スクリーニング方法、及び、スクリーニング装置
【課題】生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別する。
【解決手段】所定時間経過毎に、活性測定処理Ｓ１０を行いつつ、結合量測定処理Ｓ２０及び洗浄処理Ｓ３０を繰り返す。すべての化合物についての測定終了後に、更に活性測定処理を行い、得られた複数の活性値Ｋに基づいて、結合量データの補正を行う補正処理を実行する。この補正処理により補正された結合量データに基づいて、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物Ａを選別する。
【解決手段】所定時間経過毎に、活性測定処理Ｓ１０を行いつつ、結合量測定処理Ｓ２０及び洗浄処理Ｓ３０を繰り返す。すべての化合物についての測定終了後に、更に活性測定処理を行い、得られた複数の活性値Ｋに基づいて、結合量データの補正を行う補正処理を実行する。この補正処理により補正された結合量データに基づいて、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物Ａを選別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の化合物の中から、１の生理活性物質と特異的に結合するものを選別するスクリーニング方法、及び、スクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質などの生理活性物質と所定の化合物との相互作用を測定する装置として、様々なバイオセンサーが提案されている。そのうち、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている（特許文献１参照）。一般的に、表面プラズモンセンサーは、プリズムと、このプリズムの一面に配置され生理活性物質が固定される金属膜と、光ビームを発生させる光源と、光ビームをプリズムに対して、プリズムと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、を備え、光検出手段の検出結果に基づいて、生理活性物質に関する測定を行うものである。そして、この表面プラズモンセンサーによる測定では、金属膜の上に固定化された生理活性物質に対して化合物溶液を供給すると共に、金属膜の化合物溶液が供給されている側と逆側の面へ光ビームを入射し、その反射光から得られる屈折率の情報に基づいて、生理活性物質と化合物溶液中の化合物との相互作用が測定される。
【０００３】
上記の表面プラズモンセンサーは、金属膜上での化合物間の微細な結合状態を精度よく検出することができるため、特定の生理活性物質を金属膜に固定し、この生理活性物質に対して特異的に結合可能か否かを指標として、大量の化合物を選別する大規模なスクリーニングに好適である。
【０００４】
大量の化合物を選別するために、固定された１の生理活性物質を何度も使用して異なる化合物との間で測定が行われる場合がある。この場合、１の化合物を供給して生理活性物質と化合物との結合量の測定が行われ、その後洗浄が行われて前の化合物を除去し、次の化合物が供給される。この測定−洗浄という測定洗浄プロセスが繰り返されて、特異的結合が認められる化合物が選別される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５公報 ところで、生理活性物質の活性は、上記の測定−洗浄が繰り返されている間、一定ではなく変化していると考えられ、この活性変化を考慮して選別を行う必要がある。
【０００６】
本発明は上記事実を考慮してなされたものであり、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することの可能なスクリーニング方法、及び、スクリーニング装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、請求項１に記載のスクリーニング方法は、固定された生理活性物質へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定し、前記生理活性物質へ供給された前記化合物を前記測定後に洗浄するという測定洗浄プロセスを、１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行うことにより、特定の化合物を選別するスクリーニング方法であって、最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行い、前記活性測定により得られた前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求め、前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別するものである。
【０００８】
本発明のスクリーニング方法では、最初の測定洗浄プロセスの開始前から最後の測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行う。この活性測定により、その活性測定時における生理活性物質の活性値が検出される。生理活性物質の活性値は、経時と共に、また、測定洗浄プロセスを繰り返す度に、変化する。そこで、検出された活性値に基づいて、生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める。活性変化関係は、生理活性物質の経時変化であってもよいし、測定洗浄プロセスの回数に応じた変化であってもよい。
【０００９】
この活性変化関係に基づいて生理活性物質と前記化合物との結合量の補正を行う。そして、補正により得られた補正後結合量に基づいて、生理活性物質に対する特定の化合物を選別する。
【００１０】
本発明によれば、生理活性物質の活性変化に着目し、この活性変化を考慮して生理活性物質と化合物との結合量を補正するので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【００１１】
請求項２に記載のスクリーニング方法は、前記活性測定を、少なくとも最初の前記測定洗浄プロセスの開始前と、最後の前記測定洗浄プロセスの終了後に行うこと、を特徴とする。
【００１２】
生理活性物質の活性は、経時、測定洗浄プロセスの繰り返しにより低下することが考えられる。そこで、最初の測定洗浄プロセスの開始前に活性測定を行うことにより、最も活性値の高い生理活性物質の活性値を得ることができる。また、最後の測定洗浄プロセスの開始後に活性測定を行うことにより、最も活性値の低い生理活性物質の活性値を得ることができる。したがって、当該生理活性物質の活性値は、この２点の間にあると予想でき、活性変化関係をより正確に求めることができる。
【００１３】
請求項３に記載のスクリーニング方法は、前記活性変化関係が、前記活性値の経時変化を示すものであり、測定開始前の前記活性値を新規活性値ＫＮ、当該測定が行われた時間の活性値を活性値ＫＴ、測定により得られた結合量を測定結合量Ｓ、とすると、前記補正後結合量Ｈを、Ｈ＝Ｓ／（ＫＴ×ＫＮ）で求めること、を特徴とする。
【００１４】
上記のようにして、経時に応じた生理活性物質の活性値により、結合量を補正して補正後結合量を求めることができる。
【００１５】
請求項４に記載のスクリーニング装置は、生理活性物質が固定され、前記生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部の形成された測定チップと、前記液溜め部へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行う測定洗浄手段と、最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定手段と、前記活性測定手段により検出された前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める活性変化関係算出手段と、前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求める結合量補正手段と、前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別する選別手段と、を備えている。
【００１６】
本発明のスクリーニング装置は、測定チップを供えている。測定チップには、生理活性物質が固定されており、この生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部が形成されている。液溜め部は、キュベット方式で液体を貯留するのものでも、流路が構成されて液体が流入・流出されるものでもよい。
【００１７】
スクリーニングは、測定洗浄手段によって液溜め部へ化合物を供給し、生理活性物質と化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返すことにより行われる。
【００１８】
活性測定手段では、最初の測定洗浄プロセスの開始前から最後の測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、生理活性物質の活性値を検出する。検出された生理活性物質の活性値に基づいて、活性変化関係算出手段により生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める。活性変化関係は、前述のように、生理活性物質の経時変化であってもよいし、測定洗浄プロセスの回数に応じた変化であってもよい。
【００１９】
そして、活性変化関係に基づいて、結合量補正手段により生理活性物質と化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、選別手段により、補正後結合量に基づいて、生理活性物質に対する特定の化合物を選別する。
【００２０】
上記スクリーニング装置によれば、生理活性物質の活性変化に着目し、この活性変化を考慮して生理活性物質と化合物との結合量が補正されるので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【００２１】
請求項５に記載のスクリーニング装置は、前記液溜め部へ供給された液体を回収する回収手段をさらに備えている。
【００２２】
このように、回収手段を備えることにより、液溜め部へ活性測定試料を供給して生理活性物質反応させた後、反応後の活性測定試料を回収し、回収した活性測定試料を用いて活性値を測定することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は上記構成としたので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００２５】
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質Ｄと化合物との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物を大量の化合物Ａの中から選別するために使用される。
【００２６】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
【００２７】
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための押上機構１２Ｄが配置されている。
【００２８】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、及び、保持部材４６、で構成されている。
【００２９】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、金属膜５７が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５７との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３０】
金属膜５７の表面には、図４に示すように、リンカー層５７Ａが形成されている。リンカー層５７Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５７上に固定化するための層である。
【００３１】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが形成されている。また、プリズム部４２Ａの下側には、側端辺に沿って図示しない搬送用レールと係合されるフランジ部４２Ｄが形成されている。
【００３２】
図３に示すように、流路部材４４は、６個のベース部４４Ａを備え、ベース部４４Ａの各々に４本の円筒部材４４Ｂが立設されている。ベース部４４Ａは、３個のベース部４４Ａ毎に、立設された円筒部材４４Ｂのうちの１本の上部が連結部材４４Ｄによって連結されている。流路部材４４は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非晶質ポリオフィレンエラストマーで構成されている。
【００３３】
ベース部４４Ａには、図５及び図６に示すように、底面側に略Ｓ字状の２本の流路溝４４Ｃが形成されている。流路溝４４Ｃは、端部の各々が１の円筒部材４４Ｂの中空部と連通されている。ベース部４４Ａは、底面が誘電体ブロック４２の上面と密着され、流路溝４４Ｃと誘電体ブロック４２の上面との間に構成される空間と前記中空部とで、液体流路４５が構成される。１個のベース部４４Ａには、２本の液体流路４５が構成される。各々の液体流路４５において、円筒部材４４Ｂの上端面に液体流路４５の出入口４３が構成される。
【００３４】
ここで、２本の液体流路４５のうち、１本は測定流路４５Ａとして用いられ、他の１本は参照流路４５Ｒとして用いられる。測定流路４５Ａの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定され、参照流路４５Ｒの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定されない状態で測定が行われる。測定流路４５Ａ及び参照流路４５Ｒには、図５に示すように、各々光ビームＬ１、Ｌ２が入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、ベース部４４Ａの中心寄りに配置されるＳ字の屈曲部分に照射される。以下、流路４５Ａにおける光ビームＬ１の照射領域を測定領域Ｅ１、流路４５Ｒにおける光ビームＬ２の照射領域を参照領域Ｅ２という。参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するための測定を行う領域である。
【００３５】
保持部材４６は、長尺とされ、上面部材４７及び２枚の側面板４８が蓋状に構成された形状とされている。側面板４８には、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４８Ｃ、及び、光ビームＬ１、Ｌ２の光路に対応する部分に窓４８Ｄが形成されている。保持部材４６は、係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。なお、流路部材４４は、後述するように保持部材４６と一体成形されており、保持部材４６と誘電体ブロック４２の間に配置される。
【００３６】
上面部材４７には、流路部材４４の円筒部材４４Ｂに対応する位置に、受部４９が形成されている。受部４９は、図４に示すように、略円筒状とされ、中空の下部分に円筒部材４４Ｂが配置されている。また、前記中空の円筒部材４４Ｂよりも上側に、出入口４３と連通する凹部４９Ａが構成されている。凹部４９Ａには、ピペットチップ５０が挿入される。
【００３７】
保持部材４６は、流路部材４４よりも硬質の材料、例えば、晶質ポリオフィレンで構成されている。
【００３８】
ピペットチップ５０は、図６に示すように、略錐筒状とされ、先端部５１、本体部５２、及び保持部５３で構成されている。先端部５１は円筒状とされ、挿入方向の最先端に液体を吐出または吸入する開口５１Ａが構成されている。本体部５２は、先端部５１より外周が大径の錐筒状とされ、先端部５１との間に外周段差部５２Ａが構成されている。外周段差部５２Ａは、先端部５１側が小径のテーパー状とされている。保持部５３は、本体部５２よりも外周が大径とされ、本体部５２との間に保持段差部５３Ａが構成されている。保持段差部５３Ａは、不図示の保持孔の構成された上面板を有するピペットチップストッカにピペットチップ５０を保持する際に用いられる部分である。
【００３９】
受部４９の凹部４９Ａは、流路部材４４側の第１内壁部４９Ｂ及び、第２内壁部４９Ｃで囲まれて構成されている。第１内壁部４９Ｂは、ピペットチップ５０の挿入方向Ｚが、ピペットチップ５０の先端部５１よりも僅かに長く、先端部５１の外径よりも僅かに大径とされ、先端部５１に沿った形状とされている。
【００４０】
第２内壁部４９Ｃは、第１内壁部４９Ｂとの間の内周段差部４９Ｄ、内周段差部４９Ｄと隣接する中央内壁部４９Ｅ、最上部の上部内壁部４９Ｆで構成されている。内周段差部４９Ｄは、第１内壁部４９Ｂから連続され、ピペットチップ５０の外周段差部５２Ａに沿って上方が大径となるテーパー状とされている。中央内壁部４９Ｅは、内周段差部４９Ｄと連続され、ピペットチップ５０の上方が大径となるテーパー状とされている。上部内壁部４９Ｆは、中央内壁部４９Ｅと連続され、ピペットチップ５０の上方がさらに大径となるテーパー状とされている。
【００４１】
保持部材４６と流路部材４４とは、同一金型内で異材料同士を組み合わせて成形する、いわゆる二色成形法（ダブルモールド）によって一体成形されている。
【００４２】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【００４３】
容器載置台１６には、アナライト溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃液容器１９が載置されている。アナライト溶液プレート１７は、マトリクス状に区画されており、各種のアナライト溶液がストックされている。バッファー液ストック容器１８は、複数の容器で構成されており、複数種類の異なる屈折率のバッファー液がストックされている。バッファー液ストック容器１８には、後述するピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。廃液容器１９は、複数の容器で構成されており、バッファー液ストック容器と同様にピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４４】
液体吸排部２０は、図１に示すように、ヘッド２４、及び、吸排駆動部２６を含んで構成されている。ヘッド２４は、図示しない搬送レールに沿って矢印Ｙ方向（図１参照）に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、ヘッド２４内部の図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。
【００４５】
ヘッド２４での液体流路４５への液体の供給は、２本のピペットチップ５０を１つの液体流路４５の２つの開口へ各々挿入し、一方のピペットチップ５０から液体を吐出させると共に、他方のピペットチップ５０で液体流路４５中の液体を吸引することにより行われる。
【００４６】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４７】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００４８】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００４９】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記憶されている。
【００５０】
また、制御部６０には、活性測定部６３が接続されている。活性測定部６３は、生理活性物質Ｄの活性値Ｋを測定するための部分である。光学測定部５４の上部には、液体流路４５から回収された活性測定試料を注入して、活性測定を行うための活性測定試料回収容器１３が配置されている。この活性測定試料回収容器１３に回収された活性測定試料の蛍光度を計測することにより、生理活性物質Ｄの活性値Ｋが計測される。
【００５１】
活性値Ｋは、経時や測定洗浄ステップの繰り返しにより、低下する。図１６には、ｐ３８ｋｉｎａｓｅに対する阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の結合量が、測定洗浄ステップの繰り返しにより低下していくデータが示されている。１〜４４回の測定洗浄ステップを繰り返したところ、１回目の活性値Ｋを１００とすると、４４回目では８１．５％にまで低下していることがわかる。そこで、本実施形態では、この生理活性物質Ｄの活性値Ｋ低下を考慮して、スクリーニングを行う。
【００５２】
次に、本実施形態のバイオセンサー１０でのスクリーニングについて説明する。
【００５３】
本実施形態では、１本のセンサースティック４０の各々の液体流路４５に１種類の生理活性物質Ｄが固定されている。スクリーニングでは、センサースティック４０に配された液体流路４５に、異なる種類の化合物溶液ＹＡを供給して結合量の測定を行い、その後洗浄処理を行って生理活性物質Ｄから化合物Ａを除去し、次の化合物溶液ＹＡを供給して結合量の測定を行い、その後洗浄処理を行うという、測定洗浄プロセスが複数回（Ｎ回）繰り返される。
【００５４】
そして、最初の測定洗浄プロセスが開始される前から、最後の洗浄プロセスが終了した後までの間に少なくとも２回、生理活性物質Ｄの活性測定が行われる。本実施形態では、最初の測定洗浄プロセスが開始される前、最初の測定洗浄プロセスが開始されてから所定時間経過毎、最後の洗浄プロセスが終了した後に活性測定を行うこととする。
【００５５】
センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、図９に示すスクリーニング処理が実行される。
【００５６】
スクリーニング処理では、まず、ステップＳ１０で、活性測定処理が行われる。活性測定の方法としては、酵素活性を測定する方法及びレセプター活性を測定する方法を挙げることができる。
【００５７】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第IV章に記載されている。また、検出方法としては（１）分光学的測定法、（２）蛍光法（３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 蛋白質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００５８】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うことにより酵素活性を測定することができる。
【００５９】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
【００６０】
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
【００６１】
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００６２】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出することができる。
【００６３】
本実施形態では、上記の内、分解物の蛍光測定を行うことにより酵素活性を測定することとする。活性測定処理は、図１０に示すように、ステップＳ１２で、活性測定試料供給信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、バッファー液等容器１８に収容されている活性測定試料がピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給される。次に、ステップＳ１３で、この処理が行われている活性測定時間Ｔを記憶する。この活性測定時間Ｔは、活性測定処理が実行される毎にＴ０、Ｔ１、Ｔ２…として記憶される。ステップＳ１４で、所定時間経過するまで待機する。ここでの所定時間は、酵素により活性測定試料中の基質が分解されるのに必要な時間である。所定時間経過後に、ステップＳ１５で、活性測定試料回収信号が出力される。これにより、液体流路４５中の活性測定試料が回収される。この回収は、ヘッド２４の２本のピペットチップＣＰを液体流路４５へ差し込み、一方のピペットチップＣＰからバッファー液を注入すると共に、他方のピペットチップＣＰから活性測定試料を吸引し、吸引した活性測定試料を活性測定試料回収容器１３へ注入することにより行われる。そして、ステップＳ１６で、活性測定部６３へ活性値Ｋの計測指示信号が出力される。これにより、活性測定部６３では、回収された活性測定試料の蛍光度が計測され、計測結果が活性値Ｋとして制御部６０へ出力される。制御部６０では、ステップＳ１７で活性値Ｋの入力が行われるまで待機し、入力が行われれば、ステップＳ１８で、入力された値をステップ１３で記憶された時間に対応させてメモリ６０Ｄに記憶する。
【００６４】
上記活性測定処理により、ある時間における生理活性物質Ｄの活性値Ｋが記憶される。
【００６５】
次に、図９のステップＳ２０の、結合量測定処理が行われる。結合量測定処理では、図１１に示すように、まず、ステップＳ２２で、化合物溶液ＹＡの供給指示信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、化合物溶液プレート１７に収容されている１の化合物溶液ＹＡがピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給される。次に、ステップＳ２３で、測定データＧ１、参照データＧ２を取得し、ステップＳ２４で測定データＧ１を参照データで補正して結合量データＧ３を求める。そして、ステップＳ２５で、結合量データＧ３を、得られた時間に対応させてメモリ６０Ｄに記憶する。
【００６６】
上記結合量測定処理により、１つの化合物Ａについての結合量データＧ３が測定された時間と共に記憶される。
【００６７】
次に、図９のステップＳ３０の、洗浄処理が行われる。洗浄処理は、図１２に示すように、まず、ステップＳ３２で、バッファー液の流入指示信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、バッファー液等プレート１８に収容されているバッファー液が一方のピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給されると共に、他方のピペットチップＣＰによって吸引され、液体流路４５中をバッファー液が流れる。次に、ステップＳ３３で、所定量のバッファー液が供給されたがどうかを判断する。ここでの所定量は、化合物Ａを生理活性物質Ｄから解離させるために十分な量であり、バッファー液の流入時間により規定してもよい。所定量のバッファー液が供給されたと判断されれば、ステップＳ３４でバッファー液の供給停止信号を出力する。これにより、バッファー液の供給が停止され、液体流路４５の洗浄が終了する。
【００６８】
上記洗浄処理により、生理活性物質Ｄから化合物Ａが除去され、次の化合物溶液ＹＡでの測定が可能な状態となる。
【００６９】
次に、図９のステップＳ４０で、Ｎ回目の結合量測定処理が終了したかどうか、すなわち、１の生理活性物質Ｄに対して繰り返し行われる測定洗浄ステップがすべて終了したかどうかを判断する。まだ、すべての測定洗浄ステップが終了していない場合には、ステップＳ４２で、先の活性測定処理から所定時間経過したかどうかを判断する。ここでの所定時間は、活性測定処理が実行される予め定められた時間間隔である。所定時間が経過していれば、ステップＳ１０へ戻り活性測定処理を再度実行する。所定時間が経過していなければ、ステップＳ２０で、次の化合物Ａについて結合量測定処理を行う。
【００７０】
ステップＳ４０で、すべての測定洗浄ステップが終了していると判断された場合には、ステップＳ４４で、さらに活性測定処理を行う。ここでの活性測定処理は、ステップＳ１０で実行された図１０に示す活性測定処理と同様に行われる。
【００７１】
ステップＳ５０で、補正処理を行う。補正処理は、得られたすべての化合物Ａと生理活性物質Ｄとの結合量データＧ３を、生理活性物質Ｄの活性値Ｋとの関係で補正するものである。
【００７２】
補正処理は、図１３に示すように、ステップＳ５２で、メモリ６０Ｄに記憶された生理活性物質Ｄの活性値Ｋを読み出し、ステップＳ５４で、測定時間と生理活性物質Ｄとの間の関係を示す近似直線を算出する。例えば、図１４に示すように、１〜Ｎ回目の活性測定で活性値Ｋ１〜ＫＮが得られたとすると、近似直線Ｍは、最小二乗法等により求めることができる。ここでの近似直線Ｍは、活性値Ｋの経時変化を示す活性変化関係となる。
【００７３】
次に、ステップＳ５６で、各化合物Ａについて得られた結合量データＧ３を、近似直線Ｍに基づいて補正して、補正後結合量データＨＧ３を算出する。補正後結合量データＨＧ３は、最初の活性測定の測定時間Ｔ０における活性値を活性値Ｋ０、当該結合量データＧ３が得られた時間の活性値を活性値ＫＴ、とすると、式１で求めることができる。
【００７４】
ＨＧ３ ＝ Ｇ３／（ＫＴ／Ｋ０） …（式１）
ステップＳ５８で、各化合物Ａについての補正後結合量データＨＧ３を記憶して本処理を終了する。このようにして、結合量データＧ３を補正することにより、他の化合物Ａとの関係で相対的により正確な結合量を求めることができる。
【００７５】
次に、図９に示すステップＳ６０で、選別処理を行う。選別処理は、図１５に示すように、ステップＳ６２で、メモリ６０Ｄから補正後結合量データＨＧ３を読み出し、ステップＳ６３で、読み出された補正後結合量データＨＧ３が予め設定された閾値よりも補正後結合量データＨＧ３が大きいかどうかを判断する。補正後結合量データＨＧ３が閾値よりも大きい場合には、ステップＳ６４で、当該化合物Ａを候補化合物として抽出する。ステップＳ６５で、次の化合物Ａがあるかどうかを判断し、次の化合物が有る場合には、ステップＳ６２へ戻って上記処理を繰り返す。次の化合物Ａがない場合には、すべての化合物Ａについての選別が終了したため、本処理を終了する。
【００７６】
本実施形態によれば、補正後結合量データＨＧ３に基づいて、生理活性物質Ｄと特異的に結合される化合物Ａを選別するので、より正確な選別を行うことができる。
【００７７】
なお、本実施形態では、活性測定処理を、１つの生理活性物質Ｄについて、まず最初の結合量測定処理の前に行い、その後所定時間経過毎に行い、さらに、最後の結合量処理の後に行ったが、活性測定処理は、１つの生理活性物質Ｄについて、少なくとも２回行い、２回の活性値Ｋに基づいて活性変化関係を求めてもよい。ただし、より正確な活性変化関係を得るため、少なくとも最初の結合量測定処理の前、及び、最後の結合量処理の後に行うことが好ましい。
【００７８】
また、活性変化関係は、必ずしも近似直線でなくてもよく、複数回の活性測定から得られた活性値Ｋに基づく曲線であってもよい。
【００７９】
また、本実施形態では、経時による活性変化で結合量データＧ３を補正したが、測定洗浄プロセスの回数に応じた活性変化関係を求め、この活性変化関係に基づいて結合量データＧ３を補正してもよい。
【００８０】
なお、本発明の実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーを用いた場合に、本発明を適用することができる。
【００８１】
また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。
【実施例】
【００８２】
次に、上記実施形態で説明したバイオセンサー１０を用いて実際にスクリーニングを行った実施例について説明する。
【００８３】
（１）測定チップ（センサースティック）の作成
金属膜５７として５０ｎｍの金が蒸着された誘電体ブロック４２をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールの１．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【００８４】
次に、１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールで被覆した表面に１０重量（質量）％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）を接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。その後、表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Pharmacia）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で、２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２５℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後同様のブロモ酢酸処理をさらに１回繰り返した。
（２）蛋白質の固定化
以下に示す手順で、（１）で作成したヒドロゲル被覆測定チップにｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、＃５５９３２４）を固定化した。
【００８５】
まず、酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ１００μｇ／ｍｌ、および化合物１ １０μＭを含む蛋白質溶液を調製する。ランニングバッファーは、以下の組成とした：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ。
【００８６】
まず、ヒドロゲル被覆チップに、ランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、１５分間静置後、ランニングバッファーで洗浄する。次に、作成した蛋白質溶液を添加し２０分間静置後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する。更に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し、１５分静置後、ランニングバッファーで３回洗浄する。最初のベースラインからの信号変化分をｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量（ＲＵ）とする。ｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量は３４００ＲＵであった。
（３）化合物の結合測定
蛋白質を固定化した測定チップを、表面プラズモン共鳴測定装置にセットし、化合物１の結合測定を以下のようにして行った。ここで、化合物１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を阻害することが知られている化合物である。
【００８７】
以下の組成のランニングバッファーを作成する：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ／ＤＭＳＯ ５容量％。
【００８８】
次に、ランニングバッファーに化合物１が１０μＭになるように溶解する。次に、ヒドロゲル被覆チップにランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、調製した化合物溶液を添加して２分間静置後の信号変化分を、各化合物の結合量（ＲＵ）とする。最後にランニングバッファーを添加して、３０秒、３回洗浄する。
【００８９】
この操作を、同一の蛋白固定表面に対して、４４回繰り返し行った。測定結果を図１７に示す。１回目の結合量が１４．１ＲＵ、４４回目が１１．５ＲＵであり、この間、結合量が約１８％低下している。
【００９０】
【化１】
〔実施例２〕
（１）蛋白の活性測定
実施例１で作成したｐ３８ＭＡＰキナーゼを固定化した表面について、実施例１に記載されている化合物１の結合測定を行う前と４４回測定後の２回、以下の方法で固定化されたｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を測定した。
【００９１】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼを固定した表面と固定していない表面を実施例１の方法で作成する。それぞれにＫｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４， ２０μＭ Ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ， １０ μＭ ＡＴＰ， ２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２）を５０μｌ加える。同時に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを２５ ｎｇ， ５０ ｎｇ， １００ ｎｇ， ２００ ｎｇ用意し、それぞれに５０ μｌ のＫｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを加えて以下同様の手順を行い、校正用として用いる。Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加後、室温で１時間インキュベーションし、反応液を９６ウエルプレートに移す。各ウエルにＫｉｎａｓｅＧｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を５０ μｌ加え、室温で１０分インキュベーションした後、ＬＡＳ１０００ （富士写真フイルム）にて残存ＡＴＰ依存性の発光を測定する。蛋白を固定していない表面の発光をバックグランドとし、固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量を算出する。
【００９２】
実施例１の方法でＳＰＲ測定により算出したｐ３８ＭＡＰキナーゼ固定量、前記の固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量を用いて、校正用ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を１００％とした場合の、固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を算出した。
（計算式）
固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性（％）＝（固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量／固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量と同一量に相当する校正用ｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量）×１００
結合測定を行う前と４４回測定後の２回の各々における活性ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性に基づいて、各測定時における結合量を校正するための校正直線を求め、この校正直線に基づいて、結合量の校正を行うことができる。
【００９３】
化合物１の結合測定を行う前のｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性は４５％、４４回測定後のｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性は３５％であった。この間、活性が約２２％低下しており、実施例１の化合物１の結合量の低下の度合いとほぼ一致することがわかった。
これらのことから、蛋白同一固定表面で繰り返し化合物結合量を行う場合、化合物結合測定前後の蛋白の活性を測定し、その低下の度合いで化合物の結合量の補正を行うことが極めて有効であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は本実施形態にかかる液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図７】本実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【図９】本実施形態のスクリーニング処理のフローチャートである。
【図１０】本実施形態の活性測定処理のフローチャートである。
【図１１】本実施形態の結合量測定処理のフローチャートである。
【図１２】本実施形態の洗浄処理のフローチャートである。
【図１３】本実施形態の補正処理のフローチャートである。
【図１４】本実施形態の測定時間と活性値との関係を示すグラフである。
【図１５】本実施形態の選別処理のフローチャートである。
【図１６】測定回数と活性値との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例における、測定回数と蛋白質の活性値との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９５】
１０ バイオセンサー
４５ 液体流路
５４ 光学測定部
６０Ｄ メモリ
６０ 制御部
６３ 活性測定部
Ｄ 生理活性物質
Ｅ１ 測定領域
Ｅ２ 参照領域
Ｇ１ 測定データ
Ｇ２ 参照データ
Ｇ３ 結合量データ
ＨＧ３ 補正後結合量データ
Ｋ 活性値
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の化合物の中から、１の生理活性物質と特異的に結合するものを選別するスクリーニング方法、及び、スクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質などの生理活性物質と所定の化合物との相互作用を測定する装置として、様々なバイオセンサーが提案されている。そのうち、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている（特許文献１参照）。一般的に、表面プラズモンセンサーは、プリズムと、このプリズムの一面に配置され生理活性物質が固定される金属膜と、光ビームを発生させる光源と、光ビームをプリズムに対して、プリズムと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、を備え、光検出手段の検出結果に基づいて、生理活性物質に関する測定を行うものである。そして、この表面プラズモンセンサーによる測定では、金属膜の上に固定化された生理活性物質に対して化合物溶液を供給すると共に、金属膜の化合物溶液が供給されている側と逆側の面へ光ビームを入射し、その反射光から得られる屈折率の情報に基づいて、生理活性物質と化合物溶液中の化合物との相互作用が測定される。
【０００３】
上記の表面プラズモンセンサーは、金属膜上での化合物間の微細な結合状態を精度よく検出することができるため、特定の生理活性物質を金属膜に固定し、この生理活性物質に対して特異的に結合可能か否かを指標として、大量の化合物を選別する大規模なスクリーニングに好適である。
【０００４】
大量の化合物を選別するために、固定された１の生理活性物質を何度も使用して異なる化合物との間で測定が行われる場合がある。この場合、１の化合物を供給して生理活性物質と化合物との結合量の測定が行われ、その後洗浄が行われて前の化合物を除去し、次の化合物が供給される。この測定−洗浄という測定洗浄プロセスが繰り返されて、特異的結合が認められる化合物が選別される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５公報 ところで、生理活性物質の活性は、上記の測定−洗浄が繰り返されている間、一定ではなく変化していると考えられ、この活性変化を考慮して選別を行う必要がある。
【０００６】
本発明は上記事実を考慮してなされたものであり、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することの可能なスクリーニング方法、及び、スクリーニング装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、請求項１に記載のスクリーニング方法は、固定された生理活性物質へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定し、前記生理活性物質へ供給された前記化合物を前記測定後に洗浄するという測定洗浄プロセスを、１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行うことにより、特定の化合物を選別するスクリーニング方法であって、最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行い、前記活性測定により得られた前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求め、前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別するものである。
【０００８】
本発明のスクリーニング方法では、最初の測定洗浄プロセスの開始前から最後の測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行う。この活性測定により、その活性測定時における生理活性物質の活性値が検出される。生理活性物質の活性値は、経時と共に、また、測定洗浄プロセスを繰り返す度に、変化する。そこで、検出された活性値に基づいて、生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める。活性変化関係は、生理活性物質の経時変化であってもよいし、測定洗浄プロセスの回数に応じた変化であってもよい。
【０００９】
この活性変化関係に基づいて生理活性物質と前記化合物との結合量の補正を行う。そして、補正により得られた補正後結合量に基づいて、生理活性物質に対する特定の化合物を選別する。
【００１０】
本発明によれば、生理活性物質の活性変化に着目し、この活性変化を考慮して生理活性物質と化合物との結合量を補正するので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【００１１】
請求項２に記載のスクリーニング方法は、前記活性測定を、少なくとも最初の前記測定洗浄プロセスの開始前と、最後の前記測定洗浄プロセスの終了後に行うこと、を特徴とする。
【００１２】
生理活性物質の活性は、経時、測定洗浄プロセスの繰り返しにより低下することが考えられる。そこで、最初の測定洗浄プロセスの開始前に活性測定を行うことにより、最も活性値の高い生理活性物質の活性値を得ることができる。また、最後の測定洗浄プロセスの開始後に活性測定を行うことにより、最も活性値の低い生理活性物質の活性値を得ることができる。したがって、当該生理活性物質の活性値は、この２点の間にあると予想でき、活性変化関係をより正確に求めることができる。
【００１３】
請求項３に記載のスクリーニング方法は、前記活性変化関係が、前記活性値の経時変化を示すものであり、測定開始前の前記活性値を新規活性値ＫＮ、当該測定が行われた時間の活性値を活性値ＫＴ、測定により得られた結合量を測定結合量Ｓ、とすると、前記補正後結合量Ｈを、Ｈ＝Ｓ／（ＫＴ×ＫＮ）で求めること、を特徴とする。
【００１４】
上記のようにして、経時に応じた生理活性物質の活性値により、結合量を補正して補正後結合量を求めることができる。
【００１５】
請求項４に記載のスクリーニング装置は、生理活性物質が固定され、前記生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部の形成された測定チップと、前記液溜め部へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行う測定洗浄手段と、最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定手段と、前記活性測定手段により検出された前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める活性変化関係算出手段と、前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求める結合量補正手段と、前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別する選別手段と、を備えている。
【００１６】
本発明のスクリーニング装置は、測定チップを供えている。測定チップには、生理活性物質が固定されており、この生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部が形成されている。液溜め部は、キュベット方式で液体を貯留するのものでも、流路が構成されて液体が流入・流出されるものでもよい。
【００１７】
スクリーニングは、測定洗浄手段によって液溜め部へ化合物を供給し、生理活性物質と化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返すことにより行われる。
【００１８】
活性測定手段では、最初の測定洗浄プロセスの開始前から最後の測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、生理活性物質の活性値を検出する。検出された生理活性物質の活性値に基づいて、活性変化関係算出手段により生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める。活性変化関係は、前述のように、生理活性物質の経時変化であってもよいし、測定洗浄プロセスの回数に応じた変化であってもよい。
【００１９】
そして、活性変化関係に基づいて、結合量補正手段により生理活性物質と化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、選別手段により、補正後結合量に基づいて、生理活性物質に対する特定の化合物を選別する。
【００２０】
上記スクリーニング装置によれば、生理活性物質の活性変化に着目し、この活性変化を考慮して生理活性物質と化合物との結合量が補正されるので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【００２１】
請求項５に記載のスクリーニング装置は、前記液溜め部へ供給された液体を回収する回収手段をさらに備えている。
【００２２】
このように、回収手段を備えることにより、液溜め部へ活性測定試料を供給して生理活性物質反応させた後、反応後の活性測定試料を回収し、回収した活性測定試料を用いて活性値を測定することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は上記構成としたので、生理活性物質と特異的に結合される化合物をより正確に選別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００２５】
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質Ｄと化合物との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物を大量の化合物Ａの中から選別するために使用される。
【００２６】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
【００２７】
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための押上機構１２Ｄが配置されている。
【００２８】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、及び、保持部材４６、で構成されている。
【００２９】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、金属膜５７が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５７との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３０】
金属膜５７の表面には、図４に示すように、リンカー層５７Ａが形成されている。リンカー層５７Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５７上に固定化するための層である。
【００３１】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが形成されている。また、プリズム部４２Ａの下側には、側端辺に沿って図示しない搬送用レールと係合されるフランジ部４２Ｄが形成されている。
【００３２】
図３に示すように、流路部材４４は、６個のベース部４４Ａを備え、ベース部４４Ａの各々に４本の円筒部材４４Ｂが立設されている。ベース部４４Ａは、３個のベース部４４Ａ毎に、立設された円筒部材４４Ｂのうちの１本の上部が連結部材４４Ｄによって連結されている。流路部材４４は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非晶質ポリオフィレンエラストマーで構成されている。
【００３３】
ベース部４４Ａには、図５及び図６に示すように、底面側に略Ｓ字状の２本の流路溝４４Ｃが形成されている。流路溝４４Ｃは、端部の各々が１の円筒部材４４Ｂの中空部と連通されている。ベース部４４Ａは、底面が誘電体ブロック４２の上面と密着され、流路溝４４Ｃと誘電体ブロック４２の上面との間に構成される空間と前記中空部とで、液体流路４５が構成される。１個のベース部４４Ａには、２本の液体流路４５が構成される。各々の液体流路４５において、円筒部材４４Ｂの上端面に液体流路４５の出入口４３が構成される。
【００３４】
ここで、２本の液体流路４５のうち、１本は測定流路４５Ａとして用いられ、他の１本は参照流路４５Ｒとして用いられる。測定流路４５Ａの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定され、参照流路４５Ｒの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定されない状態で測定が行われる。測定流路４５Ａ及び参照流路４５Ｒには、図５に示すように、各々光ビームＬ１、Ｌ２が入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、ベース部４４Ａの中心寄りに配置されるＳ字の屈曲部分に照射される。以下、流路４５Ａにおける光ビームＬ１の照射領域を測定領域Ｅ１、流路４５Ｒにおける光ビームＬ２の照射領域を参照領域Ｅ２という。参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するための測定を行う領域である。
【００３５】
保持部材４６は、長尺とされ、上面部材４７及び２枚の側面板４８が蓋状に構成された形状とされている。側面板４８には、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４８Ｃ、及び、光ビームＬ１、Ｌ２の光路に対応する部分に窓４８Ｄが形成されている。保持部材４６は、係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。なお、流路部材４４は、後述するように保持部材４６と一体成形されており、保持部材４６と誘電体ブロック４２の間に配置される。
【００３６】
上面部材４７には、流路部材４４の円筒部材４４Ｂに対応する位置に、受部４９が形成されている。受部４９は、図４に示すように、略円筒状とされ、中空の下部分に円筒部材４４Ｂが配置されている。また、前記中空の円筒部材４４Ｂよりも上側に、出入口４３と連通する凹部４９Ａが構成されている。凹部４９Ａには、ピペットチップ５０が挿入される。
【００３７】
保持部材４６は、流路部材４４よりも硬質の材料、例えば、晶質ポリオフィレンで構成されている。
【００３８】
ピペットチップ５０は、図６に示すように、略錐筒状とされ、先端部５１、本体部５２、及び保持部５３で構成されている。先端部５１は円筒状とされ、挿入方向の最先端に液体を吐出または吸入する開口５１Ａが構成されている。本体部５２は、先端部５１より外周が大径の錐筒状とされ、先端部５１との間に外周段差部５２Ａが構成されている。外周段差部５２Ａは、先端部５１側が小径のテーパー状とされている。保持部５３は、本体部５２よりも外周が大径とされ、本体部５２との間に保持段差部５３Ａが構成されている。保持段差部５３Ａは、不図示の保持孔の構成された上面板を有するピペットチップストッカにピペットチップ５０を保持する際に用いられる部分である。
【００３９】
受部４９の凹部４９Ａは、流路部材４４側の第１内壁部４９Ｂ及び、第２内壁部４９Ｃで囲まれて構成されている。第１内壁部４９Ｂは、ピペットチップ５０の挿入方向Ｚが、ピペットチップ５０の先端部５１よりも僅かに長く、先端部５１の外径よりも僅かに大径とされ、先端部５１に沿った形状とされている。
【００４０】
第２内壁部４９Ｃは、第１内壁部４９Ｂとの間の内周段差部４９Ｄ、内周段差部４９Ｄと隣接する中央内壁部４９Ｅ、最上部の上部内壁部４９Ｆで構成されている。内周段差部４９Ｄは、第１内壁部４９Ｂから連続され、ピペットチップ５０の外周段差部５２Ａに沿って上方が大径となるテーパー状とされている。中央内壁部４９Ｅは、内周段差部４９Ｄと連続され、ピペットチップ５０の上方が大径となるテーパー状とされている。上部内壁部４９Ｆは、中央内壁部４９Ｅと連続され、ピペットチップ５０の上方がさらに大径となるテーパー状とされている。
【００４１】
保持部材４６と流路部材４４とは、同一金型内で異材料同士を組み合わせて成形する、いわゆる二色成形法（ダブルモールド）によって一体成形されている。
【００４２】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【００４３】
容器載置台１６には、アナライト溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃液容器１９が載置されている。アナライト溶液プレート１７は、マトリクス状に区画されており、各種のアナライト溶液がストックされている。バッファー液ストック容器１８は、複数の容器で構成されており、複数種類の異なる屈折率のバッファー液がストックされている。バッファー液ストック容器１８には、後述するピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。廃液容器１９は、複数の容器で構成されており、バッファー液ストック容器と同様にピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４４】
液体吸排部２０は、図１に示すように、ヘッド２４、及び、吸排駆動部２６を含んで構成されている。ヘッド２４は、図示しない搬送レールに沿って矢印Ｙ方向（図１参照）に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、ヘッド２４内部の図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。
【００４５】
ヘッド２４での液体流路４５への液体の供給は、２本のピペットチップ５０を１つの液体流路４５の２つの開口へ各々挿入し、一方のピペットチップ５０から液体を吐出させると共に、他方のピペットチップ５０で液体流路４５中の液体を吸引することにより行われる。
【００４６】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４７】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００４８】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００４９】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記憶されている。
【００５０】
また、制御部６０には、活性測定部６３が接続されている。活性測定部６３は、生理活性物質Ｄの活性値Ｋを測定するための部分である。光学測定部５４の上部には、液体流路４５から回収された活性測定試料を注入して、活性測定を行うための活性測定試料回収容器１３が配置されている。この活性測定試料回収容器１３に回収された活性測定試料の蛍光度を計測することにより、生理活性物質Ｄの活性値Ｋが計測される。
【００５１】
活性値Ｋは、経時や測定洗浄ステップの繰り返しにより、低下する。図１６には、ｐ３８ｋｉｎａｓｅに対する阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の結合量が、測定洗浄ステップの繰り返しにより低下していくデータが示されている。１〜４４回の測定洗浄ステップを繰り返したところ、１回目の活性値Ｋを１００とすると、４４回目では８１．５％にまで低下していることがわかる。そこで、本実施形態では、この生理活性物質Ｄの活性値Ｋ低下を考慮して、スクリーニングを行う。
【００５２】
次に、本実施形態のバイオセンサー１０でのスクリーニングについて説明する。
【００５３】
本実施形態では、１本のセンサースティック４０の各々の液体流路４５に１種類の生理活性物質Ｄが固定されている。スクリーニングでは、センサースティック４０に配された液体流路４５に、異なる種類の化合物溶液ＹＡを供給して結合量の測定を行い、その後洗浄処理を行って生理活性物質Ｄから化合物Ａを除去し、次の化合物溶液ＹＡを供給して結合量の測定を行い、その後洗浄処理を行うという、測定洗浄プロセスが複数回（Ｎ回）繰り返される。
【００５４】
そして、最初の測定洗浄プロセスが開始される前から、最後の洗浄プロセスが終了した後までの間に少なくとも２回、生理活性物質Ｄの活性測定が行われる。本実施形態では、最初の測定洗浄プロセスが開始される前、最初の測定洗浄プロセスが開始されてから所定時間経過毎、最後の洗浄プロセスが終了した後に活性測定を行うこととする。
【００５５】
センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、図９に示すスクリーニング処理が実行される。
【００５６】
スクリーニング処理では、まず、ステップＳ１０で、活性測定処理が行われる。活性測定の方法としては、酵素活性を測定する方法及びレセプター活性を測定する方法を挙げることができる。
【００５７】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第IV章に記載されている。また、検出方法としては（１）分光学的測定法、（２）蛍光法（３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 蛋白質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００５８】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うことにより酵素活性を測定することができる。
【００５９】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
【００６０】
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
【００６１】
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００６２】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出することができる。
【００６３】
本実施形態では、上記の内、分解物の蛍光測定を行うことにより酵素活性を測定することとする。活性測定処理は、図１０に示すように、ステップＳ１２で、活性測定試料供給信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、バッファー液等容器１８に収容されている活性測定試料がピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給される。次に、ステップＳ１３で、この処理が行われている活性測定時間Ｔを記憶する。この活性測定時間Ｔは、活性測定処理が実行される毎にＴ０、Ｔ１、Ｔ２…として記憶される。ステップＳ１４で、所定時間経過するまで待機する。ここでの所定時間は、酵素により活性測定試料中の基質が分解されるのに必要な時間である。所定時間経過後に、ステップＳ１５で、活性測定試料回収信号が出力される。これにより、液体流路４５中の活性測定試料が回収される。この回収は、ヘッド２４の２本のピペットチップＣＰを液体流路４５へ差し込み、一方のピペットチップＣＰからバッファー液を注入すると共に、他方のピペットチップＣＰから活性測定試料を吸引し、吸引した活性測定試料を活性測定試料回収容器１３へ注入することにより行われる。そして、ステップＳ１６で、活性測定部６３へ活性値Ｋの計測指示信号が出力される。これにより、活性測定部６３では、回収された活性測定試料の蛍光度が計測され、計測結果が活性値Ｋとして制御部６０へ出力される。制御部６０では、ステップＳ１７で活性値Ｋの入力が行われるまで待機し、入力が行われれば、ステップＳ１８で、入力された値をステップ１３で記憶された時間に対応させてメモリ６０Ｄに記憶する。
【００６４】
上記活性測定処理により、ある時間における生理活性物質Ｄの活性値Ｋが記憶される。
【００６５】
次に、図９のステップＳ２０の、結合量測定処理が行われる。結合量測定処理では、図１１に示すように、まず、ステップＳ２２で、化合物溶液ＹＡの供給指示信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、化合物溶液プレート１７に収容されている１の化合物溶液ＹＡがピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給される。次に、ステップＳ２３で、測定データＧ１、参照データＧ２を取得し、ステップＳ２４で測定データＧ１を参照データで補正して結合量データＧ３を求める。そして、ステップＳ２５で、結合量データＧ３を、得られた時間に対応させてメモリ６０Ｄに記憶する。
【００６６】
上記結合量測定処理により、１つの化合物Ａについての結合量データＧ３が測定された時間と共に記憶される。
【００６７】
次に、図９のステップＳ３０の、洗浄処理が行われる。洗浄処理は、図１２に示すように、まず、ステップＳ３２で、バッファー液の流入指示信号が出力される。これにより、ヘッド２４が駆動され、バッファー液等プレート１８に収容されているバッファー液が一方のピペットチップＣＰによって液体流路４５へ供給されると共に、他方のピペットチップＣＰによって吸引され、液体流路４５中をバッファー液が流れる。次に、ステップＳ３３で、所定量のバッファー液が供給されたがどうかを判断する。ここでの所定量は、化合物Ａを生理活性物質Ｄから解離させるために十分な量であり、バッファー液の流入時間により規定してもよい。所定量のバッファー液が供給されたと判断されれば、ステップＳ３４でバッファー液の供給停止信号を出力する。これにより、バッファー液の供給が停止され、液体流路４５の洗浄が終了する。
【００６８】
上記洗浄処理により、生理活性物質Ｄから化合物Ａが除去され、次の化合物溶液ＹＡでの測定が可能な状態となる。
【００６９】
次に、図９のステップＳ４０で、Ｎ回目の結合量測定処理が終了したかどうか、すなわち、１の生理活性物質Ｄに対して繰り返し行われる測定洗浄ステップがすべて終了したかどうかを判断する。まだ、すべての測定洗浄ステップが終了していない場合には、ステップＳ４２で、先の活性測定処理から所定時間経過したかどうかを判断する。ここでの所定時間は、活性測定処理が実行される予め定められた時間間隔である。所定時間が経過していれば、ステップＳ１０へ戻り活性測定処理を再度実行する。所定時間が経過していなければ、ステップＳ２０で、次の化合物Ａについて結合量測定処理を行う。
【００７０】
ステップＳ４０で、すべての測定洗浄ステップが終了していると判断された場合には、ステップＳ４４で、さらに活性測定処理を行う。ここでの活性測定処理は、ステップＳ１０で実行された図１０に示す活性測定処理と同様に行われる。
【００７１】
ステップＳ５０で、補正処理を行う。補正処理は、得られたすべての化合物Ａと生理活性物質Ｄとの結合量データＧ３を、生理活性物質Ｄの活性値Ｋとの関係で補正するものである。
【００７２】
補正処理は、図１３に示すように、ステップＳ５２で、メモリ６０Ｄに記憶された生理活性物質Ｄの活性値Ｋを読み出し、ステップＳ５４で、測定時間と生理活性物質Ｄとの間の関係を示す近似直線を算出する。例えば、図１４に示すように、１〜Ｎ回目の活性測定で活性値Ｋ１〜ＫＮが得られたとすると、近似直線Ｍは、最小二乗法等により求めることができる。ここでの近似直線Ｍは、活性値Ｋの経時変化を示す活性変化関係となる。
【００７３】
次に、ステップＳ５６で、各化合物Ａについて得られた結合量データＧ３を、近似直線Ｍに基づいて補正して、補正後結合量データＨＧ３を算出する。補正後結合量データＨＧ３は、最初の活性測定の測定時間Ｔ０における活性値を活性値Ｋ０、当該結合量データＧ３が得られた時間の活性値を活性値ＫＴ、とすると、式１で求めることができる。
【００７４】
ＨＧ３ ＝ Ｇ３／（ＫＴ／Ｋ０） …（式１）
ステップＳ５８で、各化合物Ａについての補正後結合量データＨＧ３を記憶して本処理を終了する。このようにして、結合量データＧ３を補正することにより、他の化合物Ａとの関係で相対的により正確な結合量を求めることができる。
【００７５】
次に、図９に示すステップＳ６０で、選別処理を行う。選別処理は、図１５に示すように、ステップＳ６２で、メモリ６０Ｄから補正後結合量データＨＧ３を読み出し、ステップＳ６３で、読み出された補正後結合量データＨＧ３が予め設定された閾値よりも補正後結合量データＨＧ３が大きいかどうかを判断する。補正後結合量データＨＧ３が閾値よりも大きい場合には、ステップＳ６４で、当該化合物Ａを候補化合物として抽出する。ステップＳ６５で、次の化合物Ａがあるかどうかを判断し、次の化合物が有る場合には、ステップＳ６２へ戻って上記処理を繰り返す。次の化合物Ａがない場合には、すべての化合物Ａについての選別が終了したため、本処理を終了する。
【００７６】
本実施形態によれば、補正後結合量データＨＧ３に基づいて、生理活性物質Ｄと特異的に結合される化合物Ａを選別するので、より正確な選別を行うことができる。
【００７７】
なお、本実施形態では、活性測定処理を、１つの生理活性物質Ｄについて、まず最初の結合量測定処理の前に行い、その後所定時間経過毎に行い、さらに、最後の結合量処理の後に行ったが、活性測定処理は、１つの生理活性物質Ｄについて、少なくとも２回行い、２回の活性値Ｋに基づいて活性変化関係を求めてもよい。ただし、より正確な活性変化関係を得るため、少なくとも最初の結合量測定処理の前、及び、最後の結合量処理の後に行うことが好ましい。
【００７８】
また、活性変化関係は、必ずしも近似直線でなくてもよく、複数回の活性測定から得られた活性値Ｋに基づく曲線であってもよい。
【００７９】
また、本実施形態では、経時による活性変化で結合量データＧ３を補正したが、測定洗浄プロセスの回数に応じた活性変化関係を求め、この活性変化関係に基づいて結合量データＧ３を補正してもよい。
【００８０】
なお、本発明の実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーを用いた場合に、本発明を適用することができる。
【００８１】
また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。
【実施例】
【００８２】
次に、上記実施形態で説明したバイオセンサー１０を用いて実際にスクリーニングを行った実施例について説明する。
【００８３】
（１）測定チップ（センサースティック）の作成
金属膜５７として５０ｎｍの金が蒸着された誘電体ブロック４２をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールの１．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【００８４】
次に、１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールで被覆した表面に１０重量（質量）％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）を接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。その後、表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Pharmacia）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で、２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２５℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後同様のブロモ酢酸処理をさらに１回繰り返した。
（２）蛋白質の固定化
以下に示す手順で、（１）で作成したヒドロゲル被覆測定チップにｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、＃５５９３２４）を固定化した。
【００８５】
まず、酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ１００μｇ／ｍｌ、および化合物１ １０μＭを含む蛋白質溶液を調製する。ランニングバッファーは、以下の組成とした：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ。
【００８６】
まず、ヒドロゲル被覆チップに、ランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、１５分間静置後、ランニングバッファーで洗浄する。次に、作成した蛋白質溶液を添加し２０分間静置後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する。更に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し、１５分静置後、ランニングバッファーで３回洗浄する。最初のベースラインからの信号変化分をｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量（ＲＵ）とする。ｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量は３４００ＲＵであった。
（３）化合物の結合測定
蛋白質を固定化した測定チップを、表面プラズモン共鳴測定装置にセットし、化合物１の結合測定を以下のようにして行った。ここで、化合物１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を阻害することが知られている化合物である。
【００８７】
以下の組成のランニングバッファーを作成する：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ／ＤＭＳＯ ５容量％。
【００８８】
次に、ランニングバッファーに化合物１が１０μＭになるように溶解する。次に、ヒドロゲル被覆チップにランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、調製した化合物溶液を添加して２分間静置後の信号変化分を、各化合物の結合量（ＲＵ）とする。最後にランニングバッファーを添加して、３０秒、３回洗浄する。
【００８９】
この操作を、同一の蛋白固定表面に対して、４４回繰り返し行った。測定結果を図１７に示す。１回目の結合量が１４．１ＲＵ、４４回目が１１．５ＲＵであり、この間、結合量が約１８％低下している。
【００９０】
【化１】
〔実施例２〕
（１）蛋白の活性測定
実施例１で作成したｐ３８ＭＡＰキナーゼを固定化した表面について、実施例１に記載されている化合物１の結合測定を行う前と４４回測定後の２回、以下の方法で固定化されたｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を測定した。
【００９１】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼを固定した表面と固定していない表面を実施例１の方法で作成する。それぞれにＫｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４， ２０μＭ Ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ， １０ μＭ ＡＴＰ， ２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２）を５０μｌ加える。同時に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを２５ ｎｇ， ５０ ｎｇ， １００ ｎｇ， ２００ ｎｇ用意し、それぞれに５０ μｌ のＫｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを加えて以下同様の手順を行い、校正用として用いる。Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加後、室温で１時間インキュベーションし、反応液を９６ウエルプレートに移す。各ウエルにＫｉｎａｓｅＧｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を５０ μｌ加え、室温で１０分インキュベーションした後、ＬＡＳ１０００ （富士写真フイルム）にて残存ＡＴＰ依存性の発光を測定する。蛋白を固定していない表面の発光をバックグランドとし、固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量を算出する。
【００９２】
実施例１の方法でＳＰＲ測定により算出したｐ３８ＭＡＰキナーゼ固定量、前記の固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量を用いて、校正用ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を１００％とした場合の、固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を算出した。
（計算式）
固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性（％）＝（固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量／固定化したｐ３８ＭＡＰキナーゼの固定量と同一量に相当する校正用ｐ３８ＭＡＰキナーゼの発光量）×１００
結合測定を行う前と４４回測定後の２回の各々における活性ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性に基づいて、各測定時における結合量を校正するための校正直線を求め、この校正直線に基づいて、結合量の校正を行うことができる。
【００９３】
化合物１の結合測定を行う前のｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性は４５％、４４回測定後のｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性は３５％であった。この間、活性が約２２％低下しており、実施例１の化合物１の結合量の低下の度合いとほぼ一致することがわかった。
これらのことから、蛋白同一固定表面で繰り返し化合物結合量を行う場合、化合物結合測定前後の蛋白の活性を測定し、その低下の度合いで化合物の結合量の補正を行うことが極めて有効であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は本実施形態にかかる液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図７】本実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【図９】本実施形態のスクリーニング処理のフローチャートである。
【図１０】本実施形態の活性測定処理のフローチャートである。
【図１１】本実施形態の結合量測定処理のフローチャートである。
【図１２】本実施形態の洗浄処理のフローチャートである。
【図１３】本実施形態の補正処理のフローチャートである。
【図１４】本実施形態の測定時間と活性値との関係を示すグラフである。
【図１５】本実施形態の選別処理のフローチャートである。
【図１６】測定回数と活性値との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例における、測定回数と蛋白質の活性値との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９５】
１０ バイオセンサー
４５ 液体流路
５４ 光学測定部
６０Ｄ メモリ
６０ 制御部
６３ 活性測定部
Ｄ 生理活性物質
Ｅ１ 測定領域
Ｅ２ 参照領域
Ｇ１ 測定データ
Ｇ２ 参照データ
Ｇ３ 結合量データ
ＨＧ３ 補正後結合量データ
Ｋ 活性値
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定された生理活性物質へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定し、前記生理活性物質へ供給された前記化合物を前記測定後に洗浄するという測定洗浄プロセスを、１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行うことにより、特定の化合物を選別するスクリーニング方法であって、
最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行い、
前記活性測定により得られた前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求め、
前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、
前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記活性測定を、少なくとも最初の前記測定洗浄プロセスの開始前と、最後の前記測定洗浄プロセスの終了後に行うこと、を特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記活性変化関係は、前記活性値の経時変化を示すものであり、測定開始前の前記活性値を新規活性値ＫＮ、当該測定が行われた時間の活性値を活性値ＫＴ、測定により得られた結合量を測定結合量Ｓ、とすると、前記補正後結合量Ｈを、
Ｈ＝Ｓ／（ＫＴ／ＫＮ）
で求めること、を特徴とする請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
生理活性物質が固定され、前記生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部の形成された測定チップと、
前記液溜め部へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行う測定洗浄手段と、
最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定手段と、
前記活性測定手段により検出された前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める活性変化関係算出手段と、
前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求める結合量補正手段と、
前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別する選別手段と、
を備えたスクリーニング装置。
【請求項５】
前記液溜め部へ供給された液体を回収する回収手段をさらに備えた請求項４に記載のスクリーニング装置。
【請求項１】
固定された生理活性物質へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定し、前記生理活性物質へ供給された前記化合物を前記測定後に洗浄するという測定洗浄プロセスを、１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行うことにより、特定の化合物を選別するスクリーニング方法であって、
最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定を行い、
前記活性測定により得られた前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求め、
前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求め、
前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記活性測定を、少なくとも最初の前記測定洗浄プロセスの開始前と、最後の前記測定洗浄プロセスの終了後に行うこと、を特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記活性変化関係は、前記活性値の経時変化を示すものであり、測定開始前の前記活性値を新規活性値ＫＮ、当該測定が行われた時間の活性値を活性値ＫＴ、測定により得られた結合量を測定結合量Ｓ、とすると、前記補正後結合量Ｈを、
Ｈ＝Ｓ／（ＫＴ／ＫＮ）
で求めること、を特徴とする請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
生理活性物質が固定され、前記生理活性物質上に液体を貯留可能な液溜め部の形成された測定チップと、
前記液溜め部へ化合物を供給し、前記生理活性物質と前記化合物との結合量を測定した後に前記生理活性物質へ供給された前記化合物を洗浄する測定洗浄プロセスを１つの生理活性物質について異なる複数の化合物毎に繰り返して行う測定洗浄手段と、
最初の前記測定洗浄プロセスの開始前から最後の前記測定洗浄プロセスの終了後までに少なくとも２回、前記生理活性物質の活性値を検出する活性測定手段と、
前記活性測定手段により検出された前記生理活性物質の活性値に基づいて、前記生理活性物質の活性変化を示す活性変化関係を求める活性変化関係算出手段と、
前記活性変化関係に基づいて前記生理活性物質と前記化合物との結合量を補正して補正後結合量を求める結合量補正手段と、
前記補正後結合量に基づいて、前記生理活性物質に対する特定の化合物を選別する選別手段と、
を備えたスクリーニング装置。
【請求項５】
前記液溜め部へ供給された液体を回収する回収手段をさらに備えた請求項４に記載のスクリーニング装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−３０３０（Ｐ２００８−３０３０Ａ）
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７５０７６（Ｐ２００６−１７５０７６）
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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