シュピーゲルマーの投与による副作用に対処するための製薬組成物
本発明は、Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応に対処するための製薬組成物を製造するための、Ｌ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを切断することができるＬ−リボザイムの使用に関する。あるいはまた、Ｌ−リボザイムによって内在性標的ＲＮＡを切断することもできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用、そのようなＬ−リボザイムを含む製薬組成物、およびそのような製薬組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、抗体／抗原反応と同様に任意の１つの標的分子に特異的に結合する、大抵は二本鎖のＤ−核酸である（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：８１８−８２２（１９９０）（非特許文献１））。所与の標的分子に対して特異的なアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法によって核酸ライブラリから単離される（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）（非特許文献２））。
【０００３】
治療の分野において、アプタマーは、とりわけ望ましくない代謝産物に結合し、それによりその代謝産物を抑制するという目的を有する。一例にすぎないが、そのような代謝産物として腫瘍遺伝子産物が挙げられる。治療分野でのアプタマーの使用における欠点は、アプタマーが、不利な薬物動態を有すること、すなわち例えば内在性ヌクレアーゼによって非常に速く分解されることである。これとは無関係に、アプタマーは、いずれにせよ比較的小さい分子であり、したがって腎臓を通って比較的すぐに排泄される。
【０００４】
シュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）は、本質的にはアプタマーであり、しかしＬ−ヌクレオチドから形成されている点が異なる。シュピーゲルマーは、一本鎖または二本鎖であることがある。Ｌ−ヌクレオチドの使用により、内在性ヌクレアーゼによる分解が妨げられ、したがって薬物動態がかなり改良され、すなわち血清中での滞留時間が長くなる。したがって、非機能的なシュピーゲルマーが代謝性であり、また２時間にわたって完全に安定であることが、Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他、Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）（非特許文献３）に記載されている。この文献には、診断分野でのシュピーゲルマーの使用も記載されており、その場合、シュピーゲルマーが例えば放射能レポータ物質と結合される。
【０００５】
所与の標的分子に対する特異的なシュピーゲルマーの同定は、例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）（非特許文献４）に記載されているように行うことができる。シュピーゲルマーおよび治療分野でのその使用可能性に関して、Ｖａｔｅｒ，Ａ．他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）（非特許文献５）も参照されたい。
【０００６】
治療分野でのシュピーゲルマーの使用においては、従来、シュピーゲルマーが免疫原性でないことを前提にしている（Ｗｌｏｔｚｋａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２）（非特許文献６））。しかしながら、本明細書に挙げる研究は、有機体中のＬ−核酸が絶対に副作用を受けないとは必ずしも言えないことを示している。したがって、シュピーゲルマーを使用するとき、患者への投与の際に、望ましくない生理学的副反応、例えば内在性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応の危険は決して無視できないものである。特に、第１相試験で起きたモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２の治験事故に鑑みて、かつ上述した関係に基づいてシュピーゲルマーの滞留時間が比較的非常に長いという背景の下で、シュピーゲルマーの投与時に、望ましくない生理学的副反応が発生したときにすぐに解毒剤を投与し、それにより血清中のシュピーゲルマーレベルを短時間で下げることができるように、使用するシュピーゲルマーに対する解毒剤を用意しておくことが望ましい。
【０００７】
他の関係、すなわちリボザイム−触媒立体選択的ディールス・アルダー反応から、Ｌ−リボザイムが知られており、これに関しては、Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）（非特許文献７）およびＳｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）（非特許文献８）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：８１８−８２２（１９９０）
【非特許文献２】Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）
【非特許文献３】Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他、Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）
【非特許文献４】Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｔｅｒ，Ａ．他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）
【非特許文献６】Ｗｌｏｔｚｋａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２）
【非特許文献７】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）
【非特許文献８】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）
【非特許文献９】Ｕｓｍａｎ，Ｎ．他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０６（１０）：１１９７−１２０１（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の技術的な課題は、治療分野で使用されるシュピーゲルマーに対する解毒剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この技術的課題を解決するために、本発明は、Ｌ−リボザイムがＬ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを切断することができる、製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を教示し、特に、Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応、特に内在性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応に対処するための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を教示する。
【００１１】
始めに、本発明は、従来の推測とは異なり、シュピーゲルマーが副作用のないものとは必ずしも限らず、有機体中で自然に生じる核酸を切断し、したがって予想不能な副作用を生み出す可能性があるという意外な認識に基づく。本発明は、この認識に基づき、投与されるシュピーゲルマーを特異的に切断し、それにより特に望ましくない副反応に関わるシュピーゲルマーの生理学的効力をなくすＬ−リボザイムを利用可能にするという技術的な教示を基礎とする。シュピーゲルマーの例としては以下のものがある。シュピーゲルマーＮＯＸＣ８９、ＮＯＸＡ４２、ＮＯＸＡ５０、ＮＯＸＢ１１、Ｎ０ＸＡ１２、ＮＯＸＥ３６、ＮＯＸＦ３７（すべてＮＯＸＸＯＮ ＡＧ）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．のシュピーゲルマー、ＮＵ１７２（ＡＲＣＡ ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）、ＡＲＣＨＥＭＩＸ、ＡＲＣ１９０５、ＡＲＣ１７７９、ＡＲＣ１８３、ＡＲＣ１８４、Ｅ１００３０、ＮＵ１７２、ＲＥＧ２、ＲＥＧｌ（すべてＡｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．）、ＡＳ１４１１、ＡＳ１４０５（どちらもＡｎｔｉｓｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ．）、ＤｓｉＲＮＡ（Ｄｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＲＮＡアプタマーＢＥＸＣＯＲＥ（ＢｅｘＣｏｒｅ Ｉｎｃ．）、ＥＬＡＮ（Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐ Ｐｌｃ．）、またはＭａｃｕｇｅｎ。したがって、シュピーゲルマーを投与したときに、望ましくない副反応の観察の過程でそのようなリボザイムを投与するにより、望ましくない副作用の原因を代謝から迅速に、効果的に、高い選択性で取り除くことができ、他方でまたＬ−リボザイムの投与の副作用の危険は非常に低い。これは、Ｌ−ヌクレオチドからＬ−リボザイムが構成されていることに基づくだけでなく、さらに、Ｌ−リボザイムの高い選択性、すなわちシュピーゲルマーの標的配列に向けられる高い選択性にも基づく。その結果、治療分野で使用されるシュピーゲルマーに対する高い有効性および高い選択性をもつ解毒剤が得られ、シュピーゲルマーの望ましくない副反応を効果的に、迅速に、副作用なしで防ぐことができる。
【００１２】
基本的には、Ｄ−ヌクレオチドから構成されたものであれＬ−ヌクレオチドから構成されたものであれ各ＲＮＡ分子に対して、特異的なリボザイムを形成することができ、このリボザイムは、ＲＮＡ分子の標的配列を切断し、したがってそれを切断する。すなわち、リボザイムの重要な特性は、標的配列へのリボザイムの配列特異的結合である。しかし、これはまた、各任意の標的配列に関してリボザイムの部分配列を生成することができることを意味する。これは、切断箇所を含むリボザイムの部分配列が標的配列とハイブリダイゼーションすることによって行われる。したがって、本発明の範囲内では、特定のリボザイム部分配列のみを特定の標的配列に関して構造的に提供することは妥当でない。したがって、実施例で提示する標的配列およびリボザイム部分配列は例にすぎず、当業者は、シュピーゲルマーの各所与の標的配列に関して適切なリボザイム部分配列、すなわちハイブリダイゼーションするリボザイム部分配列を容易に特定し、リボザイム部分配列に関する情報に基づいて、当技術分野で一般的な手段を用いてリボザイムを合成することができる。
【００１３】
基本的には、治療分子がシュピーゲルマーでよく、またはＬ−ＲＮＡがアプタマーと共有結合することができる。後者は、例えばヌクレアーゼに対して安定なアプタマーの場合に行うことができる。ここで、治療分野での本発明の利点は、Ｌ−ＲＮＡを切断することによってヌクレアーゼに対するアプタマーを得ることができることにあり、このとき、最終的には、やはり副作用を引き起こす可能性があるアプタマーも血清から比較的短時間で排除することができる。
【００１４】
しかしまた、Ｌ−リボザイムをアプタマーまたは抗体と共有結合させることもできる。この場合、例えば、細胞表面とのアプタマーまたは抗体の相互作用によりＬ−リボザイムとアプタマーまたは抗体からなる全体構造が細胞内に導入されるようにアプタマーまたは抗体が選択される。
【００１５】
好ましくは、Ｌ−リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。ハンマーヘッド型リボザイムは、とりわけトリプレットＧＵＨ（Ｈはグアニンでなく、好ましくはＣである）またはデュプレットＵＨ（Ｈは同上）を有する保存領域を有する。前者については図１を参照されたい。後者については、Ｕｓｍａｎ，Ｎ．他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０６（１０）：１１９７−１２０１（２０００）（非特許文献９）を参照されたい。ここで、ヌクレオチドＮ’およびＮは、標的配列の条件に従ってＳｔｅｍ Ｉ〜ＩＩＩの範囲内で選択される任意の塩基である。本質的には、ある標的配列に対してＬ−リボザイムを構成するとき、まず、例えばシュピーゲルマーの標的配列を規定する。この標的配列は、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨを含まなければならない。次いで、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの両端に、典型的にはそれぞれ４〜１０個または４〜１１個、特に６〜８個または６〜９個のヌクレオチドが付加され、その配列は標的配列の配列に相当する。すなわち、１１〜２３個のヌクレオチドを含有する、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨを含む標的配列のコピーを得る。次いで、図１で見られるように、コピーの両端の間に触媒ハンマーヘッド配列が追加される。適切な触媒ハンマーヘッド配列の例は以下のものである。
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮ’ＣＮ’ＮＮＮＮＮＧＮＣＧＡＡＡＣ−３’、または
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮ’ＣＮ’ＮＮＮＮＮＧＮＣＧＡＡＡＮ−３’
（Ｎ＝任意の塩基。図１において、対置するＮとＮ’は、強制的に同じ塩基対から形成されるか、または異なる塩基対から形成される）。
【００１６】
これに続いて、３’末端では、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの５’側での標的配列を補完して配列中にヌクレオチドが位置し、５’末端では、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの３’側での標的配列に対応して配列中にヌクレオチドが位置する。
【００１７】
好ましい実施形態では、触媒ハンマーヘッドは、配列
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮＵＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＣ−３’、または
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮＵＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＮ−３’
（Ｎ＝任意の塩基。ここで、図１において、対置するＮとＮ’は、強制的に同じ塩基対から形成されるか、または異なる塩基対から形成される）である。さらに、触媒ハンマーヘッド配列の５’末端に、配列
３’−（Ｎ）４〜６ＧＧＵＡＵＡＧＡＧＵＧＣＵＧＡＡＵＣＣ−５’
を設けることができ、それにより比較的低いＭｇイオン濃度しか必要としないハンマーヘッド型リボザイムが得られる。
【００１８】
この製薬組成物は、少なくともＬ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくは分子数またはモルに関してＬ−ＲＮＡの投与量の２〜１０倍に相当する投与量でＬ−リボザイムを含有する。Ｌ−ＲＮＡの投与量に比べた過剰投与が、すべての排除すべきＬ−ＲＮＡを確実に反応させて除去するために推奨される。ここで、本発明に従って提供される絶対投与量は、提示される相対量比で、厳密に所与のＬ−ＲＮＡ投与量に適合され、したがってＬ−ＲＮＡに関する所与の投与量を知っていれば当業者が容易に決定して用意することができるものである。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、製薬組成物が、さらに、標的配列の範囲内で二本鎖Ｌ−ＲＮＡを溶解することができる核酸、特に５〜２０ｍｅｒを含有する。これは、標的配列に隣接する部分配列とハイブリダイゼーションする配列である。それにより、Ｌ−ＲＮＡの立体構造に基づき、通常は空間配置上の理由から到達することができないＬ−ＲＮＡのＧＵＣ領域にＬ−リボザイムが到達することができるようになる。
【００２０】
さらに、本発明は、Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応、特に免疫反応に対処するための、Ｌ−リボザイムを含む製薬組成物に関する。
【００２１】
この製薬組成物に関して、すべての前述および後述の実施形態が同様に当てはまる。
【００２２】
最後に、本発明は、そのような製薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−ヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、その配列が、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列を切断することができ、特にトリプレットＧＵＣと、トリプレットの５’側および３’側に付加されたその他の点では任意の配列とを含む配列を切断することができ、Ｌ−リボザイムが、薬理学的に有効な量で、投与のために準備されている方法に関する。ここで、Ｌ−リボザイムは、典型的には生薬補助剤および／または担持剤と混合される。
【００２３】
基本的には、１つまたは複数の生理学的に許容できる補助剤および／または担持剤をＬ−リボザイムと混合することができ、混合物は、生薬的に、局所または全身投与、特に経口投与、非経口投与用、または目標臓器への点滴もしくは注入用、注射用（例えば、経静脈投与（ｉ．ｖ．）、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）、嚢内、または腰椎内）、歯周ポケット（歯根と歯肉の間の空間）への投与用、および／または吸入用に準備される。添加剤および／または補助剤の選択は、選択される投与形態に応じてなされる。ここで、本発明による製薬組成物の生薬投与は、当技術分野で一般的な方法で行うことができる。イオン結合のための対イオンとしては、例えばＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋、ＣａＣｌ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、またはシクロヘキシルアンモニウム、またはＣｌ−、Ｂｒ−、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンなどがある。適切な固体状または液体状の生薬調剤形態としては、例えば、顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、ジュース、懸濁液、エマルジョン、滴剤、または注射溶液（経静脈投与（ｉ．ｖ．）、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）、皮下投与（ｓ．ｃ．））、または霧化（エーロゾル）、乾燥粉末吸入用の調剤形態、経皮システム、および作用剤の遅延解放を伴う薬剤があり、その製造においては、一般的な補助剤、例えば担持剤、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、潤滑剤、調味料、甘味料、溶解補助剤が使用される。また、例えば吸入用の調剤を製造するために、作用剤を、好ましくは生分解性ナノカプセルとしてカプセル化することもできる。補助剤としては、例えば、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール、および他の糖、滑石粉、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、セルロース、およびその誘導体、動物油および植物油、例えば肝油、ヒマワリ油、落花生油、またはゴマ油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水、および１価または２価アルコール、例えばグリセリンが挙げられる。本発明による製薬組成物は、少なくとも１つの本発明に従って使用される物質の組合せを、既定の投与量で、製薬的に適切であり生理学的に許容できる担体、および場合によっては既定の投与量でのさらなる適切な作用剤、添加剤、または補助剤と混合し、望ましい投与形態にすることによって製造可能である。希釈剤としては、ポリグリコール、水、および緩衝溶液がある。適切な緩衝物質は、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ベンジルフェンエチルアミン、ジエチルアミン、リン酸塩、炭酸水素ナトリウム、または炭酸ナトリウムである。しかしまた、希釈剤なしで用いることもできる。生理学的に許容できる塩は、無機酸または有機酸、例えば乳酸、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、ｐ−トルオールスルホン酸との塩、または無機もしくは有機塩基、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２／ジエタノールアミン、エチレンジアミンとの塩、またはアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グルタミン酸などとの塩、または無機塩、例えばＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、またはその遊離イオン、例えばＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ＳＯ４２−、もしくはそれらに対応する塩、およびＭｇ＋＋またはＭｎ＋＋の遊離イオンとの塩、またはそれらの組合せである。これらは標準的な方法に従って製造される。好ましくは、５〜９の範囲、特に６〜８の範囲のｐＨ値に調整される。
【００２４】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を含む本発明の変形形態が、独自の意義をもつ。それ以外は、上記の実施形態が同様に当てはまる。これに関係して、微生物の遺伝子をコード化する標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、哺乳類の微生物感染に関わる疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を含む本発明の上述の態様のさらなる変形形態が重要である。対象となる微生物としては、とりわけウィルス、バクテリア、および菌類を挙げることができる。基本的には、少なくとも一部は分かっている遺伝子配列を有する任意の微生物を切断するためにリボザイムを使用することができ、ここで切断のための遺伝子配列の領域が選択され、これは例えば、微生物の活動および／またはその複製能力を弱化または抑制し、かつ／または細胞表面への結合を弱化または抑制する。
【００２５】
この変形形態では、例えばＤ−ＲＮＡ、特にｍＲＮＡまたは調節ＲＮＡ、さらにはｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの切断にもＬ−リボザイムを使用することができることが活用される。それにより、遺伝子またはそれによってコード化されたタンパク質を抑制することができる。これは、罹患していない有機体の発現に比べて特定の遺伝子の過剰発現を伴うすべての疾患に関して治療上有用である。
【００２６】
この変形形態は、一方では、標的配列の切断が非常に高い特異性で行われ、したがってまた調節系とのその他の干渉が生じないという利点を有する。さらに、例えばｓｉＲＮＡなど阻害Ｄ−核酸の使用に関わる副作用が確実に回避される。
【００２７】
以下、図面および実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１ａ】標的配列への結合前（ａ）の最小ハンマーヘッド型リボザイムを示す図である。
【図１ｂ】標的配列への結合後（ｂ）の最小ハンマーヘッド型リボザイムを示す図である。
【図２】一方としてＬ−標的とＤ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＬ−リボザイムの反応のＭｇＣｌ２濃度依存の比較分析図である。
【図３】一方としてＬ−標的とＤ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＬ−リボザイムの反応の、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２での時間依存比較分析図である。
【図４】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態でのＭｇＣｌ２濃度依存（１〜２５ｍＭ）の比較分析図である。
【図５】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態でのＭｇＣｌ２濃度依存（０．１〜１ｍＭ）の比較分析図である。
【図６】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図７】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図８】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図９】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１０】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１１】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、５ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１２】ヒト血清中のＬ−リボザイムによるＬ−標的の切断の試行を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施例１：劈開分析
Ｌ−リボザイムとＤ−リボザイムの活性を様々な条件下で測定した。基本条件は以下のようにした。０．０２μＭの標的ＲＮＡを、１０μｌの反応混合物と共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．５）中で０．００２μＭ、０．０２μＭ、および２μＭのリボザイムの存在下で、２０℃で２時間培養した（したがってリボザイム／標的の比率は、１０：１、１：１、および１：１０）。反応前に、標的ＲＮＡとリボザイムを２分間７０℃で変性させて、加熱ブロック内でゆっくりと（１℃／分）冷却した。０．１〜２５ｍＭの濃度でＭｇ２＋イオンの影響を調べた。切断生成物を、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で８Ｍの尿素の存在下で、２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。蛍光の分析を、ホスホイメージャＦｕｊｉ Ｆｉｌｍ ＦＬＡ ５１００で行った。プログラムＦｕｊｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍを用いてデータを取得した。Ｅｘｃｅｌでグラフを作成した。
【００３０】
実施例２：標的配列およびリボザイムの生成
標的配列として、カスタム合成の過程で、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）によって以下のものが生成された。
配列ＩＤ１：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＵＣＧＧＵＣＧＣＣ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）、および
配列ＩＤ２：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＴＣＧＧＴＣＧＣＣ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）
【００３１】
合成生成物は９０％超の純度を有していた。
【００３２】
リボザイム配列として、標的配列の条件に従って、トリプレットＧＵＣの周りのハンマーヘッド型リボザイムの変更可能な範囲を選択し、ＧｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）によって以下のリボザイム配列を生成された。
配列ＩＤ３：５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＧＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＵＧＵ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）
【００３３】
合成生成物は８５％超の純度を有していた。
【００３４】
すべての合成生成物に、５’末端でフルオレセインで標識した。
【００３５】
実施例３：Ｌ−核酸とＤ−核酸の相互作用
図２に、Ｌ−リボザイムによるＤ−標的の切断、およびその逆の切断の濃度依存を示す。Ｃは対照標準（Ｌ−標的＋Ｌ−リボザイム）であり、痕跡１〜５は、リボザイムなしでの標的に関する、グラフに示される様々なＭｇＣｌ２濃度（０〜２５ｍＭ）を表し、痕跡６〜９は、０．２μＭの標的と２μＭのリボザイムに関するものである。
【００３６】
Ｄ−リボザイムはＬ−標的を切断しないが、その逆ではかなりの代謝が行われることが分かる。これは、例えばＬ−ヌクレオチドからなるシュピーゲルマーが、特定の３次元構造に対して特異的なアプタマーとしてのその作用の他に、従来の見解に反して、例えばリボザイムとしてのさらなる生理学的相互作用を及ぼす可能性がありえることを示唆する。
【００３７】
上記のことから、シュピーゲルマーは、有機体への投与の際に望ましくない副作用の危険がある。
【００３８】
しかしまた、上記のことから、Ｌ−リボザイムを内在性Ｄ−ＲＮＡの切断に使用することができ、それにより、Ｄ−ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡによってコード化された遺伝子またはタンパク質の治療的抑制が行われる。
【００３９】
図３は、Ｌ−リボザイムによるＤ−標的の切断生成物の割合が時間と共に増加し、Ｌ−標的の切断生成物の割合よりも常にかなり大きいことを示す（痕跡Ｃ：上記と同様に対照標準。痕跡１〜１０は、グラフの時間０〜２５６分）。
【００４０】
実施例４：Ｌ−リボザイムによるＬ−標的の切断
図４〜図１１のグラフから、Ｌ−リボザイムが、すべての一般的な条件下で、対応する標的配列を有するＬ−標的を効果的に切断することが見て取れ、すなわち代謝率は、Ｄ−リボザイムとＤ−標的での代謝率に少なくとも相当する。
【００４１】
図１２は、Ｌ−リボザイムによるＬ−標的の切断が、ヒト血清の条件下でも効果的に機能することを裏付ける。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用、そのようなＬ−リボザイムを含む製薬組成物、およびそのような製薬組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、抗体／抗原反応と同様に任意の１つの標的分子に特異的に結合する、大抵は二本鎖のＤ−核酸である（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：８１８−８２２（１９９０）（非特許文献１））。所与の標的分子に対して特異的なアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法によって核酸ライブラリから単離される（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）（非特許文献２））。
【０００３】
治療の分野において、アプタマーは、とりわけ望ましくない代謝産物に結合し、それによりその代謝産物を抑制するという目的を有する。一例にすぎないが、そのような代謝産物として腫瘍遺伝子産物が挙げられる。治療分野でのアプタマーの使用における欠点は、アプタマーが、不利な薬物動態を有すること、すなわち例えば内在性ヌクレアーゼによって非常に速く分解されることである。これとは無関係に、アプタマーは、いずれにせよ比較的小さい分子であり、したがって腎臓を通って比較的すぐに排泄される。
【０００４】
シュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）は、本質的にはアプタマーであり、しかしＬ−ヌクレオチドから形成されている点が異なる。シュピーゲルマーは、一本鎖または二本鎖であることがある。Ｌ−ヌクレオチドの使用により、内在性ヌクレアーゼによる分解が妨げられ、したがって薬物動態がかなり改良され、すなわち血清中での滞留時間が長くなる。したがって、非機能的なシュピーゲルマーが代謝性であり、また２時間にわたって完全に安定であることが、Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他、Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）（非特許文献３）に記載されている。この文献には、診断分野でのシュピーゲルマーの使用も記載されており、その場合、シュピーゲルマーが例えば放射能レポータ物質と結合される。
【０００５】
所与の標的分子に対する特異的なシュピーゲルマーの同定は、例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）（非特許文献４）に記載されているように行うことができる。シュピーゲルマーおよび治療分野でのその使用可能性に関して、Ｖａｔｅｒ，Ａ．他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）（非特許文献５）も参照されたい。
【０００６】
治療分野でのシュピーゲルマーの使用においては、従来、シュピーゲルマーが免疫原性でないことを前提にしている（Ｗｌｏｔｚｋａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２）（非特許文献６））。しかしながら、本明細書に挙げる研究は、有機体中のＬ−核酸が絶対に副作用を受けないとは必ずしも言えないことを示している。したがって、シュピーゲルマーを使用するとき、患者への投与の際に、望ましくない生理学的副反応、例えば内在性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応の危険は決して無視できないものである。特に、第１相試験で起きたモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２の治験事故に鑑みて、かつ上述した関係に基づいてシュピーゲルマーの滞留時間が比較的非常に長いという背景の下で、シュピーゲルマーの投与時に、望ましくない生理学的副反応が発生したときにすぐに解毒剤を投与し、それにより血清中のシュピーゲルマーレベルを短時間で下げることができるように、使用するシュピーゲルマーに対する解毒剤を用意しておくことが望ましい。
【０００７】
他の関係、すなわちリボザイム−触媒立体選択的ディールス・アルダー反応から、Ｌ−リボザイムが知られており、これに関しては、Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）（非特許文献７）およびＳｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）（非特許文献８）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：８１８−８２２（１９９０）
【非特許文献２】Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）
【非特許文献３】Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他、Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）
【非特許文献４】Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｔｅｒ，Ａ．他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）
【非特許文献６】Ｗｌｏｔｚｋａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２）
【非特許文献７】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）
【非特許文献８】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）
【非特許文献９】Ｕｓｍａｎ，Ｎ．他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０６（１０）：１１９７−１２０１（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の技術的な課題は、治療分野で使用されるシュピーゲルマーに対する解毒剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この技術的課題を解決するために、本発明は、Ｌ−リボザイムがＬ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを切断することができる、製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を教示し、特に、Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応、特に内在性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応に対処するための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を教示する。
【００１１】
始めに、本発明は、従来の推測とは異なり、シュピーゲルマーが副作用のないものとは必ずしも限らず、有機体中で自然に生じる核酸を切断し、したがって予想不能な副作用を生み出す可能性があるという意外な認識に基づく。本発明は、この認識に基づき、投与されるシュピーゲルマーを特異的に切断し、それにより特に望ましくない副反応に関わるシュピーゲルマーの生理学的効力をなくすＬ−リボザイムを利用可能にするという技術的な教示を基礎とする。シュピーゲルマーの例としては以下のものがある。シュピーゲルマーＮＯＸＣ８９、ＮＯＸＡ４２、ＮＯＸＡ５０、ＮＯＸＢ１１、Ｎ０ＸＡ１２、ＮＯＸＥ３６、ＮＯＸＦ３７（すべてＮＯＸＸＯＮ ＡＧ）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．のシュピーゲルマー、ＮＵ１７２（ＡＲＣＡ ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）、ＡＲＣＨＥＭＩＸ、ＡＲＣ１９０５、ＡＲＣ１７７９、ＡＲＣ１８３、ＡＲＣ１８４、Ｅ１００３０、ＮＵ１７２、ＲＥＧ２、ＲＥＧｌ（すべてＡｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．）、ＡＳ１４１１、ＡＳ１４０５（どちらもＡｎｔｉｓｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ．）、ＤｓｉＲＮＡ（Ｄｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＲＮＡアプタマーＢＥＸＣＯＲＥ（ＢｅｘＣｏｒｅ Ｉｎｃ．）、ＥＬＡＮ（Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐ Ｐｌｃ．）、またはＭａｃｕｇｅｎ。したがって、シュピーゲルマーを投与したときに、望ましくない副反応の観察の過程でそのようなリボザイムを投与するにより、望ましくない副作用の原因を代謝から迅速に、効果的に、高い選択性で取り除くことができ、他方でまたＬ−リボザイムの投与の副作用の危険は非常に低い。これは、Ｌ−ヌクレオチドからＬ−リボザイムが構成されていることに基づくだけでなく、さらに、Ｌ−リボザイムの高い選択性、すなわちシュピーゲルマーの標的配列に向けられる高い選択性にも基づく。その結果、治療分野で使用されるシュピーゲルマーに対する高い有効性および高い選択性をもつ解毒剤が得られ、シュピーゲルマーの望ましくない副反応を効果的に、迅速に、副作用なしで防ぐことができる。
【００１２】
基本的には、Ｄ−ヌクレオチドから構成されたものであれＬ−ヌクレオチドから構成されたものであれ各ＲＮＡ分子に対して、特異的なリボザイムを形成することができ、このリボザイムは、ＲＮＡ分子の標的配列を切断し、したがってそれを切断する。すなわち、リボザイムの重要な特性は、標的配列へのリボザイムの配列特異的結合である。しかし、これはまた、各任意の標的配列に関してリボザイムの部分配列を生成することができることを意味する。これは、切断箇所を含むリボザイムの部分配列が標的配列とハイブリダイゼーションすることによって行われる。したがって、本発明の範囲内では、特定のリボザイム部分配列のみを特定の標的配列に関して構造的に提供することは妥当でない。したがって、実施例で提示する標的配列およびリボザイム部分配列は例にすぎず、当業者は、シュピーゲルマーの各所与の標的配列に関して適切なリボザイム部分配列、すなわちハイブリダイゼーションするリボザイム部分配列を容易に特定し、リボザイム部分配列に関する情報に基づいて、当技術分野で一般的な手段を用いてリボザイムを合成することができる。
【００１３】
基本的には、治療分子がシュピーゲルマーでよく、またはＬ−ＲＮＡがアプタマーと共有結合することができる。後者は、例えばヌクレアーゼに対して安定なアプタマーの場合に行うことができる。ここで、治療分野での本発明の利点は、Ｌ−ＲＮＡを切断することによってヌクレアーゼに対するアプタマーを得ることができることにあり、このとき、最終的には、やはり副作用を引き起こす可能性があるアプタマーも血清から比較的短時間で排除することができる。
【００１４】
しかしまた、Ｌ−リボザイムをアプタマーまたは抗体と共有結合させることもできる。この場合、例えば、細胞表面とのアプタマーまたは抗体の相互作用によりＬ−リボザイムとアプタマーまたは抗体からなる全体構造が細胞内に導入されるようにアプタマーまたは抗体が選択される。
【００１５】
好ましくは、Ｌ−リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。ハンマーヘッド型リボザイムは、とりわけトリプレットＧＵＨ（Ｈはグアニンでなく、好ましくはＣである）またはデュプレットＵＨ（Ｈは同上）を有する保存領域を有する。前者については図１を参照されたい。後者については、Ｕｓｍａｎ，Ｎ．他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０６（１０）：１１９７−１２０１（２０００）（非特許文献９）を参照されたい。ここで、ヌクレオチドＮ’およびＮは、標的配列の条件に従ってＳｔｅｍ Ｉ〜ＩＩＩの範囲内で選択される任意の塩基である。本質的には、ある標的配列に対してＬ−リボザイムを構成するとき、まず、例えばシュピーゲルマーの標的配列を規定する。この標的配列は、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨを含まなければならない。次いで、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの両端に、典型的にはそれぞれ４〜１０個または４〜１１個、特に６〜８個または６〜９個のヌクレオチドが付加され、その配列は標的配列の配列に相当する。すなわち、１１〜２３個のヌクレオチドを含有する、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨを含む標的配列のコピーを得る。次いで、図１で見られるように、コピーの両端の間に触媒ハンマーヘッド配列が追加される。適切な触媒ハンマーヘッド配列の例は以下のものである。
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮ’ＣＮ’ＮＮＮＮＮＧＮＣＧＡＡＡＣ−３’、または
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮ’ＣＮ’ＮＮＮＮＮＧＮＣＧＡＡＡＮ−３’
（Ｎ＝任意の塩基。図１において、対置するＮとＮ’は、強制的に同じ塩基対から形成されるか、または異なる塩基対から形成される）。
【００１６】
これに続いて、３’末端では、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの５’側での標的配列を補完して配列中にヌクレオチドが位置し、５’末端では、トリプレットＧＵＨまたはデュプレットＵＨの３’側での標的配列に対応して配列中にヌクレオチドが位置する。
【００１７】
好ましい実施形態では、触媒ハンマーヘッドは、配列
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮＵＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＣ−３’、または
５’−ＣＵＧＡＮＧＡＧＮＵＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＮ−３’
（Ｎ＝任意の塩基。ここで、図１において、対置するＮとＮ’は、強制的に同じ塩基対から形成されるか、または異なる塩基対から形成される）である。さらに、触媒ハンマーヘッド配列の５’末端に、配列
３’−（Ｎ）４〜６ＧＧＵＡＵＡＧＡＧＵＧＣＵＧＡＡＵＣＣ−５’
を設けることができ、それにより比較的低いＭｇイオン濃度しか必要としないハンマーヘッド型リボザイムが得られる。
【００１８】
この製薬組成物は、少なくともＬ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくは分子数またはモルに関してＬ−ＲＮＡの投与量の２〜１０倍に相当する投与量でＬ−リボザイムを含有する。Ｌ−ＲＮＡの投与量に比べた過剰投与が、すべての排除すべきＬ−ＲＮＡを確実に反応させて除去するために推奨される。ここで、本発明に従って提供される絶対投与量は、提示される相対量比で、厳密に所与のＬ−ＲＮＡ投与量に適合され、したがってＬ−ＲＮＡに関する所与の投与量を知っていれば当業者が容易に決定して用意することができるものである。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、製薬組成物が、さらに、標的配列の範囲内で二本鎖Ｌ−ＲＮＡを溶解することができる核酸、特に５〜２０ｍｅｒを含有する。これは、標的配列に隣接する部分配列とハイブリダイゼーションする配列である。それにより、Ｌ−ＲＮＡの立体構造に基づき、通常は空間配置上の理由から到達することができないＬ−ＲＮＡのＧＵＣ領域にＬ−リボザイムが到達することができるようになる。
【００２０】
さらに、本発明は、Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応、特に免疫反応に対処するための、Ｌ−リボザイムを含む製薬組成物に関する。
【００２１】
この製薬組成物に関して、すべての前述および後述の実施形態が同様に当てはまる。
【００２２】
最後に、本発明は、そのような製薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−ヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、その配列が、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列を切断することができ、特にトリプレットＧＵＣと、トリプレットの５’側および３’側に付加されたその他の点では任意の配列とを含む配列を切断することができ、Ｌ−リボザイムが、薬理学的に有効な量で、投与のために準備されている方法に関する。ここで、Ｌ−リボザイムは、典型的には生薬補助剤および／または担持剤と混合される。
【００２３】
基本的には、１つまたは複数の生理学的に許容できる補助剤および／または担持剤をＬ−リボザイムと混合することができ、混合物は、生薬的に、局所または全身投与、特に経口投与、非経口投与用、または目標臓器への点滴もしくは注入用、注射用（例えば、経静脈投与（ｉ．ｖ．）、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）、嚢内、または腰椎内）、歯周ポケット（歯根と歯肉の間の空間）への投与用、および／または吸入用に準備される。添加剤および／または補助剤の選択は、選択される投与形態に応じてなされる。ここで、本発明による製薬組成物の生薬投与は、当技術分野で一般的な方法で行うことができる。イオン結合のための対イオンとしては、例えばＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋、ＣａＣｌ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、またはシクロヘキシルアンモニウム、またはＣｌ−、Ｂｒ−、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンなどがある。適切な固体状または液体状の生薬調剤形態としては、例えば、顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、ジュース、懸濁液、エマルジョン、滴剤、または注射溶液（経静脈投与（ｉ．ｖ．）、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）、皮下投与（ｓ．ｃ．））、または霧化（エーロゾル）、乾燥粉末吸入用の調剤形態、経皮システム、および作用剤の遅延解放を伴う薬剤があり、その製造においては、一般的な補助剤、例えば担持剤、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、潤滑剤、調味料、甘味料、溶解補助剤が使用される。また、例えば吸入用の調剤を製造するために、作用剤を、好ましくは生分解性ナノカプセルとしてカプセル化することもできる。補助剤としては、例えば、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール、および他の糖、滑石粉、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、セルロース、およびその誘導体、動物油および植物油、例えば肝油、ヒマワリ油、落花生油、またはゴマ油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水、および１価または２価アルコール、例えばグリセリンが挙げられる。本発明による製薬組成物は、少なくとも１つの本発明に従って使用される物質の組合せを、既定の投与量で、製薬的に適切であり生理学的に許容できる担体、および場合によっては既定の投与量でのさらなる適切な作用剤、添加剤、または補助剤と混合し、望ましい投与形態にすることによって製造可能である。希釈剤としては、ポリグリコール、水、および緩衝溶液がある。適切な緩衝物質は、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ベンジルフェンエチルアミン、ジエチルアミン、リン酸塩、炭酸水素ナトリウム、または炭酸ナトリウムである。しかしまた、希釈剤なしで用いることもできる。生理学的に許容できる塩は、無機酸または有機酸、例えば乳酸、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、ｐ−トルオールスルホン酸との塩、または無機もしくは有機塩基、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２／ジエタノールアミン、エチレンジアミンとの塩、またはアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グルタミン酸などとの塩、または無機塩、例えばＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、またはその遊離イオン、例えばＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ＳＯ４２−、もしくはそれらに対応する塩、およびＭｇ＋＋またはＭｎ＋＋の遊離イオンとの塩、またはそれらの組合せである。これらは標準的な方法に従って製造される。好ましくは、５〜９の範囲、特に６〜８の範囲のｐＨ値に調整される。
【００２４】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を含む本発明の変形形態が、独自の意義をもつ。それ以外は、上記の実施形態が同様に当てはまる。これに関係して、微生物の遺伝子をコード化する標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、哺乳類の微生物感染に関わる疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用を含む本発明の上述の態様のさらなる変形形態が重要である。対象となる微生物としては、とりわけウィルス、バクテリア、および菌類を挙げることができる。基本的には、少なくとも一部は分かっている遺伝子配列を有する任意の微生物を切断するためにリボザイムを使用することができ、ここで切断のための遺伝子配列の領域が選択され、これは例えば、微生物の活動および／またはその複製能力を弱化または抑制し、かつ／または細胞表面への結合を弱化または抑制する。
【００２５】
この変形形態では、例えばＤ−ＲＮＡ、特にｍＲＮＡまたは調節ＲＮＡ、さらにはｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの切断にもＬ−リボザイムを使用することができることが活用される。それにより、遺伝子またはそれによってコード化されたタンパク質を抑制することができる。これは、罹患していない有機体の発現に比べて特定の遺伝子の過剰発現を伴うすべての疾患に関して治療上有用である。
【００２６】
この変形形態は、一方では、標的配列の切断が非常に高い特異性で行われ、したがってまた調節系とのその他の干渉が生じないという利点を有する。さらに、例えばｓｉＲＮＡなど阻害Ｄ−核酸の使用に関わる副作用が確実に回避される。
【００２７】
以下、図面および実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１ａ】標的配列への結合前（ａ）の最小ハンマーヘッド型リボザイムを示す図である。
【図１ｂ】標的配列への結合後（ｂ）の最小ハンマーヘッド型リボザイムを示す図である。
【図２】一方としてＬ−標的とＤ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＬ−リボザイムの反応のＭｇＣｌ２濃度依存の比較分析図である。
【図３】一方としてＬ−標的とＤ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＬ−リボザイムの反応の、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２での時間依存比較分析図である。
【図４】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態でのＭｇＣｌ２濃度依存（１〜２５ｍＭ）の比較分析図である。
【図５】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態でのＭｇＣｌ２濃度依存（０．１〜１ｍＭ）の比較分析図である。
【図６】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図７】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図８】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１倍のＬ−リボザイム過剰状態での時間依存比較分析図である。
【図９】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１０】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、１ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１１】一方としてＬ−標的とＬ−リボザイムの反応、他方としてＤ−標的とＤ−リボザイムの反応の、５ｍＭ ＭｇＣｌ２で、１０分の１のＬ−リボザイム過少状態での時間依存比較分析図である。
【図１２】ヒト血清中のＬ−リボザイムによるＬ−標的の切断の試行を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施例１：劈開分析
Ｌ−リボザイムとＤ−リボザイムの活性を様々な条件下で測定した。基本条件は以下のようにした。０．０２μＭの標的ＲＮＡを、１０μｌの反応混合物と共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．５）中で０．００２μＭ、０．０２μＭ、および２μＭのリボザイムの存在下で、２０℃で２時間培養した（したがってリボザイム／標的の比率は、１０：１、１：１、および１：１０）。反応前に、標的ＲＮＡとリボザイムを２分間７０℃で変性させて、加熱ブロック内でゆっくりと（１℃／分）冷却した。０．１〜２５ｍＭの濃度でＭｇ２＋イオンの影響を調べた。切断生成物を、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で８Ｍの尿素の存在下で、２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。蛍光の分析を、ホスホイメージャＦｕｊｉ Ｆｉｌｍ ＦＬＡ ５１００で行った。プログラムＦｕｊｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍを用いてデータを取得した。Ｅｘｃｅｌでグラフを作成した。
【００３０】
実施例２：標的配列およびリボザイムの生成
標的配列として、カスタム合成の過程で、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）によって以下のものが生成された。
配列ＩＤ１：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＵＣＧＧＵＣＧＣＣ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）、および
配列ＩＤ２：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＴＣＧＧＴＣＧＣＣ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）
【００３１】
合成生成物は９０％超の純度を有していた。
【００３２】
リボザイム配列として、標的配列の条件に従って、トリプレットＧＵＣの周りのハンマーヘッド型リボザイムの変更可能な範囲を選択し、ＧｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）によって以下のリボザイム配列を生成された。
配列ＩＤ３：５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＧＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＵＧＵ−３’
（ＲＮＡ、Ｄ−ヌクレオチドもＬ−ヌクレオチドも含む）
【００３３】
合成生成物は８５％超の純度を有していた。
【００３４】
すべての合成生成物に、５’末端でフルオレセインで標識した。
【００３５】
実施例３：Ｌ−核酸とＤ−核酸の相互作用
図２に、Ｌ−リボザイムによるＤ−標的の切断、およびその逆の切断の濃度依存を示す。Ｃは対照標準（Ｌ−標的＋Ｌ−リボザイム）であり、痕跡１〜５は、リボザイムなしでの標的に関する、グラフに示される様々なＭｇＣｌ２濃度（０〜２５ｍＭ）を表し、痕跡６〜９は、０．２μＭの標的と２μＭのリボザイムに関するものである。
【００３６】
Ｄ−リボザイムはＬ−標的を切断しないが、その逆ではかなりの代謝が行われることが分かる。これは、例えばＬ−ヌクレオチドからなるシュピーゲルマーが、特定の３次元構造に対して特異的なアプタマーとしてのその作用の他に、従来の見解に反して、例えばリボザイムとしてのさらなる生理学的相互作用を及ぼす可能性がありえることを示唆する。
【００３７】
上記のことから、シュピーゲルマーは、有機体への投与の際に望ましくない副作用の危険がある。
【００３８】
しかしまた、上記のことから、Ｌ−リボザイムを内在性Ｄ−ＲＮＡの切断に使用することができ、それにより、Ｄ−ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡによってコード化された遺伝子またはタンパク質の治療的抑制が行われる。
【００３９】
図３は、Ｌ−リボザイムによるＤ−標的の切断生成物の割合が時間と共に増加し、Ｌ−標的の切断生成物の割合よりも常にかなり大きいことを示す（痕跡Ｃ：上記と同様に対照標準。痕跡１〜１０は、グラフの時間０〜２５６分）。
【００４０】
実施例４：Ｌ−リボザイムによるＬ−標的の切断
図４〜図１１のグラフから、Ｌ−リボザイムが、すべての一般的な条件下で、対応する標的配列を有するＬ−標的を効果的に切断することが見て取れ、すなわち代謝率は、Ｄ−リボザイムとＤ−標的での代謝率に少なくとも相当する。
【００４１】
図１２は、Ｌ−リボザイムによるＬ−標的の切断が、ヒト血清の条件下でも効果的に機能することを裏付ける。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用。
【請求項２】
前記Ｌ−リボザイムが、Ｌ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを切断することができる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応に対処するための製薬組成物を製造するための、前記Ｌ−ＲＮＡの標的配列の範囲内で前記Ｌ−ＲＮＡを切断することができるＬ−リボザイムの使用。
【請求項４】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用。
【請求項５】
前記治療分子が、Ｌ−ＲＮＡ、特に二本鎖Ｌ−ＲＮＡ、例えばシュピーゲルマーからなる請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記治療分子が、Ｌ−ＲＮＡと共有結合されたアプタマーまたはＬ−ＲＮＡと共有結合された抗体を含有する請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記製薬組成物が、少なくともＬ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくはＬ−ＲＮＡの投与量の２〜１００倍、好ましくは２〜２０倍に相当する投与量でＬ−リボザイムを含有する請求項３、５、または６に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｌ−リボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムである請求項３から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記製薬組成物が、さらに、標的配列の範囲内で二本鎖Ｄ−ＲＮＡまたはＬ−ＲＮＡを溶解することができる核酸、特に５〜２０ｍｅｒを含有する請求項３から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応に対処するための、Ｌ−リボザイムを含む製薬組成物。
【請求項１１】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患を治療または予防するためのＬ−リボザイムを含む製薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の製薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−ヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、前記配列が、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列またはＤ−リボヌクレオチドからなる所定の配列を切断することができ、前記Ｌ−リボザイムが、薬理学的に有効な量で、投与のために準備されている方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−リボザイムが、生薬補助剤および／または担持剤と混合される請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用。
【請求項２】
前記Ｌ−リボザイムが、Ｌ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを切断することができる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応に対処するための製薬組成物を製造するための、前記Ｌ−ＲＮＡの標的配列の範囲内で前記Ｌ−ＲＮＡを切断することができるＬ−リボザイムの使用。
【請求項４】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患の治療または予防のための製薬組成物を製造するためのＬ−リボザイムの使用。
【請求項５】
前記治療分子が、Ｌ−ＲＮＡ、特に二本鎖Ｌ−ＲＮＡ、例えばシュピーゲルマーからなる請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記治療分子が、Ｌ−ＲＮＡと共有結合されたアプタマーまたはＬ−ＲＮＡと共有結合された抗体を含有する請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記製薬組成物が、少なくともＬ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくはＬ−ＲＮＡの投与量の２〜１００倍、好ましくは２〜２０倍に相当する投与量でＬ−リボザイムを含有する請求項３、５、または６に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｌ−リボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムである請求項３から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記製薬組成物が、さらに、標的配列の範囲内で二本鎖Ｄ−ＲＮＡまたはＬ−ＲＮＡを溶解することができる核酸、特に５〜２０ｍｅｒを含有する請求項３から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｌ−ＲＮＡを含む治療分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応に対処するための、Ｌ−リボザイムを含む製薬組成物。
【請求項１１】
遺伝子をコード化する内在性標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列をＬ−リボザイムが切断することができる、少なくとも１つの内在性遺伝子の過剰発現を伴う疾患を治療または予防するためのＬ−リボザイムを含む製薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の製薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−ヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、前記配列が、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列またはＤ−リボヌクレオチドからなる所定の配列を切断することができ、前記Ｌ−リボザイムが、薬理学的に有効な量で、投与のために準備されている方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−リボザイムが、生薬補助剤および／または担持剤と混合される請求項１２に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５１９６５５（Ｐ２０１２−５１９６５５Ａ）
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８５２９（Ｐ２０１１−５４８５２９）
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２０１０／０００１５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８８８９９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１１１８８６９１）フライエ ウニヴェルシテット ベルリン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２０１０／０００１５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８８８９９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１１１８８６９１）フライエ ウニヴェルシテット ベルリン (1)
【Ｆターム（参考）】
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