タバココナジラミのバイオタイプの判別方法
【課題】作物栽培施設に発生したタバココナジラミがバイオタイプＢであるかＱであるかを判別することは、防除対策を立てる上で極めて重要である。形態的にバイオタイプＢと区別できないタバココナジラミバイオタイプＱを判別する新規な判別方法等を提供する。
【解決手段】タバココナジラミバイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である、複数の特定の配列で示される塩基配列における特定の位置の塩基の違いを測定することにより、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプの判別が可能である。
【解決手段】タバココナジラミバイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である、複数の特定の配列で示される塩基配列における特定の位置の塩基の違いを測定することにより、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプの判別が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）は成虫の大きさが０．８ｍｍ程度の微小な害虫で、日本の施設園芸においては主にトマト、キュウリ、及びナス等の施設栽培の作物に寄生する。タバココナジラミの幼虫及び成虫は、作物に吸汁害を与えることの他に、成虫はトマト黄化葉巻病等のウイルス病を媒介することが知られている。タバココナジラミには、形態的には区別できないが、遺伝的、及び生物学的に異なる約４０種類のバイオタイプが存在する（例えば、非特許文献１を参照）。日本には在来のタバココナジラミが分布しているが、野外でサツマイモ等にわずかに寄生するだけで、作物栽培上それほど重要な害虫ではなかった。しかし、１９８９年頃に日本国外から薬剤の効きにくいタバココナジラミであるシルバーリーフコナジラミ（タバココナジラミバイオタイプＢ）が日本に侵入してきた。さらに、２００３年頃に、九州で、これまで知られていなかったバイオタイプのタバココナジラミの発生が観察された。これはタバココナジラミバイオタイプＢと遺伝的に異なり、日本国外では存在が知られていたバイオタイプＱであることが判明した（非特許文献２）。バイオタイプＱは、その後分布地域を拡大し、東北地方にまで分布するようになった。バイオタイプＱはバイオタイプＢに比べて、従来汎用されている薬剤による防除が困難なため、作物栽培上、深刻な問題となっている（例えば、非特許文献２、３を参照）。
したがって、作物栽培施設に発生したタバココナジラミがバイオタイプＢであるかＱであるかを判別することは、防除対策を立てる上で極めて重要である。形態的にバイオタイプＢと区別できないタバココナジラミバイオタイプＱを判別する方法としては、これまで、バイオタイプに特異的な制限酵素部位を利用した方法（非特許文献４）が提案されている。
しかしなお、タバココナジラミのバイオタイプの新規な判別方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｉｎｇ，Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００１年，２０，ｐ．７２５−７３７
【非特許文献２】松浦，今月の農業，２００６年２月，ｐ．５７−６１
【非特許文献３】本多，植物防疫，２００５年，５９巻，ｐ．２９９−３０４
【非特許文献４】上田，九病虫研会報，２００６年，５２巻，ｐ．４４−４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、タバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、の新規な判別方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の課題に鑑み、鋭意検討した結果、タバココナジラミ バイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である、下記配列番号１で示される塩基配列における特定の位置の塩基の違いを測定することにより、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプの判別が可能であることを見出し、本発明に到った。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［５］の判別方法、ならびに［６］および［７］オリゴヌクレオチド等を提供するものである。
［１］
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む、タバココナジラミのバイオタイプの判別方法。
［２］
前記部分配列が、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列であることを特徴とする前記［１］に記載の判別方法。
［３］
アンチセンスプライマーとして、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［１］に記載の判別方法。
［４］
センスプライマーとして、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［３］に記載の判別方法。
［５］
別のセンスプライマーとしての配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および
別のアンチセンスプライマーとしての配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［４］に記載の判別方法。
［６］
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
［７］
配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、を判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、配列番号１で示される塩基配列である。
【図２】図２は、配列番号６で示される塩基配列である。
【図３−１】図３−１は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−２】図３−２は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−３】図３−３は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−４】図３−４は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図４】図４は、ＰＣＲ後の電気泳動写真である。
【発明を実施するため形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
［タバココナジラミバイオタイプの判別方法］
本発明のタバココナジラミのバイオタイプの判別方法（本明細書中、単に「本発明の判別方法」と称する場合がある。）は、
（１）鋳型として、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料を用い、および
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、図３（本明細書中、図３とは、図３−１〜図３−４を意味する。）における配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群（本明細書中、「塩基群Ａ」と称する場合がある。）から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む。
【０００９】
配列番号１は、本発明者らが取得したタバココナジラミ バイオタイプＱから見出した、新規のチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号１で示される塩基配列を、図１に示す。本明細書中、特に断りが無い限り、塩基配列は、５’末端から３’末端の方向に記載されている。
本明細書中、塩基配列中の塩基を表示する記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ ambiguity codeに従う。
本明細書中、「塩基番号」なる用語は、特に断りの無い限り、タバココナジラミ バイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする新規遺伝子の塩基配列である配列番号１で示される塩基配列（図１）と、タバココナジラミ バイオタイプＢのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である配列番号６で示される塩基配列（図２）とを、図３に示すようにマルチプルアラインメントした場合に、開始コドンであるＡＴＧのＡを塩基番号１とし、５’→３’末端方向に１塩基ごとに付けた番号を意味する。したがって、当業者に明らかなように、当該「塩基番号」は、単独の配列番号１に付した塩基番号（図１）とは異なる。
なお、配列番号６は、本発明者らが取得したタバココナジラミ バイオタイプＢから見出した、新規のチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００１０】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられる鋳型は、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料である。当該ポリヌクレオチド試料は、特に限定されるものではないが、（１）供試されるタバココナジラミの細胞、組織、または全体（通常、虫体全体）からから抽出したＤＮＡ試料、および（２）供試されるタバココナジラミの細胞、組織、または全体（通常、虫体全体）からＲＮＡを抽出し、ついで逆転写酵素を用いてＲＮＡから調製したｃＤＮＡ試料などが好ましい。
タバココナジラミのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行えばよく、例えば、ＰｒｅｐＭａｎ ＵｌｔｒａＲｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等を用いて行うことができる。
タバココナジラミのＲＮＡの抽出は、例えば、ＲＮｅａｓｙキット（商品名、Ｑｉａｇｅｎ社）等を用いて行うことができる。
ｃＤＮＡの調製に用いられる逆転写酵素としては、例えば、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社）、ＰｒｉｍｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商品名、タカラバイオ社）、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が挙げられる。
【００１１】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる。当該センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、好ましくはＴｍ値が５５以上５８以下のオリゴヌクレオチドである。なお、これらのオリゴヌクレオチドもまた、本発明の一態様である。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列において、前記塩基群Ａから選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列または前記（ｂ）の塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列
【００１２】
バイオタイプＱの判別の正確性の観点から、前記（ａ）の塩基配列は、塩基群Ａから選択される塩基を、好ましくは１個〜５個、より好ましくは２個含む。
より好ましくは、前記（ａ）の塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下（より好ましくは、塩基長１５塩基以上２０塩基以下）の部分塩基配列である。
【００１３】
前記（ｃ）の塩基配列において、前記塩基群Ａの塩基のうちの少なくとも１つは、欠失、または置換されずに、残っている必要がある。
【００１４】
前記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列のうち、好ましくは、前記（ａ）の塩基配列、および前記（ｂ）の塩基配列である。
【００１５】
本明細書中、Ｔｍ値（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、融解温度、℃）は、Nearest Neighbor 法に基づき次の数式で計算された数値である。
Tm＝[1000ΔH/｛-10.8+ΔS+Rln(Ct/4)｝]-273.15+16.6log[Na+]
ここで、数式中の記号および数値は下記を示す。
ΔH：ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計[kcal/mol]
-10.8：ΔS(initiation)[cal/mol・K]
ΔS：ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計[cal/mol・K]
R：気体定数(1.987cal/deg・mol)
Ct：オリゴのtotalモル濃度[mol/l]。0.5μMで計算する。
Na+：Na+のモル濃度[mol/l]。50mMで計算する。
【００１６】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、それらの両方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである場合、他方のプライマーとしては、特に限定されず、ＰＣＲ法による増幅およびその検出が可能である限り、任意のプライマーを用いることができる。
【００１７】
特に好ましくは、アンチセンスプライマーとして、下記の配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。
また、特に好ましくは、センスプライマーとして、下記の配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。
【００１８】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいては、２組以上のプライマーセットを用いてもよい。
好ましくは、そのうち１組のプライマーセットは、配列番号１の配列が適切に増幅されていることを判断するためのコントロール用のプライマーセットである。
このようなプライマーセットとしては、下記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットが、特に好ましい。
センスプライマー：下記の配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー：下記の配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１９】
配列番号５：5’-ACGCATGCTTTATTCAGTG-3’
配列番号４：5’-ACTCGAAACTTGTGCTGG-3’
配列番号２：5’-AGGAGTTGAACGCCC-3’
配列番号３：5’-ATCTCGAGGAACTGGAAG-3’
なお、配列番号５、４、２、及び３で示される塩基配列からなるプライマーのＴｍ値は、それぞれ、５８．９、５８．９、５６．８、及び５６．７である。
【００２０】
このようなプライマーは、例えば、慣用の化学合成方法によって調製できる。
なお、配列番号５、配列番号４、配列番号２、および配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、新規のポリヌクレオチドであり、本発明の一態様である。
【００２１】
本発明の判別方法におけるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、前記鋳型および前記プライマー、市販の装置、市販のキット、および試薬を用いて、それらの使用説明書に記載の方法および条件に従って実施することができる。
【００２２】
本発明の判別方法は、前記のＰＣＲを行った後に、前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べることを含む。
前記プライマーに特異的な増幅の有無は、前記ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドを検出することによって、行うことができる。
このようなポリヌクレオチドの検出は、公知の検出法を用いて、実施すればよい。その例としては、例えば、前記ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド試料を、アガロースゲル上で電気泳動に付し、エチジウムブロマイド処理後、トランスイルミネーターで、前記プライマーに特異的に増幅した断片を確認する方法が挙げられる。
ここで、コントロールとして、タバココナジラミバイオタイプＱであることが確認されている個体群および／またはタバココナジラミバイオタイプＢであることが確認されている個体群を用いることが好ましい。
【００２３】
本発明のタバココナジラミにおけるバイオタイプの判別方法は、
（１）本発明の判別方法を用いてタバココナジラミがバイオタイプＱであるかどうかを判別することにより、有効な薬剤を選択する等の適切な防除対策を実施すること、
（２）本発明の判別方法を用いて各地から採集したタバココナジラミのバイオタイプを判別することにより、すなわちモニタリングを実施することにより、タバココナジラミの各バイオタイプの地理的分布を把握すること、および
（３）選別したタバココナジラミバイオタイプＱを用いることで、タバココナジラミバイオタイプＱに有効な薬剤のスクリーニングに用いること
などに利用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
（タバココナジラミ個体群のＰ４５０遺伝子を用いたバイオタイプの測定）
日本各地から採集したタバココナジラミ４個体群（１：愛知県愛西市、２：長崎県西彼杵郡、３：高知県安芸市、４：熊本県八代市）の虫体全体から、ＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
上記ＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセット（ａ）、（ｂ）を用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社から入手した。
プライマーセット（ａ）
次のセンスプライマーとアンチセンスプライマーからなるプライマーセット。
センスプライマー: 塩基配列 5’-AGGAGTTGAACGCCC-3’(配列番号２) からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー: 塩基配列 5’-ATCTCGAGGAACTGGAAG-3’ (配列番号３) からなるオリゴヌクレオチド
プライマーセット（ｂ）
次のセンスプライマーとアンチセンスプライマーからなるプライマーセット。
センスプライマー: 塩基配列 5’-ACTCGAAACTTGTGCTGG-3’ (配列番号４) からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー: 塩基配列 5’-ACGCATGCTTTATTCAGTG-3’ (配列番号５) からなるオリゴヌクレオチド
ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００上で、ＴａＫａＲａ Ｅｘ ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社）を用いて行った。反応液の組成はＥｘ Ｔａｑ：０.１μＬ、ｄＮＴＰ：１.６μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、プライマーセット（ａ）：１０μＭセンスプライマー、及び１０μＭアンチセンスプライマー各１.２μＬ、プライマーセット（ｂ）：１０μＭセンスプライマー、及び１０μＭアンチセンスプライマー各１.８μＬ、サンプル（各個体群由来のＤＮＡ）：０．８μＬおよび滅菌蒸留水：９．５μＬとした。なお、プライマー、サンプルおよび滅菌蒸留水以外はすべて上記Ｅｘ Ｔａｑに付属のものである。反応条件は、９４℃／２分に引き続き、９４℃／３０秒および６２℃／３０秒、７２℃／１分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃／５分の反応を行った。ＰＣＲ後、１.５％アガロースゲル上で電気泳動を１００Ｖで３５分間行い、エチジウムブロマイド処理後トランスイルミネーターで断片を確認した。
ＰＣＲで測定した遺伝子の増幅断片の電気泳動写真の例を図４に示し、その結果を表１にまとめた。図中、レーンＭはサイズマーカー（φＸ１７４／Ｈａｓ III ｄｉｇｅｓｔ)を、レーン１〜４は各供試タバココナジラミ個体群を示す。図４より明らかなように、バイオタイプＢでは１本のバンドが観察され、バイオタイプＱは２本のバンドが観察された。
表中、「従来方法」とは、当該分野での標準的な方法であり、具体的には、次のように実施した。タバココナジラミ成虫１頭よりＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＤＮＡを抽出した。プライマーを用いてＰＣＲによりミトコンドリアチトクロームｃサブユニットＩ ＤＮＡ（ＣＯＩ）の増幅を行なった。ＰＣＲ産物を制限酵素（ＥｃｏＴ１４ＩとＳｔｕ Ｉ）で消化し、１％アガロースゲルを用い電気泳動した。エチジウムブロマイド処理後トランスイルミネーターで断片を確認した。なお、バイオタイプＱはＥｃｏＴ１４ＩでＰＣＲ産物は切断され、バイオタイプＢはＳｔｕ Ｉで切断される。
［表１］
以上のように、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とプライマーセット（ａ）、（ｂ）を用いることにより、従来方法と同一の結果が得られた。これにより、制限酵素を用いることなく、バイオタイプＱの判別、特にバイオタイプＱとバイオタイプＢとの判別ができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、タバココナジラミバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、を判別することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００２７】
配列番号２で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号３で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号４で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号５で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）は成虫の大きさが０．８ｍｍ程度の微小な害虫で、日本の施設園芸においては主にトマト、キュウリ、及びナス等の施設栽培の作物に寄生する。タバココナジラミの幼虫及び成虫は、作物に吸汁害を与えることの他に、成虫はトマト黄化葉巻病等のウイルス病を媒介することが知られている。タバココナジラミには、形態的には区別できないが、遺伝的、及び生物学的に異なる約４０種類のバイオタイプが存在する（例えば、非特許文献１を参照）。日本には在来のタバココナジラミが分布しているが、野外でサツマイモ等にわずかに寄生するだけで、作物栽培上それほど重要な害虫ではなかった。しかし、１９８９年頃に日本国外から薬剤の効きにくいタバココナジラミであるシルバーリーフコナジラミ（タバココナジラミバイオタイプＢ）が日本に侵入してきた。さらに、２００３年頃に、九州で、これまで知られていなかったバイオタイプのタバココナジラミの発生が観察された。これはタバココナジラミバイオタイプＢと遺伝的に異なり、日本国外では存在が知られていたバイオタイプＱであることが判明した（非特許文献２）。バイオタイプＱは、その後分布地域を拡大し、東北地方にまで分布するようになった。バイオタイプＱはバイオタイプＢに比べて、従来汎用されている薬剤による防除が困難なため、作物栽培上、深刻な問題となっている（例えば、非特許文献２、３を参照）。
したがって、作物栽培施設に発生したタバココナジラミがバイオタイプＢであるかＱであるかを判別することは、防除対策を立てる上で極めて重要である。形態的にバイオタイプＢと区別できないタバココナジラミバイオタイプＱを判別する方法としては、これまで、バイオタイプに特異的な制限酵素部位を利用した方法（非特許文献４）が提案されている。
しかしなお、タバココナジラミのバイオタイプの新規な判別方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｉｎｇ，Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００１年，２０，ｐ．７２５−７３７
【非特許文献２】松浦，今月の農業，２００６年２月，ｐ．５７−６１
【非特許文献３】本多，植物防疫，２００５年，５９巻，ｐ．２９９−３０４
【非特許文献４】上田，九病虫研会報，２００６年，５２巻，ｐ．４４−４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、タバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、の新規な判別方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の課題に鑑み、鋭意検討した結果、タバココナジラミ バイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である、下記配列番号１で示される塩基配列における特定の位置の塩基の違いを測定することにより、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプの判別が可能であることを見出し、本発明に到った。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［５］の判別方法、ならびに［６］および［７］オリゴヌクレオチド等を提供するものである。
［１］
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む、タバココナジラミのバイオタイプの判別方法。
［２］
前記部分配列が、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列であることを特徴とする前記［１］に記載の判別方法。
［３］
アンチセンスプライマーとして、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［１］に記載の判別方法。
［４］
センスプライマーとして、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［３］に記載の判別方法。
［５］
別のセンスプライマーとしての配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および
別のアンチセンスプライマーとしての配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記［４］に記載の判別方法。
［６］
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
［７］
配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、制限酵素を用いることなくタバココナジラミのバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、を判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、配列番号１で示される塩基配列である。
【図２】図２は、配列番号６で示される塩基配列である。
【図３−１】図３−１は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−２】図３−２は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−３】図３−３は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図３−４】図３−４は、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図４】図４は、ＰＣＲ後の電気泳動写真である。
【発明を実施するため形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
［タバココナジラミバイオタイプの判別方法］
本発明のタバココナジラミのバイオタイプの判別方法（本明細書中、単に「本発明の判別方法」と称する場合がある。）は、
（１）鋳型として、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料を用い、および
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、図３（本明細書中、図３とは、図３−１〜図３−４を意味する。）における配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群（本明細書中、「塩基群Ａ」と称する場合がある。）から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む。
【０００９】
配列番号１は、本発明者らが取得したタバココナジラミ バイオタイプＱから見出した、新規のチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号１で示される塩基配列を、図１に示す。本明細書中、特に断りが無い限り、塩基配列は、５’末端から３’末端の方向に記載されている。
本明細書中、塩基配列中の塩基を表示する記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ ambiguity codeに従う。
本明細書中、「塩基番号」なる用語は、特に断りの無い限り、タバココナジラミ バイオタイプＱのチトクロームＰ４５０をコードする新規遺伝子の塩基配列である配列番号１で示される塩基配列（図１）と、タバココナジラミ バイオタイプＢのチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である配列番号６で示される塩基配列（図２）とを、図３に示すようにマルチプルアラインメントした場合に、開始コドンであるＡＴＧのＡを塩基番号１とし、５’→３’末端方向に１塩基ごとに付けた番号を意味する。したがって、当業者に明らかなように、当該「塩基番号」は、単独の配列番号１に付した塩基番号（図１）とは異なる。
なお、配列番号６は、本発明者らが取得したタバココナジラミ バイオタイプＢから見出した、新規のチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００１０】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられる鋳型は、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料である。当該ポリヌクレオチド試料は、特に限定されるものではないが、（１）供試されるタバココナジラミの細胞、組織、または全体（通常、虫体全体）からから抽出したＤＮＡ試料、および（２）供試されるタバココナジラミの細胞、組織、または全体（通常、虫体全体）からＲＮＡを抽出し、ついで逆転写酵素を用いてＲＮＡから調製したｃＤＮＡ試料などが好ましい。
タバココナジラミのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行えばよく、例えば、ＰｒｅｐＭａｎ ＵｌｔｒａＲｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等を用いて行うことができる。
タバココナジラミのＲＮＡの抽出は、例えば、ＲＮｅａｓｙキット（商品名、Ｑｉａｇｅｎ社）等を用いて行うことができる。
ｃＤＮＡの調製に用いられる逆転写酵素としては、例えば、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社）、ＰｒｉｍｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商品名、タカラバイオ社）、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が挙げられる。
【００１１】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる。当該センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、好ましくはＴｍ値が５５以上５８以下のオリゴヌクレオチドである。なお、これらのオリゴヌクレオチドもまた、本発明の一態様である。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列において、前記塩基群Ａから選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列または前記（ｂ）の塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列
【００１２】
バイオタイプＱの判別の正確性の観点から、前記（ａ）の塩基配列は、塩基群Ａから選択される塩基を、好ましくは１個〜５個、より好ましくは２個含む。
より好ましくは、前記（ａ）の塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下（より好ましくは、塩基長１５塩基以上２０塩基以下）の部分塩基配列である。
【００１３】
前記（ｃ）の塩基配列において、前記塩基群Ａの塩基のうちの少なくとも１つは、欠失、または置換されずに、残っている必要がある。
【００１４】
前記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列のうち、好ましくは、前記（ａ）の塩基配列、および前記（ｂ）の塩基配列である。
【００１５】
本明細書中、Ｔｍ値（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、融解温度、℃）は、Nearest Neighbor 法に基づき次の数式で計算された数値である。
Tm＝[1000ΔH/｛-10.8+ΔS+Rln(Ct/4)｝]-273.15+16.6log[Na+]
ここで、数式中の記号および数値は下記を示す。
ΔH：ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計[kcal/mol]
-10.8：ΔS(initiation)[cal/mol・K]
ΔS：ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計[cal/mol・K]
R：気体定数(1.987cal/deg・mol)
Ct：オリゴのtotalモル濃度[mol/l]。0.5μMで計算する。
Na+：Na+のモル濃度[mol/l]。50mMで計算する。
【００１６】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、それらの両方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである場合、他方のプライマーとしては、特に限定されず、ＰＣＲ法による増幅およびその検出が可能である限り、任意のプライマーを用いることができる。
【００１７】
特に好ましくは、アンチセンスプライマーとして、下記の配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。
また、特に好ましくは、センスプライマーとして、下記の配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。
【００１８】
本発明の判別方法におけるＰＣＲにおいては、２組以上のプライマーセットを用いてもよい。
好ましくは、そのうち１組のプライマーセットは、配列番号１の配列が適切に増幅されていることを判断するためのコントロール用のプライマーセットである。
このようなプライマーセットとしては、下記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットが、特に好ましい。
センスプライマー：下記の配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー：下記の配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１９】
配列番号５：5’-ACGCATGCTTTATTCAGTG-3’
配列番号４：5’-ACTCGAAACTTGTGCTGG-3’
配列番号２：5’-AGGAGTTGAACGCCC-3’
配列番号３：5’-ATCTCGAGGAACTGGAAG-3’
なお、配列番号５、４、２、及び３で示される塩基配列からなるプライマーのＴｍ値は、それぞれ、５８．９、５８．９、５６．８、及び５６．７である。
【００２０】
このようなプライマーは、例えば、慣用の化学合成方法によって調製できる。
なお、配列番号５、配列番号４、配列番号２、および配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、新規のポリヌクレオチドであり、本発明の一態様である。
【００２１】
本発明の判別方法におけるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、前記鋳型および前記プライマー、市販の装置、市販のキット、および試薬を用いて、それらの使用説明書に記載の方法および条件に従って実施することができる。
【００２２】
本発明の判別方法は、前記のＰＣＲを行った後に、前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べることを含む。
前記プライマーに特異的な増幅の有無は、前記ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドを検出することによって、行うことができる。
このようなポリヌクレオチドの検出は、公知の検出法を用いて、実施すればよい。その例としては、例えば、前記ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド試料を、アガロースゲル上で電気泳動に付し、エチジウムブロマイド処理後、トランスイルミネーターで、前記プライマーに特異的に増幅した断片を確認する方法が挙げられる。
ここで、コントロールとして、タバココナジラミバイオタイプＱであることが確認されている個体群および／またはタバココナジラミバイオタイプＢであることが確認されている個体群を用いることが好ましい。
【００２３】
本発明のタバココナジラミにおけるバイオタイプの判別方法は、
（１）本発明の判別方法を用いてタバココナジラミがバイオタイプＱであるかどうかを判別することにより、有効な薬剤を選択する等の適切な防除対策を実施すること、
（２）本発明の判別方法を用いて各地から採集したタバココナジラミのバイオタイプを判別することにより、すなわちモニタリングを実施することにより、タバココナジラミの各バイオタイプの地理的分布を把握すること、および
（３）選別したタバココナジラミバイオタイプＱを用いることで、タバココナジラミバイオタイプＱに有効な薬剤のスクリーニングに用いること
などに利用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
（タバココナジラミ個体群のＰ４５０遺伝子を用いたバイオタイプの測定）
日本各地から採集したタバココナジラミ４個体群（１：愛知県愛西市、２：長崎県西彼杵郡、３：高知県安芸市、４：熊本県八代市）の虫体全体から、ＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
上記ＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセット（ａ）、（ｂ）を用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社から入手した。
プライマーセット（ａ）
次のセンスプライマーとアンチセンスプライマーからなるプライマーセット。
センスプライマー: 塩基配列 5’-AGGAGTTGAACGCCC-3’(配列番号２) からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー: 塩基配列 5’-ATCTCGAGGAACTGGAAG-3’ (配列番号３) からなるオリゴヌクレオチド
プライマーセット（ｂ）
次のセンスプライマーとアンチセンスプライマーからなるプライマーセット。
センスプライマー: 塩基配列 5’-ACTCGAAACTTGTGCTGG-3’ (配列番号４) からなるオリゴヌクレオチド
アンチセンスプライマー: 塩基配列 5’-ACGCATGCTTTATTCAGTG-3’ (配列番号５) からなるオリゴヌクレオチド
ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００上で、ＴａＫａＲａ Ｅｘ ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社）を用いて行った。反応液の組成はＥｘ Ｔａｑ：０.１μＬ、ｄＮＴＰ：１.６μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、プライマーセット（ａ）：１０μＭセンスプライマー、及び１０μＭアンチセンスプライマー各１.２μＬ、プライマーセット（ｂ）：１０μＭセンスプライマー、及び１０μＭアンチセンスプライマー各１.８μＬ、サンプル（各個体群由来のＤＮＡ）：０．８μＬおよび滅菌蒸留水：９．５μＬとした。なお、プライマー、サンプルおよび滅菌蒸留水以外はすべて上記Ｅｘ Ｔａｑに付属のものである。反応条件は、９４℃／２分に引き続き、９４℃／３０秒および６２℃／３０秒、７２℃／１分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃／５分の反応を行った。ＰＣＲ後、１.５％アガロースゲル上で電気泳動を１００Ｖで３５分間行い、エチジウムブロマイド処理後トランスイルミネーターで断片を確認した。
ＰＣＲで測定した遺伝子の増幅断片の電気泳動写真の例を図４に示し、その結果を表１にまとめた。図中、レーンＭはサイズマーカー（φＸ１７４／Ｈａｓ III ｄｉｇｅｓｔ)を、レーン１〜４は各供試タバココナジラミ個体群を示す。図４より明らかなように、バイオタイプＢでは１本のバンドが観察され、バイオタイプＱは２本のバンドが観察された。
表中、「従来方法」とは、当該分野での標準的な方法であり、具体的には、次のように実施した。タバココナジラミ成虫１頭よりＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＤＮＡを抽出した。プライマーを用いてＰＣＲによりミトコンドリアチトクロームｃサブユニットＩ ＤＮＡ（ＣＯＩ）の増幅を行なった。ＰＣＲ産物を制限酵素（ＥｃｏＴ１４ＩとＳｔｕ Ｉ）で消化し、１％アガロースゲルを用い電気泳動した。エチジウムブロマイド処理後トランスイルミネーターで断片を確認した。なお、バイオタイプＱはＥｃｏＴ１４ＩでＰＣＲ産物は切断され、バイオタイプＢはＳｔｕ Ｉで切断される。
［表１］
以上のように、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とプライマーセット（ａ）、（ｂ）を用いることにより、従来方法と同一の結果が得られた。これにより、制限酵素を用いることなく、バイオタイプＱの判別、特にバイオタイプＱとバイオタイプＢとの判別ができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、タバココナジラミバイオタイプ、具体的にはバイオタイプＱ、を判別することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００２７】
配列番号２で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号３で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号４で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
配列番号５で示される塩基配列は、プライマーの塩基配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）鋳型として、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料を用い、および
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む、タバココナジラミのバイオタイプの判別方法。
【請求項２】
前記部分配列が、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載の判別方法。
【請求項３】
アンチセンスプライマーとして、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１に記載の判別方法。
【請求項４】
センスプライマーとして、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項３に記載の判別方法。
【請求項５】
別のセンスプライマーとしての配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および
別のアンチセンスプライマーとしての配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項４に記載の判別方法。
【請求項６】
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１】
（１）鋳型として、タバココナジラミ由来のポリヌクレオチド試料を用い、および
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行うこと、および
（２）前記プライマーに特異的な増幅の有無を調べること
を含む、タバココナジラミのバイオタイプの判別方法。
【請求項２】
前記部分配列が、図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号２０７１の塩基および塩基番号２０８５の塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載の判別方法。
【請求項３】
アンチセンスプライマーとして、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１に記載の判別方法。
【請求項４】
センスプライマーとして、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項３に記載の判別方法。
【請求項５】
別のセンスプライマーとしての配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および
別のアンチセンスプライマーとしての配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項４に記載の判別方法。
【請求項６】
図３における配列番号１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１）で示される塩基配列において、塩基番号１４６の塩基、塩基番号１５１の塩基、塩基番号２０７の塩基、塩基番号２２８の塩基、塩基番号３０３の塩基、塩基番号３４０の塩基、塩基番号５１９の塩基、塩基番号６３４の塩基、塩基番号６４３の塩基、塩基番号６９７の塩基、塩基番号７１１の塩基、塩基番号７１５の塩基、塩基番号７１８の塩基、塩基番号７７１の塩基、塩基番号８４６の塩基、塩基番号８９７の塩基、塩基番号９０９の塩基、塩基番号９２１の塩基、塩基番号９２３の塩基、塩基番号９３０の塩基、塩基番号１１３７の塩基、塩基番号１２２３の塩基、塩基番号１３０５の塩基、塩基番号１３５９の塩基、塩基番号１４６１の塩基、塩基番号１４６５の塩基、塩基番号１４６７の塩基、塩基番号１５０３の塩基、塩基番号１６２４の塩基、塩基番号１６４６の塩基、塩基番号１６８０の塩基、塩基番号１６８１の塩基、塩基番号１６９２の塩基、塩基番号１７１３の塩基、塩基番号１７１５の塩基、塩基番号１７３３の塩基、塩基番号１７４１の塩基、塩基番号１８２１の塩基、塩基番号１９４０の塩基、塩基番号１９６０の塩基、塩基番号１９６６の塩基、塩基番号１９６９の塩基、塩基番号１９７６の塩基、塩基番号１９７７の塩基、塩基番号１９７８の塩基、塩基番号１９７９の塩基、塩基番号１９８２の塩基、塩基番号１９９６の塩基、塩基番号１９９７の塩基、塩基番号１９９８の塩基、塩基番号２００２の塩基、塩基番号２００８の塩基、塩基番号２００９の塩基、塩基番号２０１０の塩基、塩基番号２０２１の塩基、塩基番号２０３３の塩基、塩基番号２０３４の塩基、塩基番号２０３５の塩基、塩基番号２０３６の塩基、塩基番号２０４０の塩基、塩基番号２０４１の塩基、塩基番号２０４６の塩基、塩基番号２０４７の塩基、塩基番号２０５０の塩基、塩基番号２０５５の塩基、塩基番号２０７１の塩基、および塩基番号２０８５の塩基からなる群から選択される少なくとも１つの塩基を含む塩基長１０塩基以上３０塩基以下の部分塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１９３７５５（Ｐ２０１０−１９３７５５Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４０７６３（Ｐ２００９−４０７６３）
【出願日】平成２１年２月２４日（２００９．２．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８〜２０年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、新たな農林水産政策を推進する実用技術開発事業の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２４日（２００９．２．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８〜２０年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、新たな農林水産政策を推進する実用技術開発事業の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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