．２μＭのフィルターを通してろ過し、２０％のスクロースクッションを通して沈降させる。各ウイルスペレット中のｐ２４の定量は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原アッセイを用いて決定した。４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２５ｎｇのｐ２４を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した患者の血清から得た抗ＨＩＶ−１抗体でプローブした。対照のために、ｒｅｖ依存性ＮＬ４．３ ｅｎｖによるトランス相補性を含めた。図２３Ｂ。サブタイプＢコンセンサスエンベロープを含有するウイルス粒子の感染性。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを用いて、コンセンサスＢ ｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０を含有する偽型ウイルスの感染性を決定した。Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって、スクロースクッションで精製されたウイルス粒子をアッセイし、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともに、各ペレットの５倍系列希釈をインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を可視化するために染色した。感染性は、１μｇのｐ２４当たりの感染単位として表されている。
【図２４−１】サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有するビリオンの中和感受性。サブタイプＢコンセンサス又はＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、３つの異なるモノクローナル中和抗体及びＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿試料のパネルとともにプレインキュベートし、次いで、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層中に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出した。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出した。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認した。図２４Ａ。サブタイプＢコンセンサスＥｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。図２４Ｂ。ＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。
【図２４−２】サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有するビリオンの中和感受性。サブタイプＢコンセンサス又はＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、３つの異なるモノクローナル中和抗体及びＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿試料のパネルとともにプレインキュベートし、次いで、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層中に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出した。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出した。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認した。図２４Ｃ。サブタイプＢコンセンサスＥｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。図２４Ｄ。ＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。
【図２５】図２５Ａ。ショ糖勾配画分の密度及びｐ２４分析。２０から６０％のショ糖勾配から、０．５ｍＬの画分を集めた。画分番号１は、勾配チューブの底から採取された最も密度の高い画分を表している。屈折計で密度を測定し、各画分中に存在するｐ２４の量を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって決定した。画分６−９、１０−１５、１６−２１及び２２−２５を一緒にプールし、ウェスタンブロットによって分析した。予想通り、ビリオンは、１．１６から１．１８ｇ／ｍＬの密度で沈降した。
【００１９】
図２５Ｂ。サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の同時形質移入によるＶＬＰの産生。サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子で、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入から４８時間後に細胞上清を採集し、２０％のショ糖クッションを通して清澄にし、２０から６０％のショ糖勾配を通してさらに精製した。勾配由来の選択した画分をプールして、２０ｍＬのＰＢＳに添加し、１００，０００×ｇで一晩遠心した。再懸濁したペレットを４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せ、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿でプローブした。
【図２６】図２６Ａ。２０００ Ｃｏｎ−Ｓ １４０ＣＦＩ．ＥＮＶ．図２６Ｂ。コドン最適化されたＹｅａｒ ２０００ Ｃｏｎ−Ｓ １４０ＣＦＩ．ｓｅｑ。
【図２７】ＨＩＶ−１エンベロープペプチドに対する各Ｃ５７ＢＬ／６マウスＴ細胞応答。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦＩ及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩのＣ５７ＢＬ／Ｃマウス中での比較免疫原性。ＤＮＡ初回刺激、ｒＷ追加刺激投与計画、群当たり５匹のマウスで、ＨＩＶ５３０５（サブタイプＡ）、２８０１（サブタイプＢ）、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ遺伝子でマウスを免疫した。ｒＷ追加刺激から１０日後に、ＨＩＶ−１ ＵＧ３７（Ａ）、ＭＮ（Ｂ）、Ｃｈｌ９（Ｃ）、８９．６（Ｂ）ＳＦ１６２（Ｂ）又は無ペプチド陰性対照のＥｎｖから得た重複するペプチドの混合物を用いて、ＩＦＮ−γスポット形成細胞に対して脾細胞をアッセイした。
【図２８】図２８Ａ。Ｃｏｎ−Ｂ ２００３ Ｅｎｖ．ｐｅｐ（８４１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図２８Ｂ。Ｃｏｎ−Ｂ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３２アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図２８Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｂ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１９２７ヌクレオチド）。
【図２９】図２９Ａ。ＣＯＮ＿ＯＦ＿ＣＯＮＳ−２００３（８２９アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図２９Ｂ。ＣｏｎＳ−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２０アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図２９Ｃ。コドン最適化された ＣｏｎＳ−２００３ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１８９１ヌクレオチド）。
【図３０】図３０Ａ。コンセンサス＿Ａ１−２００３（８４５アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３０Ｂ。Ｃｏｎ−Ａ１−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３０Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ａ１−２００３ ｓｅｑ。
【図３１】図３１Ａ。コンセンサス＿Ｃ−２００３（８３５アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３１Ｂ。Ｃｏｎ−Ｃ ２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６１９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３１Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｃ ２００３ １４０ＣＦ（１，８８８ヌクレオチド）。
【図３２】図３２Ａ。コンセンサス＿Ｇ−２００３（８４２アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３２Ｂ。Ｃｏｎ−Ｇ−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２６アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３２Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｇ−２００３ ｓｅｑ。
【図３３】図３３Ａ。コンセンサス＿０１＿ＡＥ−２００３（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３３Ｂ。Ｃｏｎ−ＡＥ０１−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３８アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３３Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−ＡＥ０１−２００３ ｓｅｑ．（１９４５ヌクレオチド）。
【図３４】図３４Ａ。野生型サブタイプＡ Ｅｎｖ．００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ（サブタイプＡ、８９１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３４Ｂ。００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６４７アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３４Ｃ。コドン最適化された ００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ １４０ＣＦ． ｓｅｑ．（１９７２ヌクレオチド）。
【図３５】図３５Ａ。野生型サブタイプＢ．ＱＨ０５１５．１ｇ ｇｐ１６０（８６１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３５Ｂ。ＱＨ０５１５． ｌｇ １４０ＣＦ （６５１アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３５Ｃ。コドン最適化された ＱＨ０５１５．１ｇ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１９８４ヌクレオチド）。
【図３６】図３６Ａ。野生型サブタイプＣ ＤＵ１２３．６ ｇｐ１６０（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３６Ｂ。ＤＵ１２３．６ １４０ＣＦ（６３８アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３６Ｃ。コドン最適化されたＤＵ１２３．６ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９４５ヌクレオチド）。
【図３７】図３７Ａ。野生型サブタイプＣＲＦ０１＿ＡＥ．９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３７Ｂ。９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ １４０ＣＦ． ｐｅｐ（６２９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３７Ｃ。コドン最適化された ９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９２１ヌクレオチド）。
【図３８】図３８Ａ。野生型ＤＲＣＢＬ−Ｇ（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３８Ｂ。ＤＲＣＢＬ−Ｇ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３０アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３８Ｃ。コドン最適化されたＤＲＣＢＬ−Ｇ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９２１ヌクレオチド）。
【図３９】図３９Ａ。２００３ Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ。図３９Ｂ。２００３ Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４０】図４０Ａ。２００３ Ｍ． Ｇｒｏｕｐ．Ａｎｃ Ｅｎｖ。Ｆｉｇ． ４０Ｂ。２００３ Ｍ． Ｇｒｏｕｐ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４１】図４１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ａ１ Ｅｎｖ。図４１Ｂ。２００３ ＣＯＮ Ａ１ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４２】図４２Ａ。２００３ Ａ１．Ａｎｃ Ｅｎｖ。図４２Ｂ。２００３ Ａ１． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４３】図４３Ａ。２００３ Ｃｏｎ＿Ａ２ Ｅｎｖ。図４３Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ａ２ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４４】図４４Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｂ Ｅｎｖ。図４４Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｂ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４５】図４５Ａ。２００３ Ｂ． ａｎｃ Ｅｎｖ。図４５Ｂ。２００３ Ｂ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４６】図４６Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｃ Ｅｎｖ。図４６Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４７】図４７Ａ。２００３ Ｃ． ａｎｃ Ｅｎｖ。図４７Ｂ。２００３ Ｃ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４８】図４８Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｄ Ｅｎｖ。図４８Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｄ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４９】図４９Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ１ Ｅｎｖ。図４９Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ１ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５０】図５０Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ２ Ｅｎｖ。図５０Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ２ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５１】図５１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｇ Ｅｎｖ。図５１Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｇ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５２】図５２Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｈ Ｅｎｖ。図５２Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｈ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５３】図５３Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ Ｅｎｖ。図５３Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５４】図５４Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ Ｅｎｖ。図５４Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５５】図５５Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ Ｅｎｖ。図５５Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５６】図５６Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図５６Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５７】図５７Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図５７Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５８】図５８Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ Ｅｎｖ。図５８Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５９】図５９Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ Ｅｎｖ。図５９Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６０】図６０Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図６０Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６１】図６１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ Ｅｎｖ。図６１Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６２】図６２Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ Ｅｎｖ。図６２Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６３】図６３Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ ＰＥＰ。図６３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６４】図６４Ａ。２００３＿Ｍ．ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６４Ｂ。２００３＿Ｍ．ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６５】図６５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｇａｇ． ＯＰＴ。図６５Ｃ。２００３＿Ａ１． ａｎｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６５Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６６】図６６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６７】図６７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｇａｇ．ＯＰＴ。図６７Ｃ。２００３＿Ｂ． ａｎｃ ｇａｇ． ＰＥＰ。図６７Ｄ。２００３＿Ｂ． ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６８】図６８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｇａｇ．ＯＰＴ。図６８Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｇａｇ．ＰＥＰ。図６８Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｇａｇ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６９】図６９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７０】図７０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ ｇａｇ ＰＥＰ。図７０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７１】図７１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７２】図７２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７３】図７３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｋ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｋ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７４】図７４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１ＡＥ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７５】図７５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２ＡＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７６】図７６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７７】図７７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７７Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７８】図７８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７９】図７９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０７＿ＢＣ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０７＿ＢＣ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８０】図８０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８１】図８１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８２】図８２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８３】図８３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ．ｇａｇ．ＰＥＰ。図８３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ． ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８４】図８４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８５】図８５Ａ。２００３＿ＣＯＮＳ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８５Ｂ。２００３＿ＣＯＮＳ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８６】図８６Ａ。２００３＿Ｍ ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８６Ｂ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ．ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８７】図８７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８８】図８８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｎｅｆ． ＰＥＰ。図８８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図８８Ｃ。２００３＿Ａ１． ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８８Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８９】図８９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｎｅｆ． ＰＥＰ。図８９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９０】図９０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ−Ｂ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図９０Ｃ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９０Ｄ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９１】図９１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９２】図９２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図９２Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９２Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｎｅｆ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９３】図９３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９４】図９４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９５】図９５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９６】図９６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９７】図９７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９８】図９８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１ ＡＥ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９９】図９９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＥ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＥ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１００】図１００Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１００Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０１】図１０１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０２】図１０２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０３】図１０３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０４】図１０４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０５】図１０５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０６】図１０６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０７】図１０７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０８】図１０８Ａ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０８Ｂ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０９−１】図１０９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０９−２】図１０９Ｃ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０９Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１０】図１１０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１１−１】図１１１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１１−２】図１１１Ｃ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１１Ｄ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１２−１】図１１２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１２−２】図１１２Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１２Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１３】図１１３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１４】図１１４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１５】図１１５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１６】図１１６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１７】図１１７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１８】図１１８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１９】図１１９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２０】図１２０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２１】図１２１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２２】図１２２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｐｏｌ． ＰＥＰ。図１２２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２３】図１２３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２４】図１２４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２５】図１２５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿ｌｌ＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿ｌｌ＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２６】図１２６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２７】図１２７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、多様なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）初代単離株を中和する抗体を誘導する免疫原及び／又はＴ細胞応答を誘導する免疫原に関する。該免疫原は、少なくとも一つのコンセンサス若しくは先祖免疫原（例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ又はＰｏｌ）、又はそれらの一部、又は変異形を含む。本発明は、コンセンサス若しくは先祖免疫原をコードする核酸配列又はそれらの一部、又は変異形にも関する。本発明は、さらに、前記免疫原およびコード配列の両者を使用する方法に関する。本発明は、具体的なコンセンサス及び先祖免疫原（例えば、グループＭコンセンサスＥｎｖ）を参照しながら、詳細に記載されているが、本明細書に記載されているアプローチは、様々なコンセンサス又は先祖免疫原（例えば、他のＨＩＶ−１グループに対するエンベロープ（例えば、Ｎ及びＯ））を作製するために使用できることが自明であろう。
【００２１】
本発明の一実施形態に従えば、コンセンサスｅｎｖ遺伝子は、例えば、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ中の配列から（例えば、ＭＡＳＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｏｒ）を用いて）特定のＨＩＶ−１グループの各サブタイプ（グループＭは、サブタイプＡ−Ｄ、Ｆ−Ｈ、Ｊ及びＫに分類される。）に対してｅｎｖ遺伝子のコンセンサス配列を作製することによって構築することができる。次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を生成することができる（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００））。実施例１に記載されたグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６と表記）の場合には、ＣＲＦ０８＿ＢＣ組換え株（９８ＣＮ００６）から得た５つの高度可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５及びｇｐ４１の細胞質ドメイン中の領域）が、配列中の欠損領域中に充填するために使用される（しかし、Ｃｏｎ−Ｓに対する対応領域を参照）。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、コンセンサス又は先祖の遺伝子のコドンを最適化することができる（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３１５−３２４（２０００）， Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４９７−１５０３（１９９８））。
【００２２】
Ｙｅａｒ１９９９コンセンサスグループＭ ｅｎｖ遺伝子ＣＯＮ６を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴγインターフェロン脾臓スポット形成細胞の数及び２系統のマウス中で認められたエピトープの数によって、野生型Ｂ及びＣ ｅｎｖに比べて、ＣＯＮ６によるＴ細胞応答の誘導が優越していることを実証することが可能であった（表１及び２は、ＢＡＬＢ／ｃマウス中のデータを示す。）。ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質がＨＩＶ−１初代単離株に対する中和抗体を誘導する能力を、幾つかのサブタイプＢ Ｅｎｖの誘導能力と比較した。ＣＯＮ６によって誘導された中和抗体の標的には、幾つかの非Ｂ ＨＩＶ−１株を含まれる。
【表１】
【表２】
【００２３】
Ｙｅａｒ ２０００コンセンサスグループＭ ｅｎｖ遺伝子Ｃｏｎ−Ｓの場合、２系統のマウスでのＴ細胞γインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｃｏｎ−ＳエンベロープがＣＯＮ６エンベロープ遺伝子と同程度に免疫原性であることが示された（Ｃ５７ＢＬ／６に対するデータが、図２７に示されている。）。さらに、モルモットにおいて、抗体に対するタンパク質免疫原としてのＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ Ｅｎｖを比較すると（表３）、両ｇｐ１４０Ｅｎｖが、サブタイプＢ初代単離株を中和する抗体を誘導することが見出された。しかしながら、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０も、サブタイプＣ単離株ＴＶ−１及びＤＵ１２３並びに１つのサブタイプＡ ＨＩＶ−１初代単離株の強固な中和を誘導したが、ＣＯＮ６は誘導しなかった。
【表３−１】
【表３−２】
【００２４】
コンセンサス免疫原の次の反復として、及び実用的なＨＩＶ−１免疫原が複数サブタイプのコンセンサス遺伝子、サブタイプとコンセンサス遺伝子の混合物、又は中心化された遺伝子と野生型遺伝子の混合物であり得るという事実を認めて、Ｙｅａｒ ２００３ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ配列から得たサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、ＣＲＦ ＡＥ０１及びＧ並びにグループＭコンセンサス遺伝子から、一連の１１のサブタイプコンセンサス及び野生型遺伝子を設計した。野生型配列が早期に伝染したＨＩＶ−１株に由来することが知られているという理由で（これらの株は、ワクチンによって保護する必要性が最も高い。）、又はそのサブタイプのデータベース中で最も最近に登録された株であるという理由で、野生型配列を選択した。これらのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図２８−３８に示されている（図示されている全ての１４０ＣＦデザインについては、１４０ＣＦ遺伝子が、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ／Ａ）とＳａｌＩ部位を含有する５’配列「ＴＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣ」及び停止コドンとＢｇｌＩＩ部位を含有するＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＡの３’配列に隣接することができる。）。図３９−６２に示されているのは、２００３中心化（コンセンサス及び先祖）ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質及びコドン最適化された遺伝子配列である。
【００２５】
（非クレードＢ ＨＩＶ株を中和しない）ＣＯＮ６ ｇｐ１４０と（非クレードＢ ＨＩＶ株を中和する抗体を誘導する）Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０との主な差は、Ｃｏｎ−Ｓ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４及びＶ５領域である。クレードＢ株の場合、Ｖ３領域のペプチドは、中和抗体を誘導することができる（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１６４６−１６５３（１９９３））。このように、Ｔｈ−Ｖ１、Ｔｈ−Ｖ２、Ｔｈ−Ｖ４、Ｔｈ−Ｖ５ペプチドの構築は、反応性が広い所望の抗非クレードＢ中和抗体を生じると予想することができる。従って、表４に示されたＴｈ−Ｖペプチドは、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０に由来するペプチド免疫原として使用することが想定される。免疫原性を促進するために、他のＨＩＶ株中のｇａｇ Ｔｈ決定基（ＧＴＨ、表４）又は任意の相同ＧＴＨ配列を使用することが可能であり、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣ４領域（ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ）又は他のＨＩＶ株からの任意の相同的なＣ４配列も使用することができる（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１６４６−１６５３（１９９３））。Ｎ末端のヘルパー決定基を有するＣｏｎ−Ｓ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５ペプチドは、ＣｏｒｉｘａのＲＣ５２９などの適切なアジュバント中に調合したときに（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ． ８：４５３−４５８（２００２））、非クレードＢ単離株に対する広い交叉反応性の中和抗体を誘導するために、単一又は一緒に使用することができる。
【表４】
【００２６】
本発明は、本明細書に具体的に開示された配列の一部及び変異形を含むことが自明であろう。例えば、ｇｐ１２０／４１が切断され、又は切断されていない、ｇｐ１４０ＣＦ、ｇｐ１４０ＣＦＩ、ｇｐ１２０又はｇｐ１６０形態として、コドン最適化コンセンサスコード化配列の形態を構築することができる。例えば、コンセンサス及び先祖エンベロープ配列に関していえば、本発明は、Ｖ３を欠くエンベロープ配列を包含する。あるいは、Ｖ３配列は、好ましい配列、例えば、米国特許出願第１０／４３１，５９６号及び米国仮出願第６０／４７１，３２７号に記載されている配列から選択することができる。さらに、幅広い応答を与えるのに最適な免疫原は、グループＭコンセンサスｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ及びｅｎｖコード化配列の混合物を含むことができ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ及びｅｎｖ ＨＩＶ遺伝子に対するサブタイプコンセンサス又は先祖コード化配列の混合物からなることができる。ウイルス株における領域差を取り扱う場合、有効な混合物には、コンセンサス／先祖及び野生型コード化配列の混合物が含まれ得る。
【００２７】
本発明のコンセンサス又は先祖エンベロープは、ＨＩＶビリオンの表面上に通常一過性に露出されているに過ぎないか、又は十分に露出されていない中和エピトープの中間高次構造を露出するために「活性化」することが可能である。免疫原は、Ｂリンパ球への提示のために特異的なエピトープを利用可能とする、「凍結された」誘導型のコンセンサス又は先祖エンベロープとすることができる。このエピトープ提示の結果、ＨＩＶを広く中和する抗体が産生される。（ＷＯ ０２／０２４１４９及びその中に記載されている活性化／誘導されたエンベロープに注目されたい。）
融合中間体免疫原の概念は、ｇｐ４１ ＨＲ−２領域ペプチドＤＰ１７８が、コイル化されていない高次構造のｇｐ４１を捕捉することができるという観察（Ｆｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：２７６（１９９８））、ホルマリン固定されたＨＩＶ感染細胞は中和抗体を広く生成することができるという観察（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：３５７（１９９７））と合致する。最近、コイルドコイル領域に対するモノクローナル抗体は、コイルドコイルｇｐ４１構造のＨＲ１及びＨＲ２領域中のｇｐ４１の高次構造決定基に結合したが、ＨＩＶを中和しなかった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １０２１３（１９９８））。しかしながら、この後者の研究は、正しい抗体が生成されれば、抗体が結合するためにコイルドコイル領域を使用できることを証明した。
【００２８】
本発明の一側面の免疫原には、可溶性形態のコンセンサス若しくは先祖エンベロープ、又は、例えば細胞小胞中若しくは脂肪貫通二重層エンベロープを含有するリポソーム中に繋留されたコンセンサス若しくは先祖エンベロープが含まれる。より本来のエンベロープを作製するために、本来の三量体エンベロープを形成させるため、脂質二重層の中にｇｐ１４０又はｇｐ１６０コンセンサス又は先祖配列を設定することができる。あるいは、アルドリチオ１−２不活化されたＨＩＶ−１ビリオン中の誘発されたｇｐ１６０を免疫原として使用することができる。ｇｐ１６０は、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０（ｇｐ１４０は、膜貫通領域を有し、及びおそらく他のｇｐ４１領域が欠失したｇｐ１６０である。）の何れかとして、組換えタンパク質としても存在することができる。ｇｐ１６０又はｇｐ１４０に結合に結合されるのは、組換えＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４共同受容体タンパク質（又はそれらの細胞外ドメインペプチド又はタンパク質断片）若しくはｇｐ１２０上のＣＸＣＲ４若しくはＣＣＲ５結合部位に結合する抗体若しくは他のリガンド、及び／又は可溶性ＣＤ４、若しくはＣＤ４の結合作用を模倣する抗体若しくは他のリガンドであり得る。あるいは、ＣＤ４、ＣＣＲ５（又はＣＸＣＲ４）、又は可溶性ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４ ｇｐ１２０結合部位を反映するペプチドを含有する小胞又はリポソーム。あるいは、最適なＣＣＲ５ペプチドリガンドは、特定のチロシンが硫酸化されているＣＣＲ５のＮ末端から得られるペプチドであり得る（Ｂｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：５７６２（２００１））。誘発された免疫原は、膜に結合される必要はなくてもよいが、溶液中に存在し、溶液中で誘発され得る。あるいは、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、ＣＤ４ペプチドミメトープによって誘発されたエンベロープ（ｇｐ１４０又はｇｐ１６０）によって置き換えることができる（Ｖｉｔｒａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１３０１（１９９９））。細胞融合を誘導するｇｐ１６０の構造と関連する変化をもたらすために、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０を「誘発する」他のＨＩＶ共同受容体分子も使用することができる。可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０初代単離株ＨＩＶ ８９．６エンベロープを可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）に連結すると、ｇｐ４１の高次構造の変化が誘導された。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、ＣＣＲ５結合領域が露出された受容体（ＣＤ４）連結コンセンサス又は先祖エンベロープの特徴を有する免疫原に関するが、ＣＤ４結合部位が遮断されたＣＤ４連結タンパク質とは異なり、この免疫原はＣＤ４結合部位が露出（開放）されている。さらに、この免疫原は、宿主ＣＤ４を欠いているので、宿主に投与したときに、害を与える可能性がある抗ＣＤ４抗体の産生が避けられる。
【００３０】
本免疫原は、Ａ３２モノクローナル抗体（ｍａｂ）によって認識されるｇｐ１２０上の部位に結合するリガンドが連結されたコンセンサス又は先祖エンベロープを含むことができる(Wyatt et al, J. Virol. 69:5723(1995),Boots et al, AIDS Res. Hum. Retro. 13:1549(1997), Moore et al, J. Virol. 68:8350(1994), Sullivan et al, J. Virol. 72:4694(1998), Fouts et al, J. Virol. 71:2779(1997), Ye et al, J. Virol. 74:11955(2000))。一つのＡ３２ ｍａｂは、ＣＤ４を模倣し、ｇｐ１２０に結合したときに、ＣＣＲ５結合部位を上方制御する（露出する）ことが示されている（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３（１９９５））。ｇｐ１２０にこのようなリガンドを連結することによっても、ＣＤ４結合部位が上方制御され、ｇｐ１２０へのＣＤ４の結合を遮断しない。有利には、このようなリガンドも、切断されたｇｐ１２０、切断されていないｇｐ１４０及び切断されたｇｐ４１に結合されたｇｐ４１のＨＲ−２結合部位も上方制御し、これにより、これらのタンパク質上にあるＨＲ−２結合部位（これらの各々が、抗ＨＩＶ中和抗体に対する潜在的な標的である。）がさらに露出される。
【００３１】
本実施形態の特定の側面において、前記免疫原は、無処置のＡ３２ ｍａｂ、Ａ３２ ｍａｂのＦａｂ２断片又はＡ３２ ｍａｂのＦａｂ断片が連結された可溶性ＨＩＶコンセンサス又は先祖ｇｐ１２０エンベロープを含み、その結果、コンセンサス又は先祖エンベロープ上のＣＤ４結合部位、ＣＣＲ５結合部位及びＨＲ−２結合部位は露出され／上方制御されることになる。前記免疫原は、Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）が結合したコンセンサス若しくは先祖エンベロープを含むことができ、Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）が結合し、３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの異種二価性架橋剤などの架橋剤で架橋されたコンセンサス若しくは先祖エンベロープを含むことができる。前記免疫原免疫原は、切断されていないコンセンサス若しくは先祖ｇｐ１４０又は切断されていないｇｐ１４０、切断されたｇｐ４１及び切断されたｇｐ１２０の混合物を含むこともできる。コンセンサス若しくは先祖ｇｐ１４０及び／又はｇｐ１２０に結合され、又はｇｐ４１に非共有結合されたｇｐ１２０に結合されたＡ３２ ｍａｂ（又はその断片）は、ｇｐ４１、ｇｐ１２０及び切断されていないｇｐ１４０中のＨＲ−２結合部位の上方制御（露出）をもたらす。Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）のｇｐ１２０又はｇｐ１４０への結合も、ＣＤ４結合部位及びＣＣＲ５結合部位の上方制御ももたらす。ｇｐ１２０を含有する複合体と同様、切断されていないｇｐ１４０とＡ３２ｍａｂ（又はその断片）を含む複合体は、３％ホルムアルデヒド又はＤＴＳＳＰなどの架橋剤で架橋されていない、又は架橋されている免疫原として使用することができる。一実施形態において、本発明は、Ｆａｂ断片又は完全なＡ３２ ｍａｂに結合及び架橋され、必要に応じて、ＨＲ−２結合タンパク質に結合及び架橋された可溶性非切断コンセンサス又は先祖ｇｐ１４０を含む免疫原に関する。
【００３２】
ｇｐ１２０上のＡ３２ ｍａｂ結合部位に結合するリガンドによって誘発されたコンセンサス又は先祖エンベロープタンパク質は、Ａ３２ ｍａｂ結合部位（ｍａｂ １７ｂによって認識されるＣＣＲ５結合部位など）と異なる部位に結合するリガンドによって誘発された、第二のエンベロープを含む少なくとも一つの第二の免疫原と組み合わせて投与することができる。１７ｂ ｍａｂ（ＡＩＤＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨから入手できる、Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３：６４８（１９９８））は、ｇｐ１２０へのｓＣＤ４結合を増強する。この第二の免疫原（単独で、又は上記のもの以外の誘発された免疫原と組み合わせて使用することもできる。）は、例えば、完全な１７ｂ ｍａｂ、１７ｍａｂのＦａｂ２断片又は１７ｂ ｍａｂのＦａｂ断片の何れかと連結された可溶性ＨＩＶコンセンサス又は先祖エンベロープを含むことができる。露出されているＣＤ４結合部位をもたらす他の抗体（又はその断片）を含む他のＣＣＲ５リガンドを、１７ｂ ｍａｂに代えて使用できることが自明であろう。このさらなる免疫原は、１７ｂ ｍａｂ若しくはその断片（又は上記他のＣＣＲ５リガンド）が結合したｇｐ１２０を含むことができ、又は、１７ｂ ｍａｂ若しくはその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）が結合し、３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの異種二価性架橋剤のような物質で架橋されたｇｐ１２０を含むことができる。あるいは、このさらなる免疫原は、単独で、又は切断されたｇｐ４１及び切断されたｇｐ１２０の混合物として存在する非切断ｇｐ１４０を含むことができる。このような混合物中のｇｐ１４０及び／又はｇｐ１２０に結合されたＭａｂ １７ｂ又はその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）は、ＣＤ４結合領域を露出させる。１７ｂ ｍａｂ 又はその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）ｇｐ１４０複合体は、架橋されていない、又は３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰのような物質で架橋されて存在することができる。
【００３３】
Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ及びＤＰ１７８などの可溶性ＨＲ−２ペプチドは、コンセンサスｇｐ１２０とｇｐ４１上のエピトープ並びに切断されていないコンセンサスｇｐ１４０分子を安定化させるために、上記複合体に追加し、該複合体と架橋して、又は架橋せずに投与することができる。
【００３４】
上記１７ｂ ｍａｂのほかに、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位に結合するｍａｂ ＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４８２（１９９４）， Ｍｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：６８６９（１９９７））、ｇｐ１２０上の高次構造決定基に結合するｍａｂ ２Ｇ１２（Ｔｒｋｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：１１００ （１９９６））及びｇｐ４１の膜近傍領域に結合するｍａｂ ２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４０３１（１９９４））など、多くのＨＩＶ初代単離株を中和する一連のモノクローナル抗体（ｍａｂ）が作製されている。
【００３５】
上記のように、本発明に従って、融合性エピトープを「凍結する」ために様々なアプローチを使用することができる。例えば、「凍結」は、コイルドコイル領域の一部に相当し、ＣＤ４によって誘発されたコンセンサス又は先祖エンベロープを添加したときに、融合の予防をもたらすＤＰ−１７８又はＴ−６４９Ｑ２６Ｌペプチドを添加することによって実施することができる（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２ ：９８６−９９３（１９９８））。ＨＲ−２ペプチドが結合したコンセンサス又は先祖ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１又はｇｐ１６０は免疫原として使用することができ、又はＤＴＳＳＰ若しくはＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）などの試薬、ホルムアルデヒド若しくは類似の効果を有する他の架橋剤によって架橋することができる。
【００３６】
「凍結」は、ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を安定化するために、又は「誘発された」ｇｐ４１分子を安定化するために、又はその両方のために、０．１％から３％のホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒド（何れも、タンパク質架橋剤である。）を複合体に添加することによって実施することもできる（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：３５７−３６２（１９９９））。
【００３７】
さらに、コンセンサス又は先祖ｇｐ４１又はｇｐ１２０融合中間体の「凍結」は、ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を架橋し、安定化するために、又は「誘発された」ｇｐ４１分子を安定化するために、又はその両方のために、ＤＳＰ（ジチオビス［スクシミジルプロピオネート］）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬＬ．， Ｎｏ．２２５８５ＺＺ）又はアミノ基と反応する２つのＮＨＳエステルを使用する水溶性ＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）などの異種二機能性物質を添加することによって実施することができる。
【００３８】
免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのＴ細胞免疫応答の解析は、エンベロープタンパク質が通常Ｔ細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質は、強力なＴ細胞免疫応答を誘導する。従って、本発明には、液性及び細胞性の両免疫応答を誘導することができるコンセンサス又は先祖免疫原のレパートリーが含まれる。コンセンサス又は先祖配列のサブユニットは、Ｔ又はＢ細胞免疫原として使用することができる。（実施例６及び７、並びに同実施例で参照されている図、並びに図６３−１２７を参照）。
【００３９】
本発明の免疫原は、本分野で周知の技術を用いて、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント（ａｌｕｍなど）とともに調合することができる。本発明の免疫原の適切な投与経路には、全身経路（例えば、筋肉内又は皮内）が含まれる。免疫応答が粘膜の免疫系（例えば、鼻内）で求められるときには、別の経路を使用することができる。
【００４０】
本発明の免疫原は、当業者に周知である方法を用いて、化学的に合成し、精製することができる。免疫原は、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することもできる。本発明の免疫原をコードする核酸は、例えば、コード配列が裸のＤＮＡとして投与されるＤＮＡワクチンの成分として使用することが可能であり、又は、例えば、前記免疫原をコードするミニ遺伝子がウイルスベクター中に存在することができる。コード化配列は、例えば、複製若しくは非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化された結核菌ベクター、ウシ型弱毒結核ワクチン（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニア若しくは修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオ及びその他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ種細菌ベクター、シゲラ種細菌ベクター、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター又はタバコモザイクウイルスベクター中に存在することができる。コード化配列は、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの活性なプロモーターとともにＤＮＡプラスミドとして発現することもできる。本発明の配列を発現するために、他の生ベクターも使用することができる。本発明の免疫原の発現は、好ましくは、ヒト細胞中での発現を最適化するコドンとプロモーターを使用して、免疫原をコードする核酸を患者自身の細胞中に導入することによって、患者自身の細胞中で誘導することができる。ＤＮＡワクチンを製造及び使用する方法の例は、米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号及び第５，７０３，０５５号に開示されている。
【００４１】
本発明の組成物は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原、又はこれをコードする核酸配列を、薬学的に許容される送達系の中に含む。本組成物は、免疫不全ウイルス感染の予防及び／又は治療のために使用することができる。本発明の組成物は、アジュバント、乳化剤、薬学的に許容される担体又はワクチン組成物中に一般的に与えられる他の成分を用いて調合することができる。最適な製剤は、当業者によって容易に設計することができ、即時放出及び／又は持続的放出のための製剤並びに全身性免疫の誘導及び／又は局所的な粘膜免疫の誘導のための製剤（例えば、製剤は、鼻内投与のために設計することができる。）を含むことができる。本組成物は、皮下、鼻内、経口、筋肉内又は他の非経口若しくは経腸経路を含む任意の便利な経路によって投与することができる。前記免疫原は、単回投薬又は複数回投薬として投与することができる。最適な免疫化スケジュールは、当業者によって容易に決定することが可能であり、患者、組成物及び求められる効果に応じて変動することができる。
【００４２】
本発明は、本発明の免疫原及び／又は該免疫原をコードする核酸及び／又は上記のベクター中でミニ遺伝子として発現された免疫原の両方を直接使用することを想定する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子は、初回及び／又は追加免疫として使用することができる。
【００４３】
本発明は、本明細書に開示されたあらゆる全てのアミノ酸配列、及び、適当な場合には、そのＣＦ及びＣＦＩ形態、並びにこれをコードする核酸配列（及びこのようなコード配列と相補的な核酸）を含む。
【００４４】
本発明の一部の側面は、以下に記載されている非限定的な実施例で、さらに詳細に記載することができる。
【実施例１】
【００４５】
人工ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスエンベロープ
実験の詳細
組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）におけるＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０タンパク質の発現。分泌型のＨＩＶ−１ ＣＯＮ６エンベロープタンパク質を発現及び精製するために、それぞれ、ｇｐ１２０切断部位（ＲＥＫＲ）の後、及び膜貫通ドメイン（ＹＩＫＩＦＩＭＩＶＧＧＬＩＧＬＲＩＶＦＡＶＬＳＩＶＮ）の前に停止コドンを導入することによって、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦプラスミドを構築した。１４０ＣＦタンパク質中では、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位及びｇｐ４１の融合ドメインを欠失した。ＣＯＮ６ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ ＤＮＡ構築物の両者を、ｐＳＣ６５ベクター（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから購入）中のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位にクローニングした。このベクターは、ｐ７．５プロモーターによって調節されるｌａｃＺ遺伝子を含有する。ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を発現するために、逆並列Ｐ Ｅ／Ｌプロモーター（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ Ｐ Ｅ／Ｌプロモーター）を使用した。ＢＳＣ−１細胞を、６ウェルプレート中の各ウェル中に、２×１０５個で播種し、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）で感染させ、感染の２時間後に、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐＳＣ６５由来のプラスミドをＶＶ感染細胞中に形質移入し、記載どおりに（Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｅａｒｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ） ｐｐ． １６．１５．１−１６．１９．９（１９９８））、組換え（ｒ）ＶＶを選択した。ＰＣＲ及び配列決定分析によって、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を含有する組換えＶＶを確認した。ＣＯＮ６エンベロープタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットアッセイによって確認した。アガロース ガランサス・ニヴァリスレクチンビーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で、組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦを精製し、使用するまで、−７０℃に保存した。組換えＶＶ発現ＪＲＦＬ（ｖＣＢ−２８）又は９６ＺＭ６５１（ｖＴ２４１Ｒ）ｇｐ１６０は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。
【００４６】
モノクローナル抗体及びｇｐ１２０野生型エンベロープ
ｇｐ１２０（Ａ３２）、ｇｐ１２０ Ｖ３ループ（Ｆ３９Ｆ）及びＣＣＲ５結合部位（１７ｂ）上の高次構造決定基に対するヒトｍａｂは、Ｊａｍｅ Ｒｏｂｉｎｓｏｎから頂いた(Tulane Medical School, New Orleans, LA)(Wyatt et al, Nature 393;705-711(1998), Wyatt et al, J. Virol. 69:5723-5733(1995))。Ｍａｂ ２Ｆ５、４４７、ｂｌ２、２Ｇ１２及び可溶性ＣＤ４は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda, MD)(Gorny et al, J. Immunol. 159:5114-5122(1997), Nyambi et al, J. Virol. 70:6235-6243(1996), Purtscher et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1651-1658(1994), Trkola et al, J. Virol 70:1100-1108(1996))から入手した。Ｔ８は、ｇｐ１２０Ｃ１領域に位置するマウスのｍａｐである（Ｐ．Ｅａｒｌ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから頂いた。）。ＢａＬ（サブタイプＢ）、９６ＺＭ６５１（サブタイプＣ）及び９３ＴＨ９７５（サブタイプＥ）ｇｐ１２０は、ＱＢＩ， Ｉｎｃ．及びＮＩＨのＡＩＤＳ部門によって提供された。９２Ｕ０３７（サブタイプＡ）及び９３ＢＲ０２９（サブタイプＦ）ｇｐｌ４０（分泌及び非切断）を発現するＣＨＯ細胞株は、イギリスのＮＩＣＢＳから入手した。
【００４７】
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ）測定及びＥＬＩＳＡ
ＳＰＲバイオセンサー測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）装置上で行い、データ解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ， Ｕｐｓａａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。タンパク質固定化に対する標準的なアミンカップリングプロトコールを用いて、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の抗ｇｐ１２０ｍａｂ（Ｔ８、Ａ３２、１７ｂ、２Ｇ１２）又はｓＣＤ４を、ＣＭ５センサーチップに直接固定した。ＦＰＬＣ精製されたＣＯＮ６ ｇｐ１２０単量体又はｇｐ１４０ＣＦオリゴマー組換えタンパク質を、それぞれ、１００及び３００μｇ／ｍＬの濃度で、ＣＭ５センサーチップ上に流した。非特異的応答又は一括応答を差し引くために、（アミンカップリングに対して活性化及び脱活性化された）盲検の直列参照表面又は非結合ｍａｂ対照を使用した。それぞれ、陽性対照及び陰性対照として、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質を注入する前に各ｍａｂ表面の活性を確保するために、可溶性８９．６ ｇｐ１２０及び無関係のＩｇＧを使用した。ＣＯＮ６エンベロープタンパク質の結合は、ＰＢＳ（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）、ｐＨ７．４を、１０から３０μＬ／分で連続的に流して、２５℃でリアルタイムにモニターした。結合したタンパク質を除去し、５ないし１０μＬの再生溶液（１０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．９）を単回又は二回、短時間与えることによって、各結合サイクルの後に、センサー表面を再生した。記載のとおり（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １１：２１１−２２１（１９９５））、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質に対する様々なのｍａｂの反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡを行った。ヒトｍａｂのｒｇｐ１２０又はｇｐ１４０タンパク質への結合のアッセイの場合、終点力価は、ｍａｂが結合したＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ Ｅｎｖタンパク質がバックグラウンド対照（非結合ヒトｍａｂ）に比べて３倍以上である、ｍａｂの最高力価（２０μｇ／ｍＬで開始）として定義した。
【００４８】
感染性及び共同受容体使用アッセイ
ＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖ及びＣＯＮ６又は対照ｅｎｖプラスミドをヒト２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ろ過し、ｐ２４濃度を定量した（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）。ＪＣ５３−Ｂｌ細胞を感染させて、感染性を決定するために、各擬ビリオンに対して等量のｐ２４（５ｎｇ）を使用した（Ｄｅｒｄｅｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：８３５８−８３６７（２０００）， Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：１８９６−１９０５（２００２））。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４受容体を発現し、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の転写調節下で安定的に組み込まれたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を含有する。これらの細胞は、β−ｇａｌ発現を染色し、１μｇの擬ビリオンのｐ２４当たりの青い細胞の数（感染単位）（ＩＵ／μｇ ｐ２４）を計数することによって、擬ビリオン株の感染性力価を定量するために使用することができる（Ｄｅｒｄｅｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：８３５８−８３６７（２０００）， Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：１８９６−１９０５（２００２））。ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子の共同受容体の使用を決定するために、ＪＣ５３ＢＬ細胞を、１．２ＡＭ ＡＭＤ３１００及び４μＭ ＴＡＫ−７９９により、１時間３７℃で処理した後、等量の各Ｅｎｖ偽型ウイルスのｐ２４（５ｎｇ）に感染させた。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来の感染単位のパーセントとして表した。対照グループからの感染性（遮断剤なし）を任意に１００％として設定した。
【００４９】
免疫化。全ての動物は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された動物使用プロトコールを使用し、ＡＡＬＡＣガイドラインに基づいて、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ中で飼育した。メーカー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）によって提供されたプロトコールに基づき、ＲＩＢＩ−ＣＷＳアジュバントを加えた安定なエマルジョン中に、組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ糖タンパク質を調合した。抗エンベロープ抗体を誘導するために、非近交系の４匹の各モルモット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）に、精製された１００μｇのＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦのうち何れかを３週ごとに皮下投与した（計５回の免疫化）。血清試料を熱で不活化し（５６℃、１時間）、使用するまで−２０℃で保存した。
【００５０】
抗エンベロープＴ細胞応答を誘導するために、６から８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， ＮＣＩ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）の大腿四頭筋に、３週の間隔を置いて、５０μｇのプラスミドＤＮＡを３回筋肉内投与して免疫した。最後のＤＮＡ免疫から３週後、Ｅｎｖタンパク質を発現する１０７ＰＦＵのｒＶＶでマウスに強化免疫を行った。強化免疫から２週後、全てのマウスを安楽死させ、脾細胞を単離するために脾臓を取り出した。
【００５１】
中和アッセイ。中和アッセイは、「Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６ ：２０１９−２０３５ （２０００）」に記載されているＭＴ−２アッセイ、ＨＩＶ−１初代単離株のパネルを使用した、５．２５．ＧＰＦ．Ｌｕｃ．Ｍ７細胞中でのルシフェーラーゼを使用する多重複製サイクルＨＩＶ−１感染アッセイ（Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：２０１９−２０３５（２０００）， Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：２２３３−２２４４（２００２）、又は不活化ＨＩＶ−１ビリオンを用いた合胞体（ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ）阻害アッセイ（Ｒｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７９９２−８００１（１９９８））のうち何れかを使用して行った。ルシフェラーゼを使用するアッセイでは、中和抗体は、Ｎａｔｈａｎｉｅｌ Ｒ． Ｌａｎｄａｕ， Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡから頂いた５．２５．ＥＧＦＰ．Ｌｕｃ．Ｍ７細胞（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：１７２９１−１７２９９ （２００２））中でのルシフェラーゼ活性の減少の関数として測定した。組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）が５００の無細胞ウイルスを、９６ウェルの平底培養プレート中、三つ組みで、１５０μＬ中の表記の血清希釈度でインキュベートした（１時間、３７℃）。ＤＥＡＥデキストラン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する培地中に、５×１０５／ｍＬ培地の密度で５．２５．ＥＧＦＰ．Ｌｕｃ．Ｍ７．細胞を懸濁した。細胞（１００μＬ）を添加し、対照ウェル（検査血清試料なし）中の１０％の細胞が、蛍光顕微鏡によって、ＧＦＰ発現が陽性になるまで添加した。この時点で、培地の半分容量を除去することによって、細胞を２倍に濃縮した。Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）上でルシフェラーゼ活性を測定するために、５０μＬの細胞懸濁物を９６ウェルの白色固体プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）に移した。ＭＴ−２及びルシフェラーゼアッセイでの中和力価とは、５０％以上のウイルス感染が阻害される力価であった。力価が１：２０を超える値のみ（すなわち、＞１：３０）を有意な陽性と考えた。合胞体阻害「ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ」アッセイでは、ＳｕｐＴ１細胞に添加されたＨＩＶ−１サブタイプＢ株ＡＤＡ及びＡＤ８（Ｌａｒｒｙ Ａｒｔｈｕｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌｉｆｓｏｎ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤから頂いた）から得たＨＩＶ−１アルドリチオールー２（ＡＴ−２）不活化ビリオンを使用し、合胞体阻害力価は、予め出血された血清と比べて、９０％以上の合胞体が阻害される力価として測定した。
【００５２】
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
７０μｍのＮｙｌｏｎ細胞ろ過器（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を通して細分し、絞り取ることによって、免疫された各マウスから得た脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０の重複するＥｎｖペプチド（１５９ペプチド、１１重複する１５マー）は、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｓｃｅｎｃｅ， Ｉｎｃ（Ｒｏｙａｌ Ｏａｋ， ＭＩ）から購入した。ＭＮ ｇｐ１４０の重複するＥｎｖペプチド（サブタイプＢ；１７０ペプチド、１１重複する１５マー）及びＣｈｎｌ９ ｇｐ１４０（サブタイプＣ；６９ペプチド、１０重複する２０マー）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から取得した。ＣＯＮ６、サブタイプＢ及びサブタイプＣ Ｅｎｖタンパク質から得られた重複するＥＮＶペプチドのプールにより、各マウスから得た脾細胞（５マウス／グループ）をインビトロで刺激した。９６ウェルＰＶＤＦプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を、抗ＩＦＮγ ｍａｂ（５μｇ／ｍｌ， ＡＮ１８； Ｍａｂｔｅｃｈ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）でコートした。完全なＨｅｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ培地を用いて、３７℃で２時間、プレートをブロッキングし、５０μＬの前記プールされた重複するエンベロープペプチド（１３のＣＯＮ６およびＭＮプール、各プール中に１３から１４のペプチド；９のＣｈｎ１９プール、各プール中に７から８のペプチド）を、それぞれ５μｇ／ｍＬの最終濃度でプレートに添加した。次いで、１．０×１０７／ｍＬの濃度の脾細胞５０μを二つ組みでウェルに添加し、５％ＣＯ２を与え、１６時間３７℃でインキュベートした。１００μＬの１：１０００希釈のストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）とともにプレートをインキュベートし、１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｐｌｕｓ）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｍｏｓｓ， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＭＤ）を使用して、紫色のスポットを発生させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ計数システム（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を使用して、スポット形成細胞（ＳＦＣ）を測定した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、１０６個の脾細胞当たりのＳＦＣとして表される。
【００５３】
結果
ＣＯＮ６エンベロープ遺伝子の設計、構築及び発現。人工グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ中の配列から各ＨＩＶ−１サブタイプに対するｅｎｖ遺伝子のコンセンサス配列を作製し、次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を作製することによって構築した（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６ （２０００））。ＣＲＦ０８＿ＢＣ組換え株（９８ＣＮ００６）から得た５つの高度可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５及びｇｐ４１の細胞質ドメイン中の領域）をＣＯＮ６配列中の欠損領域中に充填するために使用した。ＣＯＮ６ Ｖ３領域は、グループＭコンセンサスである（図１Ａ）。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子のコドンを最適化した（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３１５−３２４（２０００）， Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４９７−１５０３（１９９８））（図１Ｄ参照）。コドンが最適化されたＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を構築し、ｐｃＤＮＡ３．１ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １９：８１７−８２３（２００３））。２９３Ｔ細胞中への形質移入後、ウェスタンブロットアッセイを用いて、高レベルのタンパク質発現を確認した。性質決定のために組換えＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質を取得し、免疫原として使用し、分泌されたｇｐ１２０及び非切断ｇｐ１４０ＣＦを発現するためにｒＶＶを作製した（図１Ｂ）。還元条件下のクマシーブルーゲルによって測定したところ、各タンパク質に対する純度は９０％以上であった（図１Ｃ）。
【００５４】
ＣＤ４結合ドメイン及びその他の野生型ＨＩＶ−１エピトープは、ＣＯＮ６タンパク質上に保存される。ＣＯＮ６タンパク質がＣＤ４に結合して、他の野生型ＨＩＶ−１エピトープを発現するかどうかを決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦが可溶性ＣＤ４を結合する能力、特性が十分に決定された幾つかの抗ｇｐ１２０ｍａｂを結合する能力、並びにＣＤ４によって誘導される高次構造を変化させる能力をアッセイした。まず、ｓＣＤ４又はｍａｂのＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質への結合活性をモニタリングするために、ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップをコートした。単量体のＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びオリゴマーのｇｐ１４０ＣＦは何れも、ｓＣＤ４並びに抗ｇｐ１２０ｍａｂ Ｔ８、２Ｇ１２及びＡ３２を効率的に結合するが、ｇｐ１２０のＣＣＲ５結合部位中のＣＤ４誘導性エピトープを認識するｍａｂ１７ｂを恒常的に結合しないことが見出された（図２Ａ及び図２Ｂ）。ｓＣＤ４及びＡ３２は何れも、野生型ｇｐ１２０に結合した後、１７ｂ結合エピトープを露出することができる（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３；７０５−７１１（１９９８）， Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３−５７３３ （１９９５））。ｓＣＤ４又はＡ３２の何れかによって、１７ｂエピトープをＣＯＮ６ Ｅｎｖｓ上に誘導できるかどうかを決定するために、Ａ３２及びＴ８をセンサーチップ上にコートし、次いでＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦを捕捉し、ｍａｂ １７ｂ結合活性をモニターした。ｓＣＤ４又はｍａｂ Ａ３２を結合した後、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦは何れも高次構造の変化を生じ、ｍａｂ １７ｂを結合するように誘発された（図２Ｃ及び２Ｄ）。これに対して、ｍａｂ Ｔ８を結合した後には、１７ｂエピトープは露出されなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。次に、ｇｐ１２０ Ｖ３ ロープ（４４７、Ｆ３９Ｆ）、ＣＤ４結合部位（ｂ１２）及びｇｐ４１中和決定基（２Ｆ５）に対する一群のヒトｍａｂの、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦに対する反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡを使用した（図２Ｅ）。ＣＯＮ６ ｒｇｐ１２０及びｒｇｐ１４０ＣＦタンパク質は、中和Ｖ３ ｍａｂである４４７及びＦ３９Ｆ、並びに強力な中和ＣＤ４結合部位ｍａｂ ｂ１２に良好に結合した。Ｃ末端のｇｐ４１エピトープに結合することによってＨＩＶ−１初代単離株を中和するＭａｂ ２Ｆ５も、ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦに良好に結合した（図２Ｅ）。
【００５５】
ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子は、生物学的に機能的であり、ＣＣＲ５をその共同受容体として使用する。ＣＯＮ６エンベロープ遺伝子が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、ｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ＪＣ５３ＢＬ細胞を感染させた。ＣＯＮ６ Ｅｎｖ偽型ウイルスに感染したＪＣ５３−ＢＬ細胞中に青い細胞が検出され、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された（図３Ａ）。しかしながら、感染力価は、ＹＵ２又はＮＬ４−３野生型ＨＩＶ−１エンベロープを有する擬ビリオンの感染力価より１から２桁小さかった。
【００５６】
次に、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子に対して共同受容体の使用を決定した。ＣＸＣＲ４遮断剤ＡＭＤ３１００で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、ＹＵ２又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害されなかった（図３Ｂ）。これに対して、ＣＣＲ５遮断剤ＴＡＫ−７７９で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、ＹＵ２又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、ＣＯＮ６エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、ＣＣＲ５共同受容体を使用していることを示している。
【００５７】
ＣＯＮ６ ｇｐ１２０の、異なるサブタイプの血清との反応。複数のサブタイプの直鎖エピトープがＣＯＮ６ ｇｐ１２０上に保存されているかどうかを決定するために、組換えＥｎｖタンパク質パネル（ｇｐ１２０及びｇｐ１４０）を作製した。等量の各Ｅｎｖタンパク質（１００ｎｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に与え、ニトロセルロースに転写し、ウェスタンブロットアッセイにおいて、サブタイプＡからＧの患者の血清及び抗ＣＯＮ６ ｇｐ１２０モルモット血清（１：１０００希釈）と反応させた。各ＨＩＶ−１サブタイプについて、４から６人の患者血清を検査した。各サブタイプに対して代表的な一つの血清が図４に示されている。
【００５８】
検査した全てのサブタイプ血清が、パネル中のＥｎｖの中で可変的な反応性を示したが、全てのグループＭサブタイプ患者血清はＣＯＮ６ ｇｖ１２０ Ｅｎｖタンパク質と等しく良好に反応し、患者血清によって認識される野生型ＨＩＶ−１ ＥｎｖエピトープはＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質上に良好に保存されることが実証された。次に、モルモット中に生じたＣＯＮ６ ｇｐ１２０抗血清が異なるサブタイプのＥｎｖタンパク質に対して反応できるかどうかについて、検査を行った。サブタイプＡ Ｅｎｖタンパク質を除き、ＣＯＮ６血清はそれ自身及び他のサブタイプＥｎｖタンパク質に等しく良好に反応することが見出された（図４）。
【００５９】
ＣＯＮ６、サブタイプＢ及びサブタイプＣエンベロープ重複ペプチドに対するＴ細胞応答の誘導
ＣＯＮ６ Ｅｎｖ免疫原によって誘導されるＴ細胞免疫応答を、サブタイプ特異的な免疫原によって誘導されたＴ細胞免疫応答と比較するために、さらに２つのマウスの群を、サブタイプＢ又はサブタイプＣ ＤＮＡ及び対応するｒＶＶ発現サブタイプＢ又はＣエンベロープタンパク質で免疫した。サブタイプＢ（ＪＲＦＬ）又はサブタイプＣ（９６ＺＭ６５１） Ｅｎｖ免疫原で免疫したマウスは、主として、サブタイプ特異的なＴ細胞免疫反応を有した（図５）。サブタイプＢ（ＭＮ）ペプチドプールで刺激した後には、ＪＲＦＬ（サブタイプＢ）で免疫されたマウスから得られたＩＦＮ−γＳＦＣ免疫原が検出されたが、サブタイプＣ（Ｃｈｎｌ９）又はＣＯＮ６ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。サブタイプＣ（Ｃｈｎｌ９）及びＣＯＮ６ペプチドプールで刺激した後には、９６ＺＭ６５１（サブタイプＣ）免疫原で免疫されたマウスから得られたＩＦＮ−γ ＳＦＣが検出されたが、サブタイプＢ（ＭＮ）ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。これに対して、ＣＯＮ６ペプチドプール並びにサブタイプＢ又はＣペプチドのプールで刺激すると、ＣＯＮ６ Ｅｎｖ免疫原で免疫されたマウスからＩＦＮ−γ ＳＦＣが同定された(図５)。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０によって誘導されたＴ細胞応答は、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０によって誘導されたＴ細胞応答より強固であるように思われた。これらのデータを総合すると、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ免疫原は、野生型サブタイプＢ及びＣエンベロープのＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞応答を誘導することができることが実証された。
【００６０】
組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦエンベロープによる、ＨＩＶ−１サブタイプＢ及びＣ初代単離株を中和する抗体の誘導
ＣＯＮ６エンベロープ免疫原が、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導することができるかどうかを決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦタンパク質でモルモットを免疫した。中和アッセイのために、４又は５回の免疫化の後に集めた血清を使用し、対応する出血前の血清と比較した。分胞体阻害アッセイ（表５Ａ）で、２つのＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１単離株（ＡＤＡ及びＡＤ８）を検査した。２つのサブタイプＢ ＳＨＩＶ単離株、８つのサブタイプ初代単離株、４つのサブタイプＣ並びに１つの各サブタイプＡ、Ｄ及びＥ初代単離株を、ＭＴ−２又はルシフェラーゼを使用するアッセイの何れかで検査した（表５Ｂ）。分胞体阻害アッセイでは、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質によって誘導された抗体は、ＡＴ−２不活化ＡＤＡ及びＡＤ８によって誘導された分胞体を強力に阻害することが見出された（表５Ａ）。ＭＴ−２アッセイでは、２つのＳＨＩＶ単離株のうちの１つ（ＳＨＩＶ ＳＦ１６２Ｐ３）が２つのｇｐ１２０及び１つのｇｐ１４０ＣＦ血清によって弱く中和されることが見出された（表５Ｂ）。ルシフェラーゼを利用するアッセイでは、８つのサブタイプＢ初代単離株のうち４つ（ＢＸ０８、ＳＦ１６２、ＳＳ１１９６及びＢＡＬ）が全てのｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清によって強力に中和されることが見出され、８つのサブタイプＢ単離株のうち２つ（６１０１、０６９２）が多くのｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清によって弱く中和されることが見出された。ＨＩＶ−１ ＰＡＶＯに対しては、中和は検出されなかった（表５Ｂ）。次に、ＣＯＮ６抗ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清を４つのサブタイプＣ ＨＩＶ−１単離株に対して検査すると、４つの単離株のうち３つ（ＤＵ１７９、ＤＵ３６８及びＳ０８０）で、主として抗ＣＯＮ６ ｇｐ１２０血清によって弱い中和が見られた。１つのｇｐ１４０ＣＦ血清ｎｏ．６３５は、ＤＵ１７９を強く中和し、Ｓ０８０を弱く中和した（表５Ｂ）。最後に、抗ＣＯＮ６ Ｅｎｖ血清は、サブタイプＤ単離株（９３ＺＲ００１）を強く中和し、サブタイプＥ（ＣＭ２４４）単離株を弱く中和したが、サブタイプＡ（９２Ｗ０２０）単離株は中和しなかった。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
【００６１】
結論
ウイルスの侵入を媒介するためにＣＣＲ５共同受容体を使用することができる機能的Ｅｎｖタンパク質をコードする人工ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（コード配列）（ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ）の作製について説明してきた。重要なことは、これらのグループＭコンセンサスエンベロープ遺伝子が、サブタイプＢ及びＣ ＨＩＶ−１初代単離株のエピトープを認識するＴ及びＢ細胞応答を誘導できるということである。さらに、Ｃｏｎ−Ｓは、サブタイプＣ及びＡ ＨＩＶ−１株を強力に中和する抗体を誘導する（表３参照）。
【００６２】
ＨＩＶ−１に対する保護の相関は、確定的には明らかとなっていない。動物モデル及びＨＩＶ−１感染患者での研究から得られた多くのデータは、ＨＩＶ−１ワクチン開発の最終目標は、広い反応性を有するＣＤ４＋及びＣＤ８＋抗ＨＩＶ−１ Ｔ細胞応答（Ｌｅｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：７３−９９（２００２））及び複数のサブタイプのＨＩＶ−１初代単離株を中和する高レベルの抗体（Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：４００９−４０１８（１９９９）， Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：２７０−２１０（２０００））を誘導べきことを示唆する。
【００６３】
ＨＩＶ−１の高レベルな遺伝的可変性のため、臨床的に有用なほど十分に幅広い免疫応答を誘導できる免疫原の設計は困難であった。エピトープをベースとするＴ細胞及びＢ細胞応答に対するワクチン（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９１８−１９２１（２００２）， Ｓｂａｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ， Ｄｉｓｏｒｄ． １：３０３−３１３（２００１）， Ｈａｙｎｅｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８：９３３−９３７（１９９６））、融合中間体を反映する拘束されたエンベロープ（Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１１８４２−２２８４７（２００２））並びに抗ＨＩＶ−１中和抗体を誘導するための保存された高次構造の露出は、ＨＩＶ−１の可変性を克服すると提案されてきた（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４８２１−４８２８（１９９４）， Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１５５−１１５９（２００１））。しかしながら、増加し続けるＨＩＶ−１の多様性と急速な進化のため、ウイルスは急速に移動する厄介な標的であり、ＨＩＶ−１の変化の複雑さの程度は、これらのアプローチを何れも問題のあるものとしている。ＨＩＶ−１免疫原を設計するための現在最も一般的なアプローチは、野生型の野生ＨＩＶ−１単離株を選択することであり、これは、ワクチンを検査すべき領域に由来してもよく、又は由来しなくてもよい複数のエンベロープ免疫原を取り込んだ多価エンベロープ免疫原が設計されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ １２：１２９１−１３００（１９９８）， Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：２２２４−２２３４（２００１））。
【００６４】
上記研究は、この候補免疫原と野生型の野生ウイルス株との遺伝的距離が減少したグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）を作製することによって、ＨＩＶ−１免疫原を設計するための新しい戦略を試すものである。ほとんどの位置で最も一般的なアミノ酸を選択することによって、全てのサブタイプに対してＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を作製した（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００））。最も一般的なアミノ酸のみを使用したので、抗体及びＴ細胞エピトープの大半は良好に保存された。重要なことは、グループＭコンセンサスｅｎｖ配列と任意のサブタイプｅｎｖ配列の遺伝的距離は約１５％であって、これは、野生型サブタイプ間の遺伝的距離（３０％）の半分にすぎないということである（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０ （２００２））。この距離は、同じサブタイプに属するウイルス間の距離と概ね同じである。さらに、ＣＲＦはサブタイプ間で総合的な遺伝的多様性を増加しないので、グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子も、何れの組換えウイルスｅｎｖ遺伝子から約１５％相違していた。
【００６５】
１ラウンドの感染系を用いて、ＣＯＮ６−Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性を確認したが、感染性は減弱されており、人工エンベロープは「最適な」機能的高次構造ではないが、なお、ウイルスの侵入を媒介できることを示唆した。ＨＩＶ−１に感染した患者の大半が、当初、Ｒ５ウイルスに感染するので、ＣＯＮ６エンベロープがＣＣＲ５（Ｒ５）をその共同受容体として使用したことは重要である。
【００６６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦが何れも、ｓＣＤ４を結合し、野生型ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質に結合する多数のｍａｂを結合することが示された。野生型ＨＩＶ−１エンベロープと抗原的に類似するＣＯＮ６ ｇｐ１２０及び１４０ＣＦタンパク質の発現は、ＨＩＶ−１免疫原の進行において重要な段階である。しかしながら、多くの野生型エンベロープタンパク質は強力な中和ヒトｍａｂが結合するエピトープを発現しているが、免疫原自体として使用されたときには、中和ヒトｍａｂの特異性を有する抗ＨＩＶ−１中和抗体を広く誘導しない。
【００６７】
中和抗体研究は、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０、ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦ及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩが、特定のサブタイプＢ、Ｃ及びＤ ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導した点で有望なものであり、このうちＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩが非サブタイプＢ初代ＨＩＶ単離株の最も強固な中和を誘導する。しかしながら、最も中和が困難な初代単離株（ＰＡＶＯ、６１０１、ＢＧ１１６８、９２ＲＷ０２０、ＣＭ２４４）は、抗ＣＯＮ−６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０血清によって、弱く中和されるにすぎないか、又は中和されないことが明らかである（表４ｂ）。それにもかかわらず、非サブタイプＢ ＨＩＶ単離株に対して、Ｃｏｎ−Ｓサブユニットｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープタンパク質が与えた応答の広さに鑑みると、中和抗体を誘導するＣｏｎ−Ｓエンベロープの免疫原性は有望である。ｇｐ１２０及びｇｐ１６０を発現するポックスウイルス構築物を用いた従前の研究は、高レベルの中和抗体を生成しなかった(Evans et al, J. Infect. Dis. 180:290-298(1999), Polacino et al, J. Virol. 73:618-630(1999), Ourmanov et al, J. Virol. 74:2960-2965(2000), Pal et al, J. Virol 76:292-302(2002), Excler and Plotkin, AIDS ll(Suppl A):S127-137(1997))。分泌型ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０を発現するｒＶＶが構築され、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体が誘導された。ＨＩＶ中和抗体免疫原は、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩ又はそのサブユニットと、ほとんどのサブタイプＢ単離株を中和する免疫原との組み合わせであり得る。
【００６８】
オリゴマーのｇｐ１４０タンパク質の構造は、タンパク質の免疫原性を評価するときに極めて重要である。この点で、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）及び分析用超遠心による精製ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦタンパク質の研究は、精製ｇｐ１４０ピークが主に三量体からなり、二量体が微少成分であることを実証した。
【００６９】
このように、ＣＯＮ６、Ｃｏｎ−Ｓ又は２００３グループＭなどの中心化されたエンベロープ又は本明細書に記載されているサブタイプコンセンサス若しくは先祖のコード配列は、ＣＤ４−Ｅｎｖ複合体、拘束されたエンベロープ構造及び三量体オリゴマー形態など、潜在的に「強化された」様々なエンベロープ免疫原を調製するための魅力的な候補である。ＣＯＮ６によって誘導されたＴ細胞応答及びＢ細胞応答が、ＳＨＩＶ誘発モデルにおいて、ＨＩＶ−１感染及び／又は疾病に対して保護する能力は、ヒト以外の霊長類で研究されるであろう。
【００７０】
上記研究は、グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）及びＣｏｎ−Ｓなどの中心化された人工のＨＩＶ−１遺伝子も、野生型サブタイプＢ及びＣ Ｅｎｖタンパク質中のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答並びにグループＭコンセンサスＥｎｖタンパク質上のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答も誘導することができる（図５）。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦ免疫原を用いたＤＮＡ初回刺激及びｒＶＶ強化刺激療法は、サブタイプＢ及びＣエピトープを認識するＩＦＮ−γ産生性Ｔ細胞を明瞭に誘導したが、ＣＯＮ６エンベロープ中に見られるような中心化された配列が、野生型ＨＩＶ−１遺伝子より、異なるクレード間にわたるＴ細胞応答を誘導する上で有意に優れているかどうかを決定するために、さらなる研究が必要とされる(Ferrari et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1396-1401(1997), Ferrari et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:1433-1443(2000))。しかしながら、ＣＯＮ６（及びＣｏｎ−Ｓ；ｅｎｖコード配列）を初回刺激及び追加免疫した脾細胞Ｔ細胞がＨＩＶ−１サブタイプＢ及びＣのＴ細胞エピトープを認識したという事実は、ＣＯＮ６（及びＣＯＮーＳ）が臨床的に有用であり得るＴ細胞応答を誘導できることを実証する上で重要な段階である。
【００７１】
中心化されたＨＩＶ−１遺伝子を作製するために、３つのコンピュータモデル（コンセンサス、先祖及び樹形の中心（ＣＯＴ；ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅｅ））が提案されている（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１７−１５１８（２００３）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００）。それらは全て、サブタイプ内又はサブタイプ間の殆どのＨＩＶ−１配列について、星状の系統樹の根元に位置する傾向がある。実験的ワクチンとして、それらは全て、免疫原と野生ウイルス株間の遺伝的距離を減少させることができる。しかしながら、コンセンサス、先祖及びＣＯＴ配列には、それぞれ一長一短がある（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１７−１５１８（２００３）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。コンセンサス及びＣＯＴは、サンプルとされた現行の野生型ウイルス中の配列又はエピトープを代表し、外れたＨＩＶ−１配列によって影響を受けにくいが、先祖は外れた配列によって著しい影響を受け得る先祖配列を代表する。しかしながら、現時点では、中心化された配列の何れが最高の免疫原としての役割を果たして、多様なＨＩＶ−１株に対する広い免疫応答を惹起することができるかは不明であり、これらの異なる戦略を調べるための研究が進行中である。
【００７２】
総合すると、このデータは、ＨＩＶ−１人工ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓエンベロープは、野生型ＨＩＶ−１エピトープに対するＴ細胞応答を誘導し、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導することが可能なことを示しており、このため、ＨＩＶ−１ワクチン設計において人工的の中心化されたＨＩＶ−１配列を使用することの実現可能性と有望性を実証している。
【実施例２】
【００７３】
ＨＩＶ−１サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質
実験の詳細
ＨＩＶ−１サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ遺伝子をＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），から取得し、哺乳類細胞の発現に対してコドンの使用を最適化し、合成した（図６）。最適な発現を確保するために、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＧＣＣ）を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長の遺伝子の他に、ｇｐ４１膜貫通ドメイン（ＩＶＮＲ）及びｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位（ＲＥＫＲ）の直後に停止コドンを導入することによって、末端切断された２つのｅｎｖ遺伝子を作製し、それぞれ、ｇｐ１４０及びｇｐ１２０形態の糖タンパク質を得た（図８）。
【００７４】
インビトロ転写／翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。先祖及びコンセンサスサブタイプＣエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、ｇｐ１６０及びｇｐ１４０遺伝子をＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに同時形質移入し、ＪＣ５３−ＢＬ細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した（図７）。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。コドン使用が最適化されたｒｅｖ依存性９６ＺＡＭ６５１ ｅｎｖ遺伝子を、現サブタイプＣ対照として使用した。
【００７５】
結果
コドンを最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子（ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）は、哺乳類細胞中で高レベルのｅｎｖ糖タンパク質を発現する（図９）。
【００７６】
コドンを最適化されたサブタイプＣ ｇｐ１６０及びｇｐ１４０糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、ｒｅｖ依存性の現エンベロープ対照と比べて、コドンを最適化されたエンベロープのビリオン取り込みが１０倍高いレベルであることが明らかである（図１０Ａ）。
【００７７】
サブタイプＣコンセンサスｇｐ１６０又はｇｐ１４０エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、対応するｇｐ１６０及びｇｐ１４０先祖エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高かった。さらに、ｇｐ１６０エンベロープは、それらの対応するｇｐ１４０より一貫して感染性が高かった（図１０Ｂ）。
【００７８】
サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープは何れも、ウイルス侵入を媒介するために、共同受容体としてＣＣＲ５を使用する(図１１)。
【００７９】
擬ビリオンを含有するサブタイプＣ先祖及びコンセンサスｇｐ１６０の感染性は、サブタイプＣに感染した患者から得た血漿によって中和された。このことは、これらの人工エンベロープが、固有のＨＩＶ−１ ｅｎｖ 糖タンパク質と類似した構造を有すること、及び共通の中和エピトープが保存されていることを示唆している。サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ糖タンパク質（ｇｐ１６０）の間には、中和能に有意な差は見られなかった（図１２）。
【００８０】
結論
ＨＩＶ−１サブタイプＣウイルスは、最も広く流行している単離株であり、世界中の新しい感染のうち約５０％を占める。世界的に流行しているＨＩＶ−１株における遺伝的多様性は、ワクチン設計に対して困難な問題を提起する。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質は可変性が高いが、感染した宿主中で液性免疫と細胞性免疫をともに誘導することができる。７０のＨＩＶ−１完全サブタイプＣ ｅｎｖ配列を分析することによって、コンセンサス及び先祖サブタイプＣ ｅｎｖ遺伝子が作製された。両配列は、現サブタイプＣ株と概ね等距離にあり、このため、さらに優れた交叉保護免疫を誘導すると予想される。再構築された先祖又はコンセンサス配列由来の免疫原は、ワクチン候補と現単離株間の遺伝的差異の程度を最小限に抑える。しかしながら、コンセンサス及び先祖サブタイプＣ ｅｎｖ遺伝子は、アミノ酸配列が５％異なる。コンセンサス配列と先祖配列の両方を分析のために合成した。コドンを最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子を構築し、発現された糖タンパク質のインビトロでの生物特性を決定した。合成サブタイプＣコンセンサス及び先祖ｅｎｖ遺伝子は、現サブタイプＣ野生型エンベロープ糖タンパク質と構造、機能及び抗原性が類似する糖タンパク質を発現する。
【実施例３】
【００８１】
サブタイプＣ ｇａｇ及びｎｅｆ遺伝子のコンセンサス（Ｃ． ｃｏｎ． ｇａｇ及びＣ． ｃｏｎ． ｎｅｆ）のコドン使用の最適化
サブタイプＣウイルスは、グループＭウイルスの全サブタイプ中、世界で最も多く蔓延しているウイルスとなった。現在、５０％を超えるＨＩＶ−１感染者が、ＨＩＶ−１サブタイプＣウイルスを保有している。さらに、サブタイプＣ内にかなりの可変性が存在する。すなわち、異なるサブタイプＣウイルスは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＮｅｆタンパク質がそれぞれ１０％、６％、１７％及び１６％も異なることがある。最も重要なことは、ある国から得られるサブタイプＣウイルスは、世界の他の地域から単離されたウイルスと同程度に異なり得ることである。唯一の例外は、サブタイプＣがより最近に導入されたインド／中国、ブラジル及びエチオピア／ジブチから得られるＨＩＶ−１株である。単一の国内でさえ、サブタイプＣウイルスの遺伝的多様性は高いので、単一のウイルス単離株に基づく免疫原は、同じ地域中で流行する他の単離株に対して防御免疫を誘発しない場合がある。
【００８２】
このため、サブタイプＣウイルスのｇａｇ及びｎｅｆ遺伝子配列を集め、５０％のコンセンサス閾値を使用することによって、両遺伝子に対するコンセンサス配列を作製した。創始ウイルスに対して生じ得る偏りを避けるために、インド／中国、ブラジル及びエチオピア／ジブチから、それぞれ一つだけ配列を使用して、サブタイプＣコンセンサス配列（Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）を作製した。Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。２９３Ｔ細胞中への形質移入後のタンパク質発現が、図１３に示されている。図から明らかなように、コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆタンパク質は効率的に発現され、Ｇａｇ及びＮｅｆ特異的抗体によって認識された。Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ両遺伝子のタンパク質発現レベルは、元のサブタイプｅｎｖ遺伝子（９６ＺＭ６５１）のタンパク質発現レベルと同等である。
【実施例４】
【００８３】
「コンセンサス可変領域を有するコンセンサスｅｎｖ遺伝子の完全長コンセンサス」（ＣＯＮ−Ｓ）の合成
合成された「コンセンサスｅｎｖ遺伝子のコンセンサス」（ＣＯＮ６）では、可変領域が、現サブタイプＣウイルス由来の対応する領域（９８ＣＮ００６）で置換されている。さらに、コンセンサス可変領域も有するｃｏｎ／ｃｏｎ遺伝子（ＣＯＮ−ｓ）も設計された。Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。（アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図１４Ａ及び１４Ｂを参照。）
３’末端が２０ｂｐ重複し、５’末端及び３’末端に不変の配列（それぞれ、制限酵素部位ＥｃｏＲＩ及びＢｂｓＩ並びにＢｓｍＢＩ及びＢａｍＨＩを含む。）を含有する、対を成すオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。それらは、１８ｂｐの不変領域に隣接する最初の４つの残基を切断して、後続の連結工程のために各断片の末端に、４塩基の５’突出を残すように、オリゴマー中に配置された。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなす２６のオリゴマーを個別に連結した。
【００８４】
Ｔ／Ａクローニング法を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に各対をクローニングし、不慮の変異／欠失の不存在を確認するために配列を決定した。次いで、適切なインサートを含有するｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、１％のアガロースゲルを走行させ、ゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。マルチ断片連結反応において、４つの各１０８マーをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で四方向の連結が段階的に起こった。遺伝子全体がｐｃＤＮＡ３．１ベクター中に再構築されるまで、このプロセスを繰り返した。
【００８５】
コドン使用が最適化されたオリゴ対を一緒に連結することによって、完全なＣｏｎ−Ｓ遺伝子を構築した。そのオープンリーディングフレームを確認するために、インビトロ転写及び翻訳アッセイを行った。翻訳工程の間に、Ｓ３５−メチオニンによってタンパク質産物を標識し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ラジオオートグラフィーによって検出した。予想されたサイズの発現されたＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１６０が、７つのクローンのうち４つで同定された（図１４Ｃ）。
【００８６】
ウェスタンブロットアッセイを用いた、２９３Ｔ細胞中に形質移入後の、哺乳類細胞中でのＣＯＮｓ Ｅｎｖタンパク質発現（図１５）。Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現レベルは、コンセンサス保存領域と９８ＣＮ００６ウイルス単離株から得られる可変ループとを含有する以前のＣＯＮ６ ｅｎｖクローンから観察されたものと極めて類似していた。
【００８７】
Ｅｎｖ−擬ビリオンは、Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖクローンとｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンを２９３Ｔ細胞中に同時形質移入することによって作製された。形質移入から２日後に、擬ビリオンを採集し、ＪＣ５３ＢＬ−１３細胞中に感染させた。感染単位（ＩＵ）は、３つの独立した実験において、Ｘ−ｇａｌで染色した後、青色の細胞を計数することによって決定した。ＣＯＮ６ ｅｎｖクローンと比較したときに、Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖクローンは、ＪＣ５３ＢＬ−１３細胞中で同じような数のＩＵを産生する（図１６）。両者に対するＩＣ力価は、ＳＧ３骨格クローン対照（Ｅｎｖなし）より約３桁高い。しかしながら、この力価も、陽性対照（固有のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子、ＮＬ４−３又はＹＵ２）より約２桁低い。これらのデータは、両コンセンサスグループＭ ｅｎｖクローンが生物学的に機能であることを示唆している。しかしながら、それらの機能は低下していた。機能的コンセンサスｅｎｖ遺伝子は、これらのＥｎｖタンパク質が正しく折り畳まれ、固有のＥｎｖタンパク質の基本的高次構造を保存しており、普遍的なＥｎｖ免疫原として発達できることを示唆する。
【００８８】
次に、Ｃｏｎ−Ｓ ＥｎｖがＪＣ５３−ＢＬ細胞中に侵入するためにどの共同受容体を使用しているかを決定した。ＣＸＣＲ４遮断剤ＡＭＤ３１００で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、ＹＵ２、Ｃｏｎ−Ｓ又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害されなかった。これに対して、ＣＣＲ５遮断剤ＴＡＫ７７９で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、ＹＵ２、Ｃｏｎ−Ｓ又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、Ｃｏｎ−Ｓ及びＣＯＮ６エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、ＣＣＲ５共同受容体を使用し、ＣＸＣＲ４共同受容体をしていないことを示している。
【００８９】
次に、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質が擬ビリオン中に等しく効率的に取り込まれ得るかどうかを決定した。Ｅｎｖタンパク質がいくつの擬ビリオン中に取り込まれたかを正確に比較できるようにするために、細胞可溶化液に対して、同じ濃度：５μｇ総タンパク質（細胞培養上清では２５ｎｇのｐ２４、又は精製されたウイルス株（超高速遠心後の濃縮された擬ビリオン）では１５０ｎｇのｐ２４）で各擬ビリオンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に与える。何れの調製物においても、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ擬ビリオン中に取り込まれたＥｎｖタンパク質の量に差は存在しなかった（細胞可溶化液、細胞培養上清又は精製されたウイルス株）（図１７）。
【実施例５】
【００９０】
コンセンサスサブタイプＡ完全長ｅｎｖ（Ａ．ｃｏｎ．ｅｎｖ）遺伝子の合成
サブタイプＡウイルスは、７０％を超えるＨＩＶ−１感染が文献で報告されているアフリカ大陸において、二番目に多く広まっているＨＩＶ−１である。アフリカ及び世界で最も多く蔓延しているサブタイプＣウイルスに対するコンセンサスｇａｇ、ｅｎｖ及びｎｅｆ遺伝子は既に作製された。サブタイプＡとＣウイルスの遺伝的距離は、ｅｎｖ遺伝子中では、３０％にも達し、両サブタイプ間の交叉反応性又は保護は最適ではないであろう。全てのサブタイプに対して、２つのグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子も作製した。しかしながら、サブタイプコンセンサス遺伝子と同じサブタイプから得られる野生ウイルス間の遺伝的距離は、グループＭコンセンサス遺伝子とこれらの同じウイルス間の遺伝的距離より小さいので、特定のサブタイプウイルスを標的とするためには、サブタイプ特異的コンセンサス遺伝子がより効果的であろう。従って、サブタイプＡ特異的免疫原を開発するためには、コンセンサス遺伝子を作製することが必要である。Ａ．ｃｏｎ．ｅｎｖ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。（アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図１８Ａ及び１８Ｂを参照。）
オリゴの各対を増幅し、クローニングし、連結し、配列を決定した。Ａ．ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子のオープンリーディングフレームを、インビトロでの転写及び翻訳系によって確認した後、Ａ．ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子を２９３Ｔ細胞中に形質移入し、タンパク質の発現と特性をウェスタンブロットアッセイを用いて確認した（図１８）。次いで、Ａ．ｃｏｎエンベロープが生物学的に機能的であるか否かを決定した。これを、ｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ＪＣ５３ＢＬ細胞を感染させるために使用した。Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖ擬ビリオンに感染したＪＣ５３−ＢＬ細胞中に青い細胞が検出され、Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された（表６）。しかしながら、Ａ． ｃｏｎ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染力価は、野生型サブタイプＣエンベロープを有する擬ビリオンの約１／７であった（表６）。総合すると、生物学的に機能的なＡ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質は、Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質が正しく折り畳まれており、Ｅｎｖ免疫原として使用されれば、直鎖及び高次構造のＴ及びＢ細胞エピトープを誘導し得ることを示唆する。
【表６】
【実施例６】
【００９１】
完全長「コンセンサスｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ遺伝子のコンセンサス」（Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ及びＭ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）及びサブタイプＣコンセンサスｐｏｌ遺伝子（Ｃ．ｃｏｎ．ｐｏｌ）の設計
グループＭコンセンサス遺伝子については、ウイルス特異的な可変領域を有するｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）とコンセンサス可変領域を有するｅｎｖ遺伝子（Ｃｏｎ−Ｓ）という２つの異なるｅｎｖ遺伝子を構築した。しかしながら、免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのＴ細胞免疫応答の解析は、ｅｎｖ遺伝子が通常Ｔ細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。代わりに、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質が、強力なＴ細胞免疫応答を誘導するために重要であることが見出される。全てのサブタイプに対して、さらに広い液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる免疫原のレパートリーを作製するためには、ｅｎｖ遺伝子のみ以外に、他のグループＭコンセンサス遺伝子を構築することが必要であるかもしれない。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ遺伝子「コンセンサスのコンセンサス」（Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ及びＭ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）が設計された。サブタイプコンセンサスｐｏｌ遺伝子を作製するために、サブタイプＣコンセンサスｐｏｌ遺伝子（Ｃ．ｃｏｎ．ｐｏｌ）も設計した。Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ．、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏ．遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、最適化された。（核酸配列及びアミノ酸配列については、図１９を参照。）
【実施例７】
【００９２】
合成サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子
実験の詳細
それぞれ、３７及び１３７個の現ＨＩＶ−１株から、サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ配列を得て、哺乳類細胞発現に対してコドン使用を最適化し、合成した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。最適な発現を確保するために、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＧＣＣ）を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長のｅｎｖ遺伝子に加えて、ｇｐ１４５遺伝子を作製するために、ｇｐ４１膜貫通ドメイン（ＩＶＮＲ）の直後に停止コドンを導入することにより、末端切断されたｅｎｖ遺伝子を作製した。インビトロ転写／翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。（サブタイプＢコンセンサスＧａｇ及びＥｎｖ配列は、それぞれ、図２０Ｃ及び２０Ｄに記載されている。）
サブタイプＢコンセンサスエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、ｇｐ１６０及びｇｐ１４５遺伝子をＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに同時形質移入し、ＪＣ５３−ＢＬ細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、高レベルのＣＤ４並びにＨＩＶ−１共同受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞から派生した細胞である。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、それぞれ、ＨＩＶ−１ ＬＴＲから発現されるルシフェラーゼとガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を２４ウェルプレート中に播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、３７℃で３０分間、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎで処理した。１％ ＤＭＥＭ中にウイルスを系列希釈し、ＤＥＡＥ−デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、さらに５００μＬの細胞培地を各ウェルに添加する。３７℃で４８時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌを用いて染色し、青色の病巣を顕微鏡で計数するために、ＰＢＳを重層した。偽感染されたウェルに対するカウント（バックグラウンドを決定するために使用）を、試料ウェルに対するカウントから差し引く。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。サブタイプＢコンセンサスＧａｇタンパク質が、Ｅｎｖ糖タンパク質を取り込んだウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生できるかどうかを決定するために、２９３Ｔ細胞をサブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子で同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、ＶＬＰを含有する細胞上清を集め、卓上遠心機で清澄にし、０．２ｍＭのフィルターを通してろ過し、２０％のショ糖クッションを通して沈降させる。ＶＬＰペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、２０から６０％の連続スクロース勾配上に転写した。１００，０００×ｇで一晩遠心した後、０．５ｍＬの画分を集め、ｐ２４含量をアッセイした。各画分の屈折率も測定した。ＶＬＰに対する正しい密度を有し、最高レベルのｐ２４を含有する画分をプールし、最後に沈降する。ＶＬＰ含有ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、サブタイプＢのＨＩＶ−１に感染した個体から得た血清でプローブした。
【００９３】
結果
コドン使用を最適化されたサブタイプＢコンセンサスエンベロープ（ｇｐ１６０、ｇｐ１４５）及びｇａｇ遺伝子は、哺乳類細胞中で高レベルの糖タンパク質を発現する（図２１）。
【００９４】
サブタイプＣｇｐ１６０及びｇｐ１４５糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、ｒｅｖ依存性の現エンベローの取り込みと比べて、コンセンサスＢエンベロープの取り込みレベルは少なくとも５倍であることを示唆する（図２３Ａ）。サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４５エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、ｒｅｖ依存性の現エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高い（図２３Ｂ）。
【００９５】
サブタイプＢコンセンサスエンベロープは、ＣＤ４を有する標的細胞中に侵入するための共同受容体としてＣＣＲ５を使用する（図２２）。
【００９６】
サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有する擬ビリオンの感染性は、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した患者から得た血漿（図２４Ｃ）及び中和モノクローナル抗体（図２４Ａ）によって中和された。このことは、サブタイプＢ合成コンセンサスＢエンベロープの全体的な構造が固有のＮＩＶ−１ Ｅｎｖ糖タンパク質と類似していること、及び共通する中和エピトープがそのままの状態を保っていることを示唆する。図２４Ｂ及び２４Ｄは、サブタイプＢ対照エンベロープ（ＮＬ４．３ Ｅｎｖ）の中和プロファイルを示している。
【００９７】
サブタイプＢコンセンサスＧａｇタンパク質は、細胞膜から出芽し、ウイルス様粒子を形成することができる（図２５Ａ）。コドンを最適化されたサブタイプＢコンセンサスがｇａｇ及びがｐ１６０遺伝子の同時形質移入によって、取り込まれたエンベロープを有するＶＬＰが産生される（図２５Ｂ）。
【００９８】
結論
合成サブタイプＢコンセンサスｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子は、現サブタイプＢ Ｅｎｖ及びＧａｇタンパク質と構造、機能及び抗原性が類似するウイルスタンパク質を発現する。サブタイプＢコンセンサス遺伝子を基礎とする免疫原は、幅広い一群のＨＩＶ−１単離株に対して保護的であるＣＴＬ及び中和免疫応答を惹起するであろう。
【００９９】
上記に引用されている全ての文献及びその他の情報源は、参照により、それらの全体が本明細書に援用される。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：５２７０（２００４））も、参照により援用される。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年９月１７日に出願された仮出願第６０／５０３，４６０号及び２００４年８月２７日に出願された仮出願第６０／６０４，７２２号の優先権を主張するものであり、これらの内容全体は、参照により、本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、概括的には免疫原に関し、具体的には、幅広いＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する免疫原に関する。本発明は、このような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法にも関する。本発明は、さらに、本発明の免疫原をコードする核酸配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１の高レベルの遺伝的変異性は、ＡＩＤＳワクチン開発にとって大きな障害となっている。ＨＩＶ−１のグループＭ、Ｎ及びＯ間の遺伝的差異は大きく、ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子では、それぞれ３０％から５０％にわたる(Gurtler et al, J.Virol. 68:1581-1585(1994), Vanden Haesevelde et al, J. Virol. 68: 1586-1596(1994), Simon et al, Nat. Med. 4:1032-1037(1998), Kuiken et al, Human retroviruses and AIDS 2000: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico))。グループＭに属するウイルスは、さらに、遺伝的に異なる９つのサブタイプ（Ａ−Ｄ、Ｆ−Ｈ、Ｊ及びＫ）に分類される(Kuiken et al, Human retroviruses and AIDS 2000: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, Robertson et al, Science 288:55-56(2000), Robertson et al, Human retroviruses and AIDS 1999: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Kuiken et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. 492-505(2000))。ＨＩＶ−１サブタイプ間のｅｎｖ遺伝子中の遺伝的変動が３０％にも達するため、全てのＨＩＶ−１サブタイプに対して、異なるサブタイプにわたり、Ｔ及びＢ細胞免疫応答を一貫して惹起することは困難であった。ＨＩＶ−１は、しばしば、異なるサブタイプ間で組換えを行い、組換え型流行株（ＣＲＦ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｒｍ）を作り出す(Robertson et al, Science 288:55-56(2000), Robertson et al, Human retroviruses and AIDS 1999: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Kuiken et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. 492-505 (2000), Carr et al, Human retroviruses and AIDS 1998: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, eds. Korber et al (Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico), pp. III-10-III-19(1998))。複数のサブタイプが一般的な地理的領域では、ＨＩＶ−１単離株の２０％超が組換え体であり(Robertson et al, Nature 374:124-126(1995), Cornelissen et al, J. virol.70:8209-8212(1996), Dowling et al, AIDS 16:1809-1820(2002))、組換えウイルスの発生頻度が高いことが、実験的なＨＩＶ−１免疫原の設計をさらに複雑にし得る。
【０００４】
ＡＩＤＳワクチン開発におけるこれらの困難な課題を克服するために、３つのコンピュータモデル（コンセンサス、先祖及び樹形中心（ＣＯＴ；ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅｅ））を使用して、中心化されたＨＩＶ−１遺伝子（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ＨＩＶ−１ ｇｅｎｅ）が生成されている(Gaschen et al, Science 296:2354-2360(2002), Gao et al, Science 299:1517-1518(2003), Nickle et al, Science 299:1515-1517 (2003), Novitsky et al, J. Virol. 76:5435-5451(2002), Ellenberger et al, Virology 302:155-163(2002), Korber et al, Science 288:1789-1796(2000))。ＨＩＶの生物学は、星状の系統発生を生じ、この結果、３種類の配列は互いに２から５％異なる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：５１７−１５１８ （２００３））。３つの中心化された遺伝子戦略は何れも、免疫原と野生ウイルス株間のタンパク質距離を少なくするであろう。コンセンサス配列は、アラインメント中の各位置において最も一般的なアミノ酸を基礎として、人工配列を作製することによって、ワクチン株と現在の流行ウイルス間の配列の不一致の程度を最小限に抑える（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２））。先祖配列は、コンセンサス配列と類似するが、最大確率系統発生分析法を用いて作製される（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。このようにする際には、本方法は、分析された現行の野生型配列の仮定的な先祖遺伝子を再現する（図２６）。Ｎｉｃｋｌｅらは、樹形中心（ＣＯＴ）という、先祖配列と似ているが、外れ値による影響が先祖配列より低い中心化されたＨＩＶ−１配列を作製するための別の方法を提案した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。
【０００５】
本発明は、中心化された免疫原がＴ及びＢの両細胞免疫応答を動物に誘導できるかどうかを決定するために設計された研究の結果から、少なくとも部分的にはもたらされる。これらの研究では、人工のグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製、並びにＣＯＮ６エンベロープを可溶性ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質として発現するためのＤＮＡプラスミド及び組換えワクシニアウイルスの構築を行う。この結果は、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であり、野生型ＨＩＶの線形、高次構造及びグリカン依存性エピトープを有しており、ＨＩＶサブタイプＢ及びＣの両方のＴ細胞エピトープを認識するサイトカイン産生Ｔ細胞を誘導する。重要なことは、ＣＯＮ６、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質は、サブタイプＢ及びＣのＨＩＶ−１初代単離株のサブセットを中和する抗体を誘導するということである。
【０００６】
中心化されたＨＩＶ−１遺伝子アプローチの研究の反復的性質は、ＨＩＶ−１配列の急速に拡大する進化、及びＨＩＶ配列データベース（すなわち、 ｔｈｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ）に集められた配列は、毎年、継続的に新たな配列で更新されているという事実に由来する。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０エンベロープ遺伝子は、Ｙｅａｒ １９９９ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅの配列に由来し、Ｃｏｎ−ｓはＹｅａｒ ２０００ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅの配列に由来する。さらに、ＣＯＮ６は、チャイニーズサブタイプＣ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４及びＶ５ Ｅｎｖ配列を有するのに対して、Ｃｏｎ−Ｓは全て、最小長の可変ループへと短縮されたグループＭコンセンサスＥｎｖ定常領域及び可変領域を有する。ＨＩＶ−１初代単離株に対して幅広い反応性があるＴ及びＢ細胞応答を誘導するのに使用するために、野生型ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ遺伝子の対応する系列を比較用に有するように、一連のＹｅａｒ ２００３グループＭ及びサブタイプコンセンサス配列に対するコドン最適化遺伝子が設計されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、幅広いＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する免疫原ならびに前記免疫原をコードする核酸配列に関する。本発明は、このような免疫原を使用して、抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法及び／又はＴ細胞免疫応答を誘導する方法にも関する。
【０００８】
本発明の目的及び利点は、以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製及び発現。ＣＯＮ６ ｇｐ１６０の完全なアミノ酸配列が示されている。
【００１０】
（図１Ａ）野生型ＣＲＦ０８＿ＢＣ（９８ＣＮ００６）ｅｎｖ遺伝子から得られる５つの領域は、下線を付した文字によって記されている。可変領域は、配列の上にある括弧によって記されている。Ｎ結合型グリコシル化部位の候補は、太字で強調されている。
【図１−２】グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）の作製及び発現。
【００１１】
（図１Ｂ）ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの構築。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦプラスミドは、それぞれ、ｇｐ１２０切断部位の後、又は膜貫通ドメインの前に停止コドンを導入することによって作製された。ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位及びｇｐ４１の融合ドメインは、ｇｐ１４０ＣＦタンパク質では欠失した。
【００１２】
（図１Ｃ）ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの発現。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦは、ｇａｌａｎｔｈｕｓ Ｎｉｖａｌｉｓアルガロース−レクチンカラムを用いて、ｒＷを感染させた２９３Ｔ細胞の細胞培養上清から精製された。ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦの両者を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅブルーで染色した。
【００１３】
（図１Ｄ．）高度に発現されるヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を最適化した。
【図２−１】ＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ｇｐ１４０ ＣＦの、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）及び抗Ｅｎｖ ｍＡｂへの結合。
【００１４】
（図２Ａ−２Ｂ）ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）に、表記の各ｍａｂ及びｓＣＤ４を共有結合によって固定し、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０（図２Ａ）又はｇｐ１４０ＣＦ（図２Ｂ）（それぞれ、１００ｇ／ｍＬ及び３００μｇ／ｍＬ）を各表面に注射した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦへの結合が無視できる程度であったｆｏｒ１７ｂ ｍａｂを除き、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ両タンパク質は、検査した各抗ｇｐ１２０ｍａｂと反応した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦへの１７ｂ ｍａｂ結合の誘導を測定するために、ｓＣＤ４又はｍａｂ Ａ３２若しくはＴ８が固定化された各フローセル上にＣＯＮ６ ｇｐ１２０（図２Ｃ）又はｇｐ１４０ＣＦ（図２Ｄ）タンパク質を捕捉した（４００から５８０ＲＵ）。各表面の安定化を行った後、ｍＡｂ １７ｂを注入し、固定化された各フローセルの上に流した。曲線の重ね合わせにより、ｍａｂ １７ｂのＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質への結合が、ｓＣＤ４及びｍａｂ Ａ３２表面の両者で顕著に増加しているが、Ｔ８表面上では増加していないことが明らかである（図２Ｃ−２Ｄ）。
【図２−２】ＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ｇｐ１４０ ＣＦの、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）及び抗Ｅｎｖ ｍＡｂへの結合。
【００１５】
ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦのヒト ｍａｂへの結合をＥＬＩＳＡで決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦに対するｍａｂ ４４７、Ｆ３９Ｆ、Ａ３２、ＩｇＧ１ｂ１２及び２Ｆ５の２０μｇ／ｍＬの原溶液を滴定した（図２Ｅ）。Ｍａｂ ４４７（Ｖ３）、Ｆ３９Ｆ（Ｖ３）Ａ３２（ｇｐ１２０）及びＩｇＧ１ｂ１２（ＣＤ４結合部位）は、それぞれ、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及び１４０ウェルの両方に結合したのに対して、２Ｆ５（抗ｇｐ４１ ＥＬＤＫＷＡＳ）はｇｐ１４０ＣＦのみを結合した。ｇｐ１２０に対するｍａｂ ４４７及びＦ３９Ｆの結合の終末点力価における濃度は、それぞれ、０．００３μｇ／ｍＬ未満及び０．００６μｇ／ｍＬ未満であり、ｍａｂ Ａ３２については、０．１２５μｇ／ｍＬ未満、ＩｇＧ１ｂ１２については、０．００２μｇ／ｍＬ未満、２Ｆ５については、０．０１６ｇ／ｍＬであった。
【図３】ＣＯＮ６エンベロープの感染性及び共同受容体使用。
【００１６】
（図３Ａ）ＣＯＮ６及び対照ｅｎｖプラスミドを、ＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖ骨格とともに、ヒト２９３Ｔ細胞中に同時形質移入して、Ｅｎｖ擬ビリオンを作製した。ＪＣ５３−ＢＬ細胞を感染させるために、等量の各擬ビリオン（５ｎｇ ｐ２４）を使用した。β−ｇａｌ発現について感染細胞を染色した後、１μｇの擬ビリオンのｐ２４（ＩＵ／μｇ ｐ２４）当たりの青い細胞（感染単位、ＩＵ）の数を数えることによって、感染性を決定した。
【００１７】
（図３Ｂ）ＡＭＤ３１００及び／又はＴＡＫ−７９９により、１時間（３７℃）で処理した後、等量の各Ｅｎｖ擬ビリオンのｐ２４（５ｎｇ）に感染させたＪＣ５３ＢＬ細胞に対して、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子の共同受容体の使用を決定した。対照グループにおける感染性（遮断剤なし）を１００％として設定した。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来のＩＵのパーセントとして表した。示されているデータは、平均±ＳＤである。
【図４】複数サブタイプの抗血清に対する複数サブタイプのＥｎｖタンパク質のウェスタンブロット分析。等量のＥｎｖタンパク質（１００ｎｇ）を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬニトロセルロース膜に転写し、ＨＩＶ−１感染した患者から得た血清（１：１，０００）、又はＣＯＮ６ ｇｐ１２０ ＤＮＡ初回刺激、ｒＷ追加刺激で免疫したモルモット（１：１，０００）から得た血清（１：１，０００）と反応させた。タンパク質が結合された抗体を、蛍光標識した二次抗体でプローブし、画像をスキャンし、赤外線撮像装置Ｏｄｙｓｓｅｙ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ．ＮＥ．）上に記録した。サブタイプは、Ｅｎｖタンパク質及び血清ＩＤの後に、一文字で表記されている。各サブタイプに対して４から６個の血清を検査し、反応パターンは、同じサブタイプから得た全ての血清間で類似していた。各サブタイプの血清に対して一つの代表的な結果が示されている。
【図５】マウス中のＣＯＮ６ Ｅｎｖ 免疫原によって誘導されたＴ細胞免疫応答。免疫化された各マウスから脾細胞を単離した（５匹のマウス／群）。ＣＯＮ６（黒のカラム）、サブタイプＢ（斜線入りカラム）、サブタイプＣ（白のカラム）及び溶媒（ペプチドなし；灰色のカラム）の重複するＥｎｖペプチドプールで、脾細胞をインビトロで刺激した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＩＮＦ−γ産生細胞を決定した。ＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦによって誘導されたＴ細胞ＩＦＮ−γ応答を、サブタイプ特異的なＥｎｖ免疫原（ＪＲＦＬ及び９６ＺＭ６５１）によって誘導された応答と比較した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、百万個の脾細胞当たりのＳＦＣとして表される。各カラムに対する値は、ＩＦＮ−γ ＳＦＣの平均±ＳＥＭである（ｎ＝５匹のマウス／群）。
【図６Ａ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｂ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｃ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｄ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図６Ｅ】コドン使用を最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子の構築（それぞれ、図６Ａ及び６Ｂ）。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用を正確に反映させるために、先祖及びコンセンサスアミノ酸配列（それぞれ、図６Ｃ及び６Ｄ）を転写した。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｓｍＢＩを含む５’の不変配列を含有するように、２０ｂｐが重複するペアのオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢｓｍＢＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなすオリゴマーを個別に段階的な様式で連結し、１４０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらをｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングし、配列決定して意図しない変異／欠失の不存在を確認した。適切な挿入物を含有する４つの各ｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、互いに連結してｐｃＤＮＡ３．１とした。全体の遺伝子がｐｃＤＮＡ３．１中に再構築されるまで、遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で多断片連結が段階的に繰り返し起こった。（図６Ｅの模式図参照）
【図７】ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、高レベルのＣＤ４並びにＨＩＶ−１共同受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞から派生した細胞である。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、それぞれ、ＨＩＶ−１ ＬＴＲから発現されるルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を２４又は９６ウェルプレート中に播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、３７℃で３０分間、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎで処理した。１％ ＤＭＥＭ中にウイルスを系列希釈し、ＤＥＡＥ−デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、さらに細胞培地を各ウェルに添加する。３７℃で４８時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼを発現している青色の病巣を可視化するために、Ｘ−Ｇａｌを用いて染色するか、又はルシフェラーゼ活性を測定するために３回凍結融解した。
【図８】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ遺伝子の配列アラインメント。９５．５％の配列相同性を示すサブタイプＣ先祖（下の線）及びコンセンサス（上の線）ｅｎｖ配列のアラインメント；アミノ酸配列の差が記されている。一つの顕著な差は、Ｖ１ループの基部にあるＣ先祖ｅｎｖ遺伝子中にグリコシル化部位が追加されていることである。プラスの符号は、表記位置におけるアミノ酸がクラス内で異なることを表しており、バーは、アミノ酸のクラスが変化していることを表している。Ｎ−グリコシル化部位の候補は、青でマークされている。ｇｐ１４０遺伝子に対する末端切断の位置も示されている。
【図９】２９３Ｔ細胞中でのサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープの発現。コドンを最適化されたｇｐ１６０、ｇｐ１４０又はｇｐ１２０サブタイプＣ先祖及びコンセンサス遺伝子を含有するプラスミドを２９３Ｔ細胞中に形質移入し、細胞可溶化液のウェスタンブロット分析によって、タンパク質発現を調べた。形質移入から４８時間後に、細胞可溶化液を集め、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、総タンパク質含量を測定し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２μｇの総タンパク質を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、サブタイプＣに感染した患者から得たＨＩＶ−１血漿でプローブした。
【図１０】図１０Ａ。コドン最適化されたサブタイプ先祖Ｃ及びコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４０による、ｅｎｖ欠失ＨＩＶ−１のトランス相補性。コドン最適化された、サブタイプＣ先祖又はコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０遺伝子を含有するプラスミドを、ＨＩＶ−１ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、偽型ウイルスを含有する細胞上清を採集し、遠心によって清澄にし、０．２μＭのフィルターを通してろ過し、２０％のスクロースクッションを通して沈降させる。各ウイルスペレット中のｐ２４の定量は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原アッセイを用いて決定した。コドン最適化されたエンベロープを含有する粒子については、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２５ｎｇのｐ２４を載せた。ｒｅｖ依存性野生型サブタイプＣ ９６ＺＡＭ６５１ｅｎｖ遺伝子の同時形質移入によって作製された粒子については、レーン当たり２５０ｎｇのｐ２４を載せた。レーン当たりに載せられたｐ２４の量の差は、ウェスタンブロットによるｒｅｖ依存性エンベロープの可視化を確保するために必要であった。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢ及びサブタイプＣに感染した個体から得た、プールされた血漿でプローブした。
【００１８】
図１０Ｂ。サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス粒子の感染性。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを用いて、先祖又はコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０エンベロープを含有する偽型ウイルスの感染性を決定した。Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって、スクロースクッションで精製されたウイルス粒子をアッセイし、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともに、各ペレットの５倍系列希釈をインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を可視化するために染色した。導入した擬ビリオンの濃度差を標準化するために、感染性は、１ｎｇのｐ２４当たりの感染単位として表されている。
【図１１】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープの共同受容体の使用。先祖又はコンセンサスエンベロープを含有する偽型粒子を、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４の特異的阻害剤）、ＴＡＫ７７９（ＣＣＲ５の特異的阻害剤）又はＡＭＤ３０００＋ＴＡＫ７７９の存在下で、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともにインキュベートして、共同受容体の使用を測定した。ＣＸＣＲ４を使用することが知られた単離株ＮＬ４．３及びＣＣＲ５を使用する公知の単離株ＹＵ−２を対照として含めた。
【図１２】サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質の中和感受性。先祖、コンセンサス又は９６ＺＡＭ６５１ ｇｐ１６０エンベロープ（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、ＨＩＶ−１サブタイプＣに感染した患者から得た血漿試料のパネルとともに、プレインキュベートし、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出する。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出する。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認する。
【図１３−１】２９３Ｔ細胞への形質移入後のコンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ（図１３Ａ）とＮｅｆ（図１３Ｂ）のタンパク質発現。コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆアミノ酸配列は、それぞれ、図１３Ｃ及び１３Ｄに記されており、コードしている配列は、図１３Ｅ及び１３Ｆに記されている。
【図１３−２】２９３Ｔ細胞への形質移入後のコンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ（図１３Ａ）とＮｅｆ（図１３Ｂ）のタンパク質発現。コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆアミノ酸配列は、それぞれ、図１３Ｃ及び１３Ｄに記されており、コードしている配列は、図１３Ｅ及び１３Ｆに記されている。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖのアミノ酸配列及びコード配列を示している。図１４Ｃは、インビトロ転写及び翻訳系を用いたグループＭコンセンサスＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現を示している。
【図１４−２】図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖのアミノ酸配列及びコード配列を示している。図１４Ｃは、インビトロ転写及び翻訳系を用いたグループＭコンセンサスＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現を示している。
【図１５】哺乳類細胞中でのＣｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子の発現。（図１５Ａ−細胞可溶化液、図１５Ｂ−上清）
【図１６】ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子の感染性（図１６Ａ）及び共同受容体の使用（図１６Ｂ）。
【図１７】ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ擬ビリオンへのＥｎｖタンパク質の取り込み。（図１７Ａ−可溶化液、図１７Ｂ−上清、図１７Ｃ−ペレット。）
【図１８−１】図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、サブタイプＡのコンセンサスＥｎｖアミノ酸配列及びこれをコードする核酸配列を示している。
【図１８−２】図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、サブタイプＡのコンセンサスＥｎｖアミノ酸配列及びこれをコードする核酸配列を示している。
【図１８−３】図１８Ｃ及び１８Ｄは、哺乳類細胞中でのＡ． ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子発現を示している（図１８Ｃ−細胞可溶化液、図１８Ｄ−上清）。
【図１９−１】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−２】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−３】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−４】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図１９−５】Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ（図１９Ａ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｂ）、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ（図１９Ｃ）及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏｌ（図１９Ｄ）核酸配列及び対応するコードされたアミノ酸配列（それぞれ、図１９Ｅ−１９Ｈ）
【図２０−１】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２０−２】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２０−３】サブタイプＢコンセンサスｇａｇ（図２０Ａ）及びｅｎｖ（図２０Ｂ）遺伝子。対応するアミノ酸配列は、図２０Ｃ及び２０Ｄに示されている。
【図２１】２９３Ｔ細胞中でのサブタイプＢコンセンサスｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子の発現。コドンを最適化されたサブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０、ｇｐ１４０及びｇａｇ遺伝子を含有するプラスミドを２９３Ｔ細胞中に形質移入し、細胞可溶化液のウェスタンブロット分析によって、タンパク質発現を調べた。形質移入から４８時間後に、細胞可溶化液を集め、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、総タンパク質含量を測定し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２μｇの総タンパク質を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血清で探索した。
【図２２】サブタイプＢコンセンサスエンベロープの共同受容体の使用。サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０ Ｅｎｖを含有する偽型粒子を、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４の特異的阻害剤）、ＴＡＫ７７９（ＣＣＲ５の特異的阻害剤）及びＡＭＤ３０００＋ＴＡＫ７７９の存在下で、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともにインキュベートして、共同受容体の使用を測定した。ＣＸＣＲ４を使用することが知られた単離株ＮＬ４．３及びＣＣＲ５を使用する公知の単離株ＹＵ−２を対照として含めた。
【図２３】コドン最適化されたサブタイプＢ並びにコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４０遺伝子による、ｅｎｖ欠失ＨＩＶ−１のトランス相補性。コドン最適化された、サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０遺伝子を含有するプラスミドを、ＨＩＶ−１ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、偽型ウイルスを含有する細胞上清を採集し、卓上遠心機で清澄にし、０．２μＭのフィルターを通してろ過し、２０％のスクロースクッションを通して沈降させる。各ウイルスペレット中のｐ２４の定量は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原アッセイを用いて決定した。４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のレーン当たり２５ｎｇのｐ２４を載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した患者の血清から得た抗ＨＩＶ−１抗体でプローブした。対照のために、ｒｅｖ依存性ＮＬ４．３ ｅｎｖによるトランス相補性を含めた。図２３Ｂ。サブタイプＢコンセンサスエンベロープを含有するウイルス粒子の感染性。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを用いて、コンセンサスＢ ｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０を含有する偽型ウイルスの感染性を決定した。Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって、スクロースクッションで精製されたウイルス粒子をアッセイし、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ処理されたＪＣ５３−ＢＬ細胞とともに、各ペレットの５倍系列希釈をインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を可視化するために染色した。感染性は、１μｇのｐ２４当たりの感染単位として表されている。
【図２４−１】サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有するビリオンの中和感受性。サブタイプＢコンセンサス又はＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、３つの異なるモノクローナル中和抗体及びＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿試料のパネルとともにプレインキュベートし、次いで、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層中に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出した。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出した。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認した。図２４Ａ。サブタイプＢコンセンサスＥｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。図２４Ｂ。ＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。
【図２４−２】サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有するビリオンの中和感受性。サブタイプＢコンセンサス又はＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）（１，５００感染単位）を含有する等量の擬ビリオンを、３つの異なるモノクローナル中和抗体及びＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿試料のパネルとともにプレインキュベートし、次いで、９６ウェルプレート中のＪＣ５３−ＢＬ細胞単層中に添加した。プレートを２日間培養し、ウイルスの感染性の指標として、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染性は、各濃度の抗体で生じたルシフェラーゼユニット（ＬＵ）を、対照感染によって生じたＬＵで除することによって算出した。次いで、各ウイルスに対して、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び各抗体希釈における実際の％中和を算出した。平行する感染における青色の病巣を直接計数することによって、全てのルシフェラーゼ実験の結果を確認した。図２４Ｃ。サブタイプＢコンセンサスＥｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。図２４Ｄ。ＮＬ４．３ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）を含有する擬ビリオンの中和。
【図２５】図２５Ａ。ショ糖勾配画分の密度及びｐ２４分析。２０から６０％のショ糖勾配から、０．５ｍＬの画分を集めた。画分番号１は、勾配チューブの底から採取された最も密度の高い画分を表している。屈折計で密度を測定し、各画分中に存在するｐ２４の量を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイによって決定した。画分６−９、１０−１５、１６−２１及び２２−２５を一緒にプールし、ウェスタンブロットによって分析した。予想通り、ビリオンは、１．１６から１．１８ｇ／ｍＬの密度で沈降した。
【００１９】
図２５Ｂ。サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の同時形質移入によるＶＬＰの産生。サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子で、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入から４８時間後に細胞上清を採集し、２０％のショ糖クッションを通して清澄にし、２０から６０％のショ糖勾配を通してさらに精製した。勾配由来の選択した画分をプールして、２０ｍＬのＰＢＳに添加し、１００，０００×ｇで一晩遠心した。再懸濁したペレットを４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せ、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した個体から得た血漿でプローブした。
【図２６】図２６Ａ。２０００ Ｃｏｎ−Ｓ １４０ＣＦＩ．ＥＮＶ．図２６Ｂ。コドン最適化されたＹｅａｒ ２０００ Ｃｏｎ−Ｓ １４０ＣＦＩ．ｓｅｑ。
【図２７】ＨＩＶ−１エンベロープペプチドに対する各Ｃ５７ＢＬ／６マウスＴ細胞応答。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦＩ及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩのＣ５７ＢＬ／Ｃマウス中での比較免疫原性。ＤＮＡ初回刺激、ｒＷ追加刺激投与計画、群当たり５匹のマウスで、ＨＩＶ５３０５（サブタイプＡ）、２８０１（サブタイプＢ）、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ遺伝子でマウスを免疫した。ｒＷ追加刺激から１０日後に、ＨＩＶ−１ ＵＧ３７（Ａ）、ＭＮ（Ｂ）、Ｃｈｌ９（Ｃ）、８９．６（Ｂ）ＳＦ１６２（Ｂ）又は無ペプチド陰性対照のＥｎｖから得た重複するペプチドの混合物を用いて、ＩＦＮ−γスポット形成細胞に対して脾細胞をアッセイした。
【図２８】図２８Ａ。Ｃｏｎ−Ｂ ２００３ Ｅｎｖ．ｐｅｐ（８４１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図２８Ｂ。Ｃｏｎ−Ｂ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３２アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図２８Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｂ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１９２７ヌクレオチド）。
【図２９】図２９Ａ。ＣＯＮ＿ＯＦ＿ＣＯＮＳ−２００３（８２９アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図２９Ｂ。ＣｏｎＳ−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２０アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図２９Ｃ。コドン最適化された ＣｏｎＳ−２００３ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１８９１ヌクレオチド）。
【図３０】図３０Ａ。コンセンサス＿Ａ１−２００３（８４５アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３０Ｂ。Ｃｏｎ−Ａ１−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３０Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ａ１−２００３ ｓｅｑ。
【図３１】図３１Ａ。コンセンサス＿Ｃ−２００３（８３５アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３１Ｂ。Ｃｏｎ−Ｃ ２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６１９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３１Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｃ ２００３ １４０ＣＦ（１，８８８ヌクレオチド）。
【図３２】図３２Ａ。コンセンサス＿Ｇ−２００３（８４２アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３２Ｂ。Ｃｏｎ−Ｇ−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６２６アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３２Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−Ｇ−２００３ ｓｅｑ。
【図３３】図３３Ａ。コンセンサス＿０１＿ＡＥ−２００３（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３３Ｂ。Ｃｏｎ−ＡＥ０１−２００３ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３８アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３３Ｃ。コドン最適化された Ｃｏｎ−ＡＥ０１−２００３ ｓｅｑ．（１９４５ヌクレオチド）。
【図３４】図３４Ａ。野生型サブタイプＡ Ｅｎｖ．００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ（サブタイプＡ、８９１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３４Ｂ。００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６４７アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３４Ｃ。コドン最適化された ００ＫＥ＿ＭＳＡ４０７６−Ａ １４０ＣＦ． ｓｅｑ．（１９７２ヌクレオチド）。
【図３５】図３５Ａ。野生型サブタイプＢ．ＱＨ０５１５．１ｇ ｇｐ１６０（８６１アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３５Ｂ。ＱＨ０５１５． ｌｇ １４０ＣＦ （６５１アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３５Ｃ。コドン最適化された ＱＨ０５１５．１ｇ １４０ＣＦ．ｓｅｑ（１９８４ヌクレオチド）。
【図３６】図３６Ａ。野生型サブタイプＣ ＤＵ１２３．６ ｇｐ１６０（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３６Ｂ。ＤＵ１２３．６ １４０ＣＦ（６３８アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３６Ｃ。コドン最適化されたＤＵ１２３．６ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９４５ヌクレオチド）。
【図３７】図３７Ａ。野生型サブタイプＣＲＦ０１＿ＡＥ．９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３７Ｂ。９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ １４０ＣＦ． ｐｅｐ（６２９アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３７Ｃ。コドン最適化された ９７ＣＮＧＸ２Ｆ−ＡＥ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９２１ヌクレオチド）。
【図３８】図３８Ａ。野生型ＤＲＣＢＬ−Ｇ（８５４アミノ酸）。下線が付されているアミノ酸配列は、１４０ＣＦデザインでは欠失している融合ドメインであり、下線が付されている「Ｗ」はＣ末端に存在する最後のアミノ酸であり、「Ｗ」以降の全てのアミノ酸は、１４０ＣＦデザインでは、欠失している。図３８Ｂ。ＤＲＣＢＬ−Ｇ １４０ＣＦ．ｐｅｐ（６３０アミノ酸）。太字のアミノ酸は、欠失された融合切断部位の合流部を表している。図３８Ｃ。コドン最適化されたＤＲＣＢＬ−Ｇ １４０ＣＦ． ｓｅｑ（１９２１ヌクレオチド）。
【図３９】図３９Ａ。２００３ Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ。図３９Ｂ。２００３ Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４０】図４０Ａ。２００３ Ｍ． Ｇｒｏｕｐ．Ａｎｃ Ｅｎｖ。Ｆｉｇ． ４０Ｂ。２００３ Ｍ． Ｇｒｏｕｐ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４１】図４１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ａ１ Ｅｎｖ。図４１Ｂ。２００３ ＣＯＮ Ａ１ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４２】図４２Ａ。２００３ Ａ１．Ａｎｃ Ｅｎｖ。図４２Ｂ。２００３ Ａ１． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４３】図４３Ａ。２００３ Ｃｏｎ＿Ａ２ Ｅｎｖ。図４３Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ａ２ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４４】図４４Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｂ Ｅｎｖ。図４４Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｂ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４５】図４５Ａ。２００３ Ｂ． ａｎｃ Ｅｎｖ。図４５Ｂ。２００３ Ｂ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４６】図４６Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｃ Ｅｎｖ。図４６Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４７】図４７Ａ。２００３ Ｃ． ａｎｃ Ｅｎｖ。図４７Ｂ。２００３ Ｃ． ａｎｃ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４８】図４８Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｄ Ｅｎｖ。図４８Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｄ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図４９】図４９Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ１ Ｅｎｖ。図４９Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ１ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５０】図５０Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ２ Ｅｎｖ。図５０Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｆ２ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５１】図５１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｇ Ｅｎｖ。図５１Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｇ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５２】図５２Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｈ Ｅｎｖ。図５２Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿Ｈ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５３】図５３Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ Ｅｎｖ。図５３Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５４】図５４Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ Ｅｎｖ。図５４Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５５】図５５Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ Ｅｎｖ。図５５Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５６】図５６Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図５６Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５７】図５７Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図５７Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５８】図５８Ａ。２００３ ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ Ｅｎｖ。図５８Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図５９】図５９Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ Ｅｎｖ。図５９Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６０】図６０Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ Ｅｎｖ。図６０Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６１】図６１Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ Ｅｎｖ。図６１Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６２】図６２Ａ。２００３ ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ Ｅｎｖ。図６２Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ Ｅｎｖ．ｓｅｑ．ｏｐｔ．（Ｓｅｑ．ｏｐｔ．＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６３】図６３Ａ。２００３ ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ ＰＥＰ。図６３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６４】図６４Ａ。２００３＿Ｍ．ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６４Ｂ。２００３＿Ｍ．ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６５】図６５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｇａｇ． ＯＰＴ。図６５Ｃ。２００３＿Ａ１． ａｎｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６５Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６６】図６６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６７】図６７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｇａｇ．ＯＰＴ。図６７Ｃ。２００３＿Ｂ． ａｎｃ ｇａｇ． ＰＥＰ。図６７Ｄ。２００３＿Ｂ． ａｎｃ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６８】図６８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｇａｇ．ＯＰＴ。図６８Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｇａｇ．ＰＥＰ。図６８Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｇａｇ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図６９】図６９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｇａｇ．ＰＥＰ。図６９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７０】図７０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ ｇａｇ ＰＥＰ。図７０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７１】図７１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７２】図７２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７３】図７３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｋ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｋ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７４】図７４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１ＡＥ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７５】図７５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２ＡＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７６】図７６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７７】図７７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７７Ｂ。２００３ ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７８】図７８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図７９】図７９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０７＿ＢＣ ｇａｇ．ＰＥＰ。図７９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０７＿ＢＣ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８０】図８０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８１】図８１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８２】図８２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＰＸ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８３】図８３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ．ｇａｇ．ＰＥＰ。図８３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ． ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８４】図８４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｇａｇ．ＰＥＰ。図８４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｇａｇ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８５】図８５Ａ。２００３＿ＣＯＮＳ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８５Ｂ。２００３＿ＣＯＮＳ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８６】図８６Ａ。２００３＿Ｍ ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８６Ｂ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ．ａｎｃ．ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８７】図８７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８８】図８８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｎｅｆ． ＰＥＰ。図８８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図８８Ｃ。２００３＿Ａ１． ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図８８Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図８９】図８９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｎｅｆ． ＰＥＰ。図８９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９０】図９０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ−Ｂ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図９０Ｃ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９０Ｄ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９１】図９１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９２】図９２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｎｅｆ．ＯＰＴ。図９２Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９２Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ．ｎｅｆ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９３】図９３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９４】図９４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９５】図９５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９６】図９６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９７】図９７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９８】図９８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１ ＡＥ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図９９】図９９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＥ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図９９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＥ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１００】図１００Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１００Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０１】図１０１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０２】図１０２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０３】図１０３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０４】図１０４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１１＿ＣＦＸ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０５】図１０５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０６】図１０６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｎｅｆ．ＰＥＰ。図１０６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｎｅｆ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０７】図１０７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｓ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０８】図１０８Ａ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０８Ｂ。２００３＿Ｍ． ＧＲＯＵＰ． ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０９−１】図１０９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ１ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１０９−２】図１０９Ｃ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１０９Ｄ。２００３＿Ａ１．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１０】図１１０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ａ２ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１１−１】図１１１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｂ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１１−２】図１１１Ｃ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１１Ｄ。２００３＿Ｂ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１２−１】図１１２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１２−２】図１１２Ｃ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１２Ｄ。２００３＿Ｃ．ａｎｃ ｐｏｌ．ＯＰＴ．（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１３】図１１３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｄ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１４】図１１４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ１ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１５】図１１５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｆ２ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１６】図１１６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｇ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１７】図１１７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿Ｈ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１８】図１１８Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１８Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０１＿ＡＥ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１１９】図１１９Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１１９Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０２＿ＡＧ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２０】図１２０Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２０Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０３＿ＡＢ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２１】図１２１Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２１Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０４＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２２】図１２２Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｐｏｌ． ＰＥＰ。図１２２Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０６＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２３】図１２３Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２３Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿０８＿ＢＣ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２４】図１２４Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２４Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１０＿ＣＤ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２５】図１２５Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿ｌｌ＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２５Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿ｌｌ＿ＣＰＸ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２６】図１２６Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２６Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１２＿ＢＦ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【図１２７】図１２７Ａ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｐｏｌ．ＰＥＰ。図１２７Ｂ。２００３＿ＣＯＮ＿１４＿ＢＧ ｐｏｌ．ＯＰＴ（ＯＰＴ＝コドン最適化されたコード配列）。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、多様なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）初代単離株を中和する抗体を誘導する免疫原及び／又はＴ細胞応答を誘導する免疫原に関する。該免疫原は、少なくとも一つのコンセンサス若しくは先祖免疫原（例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ又はＰｏｌ）、又はそれらの一部、又は変異形を含む。本発明は、コンセンサス若しくは先祖免疫原をコードする核酸配列又はそれらの一部、又は変異形にも関する。本発明は、さらに、前記免疫原およびコード配列の両者を使用する方法に関する。本発明は、具体的なコンセンサス及び先祖免疫原（例えば、グループＭコンセンサスＥｎｖ）を参照しながら、詳細に記載されているが、本明細書に記載されているアプローチは、様々なコンセンサス又は先祖免疫原（例えば、他のＨＩＶ−１グループに対するエンベロープ（例えば、Ｎ及びＯ））を作製するために使用できることが自明であろう。
【００２１】
本発明の一実施形態に従えば、コンセンサスｅｎｖ遺伝子は、例えば、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ中の配列から（例えば、ＭＡＳＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｏｒ）を用いて）特定のＨＩＶ−１グループの各サブタイプ（グループＭは、サブタイプＡ−Ｄ、Ｆ−Ｈ、Ｊ及びＫに分類される。）に対してｅｎｖ遺伝子のコンセンサス配列を作製することによって構築することができる。次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を生成することができる（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００））。実施例１に記載されたグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６と表記）の場合には、ＣＲＦ０８＿ＢＣ組換え株（９８ＣＮ００６）から得た５つの高度可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５及びｇｐ４１の細胞質ドメイン中の領域）が、配列中の欠損領域中に充填するために使用される（しかし、Ｃｏｎ−Ｓに対する対応領域を参照）。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、コンセンサス又は先祖の遺伝子のコドンを最適化することができる（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３１５−３２４（２０００）， Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４９７−１５０３（１９９８））。
【００２２】
Ｙｅａｒ１９９９コンセンサスグループＭ ｅｎｖ遺伝子ＣＯＮ６を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴγインターフェロン脾臓スポット形成細胞の数及び２系統のマウス中で認められたエピトープの数によって、野生型Ｂ及びＣ ｅｎｖに比べて、ＣＯＮ６によるＴ細胞応答の誘導が優越していることを実証することが可能であった（表１及び２は、ＢＡＬＢ／ｃマウス中のデータを示す。）。ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質がＨＩＶ−１初代単離株に対する中和抗体を誘導する能力を、幾つかのサブタイプＢ Ｅｎｖの誘導能力と比較した。ＣＯＮ６によって誘導された中和抗体の標的には、幾つかの非Ｂ ＨＩＶ−１株を含まれる。
【表１】
【表２】
【００２３】
Ｙｅａｒ ２０００コンセンサスグループＭ ｅｎｖ遺伝子Ｃｏｎ−Ｓの場合、２系統のマウスでのＴ細胞γインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｃｏｎ−ＳエンベロープがＣＯＮ６エンベロープ遺伝子と同程度に免疫原性であることが示された（Ｃ５７ＢＬ／６に対するデータが、図２７に示されている。）。さらに、モルモットにおいて、抗体に対するタンパク質免疫原としてのＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ Ｅｎｖを比較すると（表３）、両ｇｐ１４０Ｅｎｖが、サブタイプＢ初代単離株を中和する抗体を誘導することが見出された。しかしながら、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０も、サブタイプＣ単離株ＴＶ−１及びＤＵ１２３並びに１つのサブタイプＡ ＨＩＶ−１初代単離株の強固な中和を誘導したが、ＣＯＮ６は誘導しなかった。
【表３−１】
【表３−２】
【００２４】
コンセンサス免疫原の次の反復として、及び実用的なＨＩＶ−１免疫原が複数サブタイプのコンセンサス遺伝子、サブタイプとコンセンサス遺伝子の混合物、又は中心化された遺伝子と野生型遺伝子の混合物であり得るという事実を認めて、Ｙｅａｒ ２００３ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ配列から得たサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、ＣＲＦ ＡＥ０１及びＧ並びにグループＭコンセンサス遺伝子から、一連の１１のサブタイプコンセンサス及び野生型遺伝子を設計した。野生型配列が早期に伝染したＨＩＶ−１株に由来することが知られているという理由で（これらの株は、ワクチンによって保護する必要性が最も高い。）、又はそのサブタイプのデータベース中で最も最近に登録された株であるという理由で、野生型配列を選択した。これらのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図２８−３８に示されている（図示されている全ての１４０ＣＦデザインについては、１４０ＣＦ遺伝子が、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ／Ａ）とＳａｌＩ部位を含有する５’配列「ＴＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣ」及び停止コドンとＢｇｌＩＩ部位を含有するＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＡの３’配列に隣接することができる。）。図３９−６２に示されているのは、２００３中心化（コンセンサス及び先祖）ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質及びコドン最適化された遺伝子配列である。
【００２５】
（非クレードＢ ＨＩＶ株を中和しない）ＣＯＮ６ ｇｐ１４０と（非クレードＢ ＨＩＶ株を中和する抗体を誘導する）Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０との主な差は、Ｃｏｎ−Ｓ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４及びＶ５領域である。クレードＢ株の場合、Ｖ３領域のペプチドは、中和抗体を誘導することができる（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１６４６−１６５３（１９９３））。このように、Ｔｈ−Ｖ１、Ｔｈ−Ｖ２、Ｔｈ−Ｖ４、Ｔｈ−Ｖ５ペプチドの構築は、反応性が広い所望の抗非クレードＢ中和抗体を生じると予想することができる。従って、表４に示されたＴｈ−Ｖペプチドは、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０に由来するペプチド免疫原として使用することが想定される。免疫原性を促進するために、他のＨＩＶ株中のｇａｇ Ｔｈ決定基（ＧＴＨ、表４）又は任意の相同ＧＴＨ配列を使用することが可能であり、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣ４領域（ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ）又は他のＨＩＶ株からの任意の相同的なＣ４配列も使用することができる（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１６４６−１６５３（１９９３））。Ｎ末端のヘルパー決定基を有するＣｏｎ−Ｓ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５ペプチドは、ＣｏｒｉｘａのＲＣ５２９などの適切なアジュバント中に調合したときに（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ． ８：４５３−４５８（２００２））、非クレードＢ単離株に対する広い交叉反応性の中和抗体を誘導するために、単一又は一緒に使用することができる。
【表４】
【００２６】
本発明は、本明細書に具体的に開示された配列の一部及び変異形を含むことが自明であろう。例えば、ｇｐ１２０／４１が切断され、又は切断されていない、ｇｐ１４０ＣＦ、ｇｐ１４０ＣＦＩ、ｇｐ１２０又はｇｐ１６０形態として、コドン最適化コンセンサスコード化配列の形態を構築することができる。例えば、コンセンサス及び先祖エンベロープ配列に関していえば、本発明は、Ｖ３を欠くエンベロープ配列を包含する。あるいは、Ｖ３配列は、好ましい配列、例えば、米国特許出願第１０／４３１，５９６号及び米国仮出願第６０／４７１，３２７号に記載されている配列から選択することができる。さらに、幅広い応答を与えるのに最適な免疫原は、グループＭコンセンサスｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ及びｅｎｖコード化配列の混合物を含むことができ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ及びｅｎｖ ＨＩＶ遺伝子に対するサブタイプコンセンサス又は先祖コード化配列の混合物からなることができる。ウイルス株における領域差を取り扱う場合、有効な混合物には、コンセンサス／先祖及び野生型コード化配列の混合物が含まれ得る。
【００２７】
本発明のコンセンサス又は先祖エンベロープは、ＨＩＶビリオンの表面上に通常一過性に露出されているに過ぎないか、又は十分に露出されていない中和エピトープの中間高次構造を露出するために「活性化」することが可能である。免疫原は、Ｂリンパ球への提示のために特異的なエピトープを利用可能とする、「凍結された」誘導型のコンセンサス又は先祖エンベロープとすることができる。このエピトープ提示の結果、ＨＩＶを広く中和する抗体が産生される。（ＷＯ ０２／０２４１４９及びその中に記載されている活性化／誘導されたエンベロープに注目されたい。）
融合中間体免疫原の概念は、ｇｐ４１ ＨＲ−２領域ペプチドＤＰ１７８が、コイル化されていない高次構造のｇｐ４１を捕捉することができるという観察（Ｆｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：２７６（１９９８））、ホルマリン固定されたＨＩＶ感染細胞は中和抗体を広く生成することができるという観察（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：３５７（１９９７））と合致する。最近、コイルドコイル領域に対するモノクローナル抗体は、コイルドコイルｇｐ４１構造のＨＲ１及びＨＲ２領域中のｇｐ４１の高次構造決定基に結合したが、ＨＩＶを中和しなかった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １０２１３（１９９８））。しかしながら、この後者の研究は、正しい抗体が生成されれば、抗体が結合するためにコイルドコイル領域を使用できることを証明した。
【００２８】
本発明の一側面の免疫原には、可溶性形態のコンセンサス若しくは先祖エンベロープ、又は、例えば細胞小胞中若しくは脂肪貫通二重層エンベロープを含有するリポソーム中に繋留されたコンセンサス若しくは先祖エンベロープが含まれる。より本来のエンベロープを作製するために、本来の三量体エンベロープを形成させるため、脂質二重層の中にｇｐ１４０又はｇｐ１６０コンセンサス又は先祖配列を設定することができる。あるいは、アルドリチオ１−２不活化されたＨＩＶ−１ビリオン中の誘発されたｇｐ１６０を免疫原として使用することができる。ｇｐ１６０は、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０（ｇｐ１４０は、膜貫通領域を有し、及びおそらく他のｇｐ４１領域が欠失したｇｐ１６０である。）の何れかとして、組換えタンパク質としても存在することができる。ｇｐ１６０又はｇｐ１４０に結合に結合されるのは、組換えＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４共同受容体タンパク質（又はそれらの細胞外ドメインペプチド又はタンパク質断片）若しくはｇｐ１２０上のＣＸＣＲ４若しくはＣＣＲ５結合部位に結合する抗体若しくは他のリガンド、及び／又は可溶性ＣＤ４、若しくはＣＤ４の結合作用を模倣する抗体若しくは他のリガンドであり得る。あるいは、ＣＤ４、ＣＣＲ５（又はＣＸＣＲ４）、又は可溶性ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４ ｇｐ１２０結合部位を反映するペプチドを含有する小胞又はリポソーム。あるいは、最適なＣＣＲ５ペプチドリガンドは、特定のチロシンが硫酸化されているＣＣＲ５のＮ末端から得られるペプチドであり得る（Ｂｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：５７６２（２００１））。誘発された免疫原は、膜に結合される必要はなくてもよいが、溶液中に存在し、溶液中で誘発され得る。あるいは、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、ＣＤ４ペプチドミメトープによって誘発されたエンベロープ（ｇｐ１４０又はｇｐ１６０）によって置き換えることができる（Ｖｉｔｒａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１３０１（１９９９））。細胞融合を誘導するｇｐ１６０の構造と関連する変化をもたらすために、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０を「誘発する」他のＨＩＶ共同受容体分子も使用することができる。可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０初代単離株ＨＩＶ ８９．６エンベロープを可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）に連結すると、ｇｐ４１の高次構造の変化が誘導された。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、ＣＣＲ５結合領域が露出された受容体（ＣＤ４）連結コンセンサス又は先祖エンベロープの特徴を有する免疫原に関するが、ＣＤ４結合部位が遮断されたＣＤ４連結タンパク質とは異なり、この免疫原はＣＤ４結合部位が露出（開放）されている。さらに、この免疫原は、宿主ＣＤ４を欠いているので、宿主に投与したときに、害を与える可能性がある抗ＣＤ４抗体の産生が避けられる。
【００３０】
本免疫原は、Ａ３２モノクローナル抗体（ｍａｂ）によって認識されるｇｐ１２０上の部位に結合するリガンドが連結されたコンセンサス又は先祖エンベロープを含むことができる(Wyatt et al, J. Virol. 69:5723(1995),Boots et al, AIDS Res. Hum. Retro. 13:1549(1997), Moore et al, J. Virol. 68:8350(1994), Sullivan et al, J. Virol. 72:4694(1998), Fouts et al, J. Virol. 71:2779(1997), Ye et al, J. Virol. 74:11955(2000))。一つのＡ３２ ｍａｂは、ＣＤ４を模倣し、ｇｐ１２０に結合したときに、ＣＣＲ５結合部位を上方制御する（露出する）ことが示されている（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３（１９９５））。ｇｐ１２０にこのようなリガンドを連結することによっても、ＣＤ４結合部位が上方制御され、ｇｐ１２０へのＣＤ４の結合を遮断しない。有利には、このようなリガンドも、切断されたｇｐ１２０、切断されていないｇｐ１４０及び切断されたｇｐ４１に結合されたｇｐ４１のＨＲ−２結合部位も上方制御し、これにより、これらのタンパク質上にあるＨＲ−２結合部位（これらの各々が、抗ＨＩＶ中和抗体に対する潜在的な標的である。）がさらに露出される。
【００３１】
本実施形態の特定の側面において、前記免疫原は、無処置のＡ３２ ｍａｂ、Ａ３２ ｍａｂのＦａｂ２断片又はＡ３２ ｍａｂのＦａｂ断片が連結された可溶性ＨＩＶコンセンサス又は先祖ｇｐ１２０エンベロープを含み、その結果、コンセンサス又は先祖エンベロープ上のＣＤ４結合部位、ＣＣＲ５結合部位及びＨＲ−２結合部位は露出され／上方制御されることになる。前記免疫原は、Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）が結合したコンセンサス若しくは先祖エンベロープを含むことができ、Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）が結合し、３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの異種二価性架橋剤などの架橋剤で架橋されたコンセンサス若しくは先祖エンベロープを含むことができる。前記免疫原免疫原は、切断されていないコンセンサス若しくは先祖ｇｐ１４０又は切断されていないｇｐ１４０、切断されたｇｐ４１及び切断されたｇｐ１２０の混合物を含むこともできる。コンセンサス若しくは先祖ｇｐ１４０及び／又はｇｐ１２０に結合され、又はｇｐ４１に非共有結合されたｇｐ１２０に結合されたＡ３２ ｍａｂ（又はその断片）は、ｇｐ４１、ｇｐ１２０及び切断されていないｇｐ１４０中のＨＲ−２結合部位の上方制御（露出）をもたらす。Ａ３２ ｍａｂ（又はその断片）のｇｐ１２０又はｇｐ１４０への結合も、ＣＤ４結合部位及びＣＣＲ５結合部位の上方制御ももたらす。ｇｐ１２０を含有する複合体と同様、切断されていないｇｐ１４０とＡ３２ｍａｂ（又はその断片）を含む複合体は、３％ホルムアルデヒド又はＤＴＳＳＰなどの架橋剤で架橋されていない、又は架橋されている免疫原として使用することができる。一実施形態において、本発明は、Ｆａｂ断片又は完全なＡ３２ ｍａｂに結合及び架橋され、必要に応じて、ＨＲ−２結合タンパク質に結合及び架橋された可溶性非切断コンセンサス又は先祖ｇｐ１４０を含む免疫原に関する。
【００３２】
ｇｐ１２０上のＡ３２ ｍａｂ結合部位に結合するリガンドによって誘発されたコンセンサス又は先祖エンベロープタンパク質は、Ａ３２ ｍａｂ結合部位（ｍａｂ １７ｂによって認識されるＣＣＲ５結合部位など）と異なる部位に結合するリガンドによって誘発された、第二のエンベロープを含む少なくとも一つの第二の免疫原と組み合わせて投与することができる。１７ｂ ｍａｂ（ＡＩＤＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨから入手できる、Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３：６４８（１９９８））は、ｇｐ１２０へのｓＣＤ４結合を増強する。この第二の免疫原（単独で、又は上記のもの以外の誘発された免疫原と組み合わせて使用することもできる。）は、例えば、完全な１７ｂ ｍａｂ、１７ｍａｂのＦａｂ２断片又は１７ｂ ｍａｂのＦａｂ断片の何れかと連結された可溶性ＨＩＶコンセンサス又は先祖エンベロープを含むことができる。露出されているＣＤ４結合部位をもたらす他の抗体（又はその断片）を含む他のＣＣＲ５リガンドを、１７ｂ ｍａｂに代えて使用できることが自明であろう。このさらなる免疫原は、１７ｂ ｍａｂ若しくはその断片（又は上記他のＣＣＲ５リガンド）が結合したｇｐ１２０を含むことができ、又は、１７ｂ ｍａｂ若しくはその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）が結合し、３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの異種二価性架橋剤のような物質で架橋されたｇｐ１２０を含むことができる。あるいは、このさらなる免疫原は、単独で、又は切断されたｇｐ４１及び切断されたｇｐ１２０の混合物として存在する非切断ｇｐ１４０を含むことができる。このような混合物中のｇｐ１４０及び／又はｇｐ１２０に結合されたＭａｂ １７ｂ又はその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）は、ＣＤ４結合領域を露出させる。１７ｂ ｍａｂ 又はその断片（又は上記した他のＣＣＲ５リガンド）ｇｐ１４０複合体は、架橋されていない、又は３％ホルムアルデヒド若しくはＤＴＳＳＰのような物質で架橋されて存在することができる。
【００３３】
Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ及びＤＰ１７８などの可溶性ＨＲ−２ペプチドは、コンセンサスｇｐ１２０とｇｐ４１上のエピトープ並びに切断されていないコンセンサスｇｐ１４０分子を安定化させるために、上記複合体に追加し、該複合体と架橋して、又は架橋せずに投与することができる。
【００３４】
上記１７ｂ ｍａｂのほかに、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位に結合するｍａｂ ＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４８２（１９９４）， Ｍｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：６８６９（１９９７））、ｇｐ１２０上の高次構造決定基に結合するｍａｂ ２Ｇ１２（Ｔｒｋｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：１１００ （１９９６））及びｇｐ４１の膜近傍領域に結合するｍａｂ ２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４０３１（１９９４））など、多くのＨＩＶ初代単離株を中和する一連のモノクローナル抗体（ｍａｂ）が作製されている。
【００３５】
上記のように、本発明に従って、融合性エピトープを「凍結する」ために様々なアプローチを使用することができる。例えば、「凍結」は、コイルドコイル領域の一部に相当し、ＣＤ４によって誘発されたコンセンサス又は先祖エンベロープを添加したときに、融合の予防をもたらすＤＰ−１７８又はＴ−６４９Ｑ２６Ｌペプチドを添加することによって実施することができる（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２ ：９８６−９９３（１９９８））。ＨＲ−２ペプチドが結合したコンセンサス又は先祖ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１又はｇｐ１６０は免疫原として使用することができ、又はＤＴＳＳＰ若しくはＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）などの試薬、ホルムアルデヒド若しくは類似の効果を有する他の架橋剤によって架橋することができる。
【００３６】
「凍結」は、ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を安定化するために、又は「誘発された」ｇｐ４１分子を安定化するために、又はその両方のために、０．１％から３％のホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒド（何れも、タンパク質架橋剤である。）を複合体に添加することによって実施することもできる（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：３５７−３６２（１９９９））。
【００３７】
さらに、コンセンサス又は先祖ｇｐ４１又はｇｐ１２０融合中間体の「凍結」は、ＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を架橋し、安定化するために、又は「誘発された」ｇｐ４１分子を安定化するために、又はその両方のために、ＤＳＰ（ジチオビス［スクシミジルプロピオネート］）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬＬ．， Ｎｏ．２２５８５ＺＺ）又はアミノ基と反応する２つのＮＨＳエステルを使用する水溶性ＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）などの異種二機能性物質を添加することによって実施することができる。
【００３８】
免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのＴ細胞免疫応答の解析は、エンベロープタンパク質が通常Ｔ細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質は、強力なＴ細胞免疫応答を誘導する。従って、本発明には、液性及び細胞性の両免疫応答を誘導することができるコンセンサス又は先祖免疫原のレパートリーが含まれる。コンセンサス又は先祖配列のサブユニットは、Ｔ又はＢ細胞免疫原として使用することができる。（実施例６及び７、並びに同実施例で参照されている図、並びに図６３−１２７を参照）。
【００３９】
本発明の免疫原は、本分野で周知の技術を用いて、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント（ａｌｕｍなど）とともに調合することができる。本発明の免疫原の適切な投与経路には、全身経路（例えば、筋肉内又は皮内）が含まれる。免疫応答が粘膜の免疫系（例えば、鼻内）で求められるときには、別の経路を使用することができる。
【００４０】
本発明の免疫原は、当業者に周知である方法を用いて、化学的に合成し、精製することができる。免疫原は、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することもできる。本発明の免疫原をコードする核酸は、例えば、コード配列が裸のＤＮＡとして投与されるＤＮＡワクチンの成分として使用することが可能であり、又は、例えば、前記免疫原をコードするミニ遺伝子がウイルスベクター中に存在することができる。コード化配列は、例えば、複製若しくは非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化された結核菌ベクター、ウシ型弱毒結核ワクチン（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニア若しくは修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオ及びその他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ種細菌ベクター、シゲラ種細菌ベクター、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター又はタバコモザイクウイルスベクター中に存在することができる。コード化配列は、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの活性なプロモーターとともにＤＮＡプラスミドとして発現することもできる。本発明の配列を発現するために、他の生ベクターも使用することができる。本発明の免疫原の発現は、好ましくは、ヒト細胞中での発現を最適化するコドンとプロモーターを使用して、免疫原をコードする核酸を患者自身の細胞中に導入することによって、患者自身の細胞中で誘導することができる。ＤＮＡワクチンを製造及び使用する方法の例は、米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号及び第５，７０３，０５５号に開示されている。
【００４１】
本発明の組成物は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原、又はこれをコードする核酸配列を、薬学的に許容される送達系の中に含む。本組成物は、免疫不全ウイルス感染の予防及び／又は治療のために使用することができる。本発明の組成物は、アジュバント、乳化剤、薬学的に許容される担体又はワクチン組成物中に一般的に与えられる他の成分を用いて調合することができる。最適な製剤は、当業者によって容易に設計することができ、即時放出及び／又は持続的放出のための製剤並びに全身性免疫の誘導及び／又は局所的な粘膜免疫の誘導のための製剤（例えば、製剤は、鼻内投与のために設計することができる。）を含むことができる。本組成物は、皮下、鼻内、経口、筋肉内又は他の非経口若しくは経腸経路を含む任意の便利な経路によって投与することができる。前記免疫原は、単回投薬又は複数回投薬として投与することができる。最適な免疫化スケジュールは、当業者によって容易に決定することが可能であり、患者、組成物及び求められる効果に応じて変動することができる。
【００４２】
本発明は、本発明の免疫原及び／又は該免疫原をコードする核酸及び／又は上記のベクター中でミニ遺伝子として発現された免疫原の両方を直接使用することを想定する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子は、初回及び／又は追加免疫として使用することができる。
【００４３】
本発明は、本明細書に開示されたあらゆる全てのアミノ酸配列、及び、適当な場合には、そのＣＦ及びＣＦＩ形態、並びにこれをコードする核酸配列（及びこのようなコード配列と相補的な核酸）を含む。
【００４４】
本発明の一部の側面は、以下に記載されている非限定的な実施例で、さらに詳細に記載することができる。
【実施例１】
【００４５】
人工ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスエンベロープ
実験の詳細
組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）におけるＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０タンパク質の発現。分泌型のＨＩＶ−１ ＣＯＮ６エンベロープタンパク質を発現及び精製するために、それぞれ、ｇｐ１２０切断部位（ＲＥＫＲ）の後、及び膜貫通ドメイン（ＹＩＫＩＦＩＭＩＶＧＧＬＩＧＬＲＩＶＦＡＶＬＳＩＶＮ）の前に停止コドンを導入することによって、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦプラスミドを構築した。１４０ＣＦタンパク質中では、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位及びｇｐ４１の融合ドメインを欠失した。ＣＯＮ６ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ ＤＮＡ構築物の両者を、ｐＳＣ６５ベクター（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから購入）中のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位にクローニングした。このベクターは、ｐ７．５プロモーターによって調節されるｌａｃＺ遺伝子を含有する。ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を発現するために、逆並列Ｐ Ｅ／Ｌプロモーター（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ Ｐ Ｅ／Ｌプロモーター）を使用した。ＢＳＣ−１細胞を、６ウェルプレート中の各ウェル中に、２×１０５個で播種し、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）で感染させ、感染の２時間後に、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐＳＣ６５由来のプラスミドをＶＶ感染細胞中に形質移入し、記載どおりに（Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｅａｒｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ） ｐｐ． １６．１５．１−１６．１９．９（１９９８））、組換え（ｒ）ＶＶを選択した。ＰＣＲ及び配列決定分析によって、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を含有する組換えＶＶを確認した。ＣＯＮ６エンベロープタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットアッセイによって確認した。アガロース ガランサス・ニヴァリスレクチンビーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で、組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦを精製し、使用するまで、−７０℃に保存した。組換えＶＶ発現ＪＲＦＬ（ｖＣＢ−２８）又は９６ＺＭ６５１（ｖＴ２４１Ｒ）ｇｐ１６０は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。
【００４６】
モノクローナル抗体及びｇｐ１２０野生型エンベロープ
ｇｐ１２０（Ａ３２）、ｇｐ１２０ Ｖ３ループ（Ｆ３９Ｆ）及びＣＣＲ５結合部位（１７ｂ）上の高次構造決定基に対するヒトｍａｂは、Ｊａｍｅ Ｒｏｂｉｎｓｏｎから頂いた(Tulane Medical School, New Orleans, LA)(Wyatt et al, Nature 393;705-711(1998), Wyatt et al, J. Virol. 69:5723-5733(1995))。Ｍａｂ ２Ｆ５、４４７、ｂｌ２、２Ｇ１２及び可溶性ＣＤ４は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda, MD)(Gorny et al, J. Immunol. 159:5114-5122(1997), Nyambi et al, J. Virol. 70:6235-6243(1996), Purtscher et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1651-1658(1994), Trkola et al, J. Virol 70:1100-1108(1996))から入手した。Ｔ８は、ｇｐ１２０Ｃ１領域に位置するマウスのｍａｐである（Ｐ．Ｅａｒｌ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから頂いた。）。ＢａＬ（サブタイプＢ）、９６ＺＭ６５１（サブタイプＣ）及び９３ＴＨ９７５（サブタイプＥ）ｇｐ１２０は、ＱＢＩ， Ｉｎｃ．及びＮＩＨのＡＩＤＳ部門によって提供された。９２Ｕ０３７（サブタイプＡ）及び９３ＢＲ０２９（サブタイプＦ）ｇｐｌ４０（分泌及び非切断）を発現するＣＨＯ細胞株は、イギリスのＮＩＣＢＳから入手した。
【００４７】
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ）測定及びＥＬＩＳＡ
ＳＰＲバイオセンサー測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）装置上で行い、データ解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ， Ｕｐｓａａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。タンパク質固定化に対する標準的なアミンカップリングプロトコールを用いて、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の抗ｇｐ１２０ｍａｂ（Ｔ８、Ａ３２、１７ｂ、２Ｇ１２）又はｓＣＤ４を、ＣＭ５センサーチップに直接固定した。ＦＰＬＣ精製されたＣＯＮ６ ｇｐ１２０単量体又はｇｐ１４０ＣＦオリゴマー組換えタンパク質を、それぞれ、１００及び３００μｇ／ｍＬの濃度で、ＣＭ５センサーチップ上に流した。非特異的応答又は一括応答を差し引くために、（アミンカップリングに対して活性化及び脱活性化された）盲検の直列参照表面又は非結合ｍａｂ対照を使用した。それぞれ、陽性対照及び陰性対照として、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質を注入する前に各ｍａｂ表面の活性を確保するために、可溶性８９．６ ｇｐ１２０及び無関係のＩｇＧを使用した。ＣＯＮ６エンベロープタンパク質の結合は、ＰＢＳ（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）、ｐＨ７．４を、１０から３０μＬ／分で連続的に流して、２５℃でリアルタイムにモニターした。結合したタンパク質を除去し、５ないし１０μＬの再生溶液（１０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．９）を単回又は二回、短時間与えることによって、各結合サイクルの後に、センサー表面を再生した。記載のとおり（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １１：２１１−２２１（１９９５））、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質に対する様々なのｍａｂの反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡを行った。ヒトｍａｂのｒｇｐ１２０又はｇｐ１４０タンパク質への結合のアッセイの場合、終点力価は、ｍａｂが結合したＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ Ｅｎｖタンパク質がバックグラウンド対照（非結合ヒトｍａｂ）に比べて３倍以上である、ｍａｂの最高力価（２０μｇ／ｍＬで開始）として定義した。
【００４８】
感染性及び共同受容体使用アッセイ
ＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖ及びＣＯＮ６又は対照ｅｎｖプラスミドをヒト２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ろ過し、ｐ２４濃度を定量した（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）。ＪＣ５３−Ｂｌ細胞を感染させて、感染性を決定するために、各擬ビリオンに対して等量のｐ２４（５ｎｇ）を使用した（Ｄｅｒｄｅｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：８３５８−８３６７（２０００）， Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：１８９６−１９０５（２００２））。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４受容体を発現し、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の転写調節下で安定的に組み込まれたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を含有する。これらの細胞は、β−ｇａｌ発現を染色し、１μｇの擬ビリオンのｐ２４当たりの青い細胞の数（感染単位）（ＩＵ／μｇ ｐ２４）を計数することによって、擬ビリオン株の感染性力価を定量するために使用することができる（Ｄｅｒｄｅｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：８３５８−８３６７（２０００）， Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：１８９６−１９０５（２００２））。ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子の共同受容体の使用を決定するために、ＪＣ５３ＢＬ細胞を、１．２ＡＭ ＡＭＤ３１００及び４μＭ ＴＡＫ−７９９により、１時間３７℃で処理した後、等量の各Ｅｎｖ偽型ウイルスのｐ２４（５ｎｇ）に感染させた。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来の感染単位のパーセントとして表した。対照グループからの感染性（遮断剤なし）を任意に１００％として設定した。
【００４９】
免疫化。全ての動物は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された動物使用プロトコールを使用し、ＡＡＬＡＣガイドラインに基づいて、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ中で飼育した。メーカー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）によって提供されたプロトコールに基づき、ＲＩＢＩ−ＣＷＳアジュバントを加えた安定なエマルジョン中に、組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ糖タンパク質を調合した。抗エンベロープ抗体を誘導するために、非近交系の４匹の各モルモット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）に、精製された１００μｇのＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦのうち何れかを３週ごとに皮下投与した（計５回の免疫化）。血清試料を熱で不活化し（５６℃、１時間）、使用するまで−２０℃で保存した。
【００５０】
抗エンベロープＴ細胞応答を誘導するために、６から８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， ＮＣＩ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）の大腿四頭筋に、３週の間隔を置いて、５０μｇのプラスミドＤＮＡを３回筋肉内投与して免疫した。最後のＤＮＡ免疫から３週後、Ｅｎｖタンパク質を発現する１０７ＰＦＵのｒＶＶでマウスに強化免疫を行った。強化免疫から２週後、全てのマウスを安楽死させ、脾細胞を単離するために脾臓を取り出した。
【００５１】
中和アッセイ。中和アッセイは、「Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６ ：２０１９−２０３５ （２０００）」に記載されているＭＴ−２アッセイ、ＨＩＶ−１初代単離株のパネルを使用した、５．２５．ＧＰＦ．Ｌｕｃ．Ｍ７細胞中でのルシフェーラーゼを使用する多重複製サイクルＨＩＶ−１感染アッセイ（Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：２０１９−２０３５（２０００）， Ｂｕｒｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：２２３３−２２４４（２００２）、又は不活化ＨＩＶ−１ビリオンを用いた合胞体（ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ）阻害アッセイ（Ｒｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７９９２−８００１（１９９８））のうち何れかを使用して行った。ルシフェラーゼを使用するアッセイでは、中和抗体は、Ｎａｔｈａｎｉｅｌ Ｒ． Ｌａｎｄａｕ， Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡから頂いた５．２５．ＥＧＦＰ．Ｌｕｃ．Ｍ７細胞（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：１７２９１−１７２９９ （２００２））中でのルシフェラーゼ活性の減少の関数として測定した。組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）が５００の無細胞ウイルスを、９６ウェルの平底培養プレート中、三つ組みで、１５０μＬ中の表記の血清希釈度でインキュベートした（１時間、３７℃）。ＤＥＡＥデキストラン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する培地中に、５×１０５／ｍＬ培地の密度で５．２５．ＥＧＦＰ．Ｌｕｃ．Ｍ７．細胞を懸濁した。細胞（１００μＬ）を添加し、対照ウェル（検査血清試料なし）中の１０％の細胞が、蛍光顕微鏡によって、ＧＦＰ発現が陽性になるまで添加した。この時点で、培地の半分容量を除去することによって、細胞を２倍に濃縮した。Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）上でルシフェラーゼ活性を測定するために、５０μＬの細胞懸濁物を９６ウェルの白色固体プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）に移した。ＭＴ−２及びルシフェラーゼアッセイでの中和力価とは、５０％以上のウイルス感染が阻害される力価であった。力価が１：２０を超える値のみ（すなわち、＞１：３０）を有意な陽性と考えた。合胞体阻害「ｆｕｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ」アッセイでは、ＳｕｐＴ１細胞に添加されたＨＩＶ−１サブタイプＢ株ＡＤＡ及びＡＤ８（Ｌａｒｒｙ Ａｒｔｈｕｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌｉｆｓｏｎ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤから頂いた）から得たＨＩＶ−１アルドリチオールー２（ＡＴ−２）不活化ビリオンを使用し、合胞体阻害力価は、予め出血された血清と比べて、９０％以上の合胞体が阻害される力価として測定した。
【００５２】
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
７０μｍのＮｙｌｏｎ細胞ろ過器（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を通して細分し、絞り取ることによって、免疫された各マウスから得た脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０の重複するＥｎｖペプチド（１５９ペプチド、１１重複する１５マー）は、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｓｃｅｎｃｅ， Ｉｎｃ（Ｒｏｙａｌ Ｏａｋ， ＭＩ）から購入した。ＭＮ ｇｐ１４０の重複するＥｎｖペプチド（サブタイプＢ；１７０ペプチド、１１重複する１５マー）及びＣｈｎｌ９ ｇｐ１４０（サブタイプＣ；６９ペプチド、１０重複する２０マー）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から取得した。ＣＯＮ６、サブタイプＢ及びサブタイプＣ Ｅｎｖタンパク質から得られた重複するＥＮＶペプチドのプールにより、各マウスから得た脾細胞（５マウス／グループ）をインビトロで刺激した。９６ウェルＰＶＤＦプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を、抗ＩＦＮγ ｍａｂ（５μｇ／ｍｌ， ＡＮ１８； Ｍａｂｔｅｃｈ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）でコートした。完全なＨｅｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ培地を用いて、３７℃で２時間、プレートをブロッキングし、５０μＬの前記プールされた重複するエンベロープペプチド（１３のＣＯＮ６およびＭＮプール、各プール中に１３から１４のペプチド；９のＣｈｎ１９プール、各プール中に７から８のペプチド）を、それぞれ５μｇ／ｍＬの最終濃度でプレートに添加した。次いで、１．０×１０７／ｍＬの濃度の脾細胞５０μを二つ組みでウェルに添加し、５％ＣＯ２を与え、１６時間３７℃でインキュベートした。１００μＬの１：１０００希釈のストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）とともにプレートをインキュベートし、１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｐｌｕｓ）Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｍｏｓｓ， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＭＤ）を使用して、紫色のスポットを発生させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ計数システム（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を使用して、スポット形成細胞（ＳＦＣ）を測定した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、１０６個の脾細胞当たりのＳＦＣとして表される。
【００５３】
結果
ＣＯＮ６エンベロープ遺伝子の設計、構築及び発現。人工グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ中の配列から各ＨＩＶ−１サブタイプに対するｅｎｖ遺伝子のコンセンサス配列を作製し、次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を作製することによって構築した（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６ （２０００））。ＣＲＦ０８＿ＢＣ組換え株（９８ＣＮ００６）から得た５つの高度可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５及びｇｐ４１の細胞質ドメイン中の領域）をＣＯＮ６配列中の欠損領域中に充填するために使用した。ＣＯＮ６ Ｖ３領域は、グループＭコンセンサスである（図１Ａ）。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子のコドンを最適化した（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３１５−３２４（２０００）， Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４９７−１５０３（１９９８））（図１Ｄ参照）。コドンが最適化されたＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を構築し、ｐｃＤＮＡ３．１ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １９：８１７−８２３（２００３））。２９３Ｔ細胞中への形質移入後、ウェスタンブロットアッセイを用いて、高レベルのタンパク質発現を確認した。性質決定のために組換えＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質を取得し、免疫原として使用し、分泌されたｇｐ１２０及び非切断ｇｐ１４０ＣＦを発現するためにｒＶＶを作製した（図１Ｂ）。還元条件下のクマシーブルーゲルによって測定したところ、各タンパク質に対する純度は９０％以上であった（図１Ｃ）。
【００５４】
ＣＤ４結合ドメイン及びその他の野生型ＨＩＶ−１エピトープは、ＣＯＮ６タンパク質上に保存される。ＣＯＮ６タンパク質がＣＤ４に結合して、他の野生型ＨＩＶ−１エピトープを発現するかどうかを決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦが可溶性ＣＤ４を結合する能力、特性が十分に決定された幾つかの抗ｇｐ１２０ｍａｂを結合する能力、並びにＣＤ４によって誘導される高次構造を変化させる能力をアッセイした。まず、ｓＣＤ４又はｍａｂのＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質への結合活性をモニタリングするために、ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップをコートした。単量体のＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びオリゴマーのｇｐ１４０ＣＦは何れも、ｓＣＤ４並びに抗ｇｐ１２０ｍａｂ Ｔ８、２Ｇ１２及びＡ３２を効率的に結合するが、ｇｐ１２０のＣＣＲ５結合部位中のＣＤ４誘導性エピトープを認識するｍａｂ１７ｂを恒常的に結合しないことが見出された（図２Ａ及び図２Ｂ）。ｓＣＤ４及びＡ３２は何れも、野生型ｇｐ１２０に結合した後、１７ｂ結合エピトープを露出することができる（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３；７０５−７１１（１９９８）， Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３−５７３３ （１９９５））。ｓＣＤ４又はＡ３２の何れかによって、１７ｂエピトープをＣＯＮ６ Ｅｎｖｓ上に誘導できるかどうかを決定するために、Ａ３２及びＴ８をセンサーチップ上にコートし、次いでＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦを捕捉し、ｍａｂ １７ｂ結合活性をモニターした。ｓＣＤ４又はｍａｂ Ａ３２を結合した後、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦは何れも高次構造の変化を生じ、ｍａｂ １７ｂを結合するように誘発された（図２Ｃ及び２Ｄ）。これに対して、ｍａｂ Ｔ８を結合した後には、１７ｂエピトープは露出されなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。次に、ｇｐ１２０ Ｖ３ ロープ（４４７、Ｆ３９Ｆ）、ＣＤ４結合部位（ｂ１２）及びｇｐ４１中和決定基（２Ｆ５）に対する一群のヒトｍａｂの、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦに対する反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡを使用した（図２Ｅ）。ＣＯＮ６ ｒｇｐ１２０及びｒｇｐ１４０ＣＦタンパク質は、中和Ｖ３ ｍａｂである４４７及びＦ３９Ｆ、並びに強力な中和ＣＤ４結合部位ｍａｂ ｂ１２に良好に結合した。Ｃ末端のｇｐ４１エピトープに結合することによってＨＩＶ−１初代単離株を中和するＭａｂ ２Ｆ５も、ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦに良好に結合した（図２Ｅ）。
【００５５】
ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子は、生物学的に機能的であり、ＣＣＲ５をその共同受容体として使用する。ＣＯＮ６エンベロープ遺伝子が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、ｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ＪＣ５３ＢＬ細胞を感染させた。ＣＯＮ６ Ｅｎｖ偽型ウイルスに感染したＪＣ５３−ＢＬ細胞中に青い細胞が検出され、ＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された（図３Ａ）。しかしながら、感染力価は、ＹＵ２又はＮＬ４−３野生型ＨＩＶ−１エンベロープを有する擬ビリオンの感染力価より１から２桁小さかった。
【００５６】
次に、ＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子に対して共同受容体の使用を決定した。ＣＸＣＲ４遮断剤ＡＭＤ３１００で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、ＹＵ２又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害されなかった（図３Ｂ）。これに対して、ＣＣＲ５遮断剤ＴＡＫ−７７９で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、ＹＵ２又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、ＣＯＮ６エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、ＣＣＲ５共同受容体を使用していることを示している。
【００５７】
ＣＯＮ６ ｇｐ１２０の、異なるサブタイプの血清との反応。複数のサブタイプの直鎖エピトープがＣＯＮ６ ｇｐ１２０上に保存されているかどうかを決定するために、組換えＥｎｖタンパク質パネル（ｇｐ１２０及びｇｐ１４０）を作製した。等量の各Ｅｎｖタンパク質（１００ｎｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に与え、ニトロセルロースに転写し、ウェスタンブロットアッセイにおいて、サブタイプＡからＧの患者の血清及び抗ＣＯＮ６ ｇｐ１２０モルモット血清（１：１０００希釈）と反応させた。各ＨＩＶ−１サブタイプについて、４から６人の患者血清を検査した。各サブタイプに対して代表的な一つの血清が図４に示されている。
【００５８】
検査した全てのサブタイプ血清が、パネル中のＥｎｖの中で可変的な反応性を示したが、全てのグループＭサブタイプ患者血清はＣＯＮ６ ｇｖ１２０ Ｅｎｖタンパク質と等しく良好に反応し、患者血清によって認識される野生型ＨＩＶ−１ ＥｎｖエピトープはＣＯＮ６ Ｅｎｖタンパク質上に良好に保存されることが実証された。次に、モルモット中に生じたＣＯＮ６ ｇｐ１２０抗血清が異なるサブタイプのＥｎｖタンパク質に対して反応できるかどうかについて、検査を行った。サブタイプＡ Ｅｎｖタンパク質を除き、ＣＯＮ６血清はそれ自身及び他のサブタイプＥｎｖタンパク質に等しく良好に反応することが見出された（図４）。
【００５９】
ＣＯＮ６、サブタイプＢ及びサブタイプＣエンベロープ重複ペプチドに対するＴ細胞応答の誘導
ＣＯＮ６ Ｅｎｖ免疫原によって誘導されるＴ細胞免疫応答を、サブタイプ特異的な免疫原によって誘導されたＴ細胞免疫応答と比較するために、さらに２つのマウスの群を、サブタイプＢ又はサブタイプＣ ＤＮＡ及び対応するｒＶＶ発現サブタイプＢ又はＣエンベロープタンパク質で免疫した。サブタイプＢ（ＪＲＦＬ）又はサブタイプＣ（９６ＺＭ６５１） Ｅｎｖ免疫原で免疫したマウスは、主として、サブタイプ特異的なＴ細胞免疫反応を有した（図５）。サブタイプＢ（ＭＮ）ペプチドプールで刺激した後には、ＪＲＦＬ（サブタイプＢ）で免疫されたマウスから得られたＩＦＮ−γＳＦＣ免疫原が検出されたが、サブタイプＣ（Ｃｈｎｌ９）又はＣＯＮ６ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。サブタイプＣ（Ｃｈｎｌ９）及びＣＯＮ６ペプチドプールで刺激した後には、９６ＺＭ６５１（サブタイプＣ）免疫原で免疫されたマウスから得られたＩＦＮ−γ ＳＦＣが検出されたが、サブタイプＢ（ＭＮ）ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。これに対して、ＣＯＮ６ペプチドプール並びにサブタイプＢ又はＣペプチドのプールで刺激すると、ＣＯＮ６ Ｅｎｖ免疫原で免疫されたマウスからＩＦＮ−γ ＳＦＣが同定された(図５)。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０によって誘導されたＴ細胞応答は、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０によって誘導されたＴ細胞応答より強固であるように思われた。これらのデータを総合すると、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ免疫原は、野生型サブタイプＢ及びＣエンベロープのＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞応答を誘導することができることが実証された。
【００６０】
組換えＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦエンベロープによる、ＨＩＶ−１サブタイプＢ及びＣ初代単離株を中和する抗体の誘導
ＣＯＮ６エンベロープ免疫原が、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導することができるかどうかを決定するために、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０ＣＦタンパク質でモルモットを免疫した。中和アッセイのために、４又は５回の免疫化の後に集めた血清を使用し、対応する出血前の血清と比較した。分胞体阻害アッセイ（表５Ａ）で、２つのＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１単離株（ＡＤＡ及びＡＤ８）を検査した。２つのサブタイプＢ ＳＨＩＶ単離株、８つのサブタイプ初代単離株、４つのサブタイプＣ並びに１つの各サブタイプＡ、Ｄ及びＥ初代単離株を、ＭＴ−２又はルシフェラーゼを使用するアッセイの何れかで検査した（表５Ｂ）。分胞体阻害アッセイでは、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦタンパク質によって誘導された抗体は、ＡＴ−２不活化ＡＤＡ及びＡＤ８によって誘導された分胞体を強力に阻害することが見出された（表５Ａ）。ＭＴ−２アッセイでは、２つのＳＨＩＶ単離株のうちの１つ（ＳＨＩＶ ＳＦ１６２Ｐ３）が２つのｇｐ１２０及び１つのｇｐ１４０ＣＦ血清によって弱く中和されることが見出された（表５Ｂ）。ルシフェラーゼを利用するアッセイでは、８つのサブタイプＢ初代単離株のうち４つ（ＢＸ０８、ＳＦ１６２、ＳＳ１１９６及びＢＡＬ）が全てのｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清によって強力に中和されることが見出され、８つのサブタイプＢ単離株のうち２つ（６１０１、０６９２）が多くのｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清によって弱く中和されることが見出された。ＨＩＶ−１ ＰＡＶＯに対しては、中和は検出されなかった（表５Ｂ）。次に、ＣＯＮ６抗ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦ血清を４つのサブタイプＣ ＨＩＶ−１単離株に対して検査すると、４つの単離株のうち３つ（ＤＵ１７９、ＤＵ３６８及びＳ０８０）で、主として抗ＣＯＮ６ ｇｐ１２０血清によって弱い中和が見られた。１つのｇｐ１４０ＣＦ血清ｎｏ．６３５は、ＤＵ１７９を強く中和し、Ｓ０８０を弱く中和した（表５Ｂ）。最後に、抗ＣＯＮ６ Ｅｎｖ血清は、サブタイプＤ単離株（９３ＺＲ００１）を強く中和し、サブタイプＥ（ＣＭ２４４）単離株を弱く中和したが、サブタイプＡ（９２Ｗ０２０）単離株は中和しなかった。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
【００６１】
結論
ウイルスの侵入を媒介するためにＣＣＲ５共同受容体を使用することができる機能的Ｅｎｖタンパク質をコードする人工ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（コード配列）（ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓ）の作製について説明してきた。重要なことは、これらのグループＭコンセンサスエンベロープ遺伝子が、サブタイプＢ及びＣ ＨＩＶ−１初代単離株のエピトープを認識するＴ及びＢ細胞応答を誘導できるということである。さらに、Ｃｏｎ−Ｓは、サブタイプＣ及びＡ ＨＩＶ−１株を強力に中和する抗体を誘導する（表３参照）。
【００６２】
ＨＩＶ−１に対する保護の相関は、確定的には明らかとなっていない。動物モデル及びＨＩＶ−１感染患者での研究から得られた多くのデータは、ＨＩＶ−１ワクチン開発の最終目標は、広い反応性を有するＣＤ４＋及びＣＤ８＋抗ＨＩＶ−１ Ｔ細胞応答（Ｌｅｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：７３−９９（２００２））及び複数のサブタイプのＨＩＶ−１初代単離株を中和する高レベルの抗体（Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：４００９−４０１８（１９９９）， Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：２７０−２１０（２０００））を誘導べきことを示唆する。
【００６３】
ＨＩＶ−１の高レベルな遺伝的可変性のため、臨床的に有用なほど十分に幅広い免疫応答を誘導できる免疫原の設計は困難であった。エピトープをベースとするＴ細胞及びＢ細胞応答に対するワクチン（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９１８−１９２１（２００２）， Ｓｂａｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ， Ｄｉｓｏｒｄ． １：３０３−３１３（２００１）， Ｈａｙｎｅｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８：９３３−９３７（１９９６））、融合中間体を反映する拘束されたエンベロープ（Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１１８４２−２２８４７（２００２））並びに抗ＨＩＶ−１中和抗体を誘導するための保存された高次構造の露出は、ＨＩＶ−１の可変性を克服すると提案されてきた（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４８２１−４８２８（１９９４）， Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１５５−１１５９（２００１））。しかしながら、増加し続けるＨＩＶ−１の多様性と急速な進化のため、ウイルスは急速に移動する厄介な標的であり、ＨＩＶ−１の変化の複雑さの程度は、これらのアプローチを何れも問題のあるものとしている。ＨＩＶ−１免疫原を設計するための現在最も一般的なアプローチは、野生型の野生ＨＩＶ−１単離株を選択することであり、これは、ワクチンを検査すべき領域に由来してもよく、又は由来しなくてもよい複数のエンベロープ免疫原を取り込んだ多価エンベロープ免疫原が設計されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ １２：１２９１−１３００（１９９８）， Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：２２２４−２２３４（２００１））。
【００６４】
上記研究は、この候補免疫原と野生型の野生ウイルス株との遺伝的距離が減少したグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）を作製することによって、ＨＩＶ−１免疫原を設計するための新しい戦略を試すものである。ほとんどの位置で最も一般的なアミノ酸を選択することによって、全てのサブタイプに対してＣＯＮ６ ｅｎｖ遺伝子を作製した（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００））。最も一般的なアミノ酸のみを使用したので、抗体及びＴ細胞エピトープの大半は良好に保存された。重要なことは、グループＭコンセンサスｅｎｖ配列と任意のサブタイプｅｎｖ配列の遺伝的距離は約１５％であって、これは、野生型サブタイプ間の遺伝的距離（３０％）の半分にすぎないということである（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０ （２００２））。この距離は、同じサブタイプに属するウイルス間の距離と概ね同じである。さらに、ＣＲＦはサブタイプ間で総合的な遺伝的多様性を増加しないので、グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子も、何れの組換えウイルスｅｎｖ遺伝子から約１５％相違していた。
【００６５】
１ラウンドの感染系を用いて、ＣＯＮ６−Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性を確認したが、感染性は減弱されており、人工エンベロープは「最適な」機能的高次構造ではないが、なお、ウイルスの侵入を媒介できることを示唆した。ＨＩＶ−１に感染した患者の大半が、当初、Ｒ５ウイルスに感染するので、ＣＯＮ６エンベロープがＣＣＲ５（Ｒ５）をその共同受容体として使用したことは重要である。
【００６６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０ＣＦが何れも、ｓＣＤ４を結合し、野生型ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質に結合する多数のｍａｂを結合することが示された。野生型ＨＩＶ−１エンベロープと抗原的に類似するＣＯＮ６ ｇｐ１２０及び１４０ＣＦタンパク質の発現は、ＨＩＶ−１免疫原の進行において重要な段階である。しかしながら、多くの野生型エンベロープタンパク質は強力な中和ヒトｍａｂが結合するエピトープを発現しているが、免疫原自体として使用されたときには、中和ヒトｍａｂの特異性を有する抗ＨＩＶ−１中和抗体を広く誘導しない。
【００６７】
中和抗体研究は、ＣＯＮ６ ｇｐ１２０、ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦ及びＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩが、特定のサブタイプＢ、Ｃ及びＤ ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導した点で有望なものであり、このうちＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩが非サブタイプＢ初代ＨＩＶ単離株の最も強固な中和を誘導する。しかしながら、最も中和が困難な初代単離株（ＰＡＶＯ、６１０１、ＢＧ１１６８、９２ＲＷ０２０、ＣＭ２４４）は、抗ＣＯＮ−６ ｇｐ１２０又はｇｐ１４０血清によって、弱く中和されるにすぎないか、又は中和されないことが明らかである（表４ｂ）。それにもかかわらず、非サブタイプＢ ＨＩＶ単離株に対して、Ｃｏｎ−Ｓサブユニットｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープタンパク質が与えた応答の広さに鑑みると、中和抗体を誘導するＣｏｎ−Ｓエンベロープの免疫原性は有望である。ｇｐ１２０及びｇｐ１６０を発現するポックスウイルス構築物を用いた従前の研究は、高レベルの中和抗体を生成しなかった(Evans et al, J. Infect. Dis. 180:290-298(1999), Polacino et al, J. Virol. 73:618-630(1999), Ourmanov et al, J. Virol. 74:2960-2965(2000), Pal et al, J. Virol 76:292-302(2002), Excler and Plotkin, AIDS ll(Suppl A):S127-137(1997))。分泌型ＣＯＮ６ ｇｐ１２０及びｇｐ１４０を発現するｒＶＶが構築され、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体が誘導された。ＨＩＶ中和抗体免疫原は、Ｃｏｎ−Ｓ ｇｐ１４０ＣＦＩ又はそのサブユニットと、ほとんどのサブタイプＢ単離株を中和する免疫原との組み合わせであり得る。
【００６８】
オリゴマーのｇｐ１４０タンパク質の構造は、タンパク質の免疫原性を評価するときに極めて重要である。この点で、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）及び分析用超遠心による精製ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦタンパク質の研究は、精製ｇｐ１４０ピークが主に三量体からなり、二量体が微少成分であることを実証した。
【００６９】
このように、ＣＯＮ６、Ｃｏｎ−Ｓ又は２００３グループＭなどの中心化されたエンベロープ又は本明細書に記載されているサブタイプコンセンサス若しくは先祖のコード配列は、ＣＤ４−Ｅｎｖ複合体、拘束されたエンベロープ構造及び三量体オリゴマー形態など、潜在的に「強化された」様々なエンベロープ免疫原を調製するための魅力的な候補である。ＣＯＮ６によって誘導されたＴ細胞応答及びＢ細胞応答が、ＳＨＩＶ誘発モデルにおいて、ＨＩＶ−１感染及び／又は疾病に対して保護する能力は、ヒト以外の霊長類で研究されるであろう。
【００７０】
上記研究は、グループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）及びＣｏｎ−Ｓなどの中心化された人工のＨＩＶ−１遺伝子も、野生型サブタイプＢ及びＣ Ｅｎｖタンパク質中のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答並びにグループＭコンセンサスＥｎｖタンパク質上のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答も誘導することができる（図５）。ＣＯＮ６ ｇｐ１４０ＣＦ免疫原を用いたＤＮＡ初回刺激及びｒＶＶ強化刺激療法は、サブタイプＢ及びＣエピトープを認識するＩＦＮ−γ産生性Ｔ細胞を明瞭に誘導したが、ＣＯＮ６エンベロープ中に見られるような中心化された配列が、野生型ＨＩＶ−１遺伝子より、異なるクレード間にわたるＴ細胞応答を誘導する上で有意に優れているかどうかを決定するために、さらなる研究が必要とされる(Ferrari et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1396-1401(1997), Ferrari et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:1433-1443(2000))。しかしながら、ＣＯＮ６（及びＣｏｎ−Ｓ；ｅｎｖコード配列）を初回刺激及び追加免疫した脾細胞Ｔ細胞がＨＩＶ−１サブタイプＢ及びＣのＴ細胞エピトープを認識したという事実は、ＣＯＮ６（及びＣＯＮーＳ）が臨床的に有用であり得るＴ細胞応答を誘導できることを実証する上で重要な段階である。
【００７１】
中心化されたＨＩＶ−１遺伝子を作製するために、３つのコンピュータモデル（コンセンサス、先祖及び樹形の中心（ＣＯＴ；ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅｅ））が提案されている（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１７−１５１８（２００３）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３）， Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１７８９−１７９６（２０００）。それらは全て、サブタイプ内又はサブタイプ間の殆どのＨＩＶ−１配列について、星状の系統樹の根元に位置する傾向がある。実験的ワクチンとして、それらは全て、免疫原と野生ウイルス株間の遺伝的距離を減少させることができる。しかしながら、コンセンサス、先祖及びＣＯＴ配列には、それぞれ一長一短がある（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４−２３６０（２００２）， Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１７−１５１８（２００３）， Ｎｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５１５−１５１７（２００３））。コンセンサス及びＣＯＴは、サンプルとされた現行の野生型ウイルス中の配列又はエピトープを代表し、外れたＨＩＶ−１配列によって影響を受けにくいが、先祖は外れた配列によって著しい影響を受け得る先祖配列を代表する。しかしながら、現時点では、中心化された配列の何れが最高の免疫原としての役割を果たして、多様なＨＩＶ−１株に対する広い免疫応答を惹起することができるかは不明であり、これらの異なる戦略を調べるための研究が進行中である。
【００７２】
総合すると、このデータは、ＨＩＶ−１人工ＣＯＮ６及びＣｏｎ−Ｓエンベロープは、野生型ＨＩＶ−１エピトープに対するＴ細胞応答を誘導し、ＨＩＶ−１初代単離株を中和する抗体を誘導することが可能なことを示しており、このため、ＨＩＶ−１ワクチン設計において人工的の中心化されたＨＩＶ−１配列を使用することの実現可能性と有望性を実証している。
【実施例２】
【００７３】
ＨＩＶ−１サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質
実験の詳細
ＨＩＶ−１サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ遺伝子をＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），から取得し、哺乳類細胞の発現に対してコドンの使用を最適化し、合成した（図６）。最適な発現を確保するために、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＧＣＣ）を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長の遺伝子の他に、ｇｐ４１膜貫通ドメイン（ＩＶＮＲ）及びｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位（ＲＥＫＲ）の直後に停止コドンを導入することによって、末端切断された２つのｅｎｖ遺伝子を作製し、それぞれ、ｇｐ１４０及びｇｐ１２０形態の糖タンパク質を得た（図８）。
【００７４】
インビトロ転写／翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。先祖及びコンセンサスサブタイプＣエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、ｇｐ１６０及びｇｐ１４０遺伝子をＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに同時形質移入し、ＪＣ５３−ＢＬ細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した（図７）。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。コドン使用が最適化されたｒｅｖ依存性９６ＺＡＭ６５１ ｅｎｖ遺伝子を、現サブタイプＣ対照として使用した。
【００７５】
結果
コドンを最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子（ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）は、哺乳類細胞中で高レベルのｅｎｖ糖タンパク質を発現する（図９）。
【００７６】
コドンを最適化されたサブタイプＣ ｇｐ１６０及びｇｐ１４０糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、ｒｅｖ依存性の現エンベロープ対照と比べて、コドンを最適化されたエンベロープのビリオン取り込みが１０倍高いレベルであることが明らかである（図１０Ａ）。
【００７７】
サブタイプＣコンセンサスｇｐ１６０又はｇｐ１４０エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、対応するｇｐ１６０及びｇｐ１４０先祖エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高かった。さらに、ｇｐ１６０エンベロープは、それらの対応するｇｐ１４０より一貫して感染性が高かった（図１０Ｂ）。
【００７８】
サブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープは何れも、ウイルス侵入を媒介するために、共同受容体としてＣＣＲ５を使用する(図１１)。
【００７９】
擬ビリオンを含有するサブタイプＣ先祖及びコンセンサスｇｐ１６０の感染性は、サブタイプＣに感染した患者から得た血漿によって中和された。このことは、これらの人工エンベロープが、固有のＨＩＶ−１ ｅｎｖ 糖タンパク質と類似した構造を有すること、及び共通の中和エピトープが保存されていることを示唆している。サブタイプＣ先祖及びコンセンサスｅｎｖ糖タンパク質（ｇｐ１６０）の間には、中和能に有意な差は見られなかった（図１２）。
【００８０】
結論
ＨＩＶ−１サブタイプＣウイルスは、最も広く流行している単離株であり、世界中の新しい感染のうち約５０％を占める。世界的に流行しているＨＩＶ−１株における遺伝的多様性は、ワクチン設計に対して困難な問題を提起する。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質は可変性が高いが、感染した宿主中で液性免疫と細胞性免疫をともに誘導することができる。７０のＨＩＶ−１完全サブタイプＣ ｅｎｖ配列を分析することによって、コンセンサス及び先祖サブタイプＣ ｅｎｖ遺伝子が作製された。両配列は、現サブタイプＣ株と概ね等距離にあり、このため、さらに優れた交叉保護免疫を誘導すると予想される。再構築された先祖又はコンセンサス配列由来の免疫原は、ワクチン候補と現単離株間の遺伝的差異の程度を最小限に抑える。しかしながら、コンセンサス及び先祖サブタイプＣ ｅｎｖ遺伝子は、アミノ酸配列が５％異なる。コンセンサス配列と先祖配列の両方を分析のために合成した。コドンを最適化されたサブタイプＣ先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子を構築し、発現された糖タンパク質のインビトロでの生物特性を決定した。合成サブタイプＣコンセンサス及び先祖ｅｎｖ遺伝子は、現サブタイプＣ野生型エンベロープ糖タンパク質と構造、機能及び抗原性が類似する糖タンパク質を発現する。
【実施例３】
【００８１】
サブタイプＣ ｇａｇ及びｎｅｆ遺伝子のコンセンサス（Ｃ． ｃｏｎ． ｇａｇ及びＣ． ｃｏｎ． ｎｅｆ）のコドン使用の最適化
サブタイプＣウイルスは、グループＭウイルスの全サブタイプ中、世界で最も多く蔓延しているウイルスとなった。現在、５０％を超えるＨＩＶ−１感染者が、ＨＩＶ−１サブタイプＣウイルスを保有している。さらに、サブタイプＣ内にかなりの可変性が存在する。すなわち、異なるサブタイプＣウイルスは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＮｅｆタンパク質がそれぞれ１０％、６％、１７％及び１６％も異なることがある。最も重要なことは、ある国から得られるサブタイプＣウイルスは、世界の他の地域から単離されたウイルスと同程度に異なり得ることである。唯一の例外は、サブタイプＣがより最近に導入されたインド／中国、ブラジル及びエチオピア／ジブチから得られるＨＩＶ−１株である。単一の国内でさえ、サブタイプＣウイルスの遺伝的多様性は高いので、単一のウイルス単離株に基づく免疫原は、同じ地域中で流行する他の単離株に対して防御免疫を誘発しない場合がある。
【００８２】
このため、サブタイプＣウイルスのｇａｇ及びｎｅｆ遺伝子配列を集め、５０％のコンセンサス閾値を使用することによって、両遺伝子に対するコンセンサス配列を作製した。創始ウイルスに対して生じ得る偏りを避けるために、インド／中国、ブラジル及びエチオピア／ジブチから、それぞれ一つだけ配列を使用して、サブタイプＣコンセンサス配列（Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）を作製した。Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。２９３Ｔ細胞中への形質移入後のタンパク質発現が、図１３に示されている。図から明らかなように、コンセンサスサブタイプＣ Ｇａｇ及びＮｅｆタンパク質は効率的に発現され、Ｇａｇ及びＮｅｆ特異的抗体によって認識された。Ｃ．ｃｏｎ．ｇａｇ及びＣ．ｃｏｎ．ｎｅｆ両遺伝子のタンパク質発現レベルは、元のサブタイプｅｎｖ遺伝子（９６ＺＭ６５１）のタンパク質発現レベルと同等である。
【実施例４】
【００８３】
「コンセンサス可変領域を有するコンセンサスｅｎｖ遺伝子の完全長コンセンサス」（ＣＯＮ−Ｓ）の合成
合成された「コンセンサスｅｎｖ遺伝子のコンセンサス」（ＣＯＮ６）では、可変領域が、現サブタイプＣウイルス由来の対応する領域（９８ＣＮ００６）で置換されている。さらに、コンセンサス可変領域も有するｃｏｎ／ｃｏｎ遺伝子（ＣＯＮ−ｓ）も設計された。Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。（アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図１４Ａ及び１４Ｂを参照。）
３’末端が２０ｂｐ重複し、５’末端及び３’末端に不変の配列（それぞれ、制限酵素部位ＥｃｏＲＩ及びＢｂｓＩ並びにＢｓｍＢＩ及びＢａｍＨＩを含む。）を含有する、対を成すオリゴヌクレオチド（８０マー）を設計した。ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩは、それらの認識配列の外側を切断するＩＩ型の制限酵素である。それらは、１８ｂｐの不変領域に隣接する最初の４つの残基を切断して、後続の連結工程のために各断片の末端に、４塩基の５’突出を残すように、オリゴマー中に配置された。ＰＣＲ及び１８ｂｐの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなす２６のオリゴマーを個別に連結した。
【００８４】
Ｔ／Ａクローニング法を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に各対をクローニングし、不慮の変異／欠失の不存在を確認するために配列を決定した。次いで、適切なインサートを含有するｐＧＥＭ−Ｔサブクローンを消化し、１％のアガロースゲルを走行させ、ゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。マルチ断片連結反応において、４つの各１０８マーをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。遺伝子の５’から３’末端へ、断片群の間で四方向の連結が段階的に起こった。遺伝子全体がｐｃＤＮＡ３．１ベクター中に再構築されるまで、このプロセスを繰り返した。
【００８５】
コドン使用が最適化されたオリゴ対を一緒に連結することによって、完全なＣｏｎ−Ｓ遺伝子を構築した。そのオープンリーディングフレームを確認するために、インビトロ転写及び翻訳アッセイを行った。翻訳工程の間に、Ｓ３５−メチオニンによってタンパク質産物を標識し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ラジオオートグラフィーによって検出した。予想されたサイズの発現されたＣｏｎ−Ｓ ｇｐ１６０が、７つのクローンのうち４つで同定された（図１４Ｃ）。
【００８６】
ウェスタンブロットアッセイを用いた、２９３Ｔ細胞中に形質移入後の、哺乳類細胞中でのＣＯＮｓ Ｅｎｖタンパク質発現（図１５）。Ｃｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質の発現レベルは、コンセンサス保存領域と９８ＣＮ００６ウイルス単離株から得られる可変ループとを含有する以前のＣＯＮ６ ｅｎｖクローンから観察されたものと極めて類似していた。
【００８７】
Ｅｎｖ−擬ビリオンは、Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖクローンとｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンを２９３Ｔ細胞中に同時形質移入することによって作製された。形質移入から２日後に、擬ビリオンを採集し、ＪＣ５３ＢＬ−１３細胞中に感染させた。感染単位（ＩＵ）は、３つの独立した実験において、Ｘ−ｇａｌで染色した後、青色の細胞を計数することによって決定した。ＣＯＮ６ ｅｎｖクローンと比較したときに、Ｃｏｎ−Ｓ ｅｎｖクローンは、ＪＣ５３ＢＬ−１３細胞中で同じような数のＩＵを産生する（図１６）。両者に対するＩＣ力価は、ＳＧ３骨格クローン対照（Ｅｎｖなし）より約３桁高い。しかしながら、この力価も、陽性対照（固有のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子、ＮＬ４−３又はＹＵ２）より約２桁低い。これらのデータは、両コンセンサスグループＭ ｅｎｖクローンが生物学的に機能であることを示唆している。しかしながら、それらの機能は低下していた。機能的コンセンサスｅｎｖ遺伝子は、これらのＥｎｖタンパク質が正しく折り畳まれ、固有のＥｎｖタンパク質の基本的高次構造を保存しており、普遍的なＥｎｖ免疫原として発達できることを示唆する。
【００８８】
次に、Ｃｏｎ−Ｓ ＥｎｖがＪＣ５３−ＢＬ細胞中に侵入するためにどの共同受容体を使用しているかを決定した。ＣＸＣＲ４遮断剤ＡＭＤ３１００で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、ＹＵ２、Ｃｏｎ−Ｓ又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害されなかった。これに対して、ＣＣＲ５遮断剤ＴＡＫ７７９で処理すると、ＮＬ４−３ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、ＹＵ２、Ｃｏｎ−Ｓ又はＣＯＮ６ Ｅｎｖ−擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、Ｃｏｎ−Ｓ及びＣＯＮ６エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、ＣＣＲ５共同受容体を使用し、ＣＸＣＲ４共同受容体をしていないことを示している。
【００８９】
次に、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖタンパク質が擬ビリオン中に等しく効率的に取り込まれ得るかどうかを決定した。Ｅｎｖタンパク質がいくつの擬ビリオン中に取り込まれたかを正確に比較できるようにするために、細胞可溶化液に対して、同じ濃度：５μｇ総タンパク質（細胞培養上清では２５ｎｇのｐ２４、又は精製されたウイルス株（超高速遠心後の濃縮された擬ビリオン）では１５０ｎｇのｐ２４）で各擬ビリオンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に与える。何れの調製物においても、ＣＯＮ６又はＣｏｎ−Ｓ Ｅｎｖ擬ビリオン中に取り込まれたＥｎｖタンパク質の量に差は存在しなかった（細胞可溶化液、細胞培養上清又は精製されたウイルス株）（図１７）。
【実施例５】
【００９０】
コンセンサスサブタイプＡ完全長ｅｎｖ（Ａ．ｃｏｎ．ｅｎｖ）遺伝子の合成
サブタイプＡウイルスは、７０％を超えるＨＩＶ−１感染が文献で報告されているアフリカ大陸において、二番目に多く広まっているＨＩＶ−１である。アフリカ及び世界で最も多く蔓延しているサブタイプＣウイルスに対するコンセンサスｇａｇ、ｅｎｖ及びｎｅｆ遺伝子は既に作製された。サブタイプＡとＣウイルスの遺伝的距離は、ｅｎｖ遺伝子中では、３０％にも達し、両サブタイプ間の交叉反応性又は保護は最適ではないであろう。全てのサブタイプに対して、２つのグループＭコンセンサスｅｎｖ遺伝子も作製した。しかしながら、サブタイプコンセンサス遺伝子と同じサブタイプから得られる野生ウイルス間の遺伝的距離は、グループＭコンセンサス遺伝子とこれらの同じウイルス間の遺伝的距離より小さいので、特定のサブタイプウイルスを標的とするためには、サブタイプ特異的コンセンサス遺伝子がより効果的であろう。従って、サブタイプＡ特異的免疫原を開発するためには、コンセンサス遺伝子を作製することが必要である。Ａ．ｃｏｎ．ｅｎｖ遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。（アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図１８Ａ及び１８Ｂを参照。）
オリゴの各対を増幅し、クローニングし、連結し、配列を決定した。Ａ．ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子のオープンリーディングフレームを、インビトロでの転写及び翻訳系によって確認した後、Ａ．ｃｏｎ ｅｎｖ遺伝子を２９３Ｔ細胞中に形質移入し、タンパク質の発現と特性をウェスタンブロットアッセイを用いて確認した（図１８）。次いで、Ａ．ｃｏｎエンベロープが生物学的に機能的であるか否かを決定した。これを、ｅｎｖ欠損ＳＧ３プロウイルスクローンとともに、２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ＪＣ５３ＢＬ細胞を感染させるために使用した。Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖ擬ビリオンに感染したＪＣ５３−ＢＬ細胞中に青い細胞が検出され、Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された（表６）。しかしながら、Ａ． ｃｏｎ Ｅｎｖ擬ビリオンの感染力価は、野生型サブタイプＣエンベロープを有する擬ビリオンの約１／７であった（表６）。総合すると、生物学的に機能的なＡ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質は、Ａ．ｃｏｎ Ｅｎｖタンパク質が正しく折り畳まれており、Ｅｎｖ免疫原として使用されれば、直鎖及び高次構造のＴ及びＢ細胞エピトープを誘導し得ることを示唆する。
【表６】
【実施例６】
【００９１】
完全長「コンセンサスｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ遺伝子のコンセンサス」（Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ及びＭ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）及びサブタイプＣコンセンサスｐｏｌ遺伝子（Ｃ．ｃｏｎ．ｐｏｌ）の設計
グループＭコンセンサス遺伝子については、ウイルス特異的な可変領域を有するｅｎｖ遺伝子（ＣＯＮ６）とコンセンサス可変領域を有するｅｎｖ遺伝子（Ｃｏｎ−Ｓ）という２つの異なるｅｎｖ遺伝子を構築した。しかしながら、免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのＴ細胞免疫応答の解析は、ｅｎｖ遺伝子が通常Ｔ細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。代わりに、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質が、強力なＴ細胞免疫応答を誘導するために重要であることが見出される。全てのサブタイプに対して、さらに広い液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる免疫原のレパートリーを作製するためには、ｅｎｖ遺伝子のみ以外に、他のグループＭコンセンサス遺伝子を構築することが必要であるかもしれない。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ遺伝子「コンセンサスのコンセンサス」（Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ及びＭ．ｃｏｎ．ｎｅｆ）が設計された。サブタイプコンセンサスｐｏｌ遺伝子を作製するために、サブタイプＣコンセンサスｐｏｌ遺伝子（Ｃ．ｃｏｎ．ｐｏｌ）も設計した。Ｍ．ｃｏｎ．ｇａｇ．、Ｍ．ｃｏｎ．ｐｏｌ、Ｍ．ｃｏｎ．ｎｅｆ及びＣ．ｃｏｎ．ｐｏ．遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、最適化された。（核酸配列及びアミノ酸配列については、図１９を参照。）
【実施例７】
【００９２】
合成サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子
実験の詳細
それぞれ、３７及び１３７個の現ＨＩＶ−１株から、サブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ配列を得て、哺乳類細胞発現に対してコドン使用を最適化し、合成した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。最適な発現を確保するために、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＧＣＣ）を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長のｅｎｖ遺伝子に加えて、ｇｐ１４５遺伝子を作製するために、ｇｐ４１膜貫通ドメイン（ＩＶＮＲ）の直後に停止コドンを導入することにより、末端切断されたｅｎｖ遺伝子を作製した。インビトロ転写／翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。（サブタイプＢコンセンサスＧａｇ及びＥｎｖ配列は、それぞれ、図２０Ｃ及び２０Ｄに記載されている。）
サブタイプＢコンセンサスエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、ｇｐ１６０及びｇｐ１４５遺伝子をＨＩＶ−１／ＳＧ３Δｅｎｖプロウイルスとともに同時形質移入し、ＪＣ５３−ＢＬ細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、高レベルのＣＤ４並びにＨＩＶ−１共同受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞から派生した細胞である。ＪＣ５３−ＢＬ細胞は、それぞれ、ＨＩＶ−１ ＬＴＲから発現されるルシフェラーゼとガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を２４ウェルプレート中に播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、３７℃で３０分間、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎで処理した。１％ ＤＭＥＭ中にウイルスを系列希釈し、ＤＥＡＥ−デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、さらに５００μＬの細胞培地を各ウェルに添加する。３７℃で４８時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌを用いて染色し、青色の病巣を顕微鏡で計数するために、ＰＢＳを重層した。偽感染されたウェルに対するカウント（バックグラウンドを決定するために使用）を、試料ウェルに対するカウントから差し引く。ＪＣ５３−ＢＬアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。サブタイプＢコンセンサスＧａｇタンパク質が、Ｅｎｖ糖タンパク質を取り込んだウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生できるかどうかを決定するために、２９３Ｔ細胞をサブタイプＢコンセンサスｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子で同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、ＶＬＰを含有する細胞上清を集め、卓上遠心機で清澄にし、０．２ｍＭのフィルターを通してろ過し、２０％のショ糖クッションを通して沈降させる。ＶＬＰペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、２０から６０％の連続スクロース勾配上に転写した。１００，０００×ｇで一晩遠心した後、０．５ｍＬの画分を集め、ｐ２４含量をアッセイした。各画分の屈折率も測定した。ＶＬＰに対する正しい密度を有し、最高レベルのｐ２４を含有する画分をプールし、最後に沈降する。ＶＬＰ含有ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、サブタイプＢのＨＩＶ−１に感染した個体から得た血清でプローブした。
【００９３】
結果
コドン使用を最適化されたサブタイプＢコンセンサスエンベロープ（ｇｐ１６０、ｇｐ１４５）及びｇａｇ遺伝子は、哺乳類細胞中で高レベルの糖タンパク質を発現する（図２１）。
【００９４】
サブタイプＣｇｐ１６０及びｇｐ１４５糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、ｒｅｖ依存性の現エンベローの取り込みと比べて、コンセンサスＢエンベロープの取り込みレベルは少なくとも５倍であることを示唆する（図２３Ａ）。サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０及びｇｐ１４５エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、ｒｅｖ依存性の現エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高い（図２３Ｂ）。
【００９５】
サブタイプＢコンセンサスエンベロープは、ＣＤ４を有する標的細胞中に侵入するための共同受容体としてＣＣＲ５を使用する（図２２）。
【００９６】
サブタイプＢコンセンサスｇｐ１６０エンベロープを含有する擬ビリオンの感染性は、ＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した患者から得た血漿（図２４Ｃ）及び中和モノクローナル抗体（図２４Ａ）によって中和された。このことは、サブタイプＢ合成コンセンサスＢエンベロープの全体的な構造が固有のＮＩＶ−１ Ｅｎｖ糖タンパク質と類似していること、及び共通する中和エピトープがそのままの状態を保っていることを示唆する。図２４Ｂ及び２４Ｄは、サブタイプＢ対照エンベロープ（ＮＬ４．３ Ｅｎｖ）の中和プロファイルを示している。
【００９７】
サブタイプＢコンセンサスＧａｇタンパク質は、細胞膜から出芽し、ウイルス様粒子を形成することができる（図２５Ａ）。コドンを最適化されたサブタイプＢコンセンサスがｇａｇ及びがｐ１６０遺伝子の同時形質移入によって、取り込まれたエンベロープを有するＶＬＰが産生される（図２５Ｂ）。
【００９８】
結論
合成サブタイプＢコンセンサスｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子は、現サブタイプＢ Ｅｎｖ及びＧａｇタンパク質と構造、機能及び抗原性が類似するウイルスタンパク質を発現する。サブタイプＢコンセンサス遺伝子を基礎とする免疫原は、幅広い一群のＨＩＶ−１単離株に対して保護的であるＣＴＬ及び中和免疫応答を惹起するであろう。
【００９９】
上記に引用されている全ての文献及びその他の情報源は、参照により、それらの全体が本明細書に援用される。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：５２７０（２００４））も、参照により援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１Ａに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項２】
ＣＯＮ６ ＨＩＶ ｇｐ１６０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項３】
前記核酸が図１Ｄに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
サブタイプＣ先祖ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項５】
前記核酸が図６Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項７】
前記核酸が図６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
図６Ｃ又は６Ｄに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項９】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１０】
前記核酸が図１３Ｅに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１２】
前記核酸が図１３Ｆに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
グループＭコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１４】
前記核酸が図１４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
サブタイプＡコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１６】
前記核酸が図１８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
グループＭコンセンサスＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１８】
前記核酸が図１９Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
グループＭコンセンサスＨＩＶｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２０】
前記核酸が図１９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
グループＭコンセンサスＨＩＶ ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２２】
前記核酸が図１９Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２４】
前記核酸が図１９Ｄに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
サブタイプＢコンセンサスＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２６】
前記核酸が図２０Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
サブタイプＢコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２８】
前記核酸が図２０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
図２０Ｃ又は２０Ｄに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３０】
図２６Ａに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３１】
請求項３０に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３２】
前記核酸が図２６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
図２８Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３４】
請求項３３に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３５】
前記核酸が図２８Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の核酸配列。
【請求項３６】
図２９Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３７】
請求項３６に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３８】
前記核酸が図２９Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
図３０Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４０】
請求項３９に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４１】
前記核酸が図３０Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４２】
図３１Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４３】
請求項４２に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４４】
前記核酸が図３１Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の核酸配列。
【請求項４５】
図３２Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４６】
請求項４５に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４７】
前記核酸が図３２Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の核酸配列。
【請求項４８】
図３３Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４９】
請求項４８に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５０】
前記核酸が図３３Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の核酸配列。
【請求項５１】
図３４Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５２】
請求項５１に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５３】
前記核酸が図３４Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載の核酸配列。
【請求項５４】
図３５Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５５】
請求項５４に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５６】
前記核酸が図３５Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の核酸配列。
【請求項５７】
図３６Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５８】
請求項５７に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５９】
前記核酸が図３６Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の核酸配列。
【請求項６０】
図３７Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項６１】
請求項６０に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６２】
前記核酸が図３７Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載の核酸配列。
【請求項６３】
図３８Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項６４】
請求項６３に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６５】
前記核酸が図３８Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載の核酸配列。
【請求項６６】
図３９Ａから１２７Ａの何れか一つに記されているアミノ酸配列のＣＦ又はＣＦＩ形態を含む単離されたタンパク質。
【請求項６７】
図３９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６８】
図４０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６９】
図４１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７０】
図４２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７１】
図４３Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７２】
図４４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７３】
図４５Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７４】
図４６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７５】
図４７Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７６】
図４８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７７】
図４９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７８】
図５０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７９】
図５１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８０】
図５２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８１】
図５３Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８２】
図５４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８３】
図５５Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８４】
図５６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８５】
図５７Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８６】
図５８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８７】
図５９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８８】
図６０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８９】
図６１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９０】
図６２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９１】
図６３Ｂから８４Ｂ、６５Ｄ、６７Ｄ及び６８Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９２】
図８５Ｂから１０６Ｂ、８８Ｄ、９０Ｄ及び９２Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９３】
図１０７Ｂから１２７Ｂ、１０９Ｄ、１１１Ｄ及び１１２Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９４】
請求項２から７、９から２８、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５及び６７から９３の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９５】
請求項１から９３の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質又は核酸と、担体とを含む組成物。
【請求項９６】
哺乳動物に免疫応答を誘導するのに十分な量の、請求項１から９３の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質及び／又は核酸を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に免疫応答を誘導する方法。
【請求項１】
図１Ａに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項２】
ＣＯＮ６ ＨＩＶ ｇｐ１６０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項３】
前記核酸が図１Ｄに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
サブタイプＣ先祖ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項５】
前記核酸が図６Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項７】
前記核酸が図６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
図６Ｃ又は６Ｄに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項９】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１０】
前記核酸が図１３Ｅに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１２】
前記核酸が図１３Ｆに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
グループＭコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１４】
前記核酸が図１４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
サブタイプＡコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１６】
前記核酸が図１８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
グループＭコンセンサスＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項１８】
前記核酸が図１９Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
グループＭコンセンサスＨＩＶｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２０】
前記核酸が図１９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
グループＭコンセンサスＨＩＶ ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２２】
前記核酸が図１９Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
サブタイプＣコンセンサスＨＩＶ ｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２４】
前記核酸が図１９Ｄに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
サブタイプＢコンセンサスＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２６】
前記核酸が図２０Ａに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
サブタイプＢコンセンサスＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。
【請求項２８】
前記核酸が図２０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
図２０Ｃ又は２０Ｄに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３０】
図２６Ａに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３１】
請求項３０に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３２】
前記核酸が図２６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
図２８Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３４】
請求項３３に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３５】
前記核酸が図２８Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の核酸配列。
【請求項３６】
図２９Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項３７】
請求項３６に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３８】
前記核酸が図２９Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
図３０Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４０】
請求項３９に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４１】
前記核酸が図３０Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４２】
図３１Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４３】
請求項４２に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４４】
前記核酸が図３１Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の核酸配列。
【請求項４５】
図３２Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４６】
請求項４５に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４７】
前記核酸が図３２Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の核酸配列。
【請求項４８】
図３３Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４９】
請求項４８に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５０】
前記核酸が図３３Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の核酸配列。
【請求項５１】
図３４Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５２】
請求項５１に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５３】
前記核酸が図３４Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載の核酸配列。
【請求項５４】
図３５Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５５】
請求項５４に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５６】
前記核酸が図３５Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の核酸配列。
【請求項５７】
図３６Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項５８】
請求項５７に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５９】
前記核酸が図３６Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の核酸配列。
【請求項６０】
図３７Ｂに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項６１】
請求項６０に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６２】
前記核酸が図３７Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載の核酸配列。
【請求項６３】
図３８Ｂに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項６４】
請求項６３に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６５】
前記核酸が図３８Ｃに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載の核酸配列。
【請求項６６】
図３９Ａから１２７Ａの何れか一つに記されているアミノ酸配列のＣＦ又はＣＦＩ形態を含む単離されたタンパク質。
【請求項６７】
図３９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６８】
図４０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６９】
図４１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７０】
図４２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７１】
図４３Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７２】
図４４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７３】
図４５Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７４】
図４６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７５】
図４７Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７６】
図４８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７７】
図４９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７８】
図５０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７９】
図５１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８０】
図５２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８１】
図５３Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８２】
図５４Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８３】
図５５Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８４】
図５６Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８５】
図５７Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８６】
図５８Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８７】
図５９Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８８】
図６０Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８９】
図６１Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９０】
図６２Ｂに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９１】
図６３Ｂから８４Ｂ、６５Ｄ、６７Ｄ及び６８Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９２】
図８５Ｂから１０６Ｂ、８８Ｄ、９０Ｄ及び９２Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９３】
図１０７Ｂから１２７Ｂ、１０９Ｄ、１１１Ｄ及び１１２Ｄの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９４】
請求項２から７、９から２８、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５及び６７から９３の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９５】
請求項１から９３の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質又は核酸と、担体とを含む組成物。
【請求項９６】
哺乳動物に免疫応答を誘導するのに十分な量の、請求項１から９３の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質及び／又は核酸を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に免疫応答を誘導する方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２０−３】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
【図１０８】
【図１０９−１】
【図１０９−２】
【図１１０】
【図１１１−１】
【図１１１−２】
【図１１２−１】
【図１１２−２】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１５】
【図１１６】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２０】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２０−３】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
【図１０８】
【図１０９−１】
【図１０９−２】
【図１１０】
【図１１１−１】
【図１１１−２】
【図１１２−１】
【図１１２−２】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１５】
【図１１６】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２０】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【公開番号】特開２０１１−１３６９９７（Ｐ２０１１−１３６９９７Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２７５（Ｐ２０１１−２７５）
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【分割の表示】特願２００６−５２７０３０（Ｐ２００６−５２７０３０）の分割
【原出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【出願人】（５０６０９０４８４）ザ・ユニバーシティー・オブ・アラバマ・アット・バーミンガム・リサーチ・ファウンデーション (2)
【出願人】（５９２０３４５４８）ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア (8)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７５（Ｐ２０１１−２７５）
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【分割の表示】特願２００６−５２７０３０（Ｐ２００６−５２７０３０）の分割
【原出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【出願人】（５０６０９０４８４）ザ・ユニバーシティー・オブ・アラバマ・アット・バーミンガム・リサーチ・ファウンデーション (2)
【出願人】（５９２０３４５４８）ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア (8)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]