スフィンゴ脂質の富化方法
【課題】有機溶媒抽出や濃縮等を行うことなく食品組成物としてそのまま用いることができる麹において、煩雑な工程を経ることなく安全なスフィンゴ脂質を大量かつ安定的に富化する方法を提供する。
【解決手段】蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
【解決手段】蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法に関する。
【０００２】
スフィンゴ脂質とは、スフィンゴイド塩基（長鎖塩基）を構造骨格としてもつ複合脂質の総称である。動物細胞のスフィンゴ脂質の骨格はスフィンゴシンであるが、植物や真菌では主にフィトスフィンゴシンである（非特許文献１）。
【０００３】
スフィンゴ脂質には、スフィンゴイド塩基のアミノ基にアシル基がアミド結合したセラミドや、セラミドに糖、リン、硫黄、アミノ酸など様々な極性基が付加した複合スフィンゴ脂質などがある。なかでも糖が結合したスフィンゴ糖脂質は、真核生物やバクテリアの一部などに普遍的に存在しており、糖鎖部分の構造は様々であることが知られている。グルコースが結合したグルコシルセラミドは、セレブロシドとも呼ばれ、植物、真菌、動物に共通してみられる代表的なスフィンゴ糖脂質である（非特許文献２）。
【０００４】
セラミドはヒトの皮膚の角質層の細胞間脂質の主成分として約５０％を占め、皮膚の保湿性や柔軟性にかかわっていると言われている。加齢により減少し、しわ、ドライスキン、肌荒れの原因となるほか、アトピー性皮膚炎にも関与していると考えられている。従来はセラミドを補充する方法として、安価な供給源である牛脳由来のスフィンゴ脂質が用いられていたが、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）発症の原因であるプリオンが脳幹部位に蓄積していることが明らかとなって以来、食品・化粧品用途での利用は不可能となっている。また、合成セラミドは安全性の観点から食品素材としては利用の制限がある。
【０００５】
牛脳の代替供給源として、現在では主に農産加工副産物である大豆油さいやビール粕、米や小麦などの穀類の胚芽、コンニャク芋などが利用されているが、含有量が微量であり、食品としてそのまま利用しにくいことから、有機溶媒などによる抽出・濃縮が行なわれている。このため製造に多大なコストがかり、製品が非常に高価であるという問題があった（特許文献１、２）。
【０００６】
また、酵母、キノコなどの真菌類からもセレブロシドの抽出が行われている。酵母においてはセレブロシドが存在する種は限られているため（非特許文献３）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）やクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）といったセレブロシド生産菌を用い、液体培養下で様々な環境ストレス付与や培地への塩類添加を行い、生産量、蓄積量を高める製造方法も検討されている（特許文献３、４）。
【０００７】
例えば環境ストレスの付与として、培地への食塩添加についての報告があり、これにより菌体重量あたりのセレブロシド含量が増加している（特許文献３）。また、窒素源として培地中へ硫酸アンモニウムを添加する方法や、あるいはナトリウム源として各種ナトリウム化合物を添加する方法も検討されており、いずれも菌体あたりのセレブロシド量が増加するという報告がある（特許文献４）。したがって、酵母においては培地中への塩類添加により、環境ストレスの付与、あるいは栄養源の補給がなされ、これによりセレブロシドが菌体内に蓄積すると考えられる。
【０００８】
このように、酵母においては、培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することから、様々な高生産法についての検討がなされてきた。しかしながら、こうしたスフィンゴ脂質を富化した酵母においても、菌体からのセレブロシドの回収のため、有機溶媒抽出や冷凍処理などが用いられており、工程が煩雑であり、多大なコストがかかるほか、環境への負荷も懸念されるなどの問題があった。
【０００９】
一方、国内で伝統的な発酵食品の製造に利用されてきた麹菌についても、液体培養時にセラミドやセレブロシドといったスフィンゴ脂質を生産するという報告がある（非特許文献４、５）。しかし、仮に麹菌の液体培養において培養条件の検討を行い、麹菌のスフィンゴ脂質含量を増加させたとしても、菌体だけをろ過回収して食するような食経験が無いため、有機溶媒抽出等の処理が必要となり、前述のような問題点が生じる。
【００１０】
一方で、麹菌の固体培養物は、伝統的に「麹」として丸ごと食する食習慣があるため、食品として麹菌スフィンゴ脂質を利用するには非常に適している。
【００１１】
しかしながら固体培養時、すなわち麹にした際のスフィンゴ脂質の生産能力や分子種についての報告は無く、高生産のための培養条件の検討はもちろん、麹をスフィンゴ脂質供給源として利用するための検討さえ行なわれてきていない。
【００１２】
麹菌による固体培養（すなわち、製麹）については、一般に酵素生産や種麹としての胞子着生を目的として行われてきた。製麹時の塩類添加としては、種麹製造における木灰添加が一般に知られている。木灰の添加は、灰のアルカリ度による防腐作用、ｐＨ調節、物理的効果、栄養的効果などの効果があると考えられている（非特許文献６）。また、味噌麹や清酒麹製造などで、一部で製麹時の塩類添加が検討されており、炭酸カルシウムや硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムの添加により、プロテアーゼやアミラーゼの生産が高まることが知られている。また、米麹のアルカリ性プロテアーゼ生成は、硝酸塩、酸性アミノ酸ナトリウム等の含窒素化合物を添加製麹することにより促進され、リン酸二水素カリウムを共存させることにより更に高まるという報告がある（非特許文献６）。その他塩類添加に関しては、焼酎麹の製造において、硝酸ナトリウムおよび炭酸カルシウムの添加により脂肪酸の生成が抑制される、という報告もある。（非特許文献６）。
【００１３】
以上のように、製麹時における培地への塩類添加は、胞子着生や酵素生産が目的で行われてきている。すなわち麹菌の固体培養において、スフィンゴ脂質含量を高めるという観点では、何ら製麹条件（固体培養条件）の検討はなされてきていない。
【００１４】
【特許文献１】特開平４−２８２３１７号公報
【特許文献２】特開平１１−２７９５８６号公報
【特許文献３】特開２００５−１８５１２６号公報
【特許文献４】特開２００６−５５０７０号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，５，６−４３（１９７０）
【非特許文献２】ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６０，９１９−９４１（２００３）
【非特許文献３】ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２，５３３−５３８（２００２）
【非特許文献４】日本農芸化学誌，第４９巻，第４号，２０５−２１２（１９７５）
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，４８６，１６１−１７１（１９７７）
【非特許文献６】麹学，日本醸造協会発行，村上英也 編著（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
スフィンゴ脂質を効率的に取得するためには、真菌類などの微生物が適しているが、酵母やキノコ類は上述のような課題を有し、またその形態や香味ゆえにいずれも食品としてはそのまま使用しづらい。そこで本発明は、有機溶媒抽出や濃縮等を行うことなく食品組成物としてそのまま用いることができる麹において、煩雑な工程を経ることなく安全なスフィンゴ脂質を大量かつ安定的に富化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩の一種又は二種以上の存在下で製麹を行うことにより、製造される麹中のスフィンゴ脂質が効率的に富化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
（２）カリウム塩又はナトリウム塩の存在下で製麹を行うことを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）製麹原料は米であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（４）製麹原料を蒸きょうした後、麹菌の植菌前または植菌後盛りまでに無機塩類を添加することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌであることを特徴とする上記（４）記載の方法。
（６）蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に無機塩類を添加することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（７）無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌであることを特徴とする上記（６）記載の方法。
（８）スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の方法。
（９）製麹に使用する麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の方法。
（１０）蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、食用としてそのまま食することができる麹中のスフィンゴ脂質を簡便かつ安価に富化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書で使用する「製麹」とは、蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養する、当業者に公知の製麹方法（例えば、蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法など）を指す。これらの製麹方法は、製麹原料を水洗いし、水に浸漬し、蒸きょうした後、麹菌を植菌して培養する工程を含み、その間、一般的に「引き込み」、「盛り」、「仲仕事」、「仕舞仕事」といった処理を含んでいる。
【００２０】
「盛り」とは、「床もみ」（すなわち種麹植菌）後、麹菌の生育が旺盛になりかけたものを小区分に分けて品温管理をしやすくする作業を指す。一般的に製麹において、盛りまでを「床時代」、盛り以降を「棚時代」と呼ぶ。床時代とは床もみを行った後、蒸した製麹原料を堆積し、布などで包むなどして湿度を維持し、乾燥を防ぐ工程であり、乾燥が進む原因となる手入れをほとんど行わず、切り返しを行うのみで培養を行う。
【００２１】
床時代における製麹温度は、使用する麹菌の菌体生育の至適温度に応じて、一般的には２８〜４２℃、例えば３０〜３７℃とされる。ただし、床時代の製麹温度をおよそ３８℃以上の比較的高温とする場合、麹菌が生育阻害を受ける虞がある。なお、製麹温度とは、麹の品温を意味する。製麹温度は、麹菌の生育に伴う発酵熱を制御することによって、又は製麹における周囲温度を制御することによって調節することができる。
【００２２】
床時代の所要時間は、一般的には１８時間〜２０時間である。生育が旺盛になった状態のまま長時間放置すると発酵熱を除くことができず、品温が制御できなくなるうえに、原料が密集しているため製麹の生育が抑制されてしまうため、この時点で盛りを行い、棚時代に移行する。
【００２３】
一方、棚時代は、麹を薄く盛り、麹の水分蒸発を進める工程であり、この培養工程の中で、「仲仕事」、「仕舞仕事」と呼ばれる手入れ作業が行われる。上記非特許文献６によれば、出麹までに蒸発する総水分量の７５％が仲仕事までの間に蒸発することが記載されている。
【００２４】
製麹の詳細については、例えば上記非特許文献６及び発酵ハンドブック（（財）バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編，２００１年）などを参照されたい。
【００２５】
本発明の麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法（以下、本発明の方法ともいう）において、下記で特に規定されない限り、製麹は時間、湿度、温度条件などに関し、上記のような当業者に公知の製麹と同様にして行うことができる。すなわち、麹菌接種後、培養初期（すなわち床時代）は湿度を高く（例えば８５％以上）に維持し、培養後半（すなわち、棚時代、例えば植菌後約２０時間以降）には湿度を落とし（例えば７５〜５０％）、例えば３０〜４０℃で４３〜４８時間製麹を行うことができる。
【００２６】
具体的に本発明の方法は、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする。
【００２７】
本発明の方法で使用される製麹原料は、麹菌を生やして麹にできるものであれば特に制限されず、例えば穀類、擬穀類、豆類、ゴマ類、芋類等を使用することができる。具体的に、穀類としては、白米、玄米、黒米、赤米、大麦、小麦などを、擬穀類としてはソバ、アマランサス、キヌアなど、豆類としては大豆、小豆、黒豆、ヒヨコ豆などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。麹の原料として穀類、例えばイネ科植物を使用することが好ましく、イネ科植物として白米や、大麦などの麦類を使用することが特に好ましい。本発明において、製麹原料として米を使用することが最も好ましい。
【００２８】
本発明の方法において特に好ましい塩類は、カリウム塩、ナトリウム塩である。カリウム塩としてはリン酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウムなどが挙げられ、最も好ましいものとして硝酸カリウム、クエン酸カリウムが挙げられる。また、ナトリウム塩としては硝酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられ、最も好ましいものとしてリン酸ナトリウムが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法において、無機塩類を添加する時期は、培養期間中であれば特に限定されないが、蒸きょう前の製麹原料の浸漬時、製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後であることが好ましい。より好ましくは、製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後である。ここで、「製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前」とは、蒸し原料の放冷途中または放冷後、種麹の添加前のことをいう。「植菌後盛りまで」とは、種麹の添加後で盛り工程の終了時までのことをいう。「植菌直後」とは、床もみ（植菌）した後、床培養を開始する前のことをいう。また、「蒸きょう前の製麹原料の浸漬時」とは、原料穀類への吸水工程時のことをいう。
【００３０】
本発明の方法において、無機塩類の添加濃度は、使用する無機塩類や製麹原料、無機塩類の添加時期などに応じて変動しうる。例えば、本発明において、米を製麹原料として用い、無機塩類を蒸きょうした後の麹菌植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後に添加する場合には、使用する無機塩類に応じて以下の添加濃度とすることができる：カリウム塩、米１ｋｇあたりカリウムイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜２４０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは１２ｍｍｏｌ〜１２０ｍｍｏｌ；ナトリウム塩、米１ｋｇあたりナトリウムイオン換算で１〜２００ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜１６０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは１２ｍｍｏｌ〜１２０ｍｍｏｌ；マグネシウム塩、米１ｋｇあたりマグネシウムイオン換算で１〜１００ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜４０ｍｍｏｌ；カルシウム塩、米１ｋｇあたりカルシウムイオン換算で１〜１００ｍｍｏｌ、好ましくは１ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌ；鉄塩、米１ｋｇあたり鉄イオン換算で０．０１〜１ｍｍｏｌ、好ましくは０．０３ｍｍｏｌ〜０．３ｍｍｏｌ。
【００３１】
また、本発明において、米を製麹原料として用い、無機塩類を蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に添加する場合には、使用する無機塩類に応じて以下の添加濃度とすることができる：カリウム塩、米１ｋｇあたりカリウムイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌ、好ましくは８０〜２５０ｍｍｏｌ。
【００３２】
なお、上記濃度範囲は例示であり、使用する無機塩類や製麹原料、無機塩類の添加時期などに応じて、当業者は適宜適切な添加濃度を選択することができる点に留意すべきである。
【００３３】
本発明の方法に用いることができる麹菌は、スフィンゴ脂質を生産できるものであれば特に限定されないが、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）や、その近縁のアスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）などを挙げることができる。Ａ．オリゼとして具体的には市販の種麹や、登録番号ＲＩＢ４０、ＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８又はＡＴＣＣ３６２６１で指定される特定の菌株などを用いることができる。また、Ａ．ソーエとしては、市販の種麹や、登録番号ＪＣＭ２２２６、ＮＢＲＣ４２３９又はＮＢＲＣ５２４１で指定される特定の菌株などを用いることができる。Ａ．オリゼとしてＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８が、そしてＡ．ソーエとしてＪＣＭ２２２６が白米、大麦の両方の麹においてセレブロシド生産量が高いことから、本発明で使用するのに特に適している。また、上記麹菌以外の麹菌として、大麦麹の場合にＡ．オリゼは登録番号ＮＢＲＣ４２５５、ＡＴＣＣ１１４９４、ＡＴＣＣ１６８６８、ＮＢＲＣ５７８６、ＪＣＭ２２４５、ＮＢＲＣ５２４０などを、米麹の場合にＡ．オリゼは登録番号ＪＣＭ２２２７、ＪＣＭ２１７３、ＪＣＭ２２２９、ＮＢＲＣ４２６１などを使用することができる。
【００３４】
本発明の方法において、蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることが好ましい。蒸きょう後の製麹原料の水分量が３０重量％未満であると、発芽および菌体生育が抑制されてしまう虞があり、又は３６重量％を超えると、発芽は早まるが菌体生育が緩慢になる虞があるからである。
【００３５】
本発明の方法においては、棚時代を高湿度（例えば８５％以上）条件下で行うことが好ましい。これにより、棚時代における麹水分の蒸散を抑制することができ、その結果、スフィンゴ脂質を効率的に富化することができる。
【００３６】
また本発明の方法においては、棚時代を、製麹時間が４６時間以上となるまで行うことが好ましい。これにより、製造される麹中のスフィンゴ脂質を経時的に富化することができる。
【００３７】
上記のようにして製造される麹は、スフィンゴ脂質（特にセレブロシド）を豊富に含むものである。具体的には、本発明の方法は、無機塩類を添加しない製麹によって製造された米麹、あるいは従来の製麹によって製造された市販の米麹に比べて、添加する無機塩類の種類及び濃度に応じて、米麹中のスフィンゴ脂質の総量をそれぞれ最大で約２．２倍、および１０．６倍まで富化することができた（実施例５、図６）。なお、麹中のスフィンゴ脂質の量は、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどを使用することによって測定することができる。
【００３８】
このように、本発明の方法は、有機溶媒を用いた抽出や濃縮を行うことなくそのまま食用として用いることができる麹において、煩雑な条件でストレスをかける工程などを必要とせず、安全性が高いスフィンゴ脂質を効率的に富化することができる。
【００３９】
本発明の方法により富化されたスフィンゴ脂質を含む麹は、飲食品原料の一部として用いたり、或いは飲食品の製造工程又は製造後に添加又は配合してもよいし、飲食品としてそのまま使用してもよい。そのような飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などとして提供することもできる。
【００４０】
飲食品の形態は特に制限されるものではなく、例えばこれに制限されるものではないが、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類（アルコール性飲料）、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、サラダ、スープ等の各種総菜などを例示することができる。
【００４１】
また、飲食品中の有効成分としてのスフィンゴ脂質富化麹の摂取量は、通常、０．７〜１．４ｇ／日、好ましくは１．１〜２．２ｇ／日程度とすることができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
Ａ．オリゼは液体培養時、グルコシルセラミドやセラミドといったスフィンゴ脂質を生産することが知られており、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）はその他にガラクトシルセラミドも生産するという報告がある（上記非特許文献２）。すなわち、麹菌は種によって異なる分子種を生産すると考えられる。現在、各種麹菌が上記以外に、どのような複合スフィンゴ脂質を生産しているかについては未解明であるため、以下の実施例では、代表的な麹菌としてＡ．オリゼを選び、スフィンゴ脂質の中でも分析例が多いグルコシルセラミド、すなわちセレブロシド量を測定することで、総スフィンゴ脂質量の評価を行った。
【００４４】
[実施例１] 米麹セレブロシド標準品の精製と構造解析
米麹セレブロシド標準品の調製法を以下に示した。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）を使用して製麹した米麹５．４ｋｇを粉砕し、５倍量のクロロホルム−メタノール（２：１）で２回抽出、濾過して得られた抽出液を濃縮、乾固後、０．２Ｍ ＫＯＨ−メタノール溶液にて３７℃で２時間振盪し、グリセロ脂質を分解しアルカリ安定脂質を得た。中和後、濃縮、乾固し、クロロホルム−メタノール−０．８％ＮａＣｌ（８：４：３）に再溶解した。振盪混合し、遠心分離後、下層を濃縮した。
【００４５】
これをケイ酸カラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノールを用いて遊離脂肪酸等を除いた。再度ケイ酸カラムクロマトグラフィーに供した後、セレブロシド画分として白色の固形油脂状物４０７．９ｍｇを得た。その後、わずかに混在する遊離脂肪酸を除去するため、さらにＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて精製を行なった。カラムはＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ；２０×２５０ｍｍ、カラムオーブンは４０℃、移動相にはメタノールを用いて、アイソクラティック溶出を行い、流速６ｍｌ／ｍｉｎとした。得られた精製品は、薄層クロマトに供したところ単一スポットとなり、また以下に示すように主要分子がグルコシルセラミドと同定されたため、これを標準品としてセレブロシドの定量を行った。
【００４６】
主要分子種の構造解析を行った。すなわち、ＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて、前述の条件で、精製セレブロシドに含まれる主要分子を分取した。得られた主要３分子（保持時間２８．７分、３２．１分、３７．４分）について、構造解析を実施した。
【００４７】
保持時間２８．７分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ ７７６．５７４５６に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、分子式はＣ４３Ｈ７９ＮＯ９（Ｃ４３Ｈ７９ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７７６．５６５２５（Δ＋４．５７ｍｍｕ））と決定した。
【００４８】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルの特徴からこの分子がセレブロシドであると同定された。まず糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値から、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００４９】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ５．１０）−Ｈ−３’（δ６．１０、Ｊ３’，４’＝１５．７Ｈｚ）−Ｈ−４’（δ６．１６）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されること、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ、３−トランス脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、この分子をメタノール性０．９Ｎ ＨＣｌを用いて１００℃、１８時間還流することで分解（メタノリシス）し、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３６９に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した。
【００５０】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−１（δ ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１４）−Ｈ−７（δ ２．１４）−Ｈ−８（δ５．２４）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及びＨＭＢＣスペクトルで９−ＣＨ３（δ１．６０）からＣ−８（δ１２３．３）、Ｃ−９（δ１３．５）に１Ｈ−１３Ｃ遠隔スピン結合が観測されることから、９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。この時点で既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８であると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（非特許文献２）。
【００５１】
保持時間３２．１分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ ７７８．５８４０３に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、分子式はＣ４３Ｈ８１ＮＯ９（Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７７８．５８０９０（Δ＋３．１３ｍｍｕ））と決定した。
【００５２】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間２８．７分）によく類似していた。糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値はほぼ同一であることから、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００５３】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されたこと、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするためにメタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３７１に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した（＝２−ヒドロキシステアリン酸）。
【００５４】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトル及びＨＭＢＣスペクトルにおいて１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃとまったく同じ相関が認められることから、この分子の長鎖塩基も９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分も直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８あると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（非特許文献２）。
【００５５】
保持時間３７．４分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ７９２．６０１５８に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、Ｆ５の分子式はＣ４４Ｈ８３ＮＯ９（Ｃ４４Ｈ８３ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７９２．５９６５５（Δ＋０．９４ｍｍｕ））と決定した。
【００５６】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ解析）を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間３２．１分）によく類似していた。糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値についても１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同一であることから、構成糖もグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００５７】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいて１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同様にＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されること、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、メタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。精製後トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３９９に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、Ｆ５を構成する脂肪酸炭素数はＣ２０と決定した（＝２−ヒドロキシアラキジン酸）。
【００５８】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルでＨ−１（δ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１６）−Ｈ−７（δ２．１６）−Ｈ−８（δ５．４６）−Ｈ−９（δ５．４６）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及び１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃで観測された９−ＣＨ３の信号が観測されないことから、４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ２０）の炭素数を引いたＣ１８であると決定され、この結果、この分子の構造は図１に示すように２０ｈ：０ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類及び植物に特徴的な構造であり（非特許文献２）、米由来のセレブロシドも含まれていると考えられる。
【００５９】
続いて、セレブロシドの精製品をＬＣ／ＭＳ（ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ島津製作所）によって分析し、主要３分子の量比を調べた。イオン化モードはＥＳＩ（−）、カラムはＣａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ １５０×２ｍｍ、移動相はＴＨＦ／メタノール（１／９ ｖ／ｖ）を用いてアイソクラティック溶出を行い、流速は０．２ｍｌ／ｍｌとした。その結果、それぞれの分子種の量比は、以下のとおりであることが示唆された。このことから、真菌に特徴的な分子である１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃが、米麹中のセレブロシドの大半を占めることが示された。
【００６０】
【表１】
【００６１】
[実施例２] 米麹、大麦麹中のセレブロシド含量の測定法
実施例３〜６におけるセレブロシドの定量は、各検体から有機溶剤を用いて抽出後、実施例１で得られたセレブロシドを標準品として用い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行った。ＴＬＣとＨＰＬＣのどちらの測定法においても、定量値がほぼ一致していることを確認した（図２）。
【００６２】
また、麹からのセレブロシドの抽出は以下に示すように単回、又は繰り返し抽出により行った。単回抽出は、より簡便な方法によって、各実験区におけるセレブロシド含量の比較を行うために実施し、繰り返し抽出は実際に麹に含まれるセレブロシド含量を定量する目的で実施した。各抽出法で得られる定量値について、比較データの一例を図２に示した。検討の結果、麹中のセレブロシド含量によって、単回抽出の抽出効率は変動し、繰り返し抽出で得られる米麹中のセレブロシド含量は、単回抽出で得られる定量値の約１．５〜２倍程度に相当する事が示された。
【００６３】
単回抽出によるセレブロシド量の測定法を以下に示した。麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対してクロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行った。これを遠心分離して得られた上清１ｍｌに対し、０．８％ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加後、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収し、一定量を測定に用いた。
【００６４】
繰り返し抽出による総セレブロシド含量の測定法を以下に示した。米麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対し、クロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行い、遠心分離後に上清を得た。計３回の抽出を行った後、上清全量に１／４量の０．８％ＮａＣｌ溶液を添加し、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収した。上清にクロロホルムを添加して、さらに２回の抽出を行った。下層全量を一定量に合わせ測定を行い、乾燥麹１ｇあたりに含まれる総セレブロシド量を算出した。
【００６５】
ＴＬＣ−デンシトメトリー法によるセレブロシド定量法を以下に示す。抽出した試料をケイ酸薄層クロマトグラフィー（メルク社製、商品名：ＨＰＴＬＣ ｓｉｌｉｃａ−６０ Ｆ２５４）にかけた。クロロホルム−メタノール（９５：１５）で展開後、オルシノール硫酸試薬（オルシノール：０．２％ｗ／ｖ、硫酸：１１．４％ｖ／ｖ）を噴霧し、加熱後に出現する赤紫色のセレブロシドのスポットについて、デンシトメトリーを用いて定量を行った。
【００６６】
ＨＰＬＣ−コロナＣＡＤ検出器によるセレブロシド定量法を以下に示した。定量法は、ＨＰＬＣ−蒸発光散乱検出器法（Ｊ．Ｏｌｅｏ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．３，ｐ．１２７−１３３，２００４）を基に、より検出感度を上げるために検出部分を改良して行った。すなわち移動相は、Ａ液：クロロホルム、Ｂ液：９５％メタノール、を用いて、グラジエント溶出を行った（表２）。カラムは、シリカカラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＳＩＬ−１００Ａ（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、カラムオーブン：４０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎとした。また、検出器については蒸発光散乱検出器よりも感度、定量範囲、再現性が優れているとされるコロナＣＡＤ検出器を用いた。コロナＣＡＤ検出器は、ガス：窒素ガス、操作時ガス圧：３５ｐｓｉとした。
【００６７】
【表２】
【００６８】
[実施例３] 各種麹菌のセレブロシド生産量
蒸米および蒸大麦に対し、各種市販種麹１０株及び菌株保存機関より入手した各種麹菌５５株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、４６時間製麹した。得られた麹を凍結乾燥し、粉砕後に乾燥麹中のセレブロシド量を実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００６９】
図３に、大麦麹及び米麹に含まれる各種麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）のセレブロシド生産量を示した。原料が米の場合においても、大麦の場合においても、セレブロシド含量が高い株について、菌株名と入手元の菌株保存機関における識別番号を記した。Ａ．ｏｒｙｚａｅにおいてはＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８、ＡＴＣＣ３６２６１を、Ａ．ｓｏｊａｅとしてはＪＣＭ２２２６が、米、大麦、いずれの培地においてもセレブロシド生産量が特に高いことが示された。また、全ての菌株において原料を大麦にした場合の方が、米の場合より生産量が高く（１．１倍〜４倍程度）なった。
【００７０】
[実施例４] 米麹における各種塩類添加検討
各種塩類を添加し、製麹を行った場合のセレブロシド含量の変化について評価した。原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用いて、水分量３０％の蒸米を調製した。この蒸米１ｋｇに対し、４０ｍｌの割合で各種塩類の溶液（リン酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸二カリウム、酢酸カリウム、クエン酸三カリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫化鉄、硫化亜鉛、硫化マンガン）溶液を添加し、均一になるように混合した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００７１】
調製した米麹のセレブロシド量を図４に示した（グラフ中の各種塩類量は白米１ｋｇに対する添加量を示している）。その結果、クエン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの塩類においてセレブロシド量増加が顕著にみられ、いずれも濃度依存的にセレブロシド量が増加していた。
【００７２】
[実施例５] 米麹でのカリウム塩添加濃度検討
実施例４において、クエン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム等のカリウム塩において顕著な効果がみられたことから、これらのカリウム塩の最適添加量を調べた。すなわち、原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用いて、水分量３０％の蒸米を調製した。この蒸米１ｋｇに対し、４０ｍｌの割合で各カリウム塩溶液（クエン酸三カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム）を添加し、均一になるように混合した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。各カリウム塩の添加濃度は白米１ｋｇあたり、リン酸カリウム：４〜４０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム：４０〜１６０ｍｍｏｌ、クエン酸三カリウム：２０〜１２０ｍｍｏｌとした。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。
【００７３】
調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。出麹サンプルのセレブロシド量を図５に示した（グラフ中の塩類量は白米１ｋｇに対する添加量）。いずれの実験区においても、コントロール（水添加）と比較して、セレブロシド量が増加していた。リン酸カリウムは２０ｍｍｏｌ添加、硝酸カリウムは８０ｍｍｏｌ添加、クエン酸カリウムは４０ｍｍｏｌ添加時にセレブロシド量が最大となった。無添加の米麹と比較すると、セレブロシド量の増加はリン酸カリウム添加で１．３倍、硝酸カリウム添加で２．０倍、クエン酸カリウム添加で２．１倍であった。
【００７４】
さらに、各カリウム塩添加で最も効果の見られた濃度（リン酸カリウム２０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム８０ｍｍｏｌ、クエン酸カリウム４０ｍｍｏｌ添加）、コントロール（水添加）、一般製麹条件（４６時間：市販米麹）における総セレブロシド量を、実施例１の繰り返し抽出及びＨＰＬＣによって測定し麹１ｇあたりの総セレブロシド量を測定した。結果を図６に示した。その結果、最も効果の高かったクエン酸カリウム添加において、総セレブロシド量がコントロールの２．２倍、さらに一般的製麹条件（４６時間：市販米麹）に比べて１０．６倍にまで達することが示された。
【００７５】
[実施例６] 浸漬時カリウム塩添加濃度検討
実施例４、５では、植菌時に塩類を添加しているが、原料を浸漬する際に塩類添加した場合でも、効果が見られるか検討を行った。原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用い、実施例４で顕著な効果が見られたカリウム塩溶液（リン酸カリウム、硝酸カリウム、クエン酸三カリウム）を浸漬・吸水させて蒸米を調製した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。蒸米水分量は３０〜３３％で、蒸米水分量より算出したカリウム塩添加濃度は白米１ｋｇあたり、リン酸カリウム：２５０ｍｍｏｌ、４７０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム：２００ｍｍｏｌ、クエン酸三カリウム：８０ｍｍｏｌとした。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００７６】
調製した米麹のセレブロシド量を図７に示した（グラフ中の添加量は白米１ｋｇあたりの添加量を示した）。その結果、カリウム塩類を添加した米麹はコントロール（添加なし）の米麹と比較して、セレブロシド量が増加していた。このことから、カリウム塩の添加が原料浸漬時であっても、植菌時添加と同様にセレブロシド量が増加することが確認できた。コントロールの米麹と比較すると、セレブロシド量の増加は、浸漬時のカリウム塩がリン酸カリウムの場合１．９倍、硝酸カリウムで２．２倍、クエン酸カリウムにおいても２．２倍であった。
【００７７】
[比較例１] 各種液体培地における菌体あたりのセレブロシド量
培地条件の違いが菌体あたりのセレブロシド量に及ぼす影響を評価するために、ＣＺＡＰＥＫ ＤＯＸ培地（２％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ＮａＮＯ３、０．２％ＫＣｌ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、デキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ペプトン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮａＮＯ３、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、麦芽エキス培地（２％モルトエキス）及びポテトデキストロース培地（２．４％ポテトデキストロース）に対し、胞子数が１０５／ｍｌとなるように粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２ｈｒ培養した。培養後、菌体を回収・洗浄後、凍結乾燥し、実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって乾燥菌体あたりのセレブロシド量を求めた。
【００７８】
各培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を図８に示す。図８から分かるとおり、酵母における報告と同様に、麹菌においても培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することがわかった。これは、単純に菌体量が増えればスフィンゴ脂質も増大するというものではないことを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明にかかるスフィンゴ脂質富化麹の製造方法は、煩雑な工程を必要とせず、従来微生物によるスフィンゴ脂質製造において行われていたような、有機溶媒を用いた抽出や濃縮をすることも必要としないため、労力とコストを低減できるばかりでなく、食品組成物として安全性が高く、非常に有用なスフィンゴ脂質富化麹を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、米麹由来のグルコシルセラミド主要分子種の構造を示す。
【図２】図２は、セレブロシドの測定における薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との比較を示す。
【図３】図３は、各種麹菌のセレブロシド生産量を示す。
【図４】図４は、製麹において各種塩類溶液を添加することにより調製した米麹中のセレブロシド量の比較を示す。
【図５】図５は、製麹におけるカリウム塩添加量とセレブロシド量との関係を示す。
【図６】図６は、実施例において最も効果が認められた濃度の各カリウム塩存在下で製麹を行った際の、米麹中の総セレブロシド量の比較を示す。
【図７】図７は、製麹原料浸漬時に各種塩類を添加した場合におけるセレブロシド量を示す。
【図８】図８は、各種液体培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法に関する。
【０００２】
スフィンゴ脂質とは、スフィンゴイド塩基（長鎖塩基）を構造骨格としてもつ複合脂質の総称である。動物細胞のスフィンゴ脂質の骨格はスフィンゴシンであるが、植物や真菌では主にフィトスフィンゴシンである（非特許文献１）。
【０００３】
スフィンゴ脂質には、スフィンゴイド塩基のアミノ基にアシル基がアミド結合したセラミドや、セラミドに糖、リン、硫黄、アミノ酸など様々な極性基が付加した複合スフィンゴ脂質などがある。なかでも糖が結合したスフィンゴ糖脂質は、真核生物やバクテリアの一部などに普遍的に存在しており、糖鎖部分の構造は様々であることが知られている。グルコースが結合したグルコシルセラミドは、セレブロシドとも呼ばれ、植物、真菌、動物に共通してみられる代表的なスフィンゴ糖脂質である（非特許文献２）。
【０００４】
セラミドはヒトの皮膚の角質層の細胞間脂質の主成分として約５０％を占め、皮膚の保湿性や柔軟性にかかわっていると言われている。加齢により減少し、しわ、ドライスキン、肌荒れの原因となるほか、アトピー性皮膚炎にも関与していると考えられている。従来はセラミドを補充する方法として、安価な供給源である牛脳由来のスフィンゴ脂質が用いられていたが、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）発症の原因であるプリオンが脳幹部位に蓄積していることが明らかとなって以来、食品・化粧品用途での利用は不可能となっている。また、合成セラミドは安全性の観点から食品素材としては利用の制限がある。
【０００５】
牛脳の代替供給源として、現在では主に農産加工副産物である大豆油さいやビール粕、米や小麦などの穀類の胚芽、コンニャク芋などが利用されているが、含有量が微量であり、食品としてそのまま利用しにくいことから、有機溶媒などによる抽出・濃縮が行なわれている。このため製造に多大なコストがかり、製品が非常に高価であるという問題があった（特許文献１、２）。
【０００６】
また、酵母、キノコなどの真菌類からもセレブロシドの抽出が行われている。酵母においてはセレブロシドが存在する種は限られているため（非特許文献３）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）やクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）といったセレブロシド生産菌を用い、液体培養下で様々な環境ストレス付与や培地への塩類添加を行い、生産量、蓄積量を高める製造方法も検討されている（特許文献３、４）。
【０００７】
例えば環境ストレスの付与として、培地への食塩添加についての報告があり、これにより菌体重量あたりのセレブロシド含量が増加している（特許文献３）。また、窒素源として培地中へ硫酸アンモニウムを添加する方法や、あるいはナトリウム源として各種ナトリウム化合物を添加する方法も検討されており、いずれも菌体あたりのセレブロシド量が増加するという報告がある（特許文献４）。したがって、酵母においては培地中への塩類添加により、環境ストレスの付与、あるいは栄養源の補給がなされ、これによりセレブロシドが菌体内に蓄積すると考えられる。
【０００８】
このように、酵母においては、培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することから、様々な高生産法についての検討がなされてきた。しかしながら、こうしたスフィンゴ脂質を富化した酵母においても、菌体からのセレブロシドの回収のため、有機溶媒抽出や冷凍処理などが用いられており、工程が煩雑であり、多大なコストがかかるほか、環境への負荷も懸念されるなどの問題があった。
【０００９】
一方、国内で伝統的な発酵食品の製造に利用されてきた麹菌についても、液体培養時にセラミドやセレブロシドといったスフィンゴ脂質を生産するという報告がある（非特許文献４、５）。しかし、仮に麹菌の液体培養において培養条件の検討を行い、麹菌のスフィンゴ脂質含量を増加させたとしても、菌体だけをろ過回収して食するような食経験が無いため、有機溶媒抽出等の処理が必要となり、前述のような問題点が生じる。
【００１０】
一方で、麹菌の固体培養物は、伝統的に「麹」として丸ごと食する食習慣があるため、食品として麹菌スフィンゴ脂質を利用するには非常に適している。
【００１１】
しかしながら固体培養時、すなわち麹にした際のスフィンゴ脂質の生産能力や分子種についての報告は無く、高生産のための培養条件の検討はもちろん、麹をスフィンゴ脂質供給源として利用するための検討さえ行なわれてきていない。
【００１２】
麹菌による固体培養（すなわち、製麹）については、一般に酵素生産や種麹としての胞子着生を目的として行われてきた。製麹時の塩類添加としては、種麹製造における木灰添加が一般に知られている。木灰の添加は、灰のアルカリ度による防腐作用、ｐＨ調節、物理的効果、栄養的効果などの効果があると考えられている（非特許文献６）。また、味噌麹や清酒麹製造などで、一部で製麹時の塩類添加が検討されており、炭酸カルシウムや硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムの添加により、プロテアーゼやアミラーゼの生産が高まることが知られている。また、米麹のアルカリ性プロテアーゼ生成は、硝酸塩、酸性アミノ酸ナトリウム等の含窒素化合物を添加製麹することにより促進され、リン酸二水素カリウムを共存させることにより更に高まるという報告がある（非特許文献６）。その他塩類添加に関しては、焼酎麹の製造において、硝酸ナトリウムおよび炭酸カルシウムの添加により脂肪酸の生成が抑制される、という報告もある。（非特許文献６）。
【００１３】
以上のように、製麹時における培地への塩類添加は、胞子着生や酵素生産が目的で行われてきている。すなわち麹菌の固体培養において、スフィンゴ脂質含量を高めるという観点では、何ら製麹条件（固体培養条件）の検討はなされてきていない。
【００１４】
【特許文献１】特開平４−２８２３１７号公報
【特許文献２】特開平１１−２７９５８６号公報
【特許文献３】特開２００５−１８５１２６号公報
【特許文献４】特開２００６−５５０７０号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，５，６−４３（１９７０）
【非特許文献２】ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６０，９１９−９４１（２００３）
【非特許文献３】ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２，５３３−５３８（２００２）
【非特許文献４】日本農芸化学誌，第４９巻，第４号，２０５−２１２（１９７５）
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，４８６，１６１−１７１（１９７７）
【非特許文献６】麹学，日本醸造協会発行，村上英也 編著（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
スフィンゴ脂質を効率的に取得するためには、真菌類などの微生物が適しているが、酵母やキノコ類は上述のような課題を有し、またその形態や香味ゆえにいずれも食品としてはそのまま使用しづらい。そこで本発明は、有機溶媒抽出や濃縮等を行うことなく食品組成物としてそのまま用いることができる麹において、煩雑な工程を経ることなく安全なスフィンゴ脂質を大量かつ安定的に富化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩の一種又は二種以上の存在下で製麹を行うことにより、製造される麹中のスフィンゴ脂質が効率的に富化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
（２）カリウム塩又はナトリウム塩の存在下で製麹を行うことを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）製麹原料は米であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（４）製麹原料を蒸きょうした後、麹菌の植菌前または植菌後盛りまでに無機塩類を添加することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌであることを特徴とする上記（４）記載の方法。
（６）蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に無機塩類を添加することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（７）無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌであることを特徴とする上記（６）記載の方法。
（８）スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の方法。
（９）製麹に使用する麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の方法。
（１０）蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、食用としてそのまま食することができる麹中のスフィンゴ脂質を簡便かつ安価に富化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書で使用する「製麹」とは、蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養する、当業者に公知の製麹方法（例えば、蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法など）を指す。これらの製麹方法は、製麹原料を水洗いし、水に浸漬し、蒸きょうした後、麹菌を植菌して培養する工程を含み、その間、一般的に「引き込み」、「盛り」、「仲仕事」、「仕舞仕事」といった処理を含んでいる。
【００２０】
「盛り」とは、「床もみ」（すなわち種麹植菌）後、麹菌の生育が旺盛になりかけたものを小区分に分けて品温管理をしやすくする作業を指す。一般的に製麹において、盛りまでを「床時代」、盛り以降を「棚時代」と呼ぶ。床時代とは床もみを行った後、蒸した製麹原料を堆積し、布などで包むなどして湿度を維持し、乾燥を防ぐ工程であり、乾燥が進む原因となる手入れをほとんど行わず、切り返しを行うのみで培養を行う。
【００２１】
床時代における製麹温度は、使用する麹菌の菌体生育の至適温度に応じて、一般的には２８〜４２℃、例えば３０〜３７℃とされる。ただし、床時代の製麹温度をおよそ３８℃以上の比較的高温とする場合、麹菌が生育阻害を受ける虞がある。なお、製麹温度とは、麹の品温を意味する。製麹温度は、麹菌の生育に伴う発酵熱を制御することによって、又は製麹における周囲温度を制御することによって調節することができる。
【００２２】
床時代の所要時間は、一般的には１８時間〜２０時間である。生育が旺盛になった状態のまま長時間放置すると発酵熱を除くことができず、品温が制御できなくなるうえに、原料が密集しているため製麹の生育が抑制されてしまうため、この時点で盛りを行い、棚時代に移行する。
【００２３】
一方、棚時代は、麹を薄く盛り、麹の水分蒸発を進める工程であり、この培養工程の中で、「仲仕事」、「仕舞仕事」と呼ばれる手入れ作業が行われる。上記非特許文献６によれば、出麹までに蒸発する総水分量の７５％が仲仕事までの間に蒸発することが記載されている。
【００２４】
製麹の詳細については、例えば上記非特許文献６及び発酵ハンドブック（（財）バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編，２００１年）などを参照されたい。
【００２５】
本発明の麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法（以下、本発明の方法ともいう）において、下記で特に規定されない限り、製麹は時間、湿度、温度条件などに関し、上記のような当業者に公知の製麹と同様にして行うことができる。すなわち、麹菌接種後、培養初期（すなわち床時代）は湿度を高く（例えば８５％以上）に維持し、培養後半（すなわち、棚時代、例えば植菌後約２０時間以降）には湿度を落とし（例えば７５〜５０％）、例えば３０〜４０℃で４３〜４８時間製麹を行うことができる。
【００２６】
具体的に本発明の方法は、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする。
【００２７】
本発明の方法で使用される製麹原料は、麹菌を生やして麹にできるものであれば特に制限されず、例えば穀類、擬穀類、豆類、ゴマ類、芋類等を使用することができる。具体的に、穀類としては、白米、玄米、黒米、赤米、大麦、小麦などを、擬穀類としてはソバ、アマランサス、キヌアなど、豆類としては大豆、小豆、黒豆、ヒヨコ豆などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。麹の原料として穀類、例えばイネ科植物を使用することが好ましく、イネ科植物として白米や、大麦などの麦類を使用することが特に好ましい。本発明において、製麹原料として米を使用することが最も好ましい。
【００２８】
本発明の方法において特に好ましい塩類は、カリウム塩、ナトリウム塩である。カリウム塩としてはリン酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウムなどが挙げられ、最も好ましいものとして硝酸カリウム、クエン酸カリウムが挙げられる。また、ナトリウム塩としては硝酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられ、最も好ましいものとしてリン酸ナトリウムが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法において、無機塩類を添加する時期は、培養期間中であれば特に限定されないが、蒸きょう前の製麹原料の浸漬時、製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後であることが好ましい。より好ましくは、製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後である。ここで、「製麹原料を蒸きょうした後の麹菌の植菌前」とは、蒸し原料の放冷途中または放冷後、種麹の添加前のことをいう。「植菌後盛りまで」とは、種麹の添加後で盛り工程の終了時までのことをいう。「植菌直後」とは、床もみ（植菌）した後、床培養を開始する前のことをいう。また、「蒸きょう前の製麹原料の浸漬時」とは、原料穀類への吸水工程時のことをいう。
【００３０】
本発明の方法において、無機塩類の添加濃度は、使用する無機塩類や製麹原料、無機塩類の添加時期などに応じて変動しうる。例えば、本発明において、米を製麹原料として用い、無機塩類を蒸きょうした後の麹菌植菌前、又は植菌後盛りまで若しくは植菌直後に添加する場合には、使用する無機塩類に応じて以下の添加濃度とすることができる：カリウム塩、米１ｋｇあたりカリウムイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜２４０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは１２ｍｍｏｌ〜１２０ｍｍｏｌ；ナトリウム塩、米１ｋｇあたりナトリウムイオン換算で１〜２００ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜１６０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは１２ｍｍｏｌ〜１２０ｍｍｏｌ；マグネシウム塩、米１ｋｇあたりマグネシウムイオン換算で１〜１００ｍｍｏｌ、好ましくは４ｍｍｏｌ〜４０ｍｍｏｌ；カルシウム塩、米１ｋｇあたりカルシウムイオン換算で１〜１００ｍｍｏｌ、好ましくは１ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌ；鉄塩、米１ｋｇあたり鉄イオン換算で０．０１〜１ｍｍｏｌ、好ましくは０．０３ｍｍｏｌ〜０．３ｍｍｏｌ。
【００３１】
また、本発明において、米を製麹原料として用い、無機塩類を蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に添加する場合には、使用する無機塩類に応じて以下の添加濃度とすることができる：カリウム塩、米１ｋｇあたりカリウムイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌ、好ましくは８０〜２５０ｍｍｏｌ。
【００３２】
なお、上記濃度範囲は例示であり、使用する無機塩類や製麹原料、無機塩類の添加時期などに応じて、当業者は適宜適切な添加濃度を選択することができる点に留意すべきである。
【００３３】
本発明の方法に用いることができる麹菌は、スフィンゴ脂質を生産できるものであれば特に限定されないが、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）や、その近縁のアスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）などを挙げることができる。Ａ．オリゼとして具体的には市販の種麹や、登録番号ＲＩＢ４０、ＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８又はＡＴＣＣ３６２６１で指定される特定の菌株などを用いることができる。また、Ａ．ソーエとしては、市販の種麹や、登録番号ＪＣＭ２２２６、ＮＢＲＣ４２３９又はＮＢＲＣ５２４１で指定される特定の菌株などを用いることができる。Ａ．オリゼとしてＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８が、そしてＡ．ソーエとしてＪＣＭ２２２６が白米、大麦の両方の麹においてセレブロシド生産量が高いことから、本発明で使用するのに特に適している。また、上記麹菌以外の麹菌として、大麦麹の場合にＡ．オリゼは登録番号ＮＢＲＣ４２５５、ＡＴＣＣ１１４９４、ＡＴＣＣ１６８６８、ＮＢＲＣ５７８６、ＪＣＭ２２４５、ＮＢＲＣ５２４０などを、米麹の場合にＡ．オリゼは登録番号ＪＣＭ２２２７、ＪＣＭ２１７３、ＪＣＭ２２２９、ＮＢＲＣ４２６１などを使用することができる。
【００３４】
本発明の方法において、蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることが好ましい。蒸きょう後の製麹原料の水分量が３０重量％未満であると、発芽および菌体生育が抑制されてしまう虞があり、又は３６重量％を超えると、発芽は早まるが菌体生育が緩慢になる虞があるからである。
【００３５】
本発明の方法においては、棚時代を高湿度（例えば８５％以上）条件下で行うことが好ましい。これにより、棚時代における麹水分の蒸散を抑制することができ、その結果、スフィンゴ脂質を効率的に富化することができる。
【００３６】
また本発明の方法においては、棚時代を、製麹時間が４６時間以上となるまで行うことが好ましい。これにより、製造される麹中のスフィンゴ脂質を経時的に富化することができる。
【００３７】
上記のようにして製造される麹は、スフィンゴ脂質（特にセレブロシド）を豊富に含むものである。具体的には、本発明の方法は、無機塩類を添加しない製麹によって製造された米麹、あるいは従来の製麹によって製造された市販の米麹に比べて、添加する無機塩類の種類及び濃度に応じて、米麹中のスフィンゴ脂質の総量をそれぞれ最大で約２．２倍、および１０．６倍まで富化することができた（実施例５、図６）。なお、麹中のスフィンゴ脂質の量は、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどを使用することによって測定することができる。
【００３８】
このように、本発明の方法は、有機溶媒を用いた抽出や濃縮を行うことなくそのまま食用として用いることができる麹において、煩雑な条件でストレスをかける工程などを必要とせず、安全性が高いスフィンゴ脂質を効率的に富化することができる。
【００３９】
本発明の方法により富化されたスフィンゴ脂質を含む麹は、飲食品原料の一部として用いたり、或いは飲食品の製造工程又は製造後に添加又は配合してもよいし、飲食品としてそのまま使用してもよい。そのような飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などとして提供することもできる。
【００４０】
飲食品の形態は特に制限されるものではなく、例えばこれに制限されるものではないが、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類（アルコール性飲料）、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、サラダ、スープ等の各種総菜などを例示することができる。
【００４１】
また、飲食品中の有効成分としてのスフィンゴ脂質富化麹の摂取量は、通常、０．７〜１．４ｇ／日、好ましくは１．１〜２．２ｇ／日程度とすることができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
Ａ．オリゼは液体培養時、グルコシルセラミドやセラミドといったスフィンゴ脂質を生産することが知られており、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）はその他にガラクトシルセラミドも生産するという報告がある（上記非特許文献２）。すなわち、麹菌は種によって異なる分子種を生産すると考えられる。現在、各種麹菌が上記以外に、どのような複合スフィンゴ脂質を生産しているかについては未解明であるため、以下の実施例では、代表的な麹菌としてＡ．オリゼを選び、スフィンゴ脂質の中でも分析例が多いグルコシルセラミド、すなわちセレブロシド量を測定することで、総スフィンゴ脂質量の評価を行った。
【００４４】
[実施例１] 米麹セレブロシド標準品の精製と構造解析
米麹セレブロシド標準品の調製法を以下に示した。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）を使用して製麹した米麹５．４ｋｇを粉砕し、５倍量のクロロホルム−メタノール（２：１）で２回抽出、濾過して得られた抽出液を濃縮、乾固後、０．２Ｍ ＫＯＨ−メタノール溶液にて３７℃で２時間振盪し、グリセロ脂質を分解しアルカリ安定脂質を得た。中和後、濃縮、乾固し、クロロホルム−メタノール−０．８％ＮａＣｌ（８：４：３）に再溶解した。振盪混合し、遠心分離後、下層を濃縮した。
【００４５】
これをケイ酸カラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノールを用いて遊離脂肪酸等を除いた。再度ケイ酸カラムクロマトグラフィーに供した後、セレブロシド画分として白色の固形油脂状物４０７．９ｍｇを得た。その後、わずかに混在する遊離脂肪酸を除去するため、さらにＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて精製を行なった。カラムはＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ；２０×２５０ｍｍ、カラムオーブンは４０℃、移動相にはメタノールを用いて、アイソクラティック溶出を行い、流速６ｍｌ／ｍｉｎとした。得られた精製品は、薄層クロマトに供したところ単一スポットとなり、また以下に示すように主要分子がグルコシルセラミドと同定されたため、これを標準品としてセレブロシドの定量を行った。
【００４６】
主要分子種の構造解析を行った。すなわち、ＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて、前述の条件で、精製セレブロシドに含まれる主要分子を分取した。得られた主要３分子（保持時間２８．７分、３２．１分、３７．４分）について、構造解析を実施した。
【００４７】
保持時間２８．７分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ ７７６．５７４５６に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、分子式はＣ４３Ｈ７９ＮＯ９（Ｃ４３Ｈ７９ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７７６．５６５２５（Δ＋４．５７ｍｍｕ））と決定した。
【００４８】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルの特徴からこの分子がセレブロシドであると同定された。まず糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値から、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００４９】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ５．１０）−Ｈ−３’（δ６．１０、Ｊ３’，４’＝１５．７Ｈｚ）−Ｈ−４’（δ６．１６）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されること、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ、３−トランス脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、この分子をメタノール性０．９Ｎ ＨＣｌを用いて１００℃、１８時間還流することで分解（メタノリシス）し、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３６９に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した。
【００５０】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−１（δ ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１４）−Ｈ−７（δ ２．１４）−Ｈ−８（δ５．２４）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及びＨＭＢＣスペクトルで９−ＣＨ３（δ１．６０）からＣ−８（δ１２３．３）、Ｃ−９（δ１３．５）に１Ｈ−１３Ｃ遠隔スピン結合が観測されることから、９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。この時点で既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８であると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（非特許文献２）。
【００５１】
保持時間３２．１分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ ７７８．５８４０３に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、分子式はＣ４３Ｈ８１ＮＯ９（Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７７８．５８０９０（Δ＋３．１３ｍｍｕ））と決定した。
【００５２】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間２８．７分）によく類似していた。糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値はほぼ同一であることから、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００５３】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されたこと、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするためにメタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３７１に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した（＝２−ヒドロキシステアリン酸）。
【００５４】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトル及びＨＭＢＣスペクトルにおいて１８ｈ：１−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃとまったく同じ相関が認められることから、この分子の長鎖塩基も９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分も直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８あると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（非特許文献２）。
【００５５】
保持時間３７．４分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ７９２．６０１５８に（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンが観測され、Ｆ５の分子式はＣ４４Ｈ８３ＮＯ９（Ｃ４４Ｈ８３ＮＯ９Ｎａ ｃａｌｄ ７９２．５９６５５（Δ＋０．９４ｍｍｕ））と決定した。
【００５６】
次にこの分子を重ピリジン（Ｃ６Ｄ５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ解析）を行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間３２．１分）によく類似していた。糖部分の１Ｈ、１３Ｃ化学シフト値及びＪＨＨ値についても１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同一であることから、構成糖もグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。
【００５７】
脂肪酸については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルにおいて１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同様にＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ結合が観測されること、また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、メタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。精製後トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ ３９９に（Ｍ−１５）＋のピークが観測され、Ｆ５を構成する脂肪酸炭素数はＣ２０と決定した（＝２−ヒドロキシアラキジン酸）。
【００５８】
長鎖塩基については１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルでＨ−１（δ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１６）−Ｈ−７（δ２．１６）−Ｈ−８（δ５．４６）−Ｈ−９（δ５．４６）というｖｉｃｉｎａｌ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及び１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃで観測された９−ＣＨ３の信号が観測されないことから、４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また１Ｈ ＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ２０）の炭素数を引いたＣ１８であると決定され、この結果、この分子の構造は図１に示すように２０ｈ：０ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類及び植物に特徴的な構造であり（非特許文献２）、米由来のセレブロシドも含まれていると考えられる。
【００５９】
続いて、セレブロシドの精製品をＬＣ／ＭＳ（ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ島津製作所）によって分析し、主要３分子の量比を調べた。イオン化モードはＥＳＩ（−）、カラムはＣａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ １５０×２ｍｍ、移動相はＴＨＦ／メタノール（１／９ ｖ／ｖ）を用いてアイソクラティック溶出を行い、流速は０．２ｍｌ／ｍｌとした。その結果、それぞれの分子種の量比は、以下のとおりであることが示唆された。このことから、真菌に特徴的な分子である１８ｈ：０−９Ｍｅ ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃが、米麹中のセレブロシドの大半を占めることが示された。
【００６０】
【表１】
【００６１】
[実施例２] 米麹、大麦麹中のセレブロシド含量の測定法
実施例３〜６におけるセレブロシドの定量は、各検体から有機溶剤を用いて抽出後、実施例１で得られたセレブロシドを標準品として用い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行った。ＴＬＣとＨＰＬＣのどちらの測定法においても、定量値がほぼ一致していることを確認した（図２）。
【００６２】
また、麹からのセレブロシドの抽出は以下に示すように単回、又は繰り返し抽出により行った。単回抽出は、より簡便な方法によって、各実験区におけるセレブロシド含量の比較を行うために実施し、繰り返し抽出は実際に麹に含まれるセレブロシド含量を定量する目的で実施した。各抽出法で得られる定量値について、比較データの一例を図２に示した。検討の結果、麹中のセレブロシド含量によって、単回抽出の抽出効率は変動し、繰り返し抽出で得られる米麹中のセレブロシド含量は、単回抽出で得られる定量値の約１．５〜２倍程度に相当する事が示された。
【００６３】
単回抽出によるセレブロシド量の測定法を以下に示した。麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対してクロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行った。これを遠心分離して得られた上清１ｍｌに対し、０．８％ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加後、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収し、一定量を測定に用いた。
【００６４】
繰り返し抽出による総セレブロシド含量の測定法を以下に示した。米麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対し、クロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行い、遠心分離後に上清を得た。計３回の抽出を行った後、上清全量に１／４量の０．８％ＮａＣｌ溶液を添加し、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収した。上清にクロロホルムを添加して、さらに２回の抽出を行った。下層全量を一定量に合わせ測定を行い、乾燥麹１ｇあたりに含まれる総セレブロシド量を算出した。
【００６５】
ＴＬＣ−デンシトメトリー法によるセレブロシド定量法を以下に示す。抽出した試料をケイ酸薄層クロマトグラフィー（メルク社製、商品名：ＨＰＴＬＣ ｓｉｌｉｃａ−６０ Ｆ２５４）にかけた。クロロホルム−メタノール（９５：１５）で展開後、オルシノール硫酸試薬（オルシノール：０．２％ｗ／ｖ、硫酸：１１．４％ｖ／ｖ）を噴霧し、加熱後に出現する赤紫色のセレブロシドのスポットについて、デンシトメトリーを用いて定量を行った。
【００６６】
ＨＰＬＣ−コロナＣＡＤ検出器によるセレブロシド定量法を以下に示した。定量法は、ＨＰＬＣ−蒸発光散乱検出器法（Ｊ．Ｏｌｅｏ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．３，ｐ．１２７−１３３，２００４）を基に、より検出感度を上げるために検出部分を改良して行った。すなわち移動相は、Ａ液：クロロホルム、Ｂ液：９５％メタノール、を用いて、グラジエント溶出を行った（表２）。カラムは、シリカカラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＳＩＬ−１００Ａ（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、カラムオーブン：４０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎとした。また、検出器については蒸発光散乱検出器よりも感度、定量範囲、再現性が優れているとされるコロナＣＡＤ検出器を用いた。コロナＣＡＤ検出器は、ガス：窒素ガス、操作時ガス圧：３５ｐｓｉとした。
【００６７】
【表２】
【００６８】
[実施例３] 各種麹菌のセレブロシド生産量
蒸米および蒸大麦に対し、各種市販種麹１０株及び菌株保存機関より入手した各種麹菌５５株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、４６時間製麹した。得られた麹を凍結乾燥し、粉砕後に乾燥麹中のセレブロシド量を実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００６９】
図３に、大麦麹及び米麹に含まれる各種麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）のセレブロシド生産量を示した。原料が米の場合においても、大麦の場合においても、セレブロシド含量が高い株について、菌株名と入手元の菌株保存機関における識別番号を記した。Ａ．ｏｒｙｚａｅにおいてはＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８、ＡＴＣＣ３６２６１を、Ａ．ｓｏｊａｅとしてはＪＣＭ２２２６が、米、大麦、いずれの培地においてもセレブロシド生産量が特に高いことが示された。また、全ての菌株において原料を大麦にした場合の方が、米の場合より生産量が高く（１．１倍〜４倍程度）なった。
【００７０】
[実施例４] 米麹における各種塩類添加検討
各種塩類を添加し、製麹を行った場合のセレブロシド含量の変化について評価した。原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用いて、水分量３０％の蒸米を調製した。この蒸米１ｋｇに対し、４０ｍｌの割合で各種塩類の溶液（リン酸カリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸二カリウム、酢酸カリウム、クエン酸三カリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫化鉄、硫化亜鉛、硫化マンガン）溶液を添加し、均一になるように混合した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００７１】
調製した米麹のセレブロシド量を図４に示した（グラフ中の各種塩類量は白米１ｋｇに対する添加量を示している）。その結果、クエン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの塩類においてセレブロシド量増加が顕著にみられ、いずれも濃度依存的にセレブロシド量が増加していた。
【００７２】
[実施例５] 米麹でのカリウム塩添加濃度検討
実施例４において、クエン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム等のカリウム塩において顕著な効果がみられたことから、これらのカリウム塩の最適添加量を調べた。すなわち、原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用いて、水分量３０％の蒸米を調製した。この蒸米１ｋｇに対し、４０ｍｌの割合で各カリウム塩溶液（クエン酸三カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム）を添加し、均一になるように混合した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。各カリウム塩の添加濃度は白米１ｋｇあたり、リン酸カリウム：４〜４０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム：４０〜１６０ｍｍｏｌ、クエン酸三カリウム：２０〜１２０ｍｍｏｌとした。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。
【００７３】
調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。出麹サンプルのセレブロシド量を図５に示した（グラフ中の塩類量は白米１ｋｇに対する添加量）。いずれの実験区においても、コントロール（水添加）と比較して、セレブロシド量が増加していた。リン酸カリウムは２０ｍｍｏｌ添加、硝酸カリウムは８０ｍｍｏｌ添加、クエン酸カリウムは４０ｍｍｏｌ添加時にセレブロシド量が最大となった。無添加の米麹と比較すると、セレブロシド量の増加はリン酸カリウム添加で１．３倍、硝酸カリウム添加で２．０倍、クエン酸カリウム添加で２．１倍であった。
【００７４】
さらに、各カリウム塩添加で最も効果の見られた濃度（リン酸カリウム２０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム８０ｍｍｏｌ、クエン酸カリウム４０ｍｍｏｌ添加）、コントロール（水添加）、一般製麹条件（４６時間：市販米麹）における総セレブロシド量を、実施例１の繰り返し抽出及びＨＰＬＣによって測定し麹１ｇあたりの総セレブロシド量を測定した。結果を図６に示した。その結果、最も効果の高かったクエン酸カリウム添加において、総セレブロシド量がコントロールの２．２倍、さらに一般的製麹条件（４６時間：市販米麹）に比べて１０．６倍にまで達することが示された。
【００７５】
[実施例６] 浸漬時カリウム塩添加濃度検討
実施例４、５では、植菌時に塩類を添加しているが、原料を浸漬する際に塩類添加した場合でも、効果が見られるか検討を行った。原料米としてコシヒカリ（水分１２．５％）を用い、実施例４で顕著な効果が見られたカリウム塩溶液（リン酸カリウム、硝酸カリウム、クエン酸三カリウム）を浸漬・吸水させて蒸米を調製した。リン酸カリウムはｐＨ５．８となるようにリン酸一カリウムとリン酸二カリウムを用いて調製した。蒸米水分量は３０〜３３％で、蒸米水分量より算出したカリウム塩添加濃度は白米１ｋｇあたり、リン酸カリウム：２５０ｍｍｏｌ、４７０ｍｍｏｌ、硝酸カリウム：２００ｍｍｏｌ、クエン酸三カリウム：８０ｍｍｏｌとした。得られた蒸米に対し、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、３２時間後に品温を４０℃として８８時間製麹した。調製した米麹のセレブロシド量は実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって測定した。
【００７６】
調製した米麹のセレブロシド量を図７に示した（グラフ中の添加量は白米１ｋｇあたりの添加量を示した）。その結果、カリウム塩類を添加した米麹はコントロール（添加なし）の米麹と比較して、セレブロシド量が増加していた。このことから、カリウム塩の添加が原料浸漬時であっても、植菌時添加と同様にセレブロシド量が増加することが確認できた。コントロールの米麹と比較すると、セレブロシド量の増加は、浸漬時のカリウム塩がリン酸カリウムの場合１．９倍、硝酸カリウムで２．２倍、クエン酸カリウムにおいても２．２倍であった。
【００７７】
[比較例１] 各種液体培地における菌体あたりのセレブロシド量
培地条件の違いが菌体あたりのセレブロシド量に及ぼす影響を評価するために、ＣＺＡＰＥＫ ＤＯＸ培地（２％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ＮａＮＯ３、０．２％ＫＣｌ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、デキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ペプトン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮａＮＯ３、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、麦芽エキス培地（２％モルトエキス）及びポテトデキストロース培地（２．４％ポテトデキストロース）に対し、胞子数が１０５／ｍｌとなるように粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２ｈｒ培養した。培養後、菌体を回収・洗浄後、凍結乾燥し、実施例１の単回抽出及びＴＬＣによって乾燥菌体あたりのセレブロシド量を求めた。
【００７８】
各培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を図８に示す。図８から分かるとおり、酵母における報告と同様に、麹菌においても培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することがわかった。これは、単純に菌体量が増えればスフィンゴ脂質も増大するというものではないことを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明にかかるスフィンゴ脂質富化麹の製造方法は、煩雑な工程を必要とせず、従来微生物によるスフィンゴ脂質製造において行われていたような、有機溶媒を用いた抽出や濃縮をすることも必要としないため、労力とコストを低減できるばかりでなく、食品組成物として安全性が高く、非常に有用なスフィンゴ脂質富化麹を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、米麹由来のグルコシルセラミド主要分子種の構造を示す。
【図２】図２は、セレブロシドの測定における薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との比較を示す。
【図３】図３は、各種麹菌のセレブロシド生産量を示す。
【図４】図４は、製麹において各種塩類溶液を添加することにより調製した米麹中のセレブロシド量の比較を示す。
【図５】図５は、製麹におけるカリウム塩添加量とセレブロシド量との関係を示す。
【図６】図６は、実施例において最も効果が認められた濃度の各カリウム塩存在下で製麹を行った際の、米麹中の総セレブロシド量の比較を示す。
【図７】図７は、製麹原料浸漬時に各種塩類を添加した場合におけるセレブロシド量を示す。
【図８】図８は、各種液体培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
【請求項２】
カリウム塩又はナトリウム塩の存在下で製麹を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
製麹原料は米であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
製麹原料を蒸きょうした後、麹菌の植菌前または植菌後盛りまでに無機塩類を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に無機塩類を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
製麹に使用する麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及び鉄塩からなる群から選択される１種又は２種以上の無機塩類の存在下で製麹を行うことを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。
【請求項２】
カリウム塩又はナトリウム塩の存在下で製麹を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
製麹原料は米であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
製麹原料を蒸きょうした後、麹菌の植菌前または植菌後盛りまでに無機塩類を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で１〜３６０ｍｍｏｌであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
蒸きょう前の製麹原料の浸漬時に無機塩類を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
無機塩類の添加濃度は、製麹原料１ｋｇあたりイオン換算で５０〜５００ｍｍｏｌであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
製麹に使用する麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−４１９７２（Ｐ２０１０−４１９７２Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０９０２１（Ｐ２００８−２０９０２１）
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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