セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物
【課題】セルロース結合性ペプチドを使用する方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程（Ｓ１）と、前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程（Ｓ２）と、処理された前記セルロース及び前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程（Ｓ３）と、を含む。
【解決手段】本発明に係る方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程（Ｓ１）と、前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程（Ｓ２）と、処理された前記セルロース及び前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程（Ｓ３）と、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物に関し、特に、セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用を利用する方法及びその生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、例えば、微生物のアルコール発酵によるバイオエタノールの製造において使用される糖の原料として期待されている。このセルロースに関連して、特許文献１には、ファージディスプレイペプチドライブラリーを使用したバイオパニングにより、セルロース結合性ペプチドを取得することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−９４８２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、セルロース結合性ペプチドの使用については未だ十分な検討がなされていない。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程と、前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程と、処理された前記セルロース及び生成された前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程と、を含むことを特徴とする。本発明によれば、セルロース結合性ペプチドを使用する方法を提供することができる。
【０００７】
また、前記セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドであることとしてもよい。また、前記第一工程において所定量の前記セルロース結合性ペプチドを含有する前記溶液を調製し、前記第二工程において前記所定量の２０％以上の前記セルロース結合性ペプチドが切断されるまで前記溶液をインキュベーションすることとしてもよい。
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るセルロースは、前記いずれかの方法において、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理することにより製造されたことを特徴とする。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るペプチドは、前記いずれかの方法において、前記セルロース結合性ペプチドを切断することにより製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングの操作条件の一例を示す説明図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングの操作についての説明図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの一例を示す説明図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたインキュベーション及び回収の操作についての説明図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの他の例を示す説明図である。
【図１２】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドから生成された部分ペプチドを定量した結果の一例を示す説明図である。
【図１３】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドから生成された部分ペプチドを定量した結果の他の例を示す説明図である。
【図１４】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３２ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１５】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１６】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３７ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１７】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３７ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１８】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３９ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１９】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３９ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図２０】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ８４ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図２１】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ８４ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図２２】本発明の一実施形態に係る方法において５つのセルロース結合性ペプチドから生成された部分ペプチドの一例をまとめて示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。
【００１３】
図１は、本発明の一実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。図１に示すように、本方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程（以下、「準備工程Ｓ１」という。）と、当該溶液をインキュベーションすることにより、当該セルロースを当該セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程（以下、「インキュベーション工程Ｓ２」という。）と、処理された当該セルロース及び生成された当該部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程（以下、「回収工程Ｓ３」という。）と、を含む。
【００１４】
準備工程Ｓ１においては、まず、セルロースと、セルロース結合性ペプチドと、を準備する。セルロースは、β−グルコースが１，４−β−グリコシド結合により直鎖状に重合して形成された高分子物質であり、一般に、結晶部分とアモルファス部分とを含む。
【００１５】
本方法で使用されるセルロースは特に限られず、任意のものを適宜選択して使用することができる。すなわち、セルロースとしては、任意の結晶構造を有するものを使用することができる。
【００１６】
具体的に、例えば、セルロースＩ型、セルロースＩＩ型、セルロースＩＩＩ型、セルロースＩＶ型からなる群より選択される１種又は２種以上を使用することができる。セルロースＩ型としては、セルロースＩα型やセルロースＩβ型を使用することができる。セルロースＩＩＩ型としては、セルロースＩＩＩＩ型やセルロースＩＩＩＩＩ型を使用することができる。
【００１７】
これらのうち、セルロース結合性ペプチドとの相互作用を効果的に実現できる点で、セルロースＩＩＩ型を好ましく使用することができ、特にセルロースＩＩＩＩ型を好ましく使用することができる。
【００１８】
また、セルロースとしては、任意の結晶化度を有するものを使用することができる。すなわち、例えば、結晶化度が５０％以上のセルロースを使用することができ、結晶化度が７０％以上のセルロースを好ましく使用することができ、結晶化度が８０％以上のセルロースをより好ましく使用することができ、結晶化度が９０％以上のセルロースを特に好ましく使用することができる。
【００１９】
具体的に、例えば、結晶化度が９０％以上のセルロースＩＩＩ型を好ましく使用することができ、特に結晶化度が９０％以上のセルロースＩＩＩＩ型を好ましく使用することができる。
【００２０】
本発明の発明者らが独自に検討した結果、セルロースの結晶化度が高くなるほど、当該セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用をより効果的に実現することができるという知見が得られている。また、セルロースの結晶化度が低くなるほど、当該セルロースはセルロース分解酵素により分解されやすくなる傾向がある。
【００２１】
セルロースの結晶化度は、例えば、Ｘ線回折により算出することができる。すなわち、セルロースの結晶化度は、例えば、所定のＸ線回折装置を用いて測定される広角Ｘ線回折プロファイル（もしくはデコンボリューション後のプロファイル）におけるピーク面積値の比率により算出することができる。
【００２２】
本発明で使用されるセルロース結合性ペプチドは、溶液中でセルロースに結合して、当該セルロース結合性ペプチドと当該セルロースとの複合体を形成するペプチドである。すなわち、セルロース結合性ペプチドは、例えば、アミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドからなるペプチド群から、セルロースに対する結合能に基づいて選択されたペプチドである。
【００２３】
ペプチド群としては、例えば、アミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドを含むペプチドライブラリーを使用することができる。すなわち、この場合、セルロース結合性ペプチドは、例えば、アミノ酸残基数が所定範囲内であってアミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドを含むペプチドライブラリーから選択することができる。ペプチドライブラリーは、アミノ酸残基数が所定範囲内の所定値である複数種類のペプチドを含むことができ、また、アミノ酸残基数が所定範囲内で互いに異なる複数種類のペプチドを含むこともできる。
【００２４】
より具体的に、ペプチドライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイを利用したペプチドライブラリー（ファージディスプレイペプチドライブラリー）を好ましく使用することができる。ファージディスプレイペプチドライブラリーは、表面に提示したペプチドのアミノ酸配列が互いに異なる複数種類のファージを含むペプチドライブラリーである。ファージディスプレイペプチドライブラリーを構成するファージの種類は特に限られず、例えば、Ｍ１３バクテリオファージやＴ７バクテリオファージを好ましく使用することができる。
【００２５】
また、ペプチドライブラリーとしては、例えば、細胞表層に提示したペプチドのアミノ酸配列が互いに異なる複数種類の酵母や大腸菌等の微生物を含むペプチドライブラリーを使用することもできる。また、リボソームディスプレイペプチドライブラリー等、無細胞システムに基づくペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーを使用することもできる。
【００２６】
なお、ペプチドライブラリーに含まれるペプチドは、直鎖状のペプチドに限られず、例えば、環状のペプチドとすることもできる。すなわち、例えば、核酸のランダム領域の両端にシステイン残基を配置し、当該システイン残基の側鎖間でジスルフィド結合を形成することにより当該ランダム領域を環状構造にしたペプチドライブラリーを使用することもできる。
【００２７】
ペプチドライブラリーからのセルロース結合性ペプチドの選択は、当該ペプチドライブラリーに含まれるペプチドのセルロースに対する結合能の高さに基づいて行うことができる。すなわち、例えば、ペプチドライブラリーに含まれる複数種類のペプチドとセルロースとを溶液中で混合し、当該複数種類のペプチドのうち、当該セルロースに結合し複合体を形成したペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択する。
【００２８】
具体的に、セルロース結合性ペプチドは、例えば、ペプチドライブラリーを使用したバイオパニングにより選択することができる。すなわち、例えば、ファージその他の微生物やリボソーム等の提示媒体によるペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーと、セルロースと、を混合し、当該セルロースに結合した当該提示媒体を選択的に回収し、回収された当該提示媒体が提示するペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択する。
【００２９】
また、バイオパニングによってセルロースと複合体を形成する複数のペプチドが得られた場合には、当該複数のペプチドのうち、単一のパニングにおける出現頻度が２以上であるペプチド、又は操作条件の異なる複数のパニングにおいて出現したペプチドを、セルロース結合性ペプチドとして選択することもできる。この場合、さらに、セルロース以外の材料に結合する（当該材料と複合体を形成する）ペプチド以外のペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択することもできる。このような基準によれば、セルロースに特異的に結合するセルロース結合性ペプチドを確実に選択することができる。
【００３０】
また、セルロース結合性ペプチドとしては、アミノ酸残基数が比較的小さいものを好ましく使用することができる。すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドとすることができる。さらに、セルロース結合性ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、６〜２０個の範囲とすることができ、好ましくは６〜１４個の範囲とすることができ、より好ましくは７〜１２個の範囲とすることができる。
【００３１】
このため、セルロース結合性ペプチドをペプチドライブラリーから選択する場合には、アミノ酸残基数が上述の範囲であるペプチドを含むペプチドライブラリーを使用することが好ましい。すなわち、この場合、例えば、アミノ酸残基数が上述の範囲内である複数種類のペプチドを提示した提示媒体（ファージその他の微生物やリボソーム等）によるペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーを好ましく使用することができる。
【００３２】
具体的に、例えば、ランダムペプチドの鎖長が１２−ｍｅｒや７−ｍｅｒである市販のファージディスプレイペプチドライブラリーを使用することができる。もちろん、ペプチドライブラリーは市販のものに限られず、公知の方法に基づいて、アミノ酸残基数が上述の範囲である任意のペプチドライブラリーを作製し使用することができる。
【００３３】
準備工程Ｓ１においては、上述のようにして準備されたセルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液（以下、「セルロース／ペプチド溶液」という。）を調製する。すなわち、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを溶液中で混合する。
【００３４】
セルロース／ペプチド溶液は、当該溶液中でセルロースとセルロース結合性ペプチドとが相互作用でき、且つ後述するように、当該溶液中で当該セルロース結合性ペプチドを切断できるものであれば特に限られない。
【００３５】
すなわち、セルロース／ペプチド溶液は、例えば、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する水溶液とすることができる。この場合、溶媒としては、例えば、水や緩衝溶液を使用することができる。緩衝溶液は、緩衝剤を含有する水溶液であれば特に限られず、任意の組成のものを適宜選択して使用することができる。具体的に、例えば、酢酸緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ６．０〜７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を使用することができる。これらの緩衝溶液は、所定の塩類（例えば、１５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ）を含有することもできる。また、セルロース／ペプチド溶液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲とすることができる。
【００３６】
セルロースとセルロース結合性ペプチドとの組み合わせは、相互作用する組み合わせであれば特に限られないが、当該相互作用を効果的に実現する上では、当該セルロースは、当該セルロース結合性ペプチドの選択に使用されたセルロースとすることが好ましい。換言すれば、セルロース／ペプチド溶液が含有すべき所定のセルロースを使用して、セルロース結合性ペプチドを選択することが好ましい。
【００３７】
すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩＩＩ型）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合には、当該セルロース結合性ペプチドと、当該所定の結晶構造を有するセルロースと、を含有するセルロース／ペプチド溶液を調製することが好ましい。
【００３８】
また、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶化度を有するセルロース（例えば、結晶化度が９０％以上のセルロース）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合には、当該セルロース結合性ペプチドと、当該所定の結晶化度を有するセルロースと、を含有するセルロース／ペプチド溶液を調製することが好ましい。
【００３９】
なお、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩＩＩ型）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合であっても、当該セルロース結合性ペプチドと他の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩ型）との相互作用は可能である。セルロース／ペプチド溶液は、１種又は２種以上のセルロースを含有することができ、１種又は２種以上のセルロース結合性ペプチドを含有することもできる。
【００４０】
セルロース／ペプチド溶液に含有されるセルロース及びセルロース結合性ペプチドの濃度は、これらが相互作用する範囲であれば特に限られない。セルロース／ペプチド溶液におけるセルロースの濃度は、例えば、０．０５〜２重量％の範囲とすることができ、好ましくは０．１〜０．５重量％の範囲とすることができる。セルロース／ペプチド溶液におけるセルロース結合性ペプチドの濃度は、例えば、０．１μＭ以上とすることができ、好ましくは０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲とすることができ、より好ましくは１〜１００μＭの範囲とすることができる。なお、セルロース／ペプチド溶液におけるセルロース結合性ペプチドの濃度は、溶媒に溶解し得る範囲で可能な限り高めることができる。
【００４１】
インキュベーション工程Ｓ２においては、準備工程Ｓ１で調製されたセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションすることにより、セルロースをセルロース結合性ペプチドで処理するとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する。
【００４２】
なお、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドの主鎖を切断することによって生成されるペプチドである。すなわち、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸間のペプチド結合を切断することにより生成される。セルロース結合性ペプチドの切断は、例えば、加水分解によって行うことができる。
【００４３】
したがって、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列から一部のアミノ酸が欠如したアミノ酸配列からなるペプチドである。部分ペプチドは、例えば、インキュベーション後のセルロース／ペプチド溶液の上清中に含有される。
【００４４】
インキュベーションの条件は、セルロースをセルロース結合性ペプチドで処理し、且つセルロース結合性ペプチドを切断できる範囲であれば特に限られず、任意に設定することができる。
【００４５】
すなわち、例えば、準備工程Ｓ１において所定量のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液を調製した場合には、インキュベーション工程Ｓ２において、当該所定量の２０％以上の当該セルロース結合性ペプチドが切断されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする。
【００４６】
具体的に、例えば、所定モル数（例えば、２ｎｍｏｌ）のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする場合には、当該所定モル数の２０％のモル数（例えば、０．４ｎｍｏｌ）の当該セルロース結合性ペプチドが切断されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液を保持する。さらに、インキュベーション工程Ｓ２において切断するセルロース結合性ペプチドの量は、当初の量の２０％以上に限られず、例えば、４０％以上とすることができ、好ましくは６０％以上とすることもできる。
【００４７】
また、例えば、所定モル数（例えば、２ｎｍｏｌ）のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする場合には、当該所定モル数の２０％のモル数（例えば、０．４ｎｍｏｌ）の部分ペプチドが生成されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液を保持することもできる。この場合も、インキュベーション工程Ｓ２において生成する部分ペプチドの量は、当初のセルロース結合性ペプチドの量の２０％以上に限られず、例えば、４０％以上とすることができ、好ましくは６０％以上とすることもできる。
【００４８】
また、セルロース／ペプチド溶液が、ｐＨが４〜１０の範囲である水溶液として調製された場合には、インキュベーションは、当該セルロース／ペプチド溶液を１０時間以上保持することにより行うこともできる。この場合、インキュベーション時間は、さらに１５時間以上とすることがで、好ましくは１８時間以上とすることができ、より好ましくは２４時間以上とすることもできる。
【００４９】
セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする温度は、例えば、０〜５０℃の範囲とすることができ、好ましくは１０〜３０℃の範囲とすることができる。
【００５０】
インキュベーション工程Ｓ２におけるセルロース結合性ペプチドによるセルロースの処理は、例えば、当該セルロース結合性ペプチドを当該セルロースに作用させて、当該セルロースの特性を変化させることにより行うことができる。
【００５１】
すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドをセルロースに結合させるとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断することにより、当該セルロース結合性ペプチドに由来する部分ペプチドが結合したセルロースを生成することができる。
【００５２】
部分ペプチドをセルロースに結合させることにより、後述のとおり、例えば、当該セルロースの表面特性、分子の立体構造、分散性といった特性を向上させることができる。なお、このような処理により生成されるセルロースには、部分ペプチドに加えてセルロース結合性ペプチドが結合していてもよい。
【００５３】
また、インキュベーション工程Ｓ２においては、セルロース結合性ペプチドの切断によって、部分ペプチドを効率よく生成することができる。すなわち、セルロース結合性ペプチドをセルロースに作用させることによって、当該セルロース結合性ペプチドの一部を構成する特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを効率よく生成することができる。
【００５４】
具体的に、例えば、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列のＣ末端側の一部、Ｎ末端側の一部、又はこれらの両方を切断することにより、当該アミノ酸配列から当該末端部分が除去された、より短いアミノ酸配列からなる部分ペプチドを生成することができる。このような部分ペプチドは、例えば、アミノ酸残基数が所定値であるセルロース結合性ペプチドから生成される場合、アミノ酸残基数が当該所定値未満であって当該所定値の半分以上であるペプチドとすることができる。
【００５５】
なお、部分ペプチドが生成される機構は明らかではないが、例えば、セルロース結合性ペプチドがセルロースに結合することによって何らかの分解反応が起こり、当該セルロース結合性ペプチドが切断されるものと考えられる。この結果、例えば、インキュベーション工程Ｓ２においては、セルロース結合性ペプチドをセルロースに結合させ、次いで当該セルロース結合性ペプチドを切断することにより、当該セルロース結合性ペプチドの一部からなる部分ペプチドをセルロース／ペプチド溶液の上清中に遊離させるとともに、当該セルロース結合性ペプチドの他の一部からなる部分ペプチドが結合した当該セルロースを生成することができる。
【００５６】
また、インキュベーション工程Ｓ２においては、インキュベーションの条件を、第一の条件から、当該第一の条件とは異なる第二の条件に切り替えることもできる。すなわち、例えば、第一の条件として、セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用に好ましい条件を採用し、第二の条件として、当該セルロース結合性ペプチドの切断に好ましい条件を採用する。
【００５７】
具体的に、例えば、まず、セルロース／ペプチド溶液のｐＨを６〜８の範囲に調整して所定時間インキュベーションすることにより、セルロースに対するセルロース結合性ペプチドの効果的な結合を実現し、次いで、当該セルロース／ペプチド溶液のｐＨを４〜６の範囲又は８〜１０の範囲に調整して所定時間インキュベーションすることにより、当該セルロース結合性ペプチドの効果的な切断（部分ペプチドの生成）を実現することができる。
【００５８】
回収工程Ｓ３においては、上述のインキュベーション工程Ｓ２においてインキュベーションされたセルロース／ペプチド溶液から、処理されたセルロース及び生成された部分ペプチドの一方又は両方を回収する。
【００５９】
処理されたセルロースを回収する方法は特に限られず、例えば、セルロース／ペプチド溶液を遠心し、遠心後の沈殿物を回収することにより行うことができる。また、他の公知の分離方法や精製方法によってもセルロースを回収することができる。
【００６０】
部分ペプチドを回収する方法は特に限られず、例えば、セルロース／ペプチド溶液を遠心し、遠心後の上清を回収することにより行うことができる。また、他の公知の分離方法や精製方法によっても部分ペプチドを回収することができる。
【００６１】
このように、本方法によれば、セルロース結合性ペプチドで処理されたセルロース又は当該セルロース結合性ペプチドの切断により生成された部分ペプチドの一方又は両方を製造することができる。
【００６２】
すなわち、本方法によれば、セルロース結合性ペプチドを使用した処理によって、特性が向上したセルロースを製造することができる。具体的に、例えば、酵素による分解能が向上したセルロースを製造することができる。
【００６３】
ここで、セルロースは、例えば、上述のとおり、バイオエタノールの製造において微生物が資化するための糖の原料として使用される。この場合、セルロースを所定の酵素で分解する糖化処理により、当該セルロースを構成する単糖であるβ−グルコースを製造する必要がある。しかしながら、一般に、セルロースは、その分子構造や結晶性に基づき、酵素により分解されにくい。
【００６４】
この点、本方法においてセルロース結合性ペプチドにより処理されたセルロース（以下、「処理セルロース」という。）は、処理されていないセルロースに比べて、酵素により分解されやすくなっている。
【００６５】
すなわち、例えば、処理セルロースは、部分ペプチドが結合していることによって、その表面に当該部分ペプチドに基づく電荷が付与されている。このため、処理セルロースは、処理されていないセルロースに比べて、溶液中における分散性が向上している。したがって、処理セルロースは、酵素による作用を受けやすくなっている。
【００６６】
また、処理セルロースに結合している部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドより分子長さが短い。このため、部分ペプチドが結合した処理セルロースにおいては、セルロース結合性ペプチドが結合したセルロースに比べて、立体障害が低減されている。したがって、処理セルロースは、セルロース結合性ペプチドが結合したセルロースに比べて、酵素によるアクセスを受けやすく、分解されやすくなっている。また、処理セルロースにおいて酵素が作用する部分以外の部分を部分ペプチドにより被覆することにより、当該処理セルロースを当該酵素により分解しやすくすることができる。
【００６７】
このように、本方法により製造される処理セルロースは、バイオエタノールの原料として好ましく使用することができる。
【００６８】
そこで、本方法は、例えば、上述のようにして製造された処理セルロースを酵素により分解する工程をさらに含むこともできる。分解酵素は、セルロースを分解できるものであれば特に限られず、任意の１種又は２種以上の分解酵素を使用することができる。
【００６９】
すなわち、例えば、１，４−β−グリコシド結合を加水分解により切断するセルラーゼを好ましく使用することができる。具体的に、例えば、エキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）及びエンドグルカナーゼの一方又は両方を使用することができる。
【００７０】
酵素分解の条件は、酵素が作用する条件であれば特に限られず、例えば、ｐＨが４〜６の範囲の弱酸性条件を使用することができる。すなわち、この酵素分解工程においては、例えば、処理セルロース及び分解酵素を含有する酢酸緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ５．０）を調製し、当該溶液を所定温度で所定時間保持することにより、当該処理セルロースを分解することができる。
【００７１】
なお、上述のように、インキュベーション工程Ｓ２において、セルロース／ペプチド溶液のｐＨを６〜８の範囲に調整してセルロースにセルロース結合性ペプチドを結合させ、次いで、当該セルロース／ペプチド溶液のｐＨを８〜１０の範囲に調整してセルロース結合性ペプチドを切断した場合には、続く処理セルロースの酵素分解工程において、当該処理セルロース及び酵素を含有する溶液のｐＨを４〜６の範囲に調整することにより、当該処理セルロースの酵素分解を効率よく行うことができる。
【００７２】
また、本方法によれば、特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを製造することができる。すなわち、本方法においては、上述のとおり、予めアミノ酸配列が特定されたセルロース結合性ペプチドをセルロースに作用させることにより、当該アミノ酸配列のうち特定の一部からなる部分ペプチドを効率よく製造することができる。
【００７３】
このような部分ペプチドの製造方法は、アミノ酸を順次結合させていくボトムアップのペプチド合成とは異なり、トップダウンによるペプチド製造方法であるといえる。このため、ボトムアップ合成のような煩雑な操作を経ることなく、簡便に、特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを製造することができる。また、生成された部分ペプチドは、セルロース／ペプチド溶液の上清中に遊離するため、当該部分ペプチドの回収及びその後の精製を容易且つ確実に行うことができる。
【００７４】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【００７５】
Ｗａｄａらの方法（Wada, M.; Nishiyama, Y.; Langan, L. Macromolecules 2006, 39, 2947-2952）に従い、セルロースＩＩＩＩ型を調製した。シオグサ(Ｃｌａｄｏｐｈｏｒａ)を１ＭのＮａＯＨ水溶液に室温で一晩以上漬け置きした後、水道水で十分に洗浄した。次いで、得られた試料を、０．１Ｍの酢酸バッファーでｐＨ４．５に調整した０．３％ＮａＣｌＯ２溶液に８０℃で２時間漬け置きした後、水道水で十分に洗浄した。以上の操作を、試料の色が白くなるまで２又は３回繰返した。
【００７６】
さらに、ホモジナイザー（Physcotron、Microtech）を用い、試料が十分に細かい断片になるまで粉砕した後、１００００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を液体窒素で凍結し、一晩かけて湿り気がなくなるまで凍結乾燥した後、さらに１０５℃で３時間以上加熱して絶乾させた。
【００７７】
こうして得られた約１ｇの試料を耐圧容器に入れて−１３℃に冷却し、当該耐圧容器内にアンモニアガスを３０分かけて充填した。この耐圧容器をオイルバスで１４０℃に加熱して超臨界流体を生成し（臨界点：１３２．４℃、１１．２８ＭＰａ）、当該耐圧容器内の圧力を１５〜１８ＭＰａに維持して１時間反応させた。アンモニアを除去した後、得られた固体を濾過装置にセットし、アンモニア臭が消えるまで３００〜５００ｍＬのメタノールで洗浄し、さらに約２００ｍＬのアセトンで洗浄した。この固体をビーカーに移し、一晩かけてアセトンが蒸発するまで放置した。
【００７８】
得られた固体を適当量（ホモジナイズ後の回収量が１００ｇの場合、３００ｍＬ)の４ＭのＨＣｌに懸濁し８０℃で８時間攪拌（５００ｒｐｍ）して加水分解した後、同量の蒸留水を加えて反応を停止した。反応後の溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心し上清を除去した。沈殿物に蒸留水を加えて再分散し、再度１００００ｒｐｍで５分間遠心し上清を除去した。この操作を上清が完全に中和されるまで３〜５回繰返した。
【００７９】
沈殿物に蒸留水を加えて２０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清が白濁し固体が浮遊していることを確認し、上清を回収した。硫酸洗浄したガラスフィルターを用いて吸引濾過をし、濾液を回収した。こうして、セルロースＩＩＩＩ型の懸濁液を得た。セルロース懸濁液は４℃で保存した。なお、セルロースＩＩＩＩ型は、特開２００８−１６１１２５号公報に記載の方法で調製することもできる。
【００８０】
セルロース懸濁液中のセルロース濃度は、１ｍＬの当該セルロース懸濁液を５ｍＬのサンプル管に採取し、１０５℃で２４時間乾燥させたのち重量を測定することにより決定した。
【００８１】
得られたセルロースＩＩＩＩ型の結晶化度は９９．９％以上であった。この結晶化度は、Ｘ線回折装置（X-ray diffractometer RU-200BH、株式会社リガク）を用いた広角Ｘ線回折により得られたプロファイルにおけるピーク面積値の比率により算出した。
【実施例２】
【００８２】
上述の実施例１において調製されたセルロースＩＩＩＩ型と、ファージディスプレイペプチドライブラリーと、を使用してバイオパニングを実施することにより、セルロース結合性ペプチドを選択した。
【００８３】
なお、試薬は、特に表記しない限り全て特級以上のものを使用した。いずれの試薬もさらなる精製を行わずに使用した。超純水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Milli−Q Academic A-10、Millipore）で比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ以上に精製した水を使用した。
【００８４】
［ファージディスプレイペプチドライブラリー］ファージディスプレイペプチドライブラリーは、Ｐｈ．Ｄ．−１２ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（NEW ENGLAND BioLabs）を用いた。このファージライブラリーにおいては、Ｍ１３ファージの非主要外殻タンパク質であるｗｉｌｄ−ｔｙｐｅのｐＩＩＩのＮ末端に、４−ｍｅｒ（ＧＧＧＳ）のスペーサーを介して直鎖の１２残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドが提示されている。理論的な計算上は２０１２（＝４．０９６×１０１５）種類のペプチドが含まれるが、実際にはエレクトロポレーションの効率が低いため、このペプチドライブラリーにおいては、２．７〜２．８×１０９種類のアミノ酸配列が提示されている。操作は、ファージライブラリーＫｉｔ付属のマニュアルを参考に一部操作を改変して行った。
【００８５】
［滅菌精製水］超純水１００ｍＬを１００ｍＬ広口メディウム瓶に採り、オートクレーブ（S-245、TOMY）を用いて１２１℃で２０分の滅菌処理を施した後に室温で保存した。
【００８６】
［Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶内で、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Becton, Dickinson and Company：BD)２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（BD）１ｇ、ＮａＣｌ（nacalai tesqe）１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（BD）１．４ｇ、塩化マグネシウム六水和物（nacalai tesque）０．１ｇを超純水(Millipore)２００ｍＬで溶かし、さらに４ＭのＮａＯＨ水溶液(nacalai tesque)５０μＬを加え、オートクレーブした後、室温で保存した。
【００８７】
［Ｇｌｙ−ＨＣｌ］Ｇｌｙｃｉｎｅ(nacalai tesque)７．５０ｇを超純水３００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌを用いて当該水溶液のｐＨを２．２に調整した後、超純水で５００ｍＬにメスアップ後、０．２２μｍフィルター(Millex、Millipore)で濾過滅菌した。このＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（４０ｍＬ）にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）（018-15154, Lot. CER0068, Wako)４０ｍｇ、フェノールレッド(nacalai tesque)４ｍｇを加えて溶解させ、再度０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し４℃で保存した。得られたＧｌｙ−ＨＣｌ溶液は、２００ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、１ｍｇ/ｍＬのＢＳＡを含有し、そのｐＨは２．２であった。
【００８８】
［Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液］エタノール(Spectrum grade、nacalai tesque)２０ｍＬにテトラサイクリン塩酸塩(Wako)１００ｍｇを溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し、−２０℃で遮光保存した。
【００８９】
［ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液］Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（IPTG、Wako)２５０ｍｇ、５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（X-Gal、Wako)２００ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）(Spectrum
grade、nacalai tesque)５．０ｍＬに溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し、−２０℃で遮光保存した。
【００９０】
［ＬＢ培地］５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−Ｍｅｄｉｕｍ（capsules、Q・BIOgene)１２個及び超純水４８０ｍＬ、４ＭのＮａＯＨ水溶液１２０μＬを加えてオートクレーブした後、室温で保存した。
【００９１】
［ＬＢ−Ｔｅｔ ｐｌａｔｅ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを０．５ｇ、ＮａＣｌを１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒを１．５ｇ、超純水１００ｍＬで溶かし、４ＮのＮａＯＨ水溶液２５μＬを加えてオートクレーブ後、温度が５０℃以下になってからＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液４００μＬを加えた。この溶液を滅菌済みシャーレに分注し、室温で固化させた後、４℃で遮光保存し、1ヶ月以内に使用した。
【００９２】
［ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ｐｌａｔｅ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを１ｇ、ＮａＣｌを２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒを３ｇ、超純水２００ｍＬで溶かし、４ＭのＮａＯＨ水溶液５０μＬを加えてオートクレーブ後、５０℃以下まで冷却し、ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液２００μＬを加えた。この溶液を滅菌済みシャーレに分注し、室温で固化させた後、４℃で遮光保存し、4日以内に使用した。
【００９３】
［１０×ＴＢＳ］Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ(nacalai tesuque)を３０．４ｇ、ＮａＣｌを４３．８ｇ、超純水４００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌ(nacalai tesque)でｐＨを７．５に調整した後、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後、４℃で保存した。こうして５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１．５ＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨが７．５の１０×ＴＢＳを調製した。１×ＴＢＳは１０×ＴＢＳを超純水で１０倍に希釈して調製し、オートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９４】
［１×ＴＢＳ（０．１ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＴＢＳＴ）］４０ｍＬの１×ＴＢＳにＴｗｅｅｎ２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）(nacalai tesque)４０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９５】
［１×ＴＢＳ（０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ＴＢＳＴ）］４０ｍＬの１×ＴＢＳにＴｗｅｅｎ２０(nacalai tesque)２０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９６】
［１×ＴＢＳ（２０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ、２０％ＴＢＳＥ］４０ｍＬの１×ＴＢＳにｅｔｈａｎｏｌ(nacalai tesque)１０ｍＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９７】
［酢酸水溶液（５００ｍＭ）］酢酸(nacalai tesuque)１５ｇを超純水４００ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９８】
［酢酸ナトリウム水溶液（５００ｍＭ）］酢酸ナトリウム三水和物(nacalai tesuque)３４ｇを超純水４００ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９９】
［１×ＡＢ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）］酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍＬを超純水４００ｍＬに溶解させ、酢酸水溶液でｐＨ５．０に調整した後に超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【０１００】
［１×ＡＢＥ（２０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ）］４０ｍＬの１×ＡＢに１０ｍＬのｅｔｈａｎｏｌ(nacalai tesque)を１０ｍＬ加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【０１０１】
［１×ＡＢＴ（０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０）］４０ｍＬの１×ＡＢにＴｗｅｅｎ２０ (nacalai tesque)２０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【０１０２】
［５％ＮａＮ３ストック溶液］アジ化ナトリウム(nacalai tesque)５０ｍｇを１５ｍＬチューブに採り、滅菌精製水９５０μＬに溶解させ４℃で保存した。
【０１０３】
［０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳ］５％ＮａＮ３ストック溶液１００μＬを２５ｍＬの１×ＴＢＳに溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、室温で保存した。
【０１０４】
［ＰＥＧ／ＮａＣｌ］Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（PEG#6000、nacalai tesque)を１００．０ｇ、ＮａＣｌを７３．０ｇ、超純水３３０ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップした。５００ｍＬ広口メディウム瓶に移し、オートクレーブした後渦を巻くように撹拌して均一に溶解させ、室温で保存した。
【０１０５】
［ＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎ］ゼラチン(Wako)１００ｍｇを１０ｍＬの１０×ＴＢＳ及び９０ｍＬの超純水に溶解させ、オートクレーブ後、渦を巻くように攪拌して均一に溶解させて室温で保存した。
【０１０６】
［１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）］Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを３０．４ｇ、超純水２００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌでｐＨ９．１に調整し、超純水で２５０ｍＬにメスアップし、オートクレーブ後４℃で保存した。
【０１０７】
［Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレート］１．７ｍＬチューブにＬＢ培地２００μＬを採り、滅菌済み爪楊枝を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８−８０℃グリセロールストックから殖菌した。これをＬＢ培地で１００倍に希釈し、その１００μＬをＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅにプレーティングした。３７℃で一晩培養した後、得られたマスタープレートを４℃で保存した。マスタープレートは調製後１ヶ月以内に使用した。
【０１０８】
［Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液］ＬＢ培地５ｍＬを試験管に採り、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液２０μＬを加えた。この溶液に滅菌済み爪楊枝を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレートのシングルコロニーを殖菌した。振盪培養器(BR-23FP、TAITEC)を用いて２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６６０＝０．５になるまで振盪培養し、得られたＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液を４℃で保存した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液は４日以内に使用した。
【０１０９】
［Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液］ＬＢ培地１０ｍＬを５０ｍＬチューブに採り、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液４０μＬを加えた。この溶液に滅菌済み爪楊枝を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレートのシングルコロニーを殖菌した。振盪培養器を用いて２００ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪培養し、得られたＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液を４℃で保存した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液は１週間以内に使用した。
【０１１０】
［バイオパニング］ファージディスプレイペプチドライブラリーとセルロースＩＩＩＩ型とを使用して、バイオパニングを実施した。セルロースＩＩＩＩ懸濁液（セルロース濃度：８．９７ｍｇ／ｍＬ）をセルロース濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＴＢＳ又はＡＢで希釈した。希釈後のセルロースＩＩＩＩ懸濁液を室温で１３０００ｒｐｍにて１分間遠心し、セルロースを沈殿させ、上清を除去した。沈殿物にＴＢＳ又はＡＢを１ｍＬ加えてセルロースを分散させ、室温で１３０００ｒｐｍにて１分間遠心し、セルロースを沈殿させて上清を除去した。この操作を３回繰り返し、セルロースをバッファーで洗浄、置換した。
【０１１１】
以下の操作は適宜条件変更し、Ｒｕｎ１からＲｕｎ１５まで、１５回のパニングを行った。ここでは、Ｒｕｎ１ついて説明し、他のＲｕｎに関しては操作条件のみを図２に示す。また、バイオパニングの操作の概略を図３に示す。なお、Ｒｕｎ１〜１３は、操作を室温で行い、Ｒｕｎ１４及び１５は全ての操作を４℃で行った。
【０１１２】
［（１）Ａｆｆｉｎｉｔｙ］ファージディスプレイペプチドライブラリーとセルロースＩＩＩＩ型とを混合した。すなわち、ファージライブラリー溶液を１．５×１０１１ｐｆｕ／ｍＬになるようＡＢで希釈して、これを上述のセルロースＩＩＩＩ懸濁液に加えピペッティングし、得られた混合溶液を３０分間静置した。静置後の混合溶液を室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。
【０１１３】
［（２）Ｗａｓｈ］得られた沈殿物を洗浄した。すなわち、沈殿物にＡＢＴを５００μＬ加えピペッティングにより分散させた後、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。この操作を４回繰り返した。
【０１１４】
沈殿物にＡＢを５００μＬ加えて分散させ、この溶液を新たな１．７ｍＬチューブに移し変え、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。再度、沈殿物にＡＢを５００μＬ加えセルロースを分散させ、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除去する操作を４回繰り返した。
【０１１５】
沈殿物にＡＢＥを５００μＬ加えて分散させ、この溶液を新たな１．７ｍＬチューブに移し変え、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。再度、沈殿物にＡＢＥを５００μＬ加えセルロースを分散させ、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除去する操作を４回繰り返した。
【０１１６】
［（３）Ｅｌｕｔｉｏｎ］洗浄された沈殿物に含有されるファージを溶出した。すなわち、沈殿物にＧｌｙ−ＨＣｌを１ｍＬ加えてピペッティングし、得られた溶液を５分間静置した。静置後の溶液を室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を新たな１．７ｍＬチューブに採り、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）を２００μＬ加えて中和した。
【０１１７】
次に、ファージ溶液の濃縮を行った。すなわち、中和した溶液を限界濾過ユニット(Amicon Ultra-4、Millipore)に移し、２５℃にて３５００ｒｐｍで２分間遠心し、ファージ溶液を濃縮した。濃縮されたファージ溶液にＴＢＳを１ｍＬ加えて遠心する操作を４回繰り返すことで（合計５回）、バッファー交換と同時にファージ溶液の濃縮を行った。なお、図２に示すように、この濃縮操作はＲｕｎ１〜８において行い、Ｒｕｎ９〜１５では省略した。得られたファージ溶液を０．６ｍＬチューブに移し、ＴＢＳで全量が２００μＬになるようにメスアップし、４℃で保存し、後述するファージプールの増幅及びタイタリングに用いた。
【０１１８】
次に、タイタリングを行った。すなわち、上述のようにして得られたファージ溶液をＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎを用いて複数の各濃度に系列希釈し、分注したＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液２００μＬに１０μＬずつ加えた。Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐを電子レンジで溶解させ、３ｍＬずつ分注し、ファージ溶液を全量加えた。これをあらかじめ３７℃に温めておいたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ｐｌａｔｅに均一に重層させ、固化した後に３７℃で１２時間培養した。プレート上の青いプラークの個数よりファージ溶液の力価を算出した。
【０１１９】
［（４）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］溶出されたファージを増幅させた。すなわち、５０ｍＬチューブにＬＢ培地２０ｍＬを採り、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬと、上述の溶出操作で得たファージ溶液１００μＬと、を加えた。得られた溶液を３００ｍＬのバッフル付きフラスコに移して２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２０】
［（５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ］増幅したファージを精製した。すなわち、培養後の溶液を新たな５０ｍＬチューブに移し、４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で１０分間遠心して菌体を分離した。５０ｍＬチューブに３．３ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを採り、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で一晩静置した。静置後、この溶液を４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で２０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２１】
得られたファージペレットを１ｍＬのＴＢＳに再度溶解させ、１．７ｍＬチューブに移し、遠心機（AR015-24、TOMY）を用いて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。１．７ｍＬチューブに１５０μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを採り、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１時間静置した。静置後、この溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２２】
得られたファージペレットを２００μＬの０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳで溶解させ、この溶液を再度４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。上清を新たな０．６ｍＬチューブに移し、４℃で保存した。
【０１２３】
［（６）Ｃｌｏｎｉｎｇ＆ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ］精製されたファージをクローニングするとともに、そのＤＮＡ配列を解析した。すなわち、タイタリングに用いたプレートから滅菌済み爪楊枝を用いて、無作為に青いプラークをピックアップし、ＬＢ培地１ｍＬ及びＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液１０μＬを入れた１．７ｍＬチューブに殖菌して、２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２４】
増幅したファージを含む溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心分離した。５０ｍＬチューブにＬＢ培地２０ｍＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬとファージ溶液１０μＬを加えて２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２５】
培養後、溶液を新たな５０ｍＬチューブに移し、４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で１０分間遠心して菌体を分離した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを３．３ｍＬ採った５０ｍＬチューブに、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１２時間静置した。静置後、溶液を４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で２０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２６】
遠心分離により得られたファージペレットを１ｍＬのＴＢＳに再度溶解させ、１．７ｍＬチューブに移し、４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを１５０μＬ採った１．７ｍＬチューブに、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１時間静置した。静置後、溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心して上清を除去した。
【０１２７】
得られたファージペレットを２００μＬの０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳで溶解させ、再度４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）遠心した。新たな０．６ｍＬチューブに上清を移し、４℃で保存した。
【０１２８】
ファージのｓｓＤＮＡ抽出及び精製はＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍ１３ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用い、Ｋｉｔ付属のプロトコールを一部改変して行った。１．７ｍＬチューブにクローニングにより得られたファージ溶液を１００μＬ採り、Ｍ１３ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＭＰ）を１．０μＬ加えてｖｏｒｔｅｘにて混合した。
【０１２９】
２分以上静置した後にｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットしたＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍの膜部分にＢｕｆｆｅｒ ＭＰで沈殿させた溶液をマウントし、遠心機（AR015-24、TOMY）を用いて、４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。さらにＬｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＭＬＢ）を０．７ｍＬ加えて４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。再びＢｕｆｆｅｒ ＭＬＢを０．７ｍＬ加え遠心し、その後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＰＥ）を加えて４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。
【０１３０】
さらに遠心を行い余分な水分を除去した後で、新たな１．７ｍＬチューブにカラムをセットし、滅菌精製水を５０μＬを加えて１０分間静置した後に、４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心し、ｓｓＤＮＡを溶出させ、４℃で保存した。
【０１３１】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＰＣＲはＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を用い、Ｋｉｔ付属のプロトコールを一部改変して行った。０．２ｍＬのＰＣＲ用チューブにＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｍｉｘ(Applied Biosystems)１．２μＬ、ＢｉｇＤｙｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(Applied Biosystems)０．６μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ−９６ｇ３ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒ溶液（5’-CCTCATAGTTAGCGTAACG-3’、SIGMA)０．９６μＬ、ＢｉｇＤｙｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(Applied
Biosystems)０．６μＬ、滅菌精製水２．６４μＬを混合し、鋳型ＤＮＡ溶液０．６μＬを加えてスピンダウンした。
【０１３２】
Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ(PC-320、ASTEC)を用いて９６℃、１分（９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分）]×２５ｃｙｃｌｅｓの条件でＰＣＲ反応をさせた。ＰＣＲ反応終了後に再びスピンダウンし、新たな平底チューブに反応溶液を移して、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２μＬ、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２μLを順に加えた。さらに９５％エタノール５０μＬを加え軽くｖｏｒｔｅｘで混合した後、室温で１５分間インキュベーションした。遠心機（AR002-64、TOMY)を用いて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１５分間遠心した。
【０１３３】
その後、上清を除去し、７０％エタノール１４０μＬを加えて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１５分間遠心した。再度上清を除去し、２０分間遠心エバポレーター(Micro Vac MV-100、TOMY)で乾燥させる操作を液滴の除去が確認できるまで行い、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡの塩基配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems)で解析した。
【０１３４】
［結果］図４〜図７には、Ｒｕｎ１〜Ｒｕｎ１５で選択されたペプチドのアミノ酸配列を示す。なお、ペプチドを構成するアミノ酸は、次のように１文字表記で示す。Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｃ：システィン（Ｃｙｓ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）。
【０１３５】
図４〜図７に示すように、各Ｒｕｎにおいて１０〜２８個のファージをクローニングした。ペプチド提示ファージの最大出現頻度は３であった（７−４−０４）。また、出現頻度が２のクローンが１０クローン得られた(１−５−０７、２−５−１１、３−４−０１、４−４−２９、５−４−０４、５−４−１３、６−４−０３、７−４−０９、８−４−１４、１３−４−４０）。
【０１３６】
また、条件の異なるパニング間において、複数回出現する配列を提示したクローンが確認された（図４〜図７において、記号「＊」と番号とを組み合わせた符号を付した配列）。これらの配列は、出現頻度は高くないもののセルロースＩＩＩＩ型に対する結合性を示すファージ、又は何らかの（例えば、増殖速度が速い）理由により非特異的に濃縮したファージ、のいずれかである可能性が考えられた。
【０１３７】
また、図４〜図７において、記号「＃」を付したペプチドは、既にセルロース以外のターゲットに対しアフィニティセレクションされたことが報告されているアミノ酸配列からなるペプチドである。このように様々なターゲットに対し濃縮されているアミノ酸配列は、非特異的な結合に基づき濃縮されたクローンである可能性が高いと考えられた。
【０１３８】
そこで、これらの点を考慮し、「出現頻度が２以上であるファージクローン又は条件の異なるパニングにおいて複数回出現したファージクローンのうち、そのアミノ酸配列が既に報告されていないペプチドを提示していること」を選択の基準としてクローンをピックアップした。
【０１３９】
その結果、アミノ酸配列が「ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ」であるペプチドを提示するクローン（２−５−１１、３−４−０１、４−４−２３、５−４−０４、８−４−２１）、アミノ酸配列が「ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−０５、１０−４−６)、アミノ酸配列が「ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−１３、４−４−３１）、アミノ酸配列が「ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ」であるペプチドを提示するクローン（４−４−２９）、及びアミノ酸配列が「ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−０５、１０−４−６)、アミノ酸配列が「ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ」であるペプチドを提示するクローン（７−４−０９)という５つのファージクローンが選択された。
【０１４０】
これらのクローンが出現したのはＲｕｎ２〜５、７、８、１０の７条件であり、特にアフィニティ時間が３０分のＲｕｎ３、４において比較的高い頻度で出現した。これはアフィニティ時間を長くすることにより、増殖速度が速いペプチドを排除し、より結合性の高いペプチドを提示するファージを選択的に濃縮できた結果と考えられた。
【実施例３】
【０１４１】
上述の実施例２で選択されたファージクローンが提示する５種類のセルロース結合性ペプチドと、セルロースＩＩＩＩ型と、を使用して本方法を実施した。
【０１４２】
［セルロース結合性ペプチド］９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）固相合成法より、Ｃ末端アミド化ペプチドである５種類のセルロース結合性ペプチドを調製した。すなわち、Ｃ１３ペプチド（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２９７．６６）、Ｃ３２ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１３１１．６９）、Ｃ３７ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２５６．６４）、Ｃ３９ペプチド（ＮＨ２−ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１３１３．６８）及びＣ８４ペプチド（ＮＨ２−ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２２２．６６）を調製した。
【０１４３】
ここで、これらのセルロース結合性ペプチドの調製について説明する。なお、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標） ＴＧＲ ｒｅｓｉｎ（０．２ｍｍｏｌ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ／ｇ ｏｆ ｒｅｓｉｎ)、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体、及び２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した。Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）はペプチド研究所から購入した。Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＮＭＰ）、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）はｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅより購入した。ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（ＴＩＳ）はＷａｋｏより購入した。
【０１４４】
５０ｍＬスクリュー管にＨＯＢｔを２．２ｇ、ＨＢＴＵを６．１ｇ採り取り、０．４５Ｍ ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとなるようにＤＭＦに溶解した。ＤＩＥＡストック溶液は０．９ＭとなるようにＮＭＰで希釈した。Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬はそれぞれ（ａ）８ｇフェノール／２ｍＬエタノール、（ｂ）１０μＬ ２０ｍＭシアン化カリウム／２ｍＬピリジン、（ｃ）０．５ニンヒドリン／１０ｍＬエタノール、の組成で調製した。
【０１４５】
合成用カラム(PD-10 empty column、GE Healthcare BioSciences)にＮｏｖａＳｙｎ（登録商標） ＴＧＲ ｒｅｓｉｎを１バッチにつき約３００ｍｇ秤量し、ＮＭＰを加えて転倒混和した後、ＮＭＰを除去した。この操作を再度行い、２ｍＬのＮＭＰを加えローテータを用いて１５分間攪拌した後、ＮＭＰを除去した。
【０１４６】
１０ｍＬサンプル管にＦｍｏｃアミノ酸誘導体を所定量秤量し、ＮＭＰと、０．４５Ｍ ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ及び０．９Ｍ ＤＩＥＡをそれぞれｒｅｓｉｎに対し３当量及び６当量となるように加えて溶解した。この際、液量が２ｍＬになるようＮＭＰの量を調整した。全量を合成用カラムに加え所定時間攪拌した後、反応液を除去した。２ｍＬのＮＭＰを加え転倒混和した後、ＮＭＰを除去する操作を５回繰り返し、樹脂を洗浄した。
【０１４７】
縮合の進行はＫａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔによりチェックし、アミノ酸の導入を確認した。合成用カラムに２ｍＬの２０％Ｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＮＭＰを加えて転倒混和した後、反応液を除去した。再度２ｍＬの２０％Ｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＮＭＰを加えて１５分間攪拌した後、反応液を除去した。２ｍＬのＮＭＰを加えて転倒混和した後、ＮＭＰを除去する操作を８回繰り返し、樹脂を十分に洗浄した。
【０１４８】
反応の進行をＫａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔによりチェックし、Ｆｍｏｃ基の脱保護を確認した。以上の操作を繰り返し、所定のアミノ酸を順次縮合した。最後のアミノ酸のＦｍｏｃ基を２０％ＰＰＤ／ＮＭＰにより除去し、２ｍＬのＮＭＰで８回洗浄後、さらに２ｍＬのジクロロメタンで５回、２ｍＬのメタノールで５回洗浄し、デシケーター内で４時間真空乾燥した。
【０１４９】
１００ｍＬナスフラスコに真空乾燥した樹脂を全量採り、７５μＬの超純水、７５μＬのＴＩＳを加えた。さらに２．８５ｍＬのＴＦＡを加えて室温で２時間攪拌した。この間、反応開始後５分間は窒素ガスをバブリングした。ファルコンチューブにフィルターを用いて反応液を回収した。
【０１５０】
濾別した樹脂は２ｍＬのＴＦＡで洗浄し、洗浄液は濾液と合わせた。濾液に、氷上で十分冷却したジエチルエーテルを白色沈殿が十分に生じるまで加えた。沈殿懸濁液を２０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清をデカンテーションにより除去し、白色ペレットを得た。
【０１５１】
ペレットを３０ｍＬの冷ジエチルエーテルでピペッティングにより懸濁した後、同様に遠心し上清を除去する操作を４回繰り返し、ペレットを洗浄した。ペレットを氷上で５分間程度静置してペレット表面を乾燥させた後、さらにデシケーター内で２時間真空乾燥し、粗製物（白色固体）を得た。
【０１５２】
粗製物をオクタデシル化シリカゲルカラム(COSMOSIL 5C18-AR-300、20mm×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィー(ELITE LaChrom：Organizer、UV- detector L-2400、Pump L-2130、Fraction Collector L-5200、HITACHI hightechnologies)により精製した。
【０１５３】
粗精製物を超純水に溶解して調製したサンプル５ｍＬを０．２２μｍフィルター(Millex GV、Millipore)で濾過した後にローディングし、流速６．０ｍＬ／ｍｉｎでフローした。溶離液はＡ液（１％アセトニトリル溶液／９９％超純水／０．０３３％ＴＦＡ溶液）及びＢ液（８０％アセトニトリル溶液／２０％超純水／０．０３３％ＴＦＡ溶液）の２種類を用い、Ｂ液が１％／ｍｉｎで増加するグラジエントを設定した。検出は２２０ｎｍのＵＶ吸収により行い、目的物をフラクションコレクターを利用して分取した。
【０１５４】
３０℃で１０分間エバポレートすることにより有機溶媒を除去後、完全に水分が除去されるまで（２４〜４８時間）、凍結乾燥機(FD-1000、EYELA)を用いて凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【０１５５】
生成物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ(autflex II TOF/TOF、Bruker Daltoniks)による分子量測定により同定した。マトリックス溶液はＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Sigma）に付属のα−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄをアセトニトリルに溶解して調製した。
【０１５６】
１μＬのマトリックス溶液を測定用プレート(MTP384 target plate polished steel T F Part No.: 209520、Bruker Daltonics)の上にマウントし、風乾後、１μＬの２０ｐｍｏｌ／μＬペプチド溶液及びキット付属の内部標準液(Bradykinin fragment Mw＝757.40、Angiotensin II (human) Mw＝1046.54、P14R Mw＝1533.86)を同様にマウントして結晶化するまで風乾した。測定条件はＰｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅとし、その他の条件は標準的な設定で行った。
【０１５７】
［１×ＡＢ］上述の実施例１と同様に、１×ＡＢ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）を調製した。
【０１５８】
［１×ＡＢＳ］３０ｍＬの１×ＡＢに３ＭのＮａＣlを８．３４ｍＬ加え、１×ＡＢで５０ｍＬにメスアップすることにより、１×ＡＢＳ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１５９】
［１０×ＭＢ］５３．３ｇのＭＥＳ(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid、nacalai tesuque）を４００ｍＬの超純水に溶解させ、４ＭのＮａＯＨでｐＨが６．０又は７．０となるように調製した後、超純水で５００ｍＬにメスアップすることにより、１０×ＭＢ（５００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０又は７．０）を調製し、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移して４℃で保存した。１×ＭＢは、１０×ＭＢを超純水で１０倍に希釈して調製し、４℃で保存した。
【０１６０】
［１×ＭＢＳ］５ｍＬの１０×ＭＢに３ＭのＮａＣｌを８．３４ｍＬ加え、超純水で５０ｍＬにメスアップすることにより１×ＭＢＳ（５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又は７．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１６１】
［１０×ＨＢ］５８．０ｇのＨＥＰＥＳ(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid、nacalai tesuque)を超純水７０ｍＬに溶解させ、４ＭのＮａＯＨでｐＨが８．０となるように調製した後、超純水で１００ｍＬにメスアップすることにより１０×ＨＢ（５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．０）を調製し、２５０ｍＬ広口メディウム瓶に移して４℃で保存した。１×ＭＥＰＥＳはこの溶液を超純水で１０倍に希釈して調製し、４℃で保存した。
【０１６２】
［１×ＨＢＳ］５ｍＬの１０×ＨＢに３ＭのＮａＣｌを８．３４ｍＬ加え、超純水で５０ｍＬにメスアップすることにより１×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１６３】
［ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた解析］セルロースＩＩＩＩ型とセルロース結合性ペプチドとを含有するセルロース／ペプチド溶液を調製するとともに、当該セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションした。図８に、これらの操作の概要を示す。
【０１６４】
まず、１．７ｍＬチューブに上述の実施例１で調製したセルロースＩＩＩＩ型懸濁液を１ｍＬ採取し、遠心機(MX-301、TOMY)を用いて、室温にて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次いで、セルロースＩＩＩＩ型懸濁液の上清を６６０μＬ除去した後、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を６６０μＬ加えてピペッティングすることにより、セルロースＩＩＩＩ型を酢酸緩衝液に再分散させた。この操作をもう一度行い、セルロースＩＩＩＩ型を所定濃度で含有する酢酸緩衝液からなるセルロース溶液を調製した。
【０１６５】
一方、５種類のセルロース結合性ペプチドの各々を５０ｍＭの酢酸緩衝液１００μＬに溶解し、さらに酢酸緩衝液で希釈して、当該セルロース結合性ペプチドを所定濃度で含有する酢酸緩衝液からなるペプチド溶液を調製した。
【０１６６】
次いで、セルロース／ペプチド溶液を調製した。すなわち、所定量のセルロース溶液と所定量のペプチド溶液とを２００μＬのＰＣＲチューブ内で混合し、０．５ｗｔ％のセルロースと１０μＭのセルロース結合性ペプチドとを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなるセルロース／ペプチド溶液を２００μＬ調製した。
【０１６７】
さらに、セルロース／ペプチド溶液のインキュベーションを行った。すなわち、セルロース／ペプチド溶液を所定回数ピペッティングし、３０℃で所定時間インキュベートした。
【０１６８】
そして、セルロース／ペプチド溶液から、部分ペプチドを含有する上清及び処理セルロースを含有する沈殿物をそれぞれ回収した。すなわち、インキュベート後、遠心機(MX-301、TOMY)を用いて、セルロース／ペプチド溶液を室温にて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。セルロース／ペプチド溶液の上清（以下、「上清サンプル」という。）を１００マイクロＬ採取し、新しい９６穴プレートのウェルに移した。一方、インキュベーション後のセルロース／ペプチド溶液を遠心して得られた、処理セルロースを含有する沈殿物を回収した。
【０１６９】
次に、採取された上清サンプルをＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて解析した。各上清サンプルにつき解析は３回行った（ｎ＝３）。
【０１７０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ(LC-20AD Prominence、SHIMAZU)に１０μＬの上清サンプルをローディングし、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎでフローした。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ(4.6mm×150mm、nacalai tesque)を用いた。溶離液はＡ液（１００％超純水／０．１％ＴＦＡ溶液）及びＢ液（１００％アセトニトリル溶液／０．１％ＴＦＡ溶液）の２種類を用いた。カラムオーブンは３５℃とし、検出はコロナ荷電化粒子検出器(コロナCAD、ESA Biosciences)を用いた。
【０１７１】
また、比較のために、１０μＭのセルロース結合性ペプチドを含有しセルロースを含有しない５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる対照溶液を調製した。そして、この対照溶液についても、同様にＨＰＬＣ解析を行った。
【０１７２】
また、ＨＰＬＣによる解析で使用後の上清サンプルの１００μＬを１．７ｍＬチューブに採取した。Ｚｉｐ−Ｔｉｐ(ZTC18S、Millipore)に７０％アセトニトリルを１０μＬ採取し３回吸引、排出を行い湿潤化および脱気を行った。０．１％ＴＦＡで３回吸引、排出を行いＺｉｐ−Ｔｉｐを平衡化した。１．７ｍＬチューブに採取しておいた上清サンプルを１０μＬ採取し、別の新しい１．７ｍＬチューブに移して、Ｚｉｐ−Ｔｉｐへのサンプル吸着を行った。この操作を１０回繰り返した。
【０１７３】
０．１％ＴＦＡを３回吸引、排出しＺｉｐ−Ｔｉｐを洗浄した。７０％アセトニトリルを樹脂充填量の２倍まで吸引し、新たな１．７ｍＬチューブで排出、吸引を３回繰り返した後に排出し、サンプルを溶出した。
【０１７４】
その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ(autflex II TOF/TOF、Bruker Daltoniks)を用いた解析を行い、上清サンプルに含有されていた物質の分子量測定を行った。測定条件は、上述の調製されたセルロース結合性ペプチドについて行った場合と同様であった。
【０１７５】
［結果］図９及び図１０には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図９においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１７６】
図１１には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２時間、６時間、１１時間、１８時間又は２４時間インキュベーションした後に採取された各上清サンプルと対照溶液とについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラムを示す。
【０１７７】
図１２及び図１３には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２時間、６時間、１１時間、１８時間又は２４時間インキュベーションした後に採取された各上清サンプルについて、当該各上清サンプルにおいて検出され帰属されたペプチドの含有量（ｎｍｏｌ）を示す。なお、ペプチドの含有量は、上述のＨＰＬＣ解析の結果及び検量線に基づいて算出した。すなわち、まず、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により分解物として同定された化学構造をもつペプチドを、標準サンプルとして別個に化学合成した。次いで、このペプチドの系列希釈溶液（０．６−２０μＭの範囲の６種類のペプチド濃度）を調製した。そして、これらの溶液のＨＰＬＣ解析を実施し、得られたクロマトグラムにおけるピーク面積値を算出した。算出されたピーク面積値と溶液中のペプチド濃度との相関関係を示すグラフを検量線として作成し、当該検量線として使用することで、分解物の生成量を算出した。
【０１７８】
図９に示すように、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを混合して３０℃で２４時間インキュベーションした後の上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、当該Ｃ１３ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。このピーク面積の減少は、上清に残存するＣ１３ペプチドの量が減少したことを示していると考えられた。
【０１７９】
さらに、図１１に示すように、このＣ１３ペプチドのピーク面積の減少は、セルロースとのインキュベーション時間に依存していた。すなわち、Ｃ１３ペプチドのピーク面積は、インキュベーション時間が長くなるにつれて減少した。
【０１８０】
一方、図９及び図１１に示すように、上清サンプル中には、対照溶液では検出されない、保持時間の異なるピークが複数観察された。実際、図１０に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ１３ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。
【０１８１】
すなわち、上清サンプル中には、Ｃ１３ペプチド（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が２〜６個欠如した５種類の部分ペプチドが検出され帰属された。
【０１８２】
具体的に、Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が２個欠如した部分ペプチドａ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチドｂ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチドｃ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチドｄ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫ−ＣＯＯＨ）及び当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が６個欠如した部分ペプチドｅ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦ−ＣＯＯＨ）が生成されているのが確認された。
【０１８３】
そして、図１２及び図１３に示すように、上清サンプル中において、Ｃ１３ペプチドの含有量はインキュベーション時間に伴い減少したのに対して、５種類の部分ペプチドａ〜ｅの含有量はインキュベーション時間に伴い増加する傾向が見られた。すなわち、セルロース／ペプチド溶液の上清中においては、セルロース結合性ペプチドの切断が進行し、部分ペプチドが徐々に濃縮された。
【０１８４】
特に、部分ペプチドｃの含有量は、他の部分ペプチドに比べて顕著に高く、インキュベーション時間の増加に伴い、略直線的に増加した。すなわち、Ｃ１３ペプチドをセルロースＩＩＩＩ型に作用させることにより、部分ペプチドｃを選択的に効率よく生成することができた。
【０１８５】
また、インキュベーション時間が１８時間の時点では、部分ペプチドの含有量は、当初添加されたＣ１３ペプチドの量（２ｎｍｏｌ）の２５％（０．５ｎｍｏｌ）以上に到達した。すなわち、１８時間のインキュベーションによって、ペプチド／セルロース溶液における当初の量の２５％以上のＣ１３ペプチドが切断されたと考えられた。
【０１８６】
また、インキュベーション時間の経過に伴って、上清サンプル中に含有されるペプチドの総量（Ｃ１３ペプチドの量と部分ペプチドの量との総和）が減少した。このことは、上清と分離されたセルロースＩＩＩＩ型にＣ１３ペプチド及び部分ペプチドの一方又は両方が結合し残存していることを示しているものと考えられた。
【０１８７】
このように、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型との相互作用に伴って、当該Ｃ１３ペプチドが当該セルロースＩＩＩＩ型に結合するのみならず、当該Ｃ１３ペプチドのペプチド結合の切断が進行した。
【０１８８】
図１４及び図１５には、Ｃ３２ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１４においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１８９】
図１４に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３２ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。
【０１９０】
そして、図１５に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３２ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３２ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３２ペプチドのＣ末端側又はＮ末端側のアミノ酸が３〜４個欠如した３種類の部分ペプチドが検出され帰属された。
【０１９１】
具体的に、Ｃ３２ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ３２ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３２ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０１９２】
図１６及び図１７には、Ｃ３７ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１６においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１９３】
図１６に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３７ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。すなわち、２４時間のインキュベーションによって、Ｃ３７ペプチドのピーク面積は消失した（ゼロ％）。
【０１９４】
一般に、ペプチドのセルロースに対する結合が、単純な吸着反応（平衡反応）に基づくだけであれば、当該ペプチドのピーク面積がゼロになることはない。したがって、Ｃ３７ペプチドはセルロースＩＩＩＩ型に吸着するだけでなく、さらに何らかの反応（例えば、分解）が進んでいると考えられた。なお、このような反応は、今回使用された５種類のセルロース結合性ペプチドの全てに共通して起こっているものと考えられた。
【０１９５】
そして、図１７に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３７ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３７ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３７ペプチドのＣ末端側又はＮ末端側のアミノ酸が３〜４個欠如した２種類のペプチドが検出され帰属された。
【０１９６】
具体的に、Ｃ３７ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ３７ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０１９７】
図１８及び図１９には、Ｃ３９ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１８においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１９８】
図１８に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３９ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。
【０１９９】
そして、図１９に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３９ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３９ペプチド（ＮＨ２−ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が１〜５個欠如した５種類のペプチドが検出され帰属された。
【０２００】
具体的に、Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が１個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が２個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０２０１】
図２０及び図２１には、Ｃ８４ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図２０においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０２０２】
図２０に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ８４ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。すなわち、２４時間のインキュベーションによって、Ｃ８４ペプチドのピーク面積は消失した（ゼロ％）。
【０２０３】
そして、図２１に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ８４ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ８４ペプチド（ＮＨ２−ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３〜５個欠如した３種類のペプチドが検出され帰属された。
【０２０４】
具体的に、Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０２０５】
図２２には、５種類のセルロース結合性ペプチドの各々について、そのアミノ酸配列と、上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析に基づき確認された部分ペプチドのアミノ酸配列と、をまとめて示す。なお、図２２に示された部分ペプチド以外に、未だ帰属できていない他の部分ペプチドが生成されている可能性があると考えられた。
【０２０６】
図２２に示すように、本方法によって、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列の一部からなる特定の部分ペプチドをトップダウンで製造することができた。
【０２０７】
また、上清中に含有されている部分ペプチドとセルロース結合性ペプチドとの総量は、セルロース／ペプチド溶液に当初含有されていた当該セルロース結合性ペプチドの量の半分未満であった。
【０２０８】
したがって、セルロース結合性ペプチドのアミノ酸配列のうち、上清中に遊離した部分ペプチドのアミノ酸配列以外の部分からなる他の部分ペプチドは、セルロースＩＩＩＩ型に結合して複合体を形成していると考えられた。
【符号の説明】
【０２０９】
Ｓ１ 準備工程、Ｓ２ インキュベーション工程、Ｓ３ 回収工程。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物に関し、特に、セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用を利用する方法及びその生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、例えば、微生物のアルコール発酵によるバイオエタノールの製造において使用される糖の原料として期待されている。このセルロースに関連して、特許文献１には、ファージディスプレイペプチドライブラリーを使用したバイオパニングにより、セルロース結合性ペプチドを取得することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−９４８２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、セルロース結合性ペプチドの使用については未だ十分な検討がなされていない。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程と、前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程と、処理された前記セルロース及び生成された前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程と、を含むことを特徴とする。本発明によれば、セルロース結合性ペプチドを使用する方法を提供することができる。
【０００７】
また、前記セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドであることとしてもよい。また、前記第一工程において所定量の前記セルロース結合性ペプチドを含有する前記溶液を調製し、前記第二工程において前記所定量の２０％以上の前記セルロース結合性ペプチドが切断されるまで前記溶液をインキュベーションすることとしてもよい。
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るセルロースは、前記いずれかの方法において、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理することにより製造されたことを特徴とする。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るペプチドは、前記いずれかの方法において、前記セルロース結合性ペプチドを切断することにより製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングの操作条件の一例を示す説明図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングの操作についての説明図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの一例を示す説明図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたバイオパニングにより選択されたペプチドの他の例を示す説明図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る方法において実施されたインキュベーション及び回収の操作についての説明図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの他の例を示す説明図である。
【図１２】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドから生成された部分ペプチドを定量した結果の一例を示す説明図である。
【図１３】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ１３ペプチドから生成された部分ペプチドを定量した結果の他の例を示す説明図である。
【図１４】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３２ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１５】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１６】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３７ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１７】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３７ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図１８】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３９ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図１９】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ３９ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図２０】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ８４ペプチドのＨＰＬＣ解析により得られたクロマトグラムの一例を示す説明図である。
【図２１】本発明の一実施形態に係る方法においてＣ８４ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により得られたマススペクトルの一例を示す説明図である。
【図２２】本発明の一実施形態に係る方法において５つのセルロース結合性ペプチドから生成された部分ペプチドの一例をまとめて示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。
【００１３】
図１は、本発明の一実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。図１に示すように、本方法は、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程（以下、「準備工程Ｓ１」という。）と、当該溶液をインキュベーションすることにより、当該セルロースを当該セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程（以下、「インキュベーション工程Ｓ２」という。）と、処理された当該セルロース及び生成された当該部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程（以下、「回収工程Ｓ３」という。）と、を含む。
【００１４】
準備工程Ｓ１においては、まず、セルロースと、セルロース結合性ペプチドと、を準備する。セルロースは、β−グルコースが１，４−β−グリコシド結合により直鎖状に重合して形成された高分子物質であり、一般に、結晶部分とアモルファス部分とを含む。
【００１５】
本方法で使用されるセルロースは特に限られず、任意のものを適宜選択して使用することができる。すなわち、セルロースとしては、任意の結晶構造を有するものを使用することができる。
【００１６】
具体的に、例えば、セルロースＩ型、セルロースＩＩ型、セルロースＩＩＩ型、セルロースＩＶ型からなる群より選択される１種又は２種以上を使用することができる。セルロースＩ型としては、セルロースＩα型やセルロースＩβ型を使用することができる。セルロースＩＩＩ型としては、セルロースＩＩＩＩ型やセルロースＩＩＩＩＩ型を使用することができる。
【００１７】
これらのうち、セルロース結合性ペプチドとの相互作用を効果的に実現できる点で、セルロースＩＩＩ型を好ましく使用することができ、特にセルロースＩＩＩＩ型を好ましく使用することができる。
【００１８】
また、セルロースとしては、任意の結晶化度を有するものを使用することができる。すなわち、例えば、結晶化度が５０％以上のセルロースを使用することができ、結晶化度が７０％以上のセルロースを好ましく使用することができ、結晶化度が８０％以上のセルロースをより好ましく使用することができ、結晶化度が９０％以上のセルロースを特に好ましく使用することができる。
【００１９】
具体的に、例えば、結晶化度が９０％以上のセルロースＩＩＩ型を好ましく使用することができ、特に結晶化度が９０％以上のセルロースＩＩＩＩ型を好ましく使用することができる。
【００２０】
本発明の発明者らが独自に検討した結果、セルロースの結晶化度が高くなるほど、当該セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用をより効果的に実現することができるという知見が得られている。また、セルロースの結晶化度が低くなるほど、当該セルロースはセルロース分解酵素により分解されやすくなる傾向がある。
【００２１】
セルロースの結晶化度は、例えば、Ｘ線回折により算出することができる。すなわち、セルロースの結晶化度は、例えば、所定のＸ線回折装置を用いて測定される広角Ｘ線回折プロファイル（もしくはデコンボリューション後のプロファイル）におけるピーク面積値の比率により算出することができる。
【００２２】
本発明で使用されるセルロース結合性ペプチドは、溶液中でセルロースに結合して、当該セルロース結合性ペプチドと当該セルロースとの複合体を形成するペプチドである。すなわち、セルロース結合性ペプチドは、例えば、アミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドからなるペプチド群から、セルロースに対する結合能に基づいて選択されたペプチドである。
【００２３】
ペプチド群としては、例えば、アミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドを含むペプチドライブラリーを使用することができる。すなわち、この場合、セルロース結合性ペプチドは、例えば、アミノ酸残基数が所定範囲内であってアミノ酸配列が互いに異なる複数種類のペプチドを含むペプチドライブラリーから選択することができる。ペプチドライブラリーは、アミノ酸残基数が所定範囲内の所定値である複数種類のペプチドを含むことができ、また、アミノ酸残基数が所定範囲内で互いに異なる複数種類のペプチドを含むこともできる。
【００２４】
より具体的に、ペプチドライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイを利用したペプチドライブラリー（ファージディスプレイペプチドライブラリー）を好ましく使用することができる。ファージディスプレイペプチドライブラリーは、表面に提示したペプチドのアミノ酸配列が互いに異なる複数種類のファージを含むペプチドライブラリーである。ファージディスプレイペプチドライブラリーを構成するファージの種類は特に限られず、例えば、Ｍ１３バクテリオファージやＴ７バクテリオファージを好ましく使用することができる。
【００２５】
また、ペプチドライブラリーとしては、例えば、細胞表層に提示したペプチドのアミノ酸配列が互いに異なる複数種類の酵母や大腸菌等の微生物を含むペプチドライブラリーを使用することもできる。また、リボソームディスプレイペプチドライブラリー等、無細胞システムに基づくペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーを使用することもできる。
【００２６】
なお、ペプチドライブラリーに含まれるペプチドは、直鎖状のペプチドに限られず、例えば、環状のペプチドとすることもできる。すなわち、例えば、核酸のランダム領域の両端にシステイン残基を配置し、当該システイン残基の側鎖間でジスルフィド結合を形成することにより当該ランダム領域を環状構造にしたペプチドライブラリーを使用することもできる。
【００２７】
ペプチドライブラリーからのセルロース結合性ペプチドの選択は、当該ペプチドライブラリーに含まれるペプチドのセルロースに対する結合能の高さに基づいて行うことができる。すなわち、例えば、ペプチドライブラリーに含まれる複数種類のペプチドとセルロースとを溶液中で混合し、当該複数種類のペプチドのうち、当該セルロースに結合し複合体を形成したペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択する。
【００２８】
具体的に、セルロース結合性ペプチドは、例えば、ペプチドライブラリーを使用したバイオパニングにより選択することができる。すなわち、例えば、ファージその他の微生物やリボソーム等の提示媒体によるペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーと、セルロースと、を混合し、当該セルロースに結合した当該提示媒体を選択的に回収し、回収された当該提示媒体が提示するペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択する。
【００２９】
また、バイオパニングによってセルロースと複合体を形成する複数のペプチドが得られた場合には、当該複数のペプチドのうち、単一のパニングにおける出現頻度が２以上であるペプチド、又は操作条件の異なる複数のパニングにおいて出現したペプチドを、セルロース結合性ペプチドとして選択することもできる。この場合、さらに、セルロース以外の材料に結合する（当該材料と複合体を形成する）ペプチド以外のペプチドをセルロース結合性ペプチドとして選択することもできる。このような基準によれば、セルロースに特異的に結合するセルロース結合性ペプチドを確実に選択することができる。
【００３０】
また、セルロース結合性ペプチドとしては、アミノ酸残基数が比較的小さいものを好ましく使用することができる。すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドとすることができる。さらに、セルロース結合性ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、６〜２０個の範囲とすることができ、好ましくは６〜１４個の範囲とすることができ、より好ましくは７〜１２個の範囲とすることができる。
【００３１】
このため、セルロース結合性ペプチドをペプチドライブラリーから選択する場合には、アミノ酸残基数が上述の範囲であるペプチドを含むペプチドライブラリーを使用することが好ましい。すなわち、この場合、例えば、アミノ酸残基数が上述の範囲内である複数種類のペプチドを提示した提示媒体（ファージその他の微生物やリボソーム等）によるペプチドディスプレイを利用したペプチドライブラリーを好ましく使用することができる。
【００３２】
具体的に、例えば、ランダムペプチドの鎖長が１２−ｍｅｒや７−ｍｅｒである市販のファージディスプレイペプチドライブラリーを使用することができる。もちろん、ペプチドライブラリーは市販のものに限られず、公知の方法に基づいて、アミノ酸残基数が上述の範囲である任意のペプチドライブラリーを作製し使用することができる。
【００３３】
準備工程Ｓ１においては、上述のようにして準備されたセルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液（以下、「セルロース／ペプチド溶液」という。）を調製する。すなわち、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを溶液中で混合する。
【００３４】
セルロース／ペプチド溶液は、当該溶液中でセルロースとセルロース結合性ペプチドとが相互作用でき、且つ後述するように、当該溶液中で当該セルロース結合性ペプチドを切断できるものであれば特に限られない。
【００３５】
すなわち、セルロース／ペプチド溶液は、例えば、セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する水溶液とすることができる。この場合、溶媒としては、例えば、水や緩衝溶液を使用することができる。緩衝溶液は、緩衝剤を含有する水溶液であれば特に限られず、任意の組成のものを適宜選択して使用することができる。具体的に、例えば、酢酸緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ６．０〜７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を使用することができる。これらの緩衝溶液は、所定の塩類（例えば、１５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ）を含有することもできる。また、セルロース／ペプチド溶液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲とすることができる。
【００３６】
セルロースとセルロース結合性ペプチドとの組み合わせは、相互作用する組み合わせであれば特に限られないが、当該相互作用を効果的に実現する上では、当該セルロースは、当該セルロース結合性ペプチドの選択に使用されたセルロースとすることが好ましい。換言すれば、セルロース／ペプチド溶液が含有すべき所定のセルロースを使用して、セルロース結合性ペプチドを選択することが好ましい。
【００３７】
すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩＩＩ型）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合には、当該セルロース結合性ペプチドと、当該所定の結晶構造を有するセルロースと、を含有するセルロース／ペプチド溶液を調製することが好ましい。
【００３８】
また、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶化度を有するセルロース（例えば、結晶化度が９０％以上のセルロース）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合には、当該セルロース結合性ペプチドと、当該所定の結晶化度を有するセルロースと、を含有するセルロース／ペプチド溶液を調製することが好ましい。
【００３９】
なお、例えば、セルロース結合性ペプチドが所定の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩＩＩ型）を使用してペプチドライブラリーから選択されたものである場合であっても、当該セルロース結合性ペプチドと他の結晶構造を有するセルロース（例えば、セルロースＩ型）との相互作用は可能である。セルロース／ペプチド溶液は、１種又は２種以上のセルロースを含有することができ、１種又は２種以上のセルロース結合性ペプチドを含有することもできる。
【００４０】
セルロース／ペプチド溶液に含有されるセルロース及びセルロース結合性ペプチドの濃度は、これらが相互作用する範囲であれば特に限られない。セルロース／ペプチド溶液におけるセルロースの濃度は、例えば、０．０５〜２重量％の範囲とすることができ、好ましくは０．１〜０．５重量％の範囲とすることができる。セルロース／ペプチド溶液におけるセルロース結合性ペプチドの濃度は、例えば、０．１μＭ以上とすることができ、好ましくは０．１μＭ〜１０ｍＭの範囲とすることができ、より好ましくは１〜１００μＭの範囲とすることができる。なお、セルロース／ペプチド溶液におけるセルロース結合性ペプチドの濃度は、溶媒に溶解し得る範囲で可能な限り高めることができる。
【００４１】
インキュベーション工程Ｓ２においては、準備工程Ｓ１で調製されたセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションすることにより、セルロースをセルロース結合性ペプチドで処理するとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する。
【００４２】
なお、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドの主鎖を切断することによって生成されるペプチドである。すなわち、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸間のペプチド結合を切断することにより生成される。セルロース結合性ペプチドの切断は、例えば、加水分解によって行うことができる。
【００４３】
したがって、部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列から一部のアミノ酸が欠如したアミノ酸配列からなるペプチドである。部分ペプチドは、例えば、インキュベーション後のセルロース／ペプチド溶液の上清中に含有される。
【００４４】
インキュベーションの条件は、セルロースをセルロース結合性ペプチドで処理し、且つセルロース結合性ペプチドを切断できる範囲であれば特に限られず、任意に設定することができる。
【００４５】
すなわち、例えば、準備工程Ｓ１において所定量のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液を調製した場合には、インキュベーション工程Ｓ２において、当該所定量の２０％以上の当該セルロース結合性ペプチドが切断されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする。
【００４６】
具体的に、例えば、所定モル数（例えば、２ｎｍｏｌ）のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする場合には、当該所定モル数の２０％のモル数（例えば、０．４ｎｍｏｌ）の当該セルロース結合性ペプチドが切断されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液を保持する。さらに、インキュベーション工程Ｓ２において切断するセルロース結合性ペプチドの量は、当初の量の２０％以上に限られず、例えば、４０％以上とすることができ、好ましくは６０％以上とすることもできる。
【００４７】
また、例えば、所定モル数（例えば、２ｎｍｏｌ）のセルロース結合性ペプチドを含有するセルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする場合には、当該所定モル数の２０％のモル数（例えば、０．４ｎｍｏｌ）の部分ペプチドが生成されるまで、当該セルロース／ペプチド溶液を保持することもできる。この場合も、インキュベーション工程Ｓ２において生成する部分ペプチドの量は、当初のセルロース結合性ペプチドの量の２０％以上に限られず、例えば、４０％以上とすることができ、好ましくは６０％以上とすることもできる。
【００４８】
また、セルロース／ペプチド溶液が、ｐＨが４〜１０の範囲である水溶液として調製された場合には、インキュベーションは、当該セルロース／ペプチド溶液を１０時間以上保持することにより行うこともできる。この場合、インキュベーション時間は、さらに１５時間以上とすることがで、好ましくは１８時間以上とすることができ、より好ましくは２４時間以上とすることもできる。
【００４９】
セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションする温度は、例えば、０〜５０℃の範囲とすることができ、好ましくは１０〜３０℃の範囲とすることができる。
【００５０】
インキュベーション工程Ｓ２におけるセルロース結合性ペプチドによるセルロースの処理は、例えば、当該セルロース結合性ペプチドを当該セルロースに作用させて、当該セルロースの特性を変化させることにより行うことができる。
【００５１】
すなわち、例えば、セルロース結合性ペプチドをセルロースに結合させるとともに、当該セルロース結合性ペプチドを切断することにより、当該セルロース結合性ペプチドに由来する部分ペプチドが結合したセルロースを生成することができる。
【００５２】
部分ペプチドをセルロースに結合させることにより、後述のとおり、例えば、当該セルロースの表面特性、分子の立体構造、分散性といった特性を向上させることができる。なお、このような処理により生成されるセルロースには、部分ペプチドに加えてセルロース結合性ペプチドが結合していてもよい。
【００５３】
また、インキュベーション工程Ｓ２においては、セルロース結合性ペプチドの切断によって、部分ペプチドを効率よく生成することができる。すなわち、セルロース結合性ペプチドをセルロースに作用させることによって、当該セルロース結合性ペプチドの一部を構成する特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを効率よく生成することができる。
【００５４】
具体的に、例えば、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列のＣ末端側の一部、Ｎ末端側の一部、又はこれらの両方を切断することにより、当該アミノ酸配列から当該末端部分が除去された、より短いアミノ酸配列からなる部分ペプチドを生成することができる。このような部分ペプチドは、例えば、アミノ酸残基数が所定値であるセルロース結合性ペプチドから生成される場合、アミノ酸残基数が当該所定値未満であって当該所定値の半分以上であるペプチドとすることができる。
【００５５】
なお、部分ペプチドが生成される機構は明らかではないが、例えば、セルロース結合性ペプチドがセルロースに結合することによって何らかの分解反応が起こり、当該セルロース結合性ペプチドが切断されるものと考えられる。この結果、例えば、インキュベーション工程Ｓ２においては、セルロース結合性ペプチドをセルロースに結合させ、次いで当該セルロース結合性ペプチドを切断することにより、当該セルロース結合性ペプチドの一部からなる部分ペプチドをセルロース／ペプチド溶液の上清中に遊離させるとともに、当該セルロース結合性ペプチドの他の一部からなる部分ペプチドが結合した当該セルロースを生成することができる。
【００５６】
また、インキュベーション工程Ｓ２においては、インキュベーションの条件を、第一の条件から、当該第一の条件とは異なる第二の条件に切り替えることもできる。すなわち、例えば、第一の条件として、セルロースとセルロース結合性ペプチドとの相互作用に好ましい条件を採用し、第二の条件として、当該セルロース結合性ペプチドの切断に好ましい条件を採用する。
【００５７】
具体的に、例えば、まず、セルロース／ペプチド溶液のｐＨを６〜８の範囲に調整して所定時間インキュベーションすることにより、セルロースに対するセルロース結合性ペプチドの効果的な結合を実現し、次いで、当該セルロース／ペプチド溶液のｐＨを４〜６の範囲又は８〜１０の範囲に調整して所定時間インキュベーションすることにより、当該セルロース結合性ペプチドの効果的な切断（部分ペプチドの生成）を実現することができる。
【００５８】
回収工程Ｓ３においては、上述のインキュベーション工程Ｓ２においてインキュベーションされたセルロース／ペプチド溶液から、処理されたセルロース及び生成された部分ペプチドの一方又は両方を回収する。
【００５９】
処理されたセルロースを回収する方法は特に限られず、例えば、セルロース／ペプチド溶液を遠心し、遠心後の沈殿物を回収することにより行うことができる。また、他の公知の分離方法や精製方法によってもセルロースを回収することができる。
【００６０】
部分ペプチドを回収する方法は特に限られず、例えば、セルロース／ペプチド溶液を遠心し、遠心後の上清を回収することにより行うことができる。また、他の公知の分離方法や精製方法によっても部分ペプチドを回収することができる。
【００６１】
このように、本方法によれば、セルロース結合性ペプチドで処理されたセルロース又は当該セルロース結合性ペプチドの切断により生成された部分ペプチドの一方又は両方を製造することができる。
【００６２】
すなわち、本方法によれば、セルロース結合性ペプチドを使用した処理によって、特性が向上したセルロースを製造することができる。具体的に、例えば、酵素による分解能が向上したセルロースを製造することができる。
【００６３】
ここで、セルロースは、例えば、上述のとおり、バイオエタノールの製造において微生物が資化するための糖の原料として使用される。この場合、セルロースを所定の酵素で分解する糖化処理により、当該セルロースを構成する単糖であるβ−グルコースを製造する必要がある。しかしながら、一般に、セルロースは、その分子構造や結晶性に基づき、酵素により分解されにくい。
【００６４】
この点、本方法においてセルロース結合性ペプチドにより処理されたセルロース（以下、「処理セルロース」という。）は、処理されていないセルロースに比べて、酵素により分解されやすくなっている。
【００６５】
すなわち、例えば、処理セルロースは、部分ペプチドが結合していることによって、その表面に当該部分ペプチドに基づく電荷が付与されている。このため、処理セルロースは、処理されていないセルロースに比べて、溶液中における分散性が向上している。したがって、処理セルロースは、酵素による作用を受けやすくなっている。
【００６６】
また、処理セルロースに結合している部分ペプチドは、セルロース結合性ペプチドより分子長さが短い。このため、部分ペプチドが結合した処理セルロースにおいては、セルロース結合性ペプチドが結合したセルロースに比べて、立体障害が低減されている。したがって、処理セルロースは、セルロース結合性ペプチドが結合したセルロースに比べて、酵素によるアクセスを受けやすく、分解されやすくなっている。また、処理セルロースにおいて酵素が作用する部分以外の部分を部分ペプチドにより被覆することにより、当該処理セルロースを当該酵素により分解しやすくすることができる。
【００６７】
このように、本方法により製造される処理セルロースは、バイオエタノールの原料として好ましく使用することができる。
【００６８】
そこで、本方法は、例えば、上述のようにして製造された処理セルロースを酵素により分解する工程をさらに含むこともできる。分解酵素は、セルロースを分解できるものであれば特に限られず、任意の１種又は２種以上の分解酵素を使用することができる。
【００６９】
すなわち、例えば、１，４−β−グリコシド結合を加水分解により切断するセルラーゼを好ましく使用することができる。具体的に、例えば、エキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）及びエンドグルカナーゼの一方又は両方を使用することができる。
【００７０】
酵素分解の条件は、酵素が作用する条件であれば特に限られず、例えば、ｐＨが４〜６の範囲の弱酸性条件を使用することができる。すなわち、この酵素分解工程においては、例えば、処理セルロース及び分解酵素を含有する酢酸緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ、ｐＨ５．０）を調製し、当該溶液を所定温度で所定時間保持することにより、当該処理セルロースを分解することができる。
【００７１】
なお、上述のように、インキュベーション工程Ｓ２において、セルロース／ペプチド溶液のｐＨを６〜８の範囲に調整してセルロースにセルロース結合性ペプチドを結合させ、次いで、当該セルロース／ペプチド溶液のｐＨを８〜１０の範囲に調整してセルロース結合性ペプチドを切断した場合には、続く処理セルロースの酵素分解工程において、当該処理セルロース及び酵素を含有する溶液のｐＨを４〜６の範囲に調整することにより、当該処理セルロースの酵素分解を効率よく行うことができる。
【００７２】
また、本方法によれば、特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを製造することができる。すなわち、本方法においては、上述のとおり、予めアミノ酸配列が特定されたセルロース結合性ペプチドをセルロースに作用させることにより、当該アミノ酸配列のうち特定の一部からなる部分ペプチドを効率よく製造することができる。
【００７３】
このような部分ペプチドの製造方法は、アミノ酸を順次結合させていくボトムアップのペプチド合成とは異なり、トップダウンによるペプチド製造方法であるといえる。このため、ボトムアップ合成のような煩雑な操作を経ることなく、簡便に、特定のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを製造することができる。また、生成された部分ペプチドは、セルロース／ペプチド溶液の上清中に遊離するため、当該部分ペプチドの回収及びその後の精製を容易且つ確実に行うことができる。
【００７４】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【００７５】
Ｗａｄａらの方法（Wada, M.; Nishiyama, Y.; Langan, L. Macromolecules 2006, 39, 2947-2952）に従い、セルロースＩＩＩＩ型を調製した。シオグサ(Ｃｌａｄｏｐｈｏｒａ)を１ＭのＮａＯＨ水溶液に室温で一晩以上漬け置きした後、水道水で十分に洗浄した。次いで、得られた試料を、０．１Ｍの酢酸バッファーでｐＨ４．５に調整した０．３％ＮａＣｌＯ２溶液に８０℃で２時間漬け置きした後、水道水で十分に洗浄した。以上の操作を、試料の色が白くなるまで２又は３回繰返した。
【００７６】
さらに、ホモジナイザー（Physcotron、Microtech）を用い、試料が十分に細かい断片になるまで粉砕した後、１００００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を液体窒素で凍結し、一晩かけて湿り気がなくなるまで凍結乾燥した後、さらに１０５℃で３時間以上加熱して絶乾させた。
【００７７】
こうして得られた約１ｇの試料を耐圧容器に入れて−１３℃に冷却し、当該耐圧容器内にアンモニアガスを３０分かけて充填した。この耐圧容器をオイルバスで１４０℃に加熱して超臨界流体を生成し（臨界点：１３２．４℃、１１．２８ＭＰａ）、当該耐圧容器内の圧力を１５〜１８ＭＰａに維持して１時間反応させた。アンモニアを除去した後、得られた固体を濾過装置にセットし、アンモニア臭が消えるまで３００〜５００ｍＬのメタノールで洗浄し、さらに約２００ｍＬのアセトンで洗浄した。この固体をビーカーに移し、一晩かけてアセトンが蒸発するまで放置した。
【００７８】
得られた固体を適当量（ホモジナイズ後の回収量が１００ｇの場合、３００ｍＬ)の４ＭのＨＣｌに懸濁し８０℃で８時間攪拌（５００ｒｐｍ）して加水分解した後、同量の蒸留水を加えて反応を停止した。反応後の溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心し上清を除去した。沈殿物に蒸留水を加えて再分散し、再度１００００ｒｐｍで５分間遠心し上清を除去した。この操作を上清が完全に中和されるまで３〜５回繰返した。
【００７９】
沈殿物に蒸留水を加えて２０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清が白濁し固体が浮遊していることを確認し、上清を回収した。硫酸洗浄したガラスフィルターを用いて吸引濾過をし、濾液を回収した。こうして、セルロースＩＩＩＩ型の懸濁液を得た。セルロース懸濁液は４℃で保存した。なお、セルロースＩＩＩＩ型は、特開２００８−１６１１２５号公報に記載の方法で調製することもできる。
【００８０】
セルロース懸濁液中のセルロース濃度は、１ｍＬの当該セルロース懸濁液を５ｍＬのサンプル管に採取し、１０５℃で２４時間乾燥させたのち重量を測定することにより決定した。
【００８１】
得られたセルロースＩＩＩＩ型の結晶化度は９９．９％以上であった。この結晶化度は、Ｘ線回折装置（X-ray diffractometer RU-200BH、株式会社リガク）を用いた広角Ｘ線回折により得られたプロファイルにおけるピーク面積値の比率により算出した。
【実施例２】
【００８２】
上述の実施例１において調製されたセルロースＩＩＩＩ型と、ファージディスプレイペプチドライブラリーと、を使用してバイオパニングを実施することにより、セルロース結合性ペプチドを選択した。
【００８３】
なお、試薬は、特に表記しない限り全て特級以上のものを使用した。いずれの試薬もさらなる精製を行わずに使用した。超純水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Milli−Q Academic A-10、Millipore）で比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ以上に精製した水を使用した。
【００８４】
［ファージディスプレイペプチドライブラリー］ファージディスプレイペプチドライブラリーは、Ｐｈ．Ｄ．−１２ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（NEW ENGLAND BioLabs）を用いた。このファージライブラリーにおいては、Ｍ１３ファージの非主要外殻タンパク質であるｗｉｌｄ−ｔｙｐｅのｐＩＩＩのＮ末端に、４−ｍｅｒ（ＧＧＧＳ）のスペーサーを介して直鎖の１２残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドが提示されている。理論的な計算上は２０１２（＝４．０９６×１０１５）種類のペプチドが含まれるが、実際にはエレクトロポレーションの効率が低いため、このペプチドライブラリーにおいては、２．７〜２．８×１０９種類のアミノ酸配列が提示されている。操作は、ファージライブラリーＫｉｔ付属のマニュアルを参考に一部操作を改変して行った。
【００８５】
［滅菌精製水］超純水１００ｍＬを１００ｍＬ広口メディウム瓶に採り、オートクレーブ（S-245、TOMY）を用いて１２１℃で２０分の滅菌処理を施した後に室温で保存した。
【００８６】
［Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶内で、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Becton, Dickinson and Company：BD)２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（BD）１ｇ、ＮａＣｌ（nacalai tesqe）１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（BD）１．４ｇ、塩化マグネシウム六水和物（nacalai tesque）０．１ｇを超純水(Millipore)２００ｍＬで溶かし、さらに４ＭのＮａＯＨ水溶液(nacalai tesque)５０μＬを加え、オートクレーブした後、室温で保存した。
【００８７】
［Ｇｌｙ−ＨＣｌ］Ｇｌｙｃｉｎｅ(nacalai tesque)７．５０ｇを超純水３００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌを用いて当該水溶液のｐＨを２．２に調整した後、超純水で５００ｍＬにメスアップ後、０．２２μｍフィルター(Millex、Millipore)で濾過滅菌した。このＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（４０ｍＬ）にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）（018-15154, Lot. CER0068, Wako)４０ｍｇ、フェノールレッド(nacalai tesque)４ｍｇを加えて溶解させ、再度０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し４℃で保存した。得られたＧｌｙ−ＨＣｌ溶液は、２００ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、１ｍｇ/ｍＬのＢＳＡを含有し、そのｐＨは２．２であった。
【００８８】
［Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液］エタノール(Spectrum grade、nacalai tesque)２０ｍＬにテトラサイクリン塩酸塩(Wako)１００ｍｇを溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し、−２０℃で遮光保存した。
【００８９】
［ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液］Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（IPTG、Wako)２５０ｍｇ、５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（X-Gal、Wako)２００ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）(Spectrum
grade、nacalai tesque)５．０ｍＬに溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し、−２０℃で遮光保存した。
【００９０】
［ＬＢ培地］５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−Ｍｅｄｉｕｍ（capsules、Q・BIOgene)１２個及び超純水４８０ｍＬ、４ＭのＮａＯＨ水溶液１２０μＬを加えてオートクレーブした後、室温で保存した。
【００９１】
［ＬＢ−Ｔｅｔ ｐｌａｔｅ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを０．５ｇ、ＮａＣｌを１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒを１．５ｇ、超純水１００ｍＬで溶かし、４ＮのＮａＯＨ水溶液２５μＬを加えてオートクレーブ後、温度が５０℃以下になってからＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液４００μＬを加えた。この溶液を滅菌済みシャーレに分注し、室温で固化させた後、４℃で遮光保存し、1ヶ月以内に使用した。
【００９２】
［ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ｐｌａｔｅ］２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを１ｇ、ＮａＣｌを２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒを３ｇ、超純水２００ｍＬで溶かし、４ＭのＮａＯＨ水溶液５０μＬを加えてオートクレーブ後、５０℃以下まで冷却し、ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液２００μＬを加えた。この溶液を滅菌済みシャーレに分注し、室温で固化させた後、４℃で遮光保存し、4日以内に使用した。
【００９３】
［１０×ＴＢＳ］Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ(nacalai tesuque)を３０．４ｇ、ＮａＣｌを４３．８ｇ、超純水４００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌ(nacalai tesque)でｐＨを７．５に調整した後、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後、４℃で保存した。こうして５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１．５ＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨが７．５の１０×ＴＢＳを調製した。１×ＴＢＳは１０×ＴＢＳを超純水で１０倍に希釈して調製し、オートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９４】
［１×ＴＢＳ（０．１ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＴＢＳＴ）］４０ｍＬの１×ＴＢＳにＴｗｅｅｎ２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）(nacalai tesque)４０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９５】
［１×ＴＢＳ（０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ＴＢＳＴ）］４０ｍＬの１×ＴＢＳにＴｗｅｅｎ２０(nacalai tesque)２０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９６】
［１×ＴＢＳ（２０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ、２０％ＴＢＳＥ］４０ｍＬの１×ＴＢＳにｅｔｈａｎｏｌ(nacalai tesque)１０ｍＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【００９７】
［酢酸水溶液（５００ｍＭ）］酢酸(nacalai tesuque)１５ｇを超純水４００ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９８】
［酢酸ナトリウム水溶液（５００ｍＭ）］酢酸ナトリウム三水和物(nacalai tesuque)３４ｇを超純水４００ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【００９９】
［１×ＡＢ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）］酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍＬを超純水４００ｍＬに溶解させ、酢酸水溶液でｐＨ５．０に調整した後に超純水で５００ｍＬにメスアップし、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移してオートクレーブ後に４℃で保存した。
【０１００】
［１×ＡＢＥ（２０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ）］４０ｍＬの１×ＡＢに１０ｍＬのｅｔｈａｎｏｌ(nacalai tesque)を１０ｍＬ加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【０１０１】
［１×ＡＢＴ（０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０）］４０ｍＬの１×ＡＢにＴｗｅｅｎ２０ (nacalai tesque)２０μＬを加えた後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後、室温で保存した。
【０１０２】
［５％ＮａＮ３ストック溶液］アジ化ナトリウム(nacalai tesque)５０ｍｇを１５ｍＬチューブに採り、滅菌精製水９５０μＬに溶解させ４℃で保存した。
【０１０３】
［０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳ］５％ＮａＮ３ストック溶液１００μＬを２５ｍＬの１×ＴＢＳに溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、室温で保存した。
【０１０４】
［ＰＥＧ／ＮａＣｌ］Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（PEG#6000、nacalai tesque)を１００．０ｇ、ＮａＣｌを７３．０ｇ、超純水３３０ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップした。５００ｍＬ広口メディウム瓶に移し、オートクレーブした後渦を巻くように撹拌して均一に溶解させ、室温で保存した。
【０１０５】
［ＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎ］ゼラチン(Wako)１００ｍｇを１０ｍＬの１０×ＴＢＳ及び９０ｍＬの超純水に溶解させ、オートクレーブ後、渦を巻くように攪拌して均一に溶解させて室温で保存した。
【０１０６】
［１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）］Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを３０．４ｇ、超純水２００ｍＬに溶解させ、６ＭのＨＣｌでｐＨ９．１に調整し、超純水で２５０ｍＬにメスアップし、オートクレーブ後４℃で保存した。
【０１０７】
［Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレート］１．７ｍＬチューブにＬＢ培地２００μＬを採り、滅菌済み爪楊枝を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８−８０℃グリセロールストックから殖菌した。これをＬＢ培地で１００倍に希釈し、その１００μＬをＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅにプレーティングした。３７℃で一晩培養した後、得られたマスタープレートを４℃で保存した。マスタープレートは調製後１ヶ月以内に使用した。
【０１０８】
［Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液］ＬＢ培地５ｍＬを試験管に採り、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液２０μＬを加えた。この溶液に滅菌済み爪楊枝を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレートのシングルコロニーを殖菌した。振盪培養器(BR-23FP、TAITEC)を用いて２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６６０＝０．５になるまで振盪培養し、得られたＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液を４℃で保存した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液は４日以内に使用した。
【０１０９】
［Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液］ＬＢ培地１０ｍＬを５０ｍＬチューブに採り、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅストック溶液４０μＬを加えた。この溶液に滅菌済み爪楊枝を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８マスタープレートのシングルコロニーを殖菌した。振盪培養器を用いて２００ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪培養し、得られたＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液を４℃で保存した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液は１週間以内に使用した。
【０１１０】
［バイオパニング］ファージディスプレイペプチドライブラリーとセルロースＩＩＩＩ型とを使用して、バイオパニングを実施した。セルロースＩＩＩＩ懸濁液（セルロース濃度：８．９７ｍｇ／ｍＬ）をセルロース濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＴＢＳ又はＡＢで希釈した。希釈後のセルロースＩＩＩＩ懸濁液を室温で１３０００ｒｐｍにて１分間遠心し、セルロースを沈殿させ、上清を除去した。沈殿物にＴＢＳ又はＡＢを１ｍＬ加えてセルロースを分散させ、室温で１３０００ｒｐｍにて１分間遠心し、セルロースを沈殿させて上清を除去した。この操作を３回繰り返し、セルロースをバッファーで洗浄、置換した。
【０１１１】
以下の操作は適宜条件変更し、Ｒｕｎ１からＲｕｎ１５まで、１５回のパニングを行った。ここでは、Ｒｕｎ１ついて説明し、他のＲｕｎに関しては操作条件のみを図２に示す。また、バイオパニングの操作の概略を図３に示す。なお、Ｒｕｎ１〜１３は、操作を室温で行い、Ｒｕｎ１４及び１５は全ての操作を４℃で行った。
【０１１２】
［（１）Ａｆｆｉｎｉｔｙ］ファージディスプレイペプチドライブラリーとセルロースＩＩＩＩ型とを混合した。すなわち、ファージライブラリー溶液を１．５×１０１１ｐｆｕ／ｍＬになるようＡＢで希釈して、これを上述のセルロースＩＩＩＩ懸濁液に加えピペッティングし、得られた混合溶液を３０分間静置した。静置後の混合溶液を室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。
【０１１３】
［（２）Ｗａｓｈ］得られた沈殿物を洗浄した。すなわち、沈殿物にＡＢＴを５００μＬ加えピペッティングにより分散させた後、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。この操作を４回繰り返した。
【０１１４】
沈殿物にＡＢを５００μＬ加えて分散させ、この溶液を新たな１．７ｍＬチューブに移し変え、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。再度、沈殿物にＡＢを５００μＬ加えセルロースを分散させ、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除去する操作を４回繰り返した。
【０１１５】
沈殿物にＡＢＥを５００μＬ加えて分散させ、この溶液を新たな１．７ｍＬチューブに移し変え、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を除去した。再度、沈殿物にＡＢＥを５００μＬ加えセルロースを分散させ、室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除去する操作を４回繰り返した。
【０１１６】
［（３）Ｅｌｕｔｉｏｎ］洗浄された沈殿物に含有されるファージを溶出した。すなわち、沈殿物にＧｌｙ−ＨＣｌを１ｍＬ加えてピペッティングし、得られた溶液を５分間静置した。静置後の溶液を室温にて１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を新たな１．７ｍＬチューブに採り、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）を２００μＬ加えて中和した。
【０１１７】
次に、ファージ溶液の濃縮を行った。すなわち、中和した溶液を限界濾過ユニット(Amicon Ultra-4、Millipore)に移し、２５℃にて３５００ｒｐｍで２分間遠心し、ファージ溶液を濃縮した。濃縮されたファージ溶液にＴＢＳを１ｍＬ加えて遠心する操作を４回繰り返すことで（合計５回）、バッファー交換と同時にファージ溶液の濃縮を行った。なお、図２に示すように、この濃縮操作はＲｕｎ１〜８において行い、Ｒｕｎ９〜１５では省略した。得られたファージ溶液を０．６ｍＬチューブに移し、ＴＢＳで全量が２００μＬになるようにメスアップし、４℃で保存し、後述するファージプールの増幅及びタイタリングに用いた。
【０１１８】
次に、タイタリングを行った。すなわち、上述のようにして得られたファージ溶液をＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎを用いて複数の各濃度に系列希釈し、分注したＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８本培養液２００μＬに１０μＬずつ加えた。Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐを電子レンジで溶解させ、３ｍＬずつ分注し、ファージ溶液を全量加えた。これをあらかじめ３７℃に温めておいたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ｐｌａｔｅに均一に重層させ、固化した後に３７℃で１２時間培養した。プレート上の青いプラークの個数よりファージ溶液の力価を算出した。
【０１１９】
［（４）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］溶出されたファージを増幅させた。すなわち、５０ｍＬチューブにＬＢ培地２０ｍＬを採り、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬと、上述の溶出操作で得たファージ溶液１００μＬと、を加えた。得られた溶液を３００ｍＬのバッフル付きフラスコに移して２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２０】
［（５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ］増幅したファージを精製した。すなわち、培養後の溶液を新たな５０ｍＬチューブに移し、４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で１０分間遠心して菌体を分離した。５０ｍＬチューブに３．３ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを採り、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で一晩静置した。静置後、この溶液を４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で２０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２１】
得られたファージペレットを１ｍＬのＴＢＳに再度溶解させ、１．７ｍＬチューブに移し、遠心機（AR015-24、TOMY）を用いて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。１．７ｍＬチューブに１５０μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを採り、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１時間静置した。静置後、この溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２２】
得られたファージペレットを２００μＬの０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳで溶解させ、この溶液を再度４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。上清を新たな０．６ｍＬチューブに移し、４℃で保存した。
【０１２３】
［（６）Ｃｌｏｎｉｎｇ＆ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ］精製されたファージをクローニングするとともに、そのＤＮＡ配列を解析した。すなわち、タイタリングに用いたプレートから滅菌済み爪楊枝を用いて、無作為に青いプラークをピックアップし、ＬＢ培地１ｍＬ及びＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液１０μＬを入れた１．７ｍＬチューブに殖菌して、２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２４】
増幅したファージを含む溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心分離した。５０ｍＬチューブにＬＢ培地２０ｍＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬとファージ溶液１０μＬを加えて２００ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。
【０１２５】
培養後、溶液を新たな５０ｍＬチューブに移し、４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で１０分間遠心して菌体を分離した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを３．３ｍＬ採った５０ｍＬチューブに、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１２時間静置した。静置後、溶液を４℃にて３５００ｒｐｍ（２３８０Ｇ）で２０分間遠心し、上清を除去した。
【０１２６】
遠心分離により得られたファージペレットを１ｍＬのＴＢＳに再度溶解させ、１．７ｍＬチューブに移し、４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを１５０μＬ採った１．７ｍＬチューブに、この上清を加え穏やかに約１００回転倒混和し、４℃で１時間静置した。静置後、溶液を４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１０分間遠心して上清を除去した。
【０１２７】
得られたファージペレットを２００μＬの０．０２％ＮａＮ３／ＴＢＳで溶解させ、再度４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）遠心した。新たな０．６ｍＬチューブに上清を移し、４℃で保存した。
【０１２８】
ファージのｓｓＤＮＡ抽出及び精製はＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍ１３ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用い、Ｋｉｔ付属のプロトコールを一部改変して行った。１．７ｍＬチューブにクローニングにより得られたファージ溶液を１００μＬ採り、Ｍ１３ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＭＰ）を１．０μＬ加えてｖｏｒｔｅｘにて混合した。
【０１２９】
２分以上静置した後にｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットしたＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍの膜部分にＢｕｆｆｅｒ ＭＰで沈殿させた溶液をマウントし、遠心機（AR015-24、TOMY）を用いて、４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。さらにＬｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＭＬＢ）を０．７ｍＬ加えて４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。再びＢｕｆｆｅｒ ＭＬＢを０．７ｍＬ加え遠心し、その後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＰＥ）を加えて４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心した。
【０１３０】
さらに遠心を行い余分な水分を除去した後で、新たな１．７ｍＬチューブにカラムをセットし、滅菌精製水を５０μＬを加えて１０分間静置した後に、４℃にて８０００ｒｐｍ（５９００Ｇ）で遠心し、ｓｓＤＮＡを溶出させ、４℃で保存した。
【０１３１】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＰＣＲはＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を用い、Ｋｉｔ付属のプロトコールを一部改変して行った。０．２ｍＬのＰＣＲ用チューブにＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｍｉｘ(Applied Biosystems)１．２μＬ、ＢｉｇＤｙｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(Applied Biosystems)０．６μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ−９６ｇ３ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒ溶液（5’-CCTCATAGTTAGCGTAACG-3’、SIGMA)０．９６μＬ、ＢｉｇＤｙｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(Applied
Biosystems)０．６μＬ、滅菌精製水２．６４μＬを混合し、鋳型ＤＮＡ溶液０．６μＬを加えてスピンダウンした。
【０１３２】
Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ(PC-320、ASTEC)を用いて９６℃、１分（９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分）]×２５ｃｙｃｌｅｓの条件でＰＣＲ反応をさせた。ＰＣＲ反応終了後に再びスピンダウンし、新たな平底チューブに反応溶液を移して、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２μＬ、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２μLを順に加えた。さらに９５％エタノール５０μＬを加え軽くｖｏｒｔｅｘで混合した後、室温で１５分間インキュベーションした。遠心機（AR002-64、TOMY)を用いて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１５分間遠心した。
【０１３３】
その後、上清を除去し、７０％エタノール１４０μＬを加えて４℃にて１３０００ｒｐｍ（１５３００Ｇ）で１５分間遠心した。再度上清を除去し、２０分間遠心エバポレーター(Micro Vac MV-100、TOMY)で乾燥させる操作を液滴の除去が確認できるまで行い、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡの塩基配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems)で解析した。
【０１３４】
［結果］図４〜図７には、Ｒｕｎ１〜Ｒｕｎ１５で選択されたペプチドのアミノ酸配列を示す。なお、ペプチドを構成するアミノ酸は、次のように１文字表記で示す。Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｃ：システィン（Ｃｙｓ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）。
【０１３５】
図４〜図７に示すように、各Ｒｕｎにおいて１０〜２８個のファージをクローニングした。ペプチド提示ファージの最大出現頻度は３であった（７−４−０４）。また、出現頻度が２のクローンが１０クローン得られた(１−５−０７、２−５−１１、３−４−０１、４−４−２９、５−４−０４、５−４−１３、６−４−０３、７−４−０９、８−４−１４、１３−４−４０）。
【０１３６】
また、条件の異なるパニング間において、複数回出現する配列を提示したクローンが確認された（図４〜図７において、記号「＊」と番号とを組み合わせた符号を付した配列）。これらの配列は、出現頻度は高くないもののセルロースＩＩＩＩ型に対する結合性を示すファージ、又は何らかの（例えば、増殖速度が速い）理由により非特異的に濃縮したファージ、のいずれかである可能性が考えられた。
【０１３７】
また、図４〜図７において、記号「＃」を付したペプチドは、既にセルロース以外のターゲットに対しアフィニティセレクションされたことが報告されているアミノ酸配列からなるペプチドである。このように様々なターゲットに対し濃縮されているアミノ酸配列は、非特異的な結合に基づき濃縮されたクローンである可能性が高いと考えられた。
【０１３８】
そこで、これらの点を考慮し、「出現頻度が２以上であるファージクローン又は条件の異なるパニングにおいて複数回出現したファージクローンのうち、そのアミノ酸配列が既に報告されていないペプチドを提示していること」を選択の基準としてクローンをピックアップした。
【０１３９】
その結果、アミノ酸配列が「ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ」であるペプチドを提示するクローン（２−５−１１、３−４−０１、４−４−２３、５−４−０４、８−４−２１）、アミノ酸配列が「ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−０５、１０−４−６)、アミノ酸配列が「ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−１３、４−４−３１）、アミノ酸配列が「ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ」であるペプチドを提示するクローン（４−４−２９）、及びアミノ酸配列が「ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ」であるペプチドを提示するクローン（３−４−０５、１０−４−６)、アミノ酸配列が「ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ」であるペプチドを提示するクローン（７−４−０９)という５つのファージクローンが選択された。
【０１４０】
これらのクローンが出現したのはＲｕｎ２〜５、７、８、１０の７条件であり、特にアフィニティ時間が３０分のＲｕｎ３、４において比較的高い頻度で出現した。これはアフィニティ時間を長くすることにより、増殖速度が速いペプチドを排除し、より結合性の高いペプチドを提示するファージを選択的に濃縮できた結果と考えられた。
【実施例３】
【０１４１】
上述の実施例２で選択されたファージクローンが提示する５種類のセルロース結合性ペプチドと、セルロースＩＩＩＩ型と、を使用して本方法を実施した。
【０１４２】
［セルロース結合性ペプチド］９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）固相合成法より、Ｃ末端アミド化ペプチドである５種類のセルロース結合性ペプチドを調製した。すなわち、Ｃ１３ペプチド（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２９７．６６）、Ｃ３２ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１３１１．６９）、Ｃ３７ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２５６．６４）、Ｃ３９ペプチド（ＮＨ２−ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１３１３．６８）及びＣ８４ペプチド（ＮＨ２−ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２、Ｍｗ＝１２２２．６６）を調製した。
【０１４３】
ここで、これらのセルロース結合性ペプチドの調製について説明する。なお、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標） ＴＧＲ ｒｅｓｉｎ（０．２ｍｍｏｌ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ／ｇ ｏｆ ｒｅｓｉｎ)、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体、及び２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した。Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）はペプチド研究所から購入した。Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＮＭＰ）、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）はｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅより購入した。ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（ＴＩＳ）はＷａｋｏより購入した。
【０１４４】
５０ｍＬスクリュー管にＨＯＢｔを２．２ｇ、ＨＢＴＵを６．１ｇ採り取り、０．４５Ｍ ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとなるようにＤＭＦに溶解した。ＤＩＥＡストック溶液は０．９ＭとなるようにＮＭＰで希釈した。Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬はそれぞれ（ａ）８ｇフェノール／２ｍＬエタノール、（ｂ）１０μＬ ２０ｍＭシアン化カリウム／２ｍＬピリジン、（ｃ）０．５ニンヒドリン／１０ｍＬエタノール、の組成で調製した。
【０１４５】
合成用カラム(PD-10 empty column、GE Healthcare BioSciences)にＮｏｖａＳｙｎ（登録商標） ＴＧＲ ｒｅｓｉｎを１バッチにつき約３００ｍｇ秤量し、ＮＭＰを加えて転倒混和した後、ＮＭＰを除去した。この操作を再度行い、２ｍＬのＮＭＰを加えローテータを用いて１５分間攪拌した後、ＮＭＰを除去した。
【０１４６】
１０ｍＬサンプル管にＦｍｏｃアミノ酸誘導体を所定量秤量し、ＮＭＰと、０．４５Ｍ ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ及び０．９Ｍ ＤＩＥＡをそれぞれｒｅｓｉｎに対し３当量及び６当量となるように加えて溶解した。この際、液量が２ｍＬになるようＮＭＰの量を調整した。全量を合成用カラムに加え所定時間攪拌した後、反応液を除去した。２ｍＬのＮＭＰを加え転倒混和した後、ＮＭＰを除去する操作を５回繰り返し、樹脂を洗浄した。
【０１４７】
縮合の進行はＫａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔによりチェックし、アミノ酸の導入を確認した。合成用カラムに２ｍＬの２０％Ｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＮＭＰを加えて転倒混和した後、反応液を除去した。再度２ｍＬの２０％Ｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＮＭＰを加えて１５分間攪拌した後、反応液を除去した。２ｍＬのＮＭＰを加えて転倒混和した後、ＮＭＰを除去する操作を８回繰り返し、樹脂を十分に洗浄した。
【０１４８】
反応の進行をＫａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔによりチェックし、Ｆｍｏｃ基の脱保護を確認した。以上の操作を繰り返し、所定のアミノ酸を順次縮合した。最後のアミノ酸のＦｍｏｃ基を２０％ＰＰＤ／ＮＭＰにより除去し、２ｍＬのＮＭＰで８回洗浄後、さらに２ｍＬのジクロロメタンで５回、２ｍＬのメタノールで５回洗浄し、デシケーター内で４時間真空乾燥した。
【０１４９】
１００ｍＬナスフラスコに真空乾燥した樹脂を全量採り、７５μＬの超純水、７５μＬのＴＩＳを加えた。さらに２．８５ｍＬのＴＦＡを加えて室温で２時間攪拌した。この間、反応開始後５分間は窒素ガスをバブリングした。ファルコンチューブにフィルターを用いて反応液を回収した。
【０１５０】
濾別した樹脂は２ｍＬのＴＦＡで洗浄し、洗浄液は濾液と合わせた。濾液に、氷上で十分冷却したジエチルエーテルを白色沈殿が十分に生じるまで加えた。沈殿懸濁液を２０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清をデカンテーションにより除去し、白色ペレットを得た。
【０１５１】
ペレットを３０ｍＬの冷ジエチルエーテルでピペッティングにより懸濁した後、同様に遠心し上清を除去する操作を４回繰り返し、ペレットを洗浄した。ペレットを氷上で５分間程度静置してペレット表面を乾燥させた後、さらにデシケーター内で２時間真空乾燥し、粗製物（白色固体）を得た。
【０１５２】
粗製物をオクタデシル化シリカゲルカラム(COSMOSIL 5C18-AR-300、20mm×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィー(ELITE LaChrom：Organizer、UV- detector L-2400、Pump L-2130、Fraction Collector L-5200、HITACHI hightechnologies)により精製した。
【０１５３】
粗精製物を超純水に溶解して調製したサンプル５ｍＬを０．２２μｍフィルター(Millex GV、Millipore)で濾過した後にローディングし、流速６．０ｍＬ／ｍｉｎでフローした。溶離液はＡ液（１％アセトニトリル溶液／９９％超純水／０．０３３％ＴＦＡ溶液）及びＢ液（８０％アセトニトリル溶液／２０％超純水／０．０３３％ＴＦＡ溶液）の２種類を用い、Ｂ液が１％／ｍｉｎで増加するグラジエントを設定した。検出は２２０ｎｍのＵＶ吸収により行い、目的物をフラクションコレクターを利用して分取した。
【０１５４】
３０℃で１０分間エバポレートすることにより有機溶媒を除去後、完全に水分が除去されるまで（２４〜４８時間）、凍結乾燥機(FD-1000、EYELA)を用いて凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【０１５５】
生成物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ(autflex II TOF/TOF、Bruker Daltoniks)による分子量測定により同定した。マトリックス溶液はＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Sigma）に付属のα−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄをアセトニトリルに溶解して調製した。
【０１５６】
１μＬのマトリックス溶液を測定用プレート(MTP384 target plate polished steel T F Part No.: 209520、Bruker Daltonics)の上にマウントし、風乾後、１μＬの２０ｐｍｏｌ／μＬペプチド溶液及びキット付属の内部標準液(Bradykinin fragment Mw＝757.40、Angiotensin II (human) Mw＝1046.54、P14R Mw＝1533.86)を同様にマウントして結晶化するまで風乾した。測定条件はＰｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅとし、その他の条件は標準的な設定で行った。
【０１５７】
［１×ＡＢ］上述の実施例１と同様に、１×ＡＢ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）を調製した。
【０１５８】
［１×ＡＢＳ］３０ｍＬの１×ＡＢに３ＭのＮａＣlを８．３４ｍＬ加え、１×ＡＢで５０ｍＬにメスアップすることにより、１×ＡＢＳ（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１５９】
［１０×ＭＢ］５３．３ｇのＭＥＳ(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid、nacalai tesuque）を４００ｍＬの超純水に溶解させ、４ＭのＮａＯＨでｐＨが６．０又は７．０となるように調製した後、超純水で５００ｍＬにメスアップすることにより、１０×ＭＢ（５００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０又は７．０）を調製し、５００ｍＬ広口メディウム瓶に移して４℃で保存した。１×ＭＢは、１０×ＭＢを超純水で１０倍に希釈して調製し、４℃で保存した。
【０１６０】
［１×ＭＢＳ］５ｍＬの１０×ＭＢに３ＭのＮａＣｌを８．３４ｍＬ加え、超純水で５０ｍＬにメスアップすることにより１×ＭＢＳ（５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又は７．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１６１】
［１０×ＨＢ］５８．０ｇのＨＥＰＥＳ(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid、nacalai tesuque)を超純水７０ｍＬに溶解させ、４ＭのＮａＯＨでｐＨが８．０となるように調製した後、超純水で１００ｍＬにメスアップすることにより１０×ＨＢ（５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．０）を調製し、２５０ｍＬ広口メディウム瓶に移して４℃で保存した。１×ＭＥＰＥＳはこの溶液を超純水で１０倍に希釈して調製し、４℃で保存した。
【０１６２】
［１×ＨＢＳ］５ｍＬの１０×ＨＢに３ＭのＮａＣｌを８．３４ｍＬ加え、超純水で５０ｍＬにメスアップすることにより１×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を調製し、４℃で保存した。
【０１６３】
［ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた解析］セルロースＩＩＩＩ型とセルロース結合性ペプチドとを含有するセルロース／ペプチド溶液を調製するとともに、当該セルロース／ペプチド溶液をインキュベーションした。図８に、これらの操作の概要を示す。
【０１６４】
まず、１．７ｍＬチューブに上述の実施例１で調製したセルロースＩＩＩＩ型懸濁液を１ｍＬ採取し、遠心機(MX-301、TOMY)を用いて、室温にて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次いで、セルロースＩＩＩＩ型懸濁液の上清を６６０μＬ除去した後、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を６６０μＬ加えてピペッティングすることにより、セルロースＩＩＩＩ型を酢酸緩衝液に再分散させた。この操作をもう一度行い、セルロースＩＩＩＩ型を所定濃度で含有する酢酸緩衝液からなるセルロース溶液を調製した。
【０１６５】
一方、５種類のセルロース結合性ペプチドの各々を５０ｍＭの酢酸緩衝液１００μＬに溶解し、さらに酢酸緩衝液で希釈して、当該セルロース結合性ペプチドを所定濃度で含有する酢酸緩衝液からなるペプチド溶液を調製した。
【０１６６】
次いで、セルロース／ペプチド溶液を調製した。すなわち、所定量のセルロース溶液と所定量のペプチド溶液とを２００μＬのＰＣＲチューブ内で混合し、０．５ｗｔ％のセルロースと１０μＭのセルロース結合性ペプチドとを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなるセルロース／ペプチド溶液を２００μＬ調製した。
【０１６７】
さらに、セルロース／ペプチド溶液のインキュベーションを行った。すなわち、セルロース／ペプチド溶液を所定回数ピペッティングし、３０℃で所定時間インキュベートした。
【０１６８】
そして、セルロース／ペプチド溶液から、部分ペプチドを含有する上清及び処理セルロースを含有する沈殿物をそれぞれ回収した。すなわち、インキュベート後、遠心機(MX-301、TOMY)を用いて、セルロース／ペプチド溶液を室温にて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。セルロース／ペプチド溶液の上清（以下、「上清サンプル」という。）を１００マイクロＬ採取し、新しい９６穴プレートのウェルに移した。一方、インキュベーション後のセルロース／ペプチド溶液を遠心して得られた、処理セルロースを含有する沈殿物を回収した。
【０１６９】
次に、採取された上清サンプルをＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて解析した。各上清サンプルにつき解析は３回行った（ｎ＝３）。
【０１７０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ(LC-20AD Prominence、SHIMAZU)に１０μＬの上清サンプルをローディングし、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎでフローした。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ(4.6mm×150mm、nacalai tesque)を用いた。溶離液はＡ液（１００％超純水／０．１％ＴＦＡ溶液）及びＢ液（１００％アセトニトリル溶液／０．１％ＴＦＡ溶液）の２種類を用いた。カラムオーブンは３５℃とし、検出はコロナ荷電化粒子検出器(コロナCAD、ESA Biosciences)を用いた。
【０１７１】
また、比較のために、１０μＭのセルロース結合性ペプチドを含有しセルロースを含有しない５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる対照溶液を調製した。そして、この対照溶液についても、同様にＨＰＬＣ解析を行った。
【０１７２】
また、ＨＰＬＣによる解析で使用後の上清サンプルの１００μＬを１．７ｍＬチューブに採取した。Ｚｉｐ−Ｔｉｐ(ZTC18S、Millipore)に７０％アセトニトリルを１０μＬ採取し３回吸引、排出を行い湿潤化および脱気を行った。０．１％ＴＦＡで３回吸引、排出を行いＺｉｐ−Ｔｉｐを平衡化した。１．７ｍＬチューブに採取しておいた上清サンプルを１０μＬ採取し、別の新しい１．７ｍＬチューブに移して、Ｚｉｐ−Ｔｉｐへのサンプル吸着を行った。この操作を１０回繰り返した。
【０１７３】
０．１％ＴＦＡを３回吸引、排出しＺｉｐ−Ｔｉｐを洗浄した。７０％アセトニトリルを樹脂充填量の２倍まで吸引し、新たな１．７ｍＬチューブで排出、吸引を３回繰り返した後に排出し、サンプルを溶出した。
【０１７４】
その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ(autflex II TOF/TOF、Bruker Daltoniks)を用いた解析を行い、上清サンプルに含有されていた物質の分子量測定を行った。測定条件は、上述の調製されたセルロース結合性ペプチドについて行った場合と同様であった。
【０１７５】
［結果］図９及び図１０には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図９においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１７６】
図１１には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２時間、６時間、１１時間、１８時間又は２４時間インキュベーションした後に採取された各上清サンプルと対照溶液とについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラムを示す。
【０１７７】
図１２及び図１３には、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２時間、６時間、１１時間、１８時間又は２４時間インキュベーションした後に採取された各上清サンプルについて、当該各上清サンプルにおいて検出され帰属されたペプチドの含有量（ｎｍｏｌ）を示す。なお、ペプチドの含有量は、上述のＨＰＬＣ解析の結果及び検量線に基づいて算出した。すなわち、まず、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により分解物として同定された化学構造をもつペプチドを、標準サンプルとして別個に化学合成した。次いで、このペプチドの系列希釈溶液（０．６−２０μＭの範囲の６種類のペプチド濃度）を調製した。そして、これらの溶液のＨＰＬＣ解析を実施し、得られたクロマトグラムにおけるピーク面積値を算出した。算出されたピーク面積値と溶液中のペプチド濃度との相関関係を示すグラフを検量線として作成し、当該検量線として使用することで、分解物の生成量を算出した。
【０１７８】
図９に示すように、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを混合して３０℃で２４時間インキュベーションした後の上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、当該Ｃ１３ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。このピーク面積の減少は、上清に残存するＣ１３ペプチドの量が減少したことを示していると考えられた。
【０１７９】
さらに、図１１に示すように、このＣ１３ペプチドのピーク面積の減少は、セルロースとのインキュベーション時間に依存していた。すなわち、Ｃ１３ペプチドのピーク面積は、インキュベーション時間が長くなるにつれて減少した。
【０１８０】
一方、図９及び図１１に示すように、上清サンプル中には、対照溶液では検出されない、保持時間の異なるピークが複数観察された。実際、図１０に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ１３ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。
【０１８１】
すなわち、上清サンプル中には、Ｃ１３ペプチド（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫＳＨ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が２〜６個欠如した５種類の部分ペプチドが検出され帰属された。
【０１８２】
具体的に、Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が２個欠如した部分ペプチドａ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧＫ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチドｂ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳＧ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチドｃ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫＳ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチドｄ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦＫ−ＣＯＯＨ）及び当該Ｃ１３ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が６個欠如した部分ペプチドｅ（ＮＨ２−ＡＳＩＴＨＦ−ＣＯＯＨ）が生成されているのが確認された。
【０１８３】
そして、図１２及び図１３に示すように、上清サンプル中において、Ｃ１３ペプチドの含有量はインキュベーション時間に伴い減少したのに対して、５種類の部分ペプチドａ〜ｅの含有量はインキュベーション時間に伴い増加する傾向が見られた。すなわち、セルロース／ペプチド溶液の上清中においては、セルロース結合性ペプチドの切断が進行し、部分ペプチドが徐々に濃縮された。
【０１８４】
特に、部分ペプチドｃの含有量は、他の部分ペプチドに比べて顕著に高く、インキュベーション時間の増加に伴い、略直線的に増加した。すなわち、Ｃ１３ペプチドをセルロースＩＩＩＩ型に作用させることにより、部分ペプチドｃを選択的に効率よく生成することができた。
【０１８５】
また、インキュベーション時間が１８時間の時点では、部分ペプチドの含有量は、当初添加されたＣ１３ペプチドの量（２ｎｍｏｌ）の２５％（０．５ｎｍｏｌ）以上に到達した。すなわち、１８時間のインキュベーションによって、ペプチド／セルロース溶液における当初の量の２５％以上のＣ１３ペプチドが切断されたと考えられた。
【０１８６】
また、インキュベーション時間の経過に伴って、上清サンプル中に含有されるペプチドの総量（Ｃ１３ペプチドの量と部分ペプチドの量との総和）が減少した。このことは、上清と分離されたセルロースＩＩＩＩ型にＣ１３ペプチド及び部分ペプチドの一方又は両方が結合し残存していることを示しているものと考えられた。
【０１８７】
このように、Ｃ１３ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型との相互作用に伴って、当該Ｃ１３ペプチドが当該セルロースＩＩＩＩ型に結合するのみならず、当該Ｃ１３ペプチドのペプチド結合の切断が進行した。
【０１８８】
図１４及び図１５には、Ｃ３２ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１４においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１８９】
図１４に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３２ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。
【０１９０】
そして、図１５に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３２ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３２ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３２ペプチドのＣ末端側又はＮ末端側のアミノ酸が３〜４個欠如した３種類の部分ペプチドが検出され帰属された。
【０１９１】
具体的に、Ｃ３２ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＡＬＨＨＴＴＮＶＰ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ３２ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＨＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３２ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＴＮＶＰＲＰＡ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０１９２】
図１６及び図１７には、Ｃ３７ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１６においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１９３】
図１６に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３７ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。すなわち、２４時間のインキュベーションによって、Ｃ３７ペプチドのピーク面積は消失した（ゼロ％）。
【０１９４】
一般に、ペプチドのセルロースに対する結合が、単純な吸着反応（平衡反応）に基づくだけであれば、当該ペプチドのピーク面積がゼロになることはない。したがって、Ｃ３７ペプチドはセルロースＩＩＩＩ型に吸着するだけでなく、さらに何らかの反応（例えば、分解）が進んでいると考えられた。なお、このような反応は、今回使用された５種類のセルロース結合性ペプチドの全てに共通して起こっているものと考えられた。
【０１９５】
そして、図１７に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３７ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３７ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３７ペプチドのＣ末端側又はＮ末端側のアミノ酸が３〜４個欠如した２種類のペプチドが検出され帰属された。
【０１９６】
具体的に、Ｃ３７ペプチドのＣ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＱＡＮＡＦＳＰＡ−ＣＯＯＨ）、当該Ｃ３７ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＡＦＳＰＡＰＲＶ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０１９７】
図１８及び図１９には、Ｃ３９ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図１８においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０１９８】
図１８に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ３９ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。
【０１９９】
そして、図１９に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ３９ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ３９ペプチド（ＮＨ２−ＱＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が１〜５個欠如した５種類のペプチドが検出され帰属された。
【０２００】
具体的に、Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が１個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＰＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が２個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＦＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＴＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ３９ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＳＬＴＰＰＡＲ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０２０１】
図２０及び図２１には、Ｃ８４ペプチドとセルロースＩＩＩＩ型とを２４時間インキュベーションした後に採取された上清サンプルについて、ＨＰＬＣ解析で得られたクロマトグラム及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析で得られたマススペクトルをそれぞれ示す。なお、図２０においては、上清サンプルの解析結果を実線で示し、対照溶液の解析結果を点線で示している。
【０２０２】
図２０に示すように、上清サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、セルロースを含有しない対照溶液と比較して、Ｃ８４ペプチドのピーク面積が顕著に減少した。すなわち、２４時間のインキュベーションによって、Ｃ８４ペプチドのピーク面積は消失した（ゼロ％）。
【０２０３】
そして、図２１に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析により、上清サンプル中には、Ｃ８４ペプチド由来の分解物と思われる複数の部分ペプチドが確認された。すなわち、上清サンプル中には、Ｃ８４ペプチド（ＮＨ２−ＴＬＡＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）に加え、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３〜５個欠如した３種類のペプチドが検出され帰属された。
【０２０４】
具体的に、Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が３個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＫＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が４個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＭＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）、当該Ｃ８４ペプチドのＮ末端側のアミノ酸が５個欠如した部分ペプチド（ＮＨ２−ＧＬＳＰＬＨＧ−ＣＯＮＨ２）が生成されているのが確認された。
【０２０５】
図２２には、５種類のセルロース結合性ペプチドの各々について、そのアミノ酸配列と、上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析に基づき確認された部分ペプチドのアミノ酸配列と、をまとめて示す。なお、図２２に示された部分ペプチド以外に、未だ帰属できていない他の部分ペプチドが生成されている可能性があると考えられた。
【０２０６】
図２２に示すように、本方法によって、セルロース結合性ペプチドを構成するアミノ酸配列の一部からなる特定の部分ペプチドをトップダウンで製造することができた。
【０２０７】
また、上清中に含有されている部分ペプチドとセルロース結合性ペプチドとの総量は、セルロース／ペプチド溶液に当初含有されていた当該セルロース結合性ペプチドの量の半分未満であった。
【０２０８】
したがって、セルロース結合性ペプチドのアミノ酸配列のうち、上清中に遊離した部分ペプチドのアミノ酸配列以外の部分からなる他の部分ペプチドは、セルロースＩＩＩＩ型に結合して複合体を形成していると考えられた。
【符号の説明】
【０２０９】
Ｓ１ 準備工程、Ｓ２ インキュベーション工程、Ｓ３ 回収工程。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程と、
前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程と、
処理された前記セルロース及び生成された前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程と、
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドである
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一工程において所定量の前記セルロース結合性ペプチドを含有する前記溶液を調製し、
前記第二工程において前記所定量の２０％以上の前記セルロース結合性ペプチドが切断されるまで前記溶液をインキュベーションする
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理することにより製造された
ことを特徴とするセルロース。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、前記セルロース結合性ペプチドを切断することにより製造された
ことを特徴とする処理されたペプチド。
【請求項１】
セルロースとセルロース結合性ペプチドとを含有する溶液を調製する第一工程と、
前記溶液をインキュベーションすることにより、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理するとともに、前記セルロース結合性ペプチドを切断して部分ペプチドを生成する第二工程と、
処理された前記セルロース及び生成された前記部分ペプチドの一方又は両方を回収する第三工程と、
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記セルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が２〜３０個の範囲内のペプチドである
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一工程において所定量の前記セルロース結合性ペプチドを含有する前記溶液を調製し、
前記第二工程において前記所定量の２０％以上の前記セルロース結合性ペプチドが切断されるまで前記溶液をインキュベーションする
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、前記セルロースを前記セルロース結合性ペプチドで処理することにより製造された
ことを特徴とするセルロース。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、前記セルロース結合性ペプチドを切断することにより製造された
ことを特徴とする処理されたペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１１−２４４２９（Ｐ２０１１−２４４２９Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７０６２７（Ｐ２００９−１７０６２７）
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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