シャペロンを利用するＦｃ結合性タンパク質の製造方法
【課題】 ヒトＦｃ受容体等のＦｃ結合性タンパク質を安価に製造可能な、微生物を利用したＦｃ結合性タンパク質の製造方法において、リフォールディング操作の不要な、活性を有したＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造する方法を提供すること。
【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質とＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させる製造方法により、前記課題を解決する。
【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質とＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させる製造方法により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体と親和性があり、抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして利用可能なＦｃ結合性タンパク質を、高効率に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、ガン等に対する治療薬、診断薬、研究試薬等に用いられており、バイオテクノロジー産業の中核的な物質および技術を担っている。抗体を工業的に製造する際は、前記抗体を産生可能な動物細胞（ＣＨＯ細胞等）を培養し、培養上清中に前記抗体を分泌産生後、細胞除去、粗精製工程、クロマトグラフィーによる精製工程を経ることで、高純度な抗体を製造している。
【０００３】
抗体を製造する際、精製工程で用いるクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの他に、抗体との特異的な結合性を利用したアフィニティークロマトグラフィーもよく用いられる。抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞表面に存在するプロテインＡが従来より用いられている。しかしながら、例えば医薬品用途といった、高い精製度が要求される分野では、プロテインＡよりも高い特異性を有するクロマトグラフィー用リガンドが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロテインＡに代わる抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用リガンドの候補として、抗体の定常領域であるＦｃ領域と結合するヒトＦｃ受容体があげられる。ヒトＦｃ受容体は免疫細胞表面に存在する分子量数万のタンパク質であり、抗体ＩｇＧの受容体としてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩのサブタイプに分類される（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜貫通領域と細胞外領域の境界にあるシステインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００７】
ヒトＦｃ受容体に限らず、ヒトタンパク質を発現・製造するためにはＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いる方法が一般的である。しかしながら、前記方法は動物細胞を培養するための培地が非常に高価であるため、製造コストが高くなる問題点がある。一方、培養するための培地原料が安価、かつ増殖速度の速い、微生物を利用したヒトＦｃ受容体の発現・製造方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、微生物を利用した製造方法で得られたヒトＦｃ受容体は不活性化型として発現するため、活性を有したヒトＦｃ受容体を得るには煩雑なリフォールディング操作を必要とした（特許文献１）。
【０００８】
そこで本発明は、ヒトＦｃ受容体等のＦｃ結合性タンパク質を安価に製造可能な、微生物を利用したＦｃ結合性タンパク質の製造方法において、リフォールディング操作が不要な、活性を有したＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質と特定のシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させることにより、活性を有したＦｃ結合性タンパク質を高効率に発現することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【００１２】
（２）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【００１３】
（３）シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦからなるタンパク質である、（１）または（２）に記載の製造方法。
【００１４】
（４）Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質、または１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質である、（１）から（３）のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
（５）（１）から（４）のいずれかの製造方法により得られた、Ｆｃ結合性タンパク質。
【００１６】
（６）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域と結合する細胞表面に存在する受容体タンパク質である。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体の場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩなどがあげられる。
【００１９】
ヒトＦｃ受容体のうち、ヒトＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでのアミノ酸）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでのアミノ酸）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでのアミノ酸）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目までのスレオニンまでのアミノ酸）から構成される。
【００２０】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質の一態様として、ヒトＦｃγＲＩのうち抗体と結合する領域を含むタンパク質があげられ、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩがあげられる。なお、ＥＣ領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部が含まれていてもよいし、ＥＣ領域のＣ末端側にある膜貫通領域（図１のＴＭ領域）の全てまたは一部や細胞内領域（図１のＣ領域）の一部が含まれていてもよい。また、ポリヒスチジンタグといった、精製などを行なうためのタグペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に付加されていてもよい。
【００２１】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質の別の態様として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩであって、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩがあげられる。前記アミノ酸置換を行なう箇所および置換数は、抗体結合活性を失わない限り任意設定が可能であり、一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩであって、
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（オ）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（カ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（キ）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（ク）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（コ）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（サ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（シ）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（ス）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（セ）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（ソ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（タ）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（チ）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（ツ）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（テ）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（ト）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（ナ）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（ニ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（ヌ）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（ネ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（ノ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（ハ）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（ヒ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（フ）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（へ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（ホ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
のいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、ヒトＦｃγＲＩがあげられる（特願２０１０−０５２７８９号）。
【００２２】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製方法として、
（Ｉ）Ｆｃ結合性タンパク質（たとえばヒトＦｃγＲＩ）のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して作製する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質（たとえばヒトＦｃγＲＩ）遺伝子の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し作製する方法、が例示できる。
【００２３】
なお、前記（Ｉ）において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することによっても可能である。また、前記（Ｉ）および（ＩＩ）の方法で作製した、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特願２００９−２５６１８０号）。
【００２４】
本発明の製造方法は、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させてＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造する方法である。シャペロンタンパク質は、宿主内でタンパク質の高次構造化を手助けするタンパク質の総称であり、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥが例示できる。このうち、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦが本発明の製造方法でＦｃ結合性タンパク質と共発現させるシャペロンタンパク質として好ましく、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをシャペロンタンパク質としてＦｃ結合性タンパク質と共発現させるとより好ましい。ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の一態様として配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＬ５５９９９）が、ＧｒｏＥＳのアミノ酸配列の一態様として配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＧ５９３４１）が、ＴＦのアミノ酸配列の一態様として配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６２７９１）がそれぞれあげられる。一方、実施例に記載のように、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥの全てが含まれているとＦｃ結合性タンパク質が発現しないことから、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥの全てが含まれるのは好ましくない。
【００２５】
本発明の製造方法で使用する宿主は、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主とするのが好ましい。本発明の製造方法で使用する宿主として好ましい大腸菌の一例として、大腸菌 Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＬＥ３９２株、ＪＭ８３株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＭＮ５２２株、Ｍ１５株、ＢＬ２１株、ＨＢ１０１株があげられる。
【００２６】
本発明の製造方法において、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを共発現可能な宿主を得る方法としては、
（Ａ）シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｆｃ結合性タンパク質を発現する宿主に導入して得る方法、
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得る方法、
（Ｃ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（プラスミド）とで宿主を形質転換して得る方法、
が例示できる。このうち、発現ベクター（プラスミド）を用いてＦｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを共発現可能な宿主を得る方法（前記（Ｂ）および（Ｃ）の方法）が、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質との共発現が可能な宿主が安定的に得られる点で好ましい。
【００２７】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するのに用いる発現ベクターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃ９９ａベクター、ｐＢＢＲベクターが例示できる。シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（プラスミド）としては、シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＧｒｏ７、シャペロンタンパク質ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＴｆ１６、シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＧ−Ｔｆ２、が例示できる。
【００２８】
Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質との共発現が可能な本発明の宿主（形質転換体）を培養し、培養液からＦｃ結合性タンパク質を抽出することにより、Ｆｃ結合性タンパク質を製造することができる。本発明の形質転換体は、形質転換体（宿主）の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入の有無によって形質転換体の増殖を選択的に可能とするために、培地に前記発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、前記発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良く、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。
【００２９】
本発明の形質転換体の培養温度は形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４が好ましく、ｐＨ７．０前後がより好ましい。
【００３０】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、前記Ｆｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドが良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）やアラビノースを例示することができる。形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭ程度が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３１】
本発明の形質転換体の培養液からＦｃ結合性タンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕して、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。抽出タンパク質の中からＦｃ結合性タンパク質を分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に精製することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の製造方法は、Ｆｃ結合性タンパク質と、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質とを宿主内で共発現させることを特徴とし、本発明の製造方法によりＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造することができる。本発明の製造方法で得られたＦｃ結合性タンパク質は、抗体の免疫活性測定用試薬、抗体精製用クロマトグラフィー用リガンド、抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体を作製するための免疫原などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩの構造の概略を示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ シャペロンプラスミドにより形質転換された形質転換体の作製
（１）下記に示す市販のシャペロンプラスミド（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｅｔ、タカラバイオ社製、製品コード３３４０）を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）に、それぞれヒートショック法で導入し、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で形質転換した。
（ａ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７、
（ｂ）シャペロンタンパク質ＴＦ（トリガーファクター）をコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＴｆ１６、
（ｃ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２、
（ｄ）シャペロンタンパク質ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＫＪＥ７、
（ｅ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧ−ＫＪＥ８。
（２）各シャペロンプラスミドで形質転換して得られた形質転換体を釣菌し、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養した（３０℃・１８時間）。
（３）培養後、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を使用しプラスミドを調製した。調製液を０．９％のアガロース電気泳動に供した結果、各シャペロンプラスミド（ｐＧｒｏ７、ｐＴｆ１６、ｐＧ−Ｔｆ２、ｐＫＪＥ７、ｐＧ−ＫＪＥ８）の導入を確認した。
【００３６】
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質の発現
（１）実施例１で作製した、各シャペロンプラスミドで形質転換して得られた形質転換体のコンピテントセルを以下の方法で作製した。
（１−１）実施例１で作製した形質転換体を、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３ｍＬに接種し培養した（３０℃・１８時間）。
（１−２）得られた培養液０．４ｍＬを（１−１）の培地４０ｍＬを添加した１００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに接種後培養し、６００ｎｍの吸光度をモニターすることにより対数増殖期の菌体培養液を調製した。
（１−３）調製した菌体培養液を５０ｍＬ容量の遠沈管に移し、氷中で５分間冷却し、遠心分離操作（３０００ｒｐｍ・５分間）後、遠心上清を除去し菌体を集菌した。
（１−４）集菌した菌体に冷却した５０ｍＭの塩化カルシウム溶液４０ｍＬを添加し、懸濁後、再度遠心分離操作に供した。
（１−５）上清を除去し、冷却した塩化カルシウム溶液２ｍＬを添加し、懸濁菌体をコンピテントセルとした。
（２）特許文献２に記載の方法に従い、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴＥＣＦｃＲを作製した。
（３）（１）のコンピテントセルにヒートショック法により、ｐＥＴＥＣＦｃＲを導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にて形質転換した。
【００３７】
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質の発現および調製
（１）実施例２で作製した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で前培養（３０℃・１８時間）し、得られた培養液０．４ｍＬを、同培地４０ｍＬを添加した１００ｍＬ容バッフル付フラスコに接種した。併せて、シャペロンタンパク質発現用の誘導物質（インデューサー）を、各シャペロプラスミドに適した濃度になるようにそれぞれ添加した（表１）。
【００３８】
【表１】
（２）６００ｎｍにおける吸光度をモニターしながら３０℃で振とう培養し、ＯＤ６００ｎｍが２．５から３．０になった時点で培養液を氷上で冷却した。
（３）培養液を１２℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１２℃の低温で振とう培養を開始した。
（４）ＩＰＴＧ誘導開始後、適時、培養液を１ｍＬずつ採取し、遠心分離で菌体ペレットを得た。
（５）得られた菌体ペレットから、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ抽出液（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてタンパク質を抽出した。
【００３９】
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質の活性測定
実施例３で調製したタンパク質抽出液を用いて活性型として発現しているＦｃ結合性タンパク質量を下記に示すＥＬＩＳＡ法により定量した。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質を定量するためのＥＬＩＳＡプレートを下記の方法で作製した。
（１−１）マキシソープ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ社製）に、１０μｇ／ｍＬのヒトガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）１００μＬを各ウェルに添加し、４℃で１６時間静置することによってヒトガンマグロブリンをプレート固相に固定化した。
（１−２）ヒトガンマグロブリンを固定化したプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＢＳＴ）で洗浄し、次いで、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製）２００μＬを各ウェルに添加した。
（１−３）３０℃で２時間の静置によりブロッキング工程を終え、Ｆｃ結合性タンパク質定量用のＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（２）（１）で作製したＦｃ結合性タンパク質定量用のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、適当な倍率で希釈した実施例３で調製したタンパク質抽出液を１００μＬずつ添加後、３０℃で１時間反応させた。
（３）ＴＢＳＴにて洗浄し、１００００倍希釈したＨｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬを各ウェルに添加後、３０℃で１時間反応させた。
（４）反応後、ＴＢＳＴによりプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質（ＴＭＢ：ナカライテスク社製）を添加した。２分後、１Ｍのリン酸水溶液を添加して反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、定量のための標準物質として市販のヒトＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を使用し、その吸光度との比較からＦｃ結合性タンパク質を定量した。なお、シャペロンプラスミドで形質転換されていない、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＥＣＦｃＲを別途作製し対照として用いた。
【００４０】
培養４２時間後における、各形質転換体でのＦｃ結合性タンパク質生産量を比較した結果を表２に示す。表２の通り、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥを用いた系（ｐＫＪＥ７で形質転換した形質転換体）、ならびにＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥを用いた系（ｐＧ−ＫＪＥ８で形質転換した形質転換体）では大腸菌の増殖阻害により、採取したタンパク質抽出液からＦｃ結合性タンパク質を検出することができなかった。一方、シャペロンタンパク質としてＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを用いた系（ｐＧｒｏ７で形質転換した形質転換体）、ならびにＴＦを用いた系（ｐＴＦ１６で形質転換した形質転換体）では、対照であるシャペロンプラスミドで形質転換していない系（シャペロンタンパク質と共発現させていない系）と比較し、有意に生産性が向上した。さらに、シャペロンタンパク質としてＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦを用いた系（ｐＧ−Ｔｆ２で形質転換した形質転換体）では、対照と比較し約１０倍（１２５７μｇ／Ｌ（培養液））のＦｃ結合性タンパク質を生産していた。以上より、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦのいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質と、Ｆｃ結合性タンパク質とを、宿主で共発現させることで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産量を向上させることができた。
【００４１】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体と親和性があり、抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして利用可能なＦｃ結合性タンパク質を、高効率に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、ガン等に対する治療薬、診断薬、研究試薬等に用いられており、バイオテクノロジー産業の中核的な物質および技術を担っている。抗体を工業的に製造する際は、前記抗体を産生可能な動物細胞（ＣＨＯ細胞等）を培養し、培養上清中に前記抗体を分泌産生後、細胞除去、粗精製工程、クロマトグラフィーによる精製工程を経ることで、高純度な抗体を製造している。
【０００３】
抗体を製造する際、精製工程で用いるクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの他に、抗体との特異的な結合性を利用したアフィニティークロマトグラフィーもよく用いられる。抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞表面に存在するプロテインＡが従来より用いられている。しかしながら、例えば医薬品用途といった、高い精製度が要求される分野では、プロテインＡよりも高い特異性を有するクロマトグラフィー用リガンドが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロテインＡに代わる抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用リガンドの候補として、抗体の定常領域であるＦｃ領域と結合するヒトＦｃ受容体があげられる。ヒトＦｃ受容体は免疫細胞表面に存在する分子量数万のタンパク質であり、抗体ＩｇＧの受容体としてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩのサブタイプに分類される（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜貫通領域と細胞外領域の境界にあるシステインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００７】
ヒトＦｃ受容体に限らず、ヒトタンパク質を発現・製造するためにはＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いる方法が一般的である。しかしながら、前記方法は動物細胞を培養するための培地が非常に高価であるため、製造コストが高くなる問題点がある。一方、培養するための培地原料が安価、かつ増殖速度の速い、微生物を利用したヒトＦｃ受容体の発現・製造方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、微生物を利用した製造方法で得られたヒトＦｃ受容体は不活性化型として発現するため、活性を有したヒトＦｃ受容体を得るには煩雑なリフォールディング操作を必要とした（特許文献１）。
【０００８】
そこで本発明は、ヒトＦｃ受容体等のＦｃ結合性タンパク質を安価に製造可能な、微生物を利用したＦｃ結合性タンパク質の製造方法において、リフォールディング操作が不要な、活性を有したＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質と特定のシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させることにより、活性を有したＦｃ結合性タンパク質を高効率に発現することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【００１２】
（２）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【００１３】
（３）シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦからなるタンパク質である、（１）または（２）に記載の製造方法。
【００１４】
（４）Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質、または１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質である、（１）から（３）のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
（５）（１）から（４）のいずれかの製造方法により得られた、Ｆｃ結合性タンパク質。
【００１６】
（６）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域と結合する細胞表面に存在する受容体タンパク質である。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体の場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩなどがあげられる。
【００１９】
ヒトＦｃ受容体のうち、ヒトＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでのアミノ酸）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでのアミノ酸）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでのアミノ酸）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目までのスレオニンまでのアミノ酸）から構成される。
【００２０】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質の一態様として、ヒトＦｃγＲＩのうち抗体と結合する領域を含むタンパク質があげられ、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩがあげられる。なお、ＥＣ領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部が含まれていてもよいし、ＥＣ領域のＣ末端側にある膜貫通領域（図１のＴＭ領域）の全てまたは一部や細胞内領域（図１のＣ領域）の一部が含まれていてもよい。また、ポリヒスチジンタグといった、精製などを行なうためのタグペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に付加されていてもよい。
【００２１】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質の別の態様として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩであって、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩがあげられる。前記アミノ酸置換を行なう箇所および置換数は、抗体結合活性を失わない限り任意設定が可能であり、一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトＦｃγＲＩであって、
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（オ）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（カ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（キ）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（ク）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（コ）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（サ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（シ）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（ス）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（セ）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（ソ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（タ）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（チ）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（ツ）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（テ）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（ト）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（ナ）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（ニ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（ヌ）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（ネ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（ノ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（ハ）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（ヒ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（フ）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（へ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（ホ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
のいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、ヒトＦｃγＲＩがあげられる（特願２０１０−０５２７８９号）。
【００２２】
本発明の製造方法で発現させるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製方法として、
（Ｉ）Ｆｃ結合性タンパク質（たとえばヒトＦｃγＲＩ）のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して作製する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質（たとえばヒトＦｃγＲＩ）遺伝子の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し作製する方法、が例示できる。
【００２３】
なお、前記（Ｉ）において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することによっても可能である。また、前記（Ｉ）および（ＩＩ）の方法で作製した、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特願２００９−２５６１８０号）。
【００２４】
本発明の製造方法は、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させてＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造する方法である。シャペロンタンパク質は、宿主内でタンパク質の高次構造化を手助けするタンパク質の総称であり、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥが例示できる。このうち、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦが本発明の製造方法でＦｃ結合性タンパク質と共発現させるシャペロンタンパク質として好ましく、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをシャペロンタンパク質としてＦｃ結合性タンパク質と共発現させるとより好ましい。ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の一態様として配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＬ５５９９９）が、ＧｒｏＥＳのアミノ酸配列の一態様として配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＧ５９３４１）が、ＴＦのアミノ酸配列の一態様として配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６２７９１）がそれぞれあげられる。一方、実施例に記載のように、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥの全てが含まれているとＦｃ結合性タンパク質が発現しないことから、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥの全てが含まれるのは好ましくない。
【００２５】
本発明の製造方法で使用する宿主は、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主とするのが好ましい。本発明の製造方法で使用する宿主として好ましい大腸菌の一例として、大腸菌 Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＬＥ３９２株、ＪＭ８３株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＭＮ５２２株、Ｍ１５株、ＢＬ２１株、ＨＢ１０１株があげられる。
【００２６】
本発明の製造方法において、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを共発現可能な宿主を得る方法としては、
（Ａ）シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｆｃ結合性タンパク質を発現する宿主に導入して得る方法、
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得る方法、
（Ｃ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（プラスミド）とで宿主を形質転換して得る方法、
が例示できる。このうち、発現ベクター（プラスミド）を用いてＦｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを共発現可能な宿主を得る方法（前記（Ｂ）および（Ｃ）の方法）が、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質との共発現が可能な宿主が安定的に得られる点で好ましい。
【００２７】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するのに用いる発現ベクターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃ９９ａベクター、ｐＢＢＲベクターが例示できる。シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（プラスミド）としては、シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＧｒｏ７、シャペロンタンパク質ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＴｆ１６、シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＧ−Ｔｆ２、が例示できる。
【００２８】
Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質との共発現が可能な本発明の宿主（形質転換体）を培養し、培養液からＦｃ結合性タンパク質を抽出することにより、Ｆｃ結合性タンパク質を製造することができる。本発明の形質転換体は、形質転換体（宿主）の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入の有無によって形質転換体の増殖を選択的に可能とするために、培地に前記発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、前記発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良く、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。
【００２９】
本発明の形質転換体の培養温度は形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４が好ましく、ｐＨ７．０前後がより好ましい。
【００３０】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、前記Ｆｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドが良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）やアラビノースを例示することができる。形質転換体（宿主）が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭ程度が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３１】
本発明の形質転換体の培養液からＦｃ結合性タンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕して、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。抽出タンパク質の中からＦｃ結合性タンパク質を分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に精製することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の製造方法は、Ｆｃ結合性タンパク質と、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質とを宿主内で共発現させることを特徴とし、本発明の製造方法によりＦｃ結合性タンパク質を高効率に製造することができる。本発明の製造方法で得られたＦｃ結合性タンパク質は、抗体の免疫活性測定用試薬、抗体精製用クロマトグラフィー用リガンド、抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体を作製するための免疫原などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩの構造の概略を示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ シャペロンプラスミドにより形質転換された形質転換体の作製
（１）下記に示す市販のシャペロンプラスミド（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｅｔ、タカラバイオ社製、製品コード３３４０）を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）に、それぞれヒートショック法で導入し、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で形質転換した。
（ａ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７、
（ｂ）シャペロンタンパク質ＴＦ（トリガーファクター）をコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＴｆ１６、
（ｃ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２、
（ｄ）シャペロンタンパク質ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＫＪＥ７、
（ｅ）シャペロンタンパク質ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥをコードするポリヌクレオチドを含むシャペロンプラスミドｐＧ−ＫＪＥ８。
（２）各シャペロンプラスミドで形質転換して得られた形質転換体を釣菌し、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養した（３０℃・１８時間）。
（３）培養後、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を使用しプラスミドを調製した。調製液を０．９％のアガロース電気泳動に供した結果、各シャペロンプラスミド（ｐＧｒｏ７、ｐＴｆ１６、ｐＧ−Ｔｆ２、ｐＫＪＥ７、ｐＧ−ＫＪＥ８）の導入を確認した。
【００３６】
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質の発現
（１）実施例１で作製した、各シャペロンプラスミドで形質転換して得られた形質転換体のコンピテントセルを以下の方法で作製した。
（１−１）実施例１で作製した形質転換体を、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３ｍＬに接種し培養した（３０℃・１８時間）。
（１−２）得られた培養液０．４ｍＬを（１−１）の培地４０ｍＬを添加した１００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに接種後培養し、６００ｎｍの吸光度をモニターすることにより対数増殖期の菌体培養液を調製した。
（１−３）調製した菌体培養液を５０ｍＬ容量の遠沈管に移し、氷中で５分間冷却し、遠心分離操作（３０００ｒｐｍ・５分間）後、遠心上清を除去し菌体を集菌した。
（１−４）集菌した菌体に冷却した５０ｍＭの塩化カルシウム溶液４０ｍＬを添加し、懸濁後、再度遠心分離操作に供した。
（１−５）上清を除去し、冷却した塩化カルシウム溶液２ｍＬを添加し、懸濁菌体をコンピテントセルとした。
（２）特許文献２に記載の方法に従い、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴＥＣＦｃＲを作製した。
（３）（１）のコンピテントセルにヒートショック法により、ｐＥＴＥＣＦｃＲを導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にて形質転換した。
【００３７】
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質の発現および調製
（１）実施例２で作製した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で前培養（３０℃・１８時間）し、得られた培養液０．４ｍＬを、同培地４０ｍＬを添加した１００ｍＬ容バッフル付フラスコに接種した。併せて、シャペロンタンパク質発現用の誘導物質（インデューサー）を、各シャペロプラスミドに適した濃度になるようにそれぞれ添加した（表１）。
【００３８】
【表１】
（２）６００ｎｍにおける吸光度をモニターしながら３０℃で振とう培養し、ＯＤ６００ｎｍが２．５から３．０になった時点で培養液を氷上で冷却した。
（３）培養液を１２℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１２℃の低温で振とう培養を開始した。
（４）ＩＰＴＧ誘導開始後、適時、培養液を１ｍＬずつ採取し、遠心分離で菌体ペレットを得た。
（５）得られた菌体ペレットから、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ抽出液（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてタンパク質を抽出した。
【００３９】
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質の活性測定
実施例３で調製したタンパク質抽出液を用いて活性型として発現しているＦｃ結合性タンパク質量を下記に示すＥＬＩＳＡ法により定量した。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質を定量するためのＥＬＩＳＡプレートを下記の方法で作製した。
（１−１）マキシソープ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ社製）に、１０μｇ／ｍＬのヒトガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）１００μＬを各ウェルに添加し、４℃で１６時間静置することによってヒトガンマグロブリンをプレート固相に固定化した。
（１−２）ヒトガンマグロブリンを固定化したプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＢＳＴ）で洗浄し、次いで、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製）２００μＬを各ウェルに添加した。
（１−３）３０℃で２時間の静置によりブロッキング工程を終え、Ｆｃ結合性タンパク質定量用のＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（２）（１）で作製したＦｃ結合性タンパク質定量用のＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、適当な倍率で希釈した実施例３で調製したタンパク質抽出液を１００μＬずつ添加後、３０℃で１時間反応させた。
（３）ＴＢＳＴにて洗浄し、１００００倍希釈したＨｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬを各ウェルに添加後、３０℃で１時間反応させた。
（４）反応後、ＴＢＳＴによりプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質（ＴＭＢ：ナカライテスク社製）を添加した。２分後、１Ｍのリン酸水溶液を添加して反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、定量のための標準物質として市販のヒトＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を使用し、その吸光度との比較からＦｃ結合性タンパク質を定量した。なお、シャペロンプラスミドで形質転換されていない、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＥＣＦｃＲを別途作製し対照として用いた。
【００４０】
培養４２時間後における、各形質転換体でのＦｃ結合性タンパク質生産量を比較した結果を表２に示す。表２の通り、シャペロンタンパク質としてｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥを用いた系（ｐＫＪＥ７で形質転換した形質転換体）、ならびにＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪおよびｇｒｐＥを用いた系（ｐＧ−ＫＪＥ８で形質転換した形質転換体）では大腸菌の増殖阻害により、採取したタンパク質抽出液からＦｃ結合性タンパク質を検出することができなかった。一方、シャペロンタンパク質としてＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを用いた系（ｐＧｒｏ７で形質転換した形質転換体）、ならびにＴＦを用いた系（ｐＴＦ１６で形質転換した形質転換体）では、対照であるシャペロンプラスミドで形質転換していない系（シャペロンタンパク質と共発現させていない系）と比較し、有意に生産性が向上した。さらに、シャペロンタンパク質としてＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦを用いた系（ｐＧ−Ｔｆ２で形質転換した形質転換体）では、対照と比較し約１０倍（１２５７μｇ／Ｌ（培養液））のＦｃ結合性タンパク質を生産していた。以上より、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦのいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質と、Ｆｃ結合性タンパク質とを、宿主で共発現させることで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産量を向上させることができた。
【００４１】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【請求項３】
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦからなるタンパク質である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質、または１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの製造方法により得られた、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項６】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質とシャペロンタンパク質とを宿主で共発現させるＦｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むタンパク質である、前記製造方法。
【請求項３】
シャペロンタンパク質がＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびＴＦからなるタンパク質である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質、または１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの製造方法により得られた、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項６】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＴＦ（トリガーファクター）のいずれか一つ以上を含むシャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１９６９９（Ｐ２０１２−１９６９９Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５７８８９（Ｐ２０１０−１５７８８９）
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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