ステム加速等温核酸増幅技術
本発明は、核酸増幅の分野にある。特に、試験試料の迅速かつ特異的な増幅を向上させるステムプライマーを利用する方法について記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、その完全な内容が本明細書に参照により組み込まれる、２００９年６月１５日出願の英国特許出願第ＧＢ０９１０３０２．９号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。特に、試験試料の迅速かつ特異的な増幅および検出を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅技術（ＮＡＡＴ）は、研究および診断の多くの領域において非常に有益で、強力なツールである。ＮＡＡＴ技法によって、高い感度および特異性で試料中の核酸を検出および定量すること、ならびに試料中の核酸を定量分析することが可能である。
【０００４】
核酸増幅は、特定のＮＡＡＴを実施した後の増幅産物の存在によって示される、試料中の特定の鋳型核酸の存在を決定するために使用することができる。逆に、増幅産物が存在しないことは、試料中に鋳型核酸が存在しないことを示す。このような技法は、診断用途において、例えば、病原体が試料中に存在するかどうかを決定するために、非常に重要である。
【０００５】
先行技術は、核酸を増幅するための様々な熱サイクリング技法および等温技法を記載している。熱サイクリング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、温度サイクリングを使用してＤＮＡ合成の反復サイクルを行わせ、鋳型ＤＮＡの元の量と比例した大量の新規ＤＮＡの合成をもたらす。増幅反応を行わせるのに熱サイクリングに頼らない等温技法もいくつか開発されている。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用する等温技法は、ＲＮＡ合成工程を含まない増幅反応のために開発された。同様に、ＲＮＡ合成工程を含む増幅反応のために、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよび／またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用しうる等温技法が開発された（例えば、Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Volume 27,Issue 3 March 2008,pages 224-243を参照されたい）。
【０００６】
使用した増幅技術によって生成したポリ核酸は、総称してアンプリコンと呼ばれる。生成したアンプリコンの性質は、実施したＮＡＡＴによって大きく異なる。例えば、ＰＣＲなどのＮＡＡＴは、大きさおよび配列が実質的に同一なアンプリコンを生成することができる。他のＮＡＡＴは、非常に様々な大きさのアンプリコンを生成し、このアンプリコンは様々な数の反復配列から構成され、したがって様々な長さのコンカテマーの集合体である。このようなコンカテマー由来の反復配列は、実施されているアッセイの対象であるポリ核酸の配列を反映する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＮＡＡＴが、多くの分野、例えば、診断用途において極めて重要であるので、速度、感度および特異性の向上したＮＡＡＴを提供することが当技術分野では引き続き必要である。本発明は、この目標を達成するために、簡単で、対費用効果の高い方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって実現される速度の増加が、特定のＮＡＡＴのためのプライマー設計を不十分なものにする配列に依存した問題によって引き起こされる増幅速度の減少を相殺することができるという利点を有する。このような速度増加によってさらに、増幅速度を高めるための費用の高い代替手段を回避することができるので、特定のＮＡＡＴに基づいたアッセイの費用を低減することができる。
【０００８】
（好ましい具体例の詳細な記載）
本発明は、ポリ核酸の改善された増幅方法を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ポリ核酸を合成する方法であって、
ａ）少なくとも第１および第２の相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
ｂ）第１および第２のセグメントを含む第１のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第１の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントが、第１のプライマーの別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｃ）第１のセグメントを含み第２のセグメントを含んでもよい第２のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第２のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２の領域がループを形成することができるように、含まれてもよい第２のセグメントが第２のプライマー中の別の領域または第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｄ）第１および第２の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも１個のプライマーを提供する工程、
ｅ）ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
ｆ）ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の基礎となっている原理は、１個または複数の「ステムプライマー（ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ）」、すなわち、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の間の領域に結合するプライマーを提供することにより、ある種のＮＡＡＴの速度および感度を著しく高めるということが驚くべきことに見出されたことである。
【００１０】
「フォワード相互プライマー結合部位」および「リバース相互プライマー結合部位」とは、フォワードおよびリバース相互プライマーが結合する鋳型ＤＮＡおよび／またはアンプリコン上の領域を意味する。本明細書で使用した「相互プライマー」または「複数の相互プライマー」という用語は、増幅中に指数関数的に増幅する元の鋳型ポリヌクレオチドの領域を区切るように作用する２個以上のプライマーのことである（図１ａおよび１ｂ）。いくつかの実施形態では、さらなるプライマーがフォワード相互プライマーおよび／またはリバース相互プライマーの５’領域に結合してもよい。このようなさらなるプライマーを使用する場合、フォワード相互プライマー結合部位および／またはリバース相互プライマー結合部位は、これらのさらなるプライマーの結合領域ならびに相互プライマー自体の結合領域を包含してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域の５’にある領域に結合する１個または複数のさらなるプライマーを使用してもよい。このような方法は、例えば、「置換プライマー」または「外部プライマー（ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）」の使用を開示しているＷＯ００２８０８２において開示された。
【００１１】
ＷＯ００２８０８２は、ループ形成プライマー（ｌｏｏｐ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）（ＬＦＰ）の使用について記載しており、ＬＦＰは第１および第２のセグメントを含むものと理解されており、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第２のセグメントがループを形成することができるように第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含んでおり、ＷＯ００２８０８２は、ＮＡＡＴはＬＦＰに加えて２個の「外部プライマー」を使用すると述べている。これらのプライマーの特徴は、「第１の外部プライマー」が鋳型中の「Ｆ２」部位の３’に結合し（すなわち、第１の外部プライマーは「Ｆ３」部位に結合する、図１４ｂ）、「第２の外部プライマー」が第２のＬＦＰの結合領域「Ｒ２ｃ」部位の３’に結合する（すなわち第２の外部プライマーは「Ｒ３ｃ」部位に結合する、図１４ｂ）ことである。したがって、これらのプライマーは、ＬＦＰのプライマー結合部位の５’に存在するアンプリコンのステム領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）には結合しない。
【００１２】
フォワード相互プライマー結合領域とリバース相互プライマー結合領域の間の領域は、アンプリコンの一部を形成することは保証されているが、それ自体は通常プライマー結合部位を提供しない領域である。この領域は、本明細書では、アンプリコンの「ステム領域」と呼ばれる。ステム領域に結合するプライマーは、本明細書では「ステムプライマー」と呼ばれる（図１ｃ、図２ａ〜２ｅ）。ステムプライマーは、ステム領域に結合するプライマーと定義することができる。ステムプライマーはさらに、フォワード鎖上のフォワード相互プライマー結合領域の３’領域およびリバース鎖上のリバース相互プライマー結合部位の３’に結合するプライマーと定義してもよい。相互プライマー結合部位およびステムプライマーの結合部位は、有意に重複していないものと理解される。相互プライマー結合部位およびステムプライマーの結合部位は、全く重複していないことが好ましい。
【００１３】
重複したプライマー結合領域に関して「有意に」とは、プライマー結合部位が１０ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、２ヌクレオチド未満または１ヌクレオチド未満重複していることを意味する。プライマー結合領域が全く重複していないことが好ましい。ステムプライマーはさらにまた、フォワード鎖上のフォワード相互プライマー結合領域の３’領域およびリバース鎖上のリバース相互プライマー結合部位の３’に結合するプライマーと定義することができるが、このプライマー結合領域は、特定のＮＡＡＴによって使用されたプライマー、特にＬＦＰの直接的な結果として生成したいかなる分子内二次構造とも実質的に重複しない（図１ｄ）。
【００１４】
驚くべきことに、ステムプライマーを使用すると増幅速度が著しく増加することが見出された。これによって、例えば、診断試験が短期間に試験結果を出すことができ、診断試験の利用者にとって一般に価値あるものとなり、明らかに有利である。迅速な増幅の他の利点は、偽陽性結果の可能性が減少し、したがって試験の特異性を高めることができることである。本発明者らの経験上、鎖置換ポリメラーゼを使用するＮＡＡＴは、増幅に必要な時間が長くなればなるほど、ますます非特異的増幅が起こりやすくなった。したがって、より迅速な増幅はまた、より正確な結果をもたらすことができる。
【００１５】
ステムプライマーは、より迅速な増幅を提供するだけでなく、少なくとも２つのさらなる重要な利点をもたらす。第１に、ＮＡＡＴ、例えば、以下により詳細に論じるループ媒介等温増幅（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、鋳型リプライミング増幅（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｒｅ−ｐｒｉｍｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（Ｓｅｌｆ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＥＡ）およびＳＭａｒｔ増幅方法（ＳＭＡＰ）の増幅速度を増加させるためにステムプライマーを使用することにより、より迅速な増幅を実現するための費用の高い代替物、例えば、より多くのポリメラーゼまたはより多くのｄＮＴＰの使用が避けられる。例えば、２００９年の価格では、ＬＡＭＰ反応においてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの量を倍にするとアッセイの費用は６０％増加し、ｄＮＴＰを倍にするとアッセイの費用は２０％増加するが、プライマーは一般的にあまり高価ではないので、２種類のステムプライマーを追加してもアッセイの費用の増加はわずか４％である。
【００１６】
第２に、ステムプライマーは、所定の標的鋳型のプライマー選択においてすぐれた適応性を提供する。例えば、核酸配列の変動が大きい病原体の特定のファミリーを検出するために、該病原体ファミリーゲノムの最も少ない配列変動を示す領域にプライマーを設計する。しかし、これには、１個または複数のプライマーを非最適部位に配置する必要性があり得る。これは、以下に論じるＬＡＭＰなどのＮＡＡＴで特に問題となる可能性があり、ある特定の方法において最大６個の異なるプライマーの位置が受け入れられる必要がある。ステムプライマーは、ＮＡＡＴで使用した他のプライマーとは非常に異なる位置に配置することができるので、通常では使用が困難であろう特定の標的鋳型中のステムプライマーの結合部位を使用することができる。
【００１７】
実際に、通常、ステムプライマーを使用することによって、ＬＡＭＰ（またはＳＭＡＰ）法で使用される他のプライマーを省くことが可能である。例えば、特定の標的鋳型では、いわゆる「置換プライマー」（すなわち、図１４ｂ、ｃおよびｅにおける位置Ｒ３およびＦ３を占めるプライマー）の１つに最適な結合部位を見出すことは困難であり、結果として試験の性能に悪影響が及ぶことが分かる。しかし、標的鋳型上に利用可能な適切なステムプライマー結合部位があれば、ステムプライマーを添加することによって、置換プライマーの欠如による性能不足を補うように作用することができる（図１９）。この原理は、ＬＡＭＰまたはＳＭＡＰで使用した特定の他のプライマーにも同様に適用することができる。
【００１８】
本発明の方法は、ＮＡＡＴがコンカテマーの形成を引き起こすならば、いかなるＮＡＡＴでも実施することができる。本明細書で使用した「コンカテマー」という用語は、１本鎖において交互に連結した、実質的に類似のヌクレオチド配列を有するポリ核酸を意味する。これらの整列した配列は、互いの単純な反復、逆方向反復またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１９】
コンカテマーの生成に適したＮＡＡＴは、当技術分野では周知で、一般的に「等温」増幅技法を含む。これは、既知の熱サイクリング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応とは対照的に、ポリ核酸の増幅にインキュベーション温度の変化を必要としないことを意味する。
【００２０】
いくつかの等温増幅技法、例えば、核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ；ＵＳ５４０９８１８）および転写媒介増幅（ＴＭＡ；ＵＳ５３９９４９１）は、増幅方法の一部として転写に依存しており、一方で、他のものは、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ；ＷＯ２００４０２７０２５）およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ；ＷＯ０３０７２８０５）はそれぞれ、ヘリカーゼまたはレコンビナーゼの作用に依存しており、さらに他に、例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ；ＵＳ５４５５１６６）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ；ＷＯ００２８０８２、ＷＯ０１３４７９０、ＷＯ０２２４９０２）、キメラ置換反応（ＲＤＣ；ＷＯ９７９４１２６）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ増幅（ＲＣＡ；Lizardi,P.M.et al.Nature Genetics,(1998)19.225-231)、核酸の等温キメラ増幅（ＩＣＡＮ；ＷＯ０２１６６３９）、ＳＭａｒｔ増幅法（ＳＭＡＰ；ＷＯ２００５０６３９７７）、線形等温多量体化増幅（ＬＩＭＡ；Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase,Hafner G.J.,Yang I.C.,Wolter L.C.,Stafford M.R.,Giffard P.M,BioTechniques,2001,vol.30,no4,pp.852-867)、ＵＳ６７４３６０５（本明細書では「鋳型リプライミング増幅」または「ＴＲＡ」と称する）およびＷＯ９６０１３２７（本明細書では、「自己伸長増幅」またはＳＥＡと称する）で記載された方法もまた、特定のＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性に依存している。
【００２１】
これらのＮＡＡＴの特徴は、プライマーまたはプライマーのセットの作用を介してポリ核酸をコピーすること、および相互プライマーまたはプライマーのセットによって前記コピーを再コピーすることの両方を提供することである。これによって、元のポリ核酸のコピーを指数関数的速度で生成することが可能である。
【００２２】
ＮＡＡＴに関して、一般的に、この方法によって検出される核酸の物理的断片を、この元の核酸から形成された最初のコピーと、この元の核酸から形成されたコピーの最初のコピーと、コピーのこのコピーのさらなるコピーと区別することは有用である。明瞭にするために、以下の定義を本明細書に付記する：それ自体分析されている試料由来の核酸は、「標的鋳型」（図３ａ）と称する；ＮＡＡＴを実施することによるこの標的鋳型の最初のプライマー依存性コピーは、「主要アンプリコン」（図３ａ）と称する；ＮＡＡＴを実施することによる主要アンプリコンの最初のコピーは、「第１世代アンプリコン」（図３ｂ）と称する；第１世代アンプリコンのさらなるコピー（およびこれらのコピーのコピー）は総称して、「次世代アンプリコン」（図３ｃ）と称する。主要アンプリコン、第１世代アンプリコンおよび次世代アンプリコンは全て、一般的にアンプリコンのサブセットである。２本鎖アンプリコンでは前述のサブセットの組み合わせまたは標的鋳型自体との組み合わせから構成されることが可能である。さらに、次世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンと同一とすることができる。さらにまた、次世代アンプリコンから第１世代アンプリコンと同一のポリ核酸分子を生成することが可能である。
【００２３】
本発明の対象は、特に次世代アンプリコンに関しており、得られたコピーのさらなる再コピーを実現する方法で増大させることができるさらなる機構を提供する。
【００２４】
前述したアンプリコンのサブセットは通常、異なる特徴を有する。標的鋳型が、特定のＮＡＡＴで使用したプライマーによって区別された核酸の領域を超えて第１のプライミング部位からコピーされ得るので、主要アンプリコンの長さは非常に様々であり得る。一般的に、ＮＡＡＴの重要な特徴は、第１世代アンプリコンを生成するために、問題のＮＡＡＴによって使用された別の相互プライマーがこの主要アンプリコンを利用できるようにする方法を提供することである。主要アンプリコンのプライマー依存性プライミングから得られた第１世代アンプリコンは、使用したプライマーによって区別される別個の長さとなる。また、ＮＡＡＴの重要な特徴は、次世代アンプリコンを生成するために、相互プライマーによってさらにプライミングするために第１世代アンプリコンを利用できるようにする方法を提供することである。また、問題のＮＡＡＴの重要な特徴は、次世代アンプリコンをさらに再コピーするための方法を提供することである。いくつかのＮＡＡＴのために、次世代アンプリコンは第１世代アンプリコンとは実質的に異なっていてもよく、特に、次世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンのコンカテマーであってもよい。
【００２５】
直鎖標的鋳型から直接、コンカテマーの形態でアンプリコンを生成する方法には、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＥＡおよびＳＭＡＰ（後者はＬＡＭＰおよびＳＥＡのハイブリッドである）が含まれる。それぞれの場合において、コンカテマーは、第１世代アンプリコンを含む方法から生じる（図３ｂ）。したがって、ポリ核酸の合成は、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＥＡおよびＳＭＡＰからなる群から選択されるＮＡＡＴを使用して実施することが好ましい。したがって、それぞれの場合では、本発明は、直鎖の標的鋳型から直接コンカテマーを生成する能力を備えた１個または複数のプライマーを提供するＮＡＡＴに関連する。
【００２６】
ＲＣＡもまた、コンカテマーを生成する。しかし、この場合、共有結合によって閉環したＤＮＡ分子を形成するために、プローブの標的鋳型特異的ライゲーションが必要である。このようなアンプリコンはそれ自体、任意の相互プライマーに頼らず、または第１および第２のセグメントを含む任意のプライマーを必要とせず、自然にコンカテマーになり、第１のセグメントは、鋳型上の第１の相互プライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントは、第１のプライマーの別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコンの領域に実質的に相補的な配列を含んでいる。したがって、ＲＣＡ自体は、本発明の対象ではない。
【００２７】
したがって、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＭＡＰおよびＳＥＡの一般的な特徴は、第１世代アンプリコン依存性プライミングの特徴であり、すなわち、第１世代アンプリコンは、分子内事象または分子間事象のいずれかによって、プライマー自体として作用し、大きさが第１世代アンプリコンよりも大きく、天然ではコンカテマーである次世代アンプリコン（この用語は、本明細書では第１世代アンプリコンのさらなるコピー（（およびこれらのコピーのコピー）を意味するために使用される；図３ｃ）をもたらす。実際に、これらのＮＡＡＴの特徴は、非常に長いアンプリコンが、短いアンプリコンから生成し、したがって、ステムプライマーの結合部位の数が増幅工程の最中に指数関数的に増加し、したがって、増幅を加速するステムプライマーの能力が増加することである。これらのＮＡＡＴにおいてコンカテマーを生成するプライマーの作用機構を正しく認識することは、ステムプライマーがどうのように効果を発揮するか理解するために役立つ。さらに、当業者は、コンカテマーの生成をもたらす機構に気づき、本発明の方法において使用できる他の適切なＮＡＡＴを容易に同定することができるだろう。
【００２８】
ＬＡＭＰがコンカテマー構造を形成する方法の詳細を図４に示す。ＴＲＡ法は同一の機構によってコンカテマーアンプリコンを形成することが予測される。図４ｂおよび４ｃは、実際に、コンカテマーが形成できる機構は少なくとも２つあり、１つは分子内機構を介し（図４ｂ）、もう１つは分子間機構を介すること（図４ｃ）を示している。実際に、本明細書で示したように、いずれの機構も第１世代および次世代アンプリコンの構造に関して同一の結果をもたらす（図４ｂ（ｉｖ）および図４ｃ（ｉｖ）を比較すること）。図４に概略を示した方法は、フォワード相互プライマー結合領域のみを参照しているが、リバース相互プライマー結合領域にも同様に適用されることを理解されたい。さらに、この方法は、次世代アンプリコンによって反復されると理解され、したがって、さらに長いコンカテマーを形成することができる。
【００２９】
ＳＥＡによるコンカテマー生成は、ＬＡＭＰおよびＴＲＡによるコンカテマー生成と本質的に同一であるが、ＬＡＭＰおよびＴＲＡのように、逆方向反復を形成するためにポリヌクレオチド上においてプライマーを伸長することを必要とせず、必要な逆方向反復がプライマー自体に直接備わっている。図５ａ〜ｃは、ＬＡＭＰ／ＴＲＡに関してＳＥＡの対応する機構を示す。
【００３０】
多くのＮＡＡＴは、本明細書で「単純プライマー」と称するものを使用する（図６ａ）。本明細書で使用した「単純プライマー」とは、ポリ核酸上のプライマー結合部位に実質的に相補的なプライマーを意味し、このプライマーは、かなりの数の追加のヌクレオチド、すなわち、プライマー結合部位に実質的に相補的なプライマー領域の３’または５’のヌクレオチドを含有しない。この文脈において「かなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉｖｅ）」という用語は、単純プライマーが約２０個未満、約１５個未満、約１０個未満、または約５個未満の追加のヌクレオチドを含有することを意味する。
【００３１】
ＬＡＭＰおよびＴＲＡ（および参照としてＳＭＡＰ）において使用されるプライマーは、アンプリコン中に１本鎖ループを生成するので、本明細書では、「ループ形成プライマー」（ＬＦＰ）と称する。本明細書で使用されるＬＦＰとは、第１および第２のセグメントを含むプライマーのことであり、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第２のセグメントがループを形成することができるように、第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む。ＬＦＰの一般的構造を図６ｂに示す。ＬＦＰによる標的鋳型のプライミングから生じた第１（および次）世代アンプリコンは、反転した反復配列のワトソン−クリック塩基対から形成された２本鎖ポリヌクレオチドが隣接した１本鎖ポリヌクレオチドのループを含有する。ポリヌクレオチドの１本鎖ループは、問題のＮＡＡＴによって使用されたさらなるプライマーが結合するために利用することはできるが、特にステムプライマーが結合するために利用することはできないと考えられる。
【００３２】
ＳＥＡ（およびＳＥＡおよびＬＡＭＰのハイブリッドである参照としてのＳＭＡＰ）で使用したプライマーを図６ｃに示す。これらのプライマーは５’末端に任意の逆方向反復を含有することを確認することができる。結果として、前記プライマーによる標的鋳型のプライミングから生じた第１世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンが潜在的に自己プライムする（または類似のアンプリコンをプライムオフ（ｐｒｉｍｅ−ｏｆｆ）する）原因となる緊密なヘアピンループを形成する。このようなプライマーは、本明細書では「ヘアピンプライマー」と称する。本明細書で使用した「ヘアピンプライマー」という用語は、第１および第２のセグメントを含むプライマーのことであり、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第１のプライマーの別の領域に実質的に相補的な配列を含む。ヘアピンプライマーは通常、問題のＮＡＡＴによって使用されたさらなるポリヌクレオチドが結合するために利用可能な第１世代または次世代アンプリコン中にポリヌクレオチドの１本鎖ループを提供しない。しかし、本発明者らは、プライマーの第２のセグメント中の逆方向反復がリンカー領域によって分離されているヘアピンプライマーを提供することができることを認識した。リンカーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも３０、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチドまたは少なくとも６０ヌクレオチドであってもよい。このようなプライマーは、１本鎖ループを形成することができ、増幅中に追加のプライマーの結合を可能にする（図６ｄおよびまた、図８ｃも参照）。逆方向反復の間にこのようなリンカー配列を含有するヘアピンプライマーは、本明細書では、「ループ提供プライマー（ｌｏｏｐ-ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）」（ＬＰＰ）と称する。このようなプライマーは、先行技術では記載されておらず、本発明の好ましい態様である。
【００３３】
ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰおよびＳＥＡでは、第１世代アンプリコンの分子内プライミングを可能にする第１世代アンプリコン中の逆方向反復を生成するプライマーを使用することは明白である。結果として、第１世代アンプリコンは、それ自体の区分をコピーし、そのようにしてコンカテマーを生じる。ＴＲＡについて記載された機構では、前述の機構は明らかにならない。それにも関わらず、ＴＲＡはコンカテマーを生じ、ＬＡＭＰと同一の機構によってコンカテマーを生じるようである（実施例１および関連する図７を参照されたい）。前述の分子内プライミングは、コンカテマーを生成するためにこれらの方法で使用されるプライマーに利用できる唯一の機構ではないが、正確な機構に関係なく、ステムプライマーの有益な効果の合理性は明らかである。
【００３４】
第１世代アンプリコンの分子内（図８ａ）または分子間（図８ｂ）自己プライミングのためにＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＭＡＰで使用したＬＦＰで論じたように、得られた次世代アンプリコンは、標的鋳型からアンプリコンを生成するために使用した元のプライマーに結合できる１本鎖領域を利用可能にする。形成した１本鎖ループの相互鎖は、以下で言及する「ループプライマー」に結合することができることに注意されたい。ＳＥＡおよびＳＭＡＰで記載したようなヘアピンプライマーは、アンプリコン中にこのような１本鎖ループを生成しない。しかし、以前に論じたように、本発明者らは、逆方向反復の間にリンカー領域を含有するＳＥＡプライマーの変種（図６ｄで示したＬＰＰ）を使用することによって、ヘアピンプライマーが、図８ｃで例示したように、１本鎖ループを生成し得ることをはっきりと理解している。
【００３５】
ＬＦＰおよびＬＰＰがアンプリコンの安定な１本鎖領域を生成する能力は、アンプリコンを迅速にさらに増大させるのに必要不可欠で、これらのプライマーを使用する技術の重要な態様である。これは、コンカテマーアンプリコンが問題のＮＡＡＴによって使用されたプライマーの新たなプライミング部位を多く含有できることを意味する。ＬＡＭＰおよびＴＲＡ（およびしたがってＳＭＡＰ）において、アンプリコン中に逆方向反復を生成するＬＦＰはまた、それ自体結合することができ、したがって、アンプリコンの再コピーをさらに開始し、したがって、さらに増幅を増大させるアンプリコンの１本鎖領域を提供する。ＬＡＭＰおよびＳＭＡＰにおいて、ＬＦＰに加えて、増幅のさらなる増大を助けるためにアンプリコンのこれらの１本鎖領域にも結合するさらなる追加のプライマーを使用することができる（ループプライマーとして知られる）。本発明の一面は、ステムプライマーが、ＬＦＰおよび／またはＬＰＰによって生成した前記安定な１本鎖ループには結合しないが、異なる機構を介して増幅を加速させることである。
【００３６】
ＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＥＡ（および参照としてＳＭＡＰ）について、次世代アンプリコンをコピーする工程は、自己プライミング（分子内または分子間のいずれで実施されるかには関係なく）、アンプリコンの１本鎖領域からのさらなるプライマーの結合および伸長、またはフォワードもしくはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに結合する他のプライマーの作用のいずれを介するにせよ、次世代アンプリコンのステム領域を一時的に１本鎖にすることが示される。ＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＥＡ（およびＳＭＡＰ）の示唆された機構によって、前記１本鎖ステム領域が、さらなるアンプリコン自己プライミングおよび再コピーの作用を介して、またはフォワードもしくはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに向けられたプライマーのための曝露された結合部位に結合するプライマーの作用を介して、２本鎖ポリヌクレオチドに迅速に変換されることが予測される。ステム領域は、一時的に１本鎖であり、安定な１本鎖ではないことしかこれまで予測されなかった。したがって、ステム領域が増幅に有用なプライマー結合部位を提供することは予測されなかった。しかし、今回、驚くべきことに、ステム領域に向けられたプライマーが実際に、増幅速度を非常に増加させることが示された。ステムプライマーがアンプリコンに結合できる機構を図９および１０に例示する。
【００３７】
ステムプライマーの作用は、アンプリコン再コピーから生じた一時的に曝露された１本鎖ポリヌクレオチド上であると予測されるが、他の機構も、ステムプライマーを使用して見られる増幅速度の増加の原因となり得ることが考えられる。例えば、コンカテマー構造において、１本のポリヌクレオチドが複製スリップ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）におけるように「ループアウト（ｌｏｏｐ ｏｕｔ）」し得ることが考えられ、このことは、コンカテマーポリヌクレオチド構造が、その性質そのものによって、反復配列の間に２次構造を形成することができることから、特に可能性がある。例えば、生成した１本鎖ポリヌクレオチドループは、ステムプライマーの結合部位を提供し得る。他の機構も、ステムプライマーの効果を説明できる可能性があるが、これは本発明の一般的態様であることが予測されるコンカテマーポリヌクレオチド配列に作用するステムプライマーの原理である。
【００３８】
以前に論じたように、適切な相互プライマーは、第１および第２のセグメントを含むことができ、第１のセグメントは鋳型上の相互プライマー結合領域に実質的に相補的である。本発明のこの態様は、本明細書では、第１のプライマーを参照にしてさらに詳細に説明するが、同様の原理が第２のプライマーにも必要に応じて変更を加えて適用されることを理解されたい。
【００３９】
「実質的に相補的」という用語は、第１のセグメントが、ＮＡＡＴ中に通常使用される条件下で鋳型および／またはアンプリコン上の相互プライマー結合領域に結合するために十分な相補性を有することを意味する。これには、相互プライマーの第１のセグメントが、鋳型上の相互プライマー結合領域に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性を有することが必要である。相互プライマーの第１のセグメントの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたはさらに少なくとも７０ヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
相互プライマーがさらに第２のセグメントを含有する場合、第２のセグメントは、第２の領域がループを形成することができるように、第１のプライマー中の別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含んでいる。「第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン」とは、第１のプライマーがポリメラーゼによって伸長するとき生成する鋳型の第１のコピーを意味する。前記アンプリコンは、５’末端に第１のプライマーの配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、プライマーが結合する標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と実質的に同一である。このようなプライマーは、以前にＬＦＰと称した。「実質的に同一」とは、第２のセグメントが標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを意味する。第２の領域の一部のみが標的鋳型上の領域と実質的な同一性を示すことも想定される。相互プライマーの第２のセグメントの全体または一部のみが標的鋳型上の領域と実質的な同一性を示すかどうかにかかわらず、標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と実質的に同一な第２のセグメントの領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたはさらに少なくとも７０ヌクレオチドである。本発明のこの態様において、相互プライマーの第１のセグメントが第１のアンプリコンを形成するために一旦伸長したならば、第２のセグメントは同じ鎖内の相補的領域に結合し、それによってループを形成することができる。
【００４２】
第２のセグメントはまた、第２のセグメント中の別の領域に実質的に相補的な領域を含んでもよい。このようなプライマーは、以前にヘアピンプライマーまたはループ提供プライマーと称した。「実質的に相補的」とは、第２のセグメント中の２つの領域が互いに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性を有することを意味する。好ましくは、相補的な領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたは少なくとも７０ヌクレオチドである。プライマーがヘアピンプライマーである場合、第２のセグメント中の相補的な２つの領域は、２つの領域が互いに結合するのを容易にするために、短い（すなわち、１０ヌクレオチド未満の）リンカー領域によって分離されていることが好ましい。リンカー領域の長さによって、当業者は長さが少なくとも１０ヌクレオチドのリンカー領域を有するＬＰＰとリンカー領域の長さが１０ヌクレオチド未満であるヘアピンプライマーとを区別することが可能である。プライマーの第１および第２のセグメントは、リンカー領域を介して連結していてもよい。いくつかの実施形態では、一旦コピーされたら、さらなるプライマーがリンカー領域の相補部分に結合するのを可能にするために、このリンカー領域は前記プライマーの第１のセグメントと実質的に同一である（図６ｄ）。「実質的に同一」とは、第１のセグメントがプライマーの第１および第２のセグメントを連結するリンカー領域と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを意味する。
【００４３】
本発明の方法は、同じ種類のフォワードおよびリバース相互プライマー、例えば、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーを使用して実施することができる。「同じ種類のプライマー」というとき、これらのプライマーが全て単純プライマー、ＬＦＰ、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであることを意味する。したがって、「異なる種類のプライマー」という用語は、少なくとも１個のプライマーが他のプライマー（複数可）と同じ種類ではない、２個以上のプライマーの組み合わせに関する。例えば、一方法で４個の相互プライマーを使用し、そのうち３個がＬＦＰで、１個がＬＰＰの場合、プライマーは異なる種類であると見なされるだろう。したがって、同じ種類ではないフォワードおよびリバース相互プライマーを使用することも想定される。例えば、ＬＦＰであるフォワード相互プライマーを、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであるリバース相互プライマーと組み合わせて使用してもよい。プライマーの組み合わせがコンカテマーの形成を引き起こすならば、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーを、単純プライマーと組み合わせることも可能である。増幅のために使用したＮＡＡＴが複数の（すなわち、２個以上の）フォワードおよび／またはリバース相互プライマーを使用する場合、同じ相互プライマー結合部位に対して同じまたは異なる種類のプライマーを組み合わせることも可能である。本発明の一態様では、２個以上のフォワードおよび／またはリバース相互プライマーは全てＬＦＰである。プライマーの適切な組み合わせは、当業者には明らかであろう。例えば、全て単純プライマーであるフォワードおよびリバース相互プライマーの組み合わせは、コンカテマーの形成をもたらすための機構を提供しない可能性があり、したがって、このような組み合わせは、本発明で使用するためには適していないことは当業者には明らかであろう。
【００４４】
一般的に、相互プライマーまたはプライマーのセットが、標的鋳型の異なる鎖に作用することを理解されたい。さらに、相互プライマー（または相互プライマーの各セットの１つ）は、コピーされた、および再コピーされた元のポリヌクレオチドの領域を区切るように作用するだろう。したがって、指数関数的増幅には、少なくとも２個のプライマー結合領域、フォワード相互プライマー結合領域とリバース相互プライマー結合領域の間の活性を合わせることが必要である（図１ａ）。フォワードおよびリバースプライマー結合領域はそれぞれ、プライマーのための１個の結合部位を含んでよく、それによって相互部位は反対のセンス鎖上にあり、すなわち、１個のプライマー結合部位は「フォワード鎖」上にあり、１個は「リバース鎖」にある（図１ａに見られる通り）。フォワードおよびリバース相互プライマー領域はまた、２個以上のプライマーそれぞれのための結合部位を含んでいてもよく、２個を上回るプライマーは特定のＮＡＡＴによって使用される。この場合、フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域中の２個以上のプライマー結合部位は全て、標的鋳型および／またはアンプリコンの同じ鎖または標的鋳型および／またはアンプリコン（またはそれらのコピー）の異なる鎖上に存在することが可能である（図１ｂ）。
【００４５】
本発明のステムプライマーは、ステムプライマー（複数可）の結合部位（複数可）がフォワードまたはリバース相互結合部位とあまり重複していないならば、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の間のどこに位置していてもよい。ＬＦＰを使用し、ＬＦＰがフォワードプライマーの場合、フォワード相互プライマー結合領域はＦ２部位（すなわち、フォワード相互プライマー結合領域）だけでなく、Ｆ１部位（すなわち、ＬＦＰの第２のセグメントに実質的に同一なフォワード鎖の領域）を包含し、ＬＦＰがリバースプライマーの場合、リバース相互プライマー結合領域はＲ２ｃ部位（すなわち、リバース相互プライマー結合領域）だけでなく、Ｒ１ｃ部位（すなわち、ＬＦＰの第２のセグメントに実質的に同一なリバース鎖上の領域）を包含することを理解されたい（図１ｅおよび図１４）。このように、ステムプライマーは２個のＬＦＰを使用したＲ１（ｃ）およびＦ１（ｃ）部位の間のどこにでも位置していてもよく（ＬＡＭＰおよびＴＲＡにおけるように）、１個のＬＦＰが特定のＮＡＡＴで使用される場合、ステムプライマーはＲ１（ｃ）またはＦ１（ｃ）部位のいずれかと非ＬＦＰによって占められた別の相互プライマー結合領域のとの間に結合していてもよい。
【００４６】
図２ａに示したように、フォワードまたはリバースポリヌクレオチド鎖のいずれかに結合する１個のステムプライマーのみを使用することが可能である。あるいは、アンプリコンの相互鎖（図２ｂ）または同じ鎖（図２ｄ）のいずれかに結合できる２個以上のステムプライマーを使用することができる。本発明の方法は、ステムプライマーの結合部位がフォワードまたはリバース相互プライマー結合領域とあまり重複しないか、または全く重複しないならば、任意の空間的組み合わせで使用でき、リバース鎖またはフォワード鎖のいずれかに結合できる１個、２個、３個、４個またはそれ以上のステムプライマーで実施することができる（図２ｅ）。ステムプライマーはさらに、ステム領域内の任意の部分に結合することができる。したがって、ステムプライマー（複数可）は、フォワードまたはリバース相互プライマー結合領域にごく接近した結合部位を有することができる（図２ｃ）。「ごく接近した」とは、ステムプライマーの結合領域および相互プライマー結合領域が１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐまたは１０００ｂｐ未満しか離れていないことを意味する。
【００４７】
本発明のステムプライマーの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチドまたは少なくとも９０ヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
ステムプライマーは、単純プライマーであってもよい。しかし、ＬＦＰ、ヘアピンプライマー、ＬＰＰ、キメラプライマーまたは他の誘導体であるステムプライマーを使用することも想定される。複数のステムプライマーを使用するとき、ステムプライマーは、同じ種類であってもよく、または異なる種類のプライマーの組み合わせであってもよい。「同じ種類のプライマー」と称するとき、プライマーは全て、単純プライマー、ＬＦＰ、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであることを意味する。したがって、「異なる種類のプライマー」という用語は、少なくとも１個のプライマーが他のプライマー（複数可）と同じ種類ではない、２個以上のプライマーの組み合わせに関する。例えば、使用したステムプライマーは全て、単純プライマーであってもよく、または単純プライマー、ＬＦＰおよび／またはヘアピンプライマーの組み合わせであってもよい。実際に、図２０に例示したように、ステムプライマーは、本発明で使用したものに対して様々なプライマー変形形態を使用するＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＭＡＰまたはＳＥＡの派生物において有用に使用することができるものと予想される。
【００４９】
ＴＲＡおよびＳＭＡＰに関連した文献、ならびに他のいくつかの情報源において概略されているように、「単純プライマー」、ＬＦＰ、ヘアピンプライマー、ＲＮＡ含有プライマー、ニッカーゼ部位含有プライマーおよび各ＮＡＡＴ法に概略された派生法を生成するための新規の組み合わせで使用できた他の新規プライマーは、多種多様に組み合わせることが可能である。前記組み合わせによって、より長いコンカテマーを生成するために自己コピーすることができるコンカテマーアンプリコンを生成する方法がもたらされる場合、ステムプライマーが利用できるものと予測される。
【００５０】
例えば、ＬＡＭＰで使用した置換プライマー（標的鋳型および主要アンプリコン上で作動するが、第１世代アンプリコンまたは次世代アンプリコンでは作動しないように設計されている）の主要な欠点は、関連したＬＦＰが標的鋳型に結合し、標的鋳型上で伸長する前に置換プライマーがその部位に結合し、その部位から伸長し、置換プライマーから生成した主要アンプリコンが指数関数的増幅に必須のＬＦＰの結合を遮断し、妨害し、したがって増幅を阻害することであることに本発明者らは注目してきた。本発明者らは、もし置換プライマーとして「単純プライマー」構造を使用する代わりに、ＬＦＰを置換プライマーとして使用するならば、この影響が、ある程度まで軽減し得ることを示した（実施例５、図１５ａおよびｂ）。これは、ＬＦＰがある程度、プライマー部位の再プライミングを可能にするためと考えられているが（ＴＲＡ技術に関連した特許に記載されているように）、主に、ＬＦＰは第１世代および次世代アンプリコンならびに標的鋳型および主要アンプリコンに作用することができ、一方、「単純」置換プライマーは主として標的鋳型および主要アンプリコンのみに作用すると予測されるためである。したがって、実施例５で記載したこのような方法は、ステムプライマーの使用と全く矛盾しない。同様に、ＩＣＡＮおよびＲＤＣで記載されたようなキメラプライマーは、置換プライマー部位の再プライミングを可能にし、したがって、ＬＦＰ結合部位を遮断する可能性を低下させるために、置換プライマーとして（単純プライマーの代わりに）使用することができた。
【００５１】
さらに、ステムプライマーはフォワードおよびリバース相互結合領域で生じるプロセスを連結することによって、ＬＦＰを使用する方法の増幅速度を増加させるように作用するため、およびＬＡＭＰ法には使用されるＬＦＰのフォワードおよびリバース相互結合部位を分離するヌクレオチドの数に上限があることが文献で教示されているため（Notomi et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Research,(2000)Vol 28., No.12, e63）、ステムプライマーを使用すると明らかに、フォワードおよびリバース相互結合部位が今までに実施できたものよりもさらに離れて配列中に位置することが可能となる（特に、いくつかのステムプライマーを使用する場合）。配列の２つの領域がポリヌクレオチド上に一緒に存在するが、この２つの領域の間の距離が離れ過ぎていて各それぞれの領域が本明細書で記載したＮＡＡＴにおいてフォワードおよびリバース相互結合領域として効果的に使用できないことを実証するのが望ましいとき、このことは非常に有益であり得る。
【００５２】
ステムプライマーを使用することによって、ステムプライマーがない場合よりもフォワードおよびリバース相互結合領域がはるかに離れていることが可能で、いまだ効果的な増幅が可能なので、ポリヌクレオチド上に２つの異なる部位の存在を確立することができる。したがって、本発明は、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域が、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、ポリ核酸の増幅方法を提供する。この距離は、使用したＮＡＡＴ、試薬および増幅条件が、ステムプライマー（複数可）が１つの反応に添加され、他の反応には添加されないこと以外は同一である、２つの別々のＮＡＡＴを並行して実施することによって、実験的に定義することができる。ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じる場合、相互プライマー結合部位は、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るような距離に位置するものと考えられる。
【００５３】
例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ)中に存在するｍｅｃＡ遺伝子は、ＭＲＳＡに関連したＳＣＣＭｅｃ可動遺伝要素の挿入部位に関連した保存されたｏｒｆＸ配列からかなり離れて位置することができる（ＷＯ０２／０９９０３４参照）。ｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列がＬＡＭＰなどの方法を使用するには配列中で離れ過ぎていても、ステムプライマーを使用すると、ｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列が増幅のために相互結合部位として作用できるようにすることによって、ＭＲＳＡを検出するために役立つことができる。したがって、一態様では、本発明は、試料中のＭＲＳＡを検出するための方法を提供する。
【００５４】
ステムプライマーは、天然に生じる核酸のみを含有していてもよい。しかし、改変塩基を含有するプライマーを利用することも想定される。このような改変塩基の例には、限定はしないが、Ｎ４−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基が含まれる。ステムプライマーおよび／または標識されたステムプライマーが結合するアンプリコンを検出可能にする部分で標識された核酸を使用することも想定される。例えば、核酸は、蛍光的に標識することができる。別法では、ステムプライマーは捕捉部分（例えば、ビオチン）で標識することができる。
【００５５】
重要なことに、ステムプライマーは、フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位に結合するプライマーによって媒介されるアンプリコンの指数関数的増幅には直接関与しないが、増幅速度だけを増加させる。これは、ステムプライマーが特定のＮＡＡＴによって使用される他のプライマーの増幅産物に働くと考えられるからである。したがって、ステムプライマーは、フォワードおよびリバース相互プライマーによって媒介される反応の増幅速度を増加させることによって働く。このことは図１ｃに示されており、ステムプライマーは標的鋳型をプライムし、標的鋳型から伸長し、標的鋳型の部分コピーはフォワード相互プライマー結合領域またはリバース相互プライマー領域のいずれかのみを含有し、両方は含有しないことを認めることができる。したがって、ステムプライマーから生成した主要アンプリコンは、相互コピーが可能ではなく、したがって、標的鋳型の指数関数的増幅には関与しないだろう（このことは図２１に詳細に示されている）。同様の論理が、特定のＮＡＡＴによって使用された他のプライマーによって生成した主要アンプリコン、および同様に第１世代アンプリコンをコピーするステムプライマーに適用される。
【００５６】
ステムプライマーは、次世代アンプリコン（すなわち、第１世代アンプリコンのさらなるコピー（およびこれらのコピーのコピー））が天然においてコンカテマーであるならば、標的鋳型の増幅速度を著しく増加させることのみが予測される。ステムプライマーがコンカテマー上で働くという必要性は、指数関数的増幅に関与する特定のポリ核酸のため、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域として作用することができる領域を含有しなければならないという必要性の次にくる。ステムプライマーを介してコンカテマー構造をコピーするとフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位の両方を有するポリヌクレオチドコピーを生成することができるが、一方、非コンカテマー構造をコピーしても生成しないことは、図２１で明らかに認めることができる。したがって、ステムプライマーの使用がコンカテマーの形成を引き起こす増幅方法に有益であると本発明者らは予測する。
【００５７】
ステムプライマー（複数可）はＮＡＡＴで使用した他のプライマーと連結した様式で作用し、この相互作用は増幅速度の観察された大きな増加を得るために必要不可欠であることが見出された。ステムプライマーを使用して認められた増幅速度の増加は、１個のステムプライマーによって生成したアンプリコンが、アンプリコンを再コピーするために特定のＮＡＡＴによって使用されている他のプライマー全ての鋳型として作用しない、追加的であるが異なる増幅方法に関与するステムプライマーでは説明できない。本発明者らは、観察された増幅速度の増加は、一方法によって生成したアンプリコンが別の方法によって生成したアンプリコンの鋳型として作用できない２種以上の異なる増幅方法ではなく、単一の、連結した増幅方法から生じるに違いないことを実験的および理論的に実証した。増幅技術ＴＲＡのための増幅速度の非常に大幅な増加の種類の例を、異なる増幅速度論を有する様々なプライマーセットについての実施例２において示す。各場合において、ステムプライマーは増幅速度を著しく増加させ、そうすることで、試験を実施する時間枠内で試験の感度を増加させる（図１１）。したがって、ステムプライマーは、標的鋳型の特定の種類および量を検出するために必要な時間を、ステムプライマー（複数可）を添加していない対照反応と比較して少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分または少なくとも６０分減少させることができる。
【００５８】
例えば、ＬＦＰと併用して単純プライマーを使用し、各プライマーが、相互的にフォワードまたはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに結合すると理解されているＴＲＡが明示された（ＵＳ６７４３６０５）。この組み合わせは、本明細書では非対称ＴＲＡ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＴＲＡ）またはＡＴＲＡと称する。このように、ステムプライマーをＴＲＡに添加すると、１つのアッセイで組み合わせた３つの別々の増幅方法、１つはＴＲＡで、次の２つが異なるＡＴＲＡ増幅である方法があることを主張することができた（図１２ａ）。したがって、ステムプライマーはＴＲＡ自体の増幅速度は増加させず、２つの付加的なＡＴＲＡ増幅を同アッセイに単に追加するだけであると示唆したくなるだろう。しかし、そのような場合は、観察された増幅全体の速度は、ＴＲＡ系の増幅速度および両ＡＴＲＡ系の増幅速度の合計であろう。しかし、本発明者らは、ステムプライマーの使用によって実質的に独立した増幅系の合計から予測されるよりもはるかに大きな増幅速度の増加が生じることを示した。実施例３では、増幅速度を、ステムプライマーおよびＬＦＰの様々な組み合わせで測定する。１個のステムプライマーおよび１個のＬＦＰを使用して示されるのは、ＡＴＲＡと同等である。ステムプライマーおよびＬＦＰの２つの可能な組み合わせ（すなわち、ＡＴＲＡの２つの表現型）を使用する場合の増幅速度は、極めて遅い速度論を与えることを確認することができる（図１２ｂ（ｉおよびｉｉ））。２個のＬＦＰを一緒に使用するとき（すなわち、ＴＲＡ系）の速度論は２個のＡＴＲＡ系よりも速い（図１２ｂ（ｉｉｉ））。ステムプライマーおよびＬＦＰを組み合わせると、増幅速度はＴＲＡまたはＡＴＲＡによって既に示されたいずれの速度よりも実質的に速い（図１２ｂ（ｉｖ））。ＡＴＲＡの速度論がいかに遅いかが示され（および増幅の指数関数性を想起する）ならば、図１２ｂ（ｉｖ）で示した増幅速度の増加が組み合わせた２つのＡＴＲＡおよびＴＲＡ系の反応速度の単純な合計であると推測することは合理的ではない。このことは、ステムプライマーが指数関数的増幅に関与する他のプライマーと連結した様式で作用しているという事実を強調し、さらに、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域を保持するアンプリコンのコピーを生成するコンカテマー上でのステムプライマーの作用によって合理的に説明することができる。
【００５９】
前記の実験例はまた、モデル化することができる。実施例４では、３種類の別々の増幅方法が数学的に定義された増幅速度でモデル化されている。このモデルは、ＢＡＲＴ曲線として表される（以下参照）。使用したパラメータは、等温ＮＡＡＴの様々な表現型の速度について本発明者らが得た結果の範囲を反映している。例えば、非常に遅い２つの増幅方法をより速い増幅方法と一緒にすると、ステムプライマーがＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ＋ループプライマーまたはＴＲＡのいずれかに添加されたとき認められる著しく速い増幅の種類が観察されないことを確認することができる（図１３ａにおけるモデルの結果を実施例２、３、５、６および７それぞれの図１１、１２ｂ、１５、１６および１７で示された実験結果と比較）。さらに、図１３ｂは、迅速な増幅方法と２種類の中程度に迅速な増幅方法とを一緒にした結果を示しており、このような条件下でも、ステムプライマーを使用して認められた全体の増幅速度の実質的な速度増加の種類はこのモデルでは認められないことを実証している。実際に、図１３ｃで明らかなように、３種類の迅速な増幅方法を一緒にした場合でも、全体の増幅速度は、個々の方法のいずれかよりもごくわずかに速いのみで、このことは、増幅の指数関数性を反映している（実施例２、３、４、５、６および７それぞれの図１１、１２ｂ、１５、１６および１７と比較）。
【００６０】
ステムプライマーがもたらすことができる増幅速度の増加は、いくつかの等温ＮＡＡＴで実証されたか、またはいくつかの等温ＮＡＡＴで働くことが実証された。ステムプライマーを特定のＮＡＡＴで使用した他のプライマーに対して展開することができる例を図１４ａ〜ｇに示す。実施例５、６および７は、図１４で示したＮＡＡＴ表現型のいくつかについての実験データを示している。それぞれの場合において、増幅速度の著しい増加を認めることができる（図１５〜１７）。
【００６１】
ＮＡＡＴを形成するコンカテマーにおけるステムプライマーのさらなる有用性は、蛍光、化学発光、電気化学レポーター系または「リアルタイム」で増幅の範囲を追跡する手段としての他のレポーター系において使用するためのプローブとなり得ることであろう。ステムプライマーは、アンプリコン中においてある種のプローブに影響を及ぼし得る逆方向反復を生成する必要がないので、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーなどを上回るプローブ含有プライマーとして利点を有することができよう。
【００６２】
本発明で使用した標的鋳型は、対象とするポリ核酸の増幅を可能にする適切な相互プライマー結合領域を含む、任意のポリ核酸であってもよい。当業者であれば、フォワード相互プライマー結合領域およびリバース相互プライマー結合領域がセンス鎖およびアンチセンス鎖それぞれにおいて増幅されるべき配列の５’に位置するように、フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位を標的鋳型上に配置する必要があることを理解するだろう。
【００６３】
標的鋳型は、１本鎖または２本鎖であってもよい。標的鋳型が１本鎖ポリ核酸の場合、当業者は、標的鋳型が最初に１個の相互プライマー結合領域のみを含むことを理解するだろう。しかし、第１のプライマーが結合すると、第２の相互プライマー結合領域を含有する相補鎖の合成が生じる。
【００６４】
標的鋳型は、ＲＮＡ分子から得てもよく、この場合、本発明の方法を実施する前にＲＮＡをＤＮＡに転写する必要がある。ＲＮＡを転写するために適切な試薬は当技術分野では周知で、限定はしないが逆転写酵素が含まれる。
【００６５】
フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域に加えて、標的鋳型は、本発明の１個または複数のステムプライマーの結合を可能にするために十分な長さを有することが必要なステム領域を含むことが必要である。したがって、ステム領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチドまたは少なくとも５００ヌクレオチドであることが好ましい。
【００６６】
当業者であれば、増幅に必要なプライマーに加えて、ＮＡＡＴはポリ核酸を合成するためにさらなる試薬を必要とすることに気づくであろう。必要な試薬は、当業者には明らかであろうが、一般的に、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼなどが含まれる。
【００６７】
当業者が認識するように、問題のＮＡＡＴを実施するために必要な全成分を添加した後、ポリ核酸を合成するために適切な条件を提供することが必要である。これは、例えば、適切なインキュベーション温度を提供することによって実現することができる。等温条件下で増幅が起こることが好ましい。これは、増幅中に温度を一定に維持することを意味する。「一定に」とは、温度変化が±１０℃以下であることを意味する。しかし、増幅工程の間、１０℃を超える１回の温度変化、１０℃を超える２回の温度変化、１０℃を超える３回の温度変化、１０℃を超える４回の温度変化、または１０℃を超える５回の温度変化を包含する方法も本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明によるポリ核酸の増幅は、当業者に既知の方法によって検出することができる。適切な方法には、限定はしないが、蛍光挿入色素、蛍光プライマーまたはプローブ、濁度の測定、電気化学的プローブ、生物発光シグナルおよび化学発光プローブの使用が含まれる。
【００６９】
ポリ核酸の増幅は、リアルタイム法、すなわち、ポリ核酸が増幅されるとき検出できる方法を使用して検出してもよい。このような検出系の例には、限定はしないが、蛍光（例えば、増幅中に添加される蛍光プローブ）、生物発光シグナルおよび電気化学的プローブが含まれる。一態様では、ステムプライマー自体を検出可能な部分、例えば、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識で標識して、ステムプライマー（複数可）が結合するアンプリコンの検出を可能にする。したがって、ＮＡＡＴを形成するコンカテマーにおけるステムプライマーのさらなる有用性は、「リアルタイム」で増幅の範囲を追跡する手段としての蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系において使用するためのプローブとなり得ることであろう。他の適切なレポーター系は、当業者には明らかであろう。ステムプライマーは、アンプリコン中においてある種のプローブに影響を及ぼし得る逆方向反復を生成する必要がないので、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーなどを上回るプローブ含有プライマーとして利点を有することができよう。あるいは、増幅産物は、終点測定、すなわち、ポリ核酸の増幅が完了した後で行う測定を使用して検出してもよい。
【００７０】
ポリ核酸の増幅はまた、ＮＡＡＴ検出で使用した他の検出方法によって検出することができる。適切な例には、限定はしないが、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ（Ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｓｔｒｉｐ）、電気泳動、質量分析および音波検出が含まれる。
【００７１】
一実施形態では、リアルタイムでの生物発光アッセイ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｉｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ）（ＢＡＲＴ）レポーター系を使用してポリ核酸の合成を検出する。この系は、本明細書に参照により組み込んだＷＯ２００４／０６２３３８およびＷＯ２００６／０１０９４８に詳細に説明されている。ＢＡＲＴは、試料からの１種のシグナル、生物発光シグナルを生じる等温ＮＡＡＴ用に設計されたレポーター系の一例である。ＢＡＲＴは、無機ピロリン酸のホタルルシフェラーゼ依存検出を利用しており、無機ピロリン酸は「標的」配列がＮＡＡＴを使用して増幅されるとき大量に生成される。このように、分子診断は、均一測定法（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ）において、密封した試験管から放射される光を測定することによって簡単にＢＡＲＴによって実現することができる。ＢＡＲＴは、いくつかの異なるＮＡＡＴで証明されており、５０〜６３℃の間で操作する。光出力が増幅の瞬間速度の測定値を表すので、ＢＡＲＴレポーターは、ＮＡＡＴの増幅速度を追跡するために特に効果的な手段である（一方、例えば、蛍光出力はシグナルの蓄積を示し、したがって、増幅速度を得るために測定値を微分しなければならない）。例として、図２２は、特定の標的ＤＮＡ分子の希釈系列を検出するために、ＢＡＲＴはＬＡＭＰと併用して使用されることを示している。試料中の標的ＤＮＡの量が減少するにつれて、最大光増加時間に達するための誘導期（最大増幅に達するための誘導期に比例する）が増加することに注意されたい。別の表現でいうと、ＢＡＲＴにおいて陽性試料に関連した特徴的な光ピークに達するための時間は、試料中の標的ポリ核酸の量と逆比例して増加する。実施例ではＢＡＲＴレポーター系を使用しているが、本発明はＢＡＲＴの使用に限定するものではなく、増幅のリアルタイム測定において、または終点測定として使用されるかどうかに関わらず、蛍光、濁度、他の分光技術または電気化学的測定法などの方法にも等しく適用できることを強調する。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法は密閉容器中で実施される。試料が汚染される可能性を減少させるか、またはさらには防止することもできるので、これは非常に有用である。さらに、研究室が汚染される可能性を減少させるか、またはさらには防止することもできる。鋳型ポリ核酸またはアンプリコンの１コピーであっても研究室に流出したならば、試験すべき他の試料を汚染し、偽陽性の結果を招く可能性があるので、これは特に重要である。したがって、汚染を防ぐ能力は、本発明の方法を診断用途で使用する場合、特に重要である。
【００７３】
本発明による方法のさらなる応用は、生物の遺伝子コード中に特定のポリ核酸配列が存在するかどうかを決定することである。例えば、植物の特定の非遺伝子改変品種または遺伝子改変植物に関連したＤＮＡの検出のため、動物の系統品種に関連したＤＮＡの検出のため、または遺伝子試験もしくは法医学などの医学的もしくは獣医学的診断用途のため、鋳型核酸の元となる核酸が遺伝的に改変されているかどうかを決定するために使用することができるだろう。本発明の方法はまた、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために適している。
【００７４】
本発明による方法は、診断用途において使用することができる。特に、この方法は、患者および他の試料中の生物の同定および定量を可能にする。この生物は、任意の微生物、例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌であってもよい。微生物は、病原性であることができるが、非病原性微生物であってもよい。微生物はまた、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよい。さらに、本発明の方法は、疾患の状態を検出するため、治療による有害反応の予測のため、また疾患状態感受性の予測のため、遺伝子改変穀物および動物を同定するために使用することができる。
【００７５】
「患者試料」とは、患者から採取した任意の試料を意味し、血液、便、拭き取り検体、痰、気管支肺胞洗浄液、組織試料、尿または脊髄液を含むことができる。他の適切な患者試料およびその抽出方法は当業者には周知である。試料を採取した「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。試料が患者試料と特に言わなければ、この用語には、他の供給源から採取した試料も含まれる。例には、表面からの拭き取り検体、水試料（例えば、下水、海水、湖水、飲用水）、食品試料、化粧品、医薬品、発酵製品、細胞および微生物培養物および微生物の検出が所望される他の試料が含まれる。
【００７６】
他の態様では、本発明の方法で使用するためのキットを提供する。好ましくは、このようなキットには、標的ポリ核酸が供給された陽性対照の一部を形成しないという条件で、試験すべき標的ポリ核酸を除く、本発明の方法を実施するために必要な成分全てが含まれる。
【００７７】
本発明による方法で使用するためのキットには、以前に記載したように、ポリ核酸ポリメラーゼ、この核酸ポリメラーゼの基質および標的ポリ核酸の等温増幅に適したプライマーが含まれることが好ましい。より好ましくは、このキットはさらに、緩衝試薬、例えば、マグネシウムイオン源、またはベタインなどのＮＡＡＴの性能を向上させるための当技術分野で知られている添加物、またはトレハロースなどのキット試薬の有効期間を向上させることが知られている添加物またはアジ化ナトリウムなどの試薬の保存を助けることが知られている添加物を含む。あるいは、本発明の方法で使用するためのキットは、これらの成分および／または追加の成分のいくつかのみを含んでもよい。試料およびキットから除外された任意の他の成分は、その後使用中にキットに添加してもよい。
【００７８】
ＢＡＲＴをポリ核酸の検出のために使用するとき、熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素、例えば、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＰＰｉをＡＴＰに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子、例えば、アデノシン５’ホスホ硫酸をキットに含めてもよい。したがって、一実施形態では、ＢＡＲＴで使用するためのキットは、核酸ポリメラーゼ、ｂ）少なくとも１種のステムプライマー、ｃ）試験試料の等温増幅に適した少なくとも２種の相互プライマー、ｄ）熱安定性ルシフェラーゼ、ｅ）ルシフェリン、ｆ）ＡＴＰスルフリラーゼおよびｇ）アデノシン５’ホスホ硫酸を含む。
【００７９】
好ましくは、キットの成分の少なくとも１つは凍結乾燥されているか、またはキット中で保存するために適した別の形態である。より好ましくは、キットの全成分は凍結乾燥されているか、または保存に適した１つまたは複数の形態である。このような他の形態には、安定化要素が添加された成分、および／またはキットの成分を含有する冷蔵した、または凍結したマスターミックスが含まれる。
【００８０】
全般
数字の値ｘに関して「約」という用語は任意で、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００８１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸから構成されるか、または追加的なもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでいてもよい。
【００８２】
ＢＡＲＴとは、試料中に存在する鋳型ポリ核酸の量を測定する方法を意味し、増幅反応から生じた無機リン酸の存在を検出し、試料中の鋳型ポリ核酸の量を示す。
【００８３】
本発明の様々な態様および実施形態をここで実施例によってより詳細に説明する。詳細の改変は、本発明の範囲を逸脱することなく行ってもよいことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】２個のプライマーのみ（図１ａ）または数個のプライマー（図１ｂ）のいずれかを使用した指数関数的増幅に一般的に必要なポリヌクレオチド上の２つの領域を示す。これらの領域に関して、本発明の対象であるポリヌクレオチドのステム領域を図１ｃに明示する。図１ｄは、これらの方法によって形成された予測された第１世代アンプリコンにおける、本明細書でＬＡＭＰおよびＴＲＡと称したＮＡＡＴのステム領域を明白に示しており、これは、ステム領域が分子内ループの形成に関与したアンプリコンの領域の間に存在することを示している。実際に、ＬＡＭＰおよびＴＲＡは異なった第１世代を表すが（関連する特許出願において）、その構造は実際には同一であることに注意されたい。図１ｅは、標的鋳型上の本明細書でＬＡＭＰおよびＴＲＡと称するＮＡＡＴのステム領域を明白に示している。
【００８５】
【図２】１個、２個またはそれ以上のステムプライマーをステム領域中に配置することができる様々な手段を示す。
【００８６】
【図３】主要アンプリコン（図３ａ）、第１世代アンプリコン（図３ｂ）および次世代アンプリコン（図３ｃ）の生成を含む本明細書で言及した様々な種類のアンプリコンの生成を示す。
【００８７】
【図４】ＬＦＰがコンカテマー構造を形成することができる方法を示す。最初の場合では、５’末端に逆方向反復を有する主要アンプリコンが形成され（図４ａ）、したがって、図４ａ（ｉｉ）をよく見ると、主要アンプリコンの５’末端から、Ｆ１領域、さらにこのアンプリコンに沿って、同じ鎖内にこの領域の相補体、Ｆ１ｃ領域（この図および以下の図における小文字のｃは、プライマー結合領域の相補体を示す）があることが分かる。主要アンプリコンを１本鎖にし、別のプライマーによるコピーに利用されるようにするための特定のＮＡＡＴによってもたらされる機構は図４ａでは明らかではないが、得られた第１世代アンプリコンを示す図４ａ（ｉｉｉ）につながる２つの黒い矢印によって表されている。 ＬＦＰによって形成された第１世代アンプリコン自体は、さらなるアンプリコンを生成するためのプライマーとして作用することができる。それが行われると、第１世代アンプリコンはコンカテマー構造を形成することができる。コンカテマーが形成し得るおおまかな機構は２つあり、１つは図４ｂで示したように分子内事象を介し、もう１つは図４ｃに示したように分子間事象を介する。いずれの場合においても、この方法によってコンカテマー内にアンプリコンの１本鎖領域が生成されることに注意し、図４ｂ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）および４ｃ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の領域Ｆ２を参照されたい。これらはさらにＬＦＰを結合することができる。その後の工程については図８を参照されたい。
【００８８】
【図５】図５は、コンカテマー形成に必要な逆方向反復が既にヘアピンプライマーに備わっており、ＬＦＰのように鎖伸長を形成する必要がないこと以外は、図４と同一の方法を示す。
【００８９】
【図６】本明細書で言及した様々なプライマーの性質を示す。図６ａでは、プライマーの実質的に大部分または全てがポリヌクレオチド鋳型とのワトソン−クリック塩基対に関与している「単純プライマー」を示す。図６ｂでは、ＬＦＰは、単純プライマーの３’末端の結合部位の３’領域と実質的に同一な追加の５’領域を有し、前記単純プライマーとはどのように異なるかを示している。この結果、このプライマーが伸長すると、プライマーの５’領域と伸長産物の間に逆方向反復が生成される（図４ａ（ｉｉ）も参照されたい）。図６ｃでは、ＳＥＡで使用したヘアピンプライマーを示す。これらのプライマーの５’領域は逆方向反復を含有するため、５’領域がヘアピン構造に折り畳まれることが予測される。このヘアピンは、非常に少ない１本鎖ヌクレオチドを含有する緊密なヘアピンであることが予測され、したがって、この１本鎖領域は別のプライマーと結合するために利用できるとは考えられない。しかし、図６ｄのように実質的なループを形成するためにヘアピンを拡張すると、このループに対するプライマーの結合は起こり得るだろう。
【００９０】
【図７】２種類の異なる増幅技術の結果を並べて示した、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを示しており、１つがＬＡＭＰでもう１つがＴＲＡである。ＬＡＭＰでは、増幅に置換プライマーおよびＬＦＰが使用され（しかしループプライマーは使用されない）、ＴＲＡでは増幅にＬＡＭＰと同じＬＦＰが使用されるが、他のプライマーは存在しない。 ＬＡＭＰおよびＴＲＡのいずれもコンカテマーアンプリコンをもたらすことは容易に認めることができる。さらに、アンプリコンの大きさは見かけ上同一である。これは、ＴＲＡおよびＬＡＭＰが共通のコンカテマー化機構を使用していることを示している。
【００９１】
【図８】既に生成したループにさらにＬＦＰを結合する効果を図８に示す。図８ａは、第１世代アンプリコンの（または次世代アンプリコンのための）分子内自己プライミングから形成されたループへのＬＦＰ結合を示す。図８ｂは、分子間で形成されたループにおける同様の結合を示す。いずれの場合においても、新たに結合したＬＦＰの伸長は、反対の鎖が１本鎖になる原因となる（図８ａ（ｉｉ）および図８ｂ（ｉｉ））。図９は、ステムプライマーがどのようにこれらの領域に結合できるかを示している。図８ｃは、ヘアピンプライマーの改変（図８ｃ（ｉ））がプライマーの３’末端と同じ配列を含有する本質的に１本鎖であるループを形成するように行われているならば（図８ｃ（ｉｉ）に見られるように）、得られた次世代アンプリコンはさらなるヘアピンプライマーを結合するための１本鎖ループを形成するだろうことを強調している（図８ｃ（ｉｉｉ））。
【００９２】
【図９】分子内（図９ａ（ｉ））または分子間（図９ａ（ｉｉ））いずれかの次世代アンプリコン形成のために、アンプリコンステムの領域は１本鎖としてステムプライマーと結合するために曝露され、利用することができる。これは、ＬＦＰによって形成される相互ループの場合でもあり（すなわち、また生成する図８ａで示したループの相互鎖）、このループは、ＬＦＰと同じセンスであるのでＬＦＰには結合できないが、使用したいわゆる「ループプライマー」の１つは結合することができる（図９ｂ（ｉ））。ループプライマーの伸長はまた、アンプリコンステム１本鎖の領域を形成し、したがってステムプライマーが結合するために利用することができる（図９ｂ（ｉｉ））。
【００９３】
【図１０】ＳＥＡについて、アンプリコンの自己伸長を介した次世代アンプリコンの再コピーがまた、ステムプライマーによる結合のために利用可能なアンプリコンステムの領域をどのように形成するのかを示す。
【００９４】
【図１１】リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）系における３種類の異なるプライマーのセットについて、ＴＲＡおよびその後のＢＡＲＴでのステムプライマー使用による速度増加を示す。ＬＦＰおよびステムプライマーの位置を図１１（ｉ）に示す。図１１（ｉｉ）〜図１１（ｉｖ）は、ＬＦＰの遅い、中程度および速いセットに応じて、ステムプライマーが存在しない場合の速度（左のパネル）とステムプライマーが存在する場合の速度（右のパネル）のＢＡＲＴによる比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９５】
【図１２】リステリア・モノサイトゲネス系におけるＴＲＡでのステムプライマーの使用（図１２ａ（ｉ））をどのように３種類の独立した増幅方法に分解することができるかを強調しており、そのうちの１つはＴＲＡで、他の２つはＡＴＲＡである（図１２ａ（ｉｉ））。両ＡＴＲＡ、ＴＲＡおよびプライマーの全組み合わせの速度のＢＡＲＴ比較を図１２ｂ（ｉ）〜（ｉｖ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９６】
【図１３】３種類の異なる増幅反応を組み合わせたＢＡＲＴの速度論モデルを示す。図１３ａでは、迅速なＮＡＡＴを２種類の非常に遅いＮＡＡＴと組み合わせると、増幅の全体速度（すなわち、３種類の増幅反応の速度の合計）が３種類のＮＡＡＴの最も迅速な時期と同一のＢＡＲＴピークをもたらすことを認めることができる。図１３ｂでは、迅速なＮＡＡＴを２種類のやや迅速なＮＡＡＴと組み合わせること以外は１３ａの通りで、この場合、増幅の全体速度は、ごくわずかに影響を受けるのみで、ＢＡＲＴピークはほんの数分早くなる。図１３ｃはいわゆる遅いＮＡＡＴが今度は最も迅速なＮＡＡＴと同じ速さであること以外は１３ａおよびｂの通りであり、組み合わせた増幅の全体速度はまたごくわずかな影響を受けるのみで、ＢＡＲＴピークはほんの数分早くなる。図１３は、いくつかの異なる指数関数的方法を同時に行う場合、ステムプライマーを使用して認められるように、著しく早いＢＡＲＴピークは認められないことを示している。これによって、別個のより遅い、または類似の速度の方法を追加するよりも、特定のＮＡＡＴで使用すると、ステムプライマーは増幅の本質的な速度を根本的かつ顕著に増加させるように作用することが強調される。
【００９７】
【図１４】図１４の（ａ）から（ｇ）のそれぞれについて、各図の部分（ｉ）は、２本鎖鋳型について、様々なＮＡＡＴによって使用されたプライマーのプライマー結合部位の位置を示している。フォワード相互結合領域と関係のあるプライマーは、Ｆで示され、リバース相互結合領域と関連のあるプライマーはＲで示される。各図の部分（ｉｉ）は、特定のＮＡＡＴによって使用される様々なプライマーがそれぞれの鎖のどこに結合するかを示し、ステムプライマーと結合することが可能な位置も示されるが、ステムプライマーの正確な位置および使用したステムプライマーの数は、図２に詳述したように大きく異なり得る。 図１４ａは、ＴＲＡにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｂは、ＬＡＭＰにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｃはループプライマーも使用するＬＡＭＰの改善された表現型において作用するステムプライマーを示している。図１４ｄは、ＳＥＡにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｅは、ＳＭＡＰにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｆは、ＡＴＲＡにおいて作用するステムプライマーを示し、図１４ｇはネステッドＬＦＰを備えたＴＲＡの変形形態で作用するステムプライマーを示している。
【００９８】
【図１５】サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）系におけるＴＲＡでのステムプライマーの存在下および非存在下におけるネスティングＬＦＰの影響を示す。 図１５ａは、ステムによって加速されたＴＲＡ（図１５ａ（ｉ））とステムによって加速されたＬＡＭＰ（図１５ａ（ｉｉ））およびステムによって加速されたネステッドＴＲＡ（図１５ａ（ｉｉｉ））の比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。 図１５ｂ（ｉ〜ｉｖ）は、ステムプライマー非存在下および存在下それぞれに応じた内部ＬＦＰ、外部ＬＦＰ、内部および外部ＬＦＰの両方を有するＴＲＡのＢＡＲＴ速度の比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９９】
【図１６】リステリア・モノサイトゲネス系において、ＬＡＭＰ、次いで、ＢＡＲＴでのステムプライマーを用いる速度増加を示す。全プライマーの位置を図１６（ｉｉｉ）に示し、ステムプライマー非存在下および存在下でのＢＡＲＴによる速度の比較を図１６（ｉ）および図１６（ｉｉ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【０１００】
【図１７】リステリア・モノサイトゲネス系においてＴＲＡ、次いでＢＡＲＴでの、ステムプライマーを用いる速度増加を示しており、ステムプライマーは前述の実施例と比較してステムの異なる領域に位置している。全プライマーの位置を図１７（ｉｉｉ）に示し、ステムプライマー非存在下および存在下での速度のＢＡＲＴによる比較を図１７（ｉ）および図１７（ｉｉ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【０１０１】
【図１８】例えば、ＬＡＭＰにおけるループプライマーと比較してステムプライマーを配置するのは自由度が大きいことを示す。ループプライマーは、厳密にいうとＦ１とＦ２部位またはＲ１とＲ２部位のいずれかの間に限定される。ループが十分な長さでないか、またはループプライマーがプライマー二量体によって非特異的増幅を引き起こす傾向があるために、配列に１個または両方のループプライマーを効率よく配置することができないならば、代わりのループプライマー設計を選択する余地はほとんど残されていない。ステムプライマーは、ステムのどこにでも配置することができ、どちらの方向にすることもでき、いかなる非特異的なプライマーの二量体化も回避する一方で、可能な設計を選択する余地が広く、最も効率よく最適化することができる。
【０１０２】
【図１９】適切なプライマー結合部位が四角で囲った領域で示されている、仮定のポリヌクレオチド配列を（ｉ）に示す。しかし、灰色の領域は、おそらく生物のゲノムのこの部分の配列の保存性が良好なため、白色の領域よりも実質的に好ましい結合部位である（例えば、異なる株間で配列変動が著しい病原体の診断試験を設計するとき関係がある）。図１９（ｉｉ）において、およびループプライマーを使用したＬＡＭＰに関しては、ＬＡＭＰのこの表現型で使用されるプライマーに様々な領域が割り当てられている。プライマーのうち４つは、最適ではない結合部位に配置されなければならず、最適な１つの結合部位は全く使用されないことに注意されたい。これは明らかに理想的ではない。別の方法では、図１９（ｉｉｉ）に示したように、最適な部位全てが使用されるようにプライマーが配置されることであろう。しかし、この表現型では、Ｒ２およびＲ１部位が非常に密接で、ループＲプライマーのための部位が全て失われることを意味しており、本発明者らはまた、Ｒ１およびＲ２部位が非常に密接な場合（または相互Ｆ１およびＦ２部位）、おそらく形成されたループ内の立体的妨害のために、最適ではない増幅が生じる可能性があることを確認し、本発明者らはさらに、一般的にループプライマーが置換プライマーよりも増幅速度を増加させることを観察した。したがって、図１９（ｉｉｉ）におけるプライマーの割り当ては特に理想的ではないと予測することができる。しかし、図１９（ｉｖ）では、ステムプライマーの使用を採用することによって、最適な結合部位全てを使用することができ、ループおよび置換プライマー部位全てを利用することができる。したがって、ステムプライマーはプライマー設計のための柔軟性を増加させた。
【０１０３】
【図２０】置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）プライマー、ループプライマーおよびステムプライマーのいずれについても示したように、「単純プライマー」以外の様々な種類のプライマーを使用することが可能である。多くの可能な組み合わせのうち３つを図２０（ｉ）から（ｉｉｉ）に示すが、フォワード相互プライマー結合領域およびステム領域のみを示している。（ｉ）では、ＬＦＰ、ヘアピンプライマーおよび単純プライマーの組み合わせを使用しており、（ｉｉ）では、ループプライマーはＲＮＡの領域またはニッカーゼの切断部位のいずれかを含有する改変された単純プライマーによって表され、（ｉｉｉ）では、ＬＦＰ、ヘアピンプライマーおよび切断可能な単純プライマーのさらに可能な組み合わせを示している。多くの他の可能な組み合わせがあることは十分に明らかである。
【０１０４】
【図２１】ステムプライマーがコンカテマーに作用する場合、ステムプライマーの作用によって指数関数的に増幅可能なアンプリコンが生成されるのみであることを示す。図２１の左には、ステムプライマーの第１世代アンプリコンに対する作用を示しており、得られたアンプリコンがリバース相互プライマー結合領域のみを含有し、指数関数的増幅に必要なフォワード相互プライマー結合領域を含有しないことが分かる。図２１の右には、対照的に、ステムプライマーがコンカテマーによって伸長できるとき、ステムプライマー２についてはあてはまるが、ステムプライマー１にはあてはまらないように、得られたアンプリコンはフォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の両方を有し、したがって、指数関数的増幅のための基質であることが分かる。
【０１０５】
【図２２】ＢＡＲＴ−ＮＡＡＴの一例を示しており、この技法の定量性を強調している。ＢＡＲＴ技術は、生物発光出力が瞬間の増幅速度を反映しているので、ＮＡＡＴにおける増幅速度を追跡するために有効な手段となっている。
【０１０６】
【図２３】（ｉ）にＭＲＳＡと関係があるＳＣＣｍｅｃカセットの一部を示す。ＳＣＣｍｅｃ移動性遺伝子要素を、ＭｅｃＡ遺伝子を介して抗生物質メチシリンに対する耐性を担うスタフィロコッカス・アウレウスのＯｒｆＸ遺伝子の保存された領域に組み込む。したがって、ＭｅｃＡ遺伝子およびＯｒｆＸ遺伝子は同じＤＮＡ鎖上にあるが、配列におけるＭｅｃＡ遺伝子とＯｒｆＸ遺伝子の距離はＳＣＣｍｅｃの異なるバージョン（したがって、ＭＲＳＡの異なる株）の間では大きく変動し得る。したがって、ＭＲＳＡの診断アッセイにおいて、特定のＮＡＡＴの相互プライマー結合領域としてＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子を使用することは、技術的に挑戦的であることが分かる。例えば、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子が５００塩基対より遠く離れている場合、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子がフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位のための部位として使用されるならば、ＬＡＭＰは任意の産物を増幅することはできないようである（ｉｉ）。しかし、ステムプライマーはＬＡＭＰなどのＮＡＡＴが標的を増幅する能力を劇的に向上させ、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸをフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位として使用するアンプリコンの「ステム」がいくつかのステムプライマーによって標的化可能となり、ステムプライマーがフォワードおよびリバース相互プライマーと連結して働くことが示されたので、したがってステムプライマーはＬＡＭＰなどの適切なＮＡＡＴを使用してＭＲＳＡの直接的検出を可能にすることができる（ｉｉｉ）。ＭｅｃＡ遺伝子とＯｒｆＸの間の領域に変更をもたらすために様々なステムプライマーを使用することができる。 前述のようなステムプライマーの使用は、ＭＲＳＡの存在を示すためにＯｒｆＸおよびＭｅｃＡ以外のＳＣＣｍｅｃの領域のみに頼る既存の技法よりも有益である。これは、スタフィロコッカス・アウレウスの一部が、ＭｅｃＡ遺伝子を有さず、したがって、実際にはＭＲＳＡではないＳＣＣｍｅｃ挿入を含有するからである。本発明の方法は、同じＤＮＡ鎖上にＯｒｆＸおよびＭｅｃＡの両方を必要とするので、ＳＣＣｍｅｃは含有するがＭｅｃＡ遺伝子を含有しない株から偽陽性が生じる可能性はない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
得られたアンプリコンがいずれもコンカテマーで、見かけ上同一であることを示すＬＡＭＰとＴＲＡの比較
サルモネラ・エンテリティディス侵入性Ａ遺伝子の２ｋｂ断片は（コピー数は反応によって１０８から１０２の間で変化した）、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）によって、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴおよびＴＲＡ−ＢＡＲＴにおいてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）０．３２Ｕ／μｌおよびホタルルシフェラーゼ１１．２μｇ／μｌを使用すること以外は実施例２と同一の条件下で６０℃で増幅した。反応混合物は、Ｒ−ＬＦＰ（６）およびＦ−ＬＦＰ（６）プライマーそれぞれ０．８μＭおよび置換プライマーＲＤ（２）およびＦＤ（２）０．２μＭを含有した。各反応の全量は２０μｌであった。反応は１００分行った。
【０１０８】
ＬＦＰプライマーセット６（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
Ｒ−ＬＦＰ（６） ５’−ａａｃ ｃｔｔ ｇｔａ ｇａｇ ｃａｔ ａｔｔ ｃｇｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｃｃｇ ｃｃａ ｔｔｇ ｇｃｇ ａａｔ ｔｔａ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（６） ５’−ｔｃｔ ｃｔｔ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃａｃ ａａｔ ｇｔｔ ｔｔｔ ａａｇ ｃｇａ ａｃｇ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃｇ
置換プライマーセット２（ＲＤは標的配列上のＲ３ｃに結合し、ＦＤはＦ３に結合する）
ＲＤ（２） ５’−ｃａｔ ｔａｃ ｔｇｃ ｔｃｇ ｔａａ ｔｔｃ
ＦＤ（２） ５’−ａｔａ ｔｃｔ ｇａａ ｇｔｔ ｔｔｇ ｃａｇ ｃ
【０１０９】
ゲル上のパターンは、置換プライマー、ＲＤおよびＦＤの有無には左右されず、ＬＦＰによってのみ特徴付けられる（図７）。ＬＡＭＰおよびＴＲＡの両方の増幅は、全く同じパターンのラダーを生じ、類似の機構によって生じることを強く示している。置換プライマーは、ＬＡＭＰ増幅の開始段階では重要な役割を担うことができるが、その後のアンプリコン増大段階ではいかなる効果も示さない。
【０１１０】
実施例２
異なる効果のＬａｍｐプライマーとステムプライマーのリステリア・モノサイトゲネスＴＲＡに対する効果
リステリア・モノサイトゲネスインターナリン（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｎ）Ａ遺伝子の断片を含有するｐＬＳ−プラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）によってＴＲＡ-ＢＡＲＴを５５℃で使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、１０８または１０４を含む１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の、Ｒ−ＬＦＰ、１、２もしくは３およびＦ−ＬＦＰ１、２または３プライマーそれぞれ０．８μＭ（遅い、中程度または速い）、ステムＲプライマー０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ）、ｄＮＴＰ（合計）０．８ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．１６Ｕ／μｌ（ＮＥＢ）、ルシフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アデノシン５’−ホスホスルフェート０．２５ｍＭ（Ｂｉｏｌｏｇ）、ホタルルシフェラーゼ５．６μｇ／μｌ（ＵｌｔｒａＧｌｏｗ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰ-スルフリラーゼ０．３７５Ｕ／ｍｌ(ＮＥＢ)。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。標的鋳型に対するプライマーの相対的方向を図１１（ｉ）に示すが、以下に挙げた配列から分かるように、実際に使用したプライマーは、Ｂ２ｃおよびＦ２結合領域の配列が大きく異なる。
【０１１１】
（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
遅いＬＦＰセット１
Ｒ−ＬＦＰ（１） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ａａｇ ａａａ ｃａａ ｃｃａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｇ
Ｆ−ＬＦＰ（１） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ａｔｔ ａｔｃ ａａａ ｃｇｔ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｔａ ｇｃ
中程度のＬＦＰセット２
Ｒ−ＬＦＰ（２） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ａｔｇ ｃｔａ ａｇｔ ｔｔｃ ａｔｇ ｔｇｇ ａｃｇ
Ｆ−ＬＦＰ（２） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｔｔ ｔｇａ ｇａｔ ｇｔｔ ｇｔｔ ａｃａ ｃｃｇ ｔｃ
速いＬＦＰセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１１２】
ステムプライマーの存在下では、いずれのＬＦＰプライマーセットでも、または存在する標的のいずれの量でも、増幅がより速く生じた。遅い、および中程度のＬＦＰプライマーセットでは（それぞれ図１１（ｉｉ）および（ｉｉｉ））、ステムプライマーがない場合、標的の１０８コピーのみが９２分および７３分に対応するピークで検出でき、一方、ステムプライマーが存在する場合、１０８コピーが３９分および４１分にピークとして検出でき、同様にアッセイ時間内に５５分および６２分のピークを有する１０４が検出できた。速いプライマーセット３の場合（図１１（ｉｖ））、３９分および６０分にピークのある低コピー数および高コピー数の両方が検出され、一方、ステムプライマー存在下では、より早い２２分および３４分のピークが検出された。この実施例は、様々な有効性、長さ、位置、Ｔｍ、ＧＣの豊富さ、形成するループの大きさおよび他のパラメータのＬＦＰプライマーのセットにステムプライマーを添加することによって、増幅の本質的な加速を実現できることを示している。
【０１１３】
実施例３
対称、非対称およびステムによって加速された対称リステリア・モノサイトゲネスＴＲＡの比較
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ（ＩｌｎＡ）遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用い、Ｒ−ＬＦＰ（３）、Ｆ−ＬＦＰ（３）、ＳｔｅｍＢ（１）およびステムＦ（１）プライマーそれぞれ０．８μＭの異なる組み合わせを使用して増幅した。
【０１１４】
ＬＦＰプライマーセット３
（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１１５】
両方の非対称増幅は非常に遅く、８４分および７５分それぞれにピークを有するリステリアＩｎｌＡ標的の高コピー数のみ検出した。ＬＦＰの同じセットを含む対称ＴＲＡは、１０８コピーについては３８分のピークおよび１０４コピーについては５６分のピークでより速い増幅速度を示した。ステムプライマーをＴＲＡの対称表現型に添加すると、高コピー数は２３分にピークを示し、低コピー数は３４分にピークを示し、したがって、ステムプライマーがない場合に認められる速度と比較して著しい増加が示された（図１２ｂ）。３種類の遅い速度の単純な加算では、数学的なモデル化によっても示されたように、増幅速度のこのような著しい増加を説明するには十分ではないだろう（実施例４）。
【０１１６】
実施例４
シミュレートしたＢＡＲＴ速度曲線は、モデル化した指数関数的方法のための標準的リチャード曲線（Ｒｉｃｈａｒｄ'ｓ ｃｕｒｖｅ）式を使用してマイクロソフトエクセルで作成した（図１３）。増幅の速度論は、異なる速度論を有する別の増幅方法のためにモデル化した。異なる、類似したまたは同一の速度論の別個の増幅方法を組み合わせる効果も、図１３に示す。図１３ａ、ｂおよびｃの比較から分かることは、別個の異なる増幅方法を組み合わせることの増幅の全体速度に対する全体的効果は、３種類の速い増幅方法を組み合わせても、驚くほど小さいことである（図１３ｃ）。これは、ステムプライマーの効果が、付加的な増幅方法を単純に付加するよりも増幅速度を根本的に増加することであることを強調している。
【０１１７】
実施例５
（Ａ）リステリア・モノサイトゲネスのステムによって加速されたＴＲＡに対する置換プライマーおよび外部ループ形成プライマーの効果の比較
リステリア・モノサイトゲネスＩｎｌＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。Ｒ−ＬＦＰ（３）、Ｆ−ＬＦＰ（３）、ステムＦ（１）およびステムＲ（１）それぞれ０．８μＭを含有する反応とＯｕｔｅｒＲ（１）およびＯｕｔｅｒＦ（１）またはＯｕｔｅｒＲ−ＬＦＰ（７）およびＯｕｔｅｒＦ−ＬＦＰ（７）をそれぞれ０．８μＭ添加した反応の比較を行った。
【０１１８】
ＬＦＰプライマーセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
置換プライマーセット１
ＲＤ（１） ５’−ｔａａ ｔｇｃ ｔａａ ｇｔｔ ｔｃａ ｔｇｔ ｇ
ＦＤ（１） ５’−ａｔａ ａｔｃ ｔａｃ ｔｇｔ ｔｔｇ ａｇａ ｔｇ
ＯｕｔｅｒＬＦＰプライマーセット７
Ｒ−ＬＦＰ（７） ５’−ｃｔｔ ｃｔｔ ｔｇｇ ｔｔｇ ｔｔｔ ｃｔｔ ｔｇｃ ｃｔｔ ｔｔｔ ｇｃｔ ａａｇ ｔｔｔ ｃａｔ ｇｔｇ ｇａｃ
Ｆ−ＬＦＰ（７） ５’−ｇｔａ ｔｔａ ａｃａ ｇｃｔ ａｃａ ｃａｇ ｃａａ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇａｇ ａｔｇ ｔｔｇ ｔｔａ ｃａｃ ｃｇｔ ｃ
【０１１９】
この実施例においてステムによって加速されるＴＲＡは、コピー数１０８および１０４の両方が２３分および３５分のそれぞれにピークがあるＩｎｌＡ遺伝子の迅速な増幅を生じる。異なる２つの外部プライマーセットを添加すると、高コピー数および低コピー数のピーク時間が１８分および３１分に対応して減少した（図１５ａ）。置換プライマーをＬＦＰに置換すると、増幅反応が迅速に進行する（図１５ａ（ｉｉｉ））。
【０１２０】
（Ｂ）ステムによって加速されるサルモネラ・エンテリティディスネステッドＴＲＡ
サルモネラ・エンテリティディス侵入性Ａ（ＩｎｖＡ）遺伝子の断片を含有するｐＬＳ−プラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）を使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、１０８または１０４を含む１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の、以下に示したような内部および／または外部リバースおよびフォワードＬＦＰそれぞれ０．８μＭ、ＳｔｅｍＢ０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ）、ｄＮＴＰ（合計）１．６ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．１６Ｕ／μｌ（ＮＥＢ）、ルシフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アデノシン５’−ホスホスルフェート０．２５ｍＭ（Ｂｉｏｌｏｇ）、ホタルルシフェラーゼ５．６μｇ／μｌ（Ｕｌｔｒａ Ｇｌｏｗ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰ-スルフリラーゼ０．３７５Ｕ／ｍｌ(ＮＥＢ)。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。
【０１２１】
内部ＬＦＰプライマーセット４
Ｒ−ＬＦＰ（４） ５’−ｇｇａ ｇｃａ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｇｔ ｔａｔ ａｔｔ ｔｇｔ ｔｔｔ ｃｇｃ ｃａｔ ｔｇｇ ｃｇａ ａｔｔ ｔａｔ ｇ
Ｆ−ＬＦＰ（４） ５’−ｃａｃ ａａｔ ｇｃｇ ａｇｃ ｇｃｔ ｔｃｃ ｔｔｔ ｔｔａ ａｇｃ ｇａａ ｃｇｔ ｇｔｔ ｔｃｃ ｇ
外部ＬＦＰプライマーセット５
Ｒ−ＬＦＰ（５） ５’−ｃｇａ ａｔｔ ａｃｇ ａｇｃ ａｇｔ ａａｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ｔｃｃ ｔｃａ ａｃｔ ｔｃａ ｇｃａ ｇ
Ｆ−ＬＦＰ（５） ５’−ｃａａ ａｃｇ ｃｔｇ ｃａａ ａａｃ ｔｔｃ ａｇｔ ｔｔｔ ｔｔａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｃ ｔｃａ ｇａｃ ａｔｇ
ステムプライマーセット２
ステムＦ（２） ５’−ｃｃｔ ｔｇｔ ｇｇａ ｇｃａ ｔａｔ ｔｃｇ
ステムＢ（２） ５’−ｇａｃ ａｔｃ ｔｔｔ ｔｔｃ ｔｃｔ ｔｇｇ ｃｇ
【０１２２】
このサルモネラ・エンテリティディスＩｎｖＡ ＴＲＡ系では、個々に使用したＬＦＰの両セットは非常に遅いので、アッセイの１００分以内の標的コピー数が１０８の高さでも検出することができなかった。ステムプライマーが存在しない場合のネステッドＴＲＡでは、増幅は、６８分にピークを有する高標的コピー数のみを検出するのに十分な速さであった。ステムプライマーを添加すると、速度の増加が生じ、ピーク時間３４分および６１分に対応する高および低標的コピー数の両方が検出可能になった（図１５）。この実施例は、様々な標的およびＬＦＰの様々な表現型について、ステムプライマーによる増幅の加速が認められることを示している。
【０１２３】
実施例６
ステムによって加速されたリステリア・モノサイトゲネスＬＡＭＰ
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。完全なＬＡＭＰプライマーミックス(各ＬＦＰ０．８μＭ、各ループプライマー０．４μＭ、各置換プライマー０．２μＭ）を含有する反応とステムＲプライマー０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭを添加した反応とを比較した。
【０１２４】
ＬＦＰプライマーセット１
Ｒ−ＬＦＰ（１） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ａａｇ ａａａ ｃａａ ｃｃａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｇ
Ｆ−ＬＦＰ（１） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ａｔｔ ａｔｃ ａａａ ｃｇｔ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｔａ ｇｃ
ループプライマー
ループＲｃ５’−ｃａｇ ｔｃａ ａｔａ ａａｔ ｔｃｃ ｃａｇ ｃ
ループＦ ５’−ｃａｔ ｃｇａ ｔｔｔ ａｔａ ｔｇｃ ｇｃａ ａｔ
置換プライマーセット１
ＲＤ（１） ５’−ｔａａ ｔｇｃ ｔａａ ｇｔｔ ｔｃａ ｔｇｔ ｇ
ＦＤ（１） ５’−ａｔａ ａｔｃ ｔａｃ ｔｇｔ ｔｔｇ ａｇａ ｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１２５】
これは、リステリア・モノサイトゲネスＩｎｌＡ標的の高および低コピー数を非常に迅速に検出したＬＡＭＰ増幅の一例である。ステムプライマーがないと、１０８コピーは１７分にピークがあり、１０４コピーは２６分にピークがあった。ステムプライマーを添加すると反応がさらにいっそう加速され、ピーク時間が１０８コピーでは１３分に、１０４コピー数では１９分に短縮した（図１６）。この場合、加速は、今まで開発された最も効率的な等温増幅系のひとつであるＬＡＭＰによって実現した。検出時間の短縮は、一般的に使用時点（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｕｓｅ）での適用のため、および特に医学的診断におけるケア時点（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）での検査にとって、非常に重要である。
【０１２６】
実施例７
ステムプライマーの異なる方向によって加速したリステリア・モノサイトゲネスＴＲＡ
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを、５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いてＴＲＡ−ＢＡＲＴで増幅した。各０．８μＭで添加したステムＲ（３）およびステムＦ（３）プライマーの存在下および非存在下でのみ、Ｒ−ＬＦＰ（３）およびＦ−ＬＦＰ（３）プライマーを用いて実施した反応の比較を行った。
【０１２７】
ＬＦＰプライマーセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット３
ステムＦ（３） ５’−ａｇｔ ｔｃｃ ｇｃｃ ｇｇｔ ｔｔｇ
ステムＲ（３） ５’−ａｃａ ｔｔｔ ｇｔｔ ｇｇｇ ｔｇｇ ｔｔｔ ｇ
【０１２８】
この実施例では、アンプリコンのステム上の様々な位置のステムプライマーの加速効果を実施例２で示したものと比較して示した。ＴＲＡ-ＢＡＲＴは、ステムプライマーがなくても、ピーク時間３９分および６９分に対応する高および低コピー標的の両方を検出した。ステムプライマーを添加すると反応が著しく加速され、ピーク時間が２２分および３９分に短縮した。ループプライマーとは異なり、ＬＦＰによって形成したループによって位置を厳密に決定し、方向を固定すると、ステムプライマーは内部Ｆ１〜Ｂ１領域の間のどこにでも位置することができ、任意の方向にすることができる。加速効果は、ステムプライマーの位置または方向とは関係なく認められる（図１７）。
【０１２９】
配列
リステリアＩｌｎＡ遺伝子断片（配列番号１）
GGCAATTTTTAATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATTGACTGAACCAGCTAAGCCTGTAAAAGAAGGTTATACATTTGTTGGGTGGTTTGATGCCCAAACCGGCGGAACTAAATGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAATGACATCGATTTATATGCGCAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACGTTTGATAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCA
サルモネラＩｎｖＡ遺伝子断片（配列番号２）
TTTGCGAATAACATCCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTGCTCGTAATTCGCCGCCATTGGCGAATTTATGACAAATATAACGCGCCATTGCTCCACGAATATGCTCCACAAGGTTAATGACATCTTTTTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAGCGCTTCCATAATTAACTTCATATTACGCACGGAAACACGTTCGCTTAACAAACGCTGCAAAACTTCAGATATACGTTGTACCGTGGCATGTCTGAGCACTTCTTTAAGTAAATCAGGAAATTTCGCTTCCAGTTGGTCCAGCATATGTTTTGTTTCCTGAATACC
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、その完全な内容が本明細書に参照により組み込まれる、２００９年６月１５日出願の英国特許出願第ＧＢ０９１０３０２．９号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。特に、試験試料の迅速かつ特異的な増幅および検出を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅技術（ＮＡＡＴ）は、研究および診断の多くの領域において非常に有益で、強力なツールである。ＮＡＡＴ技法によって、高い感度および特異性で試料中の核酸を検出および定量すること、ならびに試料中の核酸を定量分析することが可能である。
【０００４】
核酸増幅は、特定のＮＡＡＴを実施した後の増幅産物の存在によって示される、試料中の特定の鋳型核酸の存在を決定するために使用することができる。逆に、増幅産物が存在しないことは、試料中に鋳型核酸が存在しないことを示す。このような技法は、診断用途において、例えば、病原体が試料中に存在するかどうかを決定するために、非常に重要である。
【０００５】
先行技術は、核酸を増幅するための様々な熱サイクリング技法および等温技法を記載している。熱サイクリング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、温度サイクリングを使用してＤＮＡ合成の反復サイクルを行わせ、鋳型ＤＮＡの元の量と比例した大量の新規ＤＮＡの合成をもたらす。増幅反応を行わせるのに熱サイクリングに頼らない等温技法もいくつか開発されている。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用する等温技法は、ＲＮＡ合成工程を含まない増幅反応のために開発された。同様に、ＲＮＡ合成工程を含む増幅反応のために、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよび／またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用しうる等温技法が開発された（例えば、Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Volume 27,Issue 3 March 2008,pages 224-243を参照されたい）。
【０００６】
使用した増幅技術によって生成したポリ核酸は、総称してアンプリコンと呼ばれる。生成したアンプリコンの性質は、実施したＮＡＡＴによって大きく異なる。例えば、ＰＣＲなどのＮＡＡＴは、大きさおよび配列が実質的に同一なアンプリコンを生成することができる。他のＮＡＡＴは、非常に様々な大きさのアンプリコンを生成し、このアンプリコンは様々な数の反復配列から構成され、したがって様々な長さのコンカテマーの集合体である。このようなコンカテマー由来の反復配列は、実施されているアッセイの対象であるポリ核酸の配列を反映する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＮＡＡＴが、多くの分野、例えば、診断用途において極めて重要であるので、速度、感度および特異性の向上したＮＡＡＴを提供することが当技術分野では引き続き必要である。本発明は、この目標を達成するために、簡単で、対費用効果の高い方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって実現される速度の増加が、特定のＮＡＡＴのためのプライマー設計を不十分なものにする配列に依存した問題によって引き起こされる増幅速度の減少を相殺することができるという利点を有する。このような速度増加によってさらに、増幅速度を高めるための費用の高い代替手段を回避することができるので、特定のＮＡＡＴに基づいたアッセイの費用を低減することができる。
【０００８】
（好ましい具体例の詳細な記載）
本発明は、ポリ核酸の改善された増幅方法を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ポリ核酸を合成する方法であって、
ａ）少なくとも第１および第２の相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
ｂ）第１および第２のセグメントを含む第１のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第１の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントが、第１のプライマーの別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｃ）第１のセグメントを含み第２のセグメントを含んでもよい第２のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第２のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２の領域がループを形成することができるように、含まれてもよい第２のセグメントが第２のプライマー中の別の領域または第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｄ）第１および第２の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも１個のプライマーを提供する工程、
ｅ）ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
ｆ）ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の基礎となっている原理は、１個または複数の「ステムプライマー（ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ）」、すなわち、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の間の領域に結合するプライマーを提供することにより、ある種のＮＡＡＴの速度および感度を著しく高めるということが驚くべきことに見出されたことである。
【００１０】
「フォワード相互プライマー結合部位」および「リバース相互プライマー結合部位」とは、フォワードおよびリバース相互プライマーが結合する鋳型ＤＮＡおよび／またはアンプリコン上の領域を意味する。本明細書で使用した「相互プライマー」または「複数の相互プライマー」という用語は、増幅中に指数関数的に増幅する元の鋳型ポリヌクレオチドの領域を区切るように作用する２個以上のプライマーのことである（図１ａおよび１ｂ）。いくつかの実施形態では、さらなるプライマーがフォワード相互プライマーおよび／またはリバース相互プライマーの５’領域に結合してもよい。このようなさらなるプライマーを使用する場合、フォワード相互プライマー結合部位および／またはリバース相互プライマー結合部位は、これらのさらなるプライマーの結合領域ならびに相互プライマー自体の結合領域を包含してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域の５’にある領域に結合する１個または複数のさらなるプライマーを使用してもよい。このような方法は、例えば、「置換プライマー」または「外部プライマー（ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）」の使用を開示しているＷＯ００２８０８２において開示された。
【００１１】
ＷＯ００２８０８２は、ループ形成プライマー（ｌｏｏｐ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）（ＬＦＰ）の使用について記載しており、ＬＦＰは第１および第２のセグメントを含むものと理解されており、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第２のセグメントがループを形成することができるように第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含んでおり、ＷＯ００２８０８２は、ＮＡＡＴはＬＦＰに加えて２個の「外部プライマー」を使用すると述べている。これらのプライマーの特徴は、「第１の外部プライマー」が鋳型中の「Ｆ２」部位の３’に結合し（すなわち、第１の外部プライマーは「Ｆ３」部位に結合する、図１４ｂ）、「第２の外部プライマー」が第２のＬＦＰの結合領域「Ｒ２ｃ」部位の３’に結合する（すなわち第２の外部プライマーは「Ｒ３ｃ」部位に結合する、図１４ｂ）ことである。したがって、これらのプライマーは、ＬＦＰのプライマー結合部位の５’に存在するアンプリコンのステム領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）には結合しない。
【００１２】
フォワード相互プライマー結合領域とリバース相互プライマー結合領域の間の領域は、アンプリコンの一部を形成することは保証されているが、それ自体は通常プライマー結合部位を提供しない領域である。この領域は、本明細書では、アンプリコンの「ステム領域」と呼ばれる。ステム領域に結合するプライマーは、本明細書では「ステムプライマー」と呼ばれる（図１ｃ、図２ａ〜２ｅ）。ステムプライマーは、ステム領域に結合するプライマーと定義することができる。ステムプライマーはさらに、フォワード鎖上のフォワード相互プライマー結合領域の３’領域およびリバース鎖上のリバース相互プライマー結合部位の３’に結合するプライマーと定義してもよい。相互プライマー結合部位およびステムプライマーの結合部位は、有意に重複していないものと理解される。相互プライマー結合部位およびステムプライマーの結合部位は、全く重複していないことが好ましい。
【００１３】
重複したプライマー結合領域に関して「有意に」とは、プライマー結合部位が１０ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、２ヌクレオチド未満または１ヌクレオチド未満重複していることを意味する。プライマー結合領域が全く重複していないことが好ましい。ステムプライマーはさらにまた、フォワード鎖上のフォワード相互プライマー結合領域の３’領域およびリバース鎖上のリバース相互プライマー結合部位の３’に結合するプライマーと定義することができるが、このプライマー結合領域は、特定のＮＡＡＴによって使用されたプライマー、特にＬＦＰの直接的な結果として生成したいかなる分子内二次構造とも実質的に重複しない（図１ｄ）。
【００１４】
驚くべきことに、ステムプライマーを使用すると増幅速度が著しく増加することが見出された。これによって、例えば、診断試験が短期間に試験結果を出すことができ、診断試験の利用者にとって一般に価値あるものとなり、明らかに有利である。迅速な増幅の他の利点は、偽陽性結果の可能性が減少し、したがって試験の特異性を高めることができることである。本発明者らの経験上、鎖置換ポリメラーゼを使用するＮＡＡＴは、増幅に必要な時間が長くなればなるほど、ますます非特異的増幅が起こりやすくなった。したがって、より迅速な増幅はまた、より正確な結果をもたらすことができる。
【００１５】
ステムプライマーは、より迅速な増幅を提供するだけでなく、少なくとも２つのさらなる重要な利点をもたらす。第１に、ＮＡＡＴ、例えば、以下により詳細に論じるループ媒介等温増幅（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、鋳型リプライミング増幅（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｒｅ−ｐｒｉｍｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（Ｓｅｌｆ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＥＡ）およびＳＭａｒｔ増幅方法（ＳＭＡＰ）の増幅速度を増加させるためにステムプライマーを使用することにより、より迅速な増幅を実現するための費用の高い代替物、例えば、より多くのポリメラーゼまたはより多くのｄＮＴＰの使用が避けられる。例えば、２００９年の価格では、ＬＡＭＰ反応においてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの量を倍にするとアッセイの費用は６０％増加し、ｄＮＴＰを倍にするとアッセイの費用は２０％増加するが、プライマーは一般的にあまり高価ではないので、２種類のステムプライマーを追加してもアッセイの費用の増加はわずか４％である。
【００１６】
第２に、ステムプライマーは、所定の標的鋳型のプライマー選択においてすぐれた適応性を提供する。例えば、核酸配列の変動が大きい病原体の特定のファミリーを検出するために、該病原体ファミリーゲノムの最も少ない配列変動を示す領域にプライマーを設計する。しかし、これには、１個または複数のプライマーを非最適部位に配置する必要性があり得る。これは、以下に論じるＬＡＭＰなどのＮＡＡＴで特に問題となる可能性があり、ある特定の方法において最大６個の異なるプライマーの位置が受け入れられる必要がある。ステムプライマーは、ＮＡＡＴで使用した他のプライマーとは非常に異なる位置に配置することができるので、通常では使用が困難であろう特定の標的鋳型中のステムプライマーの結合部位を使用することができる。
【００１７】
実際に、通常、ステムプライマーを使用することによって、ＬＡＭＰ（またはＳＭＡＰ）法で使用される他のプライマーを省くことが可能である。例えば、特定の標的鋳型では、いわゆる「置換プライマー」（すなわち、図１４ｂ、ｃおよびｅにおける位置Ｒ３およびＦ３を占めるプライマー）の１つに最適な結合部位を見出すことは困難であり、結果として試験の性能に悪影響が及ぶことが分かる。しかし、標的鋳型上に利用可能な適切なステムプライマー結合部位があれば、ステムプライマーを添加することによって、置換プライマーの欠如による性能不足を補うように作用することができる（図１９）。この原理は、ＬＡＭＰまたはＳＭＡＰで使用した特定の他のプライマーにも同様に適用することができる。
【００１８】
本発明の方法は、ＮＡＡＴがコンカテマーの形成を引き起こすならば、いかなるＮＡＡＴでも実施することができる。本明細書で使用した「コンカテマー」という用語は、１本鎖において交互に連結した、実質的に類似のヌクレオチド配列を有するポリ核酸を意味する。これらの整列した配列は、互いの単純な反復、逆方向反復またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１９】
コンカテマーの生成に適したＮＡＡＴは、当技術分野では周知で、一般的に「等温」増幅技法を含む。これは、既知の熱サイクリング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応とは対照的に、ポリ核酸の増幅にインキュベーション温度の変化を必要としないことを意味する。
【００２０】
いくつかの等温増幅技法、例えば、核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ；ＵＳ５４０９８１８）および転写媒介増幅（ＴＭＡ；ＵＳ５３９９４９１）は、増幅方法の一部として転写に依存しており、一方で、他のものは、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ；ＷＯ２００４０２７０２５）およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ；ＷＯ０３０７２８０５）はそれぞれ、ヘリカーゼまたはレコンビナーゼの作用に依存しており、さらに他に、例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ；ＵＳ５４５５１６６）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ；ＷＯ００２８０８２、ＷＯ０１３４７９０、ＷＯ０２２４９０２）、キメラ置換反応（ＲＤＣ；ＷＯ９７９４１２６）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ増幅（ＲＣＡ；Lizardi,P.M.et al.Nature Genetics,(1998)19.225-231)、核酸の等温キメラ増幅（ＩＣＡＮ；ＷＯ０２１６６３９）、ＳＭａｒｔ増幅法（ＳＭＡＰ；ＷＯ２００５０６３９７７）、線形等温多量体化増幅（ＬＩＭＡ；Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase,Hafner G.J.,Yang I.C.,Wolter L.C.,Stafford M.R.,Giffard P.M,BioTechniques,2001,vol.30,no4,pp.852-867)、ＵＳ６７４３６０５（本明細書では「鋳型リプライミング増幅」または「ＴＲＡ」と称する）およびＷＯ９６０１３２７（本明細書では、「自己伸長増幅」またはＳＥＡと称する）で記載された方法もまた、特定のＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性に依存している。
【００２１】
これらのＮＡＡＴの特徴は、プライマーまたはプライマーのセットの作用を介してポリ核酸をコピーすること、および相互プライマーまたはプライマーのセットによって前記コピーを再コピーすることの両方を提供することである。これによって、元のポリ核酸のコピーを指数関数的速度で生成することが可能である。
【００２２】
ＮＡＡＴに関して、一般的に、この方法によって検出される核酸の物理的断片を、この元の核酸から形成された最初のコピーと、この元の核酸から形成されたコピーの最初のコピーと、コピーのこのコピーのさらなるコピーと区別することは有用である。明瞭にするために、以下の定義を本明細書に付記する：それ自体分析されている試料由来の核酸は、「標的鋳型」（図３ａ）と称する；ＮＡＡＴを実施することによるこの標的鋳型の最初のプライマー依存性コピーは、「主要アンプリコン」（図３ａ）と称する；ＮＡＡＴを実施することによる主要アンプリコンの最初のコピーは、「第１世代アンプリコン」（図３ｂ）と称する；第１世代アンプリコンのさらなるコピー（およびこれらのコピーのコピー）は総称して、「次世代アンプリコン」（図３ｃ）と称する。主要アンプリコン、第１世代アンプリコンおよび次世代アンプリコンは全て、一般的にアンプリコンのサブセットである。２本鎖アンプリコンでは前述のサブセットの組み合わせまたは標的鋳型自体との組み合わせから構成されることが可能である。さらに、次世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンと同一とすることができる。さらにまた、次世代アンプリコンから第１世代アンプリコンと同一のポリ核酸分子を生成することが可能である。
【００２３】
本発明の対象は、特に次世代アンプリコンに関しており、得られたコピーのさらなる再コピーを実現する方法で増大させることができるさらなる機構を提供する。
【００２４】
前述したアンプリコンのサブセットは通常、異なる特徴を有する。標的鋳型が、特定のＮＡＡＴで使用したプライマーによって区別された核酸の領域を超えて第１のプライミング部位からコピーされ得るので、主要アンプリコンの長さは非常に様々であり得る。一般的に、ＮＡＡＴの重要な特徴は、第１世代アンプリコンを生成するために、問題のＮＡＡＴによって使用された別の相互プライマーがこの主要アンプリコンを利用できるようにする方法を提供することである。主要アンプリコンのプライマー依存性プライミングから得られた第１世代アンプリコンは、使用したプライマーによって区別される別個の長さとなる。また、ＮＡＡＴの重要な特徴は、次世代アンプリコンを生成するために、相互プライマーによってさらにプライミングするために第１世代アンプリコンを利用できるようにする方法を提供することである。また、問題のＮＡＡＴの重要な特徴は、次世代アンプリコンをさらに再コピーするための方法を提供することである。いくつかのＮＡＡＴのために、次世代アンプリコンは第１世代アンプリコンとは実質的に異なっていてもよく、特に、次世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンのコンカテマーであってもよい。
【００２５】
直鎖標的鋳型から直接、コンカテマーの形態でアンプリコンを生成する方法には、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＥＡおよびＳＭＡＰ（後者はＬＡＭＰおよびＳＥＡのハイブリッドである）が含まれる。それぞれの場合において、コンカテマーは、第１世代アンプリコンを含む方法から生じる（図３ｂ）。したがって、ポリ核酸の合成は、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＥＡおよびＳＭＡＰからなる群から選択されるＮＡＡＴを使用して実施することが好ましい。したがって、それぞれの場合では、本発明は、直鎖の標的鋳型から直接コンカテマーを生成する能力を備えた１個または複数のプライマーを提供するＮＡＡＴに関連する。
【００２６】
ＲＣＡもまた、コンカテマーを生成する。しかし、この場合、共有結合によって閉環したＤＮＡ分子を形成するために、プローブの標的鋳型特異的ライゲーションが必要である。このようなアンプリコンはそれ自体、任意の相互プライマーに頼らず、または第１および第２のセグメントを含む任意のプライマーを必要とせず、自然にコンカテマーになり、第１のセグメントは、鋳型上の第１の相互プライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントは、第１のプライマーの別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコンの領域に実質的に相補的な配列を含んでいる。したがって、ＲＣＡ自体は、本発明の対象ではない。
【００２７】
したがって、ＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＭＡＰおよびＳＥＡの一般的な特徴は、第１世代アンプリコン依存性プライミングの特徴であり、すなわち、第１世代アンプリコンは、分子内事象または分子間事象のいずれかによって、プライマー自体として作用し、大きさが第１世代アンプリコンよりも大きく、天然ではコンカテマーである次世代アンプリコン（この用語は、本明細書では第１世代アンプリコンのさらなるコピー（（およびこれらのコピーのコピー）を意味するために使用される；図３ｃ）をもたらす。実際に、これらのＮＡＡＴの特徴は、非常に長いアンプリコンが、短いアンプリコンから生成し、したがって、ステムプライマーの結合部位の数が増幅工程の最中に指数関数的に増加し、したがって、増幅を加速するステムプライマーの能力が増加することである。これらのＮＡＡＴにおいてコンカテマーを生成するプライマーの作用機構を正しく認識することは、ステムプライマーがどうのように効果を発揮するか理解するために役立つ。さらに、当業者は、コンカテマーの生成をもたらす機構に気づき、本発明の方法において使用できる他の適切なＮＡＡＴを容易に同定することができるだろう。
【００２８】
ＬＡＭＰがコンカテマー構造を形成する方法の詳細を図４に示す。ＴＲＡ法は同一の機構によってコンカテマーアンプリコンを形成することが予測される。図４ｂおよび４ｃは、実際に、コンカテマーが形成できる機構は少なくとも２つあり、１つは分子内機構を介し（図４ｂ）、もう１つは分子間機構を介すること（図４ｃ）を示している。実際に、本明細書で示したように、いずれの機構も第１世代および次世代アンプリコンの構造に関して同一の結果をもたらす（図４ｂ（ｉｖ）および図４ｃ（ｉｖ）を比較すること）。図４に概略を示した方法は、フォワード相互プライマー結合領域のみを参照しているが、リバース相互プライマー結合領域にも同様に適用されることを理解されたい。さらに、この方法は、次世代アンプリコンによって反復されると理解され、したがって、さらに長いコンカテマーを形成することができる。
【００２９】
ＳＥＡによるコンカテマー生成は、ＬＡＭＰおよびＴＲＡによるコンカテマー生成と本質的に同一であるが、ＬＡＭＰおよびＴＲＡのように、逆方向反復を形成するためにポリヌクレオチド上においてプライマーを伸長することを必要とせず、必要な逆方向反復がプライマー自体に直接備わっている。図５ａ〜ｃは、ＬＡＭＰ／ＴＲＡに関してＳＥＡの対応する機構を示す。
【００３０】
多くのＮＡＡＴは、本明細書で「単純プライマー」と称するものを使用する（図６ａ）。本明細書で使用した「単純プライマー」とは、ポリ核酸上のプライマー結合部位に実質的に相補的なプライマーを意味し、このプライマーは、かなりの数の追加のヌクレオチド、すなわち、プライマー結合部位に実質的に相補的なプライマー領域の３’または５’のヌクレオチドを含有しない。この文脈において「かなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉｖｅ）」という用語は、単純プライマーが約２０個未満、約１５個未満、約１０個未満、または約５個未満の追加のヌクレオチドを含有することを意味する。
【００３１】
ＬＡＭＰおよびＴＲＡ（および参照としてＳＭＡＰ）において使用されるプライマーは、アンプリコン中に１本鎖ループを生成するので、本明細書では、「ループ形成プライマー」（ＬＦＰ）と称する。本明細書で使用されるＬＦＰとは、第１および第２のセグメントを含むプライマーのことであり、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第２のセグメントがループを形成することができるように、第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む。ＬＦＰの一般的構造を図６ｂに示す。ＬＦＰによる標的鋳型のプライミングから生じた第１（および次）世代アンプリコンは、反転した反復配列のワトソン−クリック塩基対から形成された２本鎖ポリヌクレオチドが隣接した１本鎖ポリヌクレオチドのループを含有する。ポリヌクレオチドの１本鎖ループは、問題のＮＡＡＴによって使用されたさらなるプライマーが結合するために利用することはできるが、特にステムプライマーが結合するために利用することはできないと考えられる。
【００３２】
ＳＥＡ（およびＳＥＡおよびＬＡＭＰのハイブリッドである参照としてのＳＭＡＰ）で使用したプライマーを図６ｃに示す。これらのプライマーは５’末端に任意の逆方向反復を含有することを確認することができる。結果として、前記プライマーによる標的鋳型のプライミングから生じた第１世代アンプリコンは、第１世代アンプリコンが潜在的に自己プライムする（または類似のアンプリコンをプライムオフ（ｐｒｉｍｅ−ｏｆｆ）する）原因となる緊密なヘアピンループを形成する。このようなプライマーは、本明細書では「ヘアピンプライマー」と称する。本明細書で使用した「ヘアピンプライマー」という用語は、第１および第２のセグメントを含むプライマーのことであり、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第１のプライマーの別の領域に実質的に相補的な配列を含む。ヘアピンプライマーは通常、問題のＮＡＡＴによって使用されたさらなるポリヌクレオチドが結合するために利用可能な第１世代または次世代アンプリコン中にポリヌクレオチドの１本鎖ループを提供しない。しかし、本発明者らは、プライマーの第２のセグメント中の逆方向反復がリンカー領域によって分離されているヘアピンプライマーを提供することができることを認識した。リンカーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも３０、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチドまたは少なくとも６０ヌクレオチドであってもよい。このようなプライマーは、１本鎖ループを形成することができ、増幅中に追加のプライマーの結合を可能にする（図６ｄおよびまた、図８ｃも参照）。逆方向反復の間にこのようなリンカー配列を含有するヘアピンプライマーは、本明細書では、「ループ提供プライマー（ｌｏｏｐ-ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）」（ＬＰＰ）と称する。このようなプライマーは、先行技術では記載されておらず、本発明の好ましい態様である。
【００３３】
ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰおよびＳＥＡでは、第１世代アンプリコンの分子内プライミングを可能にする第１世代アンプリコン中の逆方向反復を生成するプライマーを使用することは明白である。結果として、第１世代アンプリコンは、それ自体の区分をコピーし、そのようにしてコンカテマーを生じる。ＴＲＡについて記載された機構では、前述の機構は明らかにならない。それにも関わらず、ＴＲＡはコンカテマーを生じ、ＬＡＭＰと同一の機構によってコンカテマーを生じるようである（実施例１および関連する図７を参照されたい）。前述の分子内プライミングは、コンカテマーを生成するためにこれらの方法で使用されるプライマーに利用できる唯一の機構ではないが、正確な機構に関係なく、ステムプライマーの有益な効果の合理性は明らかである。
【００３４】
第１世代アンプリコンの分子内（図８ａ）または分子間（図８ｂ）自己プライミングのためにＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＭＡＰで使用したＬＦＰで論じたように、得られた次世代アンプリコンは、標的鋳型からアンプリコンを生成するために使用した元のプライマーに結合できる１本鎖領域を利用可能にする。形成した１本鎖ループの相互鎖は、以下で言及する「ループプライマー」に結合することができることに注意されたい。ＳＥＡおよびＳＭＡＰで記載したようなヘアピンプライマーは、アンプリコン中にこのような１本鎖ループを生成しない。しかし、以前に論じたように、本発明者らは、逆方向反復の間にリンカー領域を含有するＳＥＡプライマーの変種（図６ｄで示したＬＰＰ）を使用することによって、ヘアピンプライマーが、図８ｃで例示したように、１本鎖ループを生成し得ることをはっきりと理解している。
【００３５】
ＬＦＰおよびＬＰＰがアンプリコンの安定な１本鎖領域を生成する能力は、アンプリコンを迅速にさらに増大させるのに必要不可欠で、これらのプライマーを使用する技術の重要な態様である。これは、コンカテマーアンプリコンが問題のＮＡＡＴによって使用されたプライマーの新たなプライミング部位を多く含有できることを意味する。ＬＡＭＰおよびＴＲＡ（およびしたがってＳＭＡＰ）において、アンプリコン中に逆方向反復を生成するＬＦＰはまた、それ自体結合することができ、したがって、アンプリコンの再コピーをさらに開始し、したがって、さらに増幅を増大させるアンプリコンの１本鎖領域を提供する。ＬＡＭＰおよびＳＭＡＰにおいて、ＬＦＰに加えて、増幅のさらなる増大を助けるためにアンプリコンのこれらの１本鎖領域にも結合するさらなる追加のプライマーを使用することができる（ループプライマーとして知られる）。本発明の一面は、ステムプライマーが、ＬＦＰおよび／またはＬＰＰによって生成した前記安定な１本鎖ループには結合しないが、異なる機構を介して増幅を加速させることである。
【００３６】
ＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＥＡ（および参照としてＳＭＡＰ）について、次世代アンプリコンをコピーする工程は、自己プライミング（分子内または分子間のいずれで実施されるかには関係なく）、アンプリコンの１本鎖領域からのさらなるプライマーの結合および伸長、またはフォワードもしくはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに結合する他のプライマーの作用のいずれを介するにせよ、次世代アンプリコンのステム領域を一時的に１本鎖にすることが示される。ＬＡＭＰ、ＴＲＡおよびＳＥＡ（およびＳＭＡＰ）の示唆された機構によって、前記１本鎖ステム領域が、さらなるアンプリコン自己プライミングおよび再コピーの作用を介して、またはフォワードもしくはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに向けられたプライマーのための曝露された結合部位に結合するプライマーの作用を介して、２本鎖ポリヌクレオチドに迅速に変換されることが予測される。ステム領域は、一時的に１本鎖であり、安定な１本鎖ではないことしかこれまで予測されなかった。したがって、ステム領域が増幅に有用なプライマー結合部位を提供することは予測されなかった。しかし、今回、驚くべきことに、ステム領域に向けられたプライマーが実際に、増幅速度を非常に増加させることが示された。ステムプライマーがアンプリコンに結合できる機構を図９および１０に例示する。
【００３７】
ステムプライマーの作用は、アンプリコン再コピーから生じた一時的に曝露された１本鎖ポリヌクレオチド上であると予測されるが、他の機構も、ステムプライマーを使用して見られる増幅速度の増加の原因となり得ることが考えられる。例えば、コンカテマー構造において、１本のポリヌクレオチドが複製スリップ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）におけるように「ループアウト（ｌｏｏｐ ｏｕｔ）」し得ることが考えられ、このことは、コンカテマーポリヌクレオチド構造が、その性質そのものによって、反復配列の間に２次構造を形成することができることから、特に可能性がある。例えば、生成した１本鎖ポリヌクレオチドループは、ステムプライマーの結合部位を提供し得る。他の機構も、ステムプライマーの効果を説明できる可能性があるが、これは本発明の一般的態様であることが予測されるコンカテマーポリヌクレオチド配列に作用するステムプライマーの原理である。
【００３８】
以前に論じたように、適切な相互プライマーは、第１および第２のセグメントを含むことができ、第１のセグメントは鋳型上の相互プライマー結合領域に実質的に相補的である。本発明のこの態様は、本明細書では、第１のプライマーを参照にしてさらに詳細に説明するが、同様の原理が第２のプライマーにも必要に応じて変更を加えて適用されることを理解されたい。
【００３９】
「実質的に相補的」という用語は、第１のセグメントが、ＮＡＡＴ中に通常使用される条件下で鋳型および／またはアンプリコン上の相互プライマー結合領域に結合するために十分な相補性を有することを意味する。これには、相互プライマーの第１のセグメントが、鋳型上の相互プライマー結合領域に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性を有することが必要である。相互プライマーの第１のセグメントの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたはさらに少なくとも７０ヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
相互プライマーがさらに第２のセグメントを含有する場合、第２のセグメントは、第２の領域がループを形成することができるように、第１のプライマー中の別の領域または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含んでいる。「第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン」とは、第１のプライマーがポリメラーゼによって伸長するとき生成する鋳型の第１のコピーを意味する。前記アンプリコンは、５’末端に第１のプライマーの配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、プライマーが結合する標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と実質的に同一である。このようなプライマーは、以前にＬＦＰと称した。「実質的に同一」とは、第２のセグメントが標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを意味する。第２の領域の一部のみが標的鋳型上の領域と実質的な同一性を示すことも想定される。相互プライマーの第２のセグメントの全体または一部のみが標的鋳型上の領域と実質的な同一性を示すかどうかにかかわらず、標的鋳型および／またはアンプリコン上の領域と実質的に同一な第２のセグメントの領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたはさらに少なくとも７０ヌクレオチドである。本発明のこの態様において、相互プライマーの第１のセグメントが第１のアンプリコンを形成するために一旦伸長したならば、第２のセグメントは同じ鎖内の相補的領域に結合し、それによってループを形成することができる。
【００４２】
第２のセグメントはまた、第２のセグメント中の別の領域に実質的に相補的な領域を含んでもよい。このようなプライマーは、以前にヘアピンプライマーまたはループ提供プライマーと称した。「実質的に相補的」とは、第２のセグメント中の２つの領域が互いに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性を有することを意味する。好ましくは、相補的な領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドまたは少なくとも７０ヌクレオチドである。プライマーがヘアピンプライマーである場合、第２のセグメント中の相補的な２つの領域は、２つの領域が互いに結合するのを容易にするために、短い（すなわち、１０ヌクレオチド未満の）リンカー領域によって分離されていることが好ましい。リンカー領域の長さによって、当業者は長さが少なくとも１０ヌクレオチドのリンカー領域を有するＬＰＰとリンカー領域の長さが１０ヌクレオチド未満であるヘアピンプライマーとを区別することが可能である。プライマーの第１および第２のセグメントは、リンカー領域を介して連結していてもよい。いくつかの実施形態では、一旦コピーされたら、さらなるプライマーがリンカー領域の相補部分に結合するのを可能にするために、このリンカー領域は前記プライマーの第１のセグメントと実質的に同一である（図６ｄ）。「実質的に同一」とは、第１のセグメントがプライマーの第１および第２のセグメントを連結するリンカー領域と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを意味する。
【００４３】
本発明の方法は、同じ種類のフォワードおよびリバース相互プライマー、例えば、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーを使用して実施することができる。「同じ種類のプライマー」というとき、これらのプライマーが全て単純プライマー、ＬＦＰ、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであることを意味する。したがって、「異なる種類のプライマー」という用語は、少なくとも１個のプライマーが他のプライマー（複数可）と同じ種類ではない、２個以上のプライマーの組み合わせに関する。例えば、一方法で４個の相互プライマーを使用し、そのうち３個がＬＦＰで、１個がＬＰＰの場合、プライマーは異なる種類であると見なされるだろう。したがって、同じ種類ではないフォワードおよびリバース相互プライマーを使用することも想定される。例えば、ＬＦＰであるフォワード相互プライマーを、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであるリバース相互プライマーと組み合わせて使用してもよい。プライマーの組み合わせがコンカテマーの形成を引き起こすならば、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーを、単純プライマーと組み合わせることも可能である。増幅のために使用したＮＡＡＴが複数の（すなわち、２個以上の）フォワードおよび／またはリバース相互プライマーを使用する場合、同じ相互プライマー結合部位に対して同じまたは異なる種類のプライマーを組み合わせることも可能である。本発明の一態様では、２個以上のフォワードおよび／またはリバース相互プライマーは全てＬＦＰである。プライマーの適切な組み合わせは、当業者には明らかであろう。例えば、全て単純プライマーであるフォワードおよびリバース相互プライマーの組み合わせは、コンカテマーの形成をもたらすための機構を提供しない可能性があり、したがって、このような組み合わせは、本発明で使用するためには適していないことは当業者には明らかであろう。
【００４４】
一般的に、相互プライマーまたはプライマーのセットが、標的鋳型の異なる鎖に作用することを理解されたい。さらに、相互プライマー（または相互プライマーの各セットの１つ）は、コピーされた、および再コピーされた元のポリヌクレオチドの領域を区切るように作用するだろう。したがって、指数関数的増幅には、少なくとも２個のプライマー結合領域、フォワード相互プライマー結合領域とリバース相互プライマー結合領域の間の活性を合わせることが必要である（図１ａ）。フォワードおよびリバースプライマー結合領域はそれぞれ、プライマーのための１個の結合部位を含んでよく、それによって相互部位は反対のセンス鎖上にあり、すなわち、１個のプライマー結合部位は「フォワード鎖」上にあり、１個は「リバース鎖」にある（図１ａに見られる通り）。フォワードおよびリバース相互プライマー領域はまた、２個以上のプライマーそれぞれのための結合部位を含んでいてもよく、２個を上回るプライマーは特定のＮＡＡＴによって使用される。この場合、フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域中の２個以上のプライマー結合部位は全て、標的鋳型および／またはアンプリコンの同じ鎖または標的鋳型および／またはアンプリコン（またはそれらのコピー）の異なる鎖上に存在することが可能である（図１ｂ）。
【００４５】
本発明のステムプライマーは、ステムプライマー（複数可）の結合部位（複数可）がフォワードまたはリバース相互結合部位とあまり重複していないならば、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の間のどこに位置していてもよい。ＬＦＰを使用し、ＬＦＰがフォワードプライマーの場合、フォワード相互プライマー結合領域はＦ２部位（すなわち、フォワード相互プライマー結合領域）だけでなく、Ｆ１部位（すなわち、ＬＦＰの第２のセグメントに実質的に同一なフォワード鎖の領域）を包含し、ＬＦＰがリバースプライマーの場合、リバース相互プライマー結合領域はＲ２ｃ部位（すなわち、リバース相互プライマー結合領域）だけでなく、Ｒ１ｃ部位（すなわち、ＬＦＰの第２のセグメントに実質的に同一なリバース鎖上の領域）を包含することを理解されたい（図１ｅおよび図１４）。このように、ステムプライマーは２個のＬＦＰを使用したＲ１（ｃ）およびＦ１（ｃ）部位の間のどこにでも位置していてもよく（ＬＡＭＰおよびＴＲＡにおけるように）、１個のＬＦＰが特定のＮＡＡＴで使用される場合、ステムプライマーはＲ１（ｃ）またはＦ１（ｃ）部位のいずれかと非ＬＦＰによって占められた別の相互プライマー結合領域のとの間に結合していてもよい。
【００４６】
図２ａに示したように、フォワードまたはリバースポリヌクレオチド鎖のいずれかに結合する１個のステムプライマーのみを使用することが可能である。あるいは、アンプリコンの相互鎖（図２ｂ）または同じ鎖（図２ｄ）のいずれかに結合できる２個以上のステムプライマーを使用することができる。本発明の方法は、ステムプライマーの結合部位がフォワードまたはリバース相互プライマー結合領域とあまり重複しないか、または全く重複しないならば、任意の空間的組み合わせで使用でき、リバース鎖またはフォワード鎖のいずれかに結合できる１個、２個、３個、４個またはそれ以上のステムプライマーで実施することができる（図２ｅ）。ステムプライマーはさらに、ステム領域内の任意の部分に結合することができる。したがって、ステムプライマー（複数可）は、フォワードまたはリバース相互プライマー結合領域にごく接近した結合部位を有することができる（図２ｃ）。「ごく接近した」とは、ステムプライマーの結合領域および相互プライマー結合領域が１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐまたは１０００ｂｐ未満しか離れていないことを意味する。
【００４７】
本発明のステムプライマーの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチドまたは少なくとも９０ヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
ステムプライマーは、単純プライマーであってもよい。しかし、ＬＦＰ、ヘアピンプライマー、ＬＰＰ、キメラプライマーまたは他の誘導体であるステムプライマーを使用することも想定される。複数のステムプライマーを使用するとき、ステムプライマーは、同じ種類であってもよく、または異なる種類のプライマーの組み合わせであってもよい。「同じ種類のプライマー」と称するとき、プライマーは全て、単純プライマー、ＬＦＰ、ＬＰＰまたはヘアピンプライマーであることを意味する。したがって、「異なる種類のプライマー」という用語は、少なくとも１個のプライマーが他のプライマー（複数可）と同じ種類ではない、２個以上のプライマーの組み合わせに関する。例えば、使用したステムプライマーは全て、単純プライマーであってもよく、または単純プライマー、ＬＦＰおよび／またはヘアピンプライマーの組み合わせであってもよい。実際に、図２０に例示したように、ステムプライマーは、本発明で使用したものに対して様々なプライマー変形形態を使用するＬＡＭＰ、ＴＲＡ、ＳＭＡＰまたはＳＥＡの派生物において有用に使用することができるものと予想される。
【００４９】
ＴＲＡおよびＳＭＡＰに関連した文献、ならびに他のいくつかの情報源において概略されているように、「単純プライマー」、ＬＦＰ、ヘアピンプライマー、ＲＮＡ含有プライマー、ニッカーゼ部位含有プライマーおよび各ＮＡＡＴ法に概略された派生法を生成するための新規の組み合わせで使用できた他の新規プライマーは、多種多様に組み合わせることが可能である。前記組み合わせによって、より長いコンカテマーを生成するために自己コピーすることができるコンカテマーアンプリコンを生成する方法がもたらされる場合、ステムプライマーが利用できるものと予測される。
【００５０】
例えば、ＬＡＭＰで使用した置換プライマー（標的鋳型および主要アンプリコン上で作動するが、第１世代アンプリコンまたは次世代アンプリコンでは作動しないように設計されている）の主要な欠点は、関連したＬＦＰが標的鋳型に結合し、標的鋳型上で伸長する前に置換プライマーがその部位に結合し、その部位から伸長し、置換プライマーから生成した主要アンプリコンが指数関数的増幅に必須のＬＦＰの結合を遮断し、妨害し、したがって増幅を阻害することであることに本発明者らは注目してきた。本発明者らは、もし置換プライマーとして「単純プライマー」構造を使用する代わりに、ＬＦＰを置換プライマーとして使用するならば、この影響が、ある程度まで軽減し得ることを示した（実施例５、図１５ａおよびｂ）。これは、ＬＦＰがある程度、プライマー部位の再プライミングを可能にするためと考えられているが（ＴＲＡ技術に関連した特許に記載されているように）、主に、ＬＦＰは第１世代および次世代アンプリコンならびに標的鋳型および主要アンプリコンに作用することができ、一方、「単純」置換プライマーは主として標的鋳型および主要アンプリコンのみに作用すると予測されるためである。したがって、実施例５で記載したこのような方法は、ステムプライマーの使用と全く矛盾しない。同様に、ＩＣＡＮおよびＲＤＣで記載されたようなキメラプライマーは、置換プライマー部位の再プライミングを可能にし、したがって、ＬＦＰ結合部位を遮断する可能性を低下させるために、置換プライマーとして（単純プライマーの代わりに）使用することができた。
【００５１】
さらに、ステムプライマーはフォワードおよびリバース相互結合領域で生じるプロセスを連結することによって、ＬＦＰを使用する方法の増幅速度を増加させるように作用するため、およびＬＡＭＰ法には使用されるＬＦＰのフォワードおよびリバース相互結合部位を分離するヌクレオチドの数に上限があることが文献で教示されているため（Notomi et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Research,(2000)Vol 28., No.12, e63）、ステムプライマーを使用すると明らかに、フォワードおよびリバース相互結合部位が今までに実施できたものよりもさらに離れて配列中に位置することが可能となる（特に、いくつかのステムプライマーを使用する場合）。配列の２つの領域がポリヌクレオチド上に一緒に存在するが、この２つの領域の間の距離が離れ過ぎていて各それぞれの領域が本明細書で記載したＮＡＡＴにおいてフォワードおよびリバース相互結合領域として効果的に使用できないことを実証するのが望ましいとき、このことは非常に有益であり得る。
【００５２】
ステムプライマーを使用することによって、ステムプライマーがない場合よりもフォワードおよびリバース相互結合領域がはるかに離れていることが可能で、いまだ効果的な増幅が可能なので、ポリヌクレオチド上に２つの異なる部位の存在を確立することができる。したがって、本発明は、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域が、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、ポリ核酸の増幅方法を提供する。この距離は、使用したＮＡＡＴ、試薬および増幅条件が、ステムプライマー（複数可）が１つの反応に添加され、他の反応には添加されないこと以外は同一である、２つの別々のＮＡＡＴを並行して実施することによって、実験的に定義することができる。ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じる場合、相互プライマー結合部位は、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るような距離に位置するものと考えられる。
【００５３】
例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ)中に存在するｍｅｃＡ遺伝子は、ＭＲＳＡに関連したＳＣＣＭｅｃ可動遺伝要素の挿入部位に関連した保存されたｏｒｆＸ配列からかなり離れて位置することができる（ＷＯ０２／０９９０３４参照）。ｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列がＬＡＭＰなどの方法を使用するには配列中で離れ過ぎていても、ステムプライマーを使用すると、ｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列が増幅のために相互結合部位として作用できるようにすることによって、ＭＲＳＡを検出するために役立つことができる。したがって、一態様では、本発明は、試料中のＭＲＳＡを検出するための方法を提供する。
【００５４】
ステムプライマーは、天然に生じる核酸のみを含有していてもよい。しかし、改変塩基を含有するプライマーを利用することも想定される。このような改変塩基の例には、限定はしないが、Ｎ４−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基が含まれる。ステムプライマーおよび／または標識されたステムプライマーが結合するアンプリコンを検出可能にする部分で標識された核酸を使用することも想定される。例えば、核酸は、蛍光的に標識することができる。別法では、ステムプライマーは捕捉部分（例えば、ビオチン）で標識することができる。
【００５５】
重要なことに、ステムプライマーは、フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位に結合するプライマーによって媒介されるアンプリコンの指数関数的増幅には直接関与しないが、増幅速度だけを増加させる。これは、ステムプライマーが特定のＮＡＡＴによって使用される他のプライマーの増幅産物に働くと考えられるからである。したがって、ステムプライマーは、フォワードおよびリバース相互プライマーによって媒介される反応の増幅速度を増加させることによって働く。このことは図１ｃに示されており、ステムプライマーは標的鋳型をプライムし、標的鋳型から伸長し、標的鋳型の部分コピーはフォワード相互プライマー結合領域またはリバース相互プライマー領域のいずれかのみを含有し、両方は含有しないことを認めることができる。したがって、ステムプライマーから生成した主要アンプリコンは、相互コピーが可能ではなく、したがって、標的鋳型の指数関数的増幅には関与しないだろう（このことは図２１に詳細に示されている）。同様の論理が、特定のＮＡＡＴによって使用された他のプライマーによって生成した主要アンプリコン、および同様に第１世代アンプリコンをコピーするステムプライマーに適用される。
【００５６】
ステムプライマーは、次世代アンプリコン（すなわち、第１世代アンプリコンのさらなるコピー（およびこれらのコピーのコピー））が天然においてコンカテマーであるならば、標的鋳型の増幅速度を著しく増加させることのみが予測される。ステムプライマーがコンカテマー上で働くという必要性は、指数関数的増幅に関与する特定のポリ核酸のため、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域として作用することができる領域を含有しなければならないという必要性の次にくる。ステムプライマーを介してコンカテマー構造をコピーするとフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位の両方を有するポリヌクレオチドコピーを生成することができるが、一方、非コンカテマー構造をコピーしても生成しないことは、図２１で明らかに認めることができる。したがって、ステムプライマーの使用がコンカテマーの形成を引き起こす増幅方法に有益であると本発明者らは予測する。
【００５７】
ステムプライマー（複数可）はＮＡＡＴで使用した他のプライマーと連結した様式で作用し、この相互作用は増幅速度の観察された大きな増加を得るために必要不可欠であることが見出された。ステムプライマーを使用して認められた増幅速度の増加は、１個のステムプライマーによって生成したアンプリコンが、アンプリコンを再コピーするために特定のＮＡＡＴによって使用されている他のプライマー全ての鋳型として作用しない、追加的であるが異なる増幅方法に関与するステムプライマーでは説明できない。本発明者らは、観察された増幅速度の増加は、一方法によって生成したアンプリコンが別の方法によって生成したアンプリコンの鋳型として作用できない２種以上の異なる増幅方法ではなく、単一の、連結した増幅方法から生じるに違いないことを実験的および理論的に実証した。増幅技術ＴＲＡのための増幅速度の非常に大幅な増加の種類の例を、異なる増幅速度論を有する様々なプライマーセットについての実施例２において示す。各場合において、ステムプライマーは増幅速度を著しく増加させ、そうすることで、試験を実施する時間枠内で試験の感度を増加させる（図１１）。したがって、ステムプライマーは、標的鋳型の特定の種類および量を検出するために必要な時間を、ステムプライマー（複数可）を添加していない対照反応と比較して少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分または少なくとも６０分減少させることができる。
【００５８】
例えば、ＬＦＰと併用して単純プライマーを使用し、各プライマーが、相互的にフォワードまたはリバース相互プライマー結合領域のいずれかに結合すると理解されているＴＲＡが明示された（ＵＳ６７４３６０５）。この組み合わせは、本明細書では非対称ＴＲＡ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＴＲＡ）またはＡＴＲＡと称する。このように、ステムプライマーをＴＲＡに添加すると、１つのアッセイで組み合わせた３つの別々の増幅方法、１つはＴＲＡで、次の２つが異なるＡＴＲＡ増幅である方法があることを主張することができた（図１２ａ）。したがって、ステムプライマーはＴＲＡ自体の増幅速度は増加させず、２つの付加的なＡＴＲＡ増幅を同アッセイに単に追加するだけであると示唆したくなるだろう。しかし、そのような場合は、観察された増幅全体の速度は、ＴＲＡ系の増幅速度および両ＡＴＲＡ系の増幅速度の合計であろう。しかし、本発明者らは、ステムプライマーの使用によって実質的に独立した増幅系の合計から予測されるよりもはるかに大きな増幅速度の増加が生じることを示した。実施例３では、増幅速度を、ステムプライマーおよびＬＦＰの様々な組み合わせで測定する。１個のステムプライマーおよび１個のＬＦＰを使用して示されるのは、ＡＴＲＡと同等である。ステムプライマーおよびＬＦＰの２つの可能な組み合わせ（すなわち、ＡＴＲＡの２つの表現型）を使用する場合の増幅速度は、極めて遅い速度論を与えることを確認することができる（図１２ｂ（ｉおよびｉｉ））。２個のＬＦＰを一緒に使用するとき（すなわち、ＴＲＡ系）の速度論は２個のＡＴＲＡ系よりも速い（図１２ｂ（ｉｉｉ））。ステムプライマーおよびＬＦＰを組み合わせると、増幅速度はＴＲＡまたはＡＴＲＡによって既に示されたいずれの速度よりも実質的に速い（図１２ｂ（ｉｖ））。ＡＴＲＡの速度論がいかに遅いかが示され（および増幅の指数関数性を想起する）ならば、図１２ｂ（ｉｖ）で示した増幅速度の増加が組み合わせた２つのＡＴＲＡおよびＴＲＡ系の反応速度の単純な合計であると推測することは合理的ではない。このことは、ステムプライマーが指数関数的増幅に関与する他のプライマーと連結した様式で作用しているという事実を強調し、さらに、フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域を保持するアンプリコンのコピーを生成するコンカテマー上でのステムプライマーの作用によって合理的に説明することができる。
【００５９】
前記の実験例はまた、モデル化することができる。実施例４では、３種類の別々の増幅方法が数学的に定義された増幅速度でモデル化されている。このモデルは、ＢＡＲＴ曲線として表される（以下参照）。使用したパラメータは、等温ＮＡＡＴの様々な表現型の速度について本発明者らが得た結果の範囲を反映している。例えば、非常に遅い２つの増幅方法をより速い増幅方法と一緒にすると、ステムプライマーがＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ＋ループプライマーまたはＴＲＡのいずれかに添加されたとき認められる著しく速い増幅の種類が観察されないことを確認することができる（図１３ａにおけるモデルの結果を実施例２、３、５、６および７それぞれの図１１、１２ｂ、１５、１６および１７で示された実験結果と比較）。さらに、図１３ｂは、迅速な増幅方法と２種類の中程度に迅速な増幅方法とを一緒にした結果を示しており、このような条件下でも、ステムプライマーを使用して認められた全体の増幅速度の実質的な速度増加の種類はこのモデルでは認められないことを実証している。実際に、図１３ｃで明らかなように、３種類の迅速な増幅方法を一緒にした場合でも、全体の増幅速度は、個々の方法のいずれかよりもごくわずかに速いのみで、このことは、増幅の指数関数性を反映している（実施例２、３、４、５、６および７それぞれの図１１、１２ｂ、１５、１６および１７と比較）。
【００６０】
ステムプライマーがもたらすことができる増幅速度の増加は、いくつかの等温ＮＡＡＴで実証されたか、またはいくつかの等温ＮＡＡＴで働くことが実証された。ステムプライマーを特定のＮＡＡＴで使用した他のプライマーに対して展開することができる例を図１４ａ〜ｇに示す。実施例５、６および７は、図１４で示したＮＡＡＴ表現型のいくつかについての実験データを示している。それぞれの場合において、増幅速度の著しい増加を認めることができる（図１５〜１７）。
【００６１】
ＮＡＡＴを形成するコンカテマーにおけるステムプライマーのさらなる有用性は、蛍光、化学発光、電気化学レポーター系または「リアルタイム」で増幅の範囲を追跡する手段としての他のレポーター系において使用するためのプローブとなり得ることであろう。ステムプライマーは、アンプリコン中においてある種のプローブに影響を及ぼし得る逆方向反復を生成する必要がないので、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーなどを上回るプローブ含有プライマーとして利点を有することができよう。
【００６２】
本発明で使用した標的鋳型は、対象とするポリ核酸の増幅を可能にする適切な相互プライマー結合領域を含む、任意のポリ核酸であってもよい。当業者であれば、フォワード相互プライマー結合領域およびリバース相互プライマー結合領域がセンス鎖およびアンチセンス鎖それぞれにおいて増幅されるべき配列の５’に位置するように、フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位を標的鋳型上に配置する必要があることを理解するだろう。
【００６３】
標的鋳型は、１本鎖または２本鎖であってもよい。標的鋳型が１本鎖ポリ核酸の場合、当業者は、標的鋳型が最初に１個の相互プライマー結合領域のみを含むことを理解するだろう。しかし、第１のプライマーが結合すると、第２の相互プライマー結合領域を含有する相補鎖の合成が生じる。
【００６４】
標的鋳型は、ＲＮＡ分子から得てもよく、この場合、本発明の方法を実施する前にＲＮＡをＤＮＡに転写する必要がある。ＲＮＡを転写するために適切な試薬は当技術分野では周知で、限定はしないが逆転写酵素が含まれる。
【００６５】
フォワードおよびリバース相互プライマー結合領域に加えて、標的鋳型は、本発明の１個または複数のステムプライマーの結合を可能にするために十分な長さを有することが必要なステム領域を含むことが必要である。したがって、ステム領域の長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチドまたは少なくとも５００ヌクレオチドであることが好ましい。
【００６６】
当業者であれば、増幅に必要なプライマーに加えて、ＮＡＡＴはポリ核酸を合成するためにさらなる試薬を必要とすることに気づくであろう。必要な試薬は、当業者には明らかであろうが、一般的に、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼなどが含まれる。
【００６７】
当業者が認識するように、問題のＮＡＡＴを実施するために必要な全成分を添加した後、ポリ核酸を合成するために適切な条件を提供することが必要である。これは、例えば、適切なインキュベーション温度を提供することによって実現することができる。等温条件下で増幅が起こることが好ましい。これは、増幅中に温度を一定に維持することを意味する。「一定に」とは、温度変化が±１０℃以下であることを意味する。しかし、増幅工程の間、１０℃を超える１回の温度変化、１０℃を超える２回の温度変化、１０℃を超える３回の温度変化、１０℃を超える４回の温度変化、または１０℃を超える５回の温度変化を包含する方法も本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明によるポリ核酸の増幅は、当業者に既知の方法によって検出することができる。適切な方法には、限定はしないが、蛍光挿入色素、蛍光プライマーまたはプローブ、濁度の測定、電気化学的プローブ、生物発光シグナルおよび化学発光プローブの使用が含まれる。
【００６９】
ポリ核酸の増幅は、リアルタイム法、すなわち、ポリ核酸が増幅されるとき検出できる方法を使用して検出してもよい。このような検出系の例には、限定はしないが、蛍光（例えば、増幅中に添加される蛍光プローブ）、生物発光シグナルおよび電気化学的プローブが含まれる。一態様では、ステムプライマー自体を検出可能な部分、例えば、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識で標識して、ステムプライマー（複数可）が結合するアンプリコンの検出を可能にする。したがって、ＮＡＡＴを形成するコンカテマーにおけるステムプライマーのさらなる有用性は、「リアルタイム」で増幅の範囲を追跡する手段としての蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系において使用するためのプローブとなり得ることであろう。他の適切なレポーター系は、当業者には明らかであろう。ステムプライマーは、アンプリコン中においてある種のプローブに影響を及ぼし得る逆方向反復を生成する必要がないので、ＬＦＰまたはヘアピンプライマーなどを上回るプローブ含有プライマーとして利点を有することができよう。あるいは、増幅産物は、終点測定、すなわち、ポリ核酸の増幅が完了した後で行う測定を使用して検出してもよい。
【００７０】
ポリ核酸の増幅はまた、ＮＡＡＴ検出で使用した他の検出方法によって検出することができる。適切な例には、限定はしないが、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ（Ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｓｔｒｉｐ）、電気泳動、質量分析および音波検出が含まれる。
【００７１】
一実施形態では、リアルタイムでの生物発光アッセイ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｉｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ）（ＢＡＲＴ）レポーター系を使用してポリ核酸の合成を検出する。この系は、本明細書に参照により組み込んだＷＯ２００４／０６２３３８およびＷＯ２００６／０１０９４８に詳細に説明されている。ＢＡＲＴは、試料からの１種のシグナル、生物発光シグナルを生じる等温ＮＡＡＴ用に設計されたレポーター系の一例である。ＢＡＲＴは、無機ピロリン酸のホタルルシフェラーゼ依存検出を利用しており、無機ピロリン酸は「標的」配列がＮＡＡＴを使用して増幅されるとき大量に生成される。このように、分子診断は、均一測定法（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ）において、密封した試験管から放射される光を測定することによって簡単にＢＡＲＴによって実現することができる。ＢＡＲＴは、いくつかの異なるＮＡＡＴで証明されており、５０〜６３℃の間で操作する。光出力が増幅の瞬間速度の測定値を表すので、ＢＡＲＴレポーターは、ＮＡＡＴの増幅速度を追跡するために特に効果的な手段である（一方、例えば、蛍光出力はシグナルの蓄積を示し、したがって、増幅速度を得るために測定値を微分しなければならない）。例として、図２２は、特定の標的ＤＮＡ分子の希釈系列を検出するために、ＢＡＲＴはＬＡＭＰと併用して使用されることを示している。試料中の標的ＤＮＡの量が減少するにつれて、最大光増加時間に達するための誘導期（最大増幅に達するための誘導期に比例する）が増加することに注意されたい。別の表現でいうと、ＢＡＲＴにおいて陽性試料に関連した特徴的な光ピークに達するための時間は、試料中の標的ポリ核酸の量と逆比例して増加する。実施例ではＢＡＲＴレポーター系を使用しているが、本発明はＢＡＲＴの使用に限定するものではなく、増幅のリアルタイム測定において、または終点測定として使用されるかどうかに関わらず、蛍光、濁度、他の分光技術または電気化学的測定法などの方法にも等しく適用できることを強調する。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法は密閉容器中で実施される。試料が汚染される可能性を減少させるか、またはさらには防止することもできるので、これは非常に有用である。さらに、研究室が汚染される可能性を減少させるか、またはさらには防止することもできる。鋳型ポリ核酸またはアンプリコンの１コピーであっても研究室に流出したならば、試験すべき他の試料を汚染し、偽陽性の結果を招く可能性があるので、これは特に重要である。したがって、汚染を防ぐ能力は、本発明の方法を診断用途で使用する場合、特に重要である。
【００７３】
本発明による方法のさらなる応用は、生物の遺伝子コード中に特定のポリ核酸配列が存在するかどうかを決定することである。例えば、植物の特定の非遺伝子改変品種または遺伝子改変植物に関連したＤＮＡの検出のため、動物の系統品種に関連したＤＮＡの検出のため、または遺伝子試験もしくは法医学などの医学的もしくは獣医学的診断用途のため、鋳型核酸の元となる核酸が遺伝的に改変されているかどうかを決定するために使用することができるだろう。本発明の方法はまた、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために適している。
【００７４】
本発明による方法は、診断用途において使用することができる。特に、この方法は、患者および他の試料中の生物の同定および定量を可能にする。この生物は、任意の微生物、例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌であってもよい。微生物は、病原性であることができるが、非病原性微生物であってもよい。微生物はまた、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよい。さらに、本発明の方法は、疾患の状態を検出するため、治療による有害反応の予測のため、また疾患状態感受性の予測のため、遺伝子改変穀物および動物を同定するために使用することができる。
【００７５】
「患者試料」とは、患者から採取した任意の試料を意味し、血液、便、拭き取り検体、痰、気管支肺胞洗浄液、組織試料、尿または脊髄液を含むことができる。他の適切な患者試料およびその抽出方法は当業者には周知である。試料を採取した「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。試料が患者試料と特に言わなければ、この用語には、他の供給源から採取した試料も含まれる。例には、表面からの拭き取り検体、水試料（例えば、下水、海水、湖水、飲用水）、食品試料、化粧品、医薬品、発酵製品、細胞および微生物培養物および微生物の検出が所望される他の試料が含まれる。
【００７６】
他の態様では、本発明の方法で使用するためのキットを提供する。好ましくは、このようなキットには、標的ポリ核酸が供給された陽性対照の一部を形成しないという条件で、試験すべき標的ポリ核酸を除く、本発明の方法を実施するために必要な成分全てが含まれる。
【００７７】
本発明による方法で使用するためのキットには、以前に記載したように、ポリ核酸ポリメラーゼ、この核酸ポリメラーゼの基質および標的ポリ核酸の等温増幅に適したプライマーが含まれることが好ましい。より好ましくは、このキットはさらに、緩衝試薬、例えば、マグネシウムイオン源、またはベタインなどのＮＡＡＴの性能を向上させるための当技術分野で知られている添加物、またはトレハロースなどのキット試薬の有効期間を向上させることが知られている添加物またはアジ化ナトリウムなどの試薬の保存を助けることが知られている添加物を含む。あるいは、本発明の方法で使用するためのキットは、これらの成分および／または追加の成分のいくつかのみを含んでもよい。試料およびキットから除外された任意の他の成分は、その後使用中にキットに添加してもよい。
【００７８】
ＢＡＲＴをポリ核酸の検出のために使用するとき、熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素、例えば、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＰＰｉをＡＴＰに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子、例えば、アデノシン５’ホスホ硫酸をキットに含めてもよい。したがって、一実施形態では、ＢＡＲＴで使用するためのキットは、核酸ポリメラーゼ、ｂ）少なくとも１種のステムプライマー、ｃ）試験試料の等温増幅に適した少なくとも２種の相互プライマー、ｄ）熱安定性ルシフェラーゼ、ｅ）ルシフェリン、ｆ）ＡＴＰスルフリラーゼおよびｇ）アデノシン５’ホスホ硫酸を含む。
【００７９】
好ましくは、キットの成分の少なくとも１つは凍結乾燥されているか、またはキット中で保存するために適した別の形態である。より好ましくは、キットの全成分は凍結乾燥されているか、または保存に適した１つまたは複数の形態である。このような他の形態には、安定化要素が添加された成分、および／またはキットの成分を含有する冷蔵した、または凍結したマスターミックスが含まれる。
【００８０】
全般
数字の値ｘに関して「約」という用語は任意で、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００８１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸから構成されるか、または追加的なもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでいてもよい。
【００８２】
ＢＡＲＴとは、試料中に存在する鋳型ポリ核酸の量を測定する方法を意味し、増幅反応から生じた無機リン酸の存在を検出し、試料中の鋳型ポリ核酸の量を示す。
【００８３】
本発明の様々な態様および実施形態をここで実施例によってより詳細に説明する。詳細の改変は、本発明の範囲を逸脱することなく行ってもよいことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】２個のプライマーのみ（図１ａ）または数個のプライマー（図１ｂ）のいずれかを使用した指数関数的増幅に一般的に必要なポリヌクレオチド上の２つの領域を示す。これらの領域に関して、本発明の対象であるポリヌクレオチドのステム領域を図１ｃに明示する。図１ｄは、これらの方法によって形成された予測された第１世代アンプリコンにおける、本明細書でＬＡＭＰおよびＴＲＡと称したＮＡＡＴのステム領域を明白に示しており、これは、ステム領域が分子内ループの形成に関与したアンプリコンの領域の間に存在することを示している。実際に、ＬＡＭＰおよびＴＲＡは異なった第１世代を表すが（関連する特許出願において）、その構造は実際には同一であることに注意されたい。図１ｅは、標的鋳型上の本明細書でＬＡＭＰおよびＴＲＡと称するＮＡＡＴのステム領域を明白に示している。
【００８５】
【図２】１個、２個またはそれ以上のステムプライマーをステム領域中に配置することができる様々な手段を示す。
【００８６】
【図３】主要アンプリコン（図３ａ）、第１世代アンプリコン（図３ｂ）および次世代アンプリコン（図３ｃ）の生成を含む本明細書で言及した様々な種類のアンプリコンの生成を示す。
【００８７】
【図４】ＬＦＰがコンカテマー構造を形成することができる方法を示す。最初の場合では、５’末端に逆方向反復を有する主要アンプリコンが形成され（図４ａ）、したがって、図４ａ（ｉｉ）をよく見ると、主要アンプリコンの５’末端から、Ｆ１領域、さらにこのアンプリコンに沿って、同じ鎖内にこの領域の相補体、Ｆ１ｃ領域（この図および以下の図における小文字のｃは、プライマー結合領域の相補体を示す）があることが分かる。主要アンプリコンを１本鎖にし、別のプライマーによるコピーに利用されるようにするための特定のＮＡＡＴによってもたらされる機構は図４ａでは明らかではないが、得られた第１世代アンプリコンを示す図４ａ（ｉｉｉ）につながる２つの黒い矢印によって表されている。 ＬＦＰによって形成された第１世代アンプリコン自体は、さらなるアンプリコンを生成するためのプライマーとして作用することができる。それが行われると、第１世代アンプリコンはコンカテマー構造を形成することができる。コンカテマーが形成し得るおおまかな機構は２つあり、１つは図４ｂで示したように分子内事象を介し、もう１つは図４ｃに示したように分子間事象を介する。いずれの場合においても、この方法によってコンカテマー内にアンプリコンの１本鎖領域が生成されることに注意し、図４ｂ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）および４ｃ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の領域Ｆ２を参照されたい。これらはさらにＬＦＰを結合することができる。その後の工程については図８を参照されたい。
【００８８】
【図５】図５は、コンカテマー形成に必要な逆方向反復が既にヘアピンプライマーに備わっており、ＬＦＰのように鎖伸長を形成する必要がないこと以外は、図４と同一の方法を示す。
【００８９】
【図６】本明細書で言及した様々なプライマーの性質を示す。図６ａでは、プライマーの実質的に大部分または全てがポリヌクレオチド鋳型とのワトソン−クリック塩基対に関与している「単純プライマー」を示す。図６ｂでは、ＬＦＰは、単純プライマーの３’末端の結合部位の３’領域と実質的に同一な追加の５’領域を有し、前記単純プライマーとはどのように異なるかを示している。この結果、このプライマーが伸長すると、プライマーの５’領域と伸長産物の間に逆方向反復が生成される（図４ａ（ｉｉ）も参照されたい）。図６ｃでは、ＳＥＡで使用したヘアピンプライマーを示す。これらのプライマーの５’領域は逆方向反復を含有するため、５’領域がヘアピン構造に折り畳まれることが予測される。このヘアピンは、非常に少ない１本鎖ヌクレオチドを含有する緊密なヘアピンであることが予測され、したがって、この１本鎖領域は別のプライマーと結合するために利用できるとは考えられない。しかし、図６ｄのように実質的なループを形成するためにヘアピンを拡張すると、このループに対するプライマーの結合は起こり得るだろう。
【００９０】
【図７】２種類の異なる増幅技術の結果を並べて示した、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを示しており、１つがＬＡＭＰでもう１つがＴＲＡである。ＬＡＭＰでは、増幅に置換プライマーおよびＬＦＰが使用され（しかしループプライマーは使用されない）、ＴＲＡでは増幅にＬＡＭＰと同じＬＦＰが使用されるが、他のプライマーは存在しない。 ＬＡＭＰおよびＴＲＡのいずれもコンカテマーアンプリコンをもたらすことは容易に認めることができる。さらに、アンプリコンの大きさは見かけ上同一である。これは、ＴＲＡおよびＬＡＭＰが共通のコンカテマー化機構を使用していることを示している。
【００９１】
【図８】既に生成したループにさらにＬＦＰを結合する効果を図８に示す。図８ａは、第１世代アンプリコンの（または次世代アンプリコンのための）分子内自己プライミングから形成されたループへのＬＦＰ結合を示す。図８ｂは、分子間で形成されたループにおける同様の結合を示す。いずれの場合においても、新たに結合したＬＦＰの伸長は、反対の鎖が１本鎖になる原因となる（図８ａ（ｉｉ）および図８ｂ（ｉｉ））。図９は、ステムプライマーがどのようにこれらの領域に結合できるかを示している。図８ｃは、ヘアピンプライマーの改変（図８ｃ（ｉ））がプライマーの３’末端と同じ配列を含有する本質的に１本鎖であるループを形成するように行われているならば（図８ｃ（ｉｉ）に見られるように）、得られた次世代アンプリコンはさらなるヘアピンプライマーを結合するための１本鎖ループを形成するだろうことを強調している（図８ｃ（ｉｉｉ））。
【００９２】
【図９】分子内（図９ａ（ｉ））または分子間（図９ａ（ｉｉ））いずれかの次世代アンプリコン形成のために、アンプリコンステムの領域は１本鎖としてステムプライマーと結合するために曝露され、利用することができる。これは、ＬＦＰによって形成される相互ループの場合でもあり（すなわち、また生成する図８ａで示したループの相互鎖）、このループは、ＬＦＰと同じセンスであるのでＬＦＰには結合できないが、使用したいわゆる「ループプライマー」の１つは結合することができる（図９ｂ（ｉ））。ループプライマーの伸長はまた、アンプリコンステム１本鎖の領域を形成し、したがってステムプライマーが結合するために利用することができる（図９ｂ（ｉｉ））。
【００９３】
【図１０】ＳＥＡについて、アンプリコンの自己伸長を介した次世代アンプリコンの再コピーがまた、ステムプライマーによる結合のために利用可能なアンプリコンステムの領域をどのように形成するのかを示す。
【００９４】
【図１１】リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）系における３種類の異なるプライマーのセットについて、ＴＲＡおよびその後のＢＡＲＴでのステムプライマー使用による速度増加を示す。ＬＦＰおよびステムプライマーの位置を図１１（ｉ）に示す。図１１（ｉｉ）〜図１１（ｉｖ）は、ＬＦＰの遅い、中程度および速いセットに応じて、ステムプライマーが存在しない場合の速度（左のパネル）とステムプライマーが存在する場合の速度（右のパネル）のＢＡＲＴによる比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９５】
【図１２】リステリア・モノサイトゲネス系におけるＴＲＡでのステムプライマーの使用（図１２ａ（ｉ））をどのように３種類の独立した増幅方法に分解することができるかを強調しており、そのうちの１つはＴＲＡで、他の２つはＡＴＲＡである（図１２ａ（ｉｉ））。両ＡＴＲＡ、ＴＲＡおよびプライマーの全組み合わせの速度のＢＡＲＴ比較を図１２ｂ（ｉ）〜（ｉｖ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９６】
【図１３】３種類の異なる増幅反応を組み合わせたＢＡＲＴの速度論モデルを示す。図１３ａでは、迅速なＮＡＡＴを２種類の非常に遅いＮＡＡＴと組み合わせると、増幅の全体速度（すなわち、３種類の増幅反応の速度の合計）が３種類のＮＡＡＴの最も迅速な時期と同一のＢＡＲＴピークをもたらすことを認めることができる。図１３ｂでは、迅速なＮＡＡＴを２種類のやや迅速なＮＡＡＴと組み合わせること以外は１３ａの通りで、この場合、増幅の全体速度は、ごくわずかに影響を受けるのみで、ＢＡＲＴピークはほんの数分早くなる。図１３ｃはいわゆる遅いＮＡＡＴが今度は最も迅速なＮＡＡＴと同じ速さであること以外は１３ａおよびｂの通りであり、組み合わせた増幅の全体速度はまたごくわずかな影響を受けるのみで、ＢＡＲＴピークはほんの数分早くなる。図１３は、いくつかの異なる指数関数的方法を同時に行う場合、ステムプライマーを使用して認められるように、著しく早いＢＡＲＴピークは認められないことを示している。これによって、別個のより遅い、または類似の速度の方法を追加するよりも、特定のＮＡＡＴで使用すると、ステムプライマーは増幅の本質的な速度を根本的かつ顕著に増加させるように作用することが強調される。
【００９７】
【図１４】図１４の（ａ）から（ｇ）のそれぞれについて、各図の部分（ｉ）は、２本鎖鋳型について、様々なＮＡＡＴによって使用されたプライマーのプライマー結合部位の位置を示している。フォワード相互結合領域と関係のあるプライマーは、Ｆで示され、リバース相互結合領域と関連のあるプライマーはＲで示される。各図の部分（ｉｉ）は、特定のＮＡＡＴによって使用される様々なプライマーがそれぞれの鎖のどこに結合するかを示し、ステムプライマーと結合することが可能な位置も示されるが、ステムプライマーの正確な位置および使用したステムプライマーの数は、図２に詳述したように大きく異なり得る。 図１４ａは、ＴＲＡにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｂは、ＬＡＭＰにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｃはループプライマーも使用するＬＡＭＰの改善された表現型において作用するステムプライマーを示している。図１４ｄは、ＳＥＡにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｅは、ＳＭＡＰにおいて作用するステムプライマーを示している。図１４ｆは、ＡＴＲＡにおいて作用するステムプライマーを示し、図１４ｇはネステッドＬＦＰを備えたＴＲＡの変形形態で作用するステムプライマーを示している。
【００９８】
【図１５】サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）系におけるＴＲＡでのステムプライマーの存在下および非存在下におけるネスティングＬＦＰの影響を示す。 図１５ａは、ステムによって加速されたＴＲＡ（図１５ａ（ｉ））とステムによって加速されたＬＡＭＰ（図１５ａ（ｉｉ））およびステムによって加速されたネステッドＴＲＡ（図１５ａ（ｉｉｉ））の比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。 図１５ｂ（ｉ〜ｉｖ）は、ステムプライマー非存在下および存在下それぞれに応じた内部ＬＦＰ、外部ＬＦＰ、内部および外部ＬＦＰの両方を有するＴＲＡのＢＡＲＴ速度の比較を示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【００９９】
【図１６】リステリア・モノサイトゲネス系において、ＬＡＭＰ、次いで、ＢＡＲＴでのステムプライマーを用いる速度増加を示す。全プライマーの位置を図１６（ｉｉｉ）に示し、ステムプライマー非存在下および存在下でのＢＡＲＴによる速度の比較を図１６（ｉ）および図１６（ｉｉ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、認められる場合、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【０１００】
【図１７】リステリア・モノサイトゲネス系においてＴＲＡ、次いでＢＡＲＴでの、ステムプライマーを用いる速度増加を示しており、ステムプライマーは前述の実施例と比較してステムの異なる領域に位置している。全プライマーの位置を図１７（ｉｉｉ）に示し、ステムプライマー非存在下および存在下での速度のＢＡＲＴによる比較を図１７（ｉ）および図１７（ｉｉ）に対応して示す。各図において、より早いピークはより高いコピー数（１０８）を表し、遅いピークは、標的の１０４コピーを表す。鋳型を含まない対照は、薄い灰色で示す。
【０１０１】
【図１８】例えば、ＬＡＭＰにおけるループプライマーと比較してステムプライマーを配置するのは自由度が大きいことを示す。ループプライマーは、厳密にいうとＦ１とＦ２部位またはＲ１とＲ２部位のいずれかの間に限定される。ループが十分な長さでないか、またはループプライマーがプライマー二量体によって非特異的増幅を引き起こす傾向があるために、配列に１個または両方のループプライマーを効率よく配置することができないならば、代わりのループプライマー設計を選択する余地はほとんど残されていない。ステムプライマーは、ステムのどこにでも配置することができ、どちらの方向にすることもでき、いかなる非特異的なプライマーの二量体化も回避する一方で、可能な設計を選択する余地が広く、最も効率よく最適化することができる。
【０１０２】
【図１９】適切なプライマー結合部位が四角で囲った領域で示されている、仮定のポリヌクレオチド配列を（ｉ）に示す。しかし、灰色の領域は、おそらく生物のゲノムのこの部分の配列の保存性が良好なため、白色の領域よりも実質的に好ましい結合部位である（例えば、異なる株間で配列変動が著しい病原体の診断試験を設計するとき関係がある）。図１９（ｉｉ）において、およびループプライマーを使用したＬＡＭＰに関しては、ＬＡＭＰのこの表現型で使用されるプライマーに様々な領域が割り当てられている。プライマーのうち４つは、最適ではない結合部位に配置されなければならず、最適な１つの結合部位は全く使用されないことに注意されたい。これは明らかに理想的ではない。別の方法では、図１９（ｉｉｉ）に示したように、最適な部位全てが使用されるようにプライマーが配置されることであろう。しかし、この表現型では、Ｒ２およびＲ１部位が非常に密接で、ループＲプライマーのための部位が全て失われることを意味しており、本発明者らはまた、Ｒ１およびＲ２部位が非常に密接な場合（または相互Ｆ１およびＦ２部位）、おそらく形成されたループ内の立体的妨害のために、最適ではない増幅が生じる可能性があることを確認し、本発明者らはさらに、一般的にループプライマーが置換プライマーよりも増幅速度を増加させることを観察した。したがって、図１９（ｉｉｉ）におけるプライマーの割り当ては特に理想的ではないと予測することができる。しかし、図１９（ｉｖ）では、ステムプライマーの使用を採用することによって、最適な結合部位全てを使用することができ、ループおよび置換プライマー部位全てを利用することができる。したがって、ステムプライマーはプライマー設計のための柔軟性を増加させた。
【０１０３】
【図２０】置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）プライマー、ループプライマーおよびステムプライマーのいずれについても示したように、「単純プライマー」以外の様々な種類のプライマーを使用することが可能である。多くの可能な組み合わせのうち３つを図２０（ｉ）から（ｉｉｉ）に示すが、フォワード相互プライマー結合領域およびステム領域のみを示している。（ｉ）では、ＬＦＰ、ヘアピンプライマーおよび単純プライマーの組み合わせを使用しており、（ｉｉ）では、ループプライマーはＲＮＡの領域またはニッカーゼの切断部位のいずれかを含有する改変された単純プライマーによって表され、（ｉｉｉ）では、ＬＦＰ、ヘアピンプライマーおよび切断可能な単純プライマーのさらに可能な組み合わせを示している。多くの他の可能な組み合わせがあることは十分に明らかである。
【０１０４】
【図２１】ステムプライマーがコンカテマーに作用する場合、ステムプライマーの作用によって指数関数的に増幅可能なアンプリコンが生成されるのみであることを示す。図２１の左には、ステムプライマーの第１世代アンプリコンに対する作用を示しており、得られたアンプリコンがリバース相互プライマー結合領域のみを含有し、指数関数的増幅に必要なフォワード相互プライマー結合領域を含有しないことが分かる。図２１の右には、対照的に、ステムプライマーがコンカテマーによって伸長できるとき、ステムプライマー２についてはあてはまるが、ステムプライマー１にはあてはまらないように、得られたアンプリコンはフォワードおよびリバース相互プライマー結合領域の両方を有し、したがって、指数関数的増幅のための基質であることが分かる。
【０１０５】
【図２２】ＢＡＲＴ−ＮＡＡＴの一例を示しており、この技法の定量性を強調している。ＢＡＲＴ技術は、生物発光出力が瞬間の増幅速度を反映しているので、ＮＡＡＴにおける増幅速度を追跡するために有効な手段となっている。
【０１０６】
【図２３】（ｉ）にＭＲＳＡと関係があるＳＣＣｍｅｃカセットの一部を示す。ＳＣＣｍｅｃ移動性遺伝子要素を、ＭｅｃＡ遺伝子を介して抗生物質メチシリンに対する耐性を担うスタフィロコッカス・アウレウスのＯｒｆＸ遺伝子の保存された領域に組み込む。したがって、ＭｅｃＡ遺伝子およびＯｒｆＸ遺伝子は同じＤＮＡ鎖上にあるが、配列におけるＭｅｃＡ遺伝子とＯｒｆＸ遺伝子の距離はＳＣＣｍｅｃの異なるバージョン（したがって、ＭＲＳＡの異なる株）の間では大きく変動し得る。したがって、ＭＲＳＡの診断アッセイにおいて、特定のＮＡＡＴの相互プライマー結合領域としてＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子を使用することは、技術的に挑戦的であることが分かる。例えば、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子が５００塩基対より遠く離れている場合、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸ遺伝子がフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位のための部位として使用されるならば、ＬＡＭＰは任意の産物を増幅することはできないようである（ｉｉ）。しかし、ステムプライマーはＬＡＭＰなどのＮＡＡＴが標的を増幅する能力を劇的に向上させ、ＭｅｃＡおよびＯｒｆＸをフォワードおよびリバース相互プライマー結合部位として使用するアンプリコンの「ステム」がいくつかのステムプライマーによって標的化可能となり、ステムプライマーがフォワードおよびリバース相互プライマーと連結して働くことが示されたので、したがってステムプライマーはＬＡＭＰなどの適切なＮＡＡＴを使用してＭＲＳＡの直接的検出を可能にすることができる（ｉｉｉ）。ＭｅｃＡ遺伝子とＯｒｆＸの間の領域に変更をもたらすために様々なステムプライマーを使用することができる。 前述のようなステムプライマーの使用は、ＭＲＳＡの存在を示すためにＯｒｆＸおよびＭｅｃＡ以外のＳＣＣｍｅｃの領域のみに頼る既存の技法よりも有益である。これは、スタフィロコッカス・アウレウスの一部が、ＭｅｃＡ遺伝子を有さず、したがって、実際にはＭＲＳＡではないＳＣＣｍｅｃ挿入を含有するからである。本発明の方法は、同じＤＮＡ鎖上にＯｒｆＸおよびＭｅｃＡの両方を必要とするので、ＳＣＣｍｅｃは含有するがＭｅｃＡ遺伝子を含有しない株から偽陽性が生じる可能性はない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
得られたアンプリコンがいずれもコンカテマーで、見かけ上同一であることを示すＬＡＭＰとＴＲＡの比較
サルモネラ・エンテリティディス侵入性Ａ遺伝子の２ｋｂ断片は（コピー数は反応によって１０８から１０２の間で変化した）、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）によって、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴおよびＴＲＡ−ＢＡＲＴにおいてＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）０．３２Ｕ／μｌおよびホタルルシフェラーゼ１１．２μｇ／μｌを使用すること以外は実施例２と同一の条件下で６０℃で増幅した。反応混合物は、Ｒ−ＬＦＰ（６）およびＦ−ＬＦＰ（６）プライマーそれぞれ０．８μＭおよび置換プライマーＲＤ（２）およびＦＤ（２）０．２μＭを含有した。各反応の全量は２０μｌであった。反応は１００分行った。
【０１０８】
ＬＦＰプライマーセット６（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
Ｒ−ＬＦＰ（６） ５’−ａａｃ ｃｔｔ ｇｔａ ｇａｇ ｃａｔ ａｔｔ ｃｇｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｃｃｇ ｃｃａ ｔｔｇ ｇｃｇ ａａｔ ｔｔａ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（６） ５’−ｔｃｔ ｃｔｔ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃａｃ ａａｔ ｇｔｔ ｔｔｔ ａａｇ ｃｇａ ａｃｇ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃｇ
置換プライマーセット２（ＲＤは標的配列上のＲ３ｃに結合し、ＦＤはＦ３に結合する）
ＲＤ（２） ５’−ｃａｔ ｔａｃ ｔｇｃ ｔｃｇ ｔａａ ｔｔｃ
ＦＤ（２） ５’−ａｔａ ｔｃｔ ｇａａ ｇｔｔ ｔｔｇ ｃａｇ ｃ
【０１０９】
ゲル上のパターンは、置換プライマー、ＲＤおよびＦＤの有無には左右されず、ＬＦＰによってのみ特徴付けられる（図７）。ＬＡＭＰおよびＴＲＡの両方の増幅は、全く同じパターンのラダーを生じ、類似の機構によって生じることを強く示している。置換プライマーは、ＬＡＭＰ増幅の開始段階では重要な役割を担うことができるが、その後のアンプリコン増大段階ではいかなる効果も示さない。
【０１１０】
実施例２
異なる効果のＬａｍｐプライマーとステムプライマーのリステリア・モノサイトゲネスＴＲＡに対する効果
リステリア・モノサイトゲネスインターナリン（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｎ）Ａ遺伝子の断片を含有するｐＬＳ−プラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）によってＴＲＡ-ＢＡＲＴを５５℃で使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、１０８または１０４を含む１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の、Ｒ−ＬＦＰ、１、２もしくは３およびＦ−ＬＦＰ１、２または３プライマーそれぞれ０．８μＭ（遅い、中程度または速い）、ステムＲプライマー０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ）、ｄＮＴＰ（合計）０．８ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．１６Ｕ／μｌ（ＮＥＢ）、ルシフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アデノシン５’−ホスホスルフェート０．２５ｍＭ（Ｂｉｏｌｏｇ）、ホタルルシフェラーゼ５．６μｇ／μｌ（ＵｌｔｒａＧｌｏｗ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰ-スルフリラーゼ０．３７５Ｕ／ｍｌ(ＮＥＢ)。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。標的鋳型に対するプライマーの相対的方向を図１１（ｉ）に示すが、以下に挙げた配列から分かるように、実際に使用したプライマーは、Ｂ２ｃおよびＦ２結合領域の配列が大きく異なる。
【０１１１】
（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
遅いＬＦＰセット１
Ｒ−ＬＦＰ（１） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ａａｇ ａａａ ｃａａ ｃｃａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｇ
Ｆ−ＬＦＰ（１） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ａｔｔ ａｔｃ ａａａ ｃｇｔ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｔａ ｇｃ
中程度のＬＦＰセット２
Ｒ−ＬＦＰ（２） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ａｔｇ ｃｔａ ａｇｔ ｔｔｃ ａｔｇ ｔｇｇ ａｃｇ
Ｆ−ＬＦＰ（２） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｔｔ ｔｇａ ｇａｔ ｇｔｔ ｇｔｔ ａｃａ ｃｃｇ ｔｃ
速いＬＦＰセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１１２】
ステムプライマーの存在下では、いずれのＬＦＰプライマーセットでも、または存在する標的のいずれの量でも、増幅がより速く生じた。遅い、および中程度のＬＦＰプライマーセットでは（それぞれ図１１（ｉｉ）および（ｉｉｉ））、ステムプライマーがない場合、標的の１０８コピーのみが９２分および７３分に対応するピークで検出でき、一方、ステムプライマーが存在する場合、１０８コピーが３９分および４１分にピークとして検出でき、同様にアッセイ時間内に５５分および６２分のピークを有する１０４が検出できた。速いプライマーセット３の場合（図１１（ｉｖ））、３９分および６０分にピークのある低コピー数および高コピー数の両方が検出され、一方、ステムプライマー存在下では、より早い２２分および３４分のピークが検出された。この実施例は、様々な有効性、長さ、位置、Ｔｍ、ＧＣの豊富さ、形成するループの大きさおよび他のパラメータのＬＦＰプライマーのセットにステムプライマーを添加することによって、増幅の本質的な加速を実現できることを示している。
【０１１３】
実施例３
対称、非対称およびステムによって加速された対称リステリア・モノサイトゲネスＴＲＡの比較
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ（ＩｌｎＡ）遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用い、Ｒ−ＬＦＰ（３）、Ｆ−ＬＦＰ（３）、ＳｔｅｍＢ（１）およびステムＦ（１）プライマーそれぞれ０．８μＭの異なる組み合わせを使用して増幅した。
【０１１４】
ＬＦＰプライマーセット３
（Ｒ−ＬＦＰは標的配列上のＲ２ｃに結合し、Ｆ−ＬＦＰはＦ２に結合する）
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１１５】
両方の非対称増幅は非常に遅く、８４分および７５分それぞれにピークを有するリステリアＩｎｌＡ標的の高コピー数のみ検出した。ＬＦＰの同じセットを含む対称ＴＲＡは、１０８コピーについては３８分のピークおよび１０４コピーについては５６分のピークでより速い増幅速度を示した。ステムプライマーをＴＲＡの対称表現型に添加すると、高コピー数は２３分にピークを示し、低コピー数は３４分にピークを示し、したがって、ステムプライマーがない場合に認められる速度と比較して著しい増加が示された（図１２ｂ）。３種類の遅い速度の単純な加算では、数学的なモデル化によっても示されたように、増幅速度のこのような著しい増加を説明するには十分ではないだろう（実施例４）。
【０１１６】
実施例４
シミュレートしたＢＡＲＴ速度曲線は、モデル化した指数関数的方法のための標準的リチャード曲線（Ｒｉｃｈａｒｄ'ｓ ｃｕｒｖｅ）式を使用してマイクロソフトエクセルで作成した（図１３）。増幅の速度論は、異なる速度論を有する別の増幅方法のためにモデル化した。異なる、類似したまたは同一の速度論の別個の増幅方法を組み合わせる効果も、図１３に示す。図１３ａ、ｂおよびｃの比較から分かることは、別個の異なる増幅方法を組み合わせることの増幅の全体速度に対する全体的効果は、３種類の速い増幅方法を組み合わせても、驚くほど小さいことである（図１３ｃ）。これは、ステムプライマーの効果が、付加的な増幅方法を単純に付加するよりも増幅速度を根本的に増加することであることを強調している。
【０１１７】
実施例５
（Ａ）リステリア・モノサイトゲネスのステムによって加速されたＴＲＡに対する置換プライマーおよび外部ループ形成プライマーの効果の比較
リステリア・モノサイトゲネスＩｎｌＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。Ｒ−ＬＦＰ（３）、Ｆ−ＬＦＰ（３）、ステムＦ（１）およびステムＲ（１）それぞれ０．８μＭを含有する反応とＯｕｔｅｒＲ（１）およびＯｕｔｅｒＦ（１）またはＯｕｔｅｒＲ−ＬＦＰ（７）およびＯｕｔｅｒＦ−ＬＦＰ（７）をそれぞれ０．８μＭ添加した反応の比較を行った。
【０１１８】
ＬＦＰプライマーセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
置換プライマーセット１
ＲＤ（１） ５’−ｔａａ ｔｇｃ ｔａａ ｇｔｔ ｔｃａ ｔｇｔ ｇ
ＦＤ（１） ５’−ａｔａ ａｔｃ ｔａｃ ｔｇｔ ｔｔｇ ａｇａ ｔｇ
ＯｕｔｅｒＬＦＰプライマーセット７
Ｒ−ＬＦＰ（７） ５’−ｃｔｔ ｃｔｔ ｔｇｇ ｔｔｇ ｔｔｔ ｃｔｔ ｔｇｃ ｃｔｔ ｔｔｔ ｇｃｔ ａａｇ ｔｔｔ ｃａｔ ｇｔｇ ｇａｃ
Ｆ−ＬＦＰ（７） ５’−ｇｔａ ｔｔａ ａｃａ ｇｃｔ ａｃａ ｃａｇ ｃａａ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇａｇ ａｔｇ ｔｔｇ ｔｔａ ｃａｃ ｃｇｔ ｃ
【０１１９】
この実施例においてステムによって加速されるＴＲＡは、コピー数１０８および１０４の両方が２３分および３５分のそれぞれにピークがあるＩｎｌＡ遺伝子の迅速な増幅を生じる。異なる２つの外部プライマーセットを添加すると、高コピー数および低コピー数のピーク時間が１８分および３１分に対応して減少した（図１５ａ）。置換プライマーをＬＦＰに置換すると、増幅反応が迅速に進行する（図１５ａ（ｉｉｉ））。
【０１２０】
（Ｂ）ステムによって加速されるサルモネラ・エンテリティディスネステッドＴＲＡ
サルモネラ・エンテリティディス侵入性Ａ（ＩｎｖＡ）遺伝子の断片を含有するｐＬＳ−プラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）を使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、１０８または１０４を含む１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の、以下に示したような内部および／または外部リバースおよびフォワードＬＦＰそれぞれ０．８μＭ、ＳｔｅｍＢ０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ）、ｄＮＴＰ（合計）１．６ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．１６Ｕ／μｌ（ＮＥＢ）、ルシフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アデノシン５’−ホスホスルフェート０．２５ｍＭ（Ｂｉｏｌｏｇ）、ホタルルシフェラーゼ５．６μｇ／μｌ（Ｕｌｔｒａ Ｇｌｏｗ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰ-スルフリラーゼ０．３７５Ｕ／ｍｌ(ＮＥＢ)。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。
【０１２１】
内部ＬＦＰプライマーセット４
Ｒ−ＬＦＰ（４） ５’−ｇｇａ ｇｃａ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｇｔ ｔａｔ ａｔｔ ｔｇｔ ｔｔｔ ｃｇｃ ｃａｔ ｔｇｇ ｃｇａ ａｔｔ ｔａｔ ｇ
Ｆ−ＬＦＰ（４） ５’−ｃａｃ ａａｔ ｇｃｇ ａｇｃ ｇｃｔ ｔｃｃ ｔｔｔ ｔｔａ ａｇｃ ｇａａ ｃｇｔ ｇｔｔ ｔｃｃ ｇ
外部ＬＦＰプライマーセット５
Ｒ−ＬＦＰ（５） ５’−ｃｇａ ａｔｔ ａｃｇ ａｇｃ ａｇｔ ａａｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ｔｃｃ ｔｃａ ａｃｔ ｔｃａ ｇｃａ ｇ
Ｆ−ＬＦＰ（５） ５’−ｃａａ ａｃｇ ｃｔｇ ｃａａ ａａｃ ｔｔｃ ａｇｔ ｔｔｔ ｔｔａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｃ ｔｃａ ｇａｃ ａｔｇ
ステムプライマーセット２
ステムＦ（２） ５’−ｃｃｔ ｔｇｔ ｇｇａ ｇｃａ ｔａｔ ｔｃｇ
ステムＢ（２） ５’−ｇａｃ ａｔｃ ｔｔｔ ｔｔｃ ｔｃｔ ｔｇｇ ｃｇ
【０１２２】
このサルモネラ・エンテリティディスＩｎｖＡ ＴＲＡ系では、個々に使用したＬＦＰの両セットは非常に遅いので、アッセイの１００分以内の標的コピー数が１０８の高さでも検出することができなかった。ステムプライマーが存在しない場合のネステッドＴＲＡでは、増幅は、６８分にピークを有する高標的コピー数のみを検出するのに十分な速さであった。ステムプライマーを添加すると、速度の増加が生じ、ピーク時間３４分および６１分に対応する高および低標的コピー数の両方が検出可能になった（図１５）。この実施例は、様々な標的およびＬＦＰの様々な表現型について、ステムプライマーによる増幅の加速が認められることを示している。
【０１２３】
実施例６
ステムによって加速されたリステリア・モノサイトゲネスＬＡＭＰ
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを５５℃で、ＴＲＡ-ＢＡＲＴで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は２０μｌであった。試験は１００分行った。完全なＬＡＭＰプライマーミックス(各ＬＦＰ０．８μＭ、各ループプライマー０．４μＭ、各置換プライマー０．２μＭ）を含有する反応とステムＲプライマー０．８μＭおよびステムＦプライマー０．８μＭを添加した反応とを比較した。
【０１２４】
ＬＦＰプライマーセット１
Ｒ−ＬＦＰ（１） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｃａ ａａｇ ａａａ ｃａａ ｃｃａ ａａｇ ａａｇ ｔｇｇ
Ｆ−ＬＦＰ（１） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ａｔｔ ａｔｃ ａａａ ｃｇｔ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｔａ ｇｃ
ループプライマー
ループＲｃ５’−ｃａｇ ｔｃａ ａｔａ ａａｔ ｔｃｃ ｃａｇ ｃ
ループＦ ５’−ｃａｔ ｃｇａ ｔｔｔ ａｔａ ｔｇｃ ｇｃａ ａｔ
置換プライマーセット１
ＲＤ（１） ５’−ｔａａ ｔｇｃ ｔａａ ｇｔｔ ｔｃａ ｔｇｔ ｇ
ＦＤ（１） ５’−ａｔａ ａｔｃ ｔａｃ ｔｇｔ ｔｔｇ ａｇａ ｔｇ
ステムプライマーセット１
ステムＦ（１） ５’−ｔｃａ ａａｃ ｃａｃ ｃｃａ ａｃａ ａａｔ ｇ
ステムＲ（１） ５’−ａａｃ ｃｇｇ ｃｇｇ ａａｃ ｔａａ ａｔ
【０１２５】
これは、リステリア・モノサイトゲネスＩｎｌＡ標的の高および低コピー数を非常に迅速に検出したＬＡＭＰ増幅の一例である。ステムプライマーがないと、１０８コピーは１７分にピークがあり、１０４コピーは２６分にピークがあった。ステムプライマーを添加すると反応がさらにいっそう加速され、ピーク時間が１０８コピーでは１３分に、１０４コピー数では１９分に短縮した（図１６）。この場合、加速は、今まで開発された最も効率的な等温増幅系のひとつであるＬＡＭＰによって実現した。検出時間の短縮は、一般的に使用時点（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｕｓｅ）での適用のため、および特に医学的診断におけるケア時点（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）での検査にとって、非常に重要である。
【０１２６】
実施例７
ステムプライマーの異なる方向によって加速したリステリア・モノサイトゲネスＴＲＡ
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンＡ遺伝子の断片を含有するｐＬＳプラスミドを、５５℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるＬｕｃｙ（Ｌｕｍｏｒａ）において、実施例２の条件と同一の条件で、多量または少量、１０８または１０４のプラスミドを用いてＴＲＡ−ＢＡＲＴで増幅した。各０．８μＭで添加したステムＲ（３）およびステムＦ（３）プライマーの存在下および非存在下でのみ、Ｒ−ＬＦＰ（３）およびＦ−ＬＦＰ（３）プライマーを用いて実施した反応の比較を行った。
【０１２７】
ＬＦＰプライマーセット３
Ｒ−ＬＦＰ（３） ５’−ｃｃｔ ｔｃｔ ｔｔｔ ａｃａ ｇｇｃ ｔｔａ ｇｃｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｇｇａ ａｇｃ ｔｇｇ ｇａａ ｔｔｔ ａｔｔ ｇａｇ ｔｇ
Ｆ−ＬＦＰ（３） ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｇ ａｔａ ａａａ ｔｇｃ ｃｇｔ ｔｔｔ ｇｃｇ ｃａｔ ａｔａ ａａｔ ｃｇａ ｔｇｔ ｃａｔ ｔｔｇ
ステムプライマーセット３
ステムＦ（３） ５’−ａｇｔ ｔｃｃ ｇｃｃ ｇｇｔ ｔｔｇ
ステムＲ（３） ５’−ａｃａ ｔｔｔ ｇｔｔ ｇｇｇ ｔｇｇ ｔｔｔ ｇ
【０１２８】
この実施例では、アンプリコンのステム上の様々な位置のステムプライマーの加速効果を実施例２で示したものと比較して示した。ＴＲＡ-ＢＡＲＴは、ステムプライマーがなくても、ピーク時間３９分および６９分に対応する高および低コピー標的の両方を検出した。ステムプライマーを添加すると反応が著しく加速され、ピーク時間が２２分および３９分に短縮した。ループプライマーとは異なり、ＬＦＰによって形成したループによって位置を厳密に決定し、方向を固定すると、ステムプライマーは内部Ｆ１〜Ｂ１領域の間のどこにでも位置することができ、任意の方向にすることができる。加速効果は、ステムプライマーの位置または方向とは関係なく認められる（図１７）。
【０１２９】
配列
リステリアＩｌｎＡ遺伝子断片（配列番号１）
GGCAATTTTTAATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATTGACTGAACCAGCTAAGCCTGTAAAAGAAGGTTATACATTTGTTGGGTGGTTTGATGCCCAAACCGGCGGAACTAAATGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAATGACATCGATTTATATGCGCAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACGTTTGATAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCA
サルモネラＩｎｖＡ遺伝子断片（配列番号２）
TTTGCGAATAACATCCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTGCTCGTAATTCGCCGCCATTGGCGAATTTATGACAAATATAACGCGCCATTGCTCCACGAATATGCTCCACAAGGTTAATGACATCTTTTTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAGCGCTTCCATAATTAACTTCATATTACGCACGGAAACACGTTCGCTTAACAAACGCTGCAAAACTTCAGATATACGTTGTACCGTGGCATGTCTGAGCACTTCTTTAAGTAAATCAGGAAATTTCGCTTCCAGTTGGTCCAGCATATGTTTTGTTTCCTGAATACC
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ核酸の合成方法であって、
ａ）少なくとも第１および第２の相互プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
ｂ）第１および第２のセグメントを含む第１のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第１の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントが、第１のプライマーの別の領域、または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｃ）第１のセグメントを含み、第２のセグメントを含んでもよい第２のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第２のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２の領域がループを形成することができるように、前記含まれてもよい第２のセグメントが、第２のプライマー中の別の領域または第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｄ）第１および第２の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも１個のステムプライマーを提供する工程、
ｅ）ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
ｆ）ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法。
【請求項２】
合成が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鋳型リプライミング増幅（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（ＳＥＡ）およびＳＭａｒｔ増幅法（ＳＭＡＰ）からなる群から選択される核酸増幅技法を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域が２個以上のプライマーの結合部位を含む、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記２個以上のプライマーが同じ種類である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合するプライマーがループ提供プライマー（ＬＰＰ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記２個以上のプライマーがループ形成プライマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記２個以上のプライマーが異なる種類である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記２個以上の結合部位が全て標的鋳型および／またはアンプリコンの同じ鎖上に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記２個以上の結合部位が標的鋳型および／またはアンプリコンの異なる鎖上に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位が、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料中のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）を検出するために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＲＳＡがｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列を使用して検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）において、１個のステムプライマーが使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）において、２個以上のステムプライマーが使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーが同じ種類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーが異なる種類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーがアンプリコンの相互鎖に結合する、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーがアンプリコンの同じ鎖に結合する、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステムプライマー（複数可）が単純プライマー（複数可）、ループ形成プライマー（複数可）、ヘアピンプライマー（複数可）またはループ提供プライマー（複数可）である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ステムプライマー（複数可）が改変塩基を含有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記改変塩基が、Ｎ４−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステムプライマー（複数可）が、検出可能な部分で標識された核酸を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識されたステムプライマーが、蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系においてプローブとして使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリ核酸の増幅が、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ、電気泳動、質量分析および音波検出からなる群から選択される方法によって検出される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステムプライマー（複数可）が、捕捉部分で標識された核酸を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記捕捉部分がビオチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸の合成が、リアルタイム測定または終点測定を使用して検出される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ポリ核酸の増幅が、蛍光、生物発光、濁度または電気化学的測定からなる群から選択される検出系によって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
核酸の合成がリアルタイムでの生物発光アッセイ（ＢＡＲＴ）レポーター系を使用して検出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
密封された容器中で実施される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
生物の遺伝子コード中の特定のポリ核酸配列の存在を決定するための請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のための請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
診断用途で使用するための請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
試料中の生物の検出または定量において使用するための請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記生物が微生物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物が、ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記微生物が遺伝子改変生物（ＧＭＯ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子改変穀物を同定するため、遺伝子改変動物を同定するため、疾患状態を検出するため、治療による有害反応を予測するため、または疾患状態感受性を予測するための請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記請求項のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも１個のステムプライマーを含むキット。
【請求項４１】
熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素および無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項１】
ポリ核酸の合成方法であって、
ａ）少なくとも第１および第２の相互プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
ｂ）第１および第２のセグメントを含む第１のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第１の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントが、第１のプライマーの別の領域、または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｃ）第１のセグメントを含み、第２のセグメントを含んでもよい第２のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第２のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２の領域がループを形成することができるように、前記含まれてもよい第２のセグメントが、第２のプライマー中の別の領域または第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
ｄ）第１および第２の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも１個のステムプライマーを提供する工程、
ｅ）ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
ｆ）ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法。
【請求項２】
合成が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鋳型リプライミング増幅（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（ＳＥＡ）およびＳＭａｒｔ増幅法（ＳＭＡＰ）からなる群から選択される核酸増幅技法を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域が２個以上のプライマーの結合部位を含む、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記２個以上のプライマーが同じ種類である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合するプライマーがループ提供プライマー（ＬＰＰ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記２個以上のプライマーがループ形成プライマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記２個以上のプライマーが異なる種類である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記２個以上の結合部位が全て標的鋳型および／またはアンプリコンの同じ鎖上に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記２個以上の結合部位が標的鋳型および／またはアンプリコンの異なる鎖上に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位が、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料中のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）を検出するために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＲＳＡがｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列を使用して検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）において、１個のステムプライマーが使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）において、２個以上のステムプライマーが使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーが同じ種類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーが異なる種類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーがアンプリコンの相互鎖に結合する、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーがアンプリコンの同じ鎖に結合する、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステムプライマー（複数可）が単純プライマー（複数可）、ループ形成プライマー（複数可）、ヘアピンプライマー（複数可）またはループ提供プライマー（複数可）である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ステムプライマー（複数可）が改変塩基を含有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記改変塩基が、Ｎ４−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステムプライマー（複数可）が、検出可能な部分で標識された核酸を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識されたステムプライマーが、蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系においてプローブとして使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリ核酸の増幅が、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ、電気泳動、質量分析および音波検出からなる群から選択される方法によって検出される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステムプライマー（複数可）が、捕捉部分で標識された核酸を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記捕捉部分がビオチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸の合成が、リアルタイム測定または終点測定を使用して検出される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ポリ核酸の増幅が、蛍光、生物発光、濁度または電気化学的測定からなる群から選択される検出系によって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
核酸の合成がリアルタイムでの生物発光アッセイ（ＢＡＲＴ）レポーター系を使用して検出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
密封された容器中で実施される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
生物の遺伝子コード中の特定のポリ核酸配列の存在を決定するための請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のための請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
診断用途で使用するための請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
試料中の生物の検出または定量において使用するための請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記生物が微生物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物が、ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記微生物が遺伝子改変生物（ＧＭＯ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子改変穀物を同定するため、遺伝子改変動物を同定するため、疾患状態を検出するため、治療による有害反応を予測するため、または疾患状態感受性を予測するための請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記請求項のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも１個のステムプライマーを含むキット。
【請求項４１】
熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素および無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１４ｅ】
【図１４ｆ】
【図１４ｇ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１４ｅ】
【図１４ｆ】
【図１４ｇ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２０１２−５２９９０４（Ｐ２０１２−５２９９０４Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５５５３（Ｐ２０１２−５１５５５３）
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６３４９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０７０３０８８５）ルモラ・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＭＯＲＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６３４９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０７０３０８８５）ルモラ・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＭＯＲＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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