ステビオシドからステビオールを酵素的に調製する方法
本発明は、ペクチナーゼ、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）を含有する市販の酵素混合物を使用して、ステビオシドからグリコシド残基を切断してステビオールを生成する方法を対象とする。好ましい方法では、反応は酵母培養物の存在下で実施される。カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）酵素とＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）との併用についてもまた、記載される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の簡単な説明］
本発明は、ペクチナーゼ、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）を含有する市販の酵素混合物を使用して、ステビオシドからグリコシド残基を切断し、ステビオールを生成する方法を対象とする。いくつかの好ましい方法では、反応は酵母存在下で実施される。
［背景技術］
【０００２】
ステビア・リバウンディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）は、主にノンカロリー甘味料として使用される甘味のある化合物、すなわちステビオシドおよびレバウジオシドＡを含有する。ステビオールは、これらの化合物のアグリコン誘導体である。ステビオールは、認知機能を改善するのに使用し得る。例えば国際公開第２００９／０７１２７７号パンフレット（ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ，Ｂ．Ｖ．）を参照されたい。
【０００３】
ステビオシドからのステビオールの製造は困難である。酸性条件下では、生成したステビオールがイソステビオールに転位するために、ステビオシドの酸加水分解は手間がかかる。ステビオールはこの方法によっては得られないとする、いくつかの文献報告さえある（Ｋｏｈｄａ ｅｔ ａｌ １９７６ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：９８１−９８３）。
【０００４】
過ヨウ素酸ナトリウムを使用してステビオシドを切断し、ステビオールを生成する代案の方法が、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ １９８０；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３６：２６４１−２６４８に記載された。しかしこの方法は、有用な収率を達成するために、高度に希釈されたシステムと、大幅に過剰な（約１０モル当量超）高価な過ヨウ素酸ナトリウムを必要とする。したがってこの方法は、大量のステビオールを製造するのには実用的でない。
【０００５】
いくつかの酵素ベースの方法について、記載されている。
Ｂｒｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ １９３１ Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍｉｅ Ｂｉｏｌ．１３：７８１−９６は、エムルシン、ラムノジアスターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）または細断風乾した下面発酵酵母などの多様な「発酵製品」によってステビオシドが加水分解されないと述べた。同著者らは、カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのジアスターゼを成功裏に使用した。しかし彼らは１匹当たり「かろうじて０．５ｃｍ３の純粋な消化液」を得たので、大量生産には適さない。Ｍｏｓｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ，１９５５ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０：８８４−８９９もまた、グルコシドの酵素的加水分解を使用して、「酵素汁」と称されるカタツムリ酵素製剤と「乾燥製剤」とを使用して、少量（０．５グラム未満）のステビオールを生成した。本酵素のさらなる特性解析については、記載されていない。
【０００６】
前出のＫｈｏｄａらは、他の著者が粗製ヘスペリジナーゼを使用して、ステビオシドからステビオールを作り出したが、これを反復すると所望のステビオールではなく、レバウジオシドＢとグルコースが得られたことを報告した。
【０００７】
Ｒｕｄｄａｔ ｅｔ ａｌ １９６５ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１０：４９６−４９９；Ｇｉａｎｆａｇｎａ ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２（２）：４２７−４３０；およびＰｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：２４７５−２４８２は、それぞれ、様々な市販のペクチナーゼ（それぞれＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５９Ｌ」；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５０Ｌ」；Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ＡＣ」）を使用した手順を記載した。Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８２：１２４４−５０は、「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５９Ｌ」がもはや市販されていないこと、そして他のＰｅｃｔｉｎｏｌが依然として販売されているかどうかは不明である旨を報告した。
【０００８】
商業的大量生産に適した、ステビオシドからステビオールを生産する効率的な方法に対する必要性がある。
［発明の詳細な説明］
【０００９】
本発明に従って、市販の酵素製剤ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）が、ステビオシドを切断してステビオールを生成でき、効率的かつ商業的に実行可能な方法で使用し得ることが分かった。したがって本発明の一態様は、
ａ）ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤に接触させるステップと、
ｂ）ステビオールを回収するステップ
を含んでなる、ステビオールを製造する方法である。
【００１０】
切断中に遊離される糖類（グルコース）が上の酵素反応を阻害し得ることもまた発見された。したがって上の反応は、酵母存在下で実施されることが好ましい。酵母は結果として生じるグルコースを除去し得て、したがって酵素反応は妨げられずに進行し得る。したがって本発明の別の態様は、
ａ）ステビオシドを生酵母培養の存在下でＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップと、
ｂ）ステビオールを回収するステップ
を含んでなる、ステビオールを製造する方法である。
【００１１】
本明細書全体を通じて、化合物名の後にある番号は、以下の図で示される化合物を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レバウジオシドＡおよびステビオシドの加水分解を示す。
【図２】カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）酵素とペクチナーゼよるステビオシドの加水分解を示す。
【００１３】
「ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５」は、ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｄｅｌｆｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販される酵素製剤である。これはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の選択されたＧＲＡＳ株から得られる酵素の混合物であり、ペクチナーゼとヘミセルラーゼを含む。これはガラクツロン酸含有量の低いジュースを製造して、果汁調製品を清澄化するのに一般的に使用されるが、他用途の報告もまたある。
・そのβ−Ｄ−グルコシダーゼ活性をワインおよびシャンパンの製造において使用し得る（国際公開第１９９８／３８３１６号パンフレット参照）。
・そのβ−グルコピラノシダーゼおよびα−ラムノシダーゼ活性を使用してステロイドグリコシドを加水分解し、デスグルコデスラムノラシンを製造し得る（米国特許第６，９１１，３２５号明細書）。
【００１４】
「酵母」とは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｃｅａｅ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、または既知の技術を使用した大規模発酵で使用し得る他の酵母種を指すが、ただし酵母はグルコースを二酸化炭素とエタノールに変換できる。
【００１５】
この反応のためのステビオシド出発原料は、精製または単離形態で存在する必要はない。好ましい実施形態では、それらはステビア種（Ｓｔｅｖｉａ ｓｐ．）の抽出物などのステビオシドを含有する植物抽出物中、より好適にはステビア・リバウンディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）抽出物中に存在する。非切断性ステビオシド構成要素もまた、抽出物中に存在してもよい。好ましいステビア抽出物はステビオシド濃度がより高く、反応の進行につれて蓄積し工程効率を低下させるレバウジオシドＡなどの非切断性ステビオシドの濃度はより低い。抽出物中のステビオシドの好ましい濃度は、少なくとも総ステビオシドの５０％であり、好適には＞９０重量％である。（高含量のステビオシドは容易に購入し得る。
【００１６】
ステビオシドから糖を切断してステビオールを生成する反応を媒介するのに、いずれの酵素が適切なのかは正確には明らかでない。例えばいくつかのペクチナーゼが適切であるが、他はそうでない。同様にいくつかのβ−グルクロニダーゼが適切であるが、他はそうでない。したがっていくつかの酵素および酵素混合物を調査して、適合性を判定した。試験された多数の内、そのいくつかは４日間のインキュベーション後でさえ、反応をもたらさなかった。以下の酵素によって、少なくとも部分的な成功が得られた。
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルカナーゼ（ＦＬＵＫＡ ４９１０３）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−３（ＳＩＧＭＡ Ｇ８８８５）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−２（ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨＰ−２（ＳＩＧＭＡ ７０１７）；
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ ＰＳ４７１６）；
アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ Ｐ２６１１）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのスルファターゼタイプＨ−ｌ（ＳＩＧＭＡ Ｓ９６２６）；
ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）（ＤＳＭ）
【００１７】
多数の酵素の中で、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）が良好な活性を有することが分かり、それは市販され、したがってそれは本発明の好ましい酵素である。
【００１８】
さらに酵素は、切断グルコースの生成によるフィードバック阻害を被るが、（水溶性でない）ステビオールによっては阻害されないことが留意された。したがって小規模なステビオール製造は、その他の反応物質の不在下で、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）をステビオシドと共にインキュベートすることで可能であるが、それはグルコース蓄積のために、大量生産の最も好ましい方法ではないかもしれない。
【００１９】
しかし本発明に従って、グルコースが二酸化炭素とエタノールに変換されるまで、最大４０℃で酵母により発酵させることで、酵素活性がほぼその初期活性に復帰することが分かった。この方法は、これまで可能でなかったステビオールの大量生産に適した工業水準にまでスケールアップし得る。したがって本発明の別の態様は、酵母の発酵条件下において、酵母培養物存在下で、ステビオシドまたはレバウジオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）と接触させるステップと、ステビオールを回収するステップを含んでなる、製造されたステビオールを工業規模で生産する方法である。
【００２０】
所望ならば、発酵工程後、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物中に存在するものなどの残留ステビオシドの任意のさらなる酵素的加水分解を使用して、ステビオールの量を増大し得る。酵素製剤は、高温において酵母培養物よりも安定しているので、この酵素加水分解工程は、酵母を培養するのに使用したのよりも高温で実施し得る。例えば温度は、４０℃を超え得て、好適には約４０〜６０℃、より好適には約５５℃である。基質による酵素の潜在的阻害は、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物を逐次添加して、ステビオシド濃度をより低レベルに保つことで回避し得る。したがって本発明の別の態様は、
ａ）発酵条件下で酵母培養物に、ステビオシドおよびＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）を提供し、ステビオールを含んでなる培養液を生成するステップと；
ｂ）上昇する温度条件下で、培養液中の残留ステビオシドの少なくとも一部を加水分解して、ステビオールに富んだ培養液を生成するステップ
を含んでなる、ステビオールを工業規模で製造する方法である。
【００２１】
ステビオールに富んだ培養液は、そのまま使用し得て、または任意選択的に、ステビオールを分離して、所望ならば精製し得る。
【００２２】
同時のステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物加水分解とグルコース発酵は可能であるが、酵母のｔｍａｘ＝４０℃のために、４０℃における全体的加水分解速度は、逐次加水分解および発酵よりも低い。
【００２３】
［酵素併用］
本発明に従って、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）（またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ ＰＳ４７１６）またはアスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ Ｐ２６１１））と、
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−３（ＳＩＧＭＡ Ｇ８８８５）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−２（ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨＰ−２（ＳＩＧＭＡ ７０１７）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのスルファターゼタイプＨ−１（ＳＩＧＭＡ Ｓ９６２６）；
からなる群から選択される第２の酵素製剤との併用が、単一酵素製剤の使用よりもステビオシドを効率的に加水分解し得ることもまた分かった。
【００２４】
図２に示すように、カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）（食用カタツムリ）からの酵素は、ステビオシド（１）を迅速にルブソシド（５）に切断し、さらには緩慢にステビオールモノシド（６）とステビオールグルコシドエステル（７）混合物に切断して、ステビオール（３）への緩慢な最終切断がそれに続いた。このパターンは、酵素が主にスルファターゼまたはグルクロニダーゼ活性を含有したかどうかを問わずに、観察された。
【００２５】
活性ペクチナーゼおよびｃｙｔｏｌａｓｅは、ステビオシド（１）を緩慢にルブソシド（５）に切断し、６／７へのより迅速な加水分解がそれに続いて、最後にステビオール（３）ができた。ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）および活性ペクチナーゼは、ステビオシド（１）を同様の作用によってステビオールに切断した。この酵素は食品製造用に認可されており、ＤＳＭから容易に入手できることから、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）をさらなる開発のために使用した。
【００２６】
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）由来酵素とペクチナーゼまたはＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）の混合物は、どちらか単独の場合よりも、ステビオシドをより迅速により少量の酵素で切断することが分かった。カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）酵素は、第１の加水分解工程をより迅速に切断した。ペクチナーゼとＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）は、後半の加水分解工程に対してより迅速に作用した。したがって本発明の別の態様は、である。
【００２７】
特に好ましい酵素の組み合わせは、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７と；ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）グルクロニダーゼタイプＨ２ ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６である。
【００２８】
本発明をより良く例証するために、以下の実施例を提示する。
【００２９】
［実施例］
［実施例１］
様々な酵素および酵素製剤（集合的に「酵素」と称されるを、ステビオシドとレバウジオシドＡを切断してステビオールを生成する、それらの能力について評価した。５ｍｌの緩衝液ｐＨ４．１（０．１ｍｏｌ／ｌ Ｈ３ＰＯ４＋ＮａＯＨ）中で可溶化した５０ｍｇのステビア抽出物ＲＶ１４０−５４（１９％レバウジオシドＡ、１９％ステビオシド［ｗ％］）、５０μｌの酵素溶液または１０ｍｇの凍結乾燥粉末；４０℃（ｒｅｍ １）。結果を下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
いずれの酵素もレバウジオシドＡを切断できなかったので、出発原料として使用するのに好ましいステビア抽出物は、ステビオシドのレベルが高く、レバウジオシドＡの含有量が低くあるべきである。
【００３３】
［実施例２］
［ステビオシドの酵素的加水分解によるステビオール］
３０００ｍｌの水、１０８ｍｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）、およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からの１２ｍｌのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７；１６．５ｇのカリウムリン酸二水素（Ｆｌｕｋａ）、１２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」の溶液を５５℃で約１．６ｍｌオルトリン酸１ｍｏｌ／ｌの添加によってｐＨ＝４．２に調節した。
【００３４】
混合物を５５℃で４日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのステビオールへのほぼ完全な加水分解を示した。ステビオールの微細スラリーの温度を４０℃に低下させ、２．０ｇの乾燥酵母（乾燥パン酵母）を添加した。二酸化炭素の発生がほぼ収まるまで、混合物を４０℃で２４時間撹拌した。混合物を５５℃に加熱し、ｐＨを約１６ｍｌの水酸化カリウム１ｍｏｌ／ｌの添加によってｐＨ＝４．２に調節した。この混合物に、１２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」を添加した。ベージュ色のスラリーを５５℃で６日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシド（１）および中間体（５、６、７）のステビオール（３）へのほぼ完全な加水分解を示した。
【００３５】
白色スラリーを周囲温度に冷却し、ブフナー漏斗によって濾過した。湿潤な濾過ケークを３Ｌ反応フラスコ内で、３０００ｍｌの酢酸エチルに周囲温度で１時間懸濁した。エマルションを濾過して２００ｍｌの酢酸エチル「Ｆｌｕｋａ ４５７６０」で洗浄した。
【００３６】
有機相を３Ｌ反応フラスコ内で、７．５ｇの炭Ｎｏｒｉｔ ＣＡ１と共に周囲温度で４５分間撹拌した。黒色スラリーを濾過した。残渣を１００ｍｌ酢酸エチルで洗浄した。濃厚なスラリーが得られるまで、透明濾液を真空内でＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。懸濁液を濾過した。濾液に対して同手順を反復した。濾過ケークを合わせて、真空内で１８時間乾燥させた。７２．１ｇのステビオール、白色軽量結晶、含有量：９８％［ａ％］を得た。
【００３７】
［実施例３］
［ステビオシドの酵素的加水分解によるステビオール］
５００ｍｌの水、３６ｍｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）、および２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」の溶液。混合物を５５℃で４日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのステビオールへのほぼ完全な加水分解を示した。ステビオール沈殿物を濾過して、水で洗浄した。残渣を真空乾燥させた。含有量９１％のステビオール７．２９ｇを得た。
【００３８】
［実施例４］
［「グルクロニダーゼＨ２＋Ｃｙｔｏｌａｓｅ ＰＣＬ５」（酵素混合物１：４）によるステビオシドの加水分解］
条件：
１００ｍｇのステビオシド、含有量＝９８％；
２０μｌのβ−グルクロニダーゼタイプＨ２カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；
８０μｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）；
緩衝液０．０１ｍｍｏｌ／ｌリン酸ｐＨ＝４．２；
４８時間；４５℃
【００３９】
【表３】
【００４０】
酵素は生成物グルコースによって阻害される。グルコース除去なしのグルコースによる酵素の阻害は、反応時間を長期化して最大濃度を制限する。
【００４１】
［実施例５］
［酵母の影響、グルコース除去］
条件：
１００ｍｇステビオシド、含有量＝９８％；
４０ｙｌ β−グルクロニダーゼタイプＨ−２カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；
１６０ｙｌ ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）；
緩衝液０．０１ｍｍｏｌ／ｌリン酸ｐＨ＝４．２；
３５℃で２４時間；５０℃で７１時間
【００４２】
ステビオシドの切断によって形成されたグルコースは、酵素によるさらなる切断を阻害する。乾燥パン酵母は、酵素による加水分解に影響を与えることなく、グルコースを成功裏に除去した。酵母は４５℃では数時間内に不活性化されるので、酵母による処理は≦４０℃で実施した。グルコースの二酸化炭素およびエタノールへの変換後に、酵素は完全な活性を取り戻した。４０℃では、全体的反応速度は逐次法（５５℃で６日間の加水分解および４０℃で１日間の発酵）の場合よりも低いが、同時の切断およびグルコース発酵が可能である。データを下の表３に示す。
【００４３】
【表４】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の簡単な説明］
本発明は、ペクチナーゼ、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）を含有する市販の酵素混合物を使用して、ステビオシドからグリコシド残基を切断し、ステビオールを生成する方法を対象とする。いくつかの好ましい方法では、反応は酵母存在下で実施される。
［背景技術］
【０００２】
ステビア・リバウンディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）は、主にノンカロリー甘味料として使用される甘味のある化合物、すなわちステビオシドおよびレバウジオシドＡを含有する。ステビオールは、これらの化合物のアグリコン誘導体である。ステビオールは、認知機能を改善するのに使用し得る。例えば国際公開第２００９／０７１２７７号パンフレット（ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ，Ｂ．Ｖ．）を参照されたい。
【０００３】
ステビオシドからのステビオールの製造は困難である。酸性条件下では、生成したステビオールがイソステビオールに転位するために、ステビオシドの酸加水分解は手間がかかる。ステビオールはこの方法によっては得られないとする、いくつかの文献報告さえある（Ｋｏｈｄａ ｅｔ ａｌ １９７６ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：９８１−９８３）。
【０００４】
過ヨウ素酸ナトリウムを使用してステビオシドを切断し、ステビオールを生成する代案の方法が、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ １９８０；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３６：２６４１−２６４８に記載された。しかしこの方法は、有用な収率を達成するために、高度に希釈されたシステムと、大幅に過剰な（約１０モル当量超）高価な過ヨウ素酸ナトリウムを必要とする。したがってこの方法は、大量のステビオールを製造するのには実用的でない。
【０００５】
いくつかの酵素ベースの方法について、記載されている。
Ｂｒｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ １９３１ Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍｉｅ Ｂｉｏｌ．１３：７８１−９６は、エムルシン、ラムノジアスターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）または細断風乾した下面発酵酵母などの多様な「発酵製品」によってステビオシドが加水分解されないと述べた。同著者らは、カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのジアスターゼを成功裏に使用した。しかし彼らは１匹当たり「かろうじて０．５ｃｍ３の純粋な消化液」を得たので、大量生産には適さない。Ｍｏｓｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ，１９５５ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０：８８４−８９９もまた、グルコシドの酵素的加水分解を使用して、「酵素汁」と称されるカタツムリ酵素製剤と「乾燥製剤」とを使用して、少量（０．５グラム未満）のステビオールを生成した。本酵素のさらなる特性解析については、記載されていない。
【０００６】
前出のＫｈｏｄａらは、他の著者が粗製ヘスペリジナーゼを使用して、ステビオシドからステビオールを作り出したが、これを反復すると所望のステビオールではなく、レバウジオシドＢとグルコースが得られたことを報告した。
【０００７】
Ｒｕｄｄａｔ ｅｔ ａｌ １９６５ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１０：４９６−４９９；Ｇｉａｎｆａｇｎａ ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２（２）：４２７−４３０；およびＰｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：２４７５−２４８２は、それぞれ、様々な市販のペクチナーゼ（それぞれＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５９Ｌ」；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５０Ｌ」；Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓからの「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ＡＣ」）を使用した手順を記載した。Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８２：１２４４−５０は、「Ｐｅｃｔｉｎｏｌ ５９Ｌ」がもはや市販されていないこと、そして他のＰｅｃｔｉｎｏｌが依然として販売されているかどうかは不明である旨を報告した。
【０００８】
商業的大量生産に適した、ステビオシドからステビオールを生産する効率的な方法に対する必要性がある。
［発明の詳細な説明］
【０００９】
本発明に従って、市販の酵素製剤ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）が、ステビオシドを切断してステビオールを生成でき、効率的かつ商業的に実行可能な方法で使用し得ることが分かった。したがって本発明の一態様は、
ａ）ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤に接触させるステップと、
ｂ）ステビオールを回収するステップ
を含んでなる、ステビオールを製造する方法である。
【００１０】
切断中に遊離される糖類（グルコース）が上の酵素反応を阻害し得ることもまた発見された。したがって上の反応は、酵母存在下で実施されることが好ましい。酵母は結果として生じるグルコースを除去し得て、したがって酵素反応は妨げられずに進行し得る。したがって本発明の別の態様は、
ａ）ステビオシドを生酵母培養の存在下でＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップと、
ｂ）ステビオールを回収するステップ
を含んでなる、ステビオールを製造する方法である。
【００１１】
本明細書全体を通じて、化合物名の後にある番号は、以下の図で示される化合物を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レバウジオシドＡおよびステビオシドの加水分解を示す。
【図２】カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）酵素とペクチナーゼよるステビオシドの加水分解を示す。
【００１３】
「ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５」は、ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｄｅｌｆｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販される酵素製剤である。これはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の選択されたＧＲＡＳ株から得られる酵素の混合物であり、ペクチナーゼとヘミセルラーゼを含む。これはガラクツロン酸含有量の低いジュースを製造して、果汁調製品を清澄化するのに一般的に使用されるが、他用途の報告もまたある。
・そのβ−Ｄ−グルコシダーゼ活性をワインおよびシャンパンの製造において使用し得る（国際公開第１９９８／３８３１６号パンフレット参照）。
・そのβ−グルコピラノシダーゼおよびα−ラムノシダーゼ活性を使用してステロイドグリコシドを加水分解し、デスグルコデスラムノラシンを製造し得る（米国特許第６，９１１，３２５号明細書）。
【００１４】
「酵母」とは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｃｅａｅ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、または既知の技術を使用した大規模発酵で使用し得る他の酵母種を指すが、ただし酵母はグルコースを二酸化炭素とエタノールに変換できる。
【００１５】
この反応のためのステビオシド出発原料は、精製または単離形態で存在する必要はない。好ましい実施形態では、それらはステビア種（Ｓｔｅｖｉａ ｓｐ．）の抽出物などのステビオシドを含有する植物抽出物中、より好適にはステビア・リバウンディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）抽出物中に存在する。非切断性ステビオシド構成要素もまた、抽出物中に存在してもよい。好ましいステビア抽出物はステビオシド濃度がより高く、反応の進行につれて蓄積し工程効率を低下させるレバウジオシドＡなどの非切断性ステビオシドの濃度はより低い。抽出物中のステビオシドの好ましい濃度は、少なくとも総ステビオシドの５０％であり、好適には＞９０重量％である。（高含量のステビオシドは容易に購入し得る。
【００１６】
ステビオシドから糖を切断してステビオールを生成する反応を媒介するのに、いずれの酵素が適切なのかは正確には明らかでない。例えばいくつかのペクチナーゼが適切であるが、他はそうでない。同様にいくつかのβ−グルクロニダーゼが適切であるが、他はそうでない。したがっていくつかの酵素および酵素混合物を調査して、適合性を判定した。試験された多数の内、そのいくつかは４日間のインキュベーション後でさえ、反応をもたらさなかった。以下の酵素によって、少なくとも部分的な成功が得られた。
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルカナーゼ（ＦＬＵＫＡ ４９１０３）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−３（ＳＩＧＭＡ Ｇ８８８５）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−２（ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨＰ−２（ＳＩＧＭＡ ７０１７）；
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ ＰＳ４７１６）；
アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ Ｐ２６１１）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのスルファターゼタイプＨ−ｌ（ＳＩＧＭＡ Ｓ９６２６）；
ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）（ＤＳＭ）
【００１７】
多数の酵素の中で、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）が良好な活性を有することが分かり、それは市販され、したがってそれは本発明の好ましい酵素である。
【００１８】
さらに酵素は、切断グルコースの生成によるフィードバック阻害を被るが、（水溶性でない）ステビオールによっては阻害されないことが留意された。したがって小規模なステビオール製造は、その他の反応物質の不在下で、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）をステビオシドと共にインキュベートすることで可能であるが、それはグルコース蓄積のために、大量生産の最も好ましい方法ではないかもしれない。
【００１９】
しかし本発明に従って、グルコースが二酸化炭素とエタノールに変換されるまで、最大４０℃で酵母により発酵させることで、酵素活性がほぼその初期活性に復帰することが分かった。この方法は、これまで可能でなかったステビオールの大量生産に適した工業水準にまでスケールアップし得る。したがって本発明の別の態様は、酵母の発酵条件下において、酵母培養物存在下で、ステビオシドまたはレバウジオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）と接触させるステップと、ステビオールを回収するステップを含んでなる、製造されたステビオールを工業規模で生産する方法である。
【００２０】
所望ならば、発酵工程後、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物中に存在するものなどの残留ステビオシドの任意のさらなる酵素的加水分解を使用して、ステビオールの量を増大し得る。酵素製剤は、高温において酵母培養物よりも安定しているので、この酵素加水分解工程は、酵母を培養するのに使用したのよりも高温で実施し得る。例えば温度は、４０℃を超え得て、好適には約４０〜６０℃、より好適には約５５℃である。基質による酵素の潜在的阻害は、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物を逐次添加して、ステビオシド濃度をより低レベルに保つことで回避し得る。したがって本発明の別の態様は、
ａ）発酵条件下で酵母培養物に、ステビオシドおよびＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）を提供し、ステビオールを含んでなる培養液を生成するステップと；
ｂ）上昇する温度条件下で、培養液中の残留ステビオシドの少なくとも一部を加水分解して、ステビオールに富んだ培養液を生成するステップ
を含んでなる、ステビオールを工業規模で製造する方法である。
【００２１】
ステビオールに富んだ培養液は、そのまま使用し得て、または任意選択的に、ステビオールを分離して、所望ならば精製し得る。
【００２２】
同時のステビア（Ｓｔｅｖｉａ）抽出物加水分解とグルコース発酵は可能であるが、酵母のｔｍａｘ＝４０℃のために、４０℃における全体的加水分解速度は、逐次加水分解および発酵よりも低い。
【００２３】
［酵素併用］
本発明に従って、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）（またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ ＰＳ４７１６）またはアスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からのペクチナーゼ（ＳＩＧＭＡ Ｐ２６１１））と、
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−３（ＳＩＧＭＡ Ｇ８８８５）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨ−２（ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのβ−グルクロニダーゼタイプＨＰ−２（ＳＩＧＭＡ ７０１７）；
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのスルファターゼタイプＨ−１（ＳＩＧＭＡ Ｓ９６２６）；
からなる群から選択される第２の酵素製剤との併用が、単一酵素製剤の使用よりもステビオシドを効率的に加水分解し得ることもまた分かった。
【００２４】
図２に示すように、カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）（食用カタツムリ）からの酵素は、ステビオシド（１）を迅速にルブソシド（５）に切断し、さらには緩慢にステビオールモノシド（６）とステビオールグルコシドエステル（７）混合物に切断して、ステビオール（３）への緩慢な最終切断がそれに続いた。このパターンは、酵素が主にスルファターゼまたはグルクロニダーゼ活性を含有したかどうかを問わずに、観察された。
【００２５】
活性ペクチナーゼおよびｃｙｔｏｌａｓｅは、ステビオシド（１）を緩慢にルブソシド（５）に切断し、６／７へのより迅速な加水分解がそれに続いて、最後にステビオール（３）ができた。ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）および活性ペクチナーゼは、ステビオシド（１）を同様の作用によってステビオールに切断した。この酵素は食品製造用に認可されており、ＤＳＭから容易に入手できることから、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）をさらなる開発のために使用した。
【００２６】
カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）由来酵素とペクチナーゼまたはＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）の混合物は、どちらか単独の場合よりも、ステビオシドをより迅速により少量の酵素で切断することが分かった。カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）酵素は、第１の加水分解工程をより迅速に切断した。ペクチナーゼとＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）は、後半の加水分解工程に対してより迅速に作用した。したがって本発明の別の態様は、である。
【００２７】
特に好ましい酵素の組み合わせは、ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７と；ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）グルクロニダーゼタイプＨ２ ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６である。
【００２８】
本発明をより良く例証するために、以下の実施例を提示する。
【００２９】
［実施例］
［実施例１］
様々な酵素および酵素製剤（集合的に「酵素」と称されるを、ステビオシドとレバウジオシドＡを切断してステビオールを生成する、それらの能力について評価した。５ｍｌの緩衝液ｐＨ４．１（０．１ｍｏｌ／ｌ Ｈ３ＰＯ４＋ＮａＯＨ）中で可溶化した５０ｍｇのステビア抽出物ＲＶ１４０−５４（１９％レバウジオシドＡ、１９％ステビオシド［ｗ％］）、５０μｌの酵素溶液または１０ｍｇの凍結乾燥粉末；４０℃（ｒｅｍ １）。結果を下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
いずれの酵素もレバウジオシドＡを切断できなかったので、出発原料として使用するのに好ましいステビア抽出物は、ステビオシドのレベルが高く、レバウジオシドＡの含有量が低くあるべきである。
【００３３】
［実施例２］
［ステビオシドの酵素的加水分解によるステビオール］
３０００ｍｌの水、１０８ｍｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）、およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からの１２ｍｌのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７；１６．５ｇのカリウムリン酸二水素（Ｆｌｕｋａ）、１２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」の溶液を５５℃で約１．６ｍｌオルトリン酸１ｍｏｌ／ｌの添加によってｐＨ＝４．２に調節した。
【００３４】
混合物を５５℃で４日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのステビオールへのほぼ完全な加水分解を示した。ステビオールの微細スラリーの温度を４０℃に低下させ、２．０ｇの乾燥酵母（乾燥パン酵母）を添加した。二酸化炭素の発生がほぼ収まるまで、混合物を４０℃で２４時間撹拌した。混合物を５５℃に加熱し、ｐＨを約１６ｍｌの水酸化カリウム１ｍｏｌ／ｌの添加によってｐＨ＝４．２に調節した。この混合物に、１２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」を添加した。ベージュ色のスラリーを５５℃で６日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシド（１）および中間体（５、６、７）のステビオール（３）へのほぼ完全な加水分解を示した。
【００３５】
白色スラリーを周囲温度に冷却し、ブフナー漏斗によって濾過した。湿潤な濾過ケークを３Ｌ反応フラスコ内で、３０００ｍｌの酢酸エチルに周囲温度で１時間懸濁した。エマルションを濾過して２００ｍｌの酢酸エチル「Ｆｌｕｋａ ４５７６０」で洗浄した。
【００３６】
有機相を３Ｌ反応フラスコ内で、７．５ｇの炭Ｎｏｒｉｔ ＣＡ１と共に周囲温度で４５分間撹拌した。黒色スラリーを濾過した。残渣を１００ｍｌ酢酸エチルで洗浄した。濃厚なスラリーが得られるまで、透明濾液を真空内でＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。懸濁液を濾過した。濾液に対して同手順を反復した。濾過ケークを合わせて、真空内で１８時間乾燥させた。７２．１ｇのステビオール、白色軽量結晶、含有量：９８％［ａ％］を得た。
【００３７】
［実施例３］
［ステビオシドの酵素的加水分解によるステビオール］
５００ｍｌの水、３６ｍｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）、および２０ｇのステビオシド９５％「ＤＡＥ Ｐｙｕｎｇ」の溶液。混合物を５５℃で４日間撹拌した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのステビオールへのほぼ完全な加水分解を示した。ステビオール沈殿物を濾過して、水で洗浄した。残渣を真空乾燥させた。含有量９１％のステビオール７．２９ｇを得た。
【００３８】
［実施例４］
［「グルクロニダーゼＨ２＋Ｃｙｔｏｌａｓｅ ＰＣＬ５」（酵素混合物１：４）によるステビオシドの加水分解］
条件：
１００ｍｇのステビオシド、含有量＝９８％；
２０μｌのβ−グルクロニダーゼタイプＨ２カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；
８０μｌのＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）；
緩衝液０．０１ｍｍｏｌ／ｌリン酸ｐＨ＝４．２；
４８時間；４５℃
【００３９】
【表３】
【００４０】
酵素は生成物グルコースによって阻害される。グルコース除去なしのグルコースによる酵素の阻害は、反応時間を長期化して最大濃度を制限する。
【００４１】
［実施例５］
［酵母の影響、グルコース除去］
条件：
１００ｍｇステビオシド、含有量＝９８％；
４０ｙｌ β−グルクロニダーゼタイプＨ−２カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；
１６０ｙｌ ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）；
緩衝液０．０１ｍｍｏｌ／ｌリン酸ｐＨ＝４．２；
３５℃で２４時間；５０℃で７１時間
【００４２】
ステビオシドの切断によって形成されたグルコースは、酵素によるさらなる切断を阻害する。乾燥パン酵母は、酵素による加水分解に影響を与えることなく、グルコースを成功裏に除去した。酵母は４５℃では数時間内に不活性化されるので、酵母による処理は≦４０℃で実施した。グルコースの二酸化炭素およびエタノールへの変換後に、酵素は完全な活性を取り戻した。４０℃では、全体的反応速度は逐次法（５５℃で６日間の加水分解および４０℃で１日間の発酵）の場合よりも低いが、同時の切断およびグルコース発酵が可能である。データを下の表３に示す。
【００４３】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップと、
ステビオールを回収するステップと
を含んでなる、ステビオールを製造する方法。
【請求項２】
前記ステビオシドが植物抽出物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物抽出物がステビア種（ｓｔｅｖｉａ ｓｐ．）の抽出物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステビア（ｓｔｅｖｉａ）抽出物が多量のステビオシドを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＬＣ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップが、ステビオールが培養液中で生成される条件下で、培養液中の生酵母培養物の存在下で実施される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
上昇する温度条件下で、前記培養液中で残留ステビオシドの少なくとも一部を加水分解して、ステビオールに富んだ培養液を生成するステップをさらに含んでなる、請求項５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＬＣ５（登録商標）酵素製剤が、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）からのペクチナーゼもまた含んでなる、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ａ）ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７；
ｂ）ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼタイプＨ２ ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；および
ｃ）カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）由来酵素、およびペクチナーゼまたはＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）のどちらか
からなる群から選択される酵素製剤。
【請求項１】
ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップと、
ステビオールを回収するステップと
を含んでなる、ステビオールを製造する方法。
【請求項２】
前記ステビオシドが植物抽出物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物抽出物がステビア種（ｓｔｅｖｉａ ｓｐ．）の抽出物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステビア（ｓｔｅｖｉａ）抽出物が多量のステビオシドを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステビオシドをＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＬＣ５（登録商標）酵素製剤と接触させるステップが、ステビオールが培養液中で生成される条件下で、培養液中の生酵母培養物の存在下で実施される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
上昇する温度条件下で、前記培養液中で残留ステビオシドの少なくとも一部を加水分解して、ステビオールに富んだ培養液を生成するステップをさらに含んでなる、請求項５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＬＣ５（登録商標）酵素製剤が、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）からのペクチナーゼもまた含んでなる、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ａ）ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼＨＰ２ Ｓｉｇｍａ Ｇ７０１７；
ｂ）ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）およびカタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのグルクロニダーゼタイプＨ２ ＳＩＧＭＡ Ｇ０８７６；および
ｃ）カタツムリ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）由来酵素、およびペクチナーゼまたはＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５（登録商標）のどちらか
からなる群から選択される酵素製剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１６９６３（Ｐ２０１３−５１６９６３Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８３８９（Ｐ２０１２−５４８３８９）
【出願日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９０３１
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９０３１
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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