ジンクフィンガータンパク質と原核生物の転写因子とを含む人工転写因子の製造、及びその利用
本発明は、ジンクフィンガータンパク質と原核生物の転写因子を利用して、大腸菌の遺伝子発現を人為的に調節することのできる人工転写因子、及びそれを利用した形質転換大腸菌に関する。具体的には、ジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとして大腸菌の転写因子とを含む人工転写因子を製造し、その人工転写因子ライブラリーを大腸菌に導入すると、大腸菌内因性転写因子の作用と関係なく人為的に、遺伝子の発現を効果的に調節することができ、様々な形質を有する大腸菌を誘導することができ、これにより、産業的に有用な特性を有する大腸菌のみを選択的に選別して利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンクフィンガータンパク質と原核生物の転写因子を利用して、大腸菌の遺伝子発現を人為的に調節することのできる人工転写因子、及びそれを利用した形質転換大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代の到来とともに、多くの生命体の遺伝子情報に基づいて研究と分析が活発に行われている。そのうち、遺伝子の発現を人為的に調節できるシステムの開発と必要性は、焦眉の関心事となっており、盛んに研究されている分野の１つである。生物体あるいは細胞内で特定の遺伝子発現の増減を人為的に調節することができれば、これによる生物学的結果を分析することにより、特定の遺伝子の機能を解析したり、その遺伝子の生物学的役割を明らかにすることができる。それだけでなく、標的とする遺伝子の発現を適切に調節することができれば、これは遺伝子治療の手段として活用することができるであろう。また、自然界における生命体の特徴はその生命体が有する特定の遺伝子の発現有無とその程度によって決定されるので、遺伝子の発現を人為的に調節して所望の表現型を示す生物体を誘導することにより、所望の産業用微生物の開発にも応用することができる。
【０００３】
近年、ジンクフィンガータンパク質を利用して遺伝子の発現を調節することができる可能性が出てきており、これに関する肯定的な研究結果が発表された。ジンクフィンガーは、真核生物で最もよく発見されるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合モチーフとして知られている。ジンクフィンガーは、配列特異的に特定の標的配列を認識することのできる活性を示すドメインであって、それ自体で転写リプレッサーとして作用する。それだけでなく、このジンクフィンガータンパク質をＤＮＡ結合ドメインとして利用し、転写活性化（又は、抑制）ドメインと連結することにより、新しい転写因子を作成することができる。
【０００４】
近年、配列特異的ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを様々な種類の適切なエフェクタードメイン（活性化ドメイン又は抑制ドメイン）と融合して、転写因子の形で細胞で発現すると、標的遺伝子の発現を増加又は減少させることができるという研究が発表された（Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., and Barb as, C. F., III, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5525-5530; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas C. F., III, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14628-14633; Beerli R.R., Dreier B. Barbas C.F.3rd, Positive and negative regulation of endogeneous genes by designed transcription factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 Feb. 15:97(4), 1495-500）。
【０００５】
ところが、既存の原核細胞の研究は、エフェクタードメインを利用することなく、ジンクフィンガードメインのみを転写因子として利用することによって、遺伝子発現を抑制する効果のみを期待することができ、その効果も微弱であった。様々な表現型をより効果的に得るためには、遺伝子発現の抑制だけでなく、活性化による様々な遺伝子発現の調節が必要である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、ジンクフィンガードメインライブラリーに、エフェクタードメインとして、原核生物であって産業的に有用な大腸菌の転写因子を融合することにより、大腸菌の遺伝子発現の抑制だけでなく活性化を行うことのできる新しい人工転写因子を開発し、それを大腸菌に導入した場合、大腸菌の遺伝子発現が人為的に調節されることによって、様々な表現型を有する形質転換大腸菌を作成できることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとして原核生物の転写因子とを融合することにより、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制することのできる人工転写因子の製造、並びにそれを利用した、様々な形質特異性を示す形質転換された大腸菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、１つ〜３つのジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとして原核生物の転写因子とを含み、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制することのできる人工転写因子を提供する。前記エフェクタードメインとしての原核生物の転写因子は、大腸菌のＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質（Catabolite Regulatory Protein）（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質）、あるいはその誘導体、例えば野生型ＣＲＰ（ＣＲＰ Ｗ、残基１−２０９）、ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）、もしくはＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）でもよい。
【０００９】
また、前記ジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムから同定されたもので、配列番号１３〜６４の配列によりコードされているジンクフィンガードメインからなる群から選択されるものである。
【００１０】
また、前記人工転写因子は、遺伝子発現を活性化するためには、転写開始点から−８０〜−３０、好ましくは−６７〜−５０領域に挿入され、遺伝子発現を抑制するためには、転写開始点から−３０より下流、好ましくは＋２４〜＋４１領域に結合される。
【００１１】
さらに、本発明は、前記人工転写因子が導入されて様々な表現型を発現する形質転換された大腸菌を提供し、好ましくは、熱抵抗性を有する形質転換大腸菌、向上した成長速度を有する形質転換大腸菌、低温抵抗性を有する形質転換大腸菌、及び浸透圧抵抗性を有する形質転換大腸菌を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
ＤＮＡ結合ドメイン−ジンクフィンガードメイン
ジンクフィンガードメインは、真核生物で最もよく見られるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合モチーフであって、酵母から高等植物及び人間に至る様々な種で見られる。ジンクフィンガードメインは、それ自体で遺伝子発現を抑制する転写リプレッサーとして作用することが知られている。従って、このようなジンクフィンガードメインにエフェクタードメイン（活性化又は抑制）を融合した場合、その融合タンパク質は、新しい転写因子であって、ジンクフィンガーが認識する標的遺伝子の発現を活性化又は抑制することができる。
【００１４】
本発明のジンクフィンガードメインは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型のジンクフィンガードメインであって、通常、３つ以上並んでジンクフィンガータンパク質を構成する。１つのジンクフィンガードメインは３つあるいは４つの塩基からなる標的配列を認識することができるため、いくつかのジンクフィンガードメインの適切な再配列及び連結により、９−１０塩基の標的配列を選択的に認識することのできる配列特異的ジンクフィンガーを作成することができる。本発明においては、ヒトゲノムのジンクフィンガードメインを１つ〜３つ並べて、本発明で開発された新しい転写因子のＤＮＡ結合ドメインとして利用する。本発明のジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムから同定されたジンクフィンガードメインである。本発明の新しい転写因子のエフェクタードメインの機能を確認するために、レポータープラスミド上の５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’配列を標的として認識することのできる試験ジンクフィンガータンパク質を作成して利用した。ジンクフィンガーとして５’−ＧＣＧ−３’を認識するＺＦＰ１と５’−ＧＧＧ−３’を認識するＺＦＰ２を利用して、Ｎ−末端からエフェクタードメイン−ＺＦＰ２−ＺＦＰ１−ＺＦＰ１、Ｃ−末端からなる試験転写因子を作成して利用した。
【００１５】
エフェクタードメイン
一般に、原核生物の転写因子は、転写の活性化及び抑制の２つの機能を同時に有する。転写の活性化及び抑制の機能は、転写因子が結合するゲノム配列上の位置によって異なる。一般に、転写開始点から−８０〜−３０に転写因子が結合した場合は遺伝子発現を活性化し、−３０より下流に結合した場合は遺伝子発現を抑制することが知られている。
【００１６】
本発明は、原核生物である大腸菌で作用可能な転写因子を開発するためのもので、真核生物のように活性化と抑制のためのそれぞれの異なるドメインを必要とするのではなく、活性のよい１つのエフェクタードメインを利用することにより、転写の活性化及び抑制の２つの機能を同時に得ることができる。
【００１７】
また、野生型転写因子だけでなく、実際に遺伝子発現を抑制又は活性化する転写因子内部の転写調節活性化ドメインのみをエフェクタードメインとして利用することができる。
【００１８】
本発明においては、原核細胞生物の転写因子をエフェクタードメインとして利用することができる。具体的には、大腸菌の普遍的な転写因子であるＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質）とその誘導体をエフェクタードメインとして利用することができる。ＣＲＰは、大腸菌ゲノムの１００個以上のプロモータに作用し、その遺伝子の発現を調節する転写因子としてよく知られている。ＣＲＰは、２０９個のアミノ酸からなり、２つのドメインからなる。すなわち、ＣＲＰは、ＣＲＰの二量化物（dimerization）とｃＡＭＰとの相互作用に関与するＮ−末端ドメインと、ＤＮＡとの相互作用に関与するＣ−末端ドメインとからなる。さらに、ＣＲＰは、転写を活性化する３種類の活性化ドメイン、例えばＡＲ１（残基１５６−１６４）、ＡＲ２（残基１９、２１、９６、及び１０１）、並びにＡＲ３（残基５２、５３、５４、５５、５８）を含む。このうち、ＡＲ１が転写活性において最も好ましく利用される活性化ドメインである（Busby, S., Ebright, R. H., J Mol Biol., 293, 1999, 199-213; Rhodius, V. A., West, D. M., Webster, C. L., Busby, S. J., Savery N., J.Nucleic Acids Res., 25, 326-332, 1997; Rhodius, V. A., Busby, S. J., J. Mol. Biol., 299, 295-310, 2000; Wagner, R., Transcription regulation in prokaryotes., 199-207, 211-217. Oxford University Press. Oxford., 2000）。
【００１９】
本発明におけるＣＲＰは、エフェクタードメインとしての機能のみ必要とされ、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとしてはジンクフィンガードメインが利用されるため、ＣＲＰのＤＮＡ結合ドメインは不要である。従って、ＤＮＡ結合ドメインが除去されているＣＲＰを含むＣＲＰ誘導体、又はＡＲ１部分を含むＣＲＰ誘導体を、エフェクタードメインとして利用することができる。好ましくは、次の３種類をエフェクタードメインとして利用することができる：野生型ＣＲＰとしてＣＲＰ Ｗ（残基１−２０９）、ＣＲＰ誘導体としてＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）及びＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）。
【００２０】
ペプチドリンカー
様々なリンカーを使用して前記ＤＮＡ結合ドメイン同士を連結し、又は前記ＤＮＡ結合ドメインとエフェクタードメインとを連結することもできる。本発明は、自然界に存在するジンクフィンガータンパク質でジンクフィンガードメインを連結するリンカーを使用することができる。前記自然界に存在する典型的なリンカーとしては、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）がある。本発明においては、ジンクフィンガードメイン同士、並びにジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとを連結するために、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒを利用することができる。
【００２１】
レポータープラスミド
本発明においては、人工転写因子の遺伝子発現調節能力を確認するために、２つのレポータープラスミド、すなわち遺伝子発現の活性化を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ａと、遺伝子発現の抑制を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｒとが作成される。各レポータープラスミドは、大腸菌内因性（endogenous）転写因子の活性により、本発明の転写因子の能力が影響を受けるか否かを確認するために、大腸菌内因性転写因子であるｌａｃＩにより調節されるｔａｃプロモータを利用して改変した。ｔａｃプロモータの改変は、各レポータープラスミドのｔａｃプロモータの隣接領域に、本発明の試験転写因子が標的として結合できる配列５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を挿入することにより完成した。すなわち、前述のように、原核生物の転写因子は、転写開始点からの結合位置によって能力（活性化又は抑制）が異なるので、転写開始点から適切な位置に試験転写因子の結合配列を挿入することにより、レポータープラスミドのプロモータを完成した。
【００２２】
本発明の具体例において、試験転写因子の遺伝子発現活性化能力を確認するためのレポータープラスミドのプロモータは、転写開始点から−６７〜−５０領域に５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入して完成した。試験転写因子の遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドのプロモータは、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入して完成したが、これは図３に示す通りである。
【００２３】
レポーター遺伝子は、遺伝子発現の確認及び定量が容易な向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ＣＡ）を利用した。ＧＦＰ誘導体の発現は、励起後に、共焦点顕微鏡又は蛍光分光光度計を利用して蛍光放出を測定することにより検出することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ジンクフィンガードメイン及び原核生物由来のカタボライト制御タンパク質をエフェクタードメインとして利用した人工転写因子に関するものである。本発明のジンクフィンガードメインは、真核生物に由来するものであるが、原核生物においても活性を有することができる。更に、本発明の人工転写因子は、様々な原核生物のカタボライト制御タンパク質をエフェクタードメインとして利用することにより、様々な原核生物の活性を調節することができる。具体的には、本発明の転写因子が導入された場合、大腸菌内因性転写因子の作用とは関係なく遺伝子の発現を活性化又は抑制することにより、使用者所望の表現型を示す様々な形質転換大腸菌を誘導することができ、これにより、今まで明らかになっていない遺伝子の機能を分析したり、所望の有用な特性、例えば熱抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性、及び著しく向上した成長速度を有する形質転換大腸菌を誘導することができる。従って、本発明は様々な産業で利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の人工転写因子を利用して大腸菌で様々な形質転換を誘導する発明の概略図であり、円形はジンクフィンガードメインを示し、四角形はエフェクタードメインを示す。
【図２】図２は、大腸菌のカタボライト制御タンパク質（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ））の機能を確認するために作成した試験転写因子に使用したジンクフィンガータンパク質とその配列を図式的に示すものでり、各ジンクフィンガータンパク質が認識する配列を各ジンクフィンガーの下に示す。
【図３】図３は、本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとしてＣＲＰの機能を確認するために図２の試験転写因子のジンクフィンガータンパク質が認識する特定の配列をｔａｃプロモータの上下流に挿入して作成したレポータープラスミドのフラグメントを示すものであり、人工転写因子の遺伝子発現活性化能力を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ａを示す。
【図４】図４は、本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとしてＣＲＰの機能を確認するために図２の試験転写因子のジンクフィンガータンパク質が認識する特定の配列をｔａｃプロモータの上下流に挿入して作成したレポータープラスミドのフラグメントを示すものであり、遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｒを示す。
【図５】図５は、試験転写因子がｐＥＧＦＰ−Ａの向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子の転写を活性化することを共焦点顕微鏡で確認した写真である。
【図６】図６は、図５の試験転写因子により活性化されたレポーター遺伝子発現の活性化程度を数値化したグラフである。
【図７】図７は、図５の試験転写因子により抑制されたレポーター遺伝子発現の活性化程度を数値化したグラフである。
【図８】図８は、ｐＥＧＦＰ−ＲでＩＰＴＧにより発現が活性化されているレポーター遺伝子が試験転写因子により発現が抑制されることを数値化したグラフであり、 図９は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された熱抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図９】図１０は、熱抵抗性が最もよい大腸菌であるＴ２の５０℃での成長曲線を示す。
【図１０】図１１は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により成長が向上した大腸菌の３７℃、ＬＢ培地での成長速度を示す。
【図１１】図１２は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により成長が向上した大腸菌の３７℃、Ｍ９培地での成長速度を示す。
【図１２】図１３は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された低温抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図１３】図１４は、低温抵抗性が最もよい大腸菌であるＣＴ１と対照群の成長曲線を示す。
【図１４】図１５は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された浸透圧抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図１５】図１６は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドの開裂地図を示す。
【図１６】図１７は、ｐＵＣ１９プラスミドの開裂地図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、下記の実施例及び実験例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例及び実験例は本発明の例示にすぎず、本発明の権利範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
試験転写因子の製造
本発明の転写因子の機能を確認するために、レポータープラスミド上の５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’配列を標的として認識することのできる試験ジンクフィンガードメインは、次のジンクフィンガードメインを利用して作成した。ジンクフィンガーとしては、５’−ＧＣＧ−３’を認識するＺＦＰ１及び５’−ＧＧＧ−３’を認識するＺＦＰ２を利用した。エフェクタードメインとしては、ＣＲＰ Ｗ（配列番号１）、並びにＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０、配列番号３）及びＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０、配列番号５）を利用した。融合した各エフェクタードメインによって３種類の試験転写因子を作成して、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｗを利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗと命名し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０と命名し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １３７を利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７と命名した。前記転写因子は、Ｎ−末端からエフェクタードメイン−ＺＦＰ２−ＺＦＰ１−ＺＦＰ１、Ｃ−末端からなる（図２参照）。
【００２８】
前記エフェクタードメインは、大腸菌から単離してＰＣＲで増幅した後、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩを利用して発現プラスミドにクローニングした。その後、合成されたそれぞれのジンクフィンガードメインを、順にＸｍａＩとＥｃｏＲＩを利用してＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断されたエフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドに連結した。
【００２９】
また、前記試験転写因子のジンクフィンガーであるＺＦＰ１は、ヒトゲノム配列から選別され、配列番号９のヒト核酸配列によりコードされている。さらに、前記試験転写因子のジンクフィンガーであるＺＦＰ２も、ヒトゲノム配列から選別され、配列番号１１のヒト核酸配列によりコードされている。
【実施例２】
【００３０】
レポータープラスミドの製造
遺伝子発現の活性化及び抑制を確認するための各レポータープラスミドとしては、ｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．、ＵＳＡ、図１６）を改変して使用した。レポータープラスミドは、レポーター遺伝子としての向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（ＥＧＦＰ）遺伝子、ｔａｃプロモータ遺伝子、及び試験転写調節因子の標的認識配列をＰＣＲで増幅し、ｐＡＣＹＣ１８４に挿入することにより作成した。遺伝子発現活性化を確認するためのレポータープラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ａは、転写開始点から−６７〜−５０領域に試験転写因子の標的配列である５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入することにより作成した（図３参照）。また、試験転写因子の遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドとしてのｐＥＧＦＰ−Ｒのプロモータは、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に試験転写因子の標的配列である５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入することにより作成した（図４参照）。ｐＥＧＦＰ−Ａレポータープラスミドの核酸配列は配列番号７であり、ｐＥＧＦＰ−Ｒレポータープラスミドの核酸配列は配列番号８である。
【００３１】
実験例１：エフェクタードメイン機能の確認
本発明の転写因子の機能が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｋ−１２ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）内因性転写因子であるｌａｃＩリプレッサーの影響を受けず、遺伝子の発現を人為的に活性化又は抑制できるか否かを確認するために、下記のような実験を行った。
【００３２】
前記試験転写因子、すなわち前記実施例１で製造したＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗ、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０、及びＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７を、遺伝子発現の活性化を確認する場合には前記実施例２で製造されたｐＥＧＦＰ−Ａレポータープラスミド内に、そして遺伝子発現の抑制を確認する場合には前記実施例２で製造されたｐＥＧＦＰ−Ｒレポータープラスミド内に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加した場合と添加しない場合とに分けて、本発明の転写因子によるレポーター遺伝子の発現を活性化又は抑制するか否かを実験した。前記レポータープラスミド内では、緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体遺伝子により、その蛍光程度からレポータープラスミドの発現程度を観察することができ、この観察は共焦点顕微鏡により行われた。
【００３３】
更に、本発明の試験転写因子によるレポーター遺伝子発現の活性化率又は抑制率を求めた。具体的には、活性率は、前記実施例１で製造された試験転写因子をコードしていない対照群のプラスミドが導入された普通の細胞でのレポーター遺伝子の発現量を求め、この値で試験転写因子をコードしているプラスミドが導入された細胞でのレポーター遺伝子の発現量を割って数値化した。一方、抑制率は、前記実施例１の試験転写因子をコードしていない対照群のプラスミドが導入された普通の細胞でのレポーター遺伝子の発現量を求め、これを試験転写因子をコードしているプラスミドが導入された細胞でのレポーター遺伝子の発現量で割って数値化した。
【００３４】
前記実験の結果、本発明の試験転写因子のレポーター遺伝子の転写活性は、図５に示す通りであった。図５の「ベクターなし」とは、レポータープラスミドと試験転写因子をコードしているプラスミドの両方とも導入されていない野生型大腸菌を意味し、「空ベクター」とは、試験転写因子をコードしているプラスミドは導入されず、レポータープラスミドのみ導入された大腸菌を意味する。ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗは、エフェクタードメインとして野生型ＣＲＰが融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示し、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０は、エフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体のうちＣＲＰ残基１−１８０が融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示し、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７は、エフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体のうちＣＲＰ残基１３７−１９０が融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示す。図５に示すように、野生型ＣＲＰ Ｗよりも、ＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １８０及びＣＲＰ Ｄｅｌ １３７をエフェクタードメインとして有する転写因子が、レポーター遺伝子の発現の活性化にさらに優れていることを確認することができた。また、ＩＰＴＧにより既に発現が活性化されているレポーター遺伝子の発現が、試験転写因子によりさらに強く活性化され、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ２倍、３倍に、ＥＧＦＰの発現を活性化することを確認することができた（図５のＡ〜Ｅ及び図６参照）。
【００３５】
また、ＩＰＴＧを添加しないことによって発現が抑制されているレポーター遺伝子の発現は、本発明の試験転写因子により、ｐＥＧＦＰ−Ａのレポーター遺伝子の発現が活性化され、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗは２倍、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ３倍、４倍に、ＥＧＦＰの発現が活性化されることを確認することができた（図５のＦ〜Ｊ及び図７参照）。
【００３６】
一方、レポーター遺伝子を抑制するか否かは、図８に示すように、ｐＥＧＦＰ−ＲでＩＰＴＧにより発現が活性化されているレポーター遺伝子が試験転写因子により発現が抑制されることを確認することができ、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ約１．５倍、２倍に、レポーター遺伝子の発現を抑制することを確認することができた。
【００３７】
従って、前記実験の結果をまとめると、本発明の試験転写因子は、大腸菌内因性転写リプレッサーであるｌａｃＩタンパク質と関係なく、レポーター遺伝子の発現を効果的に調節することができる。
【００３８】
実験例２：転写因子ライブラリーの作成
ジェンバンク（GenBank）データベース検索結果から選別されたヒトゲノムの２６種類のジンクフィンガードメインを合成し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ． Ｉｎｃ．、ＵＳＡ、図１７参照）にクローニングした。本発明者らは、転写因子発現プラスミドにエフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １３７とＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をそれぞれクローニングして融合したエフェクタードメインによって、２種類の異なる転写因子ライブラリーを作成した。転写因子ライブラリーの作成は前記試験転写因子の作成と同様の方法で行われた。すなわち、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断する。異なるジンクフィンガードメインがクローニングされたｐＵＣ１９を同量で混ぜた後、ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断した。前記ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断された、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドと、前記ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断されたジンクフィンガードメインとを連結して、エフェクタードメインと１つのジンクフィンガードメインとからなるライブラリーを作成した。その後、上記と同様の方法で、エフェクタードメインと１つのジンクフィンガードメインがクローニングされた発現プラスミドをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断されたジンクフィンガードメインと連結して、第２のジンクフィンガードメインを連結した。最後に、上記と同様の方法で、３つのジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとからなる転写因子ライブラリーを作成した。
【００３９】
ジェンバンクデータベース検索結果から選別されたヒトゲノム配列から選別された２６種類のジンクフィンガードメインＺ１〜Ｚ２６を以下に示す：
Ｚ１は配列番号１３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２は配列番号１５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ３は配列番号１７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ４は配列番号１９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ５は配列番号２１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ６は配列番号２３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ７は配列番号２５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ８は配列番号２７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ９は配列番号２９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１０は配列番号３１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１１は配列番号３３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１２は配列番号３５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１３は配列番号３７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１４は配列番号３９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１５は配列番号４１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１６は配列番号４３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１７は配列番号４５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１８は配列番号４７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１９は配列番号４９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２０は配列番号５１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２１は配列番号５３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２２は配列番号５５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２３は配列番号５７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２４は配列番号５９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２５は配列番号６１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２６は配列番号６３の核酸配列によりコードされている。
【００４０】
実験例３：新しい転写因子を利用した様々な形質転換大腸菌の誘導
前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、特定の条件下で所望の表現型を示す大腸菌を誘導して選別した。所望の表現型を示す大腸菌から転写因子を単離して確認した後、これを大腸菌に再導入して同一の表現型が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子による特定の表現型の誘導を確認した。
【００４１】
３−１．熱抵抗性を有する形質転換大腸菌の誘導
高い温度での異種タンパク質（heterologous protein）の大量発現は、その溶解度を増加させる。従って、大腸菌において熱衝撃応答（heat shock response）に関する理解は、産業用微生物の開発において重要な課題である。１つの態様においては、転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用して作成した人工転写因子が導入された大腸菌を、５５℃で２時間熱衝撃を加え、ＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で培養した。培養後に成長したコロニーから熱抵抗性を有する大腸菌を選別した。
【００４２】
選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、熱抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。大腸菌の成長曲線は、１００ｍｌのＬＢ培地、５０℃で大腸菌の成長パターンを観察し、約１時間３０分間隔で大腸菌サンプルを取り、分光光度計の６００ｎｍで光学密度（Optical Density; OD）を測定して求めた。
【００４３】
前記実験の結果は図９に示す通りである。図９の左側の写真は熱衝撃を加えていない大腸菌の対照群の写真であり、右側の写真は５５℃で２時間熱衝撃を加えた後の大腸菌の生存率を示す写真であり、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３は異なる人工転写因子により熱抵抗性を有する大腸菌を示す。図９に示すように、熱衝撃が加えられていない条件下では、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、５５℃の熱衝撃が加えられた条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されるのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、熱衝撃がある条件でもよく成長することを確認することができた。図９の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。
【００４４】
その中でＴ２の転写因子が、熱衝撃がある条件で最もよく成長させることを確認し、その５０℃での成長曲線を図１０に示す。前記熱抵抗性が最もよいＴ２の転写因子は次の通りである：
Ｔ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ２３＋Ｚ１１＋Ｚ１９
Ｔ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１３＋Ｚ２＋Ｚ２３
Ｔ３＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ９＋Ｚ４＋Ｚ１１
３−２．向上した成長速度を有する形質転換大腸菌の誘導
宿主細胞の速い成長速度は生産性を向上させるので産業的に非常に有用である。従って、本発明においては、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを導入して、最適な成長温度である３７℃で向上した成長速度を有する大腸菌を誘導、選別した。
【００４５】
転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、１００ｍｌのＬＢ培地及びＭ９培地で３７℃で継代培養（７日間２４時間間隔で新しい１００ｍｌの培地に１ｍｌずつトランスファー）し、ストリーキング又は希釈し、プレーティングすることにより、コロニーを得た。１００ｍｌのＬＢ培地及びＭ９培地、３７℃で各コロニーの成長パターンを確認して、最終的に向上した成長速度を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、成長速度が向上するか否かを確認することにより、転写因子による成長速度の向上を確認した。
【００４６】
前記実験の結果は図１１及び図１２に示す通りであり、図１１は３７℃、ＬＢ培地で成長速度を確認した結果を示し、図１２は３７℃、Ｍ９培地で成長速度を確認した結果を示し、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＲＧ＃３２は人工転写因子により向上した成長速度を有する大腸菌を示す。図１１に示すように、人工転写因子がコードされていない大腸菌の場合は、培養後１５時間以降は成長速度が増加しなくなり、本発明の転写因子が導入された大腸菌の場合は、培養後５０時間まで持続的に成長した。これにより、大腸菌の生産性が著しく向上することを確認することができた。
【００４７】
ＲＧ＃３２＝ＣＲＰ１−１８０ａ．ａ＋Ｚ２６＋Ｚ７
前述のように、本発明の人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインであるジンクフィンガータンパク質は、真核細胞だけでなく、原核細胞においても活性を示すことを確認することができ、また本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとして利用したＣＲＰの場合、シゲラのＣＲＰと同じ配列を有し、様々な原核細胞にそのようなファミリータンパク質が存在するので、大腸菌だけでなく、様々な原核細胞で遺伝子の発現を調節することにより、様々な表現型を誘導できると期待される。
【００４８】
３−３．低温抵抗性（低温衝撃（cold shock）に対する抵抗性）を有する形質転換大腸菌の誘導
低い温度での標的タンパク質の過剰発現はタンパク質の溶解度及び安定性を向上させるので、低温抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として大きな価値がある。従って、低温衝撃に対する抵抗性を有する形質転換大腸菌を誘導するために、下記のような実験を行った。本実験においては、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを導入して、低温でも成長が可能な大腸菌を誘導、選別した。
【００４９】
前記実験例２で得られた人工転写因子ライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｅｌｌ、２００１）に導入し、ＬＢプレートにプレーティングし、１５℃で培養し、成長したコロニーから低温抵抗性を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、低温抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。
【００５０】
大腸菌の成長曲線は、１００ｍｌのＬＢ培地、１５℃で大腸菌の成長パターンを観察し、約５時間間隔で大腸菌サンプルを取り、分光光度計の６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定して求めた。対照群として、１００ｍｌのＬＢ培地、最適な成長温度である３７℃で大腸菌の成長パターンを観察した。
【００５１】
前記実験の結果は図１３に示す通りであり、図１３において、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＣＴ１及びＣＴ２は異なる人工転写因子により低温抵抗性を有する大腸菌を示し、図１３の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。対照群の場合は、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、１５℃の低温条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されたのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、低温でもよく成長することを確認することができた。
【００５２】
その中でＣＴ１及びＣＴ２の転写因子が導入された大腸菌が、低温で最もよく成長することを確認し、ＣＴ１の１５℃での成長曲線を図１４に示す。前記低温抵抗性を有するＣＴ１及びＣＴ２の転写因子は次の通りである：
ＣＴ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１９＋Ｚ６＋Ｚ２２
ＣＴ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１５＋Ｚ４＋Ｚ２
３−４．浸透圧抵抗性（高塩濃度に対する抵抗性）を有する形質転換大腸菌の誘導
発酵時に過度な熱の発生を伴う浸透圧の増加は、微生物における標的タンパク質の発現時にその生産性を阻害する。従って、浸透圧抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として非常に有用である。本実験においては、浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別するために、高塩濃度の０．６Ｍ Ｎａｃｌが添加された最小Ａ培地（１０．５ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、４．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム２Ｈ2Ｏ、１０ｍｌ／ｌの２０％のグルコース、１ｍｌ／ｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ）を利用した。エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実施例２の転写因子ライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｅｌｌ、２００１）に導入し、プレーティングし、３７℃で培養し、成長したコロニーから浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、浸透圧抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。
【００５３】
前記実験の結果は図１５に示す通りである。図１５において、左側の写真は浸透圧がかかっていない最小Ａ培地での成長を確認した大腸菌（対照群）の写真であり、右側の写真は浸透圧がかかった最小Ａ培地での大腸菌の生存率を示す写真であり、写真において、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＯＴ１、ＯＴ２、ＯＴ３、ＯＴ４は異なる人工転写因子が導入された大腸菌であって、浸透圧抵抗性を有する大腸菌である。また、図１５の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。
【００５４】
図１５に示すように、最適な成長条件下では、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、浸透圧の条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されるのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、浸透圧の条件でもよく成長することを確認することができた。浸透圧抵抗性を有するＯＴ１、ＯＴ２、ＯＴ３、ＯＴ４の人工転写因子は次の通りである：
ＯＴ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ２４＋Ｚ２＋Ｚ２
ＯＴ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ８＋Ｚ４＋Ｚ１９
ＯＴ３＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ５＋Ｚ２３＋Ｚ１７
ＯＴ４＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ９＋Ｚ２４＋Ｚ２３
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の人工転写因子を原核生物に導入して形質転換させると、導入された人工転写により様々な原核生物の遺伝子発現を活性化又は抑制することができ、使用者所望の表現型を示す様々な形質転換大腸菌を誘導することができ、産業に有用なカスタマイズされた大腸菌を提供することができる。また、今まで明らかになっていない遺伝子の機能を分析したり、所望の有用な特性を有する形質転換大腸菌を誘導することができる。代表的な例として、熱抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性、及び向上した成長速度を有する形質転換大腸菌を誘導することができ、産業に非常に有用に利用することができる。
【００５６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンクフィンガータンパク質と原核生物の転写因子を利用して、大腸菌の遺伝子発現を人為的に調節することのできる人工転写因子、及びそれを利用した形質転換大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代の到来とともに、多くの生命体の遺伝子情報に基づいて研究と分析が活発に行われている。そのうち、遺伝子の発現を人為的に調節できるシステムの開発と必要性は、焦眉の関心事となっており、盛んに研究されている分野の１つである。生物体あるいは細胞内で特定の遺伝子発現の増減を人為的に調節することができれば、これによる生物学的結果を分析することにより、特定の遺伝子の機能を解析したり、その遺伝子の生物学的役割を明らかにすることができる。それだけでなく、標的とする遺伝子の発現を適切に調節することができれば、これは遺伝子治療の手段として活用することができるであろう。また、自然界における生命体の特徴はその生命体が有する特定の遺伝子の発現有無とその程度によって決定されるので、遺伝子の発現を人為的に調節して所望の表現型を示す生物体を誘導することにより、所望の産業用微生物の開発にも応用することができる。
【０００３】
近年、ジンクフィンガータンパク質を利用して遺伝子の発現を調節することができる可能性が出てきており、これに関する肯定的な研究結果が発表された。ジンクフィンガーは、真核生物で最もよく発見されるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合モチーフとして知られている。ジンクフィンガーは、配列特異的に特定の標的配列を認識することのできる活性を示すドメインであって、それ自体で転写リプレッサーとして作用する。それだけでなく、このジンクフィンガータンパク質をＤＮＡ結合ドメインとして利用し、転写活性化（又は、抑制）ドメインと連結することにより、新しい転写因子を作成することができる。
【０００４】
近年、配列特異的ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを様々な種類の適切なエフェクタードメイン（活性化ドメイン又は抑制ドメイン）と融合して、転写因子の形で細胞で発現すると、標的遺伝子の発現を増加又は減少させることができるという研究が発表された（Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., and Barb as, C. F., III, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5525-5530; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas C. F., III, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14628-14633; Beerli R.R., Dreier B. Barbas C.F.3rd, Positive and negative regulation of endogeneous genes by designed transcription factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 Feb. 15:97(4), 1495-500）。
【０００５】
ところが、既存の原核細胞の研究は、エフェクタードメインを利用することなく、ジンクフィンガードメインのみを転写因子として利用することによって、遺伝子発現を抑制する効果のみを期待することができ、その効果も微弱であった。様々な表現型をより効果的に得るためには、遺伝子発現の抑制だけでなく、活性化による様々な遺伝子発現の調節が必要である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、ジンクフィンガードメインライブラリーに、エフェクタードメインとして、原核生物であって産業的に有用な大腸菌の転写因子を融合することにより、大腸菌の遺伝子発現の抑制だけでなく活性化を行うことのできる新しい人工転写因子を開発し、それを大腸菌に導入した場合、大腸菌の遺伝子発現が人為的に調節されることによって、様々な表現型を有する形質転換大腸菌を作成できることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとして原核生物の転写因子とを融合することにより、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制することのできる人工転写因子の製造、並びにそれを利用した、様々な形質特異性を示す形質転換された大腸菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、１つ〜３つのジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとして原核生物の転写因子とを含み、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制することのできる人工転写因子を提供する。前記エフェクタードメインとしての原核生物の転写因子は、大腸菌のＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質（Catabolite Regulatory Protein）（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質）、あるいはその誘導体、例えば野生型ＣＲＰ（ＣＲＰ Ｗ、残基１−２０９）、ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）、もしくはＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）でもよい。
【０００９】
また、前記ジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムから同定されたもので、配列番号１３〜６４の配列によりコードされているジンクフィンガードメインからなる群から選択されるものである。
【００１０】
また、前記人工転写因子は、遺伝子発現を活性化するためには、転写開始点から−８０〜−３０、好ましくは−６７〜−５０領域に挿入され、遺伝子発現を抑制するためには、転写開始点から−３０より下流、好ましくは＋２４〜＋４１領域に結合される。
【００１１】
さらに、本発明は、前記人工転写因子が導入されて様々な表現型を発現する形質転換された大腸菌を提供し、好ましくは、熱抵抗性を有する形質転換大腸菌、向上した成長速度を有する形質転換大腸菌、低温抵抗性を有する形質転換大腸菌、及び浸透圧抵抗性を有する形質転換大腸菌を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
ＤＮＡ結合ドメイン−ジンクフィンガードメイン
ジンクフィンガードメインは、真核生物で最もよく見られるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合モチーフであって、酵母から高等植物及び人間に至る様々な種で見られる。ジンクフィンガードメインは、それ自体で遺伝子発現を抑制する転写リプレッサーとして作用することが知られている。従って、このようなジンクフィンガードメインにエフェクタードメイン（活性化又は抑制）を融合した場合、その融合タンパク質は、新しい転写因子であって、ジンクフィンガーが認識する標的遺伝子の発現を活性化又は抑制することができる。
【００１４】
本発明のジンクフィンガードメインは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型のジンクフィンガードメインであって、通常、３つ以上並んでジンクフィンガータンパク質を構成する。１つのジンクフィンガードメインは３つあるいは４つの塩基からなる標的配列を認識することができるため、いくつかのジンクフィンガードメインの適切な再配列及び連結により、９−１０塩基の標的配列を選択的に認識することのできる配列特異的ジンクフィンガーを作成することができる。本発明においては、ヒトゲノムのジンクフィンガードメインを１つ〜３つ並べて、本発明で開発された新しい転写因子のＤＮＡ結合ドメインとして利用する。本発明のジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムから同定されたジンクフィンガードメインである。本発明の新しい転写因子のエフェクタードメインの機能を確認するために、レポータープラスミド上の５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’配列を標的として認識することのできる試験ジンクフィンガータンパク質を作成して利用した。ジンクフィンガーとして５’−ＧＣＧ−３’を認識するＺＦＰ１と５’−ＧＧＧ−３’を認識するＺＦＰ２を利用して、Ｎ−末端からエフェクタードメイン−ＺＦＰ２−ＺＦＰ１−ＺＦＰ１、Ｃ−末端からなる試験転写因子を作成して利用した。
【００１５】
エフェクタードメイン
一般に、原核生物の転写因子は、転写の活性化及び抑制の２つの機能を同時に有する。転写の活性化及び抑制の機能は、転写因子が結合するゲノム配列上の位置によって異なる。一般に、転写開始点から−８０〜−３０に転写因子が結合した場合は遺伝子発現を活性化し、−３０より下流に結合した場合は遺伝子発現を抑制することが知られている。
【００１６】
本発明は、原核生物である大腸菌で作用可能な転写因子を開発するためのもので、真核生物のように活性化と抑制のためのそれぞれの異なるドメインを必要とするのではなく、活性のよい１つのエフェクタードメインを利用することにより、転写の活性化及び抑制の２つの機能を同時に得ることができる。
【００１７】
また、野生型転写因子だけでなく、実際に遺伝子発現を抑制又は活性化する転写因子内部の転写調節活性化ドメインのみをエフェクタードメインとして利用することができる。
【００１８】
本発明においては、原核細胞生物の転写因子をエフェクタードメインとして利用することができる。具体的には、大腸菌の普遍的な転写因子であるＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質）とその誘導体をエフェクタードメインとして利用することができる。ＣＲＰは、大腸菌ゲノムの１００個以上のプロモータに作用し、その遺伝子の発現を調節する転写因子としてよく知られている。ＣＲＰは、２０９個のアミノ酸からなり、２つのドメインからなる。すなわち、ＣＲＰは、ＣＲＰの二量化物（dimerization）とｃＡＭＰとの相互作用に関与するＮ−末端ドメインと、ＤＮＡとの相互作用に関与するＣ−末端ドメインとからなる。さらに、ＣＲＰは、転写を活性化する３種類の活性化ドメイン、例えばＡＲ１（残基１５６−１６４）、ＡＲ２（残基１９、２１、９６、及び１０１）、並びにＡＲ３（残基５２、５３、５４、５５、５８）を含む。このうち、ＡＲ１が転写活性において最も好ましく利用される活性化ドメインである（Busby, S., Ebright, R. H., J Mol Biol., 293, 1999, 199-213; Rhodius, V. A., West, D. M., Webster, C. L., Busby, S. J., Savery N., J.Nucleic Acids Res., 25, 326-332, 1997; Rhodius, V. A., Busby, S. J., J. Mol. Biol., 299, 295-310, 2000; Wagner, R., Transcription regulation in prokaryotes., 199-207, 211-217. Oxford University Press. Oxford., 2000）。
【００１９】
本発明におけるＣＲＰは、エフェクタードメインとしての機能のみ必要とされ、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとしてはジンクフィンガードメインが利用されるため、ＣＲＰのＤＮＡ結合ドメインは不要である。従って、ＤＮＡ結合ドメインが除去されているＣＲＰを含むＣＲＰ誘導体、又はＡＲ１部分を含むＣＲＰ誘導体を、エフェクタードメインとして利用することができる。好ましくは、次の３種類をエフェクタードメインとして利用することができる：野生型ＣＲＰとしてＣＲＰ Ｗ（残基１−２０９）、ＣＲＰ誘導体としてＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）及びＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）。
【００２０】
ペプチドリンカー
様々なリンカーを使用して前記ＤＮＡ結合ドメイン同士を連結し、又は前記ＤＮＡ結合ドメインとエフェクタードメインとを連結することもできる。本発明は、自然界に存在するジンクフィンガータンパク質でジンクフィンガードメインを連結するリンカーを使用することができる。前記自然界に存在する典型的なリンカーとしては、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）がある。本発明においては、ジンクフィンガードメイン同士、並びにジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとを連結するために、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒを利用することができる。
【００２１】
レポータープラスミド
本発明においては、人工転写因子の遺伝子発現調節能力を確認するために、２つのレポータープラスミド、すなわち遺伝子発現の活性化を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ａと、遺伝子発現の抑制を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｒとが作成される。各レポータープラスミドは、大腸菌内因性（endogenous）転写因子の活性により、本発明の転写因子の能力が影響を受けるか否かを確認するために、大腸菌内因性転写因子であるｌａｃＩにより調節されるｔａｃプロモータを利用して改変した。ｔａｃプロモータの改変は、各レポータープラスミドのｔａｃプロモータの隣接領域に、本発明の試験転写因子が標的として結合できる配列５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を挿入することにより完成した。すなわち、前述のように、原核生物の転写因子は、転写開始点からの結合位置によって能力（活性化又は抑制）が異なるので、転写開始点から適切な位置に試験転写因子の結合配列を挿入することにより、レポータープラスミドのプロモータを完成した。
【００２２】
本発明の具体例において、試験転写因子の遺伝子発現活性化能力を確認するためのレポータープラスミドのプロモータは、転写開始点から−６７〜−５０領域に５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入して完成した。試験転写因子の遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドのプロモータは、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入して完成したが、これは図３に示す通りである。
【００２３】
レポーター遺伝子は、遺伝子発現の確認及び定量が容易な向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ＣＡ）を利用した。ＧＦＰ誘導体の発現は、励起後に、共焦点顕微鏡又は蛍光分光光度計を利用して蛍光放出を測定することにより検出することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ジンクフィンガードメイン及び原核生物由来のカタボライト制御タンパク質をエフェクタードメインとして利用した人工転写因子に関するものである。本発明のジンクフィンガードメインは、真核生物に由来するものであるが、原核生物においても活性を有することができる。更に、本発明の人工転写因子は、様々な原核生物のカタボライト制御タンパク質をエフェクタードメインとして利用することにより、様々な原核生物の活性を調節することができる。具体的には、本発明の転写因子が導入された場合、大腸菌内因性転写因子の作用とは関係なく遺伝子の発現を活性化又は抑制することにより、使用者所望の表現型を示す様々な形質転換大腸菌を誘導することができ、これにより、今まで明らかになっていない遺伝子の機能を分析したり、所望の有用な特性、例えば熱抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性、及び著しく向上した成長速度を有する形質転換大腸菌を誘導することができる。従って、本発明は様々な産業で利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の人工転写因子を利用して大腸菌で様々な形質転換を誘導する発明の概略図であり、円形はジンクフィンガードメインを示し、四角形はエフェクタードメインを示す。
【図２】図２は、大腸菌のカタボライト制御タンパク質（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ））の機能を確認するために作成した試験転写因子に使用したジンクフィンガータンパク質とその配列を図式的に示すものでり、各ジンクフィンガータンパク質が認識する配列を各ジンクフィンガーの下に示す。
【図３】図３は、本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとしてＣＲＰの機能を確認するために図２の試験転写因子のジンクフィンガータンパク質が認識する特定の配列をｔａｃプロモータの上下流に挿入して作成したレポータープラスミドのフラグメントを示すものであり、人工転写因子の遺伝子発現活性化能力を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ａを示す。
【図４】図４は、本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとしてＣＲＰの機能を確認するために図２の試験転写因子のジンクフィンガータンパク質が認識する特定の配列をｔａｃプロモータの上下流に挿入して作成したレポータープラスミドのフラグメントを示すものであり、遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｒを示す。
【図５】図５は、試験転写因子がｐＥＧＦＰ−Ａの向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子の転写を活性化することを共焦点顕微鏡で確認した写真である。
【図６】図６は、図５の試験転写因子により活性化されたレポーター遺伝子発現の活性化程度を数値化したグラフである。
【図７】図７は、図５の試験転写因子により抑制されたレポーター遺伝子発現の活性化程度を数値化したグラフである。
【図８】図８は、ｐＥＧＦＰ−ＲでＩＰＴＧにより発現が活性化されているレポーター遺伝子が試験転写因子により発現が抑制されることを数値化したグラフであり、 図９は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された熱抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図９】図１０は、熱抵抗性が最もよい大腸菌であるＴ２の５０℃での成長曲線を示す。
【図１０】図１１は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により成長が向上した大腸菌の３７℃、ＬＢ培地での成長速度を示す。
【図１１】図１２は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により成長が向上した大腸菌の３７℃、Ｍ９培地での成長速度を示す。
【図１２】図１３は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された低温抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図１３】図１４は、低温抵抗性が最もよい大腸菌であるＣＴ１と対照群の成長曲線を示す。
【図１４】図１５は、ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成した人工転写因子により選別された浸透圧抵抗性を有する大腸菌の写真である。
【図１５】図１６は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドの開裂地図を示す。
【図１６】図１７は、ｐＵＣ１９プラスミドの開裂地図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、下記の実施例及び実験例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例及び実験例は本発明の例示にすぎず、本発明の権利範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
試験転写因子の製造
本発明の転写因子の機能を確認するために、レポータープラスミド上の５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’配列を標的として認識することのできる試験ジンクフィンガードメインは、次のジンクフィンガードメインを利用して作成した。ジンクフィンガーとしては、５’−ＧＣＧ−３’を認識するＺＦＰ１及び５’−ＧＧＧ−３’を認識するＺＦＰ２を利用した。エフェクタードメインとしては、ＣＲＰ Ｗ（配列番号１）、並びにＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０、配列番号３）及びＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０、配列番号５）を利用した。融合した各エフェクタードメインによって３種類の試験転写因子を作成して、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｗを利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗと命名し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０と命名し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １３７を利用した場合はＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７と命名した。前記転写因子は、Ｎ−末端からエフェクタードメイン−ＺＦＰ２−ＺＦＰ１−ＺＦＰ１、Ｃ−末端からなる（図２参照）。
【００２８】
前記エフェクタードメインは、大腸菌から単離してＰＣＲで増幅した後、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩを利用して発現プラスミドにクローニングした。その後、合成されたそれぞれのジンクフィンガードメインを、順にＸｍａＩとＥｃｏＲＩを利用してＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断されたエフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドに連結した。
【００２９】
また、前記試験転写因子のジンクフィンガーであるＺＦＰ１は、ヒトゲノム配列から選別され、配列番号９のヒト核酸配列によりコードされている。さらに、前記試験転写因子のジンクフィンガーであるＺＦＰ２も、ヒトゲノム配列から選別され、配列番号１１のヒト核酸配列によりコードされている。
【実施例２】
【００３０】
レポータープラスミドの製造
遺伝子発現の活性化及び抑制を確認するための各レポータープラスミドとしては、ｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．、ＵＳＡ、図１６）を改変して使用した。レポータープラスミドは、レポーター遺伝子としての向上した緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（ＥＧＦＰ）遺伝子、ｔａｃプロモータ遺伝子、及び試験転写調節因子の標的認識配列をＰＣＲで増幅し、ｐＡＣＹＣ１８４に挿入することにより作成した。遺伝子発現活性化を確認するためのレポータープラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ａは、転写開始点から−６７〜−５０領域に試験転写因子の標的配列である５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入することにより作成した（図３参照）。また、試験転写因子の遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドとしてのｐＥＧＦＰ−Ｒのプロモータは、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に試験転写因子の標的配列である５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ−３’を２コピー挿入することにより作成した（図４参照）。ｐＥＧＦＰ−Ａレポータープラスミドの核酸配列は配列番号７であり、ｐＥＧＦＰ−Ｒレポータープラスミドの核酸配列は配列番号８である。
【００３１】
実験例１：エフェクタードメイン機能の確認
本発明の転写因子の機能が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｋ−１２ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）内因性転写因子であるｌａｃＩリプレッサーの影響を受けず、遺伝子の発現を人為的に活性化又は抑制できるか否かを確認するために、下記のような実験を行った。
【００３２】
前記試験転写因子、すなわち前記実施例１で製造したＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗ、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０、及びＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７を、遺伝子発現の活性化を確認する場合には前記実施例２で製造されたｐＥＧＦＰ−Ａレポータープラスミド内に、そして遺伝子発現の抑制を確認する場合には前記実施例２で製造されたｐＥＧＦＰ−Ｒレポータープラスミド内に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加した場合と添加しない場合とに分けて、本発明の転写因子によるレポーター遺伝子の発現を活性化又は抑制するか否かを実験した。前記レポータープラスミド内では、緑色蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体遺伝子により、その蛍光程度からレポータープラスミドの発現程度を観察することができ、この観察は共焦点顕微鏡により行われた。
【００３３】
更に、本発明の試験転写因子によるレポーター遺伝子発現の活性化率又は抑制率を求めた。具体的には、活性率は、前記実施例１で製造された試験転写因子をコードしていない対照群のプラスミドが導入された普通の細胞でのレポーター遺伝子の発現量を求め、この値で試験転写因子をコードしているプラスミドが導入された細胞でのレポーター遺伝子の発現量を割って数値化した。一方、抑制率は、前記実施例１の試験転写因子をコードしていない対照群のプラスミドが導入された普通の細胞でのレポーター遺伝子の発現量を求め、これを試験転写因子をコードしているプラスミドが導入された細胞でのレポーター遺伝子の発現量で割って数値化した。
【００３４】
前記実験の結果、本発明の試験転写因子のレポーター遺伝子の転写活性は、図５に示す通りであった。図５の「ベクターなし」とは、レポータープラスミドと試験転写因子をコードしているプラスミドの両方とも導入されていない野生型大腸菌を意味し、「空ベクター」とは、試験転写因子をコードしているプラスミドは導入されず、レポータープラスミドのみ導入された大腸菌を意味する。ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗは、エフェクタードメインとして野生型ＣＲＰが融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示し、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０は、エフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体のうちＣＲＰ残基１−１８０が融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示し、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７は、エフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体のうちＣＲＰ残基１３７−１９０が融合した試験転写因子をコードしているプラスミドとレポータープラスミドが導入された大腸菌を示す。図５に示すように、野生型ＣＲＰ Ｗよりも、ＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １８０及びＣＲＰ Ｄｅｌ １３７をエフェクタードメインとして有する転写因子が、レポーター遺伝子の発現の活性化にさらに優れていることを確認することができた。また、ＩＰＴＧにより既に発現が活性化されているレポーター遺伝子の発現が、試験転写因子によりさらに強く活性化され、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ２倍、３倍に、ＥＧＦＰの発現を活性化することを確認することができた（図５のＡ〜Ｅ及び図６参照）。
【００３５】
また、ＩＰＴＧを添加しないことによって発現が抑制されているレポーター遺伝子の発現は、本発明の試験転写因子により、ｐＥＧＦＰ−Ａのレポーター遺伝子の発現が活性化され、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｗは２倍、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ３倍、４倍に、ＥＧＦＰの発現が活性化されることを確認することができた（図５のＦ〜Ｊ及び図７参照）。
【００３６】
一方、レポーター遺伝子を抑制するか否かは、図８に示すように、ｐＥＧＦＰ−ＲでＩＰＴＧにより発現が活性化されているレポーター遺伝子が試験転写因子により発現が抑制されることを確認することができ、ＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とＺＦＰ−ＣＲＰ Ｄｅｌ １３７はそれぞれ約１．５倍、２倍に、レポーター遺伝子の発現を抑制することを確認することができた。
【００３７】
従って、前記実験の結果をまとめると、本発明の試験転写因子は、大腸菌内因性転写リプレッサーであるｌａｃＩタンパク質と関係なく、レポーター遺伝子の発現を効果的に調節することができる。
【００３８】
実験例２：転写因子ライブラリーの作成
ジェンバンク（GenBank）データベース検索結果から選別されたヒトゲノムの２６種類のジンクフィンガードメインを合成し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ． Ｉｎｃ．、ＵＳＡ、図１７参照）にクローニングした。本発明者らは、転写因子発現プラスミドにエフェクタードメインとしてＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ Ｄｅｌ １３７とＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をそれぞれクローニングして融合したエフェクタードメインによって、２種類の異なる転写因子ライブラリーを作成した。転写因子ライブラリーの作成は前記試験転写因子の作成と同様の方法で行われた。すなわち、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断する。異なるジンクフィンガードメインがクローニングされたｐＵＣ１９を同量で混ぜた後、ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断した。前記ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断された、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドと、前記ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断されたジンクフィンガードメインとを連結して、エフェクタードメインと１つのジンクフィンガードメインとからなるライブラリーを作成した。その後、上記と同様の方法で、エフェクタードメインと１つのジンクフィンガードメインがクローニングされた発現プラスミドをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＸｍａＩとＥｃｏＲＩで切断されたジンクフィンガードメインと連結して、第２のジンクフィンガードメインを連結した。最後に、上記と同様の方法で、３つのジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとからなる転写因子ライブラリーを作成した。
【００３９】
ジェンバンクデータベース検索結果から選別されたヒトゲノム配列から選別された２６種類のジンクフィンガードメインＺ１〜Ｚ２６を以下に示す：
Ｚ１は配列番号１３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２は配列番号１５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ３は配列番号１７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ４は配列番号１９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ５は配列番号２１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ６は配列番号２３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ７は配列番号２５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ８は配列番号２７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ９は配列番号２９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１０は配列番号３１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１１は配列番号３３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１２は配列番号３５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１３は配列番号３７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１４は配列番号３９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１５は配列番号４１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１６は配列番号４３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１７は配列番号４５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１８は配列番号４７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ１９は配列番号４９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２０は配列番号５１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２１は配列番号５３の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２２は配列番号５５の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２３は配列番号５７の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２４は配列番号５９の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２５は配列番号６１の核酸配列によりコードされている；
Ｚ２６は配列番号６３の核酸配列によりコードされている。
【００４０】
実験例３：新しい転写因子を利用した様々な形質転換大腸菌の誘導
前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、特定の条件下で所望の表現型を示す大腸菌を誘導して選別した。所望の表現型を示す大腸菌から転写因子を単離して確認した後、これを大腸菌に再導入して同一の表現型が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子による特定の表現型の誘導を確認した。
【００４１】
３−１．熱抵抗性を有する形質転換大腸菌の誘導
高い温度での異種タンパク質（heterologous protein）の大量発現は、その溶解度を増加させる。従って、大腸菌において熱衝撃応答（heat shock response）に関する理解は、産業用微生物の開発において重要な課題である。１つの態様においては、転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用して作成した人工転写因子が導入された大腸菌を、５５℃で２時間熱衝撃を加え、ＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で培養した。培養後に成長したコロニーから熱抵抗性を有する大腸菌を選別した。
【００４２】
選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、熱抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。大腸菌の成長曲線は、１００ｍｌのＬＢ培地、５０℃で大腸菌の成長パターンを観察し、約１時間３０分間隔で大腸菌サンプルを取り、分光光度計の６００ｎｍで光学密度（Optical Density; OD）を測定して求めた。
【００４３】
前記実験の結果は図９に示す通りである。図９の左側の写真は熱衝撃を加えていない大腸菌の対照群の写真であり、右側の写真は５５℃で２時間熱衝撃を加えた後の大腸菌の生存率を示す写真であり、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３は異なる人工転写因子により熱抵抗性を有する大腸菌を示す。図９に示すように、熱衝撃が加えられていない条件下では、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、５５℃の熱衝撃が加えられた条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されるのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、熱衝撃がある条件でもよく成長することを確認することができた。図９の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。
【００４４】
その中でＴ２の転写因子が、熱衝撃がある条件で最もよく成長させることを確認し、その５０℃での成長曲線を図１０に示す。前記熱抵抗性が最もよいＴ２の転写因子は次の通りである：
Ｔ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ２３＋Ｚ１１＋Ｚ１９
Ｔ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１３＋Ｚ２＋Ｚ２３
Ｔ３＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ９＋Ｚ４＋Ｚ１１
３−２．向上した成長速度を有する形質転換大腸菌の誘導
宿主細胞の速い成長速度は生産性を向上させるので産業的に非常に有用である。従って、本発明においては、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを導入して、最適な成長温度である３７℃で向上した成長速度を有する大腸菌を誘導、選別した。
【００４５】
転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、１００ｍｌのＬＢ培地及びＭ９培地で３７℃で継代培養（７日間２４時間間隔で新しい１００ｍｌの培地に１ｍｌずつトランスファー）し、ストリーキング又は希釈し、プレーティングすることにより、コロニーを得た。１００ｍｌのＬＢ培地及びＭ９培地、３７℃で各コロニーの成長パターンを確認して、最終的に向上した成長速度を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、成長速度が向上するか否かを確認することにより、転写因子による成長速度の向上を確認した。
【００４６】
前記実験の結果は図１１及び図１２に示す通りであり、図１１は３７℃、ＬＢ培地で成長速度を確認した結果を示し、図１２は３７℃、Ｍ９培地で成長速度を確認した結果を示し、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＲＧ＃３２は人工転写因子により向上した成長速度を有する大腸菌を示す。図１１に示すように、人工転写因子がコードされていない大腸菌の場合は、培養後１５時間以降は成長速度が増加しなくなり、本発明の転写因子が導入された大腸菌の場合は、培養後５０時間まで持続的に成長した。これにより、大腸菌の生産性が著しく向上することを確認することができた。
【００４７】
ＲＧ＃３２＝ＣＲＰ１−１８０ａ．ａ＋Ｚ２６＋Ｚ７
前述のように、本発明の人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインであるジンクフィンガータンパク質は、真核細胞だけでなく、原核細胞においても活性を示すことを確認することができ、また本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとして利用したＣＲＰの場合、シゲラのＣＲＰと同じ配列を有し、様々な原核細胞にそのようなファミリータンパク質が存在するので、大腸菌だけでなく、様々な原核細胞で遺伝子の発現を調節することにより、様々な表現型を誘導できると期待される。
【００４８】
３−３．低温抵抗性（低温衝撃（cold shock）に対する抵抗性）を有する形質転換大腸菌の誘導
低い温度での標的タンパク質の過剰発現はタンパク質の溶解度及び安定性を向上させるので、低温抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として大きな価値がある。従って、低温衝撃に対する抵抗性を有する形質転換大腸菌を誘導するために、下記のような実験を行った。本実験においては、エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実験例２で作成された転写因子ライブラリーを導入して、低温でも成長が可能な大腸菌を誘導、選別した。
【００４９】
前記実験例２で得られた人工転写因子ライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｅｌｌ、２００１）に導入し、ＬＢプレートにプレーティングし、１５℃で培養し、成長したコロニーから低温抵抗性を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、低温抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。
【００５０】
大腸菌の成長曲線は、１００ｍｌのＬＢ培地、１５℃で大腸菌の成長パターンを観察し、約５時間間隔で大腸菌サンプルを取り、分光光度計の６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定して求めた。対照群として、１００ｍｌのＬＢ培地、最適な成長温度である３７℃で大腸菌の成長パターンを観察した。
【００５１】
前記実験の結果は図１３に示す通りであり、図１３において、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＣＴ１及びＣＴ２は異なる人工転写因子により低温抵抗性を有する大腸菌を示し、図１３の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。対照群の場合は、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、１５℃の低温条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されたのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、低温でもよく成長することを確認することができた。
【００５２】
その中でＣＴ１及びＣＴ２の転写因子が導入された大腸菌が、低温で最もよく成長することを確認し、ＣＴ１の１５℃での成長曲線を図１４に示す。前記低温抵抗性を有するＣＴ１及びＣＴ２の転写因子は次の通りである：
ＣＴ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１９＋Ｚ６＋Ｚ２２
ＣＴ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ１５＋Ｚ４＋Ｚ２
３−４．浸透圧抵抗性（高塩濃度に対する抵抗性）を有する形質転換大腸菌の誘導
発酵時に過度な熱の発生を伴う浸透圧の増加は、微生物における標的タンパク質の発現時にその生産性を阻害する。従って、浸透圧抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として非常に有用である。本実験においては、浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別するために、高塩濃度の０．６Ｍ Ｎａｃｌが添加された最小Ａ培地（１０．５ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、４．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム２Ｈ2Ｏ、１０ｍｌ／ｌの２０％のグルコース、１ｍｌ／ｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ）を利用した。エフェクタードメインとしてＣＲＰ Ｄｅｌ １８０を利用し、前記実施例２の転写因子ライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｅｌｌ、２００１）に導入し、プレーティングし、３７℃で培養し、成長したコロニーから浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、ＤＮＡ配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、浸透圧抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。
【００５３】
前記実験の結果は図１５に示す通りである。図１５において、左側の写真は浸透圧がかかっていない最小Ａ培地での成長を確認した大腸菌（対照群）の写真であり、右側の写真は浸透圧がかかった最小Ａ培地での大腸菌の生存率を示す写真であり、写真において、Ｃは人工転写因子がコードされていない対照群のプラスミドが導入された普通の大腸菌を示し、ＯＴ１、ＯＴ２、ＯＴ３、ＯＴ４は異なる人工転写因子が導入された大腸菌であって、浸透圧抵抗性を有する大腸菌である。また、図１５の上段の三角形は５倍に希釈した細胞濃度を示す。
【００５４】
図１５に示すように、最適な成長条件下では、全ての大腸菌がコロニーを形成したが、浸透圧の条件下では、野生型大腸菌の場合は、成長が阻害されるのに対し、本発明のＣＲＰ Ｄｅｌ １８０をエフェクタードメインとして利用して作成された転写因子が導入された大腸菌の場合は、浸透圧の条件でもよく成長することを確認することができた。浸透圧抵抗性を有するＯＴ１、ＯＴ２、ＯＴ３、ＯＴ４の人工転写因子は次の通りである：
ＯＴ１＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ２４＋Ｚ２＋Ｚ２
ＯＴ２＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ８＋Ｚ４＋Ｚ１９
ＯＴ３＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ５＋Ｚ２３＋Ｚ１７
ＯＴ４＝ＣＲＰ １〜１８０ａ．ａ＋Ｚ９＋Ｚ２４＋Ｚ２３
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の人工転写因子を原核生物に導入して形質転換させると、導入された人工転写により様々な原核生物の遺伝子発現を活性化又は抑制することができ、使用者所望の表現型を示す様々な形質転換大腸菌を誘導することができ、産業に有用なカスタマイズされた大腸菌を提供することができる。また、今まで明らかになっていない遺伝子の機能を分析したり、所望の有用な特性を有する形質転換大腸菌を誘導することができる。代表的な例として、熱抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性、及び向上した成長速度を有する形質転換大腸菌を誘導することができ、産業に非常に有用に利用することができる。
【００５６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ〜３つのジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、原核生物の転写因子とを含み、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２】
前記原核生物の転写因子が、大腸菌のＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質）（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質）あるいはその誘導体である、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＲＰが、配列番号１の核酸配列によりコードされている野生型ＣＲＰ（ＣＲＰ Ｗ、残基１−２０９）であり、前記ＣＲＰ誘導体が、配列番号３の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）、又は配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）である、請求項２に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項４】
前記ジンクフィンガードメインがヒトゲノムから同定されたものである、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項５】
前記ジンクフィンガードメインが下記のジンクフィンガードメインからなる群から選択されたものである、請求項４に記載の人工転写因子ポリペプチド：
Ｚ１：配列番号１３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２：配列番号１５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ３：配列番号１７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ４：配列番号１９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ５：配列番号２１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ６：配列番号２３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ７：配列番号２５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ８：配列番号２７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ９：配列番号２９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１０：配列番号３１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１１：配列番号３３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１２：配列番号３５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１３：配列番号３７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１４：配列番号３９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１５：配列番号４１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１６：配列番号４３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１７：配列番号４５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１８：配列番号４７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１９：配列番号４９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２０：配列番号５１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２１：配列番号５３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２２：配列番号５５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２３：配列番号５７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２４：配列番号５９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２５：配列番号６１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２６：配列番号６３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン。
【請求項６】
遺伝子発現を活性化するために、転写開始点から−６７〜−５０領域に挿入されている、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項７】
遺伝子発現を抑制するために、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に挿入されている、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて形質転換された大腸菌。
【請求項９】
前記大腸菌が、熱抵抗性、低温抵抗性、又は浸透圧抵抗性及び向上した成長速度を有するものである、請求項８に記載の形質転換された大腸菌。
【請求項１０】
Ｚ１３（配列番号３７）、Ｚ２（配列番号１５）、及びＺ２３（配列番号５７）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｚ２３（配列番号５７）、Ｚ１１（配列番号３３）、及びＺ１９（配列番号４９）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｚ９（配列番号２９）、Ｚ４（配列番号１９）、及びＺ１１（配列番号３３）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて熱抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【請求項１４】
Ｚ２６（配列番号６３）及びＺ７（配列番号２５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、向上した成長速度を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の人工転写因子が導入されて向上した成長速度を有する形質転換大腸菌。
【請求項１６】
Ｚ１９（配列番号４９）、Ｚ６（配列番号２３）、及びＺ２２（配列番号５５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、低温抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｚ１５（配列番号４１）、Ｚ４（配列番号９）、及びＺ２（配列番号１５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、低温抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の人工転写因子が導入されて低温抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【請求項１９】
Ｚ２４（配列番号５９）、Ｚ２（配列番号１５）、及びＺ２（配列番号１５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２０】
Ｚ８（配列番号２７）、Ｚ４（配列番号１９）、及びＺ１９（配列番号４９）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２１】
Ｚ５（配列番号２１）、Ｚ２３（配列番号５７）、及びＺ１７（配列番号４５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｚ９（配列番号２９）、Ｚ２４（配列番号５９）、及びＺ２３（配列番号５７）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて浸透圧抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【請求項１】
１つ〜３つのジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、原核生物の転写因子とを含み、遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２】
前記原核生物の転写因子が、大腸菌のＣＲＰ（カタボライト制御タンパク質）（又はサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質）あるいはその誘導体である、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＲＰが、配列番号１の核酸配列によりコードされている野生型ＣＲＰ（ＣＲＰ Ｗ、残基１−２０９）であり、前記ＣＲＰ誘導体が、配列番号３の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １３７（残基１３７−１９０）、又は配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０（残基１−１８０）である、請求項２に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項４】
前記ジンクフィンガードメインがヒトゲノムから同定されたものである、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項５】
前記ジンクフィンガードメインが下記のジンクフィンガードメインからなる群から選択されたものである、請求項４に記載の人工転写因子ポリペプチド：
Ｚ１：配列番号１３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２：配列番号１５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ３：配列番号１７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ４：配列番号１９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ５：配列番号２１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ６：配列番号２３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ７：配列番号２５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ８：配列番号２７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ９：配列番号２９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１０：配列番号３１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１１：配列番号３３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１２：配列番号３５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１３：配列番号３７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１４：配列番号３９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１５：配列番号４１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１６：配列番号４３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１７：配列番号４５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１８：配列番号４７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ１９：配列番号４９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２０：配列番号５１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２１：配列番号５３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２２：配列番号５５の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２３：配列番号５７の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２４：配列番号５９の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２５：配列番号６１の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Ｚ２６：配列番号６３の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン。
【請求項６】
遺伝子発現を活性化するために、転写開始点から−６７〜−５０領域に挿入されている、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項７】
遺伝子発現を抑制するために、転写開始点から＋２４〜＋４１領域に挿入されている、請求項１に記載の人工転写因子ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて形質転換された大腸菌。
【請求項９】
前記大腸菌が、熱抵抗性、低温抵抗性、又は浸透圧抵抗性及び向上した成長速度を有するものである、請求項８に記載の形質転換された大腸菌。
【請求項１０】
Ｚ１３（配列番号３７）、Ｚ２（配列番号１５）、及びＺ２３（配列番号５７）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｚ２３（配列番号５７）、Ｚ１１（配列番号３３）、及びＺ１９（配列番号４９）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｚ９（配列番号２９）、Ｚ４（配列番号１９）、及びＺ１１（配列番号３３）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、熱抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて熱抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【請求項１４】
Ｚ２６（配列番号６３）及びＺ７（配列番号２５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、向上した成長速度を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の人工転写因子が導入されて向上した成長速度を有する形質転換大腸菌。
【請求項１６】
Ｚ１９（配列番号４９）、Ｚ６（配列番号２３）、及びＺ２２（配列番号５５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、低温抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｚ１５（配列番号４１）、Ｚ４（配列番号９）、及びＺ２（配列番号１５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、低温抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の人工転写因子が導入されて低温抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【請求項１９】
Ｚ２４（配列番号５９）、Ｚ２（配列番号１５）、及びＺ２（配列番号１５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２０】
Ｚ８（配列番号２７）、Ｚ４（配列番号１９）、及びＺ１９（配列番号４９）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２１】
Ｚ５（配列番号２１）、Ｚ２３（配列番号５７）、及びＺ１７（配列番号４５）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｚ９（配列番号２９）、Ｚ２４（配列番号５９）、及びＺ２３（配列番号５７）のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号５の核酸配列によりコードされているＣＲＰ Ｄｅｌ １８０とを含む、浸透圧抵抗性を有する人工転写因子ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の人工転写因子が導入されて浸透圧抵抗性を有する形質転換大腸菌。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５０６９０６（Ｐ２０１０−５０６９０６Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３２２８（Ｐ２００９−５３３２２８）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００５４９３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５０９３５
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（３０４０５１２８５）コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００５４９３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５０９３５
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（３０４０５１２８５）コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (32)
【Ｆターム（参考）】
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