サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤
【課題】 哺乳類のサイトカイン類やケモカイン類の産生を効果的に増強する手段を提供することを課題とする。
【解決手段】 配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤を提供することによって上記課題を解決する。
【解決手段】 配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤を提供することによって上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤に関するものであり、より詳細には、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体は外界からの物理的、化学的、生物学的侵襲に対して、様々なサイトカイン類やケモカイン類が関与する生体防御反応を示す。しかしながら、何らかの原因で生体が正常に機能できない状態、例えば、老化、癌、癌治療後の化学療法、感染による体力低下時などには、外部からこれらサイトカイン類やケモカイン類を補うことで生体反応を補助する試みがなされている。
【０００３】
近年、問題となっている癌治療後の化学療法時における血小板減少に対する治療として、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の使用が期待されたものの、その効果は明確ではない（例えば、非特許文献１を参照）。炎症時に産生されることが知られているインターロイキン６（ＩＬ−６）は、血小板を増加させる作用と骨髄における巨核球を分化成熟させる作用を有していることが知られており、血小板減少患者において臨床的にも有用であると言われている。また、近年、単球・マクロファージの形成を刺激する因子として発見されたマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）も血小板増加作用を有することが見出され、化学療法後の血小板増多剤として期待されている。さらに、インターロイキン１（ＩＬ−１）も造血能を賦活する作用が知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３などを参照）。従って、血小板のみならず、他の造血系にも作用する自己のＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−１を、生体内若しくは生体外で効率よく産生させる方法があれば、遺伝子組換えなどの手法で工業的に製造されたＩＬ−６や他の各種因子を投与するよりも、患者にとってより副作用が軽減された状態で、血小板を増加させることが可能となる。
【０００４】
一方、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などのサイトカインは細胞の分化や増殖、組織の修復、血管新生などを誘導していることが知られており、コラーゲンやフィブロネクチンの産生を促進することから創傷時の組織回復や治療にその応用が期待されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４などを参照）。
【０００５】
さらに、近年の研究において、血球細胞を炎症局所に誘導する因子として発見されたケモカイン類が、細胞の遊走を刺激する以外にも新たな生物活性を有することが判明した。例えば、ストローマ細胞由来因子(ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１、ＳＤＦ−１)は主に胎生期の造血、心臓形成、脳形成、胃腸管の血管形成など器官形成に関与する多機能サイトカインとしての活性を有し、また、インターロイキン８（ＩＬ−８）は繊維芽細胞内のサイトメガロウイルスを抑制する活性を有し、さらに、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物(ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ、ＲＡＮＴＥＳ)やマクロファージ炎症蛋白（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＩＰ)はヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）の感染を抑制する活性を有することが見出された。また、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）感染抗原であるＤｕｆｆｙ抗原はほとんどのケモカインと結合すること、さらにＨＩＶはマクロファージやＴ細胞のケモカインレセプター(例えばＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰなどのレセプター)を認識して感染することが判明し、ケモカイン自身が病原体の感染をレセプターレベルで阻害する可能性が示されつつある（例えば、非特許文献５などを参照）。従って、ケモカイン類を、生体内若しくは生体外で効率よく産生させることができれば、ＨＩＶやその他の病原体による感染を予防するなどの効果が期待できる。
【０００６】
このような状況下、サイトカイン類やケモカイン類の生体内外での産生を増強する有効な方法が見出されれば、サイトカイン類やケモカイン類を製造する場合の誘導剤として有用であるばかりでなく、癌化学療法時の血小板減少の軽減や回復促進の強力な補助の手段、さらには生体の機能を利用した病原体の感染を未然に防ぐ感染防御の手段となり得ることから、サイトカイン類やケモカイン類の生体内外での産生を効率良く増強する手段が望まれている。
【０００７】
【非特許文献１】『医学のあゆみ』、医歯薬出版（株）発行、１９９９年、第１９０巻、第１０号、８９０頁乃至８９５頁
【非特許文献２】『サイトカイン療法−基礎・病態からのアプローチ−』、１９９２年、高久史麿編集、南江堂発行、７４頁乃至７９頁
【非特許文献３】『サイトカインのすべて』、臨床免疫(増刊)、１９９５年、科学評論社発行、第２７巻、第１６号、５５１頁乃至５６１頁
【非特許文献４】『実験医学』、１９９９年、羊土社発行、第１７巻、第６号、７２１頁乃至７２６頁
【非特許文献５】『検証！ケモカイン』、細胞工学、１９９８年、秀潤社発行、第１７巻、第７号、１０８２頁乃至１０８９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、哺乳類のサイトカイン類やケモカイン類の産生を効果的に増強する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、本発明者が国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書において開示したヒト由来ポリペプチドＡｇＫ１１４−１ａ、すなわち、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ及びｍＡｇＫ１１４−１、すなわち、それぞれ配列表における配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに着目し、これらのポリペプチドを生体外で哺乳類の間葉系細胞、上皮系細胞又はマクロファージ系細胞へ作用させると、これらの細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に増強することを見出し、また、ＩＬ−６と同様に血小板を回復させるサイトカインであるＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１、及び、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類、さらには、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも顕著に増強することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、哺乳類の細胞においてＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−１の産生を顕著に増強することから、これらのサイトカインによる造血作用を増強することができる。したがって、医薬品分野において、癌などの化学療法や放射線療法、又は、骨髄移植により減少した血小板などの血液細胞の数を増加させる用途に有用であり、さらには、生体外で造血細胞を増幅させたのち、生体に投与することにも利用することができる。また、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類の産生をも増強することから、創傷組織の修復に有用である。さらに、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも増強することから、アトピー性皮膚炎などの症状の軽減剤や、細菌などの感染防御剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、本発明と同一の出願人が国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書において開示した、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるものである。これらのポリペプチドは、それが上記したアミノ酸配列を有し、且つ、生体内外においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を発揮するものであるかぎり、その純度、由来、調製方法は問わない。なお、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、サイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するという性質を実質的に失わない範囲で配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換するか、１個乃至１０個のアミノ酸を欠失させるか、若しくは、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部に、１乃至６０個のアミノ酸が付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を有するものを意味し、例えば、１個又は複数個のアラニンをグリシンに置換したアミノ酸配列、１個又は複数個のアラニンが欠失又は付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。このようなアミノ酸配列が変異したポリペプチドは、部位特異的変異やランダム変異などのプロテインエンジニアリングの手法を用いて得ることができる。なお、哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカインの産生を増強する作用の有無は、例えば、ヒト新生児由来間葉系細胞（ＮＨＤＦ細胞）、マウス由来間葉系細胞（ＭＥＦ細胞）又はマウスマクロファージ系細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物上清中におけるサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生量を測定する方法によって判定することができる。
【００１３】
本発明に用いるポリペプチドは、前記のアミノ酸配列を有しており、哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強する限り、いかなるポリペプチドであろうと包含され、例えば、組換えＤＮＡ技術により創製されたポリペプチド、天然の給源由来のポリペプチド、又は化学的に合成されたポリペプチドなどのいずれであってもよく、さらには、当該ポリペプチドを、例えば、平均分子量５，０００乃至１０，０００のデキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性の天然高分子若しくは合成高分子を結合させるなどして人為的に化学修飾したものも有利に用いることができる。
【００１４】
これらのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれをコードするＤＮＡを用い、組換えＤＮＡ技術により斯かるポリペプチドの産生能を有する形質転換細胞や形質転換微生物を作製し、培養して細胞又は菌体内外に産生させ、製造することができる。本発明におけるＤＮＡとは、前記本発明に用いるポリペプチドをコードしているＤＮＡを意味する。本発明に用いるＤＮＡの例としては、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列表における配列番号４乃至６のいずれかで表される塩基配列か、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号４乃至６のいずれかで表される塩基配列の１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、あるいはそれらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。本発明に用いるＤＮＡの天然の給源としては、例えば、ヒトの胎盤細胞及びマウスの皮膚細胞が挙げられ、それらの細胞からは国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書に開示された方法により得ることができる。
【００１５】
また、本発明に用いるポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列に従い化学的に合成することにより調製することもできる。ペプチド合成法としては斯界で一般に用いられるペプチド自動合成装置を用いて全合成する方法か、又は、予めペプチド断片をいくつかのブロックに分けて合成しておき、酵素的又は化学的に縮合させて目的とするポリペプチドを得る方法のいずれもが、必要に応じて、有利に実施できる。
【００１６】
組換えＤＮＡ技術による調製、天然の給源からの調製、又はペプチド合成法による調製のいずれかによって得ることができる本発明に用いるポリペプチドの粗調製品は哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤としてそのまま使用可能ではあるものの、通常は使用に先立ち精製して用いる。本発明に用いるポリペプチドの精製には、細胞又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
【００１７】
本発明でいうサイトカイン類とは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から選ばれる１種又は２種以上のサイトカイン類を意味し、また、本発明でいうケモカイン類とは、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物（ＲＡＮＴＥＳ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）及びマクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）から選ばれる１種又は２種以上のケモカイン類を意味する。前述のとおり、本発明に用いるポリペプチドは、これら哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカインの産生を増強する作用を有することから、例えば、医薬品などの分野において斯かる作用を有する物質を必要とする用途において有利に利用できる。医薬品の分野においては、血小板増多因子として有用である。さらには、ケモカイン類の生産に有利に利用できることから、炎症の軽減剤として利用することができ、皮膚外用剤の形態として、アトピー性皮膚炎、接触性過敏症の軽減、又はそれに伴う皮膚の炎症を軽減することに利用できる。なお、本発明で用いるポリペプチドは本来哺乳類に由来するものであることから、毒性も極めて低く安全な物質である。
【００１８】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、有効成分であるポリペプチドの含量が高いほど著明なサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を示す。ポリペプチドは高度に精製したものであっても、また、部分精製したものであっても良いものの、顕著なサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を有する剤を得るためには、後記実施例で示すように、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強試験において、ポリペプチド濃度１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを用いた場合、ポリペプチドを添加しない場合に比べてサイトカイン類又はケモカイン類の相対産生量を２倍以上増加させるレベルにまでポリペプチドの含量を高めるのが望ましい。
【００１９】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の使用方法について説明すると、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、細胞培養法により各種サイトカイン又はケモカインを製造する際、培地中に加える誘導剤として用いることができる。すなわち、哺乳類の皮膚、口腔、骨髄、血液などから分離される間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮細胞や血液系細胞、あるいは、例えば、ＭＥＦ細胞、Ｊ７７４Ａ．１細胞などの株化された細胞を、この発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約０．１ｎｇ乃至１００μｇ、望ましくは約１μｇ乃至５０μｇ含む適宜の培養培地で培養する。必要に応じて、培養培地にマイトジェンなどの細胞刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物を、生理活性物質を精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用することにより、各種サイトカインあるいはケモカインを採取することができる。
【００２０】
また、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、生体に投与することにより、血小板減少症や生体組織障害における治療剤として、さらには外来微生物による感染を防御する予防剤として用いることができる。血小板減少症、組織障害、感染の治療・予防のためには、哺乳類の体内に本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を直接塗布又は投与すれば良い。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の有効成分であるポリペプチドとしての有効な投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などによって異なるものの、具体的には、この発明のポリペプチドを投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経口又は経粘膜投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、有効成分であるポリペプチドとして、通常１乃至１０００μｇ／回、望ましくは、１０乃至５００μｇ／回、１日１回または数回に分けて、症状、投与形態に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて投与すればよい。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であってもよい。本発明の有効成分であるポリペプチドは毒性がきわめて低いことから、大量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のサイトカインあるいはケモカインを迅速に誘導できる利点がある。
【００２１】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物は、医薬品の形態としても有利に利用できる。本発明によるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤には、必要に応じてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を有するポリペプチド以外のもの、すなわち、ヒトを含む哺乳類のための医薬品への適用が許容される成分として、個々の利用分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、線維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、安定化剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤などの成分を１種または２種以上含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、通常、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の、各々の利用分野における必要性に応じて適宜選択される。以上のような成分を含む本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ゼリー、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
【００２２】
前記糖質としては、ブドウ糖、果糖、ラクトース、トレハロース、マルトース、蔗糖、ラクトスクロース、水飴などの糖類、サイクロデキストリン、環状四糖などの環状の糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、還元水飴などの糖アルコール類、プルラン、カラギーナン、などの天然多糖類、天然ガム類、カルボキシメチルセルロースなどの１種または２種以上を添加することにより、固状のものにあってはその賦形性に有利に利用できるだけでなく、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の安定化などに有利に利用できる。
【００２３】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を製造するには、対象とする動物類やその投与方法などに応じて選ばれる適宜の組成にしたがって、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤と、以上に示したような、医薬品の分野において使用が認められている１種又は２種以上の成分とを、個々の含量に基づいて、目的に応じて混合し、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を適宜実施し、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を調製し、必要に応じて所望の形状に成形すればよい。各成分を配合する順序や、上記の工程を実施する時期は、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の品質劣化をきたさないのであれば特に制限はなく、必要に応じて上記のいずれかの工程を適宜実施すればよい。
【００２４】
望ましい医薬品の形態として用いる場合には、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リモナーデ剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤などが挙げられる。以上のような形態の本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程でのサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強作用の減衰を防ぐことができる。以上のような本発明の組成物は、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤を、製品重量あたり、通常、０．０１質量％以上、望ましくは、０．１乃至１００質量％含有する。
【００２５】
以上のように本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、哺乳類の間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮系細胞及び／又はマクロファージ系細胞を含む血液系細胞のサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するので、利用した生体においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用が効果的に発揮され、重篤な副作用を惹起することなく、血小板の増多効果、病原体の感染防御効果、アレルギー抑制効果などが達成される。
【００２６】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得たマウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ、すなわち、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを用い、マウス胎児由来間葉系細胞（ＭＥＦ細胞）又はマウスマクロファージ系細胞（Ｊ７７４Ａ．１細胞）におけるＩＬ−６の産生増強作用を検討した。常法に従い、２４穴マイクロプレートにＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞を約２×１０４個／ｍｌの濃度で２ｍｌの１０％牛胎児血清Ｄ−ＭＥＭ培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で１晩培養した。次いで、増殖したＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞に、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を終濃度０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清ダルベッコ変法イーグル培地(Ｄ−ＭＥＭ培地、日水製薬株式会社製)を２ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、培養液上清中のＩＬ−６蛋白の量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定した。なお、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表１の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞では、無添加系（対照）に比べ１μｇ／ｍｌの濃度で約１．３倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約４．８倍と、用量依存的にＩＬ−６の産生を増強した。一方、ＭＥＦ細胞においても、無添加系でＩＬ−６の産生量はＥＬＩＳＡの検出限界以下であったのに対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で０．７２ｎｇ／ｍｌとＩＬ−６の産生を増強した。本試験において、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは用量依存的にＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に増強することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、間葉系細胞及びマクロファージ系細胞のＩＬ−６の産生を顕著に増強することから、血小板増多因子として用いることができる。
【実施例２】
【００３０】
＜ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬのヒト新生児由来間葉系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例７に開示された方法で調製及び精製して得た、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ、すなわち、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端部位に配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＦＬＡＧ配列）を有するペプチドが結合したアミノ酸配列を有するポリペプチドを用い、ヒト新生児由来間葉系細胞（ＮＨＤＦ細胞）におけるＩＬ−６の産生増強作用を検討した。常法に従い、６穴マイクロプレートにＮＨＤＦ細胞を約５×１０５個／ｍｌの濃度で２ｍｌの１０％牛胎児血清Ｄ−ＭＥＭ培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で１晩培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦ細胞に、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を終濃度１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、培養液上清中のＩＬ−６蛋白の量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定した。なお、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
表２の結果から明らかなようにヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、ＮＨＤＦ細胞において、１μｇ／ｍｌの濃度で無添加系（対照）の約４倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約１．９倍と、ＩＬ−６の産生を増強した。本試験において、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬはＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に促進することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、間葉系細胞のＩＬ−６の産生を顕著に促進することから、血小板増多因子として用いることができる。
【実施例３】
【００３３】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）産生増強作用＞
実施例１の方法で得たＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞の培養上清を用い、培養液上清中のＭ−ＣＳＦ蛋白の量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。結果を表３示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
表３の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞では、無添加系（対照）に比べ１μｇ／ｍｌの濃度で約１．６倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約３．７倍と、用量依存的にＭ−ＣＳＦの産生を増強した。一方、ＭＥＦ細胞においては、無添加系と産生量に差は認められなかった。本試験において、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは用量依存的にＪ７７４Ａ．１細胞におけるＭ−ＣＳＦの産生を顕著に増強することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、マクロファージ系細胞におけるＭ−ＣＳＦの産生を顕著に増強することから、血小板増多剤として用いることができる。
【実施例４】
【００３６】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）産生増強作用＞
マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を１０μｇ／ｍｌの濃度でのみ用いた以外は実施例１と同様に操作し、培養液上清中のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）蛋白の量及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）蛋白の量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。なお、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果をそれぞれ表４及び表５に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
表４の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−１α及びＩＬ−１βの産生量を、無添加系（対照）に比べ、それぞれ約９倍及び約１．６倍に増強した。一方、ＭＥＦ細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。また、表５の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＴＮＦ−αの産生量を、無添加系（対照）に比べ、検出限界を考慮すると約４７０倍以上に増強した。一方、ＭＥＦ細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。本発明に用いるポリペプチドは、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αなどのサイトカイン類の産生を増強することから、血小板増多剤としてとして、または組織修復剤として医薬品分野で有用である。
【実施例５】
【００４０】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるケモカイン類産生増強作用＞
実施例１の方法で得たＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞の培養上清を用い、培養液上清中のケモカイン類の産生量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）にて測定した。ケモカイン類としては、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰについて調べ、それぞれＥＩＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。結果を表６、７、８及び９にそれぞれ示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
表６及び表７の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞におけるＳＤＦ−１及びＩＬ−８の産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約２倍及び約２１０倍に増強した。一方、Ｊ７７４Ａ．１細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。また、表８の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞におけるＲＡＮＴＥＳの産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約１６０倍及び約３２倍に増強した。さらに、表９の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞においてＭＩＰの産生量が無添加系（対照）で検出限界以下であったのに対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で０．０２ｎｇ／ｍｌにまで増強し、Ｊ７７４Ａ．１細胞においてはＭＩＰの産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約１８倍に増強した。本発明に用いるポリペプチドは、ＳＤＦ−１、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰなどケモカイン類の産生を増強することから、病原体の感染防御剤として医薬品分野で有用である。
【実施例６】
【００４６】
＜マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１のマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書に開示されたマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をＣＯＳ−１細胞の膜表面に発現させ、このＣＯＳ−１細胞をマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞と共培養することによりマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１のＩＬ−６の産生増強作用を検討した。比較を行う目的でマウス由来分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂについても同様に行った。
【００４７】
＜実施例６−１：マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの発現用ベクターの構築＞
発現ベクター構築用の膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードするＤＮＡ及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂをコードするＤＮＡは、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書のそれぞれ実施例３及び実施例４に開示された組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３及びｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１をそれぞれ鋳型として用い作製した。それぞれのプラスミド１０ｎｇを鋳型とし、ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３に対しては、配列表における配列番号８で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号９で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行なった。一方、ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１に対しては配列表における配列番号１０で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列番号１１で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行なった。それぞれより得られた２種類の増幅断片は、それぞれポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＣａｍＳＫ（＋）(株式会社ストラタジーン製)のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により増幅断片の塩基配列の確認を行なった結果、計画通り膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードするＤＮＡは配列表における配列番号６、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂをコードするＤＮＡは配列表における配列番号５で示される塩基配列の５´末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３´末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切りだし、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例５−１に開示した方法と同様に発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロジェン株式会社製）のＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１の発現ベクターをｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４と、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの発現ベクターをｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４ｂと命名した。
【００４８】
＜実施例６−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換とマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１の発現＞
実施例６−１で得た発現ベクターｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４又はｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４ｂを、リポフェクション用遺伝子導入剤（商品名「リポフェクトアミン２０００」、インビトロジェン株式会社製）を用いて以下の様にＣＯＳ−１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ０．８μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン株式会社製）で希釈して５０μｌとしたものと、リポフェクトアミン３μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈して５０μｌとし、室温で5分間放置したものを合わせて室温で２０分間反応させ、ＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体を形成させた。次いで２４穴プレートに６×１０４個／ウェルの濃度で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤ−ＭＥＭ培地でまきこみ、一晩培養しておいたＣＯＳ−１細胞の培養上清を取り除き、ＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体１００μｌと０．４ｍｌ無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を添加した。コントロールは発現ベクターｐＣＤＭ８のみをトランスフェクションした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で５時間培養し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１が発現したＣＯＳ−１細胞及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞を得た。
【００４９】
＜実施例６−３：マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１又は分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞とマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞との共培養におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
実施例６−２で得た膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１が発現したＣＯＳ−１細胞及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞の培養液より培養上清を取り除き、２ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地にＭＥＦ細胞あるいはＪ７７４Ａ．１細胞をそれぞれ１×１０５個／ウェル、４×１０５個／ウェルとなるように調製し、培地交換と同時に共培養を開始した。培養３日後に培養上清を回収し、ＥＩＡで上清中に含まれるＩＬ−６の濃度を測定した。なお、上記いずれのポリペプチドも発現していないＣＯＳ−１細胞についても同様な操作を行い対照とした。結果を表１０に示す。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
表１０の結果から明らかなように、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞又は分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞のいずれも、共培養することによりＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞のいずれにおいてもＩＬ−６の産生を増強することが判明した。ＭＥＦ細胞におけるＩＬ−６産生量は、対照に対し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞の場合約１４０倍と、また、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞の場合約７０倍と多量であった。一方、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−６の産生量は、対照に対し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞の場合約５０倍、また、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞の場合約３０倍であった。配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１にもＩＬ−６産生増強作用が確認された。
【実施例７】
【００５２】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス皮膚創傷部位におけるサイトカイン類の産生増強作用＞
６週齢の雌ＩＣＲ／ＣＤ−１マウス１６匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線に８ｍｍの線状創を作成した。内８匹について国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得た配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを、創傷直後、６、２４、３０時間後の計４回にわたり創傷１箇所当たり５μｇ／１０μｌ−リン酸緩衝液ずつ投与した。また残り８匹についてはリン酸緩衝液をそれぞれ同様に投与して対照とした。創傷作成後、１日及び４日経過した時点でマウス４匹ずつより創傷部位の皮膚組織約５００ｍｇを切り出し、１５０ｍＭ食塩、１％界面活性剤（商品名「Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０」、ナカライテスク株式会社製）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤（商品名「コンプリート」、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液１ｍｌに懸濁した後、凍結融解を３回繰り返した後、ホモジナイザーを用いてホモジネートを調製した。ホモジネートの遠心分離上清中の形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の各サイトカイン量をそれぞれＥＩＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定し、上清蛋白１ｍｇ当たりの蛋白量に換算した。結果を表１１にそれぞれ示す。
【００５３】
【表１１】
【００５４】
表１１の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを投与した群においては、投与していない対照群に比べ、投与１日後でＴＧＦ−βが約３倍、ＶＥＧＦが約５倍と、また投与４日後ではＶＥＧＦが約２倍と産生量が顕著に多く、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂによる産生増強効果が確認された。本発明に用いるポリペプチドは、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどサイトカイン類の産生を増強することから、創傷治療時の組織修復剤などとして医薬品分野で有用である。
【実施例８】
【００５５】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける細胞浸潤抑制作用＞
常法に従い、ピクリルクロライド塗布によるアトピー性皮膚炎モデルマウスを作製した。すなわち、マウスの腹部の皮膚上皮に、１５０μｌの５％ピクリルクロライドを含有するエタノール／アセトン（４：１）溶液を塗布した。その５日後から、マウスの背中に１５０μｌの１％ピクリルクロライドを含有するオリーブオイルを塗布する操作を１週間間隔で８回行なうことで、アトピー性皮膚炎モデルマウスを作製した。国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得た配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを、常法にしたがって軟膏に調製し、これを２．５ｍｇ／ｋｇマウス体重の用量で、マウスの背中の皮膚上皮に、５％ピクリルクロライドを塗布してから１７乃至５５日後の間に週３回の頻度（合計１７回）投与した。ｍＡｇＫ１１４−１ｂを最後に投与してから２日後に、皮膚切片を作成し顕微鏡観察により評価した。対照として、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを含まない軟膏を塗布したアトピー性皮膚炎マウスの皮膚切片を用意した。その結果、対照のマウスの皮膚切片（図１）には、表皮内に浸潤した細胞（断面図上層部における黒い点）が観察されたが、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを投与したマウスの皮膚切片（図２）にはそのような浸潤した細胞はまったく観察されなかった。この結果から、ｍＡｇＫ１１４−１ｂは、皮膚に投与されることにより、皮膚における細胞浸潤を抑制し、皮膚炎の軽減作用を発揮することが明らかとなった。
【実施例９】
【００５６】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのアトピー性皮膚炎モデルマウスにおけるＩｇＥ産生抑制作用＞
１群５匹の８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを、マウス１匹当り１μｇ又は１０μｇの用量で週３回腹腔内投与した。対照として、マウス血清アルブミンを１０μｇの用量で同様にして投与した。第１週の３回目の投与後に、５％ピクリルクロライドを含むエタノールアセトン溶液（４：１）１５０μｌをマウス背部に塗布し、さらに、再感作として、５日後（再感作１回目）、１２日後（再感作２回目）、１９日後（再感作３回目）及び２６日後（再感作４回目）に、マウスの耳介に１％ピクリルクロライドを含むエタノールアセトン溶液（４：１）１００μｌを塗布した。再感作２回目、３回目及び４回目から６日後に、マウス尾静脈から血液を少量採血して、ＩｇＥ量を常法のＥＩＡ法で測定した。結果を表１２に示す。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
表１２の結果から明らかなように、４回目のピクリルクロライドの再感作により、血中のＩｇＥ量は２．２μｇ／ｍｌから１６μｇ／ｍｌに著しく増加するところ、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＩｇＥ量の増加を、８．９又は１１μｇ／ｍｌまでに抑制した。この結果は、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、アトピー性皮膚炎における著しいＩｇＥの産生亢進を抑制する効果を有し、アレルギーの緩和剤として有用であることを示している。
【実施例１０】
【００５９】
＜液剤＞
生理食塩水に実施例２で用いたヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を０．１質量％及びヒト血清アルブミンを０．１質量％になるよう溶解した後、溶液を常法に従って精密濾過により滅菌して液剤を得た。本品は、血小板増多剤として、また、病原体の感染防御剤として、アレルギー抑制剤として、医薬品分野で有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上、述べたように、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−１の産生を増強することから、癌などの化学療法や放射線療法、及び、骨髄移植などによって減少した血液細胞を増加させる用途で、また、生体外での造血細胞の増幅する用途などで、医薬品分野において血液および血小板増多剤として有用である。また、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類の産生を増強することから、創傷治療時の組織修復剤などとして有用である。さらに、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも増強することから、アトピー性皮膚炎などのアレルギーの軽減剤や細菌感染防御剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】対照のマウスの皮膚切片の顕微鏡写真のデジタル画像をディスプレー上に表示した中間調画像を示す図である。
【図２】ｍＡｇＫ１１４−１ｂを塗布したマウスの皮膚切片の顕微鏡写真のデジタル画像をディスプレー上に表示した中間調画像を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤に関するものであり、より詳細には、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体は外界からの物理的、化学的、生物学的侵襲に対して、様々なサイトカイン類やケモカイン類が関与する生体防御反応を示す。しかしながら、何らかの原因で生体が正常に機能できない状態、例えば、老化、癌、癌治療後の化学療法、感染による体力低下時などには、外部からこれらサイトカイン類やケモカイン類を補うことで生体反応を補助する試みがなされている。
【０００３】
近年、問題となっている癌治療後の化学療法時における血小板減少に対する治療として、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の使用が期待されたものの、その効果は明確ではない（例えば、非特許文献１を参照）。炎症時に産生されることが知られているインターロイキン６（ＩＬ−６）は、血小板を増加させる作用と骨髄における巨核球を分化成熟させる作用を有していることが知られており、血小板減少患者において臨床的にも有用であると言われている。また、近年、単球・マクロファージの形成を刺激する因子として発見されたマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）も血小板増加作用を有することが見出され、化学療法後の血小板増多剤として期待されている。さらに、インターロイキン１（ＩＬ−１）も造血能を賦活する作用が知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３などを参照）。従って、血小板のみならず、他の造血系にも作用する自己のＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−１を、生体内若しくは生体外で効率よく産生させる方法があれば、遺伝子組換えなどの手法で工業的に製造されたＩＬ−６や他の各種因子を投与するよりも、患者にとってより副作用が軽減された状態で、血小板を増加させることが可能となる。
【０００４】
一方、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などのサイトカインは細胞の分化や増殖、組織の修復、血管新生などを誘導していることが知られており、コラーゲンやフィブロネクチンの産生を促進することから創傷時の組織回復や治療にその応用が期待されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４などを参照）。
【０００５】
さらに、近年の研究において、血球細胞を炎症局所に誘導する因子として発見されたケモカイン類が、細胞の遊走を刺激する以外にも新たな生物活性を有することが判明した。例えば、ストローマ細胞由来因子(ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１、ＳＤＦ−１)は主に胎生期の造血、心臓形成、脳形成、胃腸管の血管形成など器官形成に関与する多機能サイトカインとしての活性を有し、また、インターロイキン８（ＩＬ−８）は繊維芽細胞内のサイトメガロウイルスを抑制する活性を有し、さらに、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物(ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ、ＲＡＮＴＥＳ)やマクロファージ炎症蛋白（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＩＰ)はヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）の感染を抑制する活性を有することが見出された。また、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）感染抗原であるＤｕｆｆｙ抗原はほとんどのケモカインと結合すること、さらにＨＩＶはマクロファージやＴ細胞のケモカインレセプター(例えばＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰなどのレセプター)を認識して感染することが判明し、ケモカイン自身が病原体の感染をレセプターレベルで阻害する可能性が示されつつある（例えば、非特許文献５などを参照）。従って、ケモカイン類を、生体内若しくは生体外で効率よく産生させることができれば、ＨＩＶやその他の病原体による感染を予防するなどの効果が期待できる。
【０００６】
このような状況下、サイトカイン類やケモカイン類の生体内外での産生を増強する有効な方法が見出されれば、サイトカイン類やケモカイン類を製造する場合の誘導剤として有用であるばかりでなく、癌化学療法時の血小板減少の軽減や回復促進の強力な補助の手段、さらには生体の機能を利用した病原体の感染を未然に防ぐ感染防御の手段となり得ることから、サイトカイン類やケモカイン類の生体内外での産生を効率良く増強する手段が望まれている。
【０００７】
【非特許文献１】『医学のあゆみ』、医歯薬出版（株）発行、１９９９年、第１９０巻、第１０号、８９０頁乃至８９５頁
【非特許文献２】『サイトカイン療法−基礎・病態からのアプローチ−』、１９９２年、高久史麿編集、南江堂発行、７４頁乃至７９頁
【非特許文献３】『サイトカインのすべて』、臨床免疫(増刊)、１９９５年、科学評論社発行、第２７巻、第１６号、５５１頁乃至５６１頁
【非特許文献４】『実験医学』、１９９９年、羊土社発行、第１７巻、第６号、７２１頁乃至７２６頁
【非特許文献５】『検証！ケモカイン』、細胞工学、１９９８年、秀潤社発行、第１７巻、第７号、１０８２頁乃至１０８９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、哺乳類のサイトカイン類やケモカイン類の産生を効果的に増強する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、本発明者が国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書において開示したヒト由来ポリペプチドＡｇＫ１１４−１ａ、すなわち、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ及びｍＡｇＫ１１４−１、すなわち、それぞれ配列表における配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに着目し、これらのポリペプチドを生体外で哺乳類の間葉系細胞、上皮系細胞又はマクロファージ系細胞へ作用させると、これらの細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に増強することを見出し、また、ＩＬ−６と同様に血小板を回復させるサイトカインであるＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１、及び、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類、さらには、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも顕著に増強することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、哺乳類の細胞においてＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−１の産生を顕著に増強することから、これらのサイトカインによる造血作用を増強することができる。したがって、医薬品分野において、癌などの化学療法や放射線療法、又は、骨髄移植により減少した血小板などの血液細胞の数を増加させる用途に有用であり、さらには、生体外で造血細胞を増幅させたのち、生体に投与することにも利用することができる。また、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類の産生をも増強することから、創傷組織の修復に有用である。さらに、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも増強することから、アトピー性皮膚炎などの症状の軽減剤や、細菌などの感染防御剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、本発明と同一の出願人が国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書において開示した、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるものである。これらのポリペプチドは、それが上記したアミノ酸配列を有し、且つ、生体内外においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を発揮するものであるかぎり、その純度、由来、調製方法は問わない。なお、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、サイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するという性質を実質的に失わない範囲で配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換するか、１個乃至１０個のアミノ酸を欠失させるか、若しくは、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部に、１乃至６０個のアミノ酸が付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を有するものを意味し、例えば、１個又は複数個のアラニンをグリシンに置換したアミノ酸配列、１個又は複数個のアラニンが欠失又は付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。このようなアミノ酸配列が変異したポリペプチドは、部位特異的変異やランダム変異などのプロテインエンジニアリングの手法を用いて得ることができる。なお、哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカインの産生を増強する作用の有無は、例えば、ヒト新生児由来間葉系細胞（ＮＨＤＦ細胞）、マウス由来間葉系細胞（ＭＥＦ細胞）又はマウスマクロファージ系細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物上清中におけるサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生量を測定する方法によって判定することができる。
【００１３】
本発明に用いるポリペプチドは、前記のアミノ酸配列を有しており、哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強する限り、いかなるポリペプチドであろうと包含され、例えば、組換えＤＮＡ技術により創製されたポリペプチド、天然の給源由来のポリペプチド、又は化学的に合成されたポリペプチドなどのいずれであってもよく、さらには、当該ポリペプチドを、例えば、平均分子量５，０００乃至１０，０００のデキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性の天然高分子若しくは合成高分子を結合させるなどして人為的に化学修飾したものも有利に用いることができる。
【００１４】
これらのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれをコードするＤＮＡを用い、組換えＤＮＡ技術により斯かるポリペプチドの産生能を有する形質転換細胞や形質転換微生物を作製し、培養して細胞又は菌体内外に産生させ、製造することができる。本発明におけるＤＮＡとは、前記本発明に用いるポリペプチドをコードしているＤＮＡを意味する。本発明に用いるＤＮＡの例としては、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列表における配列番号４乃至６のいずれかで表される塩基配列か、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号４乃至６のいずれかで表される塩基配列の１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、あるいはそれらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。本発明に用いるＤＮＡの天然の給源としては、例えば、ヒトの胎盤細胞及びマウスの皮膚細胞が挙げられ、それらの細胞からは国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書に開示された方法により得ることができる。
【００１５】
また、本発明に用いるポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列に従い化学的に合成することにより調製することもできる。ペプチド合成法としては斯界で一般に用いられるペプチド自動合成装置を用いて全合成する方法か、又は、予めペプチド断片をいくつかのブロックに分けて合成しておき、酵素的又は化学的に縮合させて目的とするポリペプチドを得る方法のいずれもが、必要に応じて、有利に実施できる。
【００１６】
組換えＤＮＡ技術による調製、天然の給源からの調製、又はペプチド合成法による調製のいずれかによって得ることができる本発明に用いるポリペプチドの粗調製品は哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤としてそのまま使用可能ではあるものの、通常は使用に先立ち精製して用いる。本発明に用いるポリペプチドの精製には、細胞又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
【００１７】
本発明でいうサイトカイン類とは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から選ばれる１種又は２種以上のサイトカイン類を意味し、また、本発明でいうケモカイン類とは、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物（ＲＡＮＴＥＳ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）及びマクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）から選ばれる１種又は２種以上のケモカイン類を意味する。前述のとおり、本発明に用いるポリペプチドは、これら哺乳類のサイトカイン類及び／又はケモカインの産生を増強する作用を有することから、例えば、医薬品などの分野において斯かる作用を有する物質を必要とする用途において有利に利用できる。医薬品の分野においては、血小板増多因子として有用である。さらには、ケモカイン類の生産に有利に利用できることから、炎症の軽減剤として利用することができ、皮膚外用剤の形態として、アトピー性皮膚炎、接触性過敏症の軽減、又はそれに伴う皮膚の炎症を軽減することに利用できる。なお、本発明で用いるポリペプチドは本来哺乳類に由来するものであることから、毒性も極めて低く安全な物質である。
【００１８】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、有効成分であるポリペプチドの含量が高いほど著明なサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を示す。ポリペプチドは高度に精製したものであっても、また、部分精製したものであっても良いものの、顕著なサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を有する剤を得るためには、後記実施例で示すように、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強試験において、ポリペプチド濃度１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを用いた場合、ポリペプチドを添加しない場合に比べてサイトカイン類又はケモカイン類の相対産生量を２倍以上増加させるレベルにまでポリペプチドの含量を高めるのが望ましい。
【００１９】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の使用方法について説明すると、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、細胞培養法により各種サイトカイン又はケモカインを製造する際、培地中に加える誘導剤として用いることができる。すなわち、哺乳類の皮膚、口腔、骨髄、血液などから分離される間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮細胞や血液系細胞、あるいは、例えば、ＭＥＦ細胞、Ｊ７７４Ａ．１細胞などの株化された細胞を、この発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約０．１ｎｇ乃至１００μｇ、望ましくは約１μｇ乃至５０μｇ含む適宜の培養培地で培養する。必要に応じて、培養培地にマイトジェンなどの細胞刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物を、生理活性物質を精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用することにより、各種サイトカインあるいはケモカインを採取することができる。
【００２０】
また、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、生体に投与することにより、血小板減少症や生体組織障害における治療剤として、さらには外来微生物による感染を防御する予防剤として用いることができる。血小板減少症、組織障害、感染の治療・予防のためには、哺乳類の体内に本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を直接塗布又は投与すれば良い。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の有効成分であるポリペプチドとしての有効な投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などによって異なるものの、具体的には、この発明のポリペプチドを投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経口又は経粘膜投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、有効成分であるポリペプチドとして、通常１乃至１０００μｇ／回、望ましくは、１０乃至５００μｇ／回、１日１回または数回に分けて、症状、投与形態に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて投与すればよい。本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であってもよい。本発明の有効成分であるポリペプチドは毒性がきわめて低いことから、大量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のサイトカインあるいはケモカインを迅速に誘導できる利点がある。
【００２１】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物は、医薬品の形態としても有利に利用できる。本発明によるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤には、必要に応じてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用を有するポリペプチド以外のもの、すなわち、ヒトを含む哺乳類のための医薬品への適用が許容される成分として、個々の利用分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、線維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、安定化剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤などの成分を１種または２種以上含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、通常、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の、各々の利用分野における必要性に応じて適宜選択される。以上のような成分を含む本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ゼリー、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
【００２２】
前記糖質としては、ブドウ糖、果糖、ラクトース、トレハロース、マルトース、蔗糖、ラクトスクロース、水飴などの糖類、サイクロデキストリン、環状四糖などの環状の糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、還元水飴などの糖アルコール類、プルラン、カラギーナン、などの天然多糖類、天然ガム類、カルボキシメチルセルロースなどの１種または２種以上を添加することにより、固状のものにあってはその賦形性に有利に利用できるだけでなく、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の安定化などに有利に利用できる。
【００２３】
本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を製造するには、対象とする動物類やその投与方法などに応じて選ばれる適宜の組成にしたがって、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤と、以上に示したような、医薬品の分野において使用が認められている１種又は２種以上の成分とを、個々の含量に基づいて、目的に応じて混合し、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を適宜実施し、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を調製し、必要に応じて所望の形状に成形すればよい。各成分を配合する順序や、上記の工程を実施する時期は、サイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤の品質劣化をきたさないのであれば特に制限はなく、必要に応じて上記のいずれかの工程を適宜実施すればよい。
【００２４】
望ましい医薬品の形態として用いる場合には、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リモナーデ剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤などが挙げられる。以上のような形態の本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を配合してなる組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程でのサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強作用の減衰を防ぐことができる。以上のような本発明の組成物は、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤を、製品重量あたり、通常、０．０１質量％以上、望ましくは、０．１乃至１００質量％含有する。
【００２５】
以上のように本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤は、哺乳類の間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮系細胞及び／又はマクロファージ系細胞を含む血液系細胞のサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するので、利用した生体においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強作用が効果的に発揮され、重篤な副作用を惹起することなく、血小板の増多効果、病原体の感染防御効果、アレルギー抑制効果などが達成される。
【００２６】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得たマウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ、すなわち、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを用い、マウス胎児由来間葉系細胞（ＭＥＦ細胞）又はマウスマクロファージ系細胞（Ｊ７７４Ａ．１細胞）におけるＩＬ−６の産生増強作用を検討した。常法に従い、２４穴マイクロプレートにＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞を約２×１０４個／ｍｌの濃度で２ｍｌの１０％牛胎児血清Ｄ−ＭＥＭ培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で１晩培養した。次いで、増殖したＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞に、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を終濃度０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清ダルベッコ変法イーグル培地(Ｄ−ＭＥＭ培地、日水製薬株式会社製)を２ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、培養液上清中のＩＬ−６蛋白の量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定した。なお、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表１の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞では、無添加系（対照）に比べ１μｇ／ｍｌの濃度で約１．３倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約４．８倍と、用量依存的にＩＬ−６の産生を増強した。一方、ＭＥＦ細胞においても、無添加系でＩＬ−６の産生量はＥＬＩＳＡの検出限界以下であったのに対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で０．７２ｎｇ／ｍｌとＩＬ−６の産生を増強した。本試験において、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは用量依存的にＭＥＦ細胞又はＪ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に増強することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、間葉系細胞及びマクロファージ系細胞のＩＬ−６の産生を顕著に増強することから、血小板増多因子として用いることができる。
【実施例２】
【００３０】
＜ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬのヒト新生児由来間葉系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例７に開示された方法で調製及び精製して得た、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ、すなわち、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端部位に配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＦＬＡＧ配列）を有するペプチドが結合したアミノ酸配列を有するポリペプチドを用い、ヒト新生児由来間葉系細胞（ＮＨＤＦ細胞）におけるＩＬ−６の産生増強作用を検討した。常法に従い、６穴マイクロプレートにＮＨＤＦ細胞を約５×１０５個／ｍｌの濃度で２ｍｌの１０％牛胎児血清Ｄ−ＭＥＭ培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で１晩培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦ細胞に、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を終濃度１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、培養液上清中のＩＬ−６蛋白の量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定した。なお、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
表２の結果から明らかなようにヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、ＮＨＤＦ細胞において、１μｇ／ｍｌの濃度で無添加系（対照）の約４倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約１．９倍と、ＩＬ−６の産生を増強した。本試験において、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬはＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−６の産生を顕著に促進することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、間葉系細胞のＩＬ−６の産生を顕著に促進することから、血小板増多因子として用いることができる。
【実施例３】
【００３３】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）産生増強作用＞
実施例１の方法で得たＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞の培養上清を用い、培養液上清中のＭ−ＣＳＦ蛋白の量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。結果を表３示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
表３の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞では、無添加系（対照）に比べ１μｇ／ｍｌの濃度で約１．６倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で約３．７倍と、用量依存的にＭ−ＣＳＦの産生を増強した。一方、ＭＥＦ細胞においては、無添加系と産生量に差は認められなかった。本試験において、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは用量依存的にＪ７７４Ａ．１細胞におけるＭ−ＣＳＦの産生を顕著に増強することが判明した。本発明に用いるポリペプチドは、マクロファージ系細胞におけるＭ−ＣＳＦの産生を顕著に増強することから、血小板増多剤として用いることができる。
【実施例４】
【００３６】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）産生増強作用＞
マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を１０μｇ／ｍｌの濃度でのみ用いた以外は実施例１と同様に操作し、培養液上清中のインターロイキン１α（ＩＬ−１α）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）蛋白の量及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）蛋白の量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。なお、ｍＡｇＫ１１４−１ｂ精製標品を添加せず同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。結果をそれぞれ表４及び表５に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
表４の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−１α及びＩＬ−１βの産生量を、無添加系（対照）に比べ、それぞれ約９倍及び約１．６倍に増強した。一方、ＭＥＦ細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。また、表５の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＴＮＦ−αの産生量を、無添加系（対照）に比べ、検出限界を考慮すると約４７０倍以上に増強した。一方、ＭＥＦ細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。本発明に用いるポリペプチドは、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αなどのサイトカイン類の産生を増強することから、血小板増多剤としてとして、または組織修復剤として医薬品分野で有用である。
【実施例５】
【００４０】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるケモカイン類産生増強作用＞
実施例１の方法で得たＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞の培養上清を用い、培養液上清中のケモカイン類の産生量を酵素免疫測定（ＥＩＡ）にて測定した。ケモカイン類としては、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰについて調べ、それぞれＥＩＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定した。結果を表６、７、８及び９にそれぞれ示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
表６及び表７の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞におけるＳＤＦ−１及びＩＬ−８の産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約２倍及び約２１０倍に増強した。一方、Ｊ７７４Ａ．１細胞においてはこれらの産生増強作用は認められなかった。また、表８の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞におけるＲＡＮＴＥＳの産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約１６０倍及び約３２倍に増強した。さらに、表９の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＭＥＦ細胞においてＭＩＰの産生量が無添加系（対照）で検出限界以下であったのに対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で０．０２ｎｇ／ｍｌにまで増強し、Ｊ７７４Ａ．１細胞においてはＭＩＰの産生量を、無添加系（対照）に比べ、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ約１８倍に増強した。本発明に用いるポリペプチドは、ＳＤＦ−１、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰなどケモカイン類の産生を増強することから、病原体の感染防御剤として医薬品分野で有用である。
【実施例６】
【００４６】
＜マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１のマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書に開示されたマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をＣＯＳ−１細胞の膜表面に発現させ、このＣＯＳ−１細胞をマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞と共培養することによりマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１のＩＬ−６の産生増強作用を検討した。比較を行う目的でマウス由来分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂについても同様に行った。
【００４７】
＜実施例６−１：マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの発現用ベクターの構築＞
発現ベクター構築用の膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードするＤＮＡ及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂをコードするＤＮＡは、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書のそれぞれ実施例３及び実施例４に開示された組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３及びｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１をそれぞれ鋳型として用い作製した。それぞれのプラスミド１０ｎｇを鋳型とし、ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３に対しては、配列表における配列番号８で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号９で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行なった。一方、ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１に対しては配列表における配列番号１０で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列番号１１で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行なった。それぞれより得られた２種類の増幅断片は、それぞれポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＣａｍＳＫ（＋）(株式会社ストラタジーン製)のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により増幅断片の塩基配列の確認を行なった結果、計画通り膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードするＤＮＡは配列表における配列番号６、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂをコードするＤＮＡは配列表における配列番号５で示される塩基配列の５´末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３´末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切りだし、国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例５−１に開示した方法と同様に発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロジェン株式会社製）のＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１の発現ベクターをｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４と、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの発現ベクターをｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４ｂと命名した。
【００４８】
＜実施例６−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換とマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１の発現＞
実施例６−１で得た発現ベクターｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４又はｐＣＤ／ｍＡｇＫ１１４ｂを、リポフェクション用遺伝子導入剤（商品名「リポフェクトアミン２０００」、インビトロジェン株式会社製）を用いて以下の様にＣＯＳ−１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ０．８μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン株式会社製）で希釈して５０μｌとしたものと、リポフェクトアミン３μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈して５０μｌとし、室温で5分間放置したものを合わせて室温で２０分間反応させ、ＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体を形成させた。次いで２４穴プレートに６×１０４個／ウェルの濃度で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤ−ＭＥＭ培地でまきこみ、一晩培養しておいたＣＯＳ−１細胞の培養上清を取り除き、ＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体１００μｌと０．４ｍｌ無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を添加した。コントロールは発現ベクターｐＣＤＭ８のみをトランスフェクションした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で５時間培養し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１が発現したＣＯＳ−１細胞及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞を得た。
【００４９】
＜実施例６−３：マウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１又は分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞とマウス胎児由来間葉系細胞及びマクロファージ系細胞との共培養におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生増強作用＞
実施例６−２で得た膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１が発現したＣＯＳ−１細胞及び分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂが発現したＣＯＳ−１細胞の培養液より培養上清を取り除き、２ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地にＭＥＦ細胞あるいはＪ７７４Ａ．１細胞をそれぞれ１×１０５個／ウェル、４×１０５個／ウェルとなるように調製し、培地交換と同時に共培養を開始した。培養３日後に培養上清を回収し、ＥＩＡで上清中に含まれるＩＬ−６の濃度を測定した。なお、上記いずれのポリペプチドも発現していないＣＯＳ−１細胞についても同様な操作を行い対照とした。結果を表１０に示す。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
表１０の結果から明らかなように、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞又は分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞のいずれも、共培養することによりＭＥＦ細胞及びＪ７７４Ａ．１細胞のいずれにおいてもＩＬ−６の産生を増強することが判明した。ＭＥＦ細胞におけるＩＬ−６産生量は、対照に対し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞の場合約１４０倍と、また、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞の場合約７０倍と多量であった。一方、Ｊ７７４Ａ．１細胞におけるＩＬ−６の産生量は、対照に対し、膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１を発現したＣＯＳ−１細胞の場合約５０倍、また、分泌型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを発現したＣＯＳ−１細胞の場合約３０倍であった。配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するマウス由来膜結合型ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１にもＩＬ−６産生増強作用が確認された。
【実施例７】
【００５２】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのマウス皮膚創傷部位におけるサイトカイン類の産生増強作用＞
６週齢の雌ＩＣＲ／ＣＤ−１マウス１６匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線に８ｍｍの線状創を作成した。内８匹について国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得た配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを、創傷直後、６、２４、３０時間後の計４回にわたり創傷１箇所当たり５μｇ／１０μｌ−リン酸緩衝液ずつ投与した。また残り８匹についてはリン酸緩衝液をそれぞれ同様に投与して対照とした。創傷作成後、１日及び４日経過した時点でマウス４匹ずつより創傷部位の皮膚組織約５００ｍｇを切り出し、１５０ｍＭ食塩、１％界面活性剤（商品名「Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０」、ナカライテスク株式会社製）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤（商品名「コンプリート」、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液１ｍｌに懸濁した後、凍結融解を３回繰り返した後、ホモジナイザーを用いてホモジネートを調製した。ホモジネートの遠心分離上清中の形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の各サイトカイン量をそれぞれＥＩＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）にて測定し、上清蛋白１ｍｇ当たりの蛋白量に換算した。結果を表１１にそれぞれ示す。
【００５３】
【表１１】
【００５４】
表１１の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを投与した群においては、投与していない対照群に比べ、投与１日後でＴＧＦ−βが約３倍、ＶＥＧＦが約５倍と、また投与４日後ではＶＥＧＦが約２倍と産生量が顕著に多く、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂによる産生増強効果が確認された。本発明に用いるポリペプチドは、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどサイトカイン類の産生を増強することから、創傷治療時の組織修復剤などとして医薬品分野で有用である。
【実施例８】
【００５５】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける細胞浸潤抑制作用＞
常法に従い、ピクリルクロライド塗布によるアトピー性皮膚炎モデルマウスを作製した。すなわち、マウスの腹部の皮膚上皮に、１５０μｌの５％ピクリルクロライドを含有するエタノール／アセトン（４：１）溶液を塗布した。その５日後から、マウスの背中に１５０μｌの１％ピクリルクロライドを含有するオリーブオイルを塗布する操作を１週間間隔で８回行なうことで、アトピー性皮膚炎モデルマウスを作製した。国際公開 ＷＯ ２００４／０４２０５６号明細書の実施例１０に開示された方法で調製及び精製して得た配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂを、常法にしたがって軟膏に調製し、これを２．５ｍｇ／ｋｇマウス体重の用量で、マウスの背中の皮膚上皮に、５％ピクリルクロライドを塗布してから１７乃至５５日後の間に週３回の頻度（合計１７回）投与した。ｍＡｇＫ１１４−１ｂを最後に投与してから２日後に、皮膚切片を作成し顕微鏡観察により評価した。対照として、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを含まない軟膏を塗布したアトピー性皮膚炎マウスの皮膚切片を用意した。その結果、対照のマウスの皮膚切片（図１）には、表皮内に浸潤した細胞（断面図上層部における黒い点）が観察されたが、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを投与したマウスの皮膚切片（図２）にはそのような浸潤した細胞はまったく観察されなかった。この結果から、ｍＡｇＫ１１４−１ｂは、皮膚に投与されることにより、皮膚における細胞浸潤を抑制し、皮膚炎の軽減作用を発揮することが明らかとなった。
【実施例９】
【００５６】
＜マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂのアトピー性皮膚炎モデルマウスにおけるＩｇＥ産生抑制作用＞
１群５匹の８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｍＡｇＫ１１４−１ｂを、マウス１匹当り１μｇ又は１０μｇの用量で週３回腹腔内投与した。対照として、マウス血清アルブミンを１０μｇの用量で同様にして投与した。第１週の３回目の投与後に、５％ピクリルクロライドを含むエタノールアセトン溶液（４：１）１５０μｌをマウス背部に塗布し、さらに、再感作として、５日後（再感作１回目）、１２日後（再感作２回目）、１９日後（再感作３回目）及び２６日後（再感作４回目）に、マウスの耳介に１％ピクリルクロライドを含むエタノールアセトン溶液（４：１）１００μｌを塗布した。再感作２回目、３回目及び４回目から６日後に、マウス尾静脈から血液を少量採血して、ＩｇＥ量を常法のＥＩＡ法で測定した。結果を表１２に示す。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
表１２の結果から明らかなように、４回目のピクリルクロライドの再感作により、血中のＩｇＥ量は２．２μｇ／ｍｌから１６μｇ／ｍｌに著しく増加するところ、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、ＩｇＥ量の増加を、８．９又は１１μｇ／ｍｌまでに抑制した。この結果は、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂは、アトピー性皮膚炎における著しいＩｇＥの産生亢進を抑制する効果を有し、アレルギーの緩和剤として有用であることを示している。
【実施例１０】
【００５９】
＜液剤＞
生理食塩水に実施例２で用いたヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を０．１質量％及びヒト血清アルブミンを０．１質量％になるよう溶解した後、溶液を常法に従って精密濾過により滅菌して液剤を得た。本品は、血小板増多剤として、また、病原体の感染防御剤として、アレルギー抑制剤として、医薬品分野で有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上、述べたように、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−１の産生を増強することから、癌などの化学療法や放射線療法、及び、骨髄移植などによって減少した血液細胞を増加させる用途で、また、生体外での造血細胞の増幅する用途などで、医薬品分野において血液および血小板増多剤として有用である。また、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦなどのサイトカイン類の産生を増強することから、創傷治療時の組織修復剤などとして有用である。さらに、本発明のサイトカイン類及び／又はケモカイン産生増強剤は、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰなどのケモカイン類の産生をも増強することから、アトピー性皮膚炎などのアレルギーの軽減剤や細菌感染防御剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】対照のマウスの皮膚切片の顕微鏡写真のデジタル画像をディスプレー上に表示した中間調画像を示す図である。
【図２】ｍＡｇＫ１１４−１ｂを塗布したマウスの皮膚切片の顕微鏡写真のデジタル画像をディスプレー上に表示した中間調画像を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項２】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項３】
ポリペプチドが、哺乳類の間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮系細胞又はマクロファージ系細胞を含む血液系細胞においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するポリペプチドである請求項１又は２記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列における１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、若しくはそれらの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡを人為的に発現させることにより得られるポリペプチドである請求項１記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項５】
サイトカイン類が、インターロイキン６（ＩＬ−６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から選ばれる１種又は２種以上である請求項１乃至４のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項６】
ケモカイン類が、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物（ＲＡＮＴＥＳ）及びマクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）から選ばれる１種又は２種以上である請求項１乃至５のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を含有せしめた医薬品。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を有効成分とする血小板増多剤。
【請求項９】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなるアレルギー抑制剤。
【請求項１】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項２】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、生物活性を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含んでなるサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項３】
ポリペプチドが、哺乳類の間葉系細胞、繊維芽細胞、上皮系細胞又はマクロファージ系細胞を含む血液系細胞においてサイトカイン類及び／又はケモカイン類の産生を増強するポリペプチドである請求項１又は２記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列における１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、若しくはそれらの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡを人為的に発現させることにより得られるポリペプチドである請求項１記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項５】
サイトカイン類が、インターロイキン６（ＩＬ−６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から選ばれる１種又は２種以上である請求項１乃至４のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項６】
ケモカイン類が、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物（ＲＡＮＴＥＳ）及びマクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）から選ばれる１種又は２種以上である請求項１乃至５のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を含有せしめた医薬品。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載のサイトカイン類及び／又はケモカイン類産生増強剤を有効成分とする血小板増多剤。
【請求項９】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなるアレルギー抑制剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１３７７４７（Ｐ２００６−１３７７４７Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９９５７１（Ｐ２００５−２９９５７１）
【出願日】平成１７年１０月１４日（２００５．１０．１４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１４日（２００５．１０．１４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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