サルモネラマーカーワクチン
本発明は、不活性化遺伝子を有するマーカーワクチンとして適切なサルモネラ株に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活性化ｐｈｏＮ遺伝子を有するサルモネラ株に関する。特に本発明は、ΔｐｈｏＮ Salmonella enterica生存減弱化ワクチン株の調製方法に関する。更に本発明は、サルモネラ感染動物からワクチン化動物を識別するための、組換えサルモネラタンパク質ｐｈｏＮを使用する血清学的試験システムに関する。更に、細菌学的試験システムがＤＩＶＡのために開示される。
【０００２】
本発明は更に、Salmonella enterica ssp. 血清型Enteritidis株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）、及びSalmonella Enteritidis感染の予防のための家禽の処理のための、及び／またはさらなる病原体に対して家畜類を保護する多価組換えサルモネラキャリアーワクチンの調製のための生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラマーカーワクチン株としての前記株の使用に関する。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、血清学的及び／または細菌学的手段によって、ワクチン化動物からの感染動物の識別（Differentiation of infected from Vaccinated Animal；ＤＩＶＡ）が可能である。
【背景技術】
【０００３】
非腸チフスサルモネラ症は、動物及びヒトにおける広くいきわたった疾患である。ヒトでは、家禽類及びブタの製品から主として発生する最も一般的な食品媒介疾患である。欧州連合では、食物連鎖への病原性Salmonella ssp.の取り込みを減少すべき監視システムが確立されるであろう（規則ＥＣ２１６０／２００３）。ワクチン接種は、家畜における病原性Salmonella ssp.の流行を減少し、かくして伝播速度を最小化するであろう。抗サルモネラワクチンは、例えば産卵鶏及びブタに対して市販されている。ワクチンは、細菌であるか生存減弱化サルモネラワクチンである。産卵鶏では、これらのワクチンを使用して、病原体の卵内伝播と糞への流出を減少する。
【０００４】
生存減弱化サルモネラワクチンの効力は、細菌ワクチンより優れていることが見出されている。家畜に対する生存減弱化サルモネラワクチンの好ましい使用は、ＥＣ２１６０／２００３の規則と一致するワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）の方法を要求している。
【０００５】
認可されている生存減弱化サルモネラワクチンの主なものは、化学的なミュータジェネシスによってSalmonella enterica ssp. enterica 血清型の規定された野生型単離物から調製される。現在では、生存減弱化サルモネラワクチンは、細菌学的手段によって野生型Salmonella ssp.から識別される。これらの方法は長時間を必要とする労力の要するものである。ワクチン化動物と感染動物の血清学的識別は非常に好ましいであろう。現在利用可能な生存減弱化サルモネラワクチンは、ＤＩＶＡストラテジーに従った血清学的識別を可能にしない。
【０００６】
ＤＩＶＡ生ワクチンは、ウイルス感染の予防のために家畜において成功して使用されている。
マーカーワクチンは、ポジティブマーカーまたはネガティブマーカーとしてのいずれかで調製できる。ポジティブマーカーワクチンは、ワクチン化動物では特異的な抗体を誘導するが感染動物では誘導しないさらなる抗原を含む。後の感染を有するワクチン化動物を単なるワクチン化動物から識別できないため、ポジティブマーカーワクチンは明らかに不利である。
【０００７】
ネガティブマーカーワクチンは、感染動物で特異的な抗体を誘導する抗原の除去によって調製される。かくしてネガティブマーカーワクチンは、感染動物のものとは異なるワクチン化動物における体液性免疫応答を誘導する。理想的にはこの差異は、血清学的手段によって検出できる。ポジティブマーカーワクチンとは対照的に、ネガティブマーカーワクチンは、後に感染するようになったワクチン化動物の同定が可能である。
【０００８】
ネガティブマーカー抗原の選択には、いくつかの観点が考慮されなければならない：前記抗原は免疫原性でなければならないが、病原体に対して動物を保護する免疫反応に関与してはならない。かくして、マーカー抗原をコードする遺伝子の除去または不活性化は、ワクチン株の免疫原性を維持しなければならない。最後に、家畜に出現して体液性免疫応答を誘導する可能性のある他の生物によって誘導される偽のポジティブな血清学的結果を避けるために、マーカー抗原は病原体に特異的であるべきである。
【０００９】
ウイルスワクチンとは対照的に生存減弱化細菌ワクチンの高度な複雑性のため、生存減弱化細菌マーカーワクチンの開発のためにはずっと多大な努力が必要である。ネガティブサルモネラマーカーワクチンの第一の候補は、高度に免疫原性の表面抗原の遺伝子を欠失することによって、生存減弱化サルモネラワクチン株から確立された。これらの生存減弱化サルモネラＤＮＡワクチンは、血清学的手段によってワクチン化動物から感染動物を識別することができた。しかしながらこれらのプロトタイプは、元となるワクチン株よりもずっと保護的ではなかった。
【００１０】
ｐｈｏＮ遺伝子は非特異的な酸性ホスファターゼをコードし、それは全てのSalmonella ssp.で広く提示されることが見出されている。ｐｈｏＮ遺伝子は、ＰｈｏＰＱレギュロンの制御下で発現され、後者はサルモネラにおける毒性遺伝子のための一般的な調節因子である。ｐｈｏＮが動物におけるサルモネラの生存に必須であるかは未知である。
【００１１】
ＰｈｏＰＱレギュロンへのｐｈｏＮのリンケージは、サルモネラが宿主組織を占有する際はいつでも、ｐｈｏＮが活性化されることを示すであろう。かくして、生存減弱化サルモネラワクチン株におけるｐｈｏＮ遺伝子の除去または不活性化が、ワクチン化動物における保護的免疫性を誘導する能力にネガティブに影響する可能性があるかどうかという疑問が残っている。生存減弱化サルモネラワクチン株における単一の遺伝子の欠失が残存している毒性を更に減少し、それが宿主の免疫応答の刺激を減少させ、その結果保護的免疫を阻害するかもしれないことが既知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl Wschr. 113, 246-252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、当該技術分野のワクチンの上述の欠点を少なくとも部分的に解消するネガティブマーカーワクチンとして適切なサルモネラ株を提供することである。
【００１４】
本発明では、サルモネラＤＩＶＡワクチンの調製のための標的として、ｐｈｏＮ遺伝子が選択された。驚くべきことに、ｐｈｏＮ遺伝子は、生ワクチンとして特に適切なｐｈｏＮ欠損サルモネラ株を作製する特徴の組み合わせを提供する。
【００１５】
第一の驚くべき特徴は、サルモネラと比較した全てのサルモネラではない細菌におけるＰｈｏＮタンパク質の構造の差異である。他方で、ＰｈｏＮアミノ酸配列は、各種のサルモネラ種において少なくとも９５％の同一性（アミノ酸配列の全量に対して計算される）の度合いを有する。
【００１６】
第二の驚くべき特徴は、ＰｈｏＮが免疫原性であるという事実である。Salmonella ssp.で感染されたチキン及びマウス由来の血清の分析により、精製ＰｈｏＮタンパク質に特異的に結合する抗体の出現が明白に明らかにされた。この結果は、ＰｈｏＮが免疫原性であり、サルモネラに感染した鳥類及び哺乳類を検出するための血清学的マーカー抗原として使用できるという最初の証拠を提供する。サルモネラワクチン株においてｐｈｏＮ遺伝子の発現を破壊すると、これは血清学的手段によりワクチン化動物から感染動物を識別することを可能にするであろう。かくして、ＰｈｏＮ抗原を欠損したサルモネラ生ワクチンによってワクチン化された動物は、ＰｈｏＮ特異的抗体を生産しない一方、野生型サルモネラで感染された動物ではこの抗体を生産するであろう。
【００１７】
第三の驚くべき特徴は、生存減弱化サルモネラワクチン株のｐｈｏＮ遺伝子の除去は、ワクチン株の毒性を更に減少させるかもしれないが、その免疫原性と同種血清型のサルモネラ感染からワクチン化チキンを保護する効力には影響しないという事実である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第一の主題は、不活性化ｐｈｏＮ遺伝子を有するサルモネラ株である。これはΔｐｈｏＮによってここで記載される。ΔｐｈｏＮサルモネラ株は、本質的にｐｈｏＮ活性を有さない。分子生物学界の当業者であれば、サルモネラのような細菌における遺伝子不活性化の方法は既知である。
【００１９】
ｐｈｏＮの不活性化は、ｐｈｏＮ遺伝子の欠損または／及び修飾を含む。特に本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質、またはＰｈｏＮタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘導できるＰｈｏＮタンパク質の断片を実質的に生産しない、即ち本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関して免疫原性ではない。ｐｈｏＮ遺伝子は、完全にまたは少なくとも部分的に欠失されて良い。ｐｈｏＮ遺伝子の部分的な欠失は、ｐｈｏＮ遺伝子の全長配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の欠失であって良い。ｐｈｏＮ遺伝子配列が部分的に欠失されているのであれば、残余の配列は好ましくは、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片、特にここに記載される免疫原性断片を発現できない。
【００２０】
ｐｈｏＮ遺伝子配列の修飾は配列置換を含む。ｐｈｏＮ遺伝子は、別の配列によって完全に置換されて良い。ｐｈｏＮ遺伝子の欠失配列は、他の配列によって完全にまたは部分的に置換されて良い。
【００２１】
ｐｈｏＮ遺伝子のコード配列（オープンリーディングフレーム）は、完全にまたは少なくとも部分的に欠失されて良い。ｐｈｏＮコード配列の部分的な欠失は、全長ｐｈｏＮコード配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列の欠失であって良い。ｐｈｏＮコード配列が部分的に欠失されているのであれば、残余の配列は好ましくは、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片、特にここに記載される免疫原性断片を発現できない。
【００２２】
ｐｈｏＮコード配列の修飾は配列置換を含む。ｐｈｏＮコード配列は、別の配列によって完全に置換されて良い。ｐｈｏＮコード配列の欠失配列は、他の配列によって完全にまたは部分的に置換されて良い。
【００２３】
サルモネラにおけるｐｈｏＮポリペプチドの配列の典型的な例は、図１に記載されている（配列番号１〜２０）。サルモネラｐｈｏＮ遺伝子ローカスの典型的な例は図２に示されており、それはｐｈｏＮオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ｐｈｏＮ ＯＲＦの上流または／及び下流の調節配列を含む（配列番号２３〜２７）。
【００２４】
本発明のｐｈｏＮポリペプチドの断片は、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０のアミノ酸残基の長さを有して良い。それらは最大で２００、最大で１５０、または最大で１００アミノ酸残基の長さを有して良い。断片は免疫原性断片（ここで免疫原性部分とも称される）を含む。
【００２５】
ｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、ここで記載されている通り、例えばｐｈｏＮコード領域の完全なまたは少なくとも部分的な欠失による、またはｐｈｏＮコード領域の置換による、不可逆的な不活性化である。特に不可逆的な不活性化は、本発明のサルモネラ株が野生型ｐｈｏＮ遺伝子型に戻ることを防止する。
【００２６】
上述のように、本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質に対する免疫応答を誘導できるＰｈｏＮタンパク質を実質的に生産しない、即ち本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関して免疫原性ではない。ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関する免疫原性は、本発明のサルモネラ株で処理されるいずれかの種における免疫原性であって良い。特にＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関する免疫原性は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における免疫原性である。
【００２７】
当業者は、サルモネラ株または非サルモネラ株におけるＰｈｏＮポリペプチド及びｐｈｏＮ遺伝子を同定することができる。本発明では、サルモネラＰｈｏＮタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むタンパク質、または選択された配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性は選択された配列の長さに関して計算される。非サルモネラＰｈｏＮタンパク質は、EscherichiaまたはShigellaから得られるＰｈｏＮタンパク質であって良く、配列番号２１及び配列番号２２から選択された配列、または配列番号２１及び配列番号２２から選択された配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性は選択された配列の長さに関して計算される。
【００２８】
本発明に係る株を得るためにここに記載されたｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、Salmonella enterica ssp.から選択されて良い。サルモネラ株は、Salmonella enterica ssp. entericaの血清型から、例えば血清型Enteritidis、Dublin、Gallinarum、Typhimurium、Newport、Choleraesuis、Agona、Hadar、Heidelberg、Kentucky、Saintpaul、Virchow、Weltevreden、Javiana、Schwarzengrund、Paratyphi、及びTyphiから、または図１に挙げられた血清型から選択されて良い。
【００２９】
ここに記載されるｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、減弱化サルモネラ株、例えば生存減弱化サルモネラ株、例えば生存減弱化Salmonella enterica ssp. enterica血清型Enteritidis His- Ade-株、例えばSalmovac SE（Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl Wschr. 113, 246-252）またはその変異体であって良い。
【００３０】
ここに記載されるｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、認可された生存減弱化サルモネラワクチンに適用されても良い。これらの株は、家畜のサルモネラ感染を避け、同時にサルモネラに感染した家畜からワクチン化した家畜の識別を可能にするために、免疫原性に影響することなく生存減弱化サルモネラΔｐｈｏＮマーカーワクチンに形質転換されて良い。化学的なミュータジェネシス及び／または遺伝的な操作によって調製されている生存減弱化サルモネラワクチン株について、または少なくとも一つの更なる同種抗原、及び／または異種病原体の少なくとも一つの更なる抗原を発現するために、例えば担体として生存減弱化サルモネラワクチン株を使用するいずれかの組換えサルモネラワクチンアプローチについて、またはワクチン化のためにＤＮＡを送達する担体として使用される生存減弱化サルモネラワクチン株について、これらの形質転換法を適用することができる。
【００３１】
生存減弱化サルモネラワクチン株である、ここに記載されたｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、特に以下のものである：
（ｉ）化学的なミュータジェネシス及び／または遺伝的な操作によって調製されたワクチン株；
（ｉｉ）少なくとも一つの同種サルモネラ抗原、及び／または少なくとも一つの異種抗原、たとえば異種病原体の抗原を任意に組換え発現する組換えワクチン株；または
（ｉｉｉ）ＤＮＡを送達するための組換え担体株。
【００３２】
本発明の好ましいサルモネラ株は、Salmonella enterica enterica Enteritidis株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）、及びそれから由来するいずれかの株である。
【００３３】
本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、医薬、例えば獣医薬において使用されるものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、ワクチンとして使用するためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、生ワクチンとして使用のするためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にここに記載されるワクチン、とりわけＤＳＭ２１９７２株は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica sspでの感染に対する保護するためのワクチンとして使用するためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のためのものであって良い。
【００３４】
本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、医薬、例えば獣医薬における医薬の製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、ワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、生ワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にここに記載されるワクチン、とりわけＤＳＭ２１９７２株は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での感染に対して保護するためのワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のための医薬の製造のために使用されて良い。
【００３５】
本発明のワクチン、特にＤＳＭ２１９７２は、後のサルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での後の感染に対して保護するためのワクチン、及び更なる病原体に対して保護する多価組換えサルモネラ担体ワクチンを調製するためのワクチンであって良い。前記ワクチンは、少なくとも一つの同種サルモネラ抗原、及び／または少なくとも一つの異種抗原、たとえば異種病原体の抗原を任意に組換え発現する。前記ワクチンは、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽に対する投与に適したものであって良い。
【００３６】
本発明の主題は、本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株の、その必要のある被験者に対する投与を含む、サルモネラ感染の予防または／及び治療のための方法である。前記被験者は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽であって良い。
【００３７】
本発明の更なる主題は、本発明のサルモネラ株の、その必要のある被験者に対する投与を含む、病原体での感染の予防または／及び治療の方法であり、本発明のサルモネラ株は、この病原体に対する保護を与えるために調製され、例えば多価サルモネラ生ワクチンである。このサルモネラ株はＤＳＭ２１９７２から由来することが好ましい。前記被験者は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽であって良い。とりわけ前記病原体はサルモネラとは異なる。
【００３８】
本発明のまた別の主題は、サルモネラ株のｐｈｏＮ遺伝子を不活性化することを含む、ここに記載されるサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株の生産方法である。
【００３９】
上述のように、ｐｈｏＮの不活性化は、生存減弱化サルモネラワクチン株の毒性を更に減少しても良いが、形質転換されたサルモネラワクチン株の免疫原性には影響しない。それ故ｐｈｏＮ不活性化は、生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチン株を生産する適切な方法である。
【００４０】
生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの調製は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での感染に対して、例えば鳥類及び／または哺乳類家畜を保護することができるいずれかの生存減弱化サルモネラワクチン株から開始することができる。ＤＳＭ２１９７２の調製は、サルモネラＳＥ株の変異体から開始された。そのようなサルモネラワクチン株から、遺伝学的操作を適用することにより、ｐｈｏＮ遺伝子をここに記載されたように不活性化する。ｐｈｏＮの不活性化が完成した後、元となるサルモネラ変異体株に対して出現した差異を評価するために、個々のサルモネラ変異体株を分析しなければならない。ｐｈｏＮサルモネラ変異体株は好ましくは、元となるサルモネラ変異体株由来のｐｈｏＮ遺伝子を除いて生物学的特徴は本質的に同一である。ｐｈｏＮサルモネラ変異体株が、ｐｈｏＮとは関連しない一つ以上の特徴において元となるサルモネラ変異体株とは異なるのであれば、これらの変更は永久的であっても良く、最も重要には、適切なワクチン化動物において後のサルモネラ感染に対して保護的免疫応答を誘導する元となる株のオリジナルの免疫原性特徴を必須に維持しても良い。
【００４１】
好ましくはｐｈｏＮは、遺伝学的操作によってｐｈｏＮ遺伝子をコードする核酸断片の欠失により不可逆的に不活性化される。不活性化法は、ｐｈｏＮの転写が開始されるアクセサリー核酸の欠失をも含んで良い。ｐｈｏＮの欠失は、新規な転写産物の出現を抑制するそのような態様で実施されても良い。遺伝学的操作は、ここに記載されるサルモネラのゲノムのいずれかのプロセッシングを包含する。好ましくは相同的組換えの方法は、ゲノムの残りの部分を変化させないままｐｈｏＮ遺伝子の正確な欠失を可能にするはずであり、それはここで「クリーンな」欠失法と記載される。更に、Datsenko及びWannerによって記載されたλファージＲｅｄリコンビナーゼのような一時的に共発現されるリコンビナーゼによって実施される相同的組換えの方法が好ましい。
【００４２】
本発明のサルモネラ株は、例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％までの減少した自動性、及び／または例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％まで減少したバイオフィルム形成能力を有して良い。
【００４３】
上述したように、ｐｈｏＮサルモネラ株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラ株、とりわけＤＳＭ２１９７２はマーカーワクチンであって良い。ＤＳＭ２１９７２のような生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラマーカーワクチン株は、血清学的及び／または補助的細菌学的手段によって、ワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）が可能である。
【００４４】
本発明のまた別の主題は、血清学的マーカー抗原としてのサルモネラＰｈｏＮポリペプチドまたは／及びその免疫原性断片を含むポリペプチドの使用である。血清学的マーカー抗原は、ＰｈｏＮポリペプチドから由来するいずれかの抗原であって良い。ｐｈｏＮ抗原は、全長ＰｈｏＮポリペプチドを含む、または好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０アミノ酸の長さを有するそのいずれかの免疫原性部分を含むポリペプチドであって良い。ＰｈｏＮポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むポリペプチド、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性％は選択された配列の全長に対して計算される。前記免疫原性部分は、ここに記載されたＰｈｏＮポリペプチドの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸部分を有する配列を有してよく、ここで同一性％は前記免疫原性部分の長さに対して計算される。ここに記載される同一性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのような一般的なアルゴリズムによって計算されて良い。好ましい配列は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０から由来する配列番号１である（図１参照）。
【００４５】
ここに記載される血清学的マーカー抗原は、本発明のサルモネラ株でのワクチン化の後のワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）のために使用されて良い。
【００４６】
本発明のｐｈｏＮ抗原は、ｐｈｏＮ核酸の組換え発現によって、特に大腸菌のような組換え宿主細胞において調製されて良い。ｐｈｏＮ抗原は、任意に適切な防腐剤とともに、凍結ストックとしてまたは凍結乾燥物として提供されて良い。
【００４７】
本発明のまた別の主題は、少なくとも一つの組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原、またはいずれかのその免疫原性部分、及び任意に更なる試験成分を含む、サルモネラｐｈｏＮ抗原に対して向けられた抗体を検出するための血清学的試験システムである。前記血清学的試験システムは、本発明のサルモネラ株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチン、例えばＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）の識別が可能であって良い。少なくとも一つのｐｈｏＮ抗原はここに記載された抗原である。サルモネラｐｈｏＮ抗原は好ましくは、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、ここで同一性は配列番号１の長さに対して計算される。
【００４８】
前記血清学的試験システムでは、前記抗原はサルモネラで感染されている疑いのある動物、またはワクチン化後にサルモネラで感染された可能性のある動物の血清中の抗体を特異的に検出する標的抗原として機能する。本発明のサルモネラ株、特に生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチンによって成功して免疫化されている動物の血清が使用されると、ＰｈｏＮ標的抗原によって抗体は検出されない。検出はＥＬＩＳＡフォーマットで実施されて良い。
【００４９】
任意に、サルモネラＬＰＳのような更なるサルモネラ特異的抗原が血清学的試験システムで使用され、前記システムは、野生型サルモネラと本発明のサルモネラ変異体株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの両者によって誘導された抗体を検出する。
【００５０】
本発明のまた別の主題は、ここに記載されたサルモネラ抗原をコードするｐｈｏＮ核酸である。ｐｈｏＮ核酸は、ＰｈｏＮポリペプチドまたはここに記載されるその断片、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むポリペプチド、または前記配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドをコードする配列を含み、ここで同一性は前記配列の長さに対して計算される。前記核酸は、ここに記載されたＰｈｏＮポリペプチドのいずれかの免疫原性断片をコードしても良い。
【００５１】
ｐｈｏＮ核酸は、適切な組換えＤＮＡベクターを使用することにより、例えば大腸菌のような宿主において、組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原またはいずれかのその免疫原性部分の製造のために使用されてよい。ｐｈｏＮ抗原は、ここに記載された抗原であって良い。ｐｈｏＮ抗原は、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列、またはここに記載されたその免疫原性部分を含んでよい。同一性は配列番号１の長さに対して計算される。
【００５２】
本発明の更なる主題は、野生型Salmonella ssp.と本発明のサルモネラ株、例えば生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの識別のための細菌学的試験システムに関する。この細菌学的試験システムは、生物学的サンプル中のサルモネラの検出を調節する公的な標準的方法を完成している。
【００５３】
本発明の細菌学的試験システムは、サルモネラコロニーが標準的な検出法でいつ出現したか、これらが野生型サルモネラか本発明のサルモネラ株、例えば生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラかを明らかにする。個々のサルモネラコロニーのゲノムがｐｈｏＮ遺伝子またはその断片を含むかを評価するため、少なくとも一つ疑わしいサルモネラコロニーが分析される。分析はＰＣＲ法によって、または／及びＰｈｏＮ活性または／及びＰｈｏＮ遺伝子産物の検出によって実施されてよい。疑わしいサルモネラコロニーの代表的な株、例えば少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０のコロニーが分析されてよい。
【００５４】
ＰｈｏＮ活性は、ＰｈｏＮ特異的基質ミックスを含むマイクロタイタープレートのウェルのような別個のバイアル内に単一のコロニーの一部を移すことによって測定でき、そこでＰｈｏＮは視覚的制御または適切な装置によって検出できる発色生成物を生成する。ＰｈｏＮは、ＰｈｏＮ活性の測定のための完全な細胞の使用を可能にするSalmonella ssp.の細胞質内空間に局在している。前記試験システムによれば、野生型サルモネラは発色生成物を生成することによってＰｈｏＮ活性を示す一方、生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラはそれを示さない。適切な基質はＢＣＩＰであって良い。
【００５５】
本発明のサルモネラ株は、ＩＳＯ６５７９に従った試験によって検出されて良い。ＩＳＯ６５７９は参考としてここに含まれる。ＩＳＯ６５７９に従って試験により、ＰｈｏＮ活性は発色性基質ＢＣＩＰによって検出されてよい。
【００５６】
本発明は更に以下の図面、実施例、及び配列表によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、各種のSalmonella enterica enterica血清型の間のＰｈｏＮタンパク質の相同性を示す図である。
【図２Ａ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２３〜２５）。
【図２Ｂ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２６）。
【図２Ｃ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２７）。
【図３】図３は、Datsenko及びWannerによって記載された置換組換えを使用する、生存減弱化Salmonella enterica enterica Enteritidisワクチン株Salmovac SEのｐｈｏＮ欠失ミュータントの調製のためのストラテジーを説明する図である。S. Enteritidisワクチン株Salmovac SEと同一であるｐｈｏＮローカスを包含するS. Enteritidis P125109株のゲノム領域が例示的に示されている。前記ゲノム領域はＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genomues）で寄託されているNC_011294.1配列の4.419.410ヌクレオチド(nt)で開始する。いずれかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の向きと長さが矢印で示されている。注釈付のＯＲＦは黒矢印で説明され、他のものはストライプの矢印で説明されている。ｐｈｏＮについては、中抜きの矢印で説明されている二つのプロモーター（Ｐ１、Ｐ２）が予測されている。図３Ａは、ｐｈｏＮ遺伝子を含む欠失領域の境界（黒塗り縦線）を例示的に説明する。図３Ｂは、ｐｈｏＮの置換の後の元のゲノム領域内のＯＲＦを説明する。元のＯＲＦの三つ（ＯＲＦ１−３）は、組換え法によって伸張されるようになる（中抜き矢印）。
【図４】図４は、図３に記載された置換組換えによるS. Enteritidisワクチン株Salmovac SEから調製されたｐｈｏＮミュータント株のゲノム領域内の逆転写ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）を説明する。図４Ａでは、推定のアセチルトランスフェラーゼ（黒矢印）として命名されたＯＲＦのＲＴ−ＰＣＲ分析のデータが説明されている。この分析は、推定のアセチルトランスフェラーゼ及び引き続くＯＲＦ１−３を包含する転写産物（ｍＲＮＡ）を明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲは更に、前記転写産物が置換断片内に亘っているが、驚くべきことにこの断片を通過していないことを明らかにした。上部の右枠では、置換断片の一次構造と含まれるＦＲＴ部位が示されている。ＦＲＴ部位は、高安定性（−１７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の二重構造を形成する。ＦＲＴ部位は実際には、置換断片を超えたＯＲＦ１−３の発現を抑制する転写終了因子として機能することが示唆される。ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、（１）置換断片を通過する、または（２）ＦＲＴ部位の前の領域をカバーする、のいずれかである転写産物を検出するために着想される。図４Ｂは、逆転写酵素（ＲＮＡ）で処理されている、またはＰＣＲの前に未処理のままである（ＤＮＡ）S. EnteritidisΔｐｈｏＮワクチン株から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。このデータは純粋なＲＮＡプローブを明らかにする。コントロールとして、ｇｙｒＢ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲが提供される。すでに記載したとおり、置換断片を越えた転写産物はほぼ破壊され（レーン１）、対照的にＦＲＴ部位の前で終結する転写産物が生成される（レーン２）。
【図５】図５は、野生型S. Enteritidis株の毒性を、生存減弱化S. Enteritidisワクチン株Salmovac SE及びΔｐｈｏＮミュータント株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４と比較した結果を示す図である。各種のサルモネラ株の相対的な毒性を、２４時間の期間以内のＭＤＣＫ細胞中のサルモネラの生存割合を測定することにより評価した。１０のＭＯＩで野生型S. Enteritidis株で細胞を感染させた。両者の生存減弱化S. Enteritidisワクチン株を１００のＭＯＩで投与した。２時間の感染期間の後、培養倍地中の過剰な細菌を洗浄により除去した。更にゲンタマイシン［２５μｇ／ｍｌ］を添加し、過剰なサルモネラ細胞を抑制した。適切な条件化での感染細胞の２４時間の培養の後、１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ中のＭＤＣＫ細胞の溶解により、細胞内サルモネラの数を測定した。前記データは、野生型S. Enteritidis単離物と比較して、ＭＤＣＫ細胞内の両者の生存減弱化S. Enteritidisワクチン株の大きく減少した維持を明らかに示す。驚くべきことに、前記データは、ＭＤＣＫ細胞中の両者のサルモネラワクチン株について異なる生存割合を明らかにした。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、図３の注釈で記載された生存減弱化S. Enteritidisワクチン株Salmovac SEから調製されている、異なるΔｐｈｏＮミュータントクローンの非自動性変異体である。前記データは、先祖株のSalmovac SEと比較して、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の減少した毒性を示した。
【図６】図６は、二つのΔｐｈｏＮS. Enteritidisワクチン株の毒性を、白色レグホンチキンで更に評価した結果を示す図である。前記動物を、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４またはＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１のいずれかの１−２×１０８ＣＦＵを使用して、１及び２１日齢で経口ワクチン化した。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１は、S. EnteritidisΔｐｈｏＮ［ａｄｅ／ｈｉｓ］−の自動性変異体である。対照的に、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、S. EnteritidisΔｐｈｏＮ［ａｄｅ／ｈｉｓ］−の非自動性変異体である。ワクチン化の各種の時間後で、５匹の動物を犠牲にし、ワクチン化動物の各種の組織で細菌の数を測定した。高いコロニー形成値は、選択的ＸＬＴ−４アガープレート上での直接培養によりサルモネラが検出されたことを示す。ペプトン水における富化培養と、その後のＩＳＯ６５７９に記載されたＭＳＲＶアガープレートでのインキュベーションの後に、残余のコロニー形成を測定した。前記データは、両者のΔｐｈｏＮS. Enteritidisワクチン株の間の毒性の差異を確認する。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１と比較してワクチン化チキンの組織からずっと迅速に消失する。
【図７】図７は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で二度ワクチン化された白色レグホンチキンが、野生型S. Enteritidis（ＳＥ１４７Ｎ）の１−２×１０８ＣＦＵを使用して経口チャレンジ感染を受けた結果を示す図である。チャレンジ感染はブースターワクチン化の２１日後で投与され、更に１４日間分析された。コントロールとして、何も処理していない白色レグホンチキンを同じ４２日齢で感染させた。各種の時間で、両者の動物群内のサルモネラの流出と組織コロニー形成を測定し、その結果が図７Ａに要約されている。前記データは、ワクチン化動物の明らかな保護を明らかにする。かくして、野生型S. Enteritidisを流出する動物の数は、ワクチン化群において明らかに減少する。更に、脾臓及び肝臓においてサルモネラを有する動物の数は、非処理コントロール群と比較してワクチン化動物でここでも低い。ワクチン化動物では、何も処理していない動物よりも盲腸の含有物における野生型サルモネラの数が著しく減少していた（図７Ｂ）。前記データは、Salmovac SEΔｐｈｏＮワクチン株の非自動性変異体であるＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の保護的特徴を明らかに示す。
【図８】図８は、ＩＳＯ６５７９に従った標準的なサルモネラ検出試験と平行して使用される細菌学的ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験の承認を示す図である。図８Ａは、ＸＬＴ４アガープレートと、発色性ホスファターゼ基質ＢＣＩＰ［８０μｇ／ｍｌ］を補ったＬＢ−アガープレートのそれぞれに、野生型Salmonella TyphimuriumとEnteritidisを平行植菌したことを例示的に示す図である。野生型Salmonella TyphimuriumとEnteritidisは一般的に、ＸＬＤ／ＸＬＴ４アガープレートでは黒色のコロニーとして、ＢＣＩＰ ＬＢ−アガープレート（ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験）では青緑色のコロニーとして出現する。図８Ｂでは、生存減弱化Salmonella EnteritidisΔｐｈｏＮワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の平行植菌が示されている。ΔｐｈｏＮサルモネラワクチン株は、サルモネラ特異的ＸＬＤ／ＸＬＴ４アガープレートでは黒色コロニーを出現するが、ＢＣＩＰ ＬＢ−アガープレートでは非着色を維持した。サルモネラはホスファターゼ活性を有するいくつかの酵素を発現することが既知であるため、この発見は驚くべきものである。ｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、ここに記載された発色性ホスファターゼ反応を阻害するのに十分であることが結論付けられる。概略が記載された試験は、生存減弱化ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡS. Enteritidisワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４を使用してセットアップされた標準的なサルモネラ試験の範囲内で、ワクチン化動物からの感染動物の明白な識別が可能である。
【図９】図９は、白色レグホンチキンにおけるＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験を示す。特に、サルモネラ感染チキン由来の血清（Ｉｎｆ）と、生存減弱化S. EnteritidisｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で免疫化されたチキン由来の血清（Ｖａｃ）を使用する、イムノブロット分析によって承認されたＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験の特異性を示す。図９Ａのブロットは、サルモネラＰｈｏＮの二つの組換え変異体であるＰｈｏＮＦＰ１０１とＰｈｏＮＦＰ２０１で調製された。ブロッティングの前に１０％Schagger-JagowＰＡＧＥで精製サンプルを分離しておいた。ＰｈｏＮＦＰ１０１は元となるＰｈｏＮの一次構造をカバーしている。ＰｈｏＮＦＰ２０１は、切り詰められたＮＨ２末端と、ＰｈｏＮの活性中心でアミノ酸置換を有し、不活性なＰｈｏＮを生じている。イムノブロット分析は、適切なアルカリホスファターゼ接合抗血清を使用して、ＩｇＧ特異的免疫応答を示す。分子量マーカーはレーンＭで示されており、それぞれ４３、３４及び２６ｋＤａに対応する。図９Ａに示されたｐｈｏＮ-ＤＩＶＡ抗体試験は、生存減弱化S. EnteritidisｐｈｏＮ-ＤＩＶＡワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で二度免疫化されたチキン由来の血清（Ｖａｃ）と、毒性S. Enteritidis株ＳＥ１４７Ｎで感染された未処理の動物由来の血清（Ｉｎｆ）で実施された。Ｉｎｆ群の抗体は両者の変異体Ｐｈｏ抗原に結合する。Ｖａｃ群はＰｈｏＮ特異的抗体を生産しない。図９Ｂでは、各種の時間での感染の両動物群の血清を使用するＥＬＩＳＡで測定された、S. Enteritidis溶解物に対するＩｇＧ力価が説明されている。ＤＩＶＡ−Ｖａｃ群では、チャレンジ感染の前（０）及び後、感染後７日目と２８日目でＩｇＧ力価が測定された。Ｉｎｆ群では、同じ態様でＩｇＧ力価が測定された。
【図１０】図１０は、融合タンパク質ＰｈｏＮＦＰ１０１（左側のマップ）とＰｈｏＮＦＰ２０１（右側のマップ）の調製のために使用された発現プラスミドのマップを示す図である。
【図１１】図１１は、ＰｈｏＮＦＰ１０１の遺伝子（Ａ）とコードされた融合タンパク質（Ｂ）の配列を示す図である。
【図１２】図１２は、ＰｈｏＮＦＰ２０１の遺伝子（Ａ）とコードされた融合タンパク質（Ｂ）の配列を示す図である。
【実施例】
【００５８】
実施例１
National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のインターネットポータルを介したデータベース「ｎｒ」を使用するＢＬＡＳＴ２．２．１８によって各種のSalmonella enterica enterica血清型内のタンパク質ＰｈｏＮの相同性を評価した。Salmonella Enteritidis株ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０のタンパク質ＰｈｏＮのアミノ酸配列を、クエリー配列（配列番号１）として使用した。ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０は、ワクチン株Salmovac SEの変異体である（Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl, Wschr. 113, 246-252）。各種のＰｈｏＮタンパク質の一次構造内の非同一アミノ酸が、着色によって強調されている。前記データは、各種のサルモネラ血清型内でＰｈｏＮタンパク質の一次構造が＞９６％で同一性を有していることを明らかにする。
【００５９】
対照的に、非サルモネラ細菌内でのＰｈｏＮタンパク質の一次構造は、Salmonella enterica enterica血清型のＰｈｏＮタンパク質と低い関係（＜４０％の同一性）しか有さない。非サルモネラ細菌の最も関連するＰｈｏＮアミノ酸配列が示されている。同一のアミノ酸のみが示されている。変異体（−）、付加的（＋）、または欠けている（Δ）アミノ酸が示されている。全配列は配列表に記載されている（配列番号２１及び２２）。
【００６０】
この結果は図１に要約されている。
【００６１】
実施例２
T. Shigaki及びK.D. Hirschi (Anal. Biochem. 2001, 298:118-120)またはK.A. Datsenko及びB.L. Wanner(PNAS 2000, 97:6640-6645)によって記載されたような遺伝学的操作による、ΔｐｈｏＮサルモネラミュータントの調製に関連するｐｈｏＮ遺伝子と隣接領域を含む各種のSalmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮゲノム領域が記載される。
【００６２】
ｐｈｏＮゲノム領域は、以下のように図２に示されている：
図２Ａ：S. Enteritidis str. P125109（RefSeq NC011294.1から引用）
S. Dublin str. CT_02021853（RefSeq NC011205.1から引用）
S. Gallinarum str. 287／91（RefSeq NC011274.1から引用）
図２Ｂ：S. Typhimurium str. LT2（RefSeq NC003197.1から引用）
図２Ｃ：S. Choleraesuis str. SC-B67（RefSeq NC006905.1から引用）
【００６３】
実施例３
本実施例では、ｐｈｏＮ遺伝子が、生存減弱化Salmonella Enteritidisワクチン株Salmovac SEの変異体から元々由来したSalmonella Enteritidis株のゲノムから遺伝学的操作により除去された。驚くべきことにより詳細な分析により、ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidisワクチン株変異体の集団において差異が示された。いくつかの限られたΔｐｈｏＮワクチン株変異体は、先祖株及び他のΔｐｈｏＮワクチン株変異体の少なくとも３０％である自動性活性を有する。更に、この減少した自動性のΔｐｈｏＮワクチン株変異体は、バイオフィルムを形成する能力も減少しており、このことは更に先祖株及び他のΔｐｈｏＮ変異体とは異なる。
【００６４】
指摘された差異に加えて、調査された全てのΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体はアデニン及びヒスチジンに対して独立栄養性であり、複雑なリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を発現する。それらは既知の毒性プラスミドのいずれかを含むものではない。かくして、全てのΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体は、ドイツにおける産卵鶏のワクチン化について承認されているSalmovac SEの関連する特徴を含む。
【００６５】
単一の変異体、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４を、減少した自動性とバイオフィルム能力を有するΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体の集団から選択した。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の更なる分析により、これらの更に同定された特徴が１５０世代を超えて安定であることが明らかにされた。
【００６６】
株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、寄託番号ＤＳＭ２１９７２の下で、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7B, D-38124 Braunschweigに２００８年１１月１０日でブタペスト条約の下で寄託されている。
【００６７】
以下の分析では、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の毒性と効力を、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidisワクチン株変異体及び元となるワクチン株と比較した。
【００６８】
サルモネラワクチン株の毒性を、in vitro及びin vivo実験によって評価した。ＭＤＣＫ細胞の定量的な感染により、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４が先祖株及び自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりもＭＤＣＫ細胞において毒性が小さいことが明らかに示された。
【００６９】
一日齢のチキンを、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis群の単一の変異体のいずれかで経口的に植菌した。その後、ワクチン化動物の各種の組織におけるサルモネラの存在を、細菌学的手段により測定した。前記データは、ワクチン化の７日後で両者の動物群において肝臓及び脾臓における同量のサルモネラを明らかにする。この後、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の量は、肝臓及び脾臓で減少するが、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体株を受けた動物の器官では高いままである。盲腸組織では、同様の結果が得られた。このデータは、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４が自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりも毒性が低いことを明らかに示す。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりもずっと早期に、ワクチン化チキンの組織及び排泄物から消失する。
【００７０】
ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis株の免疫原性を、１日齢及び２１日齢で、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体のいずれかで経口的にワクチン化されたチキンにおいて測定した。両動物群の体液性及び粘膜性免疫応答を、サルモネラ抗原を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。そのデータにより、両者のワクチン株は、経口的にワクチン化されたチキンにおいて体液性及び粘膜性免疫応答を誘導することが明らかとなり、この免疫応答は最後のワクチン化の５０日以上後でも高いままであった。かくして、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体と同様の免疫原性効力を有する。
【００７１】
最後に、１日齢及び２１日齢でＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体のいずれかによって経口的にワクチン化されたチキンは、毒性Salmonella enterica enterica Enteritidis単離物でのチャレンジ感染に抵抗性であることを示すことができた。かくして、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体と同様の保護的効力を有する。
【００７２】
要約すると、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、低い流出と高い効力を有する家禽のための新規な生存減弱化サルモネラワクチンとして同定され、更にワクチン化動物から感染動物を識別することが可能であることが同定された。
【００７３】
実施例４
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験のための組換えＰｈｏＮタンパク質の調製
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験は、組換えＰｈｏＮに基づいて好ましくは調製される。精製組換えＰｈｏＮでの以前のイムノブロット分析により、生存減弱化サルモネラｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された動物は、この全体タンパク質に結合する抗体を生成しないことが明らかである。ＰｈｏＮタンパク質の複雑性と、体液性免疫応答の広範囲の反応性にも関わらず、ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡサルモネラワクチン株で免疫化された動物の血清内で、交差反応する抗体が存在しないことは驚くべきことであった。
【００７４】
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験のための組換えＰｈｏＮは、高純度で調製されてよい。いずれかの不純物は、ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡサルモネラワクチンで免疫化された家畜の広範囲の抗体によって検出されても良く、かくしてＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験で偽の結果を生ずるであろう。
【００７５】
純粋なＰｈｏＮの調製は、高ストリンジェントな精製条件を可能にする外的ポリペプチド断片で、ＰｈｏＮの一次構造を伸張することによって容易にされてよい。好ましくは、一連のヒスチジン（Ｈｉｓタグ）を、ＰｈｏＮのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで導入する。更に、Ｈｉｓタグの除去を可能にするエンドペプチダーゼ、例えばトロンビンによって特異的に認識される別のタンパク質ドメインを、ＨｉｓタグとＰｈｏＮ構造との間に導入してよい。この分析により、Ｈｉｓタグとトロンビン部位を含むＰｈｏＮのそのような融合タンパク質が、以前の分析で示された生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された動物の血清に干渉しないことが明らかである。
【００７６】
ＰｈｏＮの融合タンパク質は、従来の発現ベクター、例えばｐＥＴ１５ｂにより、供給者、例えばNovagenによって示された標準的な精製プロトコールを適用することによって、大腸菌で調製できる。図１０〜１２は、使用された発現プラスミドのマップ、例示的に調製されたＰｈｏＮ融合タンパク質、ＰｈｏＮＦＰ１０１及びＰｈｏＮＦＰ２０１のＤＮＡ及びアミノ酸配列を開示する。
【００７７】
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験
チキンが生存減弱化サルモネラｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された際はいつでも、ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験を適用する。本実施例では、血清学的ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験システムは、組換えタンパク質ＰｈｏＮ、例えばＰｈｏＮＦＰ１０１またはＰｈｏＮＦＰ２０１、及び別のサルモネラ特異的抗原を含む。好ましくは、サルモネラ特異的抗原は、例えばIdexx Laboratories Inc. (Flockchek)、またはLabor Diagnostik GmbH Leipzig (Flocktype Salmonella)、またはBiochek及び他の会社によって提供される、チキンにおけるサルモネラ特異的抗体を検出する市販の試験キットによって提供される。この試験セットアップは、ワクチン化の後にサルモネラ特異的免疫応答が出現するかどうかを明らかにする。更に、野生型サルモネラが関与していないことを明らかにし、それはＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験における組換えタンパク質ＰｈｏＮでネガティブな反応によって指摘される。
【００７８】
一般的に、サルモネラ特異的抗体の検出のための市販の試験キットは、マイクロタイタープレートにおける間接的ＥＬＩＳＡとして準備されている。供給者に依存して、サルモネラ特異的抗原または抗原ミックスは、マイクロタイタープレートのバイアルにすでに結合されているか、ストック溶液の一部を使用して後に結合されなければならない。
【００７９】
精製ＰｈｏＮ、例えばＰｈｏＮＦＰ２０１は、適切な防腐剤と共に凍結ストック溶液または凍結乾燥物として好ましくは提供される。本実施例では、ＰｈｏＮ特異的抗体の検出のためのＥＬＩＳＡは、例えばAntibodies. A Laboratory ManualにおけるE. Harlow及びD. Laneによるもののようないずれかで記載された標準的なプロトコールに従って実施される。
【００８０】
【表１】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活性化ｐｈｏＮ遺伝子を有するサルモネラ株に関する。特に本発明は、ΔｐｈｏＮ Salmonella enterica生存減弱化ワクチン株の調製方法に関する。更に本発明は、サルモネラ感染動物からワクチン化動物を識別するための、組換えサルモネラタンパク質ｐｈｏＮを使用する血清学的試験システムに関する。更に、細菌学的試験システムがＤＩＶＡのために開示される。
【０００２】
本発明は更に、Salmonella enterica ssp. 血清型Enteritidis株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）、及びSalmonella Enteritidis感染の予防のための家禽の処理のための、及び／またはさらなる病原体に対して家畜類を保護する多価組換えサルモネラキャリアーワクチンの調製のための生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラマーカーワクチン株としての前記株の使用に関する。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、血清学的及び／または細菌学的手段によって、ワクチン化動物からの感染動物の識別（Differentiation of infected from Vaccinated Animal；ＤＩＶＡ）が可能である。
【背景技術】
【０００３】
非腸チフスサルモネラ症は、動物及びヒトにおける広くいきわたった疾患である。ヒトでは、家禽類及びブタの製品から主として発生する最も一般的な食品媒介疾患である。欧州連合では、食物連鎖への病原性Salmonella ssp.の取り込みを減少すべき監視システムが確立されるであろう（規則ＥＣ２１６０／２００３）。ワクチン接種は、家畜における病原性Salmonella ssp.の流行を減少し、かくして伝播速度を最小化するであろう。抗サルモネラワクチンは、例えば産卵鶏及びブタに対して市販されている。ワクチンは、細菌であるか生存減弱化サルモネラワクチンである。産卵鶏では、これらのワクチンを使用して、病原体の卵内伝播と糞への流出を減少する。
【０００４】
生存減弱化サルモネラワクチンの効力は、細菌ワクチンより優れていることが見出されている。家畜に対する生存減弱化サルモネラワクチンの好ましい使用は、ＥＣ２１６０／２００３の規則と一致するワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）の方法を要求している。
【０００５】
認可されている生存減弱化サルモネラワクチンの主なものは、化学的なミュータジェネシスによってSalmonella enterica ssp. enterica 血清型の規定された野生型単離物から調製される。現在では、生存減弱化サルモネラワクチンは、細菌学的手段によって野生型Salmonella ssp.から識別される。これらの方法は長時間を必要とする労力の要するものである。ワクチン化動物と感染動物の血清学的識別は非常に好ましいであろう。現在利用可能な生存減弱化サルモネラワクチンは、ＤＩＶＡストラテジーに従った血清学的識別を可能にしない。
【０００６】
ＤＩＶＡ生ワクチンは、ウイルス感染の予防のために家畜において成功して使用されている。
マーカーワクチンは、ポジティブマーカーまたはネガティブマーカーとしてのいずれかで調製できる。ポジティブマーカーワクチンは、ワクチン化動物では特異的な抗体を誘導するが感染動物では誘導しないさらなる抗原を含む。後の感染を有するワクチン化動物を単なるワクチン化動物から識別できないため、ポジティブマーカーワクチンは明らかに不利である。
【０００７】
ネガティブマーカーワクチンは、感染動物で特異的な抗体を誘導する抗原の除去によって調製される。かくしてネガティブマーカーワクチンは、感染動物のものとは異なるワクチン化動物における体液性免疫応答を誘導する。理想的にはこの差異は、血清学的手段によって検出できる。ポジティブマーカーワクチンとは対照的に、ネガティブマーカーワクチンは、後に感染するようになったワクチン化動物の同定が可能である。
【０００８】
ネガティブマーカー抗原の選択には、いくつかの観点が考慮されなければならない：前記抗原は免疫原性でなければならないが、病原体に対して動物を保護する免疫反応に関与してはならない。かくして、マーカー抗原をコードする遺伝子の除去または不活性化は、ワクチン株の免疫原性を維持しなければならない。最後に、家畜に出現して体液性免疫応答を誘導する可能性のある他の生物によって誘導される偽のポジティブな血清学的結果を避けるために、マーカー抗原は病原体に特異的であるべきである。
【０００９】
ウイルスワクチンとは対照的に生存減弱化細菌ワクチンの高度な複雑性のため、生存減弱化細菌マーカーワクチンの開発のためにはずっと多大な努力が必要である。ネガティブサルモネラマーカーワクチンの第一の候補は、高度に免疫原性の表面抗原の遺伝子を欠失することによって、生存減弱化サルモネラワクチン株から確立された。これらの生存減弱化サルモネラＤＮＡワクチンは、血清学的手段によってワクチン化動物から感染動物を識別することができた。しかしながらこれらのプロトタイプは、元となるワクチン株よりもずっと保護的ではなかった。
【００１０】
ｐｈｏＮ遺伝子は非特異的な酸性ホスファターゼをコードし、それは全てのSalmonella ssp.で広く提示されることが見出されている。ｐｈｏＮ遺伝子は、ＰｈｏＰＱレギュロンの制御下で発現され、後者はサルモネラにおける毒性遺伝子のための一般的な調節因子である。ｐｈｏＮが動物におけるサルモネラの生存に必須であるかは未知である。
【００１１】
ＰｈｏＰＱレギュロンへのｐｈｏＮのリンケージは、サルモネラが宿主組織を占有する際はいつでも、ｐｈｏＮが活性化されることを示すであろう。かくして、生存減弱化サルモネラワクチン株におけるｐｈｏＮ遺伝子の除去または不活性化が、ワクチン化動物における保護的免疫性を誘導する能力にネガティブに影響する可能性があるかどうかという疑問が残っている。生存減弱化サルモネラワクチン株における単一の遺伝子の欠失が残存している毒性を更に減少し、それが宿主の免疫応答の刺激を減少させ、その結果保護的免疫を阻害するかもしれないことが既知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl Wschr. 113, 246-252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、当該技術分野のワクチンの上述の欠点を少なくとも部分的に解消するネガティブマーカーワクチンとして適切なサルモネラ株を提供することである。
【００１４】
本発明では、サルモネラＤＩＶＡワクチンの調製のための標的として、ｐｈｏＮ遺伝子が選択された。驚くべきことに、ｐｈｏＮ遺伝子は、生ワクチンとして特に適切なｐｈｏＮ欠損サルモネラ株を作製する特徴の組み合わせを提供する。
【００１５】
第一の驚くべき特徴は、サルモネラと比較した全てのサルモネラではない細菌におけるＰｈｏＮタンパク質の構造の差異である。他方で、ＰｈｏＮアミノ酸配列は、各種のサルモネラ種において少なくとも９５％の同一性（アミノ酸配列の全量に対して計算される）の度合いを有する。
【００１６】
第二の驚くべき特徴は、ＰｈｏＮが免疫原性であるという事実である。Salmonella ssp.で感染されたチキン及びマウス由来の血清の分析により、精製ＰｈｏＮタンパク質に特異的に結合する抗体の出現が明白に明らかにされた。この結果は、ＰｈｏＮが免疫原性であり、サルモネラに感染した鳥類及び哺乳類を検出するための血清学的マーカー抗原として使用できるという最初の証拠を提供する。サルモネラワクチン株においてｐｈｏＮ遺伝子の発現を破壊すると、これは血清学的手段によりワクチン化動物から感染動物を識別することを可能にするであろう。かくして、ＰｈｏＮ抗原を欠損したサルモネラ生ワクチンによってワクチン化された動物は、ＰｈｏＮ特異的抗体を生産しない一方、野生型サルモネラで感染された動物ではこの抗体を生産するであろう。
【００１７】
第三の驚くべき特徴は、生存減弱化サルモネラワクチン株のｐｈｏＮ遺伝子の除去は、ワクチン株の毒性を更に減少させるかもしれないが、その免疫原性と同種血清型のサルモネラ感染からワクチン化チキンを保護する効力には影響しないという事実である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第一の主題は、不活性化ｐｈｏＮ遺伝子を有するサルモネラ株である。これはΔｐｈｏＮによってここで記載される。ΔｐｈｏＮサルモネラ株は、本質的にｐｈｏＮ活性を有さない。分子生物学界の当業者であれば、サルモネラのような細菌における遺伝子不活性化の方法は既知である。
【００１９】
ｐｈｏＮの不活性化は、ｐｈｏＮ遺伝子の欠損または／及び修飾を含む。特に本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質、またはＰｈｏＮタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘導できるＰｈｏＮタンパク質の断片を実質的に生産しない、即ち本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関して免疫原性ではない。ｐｈｏＮ遺伝子は、完全にまたは少なくとも部分的に欠失されて良い。ｐｈｏＮ遺伝子の部分的な欠失は、ｐｈｏＮ遺伝子の全長配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の欠失であって良い。ｐｈｏＮ遺伝子配列が部分的に欠失されているのであれば、残余の配列は好ましくは、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片、特にここに記載される免疫原性断片を発現できない。
【００２０】
ｐｈｏＮ遺伝子配列の修飾は配列置換を含む。ｐｈｏＮ遺伝子は、別の配列によって完全に置換されて良い。ｐｈｏＮ遺伝子の欠失配列は、他の配列によって完全にまたは部分的に置換されて良い。
【００２１】
ｐｈｏＮ遺伝子のコード配列（オープンリーディングフレーム）は、完全にまたは少なくとも部分的に欠失されて良い。ｐｈｏＮコード配列の部分的な欠失は、全長ｐｈｏＮコード配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列の欠失であって良い。ｐｈｏＮコード配列が部分的に欠失されているのであれば、残余の配列は好ましくは、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片、特にここに記載される免疫原性断片を発現できない。
【００２２】
ｐｈｏＮコード配列の修飾は配列置換を含む。ｐｈｏＮコード配列は、別の配列によって完全に置換されて良い。ｐｈｏＮコード配列の欠失配列は、他の配列によって完全にまたは部分的に置換されて良い。
【００２３】
サルモネラにおけるｐｈｏＮポリペプチドの配列の典型的な例は、図１に記載されている（配列番号１〜２０）。サルモネラｐｈｏＮ遺伝子ローカスの典型的な例は図２に示されており、それはｐｈｏＮオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ｐｈｏＮ ＯＲＦの上流または／及び下流の調節配列を含む（配列番号２３〜２７）。
【００２４】
本発明のｐｈｏＮポリペプチドの断片は、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０のアミノ酸残基の長さを有して良い。それらは最大で２００、最大で１５０、または最大で１００アミノ酸残基の長さを有して良い。断片は免疫原性断片（ここで免疫原性部分とも称される）を含む。
【００２５】
ｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、ここで記載されている通り、例えばｐｈｏＮコード領域の完全なまたは少なくとも部分的な欠失による、またはｐｈｏＮコード領域の置換による、不可逆的な不活性化である。特に不可逆的な不活性化は、本発明のサルモネラ株が野生型ｐｈｏＮ遺伝子型に戻ることを防止する。
【００２６】
上述のように、本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質に対する免疫応答を誘導できるＰｈｏＮタンパク質を実質的に生産しない、即ち本発明のサルモネラ株は、ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関して免疫原性ではない。ＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関する免疫原性は、本発明のサルモネラ株で処理されるいずれかの種における免疫原性であって良い。特にＰｈｏＮタンパク質またはその断片に関する免疫原性は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における免疫原性である。
【００２７】
当業者は、サルモネラ株または非サルモネラ株におけるＰｈｏＮポリペプチド及びｐｈｏＮ遺伝子を同定することができる。本発明では、サルモネラＰｈｏＮタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むタンパク質、または選択された配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性は選択された配列の長さに関して計算される。非サルモネラＰｈｏＮタンパク質は、EscherichiaまたはShigellaから得られるＰｈｏＮタンパク質であって良く、配列番号２１及び配列番号２２から選択された配列、または配列番号２１及び配列番号２２から選択された配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性は選択された配列の長さに関して計算される。
【００２８】
本発明に係る株を得るためにここに記載されたｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、Salmonella enterica ssp.から選択されて良い。サルモネラ株は、Salmonella enterica ssp. entericaの血清型から、例えば血清型Enteritidis、Dublin、Gallinarum、Typhimurium、Newport、Choleraesuis、Agona、Hadar、Heidelberg、Kentucky、Saintpaul、Virchow、Weltevreden、Javiana、Schwarzengrund、Paratyphi、及びTyphiから、または図１に挙げられた血清型から選択されて良い。
【００２９】
ここに記載されるｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、減弱化サルモネラ株、例えば生存減弱化サルモネラ株、例えば生存減弱化Salmonella enterica ssp. enterica血清型Enteritidis His- Ade-株、例えばSalmovac SE（Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl Wschr. 113, 246-252）またはその変異体であって良い。
【００３０】
ここに記載されるｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、認可された生存減弱化サルモネラワクチンに適用されても良い。これらの株は、家畜のサルモネラ感染を避け、同時にサルモネラに感染した家畜からワクチン化した家畜の識別を可能にするために、免疫原性に影響することなく生存減弱化サルモネラΔｐｈｏＮマーカーワクチンに形質転換されて良い。化学的なミュータジェネシス及び／または遺伝的な操作によって調製されている生存減弱化サルモネラワクチン株について、または少なくとも一つの更なる同種抗原、及び／または異種病原体の少なくとも一つの更なる抗原を発現するために、例えば担体として生存減弱化サルモネラワクチン株を使用するいずれかの組換えサルモネラワクチンアプローチについて、またはワクチン化のためにＤＮＡを送達する担体として使用される生存減弱化サルモネラワクチン株について、これらの形質転換法を適用することができる。
【００３１】
生存減弱化サルモネラワクチン株である、ここに記載されたｐｈｏＮ不活性化に供されるサルモネラ株は、特に以下のものである：
（ｉ）化学的なミュータジェネシス及び／または遺伝的な操作によって調製されたワクチン株；
（ｉｉ）少なくとも一つの同種サルモネラ抗原、及び／または少なくとも一つの異種抗原、たとえば異種病原体の抗原を任意に組換え発現する組換えワクチン株；または
（ｉｉｉ）ＤＮＡを送達するための組換え担体株。
【００３２】
本発明の好ましいサルモネラ株は、Salmonella enterica enterica Enteritidis株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）、及びそれから由来するいずれかの株である。
【００３３】
本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、医薬、例えば獣医薬において使用されるものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、ワクチンとして使用するためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、生ワクチンとして使用のするためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にここに記載されるワクチン、とりわけＤＳＭ２１９７２株は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica sspでの感染に対する保護するためのワクチンとして使用するためのものであって良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のためのものであって良い。
【００３４】
本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、医薬、例えば獣医薬における医薬の製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、ワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、生ワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にここに記載されるワクチン、とりわけＤＳＭ２１９７２株は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での感染に対して保護するためのワクチンの製造のために使用されて良い。本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のための医薬の製造のために使用されて良い。
【００３５】
本発明のワクチン、特にＤＳＭ２１９７２は、後のサルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での後の感染に対して保護するためのワクチン、及び更なる病原体に対して保護する多価組換えサルモネラ担体ワクチンを調製するためのワクチンであって良い。前記ワクチンは、少なくとも一つの同種サルモネラ抗原、及び／または少なくとも一つの異種抗原、たとえば異種病原体の抗原を任意に組換え発現する。前記ワクチンは、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽に対する投与に適したものであって良い。
【００３６】
本発明の主題は、本発明のサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株の、その必要のある被験者に対する投与を含む、サルモネラ感染の予防または／及び治療のための方法である。前記被験者は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽であって良い。
【００３７】
本発明の更なる主題は、本発明のサルモネラ株の、その必要のある被験者に対する投与を含む、病原体での感染の予防または／及び治療の方法であり、本発明のサルモネラ株は、この病原体に対する保護を与えるために調製され、例えば多価サルモネラ生ワクチンである。このサルモネラ株はＤＳＭ２１９７２から由来することが好ましい。前記被験者は、哺乳動物、例えばブタまたは鳥類、例えばチキンのような家禽であって良い。とりわけ前記病原体はサルモネラとは異なる。
【００３８】
本発明のまた別の主題は、サルモネラ株のｐｈｏＮ遺伝子を不活性化することを含む、ここに記載されるサルモネラ株、特にＤＳＭ２１９７２株の生産方法である。
【００３９】
上述のように、ｐｈｏＮの不活性化は、生存減弱化サルモネラワクチン株の毒性を更に減少しても良いが、形質転換されたサルモネラワクチン株の免疫原性には影響しない。それ故ｐｈｏＮ不活性化は、生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチン株を生産する適切な方法である。
【００４０】
生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの調製は、サルモネラ感染に対して、特にSalmonella enterica ssp.での感染に対して、例えば鳥類及び／または哺乳類家畜を保護することができるいずれかの生存減弱化サルモネラワクチン株から開始することができる。ＤＳＭ２１９７２の調製は、サルモネラＳＥ株の変異体から開始された。そのようなサルモネラワクチン株から、遺伝学的操作を適用することにより、ｐｈｏＮ遺伝子をここに記載されたように不活性化する。ｐｈｏＮの不活性化が完成した後、元となるサルモネラ変異体株に対して出現した差異を評価するために、個々のサルモネラ変異体株を分析しなければならない。ｐｈｏＮサルモネラ変異体株は好ましくは、元となるサルモネラ変異体株由来のｐｈｏＮ遺伝子を除いて生物学的特徴は本質的に同一である。ｐｈｏＮサルモネラ変異体株が、ｐｈｏＮとは関連しない一つ以上の特徴において元となるサルモネラ変異体株とは異なるのであれば、これらの変更は永久的であっても良く、最も重要には、適切なワクチン化動物において後のサルモネラ感染に対して保護的免疫応答を誘導する元となる株のオリジナルの免疫原性特徴を必須に維持しても良い。
【００４１】
好ましくはｐｈｏＮは、遺伝学的操作によってｐｈｏＮ遺伝子をコードする核酸断片の欠失により不可逆的に不活性化される。不活性化法は、ｐｈｏＮの転写が開始されるアクセサリー核酸の欠失をも含んで良い。ｐｈｏＮの欠失は、新規な転写産物の出現を抑制するそのような態様で実施されても良い。遺伝学的操作は、ここに記載されるサルモネラのゲノムのいずれかのプロセッシングを包含する。好ましくは相同的組換えの方法は、ゲノムの残りの部分を変化させないままｐｈｏＮ遺伝子の正確な欠失を可能にするはずであり、それはここで「クリーンな」欠失法と記載される。更に、Datsenko及びWannerによって記載されたλファージＲｅｄリコンビナーゼのような一時的に共発現されるリコンビナーゼによって実施される相同的組換えの方法が好ましい。
【００４２】
本発明のサルモネラ株は、例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％までの減少した自動性、及び／または例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％まで減少したバイオフィルム形成能力を有して良い。
【００４３】
上述したように、ｐｈｏＮサルモネラ株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラ株、とりわけＤＳＭ２１９７２はマーカーワクチンであって良い。ＤＳＭ２１９７２のような生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラマーカーワクチン株は、血清学的及び／または補助的細菌学的手段によって、ワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）が可能である。
【００４４】
本発明のまた別の主題は、血清学的マーカー抗原としてのサルモネラＰｈｏＮポリペプチドまたは／及びその免疫原性断片を含むポリペプチドの使用である。血清学的マーカー抗原は、ＰｈｏＮポリペプチドから由来するいずれかの抗原であって良い。ｐｈｏＮ抗原は、全長ＰｈｏＮポリペプチドを含む、または好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０アミノ酸の長さを有するそのいずれかの免疫原性部分を含むポリペプチドであって良い。ＰｈｏＮポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むポリペプチド、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドであって良く、ここで同一性％は選択された配列の全長に対して計算される。前記免疫原性部分は、ここに記載されたＰｈｏＮポリペプチドの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸部分を有する配列を有してよく、ここで同一性％は前記免疫原性部分の長さに対して計算される。ここに記載される同一性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのような一般的なアルゴリズムによって計算されて良い。好ましい配列は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０から由来する配列番号１である（図１参照）。
【００４５】
ここに記載される血清学的マーカー抗原は、本発明のサルモネラ株でのワクチン化の後のワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）のために使用されて良い。
【００４６】
本発明のｐｈｏＮ抗原は、ｐｈｏＮ核酸の組換え発現によって、特に大腸菌のような組換え宿主細胞において調製されて良い。ｐｈｏＮ抗原は、任意に適切な防腐剤とともに、凍結ストックとしてまたは凍結乾燥物として提供されて良い。
【００４７】
本発明のまた別の主題は、少なくとも一つの組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原、またはいずれかのその免疫原性部分、及び任意に更なる試験成分を含む、サルモネラｐｈｏＮ抗原に対して向けられた抗体を検出するための血清学的試験システムである。前記血清学的試験システムは、本発明のサルモネラ株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチン、例えばＣＬＡＢ ＳＥ４０４（ＤＳＭ２１９７２）の識別が可能であって良い。少なくとも一つのｐｈｏＮ抗原はここに記載された抗原である。サルモネラｐｈｏＮ抗原は好ましくは、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、ここで同一性は配列番号１の長さに対して計算される。
【００４８】
前記血清学的試験システムでは、前記抗原はサルモネラで感染されている疑いのある動物、またはワクチン化後にサルモネラで感染された可能性のある動物の血清中の抗体を特異的に検出する標的抗原として機能する。本発明のサルモネラ株、特に生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチンによって成功して免疫化されている動物の血清が使用されると、ＰｈｏＮ標的抗原によって抗体は検出されない。検出はＥＬＩＳＡフォーマットで実施されて良い。
【００４９】
任意に、サルモネラＬＰＳのような更なるサルモネラ特異的抗原が血清学的試験システムで使用され、前記システムは、野生型サルモネラと本発明のサルモネラ変異体株、特に生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの両者によって誘導された抗体を検出する。
【００５０】
本発明のまた別の主題は、ここに記載されたサルモネラ抗原をコードするｐｈｏＮ核酸である。ｐｈｏＮ核酸は、ＰｈｏＮポリペプチドまたはここに記載されるその断片、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０から選択される配列を含むポリペプチド、または前記配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むポリペプチドをコードする配列を含み、ここで同一性は前記配列の長さに対して計算される。前記核酸は、ここに記載されたＰｈｏＮポリペプチドのいずれかの免疫原性断片をコードしても良い。
【００５１】
ｐｈｏＮ核酸は、適切な組換えＤＮＡベクターを使用することにより、例えば大腸菌のような宿主において、組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原またはいずれかのその免疫原性部分の製造のために使用されてよい。ｐｈｏＮ抗原は、ここに記載された抗原であって良い。ｐｈｏＮ抗原は、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列、またはここに記載されたその免疫原性部分を含んでよい。同一性は配列番号１の長さに対して計算される。
【００５２】
本発明の更なる主題は、野生型Salmonella ssp.と本発明のサルモネラ株、例えば生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラＤＩＶＡワクチンの識別のための細菌学的試験システムに関する。この細菌学的試験システムは、生物学的サンプル中のサルモネラの検出を調節する公的な標準的方法を完成している。
【００５３】
本発明の細菌学的試験システムは、サルモネラコロニーが標準的な検出法でいつ出現したか、これらが野生型サルモネラか本発明のサルモネラ株、例えば生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラかを明らかにする。個々のサルモネラコロニーのゲノムがｐｈｏＮ遺伝子またはその断片を含むかを評価するため、少なくとも一つ疑わしいサルモネラコロニーが分析される。分析はＰＣＲ法によって、または／及びＰｈｏＮ活性または／及びＰｈｏＮ遺伝子産物の検出によって実施されてよい。疑わしいサルモネラコロニーの代表的な株、例えば少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０のコロニーが分析されてよい。
【００５４】
ＰｈｏＮ活性は、ＰｈｏＮ特異的基質ミックスを含むマイクロタイタープレートのウェルのような別個のバイアル内に単一のコロニーの一部を移すことによって測定でき、そこでＰｈｏＮは視覚的制御または適切な装置によって検出できる発色生成物を生成する。ＰｈｏＮは、ＰｈｏＮ活性の測定のための完全な細胞の使用を可能にするSalmonella ssp.の細胞質内空間に局在している。前記試験システムによれば、野生型サルモネラは発色生成物を生成することによってＰｈｏＮ活性を示す一方、生存減弱化ΔｐｈｏＮサルモネラはそれを示さない。適切な基質はＢＣＩＰであって良い。
【００５５】
本発明のサルモネラ株は、ＩＳＯ６５７９に従った試験によって検出されて良い。ＩＳＯ６５７９は参考としてここに含まれる。ＩＳＯ６５７９に従って試験により、ＰｈｏＮ活性は発色性基質ＢＣＩＰによって検出されてよい。
【００５６】
本発明は更に以下の図面、実施例、及び配列表によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、各種のSalmonella enterica enterica血清型の間のＰｈｏＮタンパク質の相同性を示す図である。
【図２Ａ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２３〜２５）。
【図２Ｂ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２６）。
【図２Ｃ】図２は、Salmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮのゲノム領域を示す図である（配列番号２７）。
【図３】図３は、Datsenko及びWannerによって記載された置換組換えを使用する、生存減弱化Salmonella enterica enterica Enteritidisワクチン株Salmovac SEのｐｈｏＮ欠失ミュータントの調製のためのストラテジーを説明する図である。S. Enteritidisワクチン株Salmovac SEと同一であるｐｈｏＮローカスを包含するS. Enteritidis P125109株のゲノム領域が例示的に示されている。前記ゲノム領域はＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genomues）で寄託されているNC_011294.1配列の4.419.410ヌクレオチド(nt)で開始する。いずれかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の向きと長さが矢印で示されている。注釈付のＯＲＦは黒矢印で説明され、他のものはストライプの矢印で説明されている。ｐｈｏＮについては、中抜きの矢印で説明されている二つのプロモーター（Ｐ１、Ｐ２）が予測されている。図３Ａは、ｐｈｏＮ遺伝子を含む欠失領域の境界（黒塗り縦線）を例示的に説明する。図３Ｂは、ｐｈｏＮの置換の後の元のゲノム領域内のＯＲＦを説明する。元のＯＲＦの三つ（ＯＲＦ１−３）は、組換え法によって伸張されるようになる（中抜き矢印）。
【図４】図４は、図３に記載された置換組換えによるS. Enteritidisワクチン株Salmovac SEから調製されたｐｈｏＮミュータント株のゲノム領域内の逆転写ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）を説明する。図４Ａでは、推定のアセチルトランスフェラーゼ（黒矢印）として命名されたＯＲＦのＲＴ−ＰＣＲ分析のデータが説明されている。この分析は、推定のアセチルトランスフェラーゼ及び引き続くＯＲＦ１−３を包含する転写産物（ｍＲＮＡ）を明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲは更に、前記転写産物が置換断片内に亘っているが、驚くべきことにこの断片を通過していないことを明らかにした。上部の右枠では、置換断片の一次構造と含まれるＦＲＴ部位が示されている。ＦＲＴ部位は、高安定性（−１７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の二重構造を形成する。ＦＲＴ部位は実際には、置換断片を超えたＯＲＦ１−３の発現を抑制する転写終了因子として機能することが示唆される。ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、（１）置換断片を通過する、または（２）ＦＲＴ部位の前の領域をカバーする、のいずれかである転写産物を検出するために着想される。図４Ｂは、逆転写酵素（ＲＮＡ）で処理されている、またはＰＣＲの前に未処理のままである（ＤＮＡ）S. EnteritidisΔｐｈｏＮワクチン株から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。このデータは純粋なＲＮＡプローブを明らかにする。コントロールとして、ｇｙｒＢ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲが提供される。すでに記載したとおり、置換断片を越えた転写産物はほぼ破壊され（レーン１）、対照的にＦＲＴ部位の前で終結する転写産物が生成される（レーン２）。
【図５】図５は、野生型S. Enteritidis株の毒性を、生存減弱化S. Enteritidisワクチン株Salmovac SE及びΔｐｈｏＮミュータント株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４と比較した結果を示す図である。各種のサルモネラ株の相対的な毒性を、２４時間の期間以内のＭＤＣＫ細胞中のサルモネラの生存割合を測定することにより評価した。１０のＭＯＩで野生型S. Enteritidis株で細胞を感染させた。両者の生存減弱化S. Enteritidisワクチン株を１００のＭＯＩで投与した。２時間の感染期間の後、培養倍地中の過剰な細菌を洗浄により除去した。更にゲンタマイシン［２５μｇ／ｍｌ］を添加し、過剰なサルモネラ細胞を抑制した。適切な条件化での感染細胞の２４時間の培養の後、１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ中のＭＤＣＫ細胞の溶解により、細胞内サルモネラの数を測定した。前記データは、野生型S. Enteritidis単離物と比較して、ＭＤＣＫ細胞内の両者の生存減弱化S. Enteritidisワクチン株の大きく減少した維持を明らかに示す。驚くべきことに、前記データは、ＭＤＣＫ細胞中の両者のサルモネラワクチン株について異なる生存割合を明らかにした。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、図３の注釈で記載された生存減弱化S. Enteritidisワクチン株Salmovac SEから調製されている、異なるΔｐｈｏＮミュータントクローンの非自動性変異体である。前記データは、先祖株のSalmovac SEと比較して、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の減少した毒性を示した。
【図６】図６は、二つのΔｐｈｏＮS. Enteritidisワクチン株の毒性を、白色レグホンチキンで更に評価した結果を示す図である。前記動物を、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４またはＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１のいずれかの１−２×１０８ＣＦＵを使用して、１及び２１日齢で経口ワクチン化した。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１は、S. EnteritidisΔｐｈｏＮ［ａｄｅ／ｈｉｓ］−の自動性変異体である。対照的に、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、S. EnteritidisΔｐｈｏＮ［ａｄｅ／ｈｉｓ］−の非自動性変異体である。ワクチン化の各種の時間後で、５匹の動物を犠牲にし、ワクチン化動物の各種の組織で細菌の数を測定した。高いコロニー形成値は、選択的ＸＬＴ−４アガープレート上での直接培養によりサルモネラが検出されたことを示す。ペプトン水における富化培養と、その後のＩＳＯ６５７９に記載されたＭＳＲＶアガープレートでのインキュベーションの後に、残余のコロニー形成を測定した。前記データは、両者のΔｐｈｏＮS. Enteritidisワクチン株の間の毒性の差異を確認する。ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４４１と比較してワクチン化チキンの組織からずっと迅速に消失する。
【図７】図７は、ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で二度ワクチン化された白色レグホンチキンが、野生型S. Enteritidis（ＳＥ１４７Ｎ）の１−２×１０８ＣＦＵを使用して経口チャレンジ感染を受けた結果を示す図である。チャレンジ感染はブースターワクチン化の２１日後で投与され、更に１４日間分析された。コントロールとして、何も処理していない白色レグホンチキンを同じ４２日齢で感染させた。各種の時間で、両者の動物群内のサルモネラの流出と組織コロニー形成を測定し、その結果が図７Ａに要約されている。前記データは、ワクチン化動物の明らかな保護を明らかにする。かくして、野生型S. Enteritidisを流出する動物の数は、ワクチン化群において明らかに減少する。更に、脾臓及び肝臓においてサルモネラを有する動物の数は、非処理コントロール群と比較してワクチン化動物でここでも低い。ワクチン化動物では、何も処理していない動物よりも盲腸の含有物における野生型サルモネラの数が著しく減少していた（図７Ｂ）。前記データは、Salmovac SEΔｐｈｏＮワクチン株の非自動性変異体であるＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の保護的特徴を明らかに示す。
【図８】図８は、ＩＳＯ６５７９に従った標準的なサルモネラ検出試験と平行して使用される細菌学的ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験の承認を示す図である。図８Ａは、ＸＬＴ４アガープレートと、発色性ホスファターゼ基質ＢＣＩＰ［８０μｇ／ｍｌ］を補ったＬＢ−アガープレートのそれぞれに、野生型Salmonella TyphimuriumとEnteritidisを平行植菌したことを例示的に示す図である。野生型Salmonella TyphimuriumとEnteritidisは一般的に、ＸＬＤ／ＸＬＴ４アガープレートでは黒色のコロニーとして、ＢＣＩＰ ＬＢ−アガープレート（ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験）では青緑色のコロニーとして出現する。図８Ｂでは、生存減弱化Salmonella EnteritidisΔｐｈｏＮワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４の平行植菌が示されている。ΔｐｈｏＮサルモネラワクチン株は、サルモネラ特異的ＸＬＤ／ＸＬＴ４アガープレートでは黒色コロニーを出現するが、ＢＣＩＰ ＬＢ−アガープレートでは非着色を維持した。サルモネラはホスファターゼ活性を有するいくつかの酵素を発現することが既知であるため、この発見は驚くべきものである。ｐｈｏＮ遺伝子の不活性化は、ここに記載された発色性ホスファターゼ反応を阻害するのに十分であることが結論付けられる。概略が記載された試験は、生存減弱化ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡS. Enteritidisワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４を使用してセットアップされた標準的なサルモネラ試験の範囲内で、ワクチン化動物からの感染動物の明白な識別が可能である。
【図９】図９は、白色レグホンチキンにおけるＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験を示す。特に、サルモネラ感染チキン由来の血清（Ｉｎｆ）と、生存減弱化S. EnteritidisｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で免疫化されたチキン由来の血清（Ｖａｃ）を使用する、イムノブロット分析によって承認されたＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験の特異性を示す。図９Ａのブロットは、サルモネラＰｈｏＮの二つの組換え変異体であるＰｈｏＮＦＰ１０１とＰｈｏＮＦＰ２０１で調製された。ブロッティングの前に１０％Schagger-JagowＰＡＧＥで精製サンプルを分離しておいた。ＰｈｏＮＦＰ１０１は元となるＰｈｏＮの一次構造をカバーしている。ＰｈｏＮＦＰ２０１は、切り詰められたＮＨ２末端と、ＰｈｏＮの活性中心でアミノ酸置換を有し、不活性なＰｈｏＮを生じている。イムノブロット分析は、適切なアルカリホスファターゼ接合抗血清を使用して、ＩｇＧ特異的免疫応答を示す。分子量マーカーはレーンＭで示されており、それぞれ４３、３４及び２６ｋＤａに対応する。図９Ａに示されたｐｈｏＮ-ＤＩＶＡ抗体試験は、生存減弱化S. EnteritidisｐｈｏＮ-ＤＩＶＡワクチン株ＣＬＡＢ＿ＳＥ４０４で二度免疫化されたチキン由来の血清（Ｖａｃ）と、毒性S. Enteritidis株ＳＥ１４７Ｎで感染された未処理の動物由来の血清（Ｉｎｆ）で実施された。Ｉｎｆ群の抗体は両者の変異体Ｐｈｏ抗原に結合する。Ｖａｃ群はＰｈｏＮ特異的抗体を生産しない。図９Ｂでは、各種の時間での感染の両動物群の血清を使用するＥＬＩＳＡで測定された、S. Enteritidis溶解物に対するＩｇＧ力価が説明されている。ＤＩＶＡ−Ｖａｃ群では、チャレンジ感染の前（０）及び後、感染後７日目と２８日目でＩｇＧ力価が測定された。Ｉｎｆ群では、同じ態様でＩｇＧ力価が測定された。
【図１０】図１０は、融合タンパク質ＰｈｏＮＦＰ１０１（左側のマップ）とＰｈｏＮＦＰ２０１（右側のマップ）の調製のために使用された発現プラスミドのマップを示す図である。
【図１１】図１１は、ＰｈｏＮＦＰ１０１の遺伝子（Ａ）とコードされた融合タンパク質（Ｂ）の配列を示す図である。
【図１２】図１２は、ＰｈｏＮＦＰ２０１の遺伝子（Ａ）とコードされた融合タンパク質（Ｂ）の配列を示す図である。
【実施例】
【００５８】
実施例１
National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のインターネットポータルを介したデータベース「ｎｒ」を使用するＢＬＡＳＴ２．２．１８によって各種のSalmonella enterica enterica血清型内のタンパク質ＰｈｏＮの相同性を評価した。Salmonella Enteritidis株ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０のタンパク質ＰｈｏＮのアミノ酸配列を、クエリー配列（配列番号１）として使用した。ＣＬＡＢ＿ＳＥ３６０は、ワクチン株Salmovac SEの変異体である（Springer等, 2000, Berl. Munch. Tierarztl, Wschr. 113, 246-252）。各種のＰｈｏＮタンパク質の一次構造内の非同一アミノ酸が、着色によって強調されている。前記データは、各種のサルモネラ血清型内でＰｈｏＮタンパク質の一次構造が＞９６％で同一性を有していることを明らかにする。
【００５９】
対照的に、非サルモネラ細菌内でのＰｈｏＮタンパク質の一次構造は、Salmonella enterica enterica血清型のＰｈｏＮタンパク質と低い関係（＜４０％の同一性）しか有さない。非サルモネラ細菌の最も関連するＰｈｏＮアミノ酸配列が示されている。同一のアミノ酸のみが示されている。変異体（−）、付加的（＋）、または欠けている（Δ）アミノ酸が示されている。全配列は配列表に記載されている（配列番号２１及び２２）。
【００６０】
この結果は図１に要約されている。
【００６１】
実施例２
T. Shigaki及びK.D. Hirschi (Anal. Biochem. 2001, 298:118-120)またはK.A. Datsenko及びB.L. Wanner(PNAS 2000, 97:6640-6645)によって記載されたような遺伝学的操作による、ΔｐｈｏＮサルモネラミュータントの調製に関連するｐｈｏＮ遺伝子と隣接領域を含む各種のSalmonella enterica enterica血清型のｐｈｏＮゲノム領域が記載される。
【００６２】
ｐｈｏＮゲノム領域は、以下のように図２に示されている：
図２Ａ：S. Enteritidis str. P125109（RefSeq NC011294.1から引用）
S. Dublin str. CT_02021853（RefSeq NC011205.1から引用）
S. Gallinarum str. 287／91（RefSeq NC011274.1から引用）
図２Ｂ：S. Typhimurium str. LT2（RefSeq NC003197.1から引用）
図２Ｃ：S. Choleraesuis str. SC-B67（RefSeq NC006905.1から引用）
【００６３】
実施例３
本実施例では、ｐｈｏＮ遺伝子が、生存減弱化Salmonella Enteritidisワクチン株Salmovac SEの変異体から元々由来したSalmonella Enteritidis株のゲノムから遺伝学的操作により除去された。驚くべきことにより詳細な分析により、ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidisワクチン株変異体の集団において差異が示された。いくつかの限られたΔｐｈｏＮワクチン株変異体は、先祖株及び他のΔｐｈｏＮワクチン株変異体の少なくとも３０％である自動性活性を有する。更に、この減少した自動性のΔｐｈｏＮワクチン株変異体は、バイオフィルムを形成する能力も減少しており、このことは更に先祖株及び他のΔｐｈｏＮ変異体とは異なる。
【００６４】
指摘された差異に加えて、調査された全てのΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体はアデニン及びヒスチジンに対して独立栄養性であり、複雑なリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を発現する。それらは既知の毒性プラスミドのいずれかを含むものではない。かくして、全てのΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体は、ドイツにおける産卵鶏のワクチン化について承認されているSalmovac SEの関連する特徴を含む。
【００６５】
単一の変異体、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４を、減少した自動性とバイオフィルム能力を有するΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体の集団から選択した。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の更なる分析により、これらの更に同定された特徴が１５０世代を超えて安定であることが明らかにされた。
【００６６】
株ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、寄託番号ＤＳＭ２１９７２の下で、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7B, D-38124 Braunschweigに２００８年１１月１０日でブタペスト条約の下で寄託されている。
【００６７】
以下の分析では、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の毒性と効力を、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidisワクチン株変異体及び元となるワクチン株と比較した。
【００６８】
サルモネラワクチン株の毒性を、in vitro及びin vivo実験によって評価した。ＭＤＣＫ細胞の定量的な感染により、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４が先祖株及び自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりもＭＤＣＫ細胞において毒性が小さいことが明らかに示された。
【００６９】
一日齢のチキンを、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis群の単一の変異体のいずれかで経口的に植菌した。その後、ワクチン化動物の各種の組織におけるサルモネラの存在を、細菌学的手段により測定した。前記データは、ワクチン化の７日後で両者の動物群において肝臓及び脾臓における同量のサルモネラを明らかにする。この後、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４の量は、肝臓及び脾臓で減少するが、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体株を受けた動物の器官では高いままである。盲腸組織では、同様の結果が得られた。このデータは、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４が自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりも毒性が低いことを明らかに示す。ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体よりもずっと早期に、ワクチン化チキンの組織及び排泄物から消失する。
【００７０】
ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis株の免疫原性を、１日齢及び２１日齢で、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体のいずれかで経口的にワクチン化されたチキンにおいて測定した。両動物群の体液性及び粘膜性免疫応答を、サルモネラ抗原を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。そのデータにより、両者のワクチン株は、経口的にワクチン化されたチキンにおいて体液性及び粘膜性免疫応答を誘導することが明らかとなり、この免疫応答は最後のワクチン化の５０日以上後でも高いままであった。かくして、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体と同様の免疫原性効力を有する。
【００７１】
最後に、１日齢及び２１日齢でＣＬＡＢ ＳＥ４０４または自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体のいずれかによって経口的にワクチン化されたチキンは、毒性Salmonella enterica enterica Enteritidis単離物でのチャレンジ感染に抵抗性であることを示すことができた。かくして、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、自動性ΔｐｈｏＮSalmonella Enteritidis変異体と同様の保護的効力を有する。
【００７２】
要約すると、ＣＬＡＢ ＳＥ４０４は、低い流出と高い効力を有する家禽のための新規な生存減弱化サルモネラワクチンとして同定され、更にワクチン化動物から感染動物を識別することが可能であることが同定された。
【００７３】
実施例４
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験のための組換えＰｈｏＮタンパク質の調製
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験は、組換えＰｈｏＮに基づいて好ましくは調製される。精製組換えＰｈｏＮでの以前のイムノブロット分析により、生存減弱化サルモネラｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された動物は、この全体タンパク質に結合する抗体を生成しないことが明らかである。ＰｈｏＮタンパク質の複雑性と、体液性免疫応答の広範囲の反応性にも関わらず、ｐｈｏＮ−ＤＩＶＡサルモネラワクチン株で免疫化された動物の血清内で、交差反応する抗体が存在しないことは驚くべきことであった。
【００７４】
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験のための組換えＰｈｏＮは、高純度で調製されてよい。いずれかの不純物は、ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡサルモネラワクチンで免疫化された家畜の広範囲の抗体によって検出されても良く、かくしてＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験で偽の結果を生ずるであろう。
【００７５】
純粋なＰｈｏＮの調製は、高ストリンジェントな精製条件を可能にする外的ポリペプチド断片で、ＰｈｏＮの一次構造を伸張することによって容易にされてよい。好ましくは、一連のヒスチジン（Ｈｉｓタグ）を、ＰｈｏＮのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで導入する。更に、Ｈｉｓタグの除去を可能にするエンドペプチダーゼ、例えばトロンビンによって特異的に認識される別のタンパク質ドメインを、ＨｉｓタグとＰｈｏＮ構造との間に導入してよい。この分析により、Ｈｉｓタグとトロンビン部位を含むＰｈｏＮのそのような融合タンパク質が、以前の分析で示された生存減弱化サルモネラＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された動物の血清に干渉しないことが明らかである。
【００７６】
ＰｈｏＮの融合タンパク質は、従来の発現ベクター、例えばｐＥＴ１５ｂにより、供給者、例えばNovagenによって示された標準的な精製プロトコールを適用することによって、大腸菌で調製できる。図１０〜１２は、使用された発現プラスミドのマップ、例示的に調製されたＰｈｏＮ融合タンパク質、ＰｈｏＮＦＰ１０１及びＰｈｏＮＦＰ２０１のＤＮＡ及びアミノ酸配列を開示する。
【００７７】
ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験
チキンが生存減弱化サルモネラｐｈｏＮ−ＤＩＶＡワクチン株でワクチン化された際はいつでも、ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験を適用する。本実施例では、血清学的ＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ試験システムは、組換えタンパク質ＰｈｏＮ、例えばＰｈｏＮＦＰ１０１またはＰｈｏＮＦＰ２０１、及び別のサルモネラ特異的抗原を含む。好ましくは、サルモネラ特異的抗原は、例えばIdexx Laboratories Inc. (Flockchek)、またはLabor Diagnostik GmbH Leipzig (Flocktype Salmonella)、またはBiochek及び他の会社によって提供される、チキンにおけるサルモネラ特異的抗体を検出する市販の試験キットによって提供される。この試験セットアップは、ワクチン化の後にサルモネラ特異的免疫応答が出現するかどうかを明らかにする。更に、野生型サルモネラが関与していないことを明らかにし、それはＰｈｏＮ−ＤＩＶＡ抗体試験における組換えタンパク質ＰｈｏＮでネガティブな反応によって指摘される。
【００７８】
一般的に、サルモネラ特異的抗体の検出のための市販の試験キットは、マイクロタイタープレートにおける間接的ＥＬＩＳＡとして準備されている。供給者に依存して、サルモネラ特異的抗原または抗原ミックスは、マイクロタイタープレートのバイアルにすでに結合されているか、ストック溶液の一部を使用して後に結合されなければならない。
【００７９】
精製ＰｈｏＮ、例えばＰｈｏＮＦＰ２０１は、適切な防腐剤と共に凍結ストック溶液または凍結乾燥物として好ましくは提供される。本実施例では、ＰｈｏＮ特異的抗体の検出のためのＥＬＩＳＡは、例えばAntibodies. A Laboratory ManualにおけるE. Harlow及びD. Laneによるもののようないずれかで記載された標準的なプロトコールに従って実施される。
【００８０】
【表１】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Salmonella enterica ssp. enterica血清型Enteritidis株ＤＳＭ２１９７２またはそれから由来するいずれかの株。
【請求項２】
医薬、例えば獣医薬における使用のための、請求項１に記載の株。
【請求項３】
ワクチンとしての使用のための、請求項２に記載の株。
【請求項４】
生ワクチンとしての使用のための、請求項３に記載の株。
【請求項５】
サルモネラ感染に対して保護するためのワクチンとしての使用のための、請求項３または４に記載の株。
【請求項６】
哺乳類、例えばブタ、または鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の株。
【請求項７】
血清学的マーカー抗原としての、サルモネラｐｈｏＮポリペプチドまたは／及びその免疫原性部分を含むポリペプチドの使用であって、前記ｐｈｏＮポリペプチドは、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含み、前記免疫原性部分は、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０アミノ酸の長さを有する、使用。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の株でのワクチン化後の、ワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）のための、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ｐｈｏＮ抗原が、特に大腸菌のような組換え宿主細胞における、ｐｈｏＮ核酸の組換え発現によって調製される、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の全長ｐｈｏＮポリペプチドを含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも一つの組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原、またはその免疫原性部分、及び任意に更なる試験成分を含む、サルモネラｐｈｏＮ抗原に対して向けられた抗体の検出のための血清学的試験システムであって、前記ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含む、システム。
【請求項１２】
組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原またはその免疫原性断片の製造のための、サルモネラｐｈｏＮ核酸の使用であって、前記ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含む、使用。
【請求項１】
Salmonella enterica ssp. enterica血清型Enteritidis株ＤＳＭ２１９７２またはそれから由来するいずれかの株。
【請求項２】
医薬、例えば獣医薬における使用のための、請求項１に記載の株。
【請求項３】
ワクチンとしての使用のための、請求項２に記載の株。
【請求項４】
生ワクチンとしての使用のための、請求項３に記載の株。
【請求項５】
サルモネラ感染に対して保護するためのワクチンとしての使用のための、請求項３または４に記載の株。
【請求項６】
哺乳類、例えばブタ、または鳥類、例えばチキンのような家禽における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の株。
【請求項７】
血清学的マーカー抗原としての、サルモネラｐｈｏＮポリペプチドまたは／及びその免疫原性部分を含むポリペプチドの使用であって、前記ｐｈｏＮポリペプチドは、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含み、前記免疫原性部分は、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０アミノ酸の長さを有する、使用。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の株でのワクチン化後の、ワクチン化動物からの感染動物の識別（ＤＩＶＡ）のための、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ｐｈｏＮ抗原が、特に大腸菌のような組換え宿主細胞における、ｐｈｏＮ核酸の組換え発現によって調製される、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の全長ｐｈｏＮポリペプチドを含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも一つの組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原、またはその免疫原性部分、及び任意に更なる試験成分を含む、サルモネラｐｈｏＮ抗原に対して向けられた抗体の検出のための血清学的試験システムであって、前記ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含む、システム。
【請求項１２】
組換えサルモネラｐｈｏＮ抗原またはその免疫原性断片の製造のための、サルモネラｐｈｏＮ核酸の使用であって、前記ｐｈｏＮ抗原が、配列番号１の配列、または配列番号１に少なくとも７０％同一である配列を含む、使用。
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２Ｃ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５０９０７５（Ｐ２０１２−５０９０７５Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６８７７（Ｐ２０１１−５３６８７７）
【出願日】平成２１年１１月２０日（２００９．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５５７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７９８５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５１１１２２３８５）グラビティ・ホールディング・アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２０日（２００９．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５５７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７９８５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５１１１２２３８５）グラビティ・ホールディング・アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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