タンパク質の産生に使用するためのリーダー配列
本発明はタンパク質の産生のための新規リーダー配列を包含する。更に具体的には、本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列をコードするＤＮＡコンストラクト、及び短縮ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列をコードするＤＮＡコンストラクト、に関する。本発明は更に、哺乳類細胞におけるタンパク質の産生のためのこれらのＤＮＡコンストラクトの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の産生のためのリーダー配列に関する。更に具体的には、本発明は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列をコードするＤＮＡコンストラクトに関する。本発明は更に、哺乳類細胞のタンパク質を産生するためのこれらのＤＮＡコンストラクトの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．タンパク質前駆体のプロセシング
分泌型タンパク質は最初に、細胞の内側で、分泌経路への進入を保証するリーダー配列を含む前駆体型で発現する。このようなリーダー配列は、シグナルペプチドと称され、発現産物が小胞体（ＥＲ）膜を通過するよう指示する。シグナルペプチドは通常ＥＲへの移行の間にシグナルペプチダーゼで開裂する。一旦分泌経路に進入すると、タンパク質はゴルジ体に輸送される。ゴルジ体から、このタンパク質は、細胞液胞又は細胞膜のような区画へと導く異なる経路を辿ることがあり、あるいは細胞の外側に送られ、外側の培地に分泌されることもある(Pfeffer and Rothman (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 829-852)。
【０００３】
分泌型タンパク質の工業生産のために、産生されるタンパク質は宿主細胞又は宿主生物から効率的に分泌されなければならない。シグナルペプチドは、例えば、産生されるタンパク質の天然のシグナルペプチドでも、異種のシグナルペプチドでも、又は天然のシグナルペプチドと異種のシグナルペプチドのハイブリッドであってもよい。多数のシグナルペプチドが分泌型タンパク質の産生に使用されている。それらの１つとして、マウスイムノグロブリンシグナルペプチド(ＩｇＳＰ、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ１３３３１)がある。ＩｇＳＰは１９８３年にLoh等によって最初に同定された(Cell. 33: 85-93)。ＩｇＳＰは哺乳類細胞において良好な発現をもたらすことが知られている。例えば、欧州特許第０３８２７６２号は、ＩｇＳＰと西洋ワサビペルオキシダーゼとの融合ポリペプチドを構築することによる西洋ワサビペルオキシダーゼの産生方法を開示している。
【０００４】
しかしながら、現在知られているシグナルペプチドは幾つかの問題にしばしば直面している。非ヒト宿主細胞又は生物からヒトタンパク質を産生する場合に直面する１つの問題は、天然のシグナルペプチドが効率的な移行及び／又はシグナルペプチドの開裂を保証しないということである。このことは、シグナルペプチドの不正確な開裂によるタンパク質分泌の割合の低下及び／又はＮ末端伸長を示す成熟タンパク質の成熟分泌をもたらす。従って、シグナルペプチドの選択はタンパク質の工業生産にとって非常に重要である。
【０００５】
タンパク質の分泌を指示するリーダー配列に加え、前駆体型は、成熟の間に開裂する補足のリーダー配列を含んで成ることもある。これらの補足のリーダーペプチドは、プロペプチドと称され、通常シグナルペプチドに続いている。事実上全てのペプチドホルモン、多数の生物活性タンパク質（例えば、成長因子、受容体及び細胞接着分子）、並びに多数の細菌毒素及びウイルス性のエンベロープ糖タンパク質は、翻訳後に切り出された結果成熟性で且つ生物学的に活性のタンパク質を生成するプロペプチドを含んで成る(Seidah and Chretien (1999) Brain Res. 848: 45-62)。
【０００６】
プロペプチドは、前駆タンパク質転換酵素と称される酵素により開裂する。哺乳類の前駆タンパク質転換酵素には、例えば、サブチリシン転換酵素、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２及びヒューリンがある。ヒューリンは広範に発現しており、そしてトランスゴルジ網に位置している。ヒューリンはタンパク質分解的に多数の前駆タンパク質基質を分泌経路の区画内で活性化する(Thomas (2002) Nat Rev Mol Cell Biol. 3: 753-766)。更に具体的には、ヒューリンは、トランスゴルジ網、分泌経路タンパク質をそれらの最終的な目的地へと選別するのに重要な後期ゴルジ構造、例えば、細胞表面、エンドソーム、リソソーム及び分泌顆粒、に局在化している。ヒューリンが開裂する部位は広く研究されている。当該開裂部位は、共通配列Ｒ−Ｘ−Ｌ／Ｒ−Ｒ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表しうる）のカルボキシル末端のアルギニンの後に位置する(Nakayama (1997) Biochem. J 327: 625-635)。開裂効率は、Ｘがリジン、バリン、イソロイシン又はアラニンである場合に増大する(Watanabe et al (1992) J Biol. Chem. 267: 8270-8274)。
【０００７】
２．組織型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体
ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体（ｔＰＡ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７５０）は、３５アミノ酸のリーダー配列を含んで成る５６２アミノ酸の前駆体型として合成されている。このリーダー配列は、２３アミノ酸のシグナルペプチド、その後の１２アミノ酸のプロペプチドを含んで成る。
【０００８】
Kohne等(1999, J. Cell. Biochem. 75: 446-461)は、３５アミノ酸のｔＰＡリーダー配列が、全てのＮ結合型グリコシル化部位を欠失しているキメラ腫瘍壊死因子受容体−イムノグロブリンタンパク質（ＴＮＦＲ−Ｉｇ）の細胞内輸送を救助(rescue)することができたことを示した。１９９９年に、Etcheverry等は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸とｔＰＡのプロペプチド全体を含んで成る、１３アミノ酸のリーダー配列が、ＴＮＦＲ天然シグナルペプチドとＴＮＦＲ−Ｉｇポリペプチドとの間に挿入した場合にＴＮＦＲ−Ｉｇ融合体の分泌を増強することができたことを報告した(Etcheverry et al., ESACT meeting, abstract 01.07/P1. 02)。
【０００９】
従って、タンパク質のプロセシングは、効率的なタンパク質分泌にとって基本的な過程であり、リーダー配列の選択は、分泌型ポリペプチドを産生する場合に必須のステップである。多くの場合、リーダー配列は低レベルの分泌をもたらすか、又は分泌を全くもたらさず、あるいは不正確又は不完全なタンパク質分解的なプロセシングをもたらす。従って、本発明の目的は、ポリペプチドのより効率的な分泌及び／又はプロセシングを保証するリーダー配列を提供することである。
【００１０】
本発明の要約
本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列が、他の既知のリーダー配列よりも効率的に注目のタンパク質を分泌させ、そしてプロセシングすることができるという発見に基づくものである。尚、短縮型のヒトｔＰＡプロペプチドを含んで成るリーダー配列であって、ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るものが注目のタンパク質の効率的な分泌及びプロセシングを可能にすることが明らかとなった。
【００１１】
従って、本発明の第一の観点は、ｔＰＡプロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００１２】
第二の観点は、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチド（ｔＰＡ）をコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトであって、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るもの、に関する。
【００１３】
第三の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞に関する。
【００１４】
第四の観点は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法に関する。
【００１５】
第五の観点は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法に関する。
【００１６】
第六の観点は、注目のポリペプチドの産生のための本発明のＤＮＡコンストラクトの使用に関する。
【００１７】
第七の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトがコードする融合ポリペプチドに関する。
【００１８】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００１９】
配列番号２は、ヒトｔＰＡプレプロペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２０】
配列番号３は、マウスＩｇＧμ重鎖シグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２１】
配列番号４は、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２２】
配列番号５は、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２３】
配列番号６は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドの核酸配列に相当する。
【００２４】
配列番号７は、ヒトｔＰＡ−プレプロペプチドの核酸配列に相当する。
【００２５】
配列番号８は、マウスＩｇＧμ重鎖シグナルペプチドの核酸配列に相当する。
【００２６】
配列番号９は、ＴＮＦ受容体ｐ５５の可溶性部分のタンパク質配列に相当する。
【００２７】
配列番号１０は、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖のタンパク質配列に相当する。
【００２８】
配列番号１１〜２０は、Ｉｇμ重鎖シグナルペプチドを構築し、増幅するのに使用したプライマーに相当する。
【００２９】
配列番号２１〜３４は、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドを構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３０】
配列番号３５〜４１は、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドを構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３１】
配列番号４２〜４９は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３２】
配列番号５０は、ｐ５５腫瘍壊死因子の可溶性細胞外部分の核酸配列に相当する。
【００３３】
配列番号５１〜５４は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡとｔＰＡプレプロペプチド内に３つのアミノ酸欠失を導入するために使用したプライマーに相当する。
【００３４】
配列番号５５〜５８は、ｔＰＡプレプロペプチドを生成するのに使用したプライマーに相当する。
【００３５】
本発明の詳細な説明
本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列が、他の既知のリーダー配列よりも効率的に注目のタンパク質を分泌させ、そしてプロセシングすることができるという発見に由来するものである。実施例２及び３に示すように、本発明のリーダー配列は、注目のタンパク質の分泌を促進するのに、従来技術のリーダー配列よりも少なくとも２倍超効率的である。
【００３６】
尚、短縮型のヒトｔＰＡプロペプチドを含んで成るリーダー配列であって、ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るものが注目のタンパク質の効率的な分泌及びプロセシングを可能にすることが明らかとなった。
【００３７】
従って、本発明は、（ｉ）組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチド；又は（ｉｉ）カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るｔＰＡプロペプチド、を含んで成る新規リーダー配列を提供する。これらのリーダー配列を哺乳類細胞における注目のタンパク質の産生に使用することは、本発明の追加の観点である。
【００３８】
本発明の第一の観点は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「シグナルペプチド」とは、分泌経路への進入を保証するリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「プロペプチド」とは、シグナルペプチドの後のリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「プレプロペプチド」とは、シグナルペプチド及びプロペプチドを含んで成るリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「リーダー配列」とは、タンパク質の前駆体のアミノ末端に位置する配列を意味する。リーダー配列は成熟の間に開裂する。
【００４０】
更に本明細書で使用する場合、用語「ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド」は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成る本発明のリーダー配列を意味する。
【００４１】
実施例１に示すとおり、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、ＴＢＰＩと直接融合した種々のシグナルペプチドより、ＴＮＦ受容体ｐ５５（ＴＢＰＩの可溶性部分を効率的に分泌させることを保証する。実施例２は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、ＴＢＰＩ分泌の促進において、ｔＰＡプレプロペプチド単独よりも効率的である。実施例３は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖（ＩＦＮＡＲ）の分泌の促進において、天然のＩＦＮＡＲシグナルペプチドよりも効率的であることを示す。従って、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、任意な既知のリーダー配列と比較して注目のポリペプチドのより効率的な分泌を保証する。
【００４２】
異なる種に由来する多数のイムノグロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドは既知であり、そして、全て本発明の範囲内に包含されている。好ましい態様において、Ｉｇシグナルペプチドはマウスイムノグロブリンシグナルペプチドである。好ましくは、マウスＩｇシグナルペプチドは配列番号３のマウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドである。
【００４３】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、任意な起源の組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）プロペプチドをコードする配列を含んで成る。例えば、当該ＤＮＡコンストラクトは、ヒト、マウス、ラット又はウシ起源のｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。好ましくは、当該ＤＮＡコンストラクトは、ヒト起源のｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。
【００４４】
更なる態様において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成る、ヒトｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。そのようなプロペプチドは、天然のヒトｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端側アミノ酸を欠いている短縮型プロペプチドに相当する（図１を参照のこと）。好ましくは、ヒトｔＰＡプロペプチドは、配列番号２のアミノ酸２４〜３２又は配列番号２のアミノ酸２３〜３２のいずれかから成る。
【００４５】
好ましい態様において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、配列番号１を含んで成るプレプロペプチドをコードする。最も好ましい態様において、当該プレプロペプチドは配列番号１から成る。
【００４６】
用語「を含んで成る」、「から成る」、又は「本質的に〜から成る」とは、異なる意味を有する。しかしながら、各用語は、本発明の範囲を変更するために別のもので置き換えられることがある。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドＢと融合したポリペプチドＡ」との表現は、ポリペプチドＡとＢの配列を含んで成る融合ポリペプチドであって、ポリペプチドＡの配列が前記融合ポリペプチドにおいてポリペプチドＢの配列のアミノ末端に位置するものを意味する。用語「融合」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの直接的な融合に限定されない。例えば、クローニングストラテジーは、ポリペプチドＡとＢの間にアミノ酸の存在をもたらすことがある。しかしながら、ポリペプチドの直接的な融合が好ましい。融合ポリペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトを構築する方法は当業界で周知である。例えば、実施例１〜３に記載の方法を使用してもよい。
【００４８】
本発明の別の好ましい態様は、注目のポリペプチドと融合したＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトに関する。
【００４９】
本発明によると、注目のポリペプチドは、産生が望まれる任意のポリペプチドでよい。例えば、注目のポリペプチドは、例えば、天然の分泌型タンパク質、通常細胞質内にあるタンパク質、通常膜貫通しているタンパク質、又はヒト若しくはヒト化抗体であってもよい。注目のタンパク質が通常細胞質にあるタンパク質又は通常膜貫通しているタンパク質である場合、当該タンパク質は好ましくは可溶性になるように操作されている。注目のポリペプチドは、任意の起源のものでよい。好ましい注目のポリペプチドは、ヒト起源のものである。
【００５０】
好ましくは、注目のポリペプチドの最初のアミノ酸は脂肪族の疎水性アミノ酸ではない。注目の天然ポリペプチドの最初のアミノ酸が脂肪族の疎水性アミノ酸である場合、注目のタンパク質は、好ましくは、その最初のアミノ酸が脂肪族疎水性アミノ酸でないように操作されている。
【００５１】
好ましい態様において、注目のポリペプチドは、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン胎盤性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗ＣＤ１１ａ抗体、及びそれらの変異タンパク質、フラグメント、可溶性型、機能的誘導体、融合タンパク質から成る群から選択される。
【００５２】
注目の他の好ましいポリペプチドには、例えばエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子（例えば、ソマトメジンＣ）、ケラチノサイト増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、及びそれらの変異タンパク質、フラグメント、可溶性型、機能的誘導体、融合タンパク質、が含まれる。
【００５３】
本発明の第二の観点は、カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成ることを特徴とする、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００５４】
第一の態様において、本発明のｔＰＡポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２４〜３２又は配列番号２のアミノ酸２３〜３２のいずれかから成る。
【００５５】
第二の態様において、本発明のｔＰＡプロペプチドを含んで成るＤＮＡコンストラクトは、前記ｔＰＡプロペプチドと融合したシグナル配列を更に含んで成る。
【００５６】
タンパク質分泌を促進するために現在当業界で使用されている任意のシグナルペプチドを上記態様において使用することができる。そのようなシグナルペプチドには、例えば、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチド（例えば、欧州特許出願番号０１９９９６５２．９）、欧州特許出願番号０００９０６１０３．７に開示されている分泌する能力のあるポリペプチド、ヒトエリスロポエチンシグナルペプチド、ヒトアルブミンシグナルペプチド、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド及びロタウイルスＶＰ７糖タンパク質シグナルペプチドが含まれている。
【００５７】
第三の態様において、本発明のｔＰＡプロペプチドを含んで成るＤＮＡは、注目のポリペプチドと融合した前記ｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードしている。
【００５８】
好ましい態様において、本発明に従うＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド及び／又はｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトは、ベクター内に含まれている。
【００５９】
用語「ベクター」は、外因性ＤＮＡを宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製及び／又は適切な発現のために宿主細胞に外因性ＤＮＡを移動するのに有用な外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの任意な担体を意味する。
【００６０】
更に好ましい態様において、ベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」は、当該ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドの、宿主内での発現を駆動させる適切なシグナルを含んで成る。好ましくは、前記ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドは、注目のポリペプチドをコードしている。適切なシグナルには、種々の制御因子、例えば、ウイルス、哺乳類両方を起源とするエンハンサー及び／又はプロモーターが含まれる。生成物を発現する永続性の安定的な細胞クローンを確立するための、例えば、ドミナントな薬剤選択のための選択マーカーは、それらが薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付ける因子であるため、通常本発明の発現ベクター内に含まれている。
【００６１】
更に好ましい態様において、ベクターは、遺伝子活性化を実施するためのベクターである。遺伝子活性化技術は、注目の遺伝子又はｃＤＮＡを宿主細胞に導入することなく注目のタンパク質の産生を可能にする技術である（例えば、欧州特許第０５０５５００号及び第０７７９３６２号を参照のこと）。例えば、遺伝子活性化技術は、「オフポジション」に設置されている制御ＤＮＡ配列を、「オンポジション」に設置されている制御ＤＮＡ配列でバイパスさせて注目の遺伝子を活性化することもできる。遺伝子活性化ベクターは、前記宿主細胞内に存在するポリヌクレオチド配列の、宿主細胞内での発現を駆動せしめる適切なシグナルを含んで成る。
【００６２】
更に好ましい態様において、ベクターは遺伝子治療ベクターである。遺伝子治療に使用されうる発現ベクターは当業界で周知である。好ましくは、遺伝子治療ベクターは、レンチウイルス由来ベクターであり、これは、遺伝子の移動、特にＣＮＳ内での移動が非常に効率的であることが証明されている。他の十分に確立されているウイルスベクター、例えばアデノウイルス由来ベクターも本発明において使用することができる。
【００６３】
本発明の第三の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞に関する。多くの宿主細胞が本発明に適しており、例えば、広範な真核生物由来の初代又は樹立細胞系、例えば植物細胞、動物細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は真核細胞である。最も好ましくは、前記宿主細胞は哺乳類細胞である。
【００６４】
例えば、適当な宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞等、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ベロ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞又は他の不死化細胞及び／又は形質転換細胞が含まれる。
【００６５】
好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、そしてより好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞であり、これらは例えばShotwellらによって説明されている(1982, J Biol. Chem. 257: 2974-2980)。
【００６６】
第四の観点において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法に関する。
【００６７】
第五の観点において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法に関する。
【００６８】
本発明の上記方法は、注目のタンパク質の分泌をもたらし、これは細胞培養上清から採集することができる。目的の用途に応じて、細胞が合成するポリペプチドは、本発明の方法の産物であってもよい。
【００６９】
好ましい態様において、これらの方法は、更に、注目のポリペプチドを宿主細胞から単離するステップを含んで成る。このステップは、注目のタンパク質が細胞培養上清から単純に単離することができるので、特に有利であり、そして実施が容易である。
【００７０】
これらの方法は、一過性、安定、エピソーム又はウイルスの発現系において使用することができる。好ましい態様いおいて、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。
【００７１】
第六の観点において、本発明のＤＮＡコンストラクトは注目のポリペプチドの産生のために使用される。
【００７２】
本発明の第七の観点は、注目のポリペプチドと融合した本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド及び／又はｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドに関する。
【００７３】
本発明をこれまで十分に説明してきたが、当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験無しに、広範な同等のパラメーター内で同様のことを実施することができることを理解するであろう。
【００７４】
本発明はその特定の態様に関連して説明してあるが、他の態様も可能であることが理解されるであろう。本願は、任意の変更、使用又は応用を網羅することが意図され、これは通常、本発明の原理に従い、且つ、本発明の当業界で公知又は通常の慣行となっているような、そして特許請求の範囲に記載の必須の特徴に適用することができるような、本願の開示から逸脱しているようなものを含む。
【００７５】
本明細書で引用する全ての文献、例えば学術論文又は抄録、公開された又は公開されていない特許出願、交付済みの特許又は任意な他の文献は、本明細書で引用することにより全体的に組み入れられ、引用文献に存在している全てのデータ、表、図及びテキストが含まれる。更に、本明細書で引用する引用文県内で引用された文献の全内容も、引用により全体的に組み入れられる。
【００７６】
既知の方法のステップ、常用の方法のステップ、既知の方法又は常用の方法に対する言及は、本発明のあらゆる観点、記載又は態様が関連技術において開示され、教示され、又は示唆されていることを何ら認めるものではない。
【００７７】
特定の態様の前記記載は、当業界の技術範囲内の知識（例えば、本明細書で引用する文献の内容）を利用することにより、過度の実験無しに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の態様を容易に修飾することができ、そして／あるいは種々の利用に適合させることができるという本発明の一般的な性質を非常に十分に明らかにしている。従って、そのような適用及び修飾は、本明細書で提示する教示及び手引きを基に、開示された態様の同等の意味及び範囲の中にあることが意図される。本明細書の語法又は用語は、説明を目的とするものであり、限定するためではなく、その結果、本明細書の語法又は用語は、本明細書で提示する教示及び手引きに照らして、当業者の知識と組み合わせて、当業者により解釈されるべきある。
【実施例】
【００７８】
実施例１：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドと、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、マウスイムノグロブリンシグナルペプチドとの比較
１．１．構築
１．１．１ ＩｇＳＰ
配列番号３のマウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチド（ＩｇＳＰ）を以下のようにクローニングした。配列番号１３〜２０のプライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Stratagene)と一緒に２時間３０分３７℃でインキュベートし、そして７５℃で１０分間熱不活性化した。処理済のプライマーは、StratageneのＰｆｕリガーゼを用い、取扱説明書で推奨されているものに従い、以下のサイクル条件でサイクルライゲーションを用いてライゲーションした：
−９５℃で１分間
−９５℃で３０秒間、５７℃で９０秒間、７０℃で２分間を４０サイクル
−７０℃で１０分間
【００７９】
アニーリングしたオリゴを続いてＱＩＡｑｕｉｃｋカラムで精製し、そして配列番号１３〜１７のプライマーを用い、以下のＰＣＲ条件下ＰＦＵターボでＰＣＲ増幅した：
−９５℃で５分間
−９５℃で４５秒間、７０℃で４５秒間を３０サイクル
−７０℃で１０分間
【００８０】
ＰＣＲ産物を精製し、そしてＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩで消化し、そしてｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１３８０ベクター（図２）内にクローニングした。当該産物を配列決定し、そして予想した配列を反映していることが明らかとなった。
【００８１】
１．１．２ ＧＨ＿ＳＰ
配列番号４のヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ＧＨ＿ＳＰ）を、配列番号２１〜３４のプライマーを用いてクローニングした。プライマーは上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号２１と３４のプライマーを用いて再び増幅した。当該産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８２】
１．１．３ ＳＥＡＰ＿ＳＰ
配列番号５のヒト分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ＿ＳＰ）を、配列番号３５〜４１のプライマーを用いてクローニングした。プライマーは上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号３５と４０のプライマーを用いて再び増幅した。当該産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８３】
１．１．４ Ｉｇ−ｔＰＡ
本研究のＩｇＳＰ−ｔＰＡは、（ｉ）マウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドと、これと融合した（ｉｉ）天然のｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端アミノ酸を欠失している短縮型ｔＰＡプロペプチド、を含んで成る。このＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、配列番号１に示すとおりである。このＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを以下のとおりクローニングした。
【００８４】
配列番号４２〜４９のプライマーは、上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号４５と４９のプライマーを用いて再び増幅した。精製したＰＣＲ産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８５】
組換えＰＣＲは、既知のｔＰＡプロペプチドから３つのアミノ酸（ＧＡＲ）を欠失させるために実施した。このコンストラクトの５’末端は、配列番号５１と５２のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そして３’末端は配列番号５３と５４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。完全長のＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトは、配列番号５１と５４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そして２つの組換え産物がこれまでのＰＣＲから得られた。
【００８６】
１．１．５．上記リーダー配列のＴＢＰＩに対する融合
上記リーダー配列を、ＴＮＦ受容体ｐ５５タンパク質（ＴＢＰＩ、配列番号５０）の可溶性部分に融合させた。ヒト伸長因子１（ＥＦ１）プロモーターのもとでのＴＢＰＩの発現を可能にするｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１４０３ベクター（図３）をＮｃｏ−Ｉ及びＸｂａ−Ｉで消化した。リーダー配列をコードしているフラグメントをＮｃｏ−Ｉフラグメント又はＢｓａ−Ｉ−Ｘｂａ−ＩフラグメントとしてｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１４０３内にサブクローニングした。生じたＩｇＳＰ−ＴＢＰＩ、ＧＨ＿ＳＰ−ＴＢＰＩ ＳＥＡＰ＿ＳＰ−ＴＢＰＩ及びＩｇＳＰ−ｔＰＡコンストラクトを配列決定し、そしてこれらが予想した配列を反映していることが明らかとなった。
【００８７】
１．２ タンパク質分泌の測定
各コンストラクトを、標準的な研究マニュアル（Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の標準的な脂質媒介型のトランスフェクションを用い、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、培地と細胞を採集した。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、そしてペレットを氷上で３００μｌのCytobusterバッファー(Novagen)を用い、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)の存在下で溶解させた。細胞片を、４℃で１０分間、１６０００ｇでの遠心により沈降させた。上清を採集し、そして処理する前に−２０℃で維持した。上清又は細胞内区画中に放出されたＴＢＰＩの量をＥＬＩＳＡで解析した。ＴＢＰＩの相対的な発現を測定し、そして報告した。
【００８８】
実験結果を図４に示す。ＩｇＳＰ−ｔＰＡシグナルプロペプチドは、細胞からのＴＢＰＩの分泌を促進することができ、これは上清中で検出されたＴＢＰＩの量の増大対細胞内区画で検出されたＴＢＰＩの量により証明される。従って、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプロペプチドと融合したＴＢＰＩを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトは、ＩｇＳＰシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド又は成長ホルモンシグナルペプチド、と融合したＴＢＰＩタンパク質に相当するコンストラクトと比較して、ＴＢＰＩの分泌を増大させる。
【００８９】
実施例２：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドとｔＰＡプレプロペプチドとの比較
２．１ 構築
２．１．１．ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ
１．１．５に記載のＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトをＸｂａ−Ｉで消化した。ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩを含んで成るフラグメントを、Ｎｃｏ−Ｉ及びＸｂａ−Ｉで消化したｐｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３発現ベクター（図５）内にクローニングした。
【００９０】
２．１．２．ｔＰＡ−ＴＢＰＩ
（ｉ）ｔＰＡシグナルペプチド、及び（ｉｉ）天然のｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端のアミノ酸を欠失している短縮型ｔＰＡプロペプチド、を含んで成る配列番号２のｔＰＡプレプロペプチドは以下のとおり生成させた。
【００９１】
ヒトｔＰＡプレプロペプチドは、鋳型としてＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトを用いることによりクローニングした。最初のＰＣＲを配列番号５５と５６のプライマーを用いて実施し、ｔＰＡプロペプチド及びＴＢＰＩの５’末端を増幅させた。２回目のＰＣＲにおいて、第一段階由来のＰＣＲ産物を、配列番号５７と５８と５６とを用いた再増幅により伸長させた。続いて、ＰＣＲ産物を、Ｂｇｌ−ＩＩとＢｓｒＧＩで消化したｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１３８０ベクター（図２）内にクローニングした。組換えＰＣＲを１．１．４．に記載のとおり実施し、プライマーには配列番号５１〜５４を用い、既知のｔＰＡプロペプチド内に３つのアミノ酸（ＧＡＲ）の内部欠失を導入した。
【００９２】
生じたｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトをＢｓａ−ＩとＸｂａ−Ｉで消化した。ｔＰＡ−ＴＢＰＩを含んで成るフラグメントを、Ｎｃｏ−ＩとＸｂａ−Ｉで消化したｐ又はＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３発現ベクター内にクローニングした。
【００９３】
２．２．タンパク質分泌の測定
ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミンを用いてＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトとｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトでトランスフェクションした。一連の実験において、ＴＢＰＩ発現ベクターを、選択用のＳＶ４０ｎｅｏベクターとＳＶ４０ｐｕｒｏベクターと同時トランスフェクションした。別の系においては、ＴＢＰＩ発現ベクターは、ＳＶ４０ｄｈｆｒベクターとＳＶ４０ｐｕｒｏベクターと一緒に同時トランスフェクションした。少なくとも１００クローンを表している安定発現クローンのプールは、異なる選択培地中で広げられた（６００μｇ・ｍｌ-1ネオマイシン、６μｇ・ｍｌ-1ピューロマイシン又はＨＴ＋６μｇ・ｍｌ-1ピューロマイシン）。プールを分割し、そして細胞をＦＣＳ含有培地又は無血清培地中で播種した。培地を４８時間後に採集し、そして上清中に放出されたＴＢＰＩの量をＥＬＩＳＡを用いて決定した。この実験結果を図６に示す。各棒はプールを表す。白棒と黒棒は、３７℃で１０％ＦＣＳを含む媒地中での４８時間の２つの異なるパルスを表す。斜線入りの四角と方眼入りの棒は、無血清培地中での３２℃での４８時間の２つの異なるパルスを表す。播種した細胞の最初の数とパルス期間は各実験において同様である。
【００９４】
図６は、研究した全ての条件で、ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞のプールがｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞のプールよりも高い力価を有することを示した。この結果は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡコンストラクトが、生成する分泌型タンパク質の量の点でｔＰＡコンストラクトよりも少なくとも２倍優れていることを示す。
【００９５】
従って、ｔＰＡプロペプチドとＩｇＳＰシグナルペプチドとの新規な組み合わせは、ｔＰＡ−プレプロペプチドよりもタンパク質分泌を促進するのにより効率的である。
【００９６】
尚、ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞から分泌されるＴＢＰＩタンパク質のＮ末端側の配列は、エドマン分解を用いたＮ末端配列決定により決定した。これにより、１００％のタンパク質がｔＰＡの最後のアルギニン残基の後で開裂していたことが明らかとなった。このように、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、効率的で且つ信頼性のあるポリペプチドのプロセシングを保証する。
【００９７】
実施例３：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドとインターフェロンガンマの産生用インターフェロンガンマ受容体シグナルペプチドとの比較
３．１．コンストラクト
ＩｇＳＰプレプロペプチドを、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖（ＩＦＮＡＲ）に融合させ、そして（ｉ）ｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクター（図３）；又は（ｉｉ）欧州特許出願０３１００６１７．４に記載のｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターを含んで成る発現ベクター、の中にクローニングした。
【００９８】
天然のシグナルペプチドを含んで成る完全長ＩＦＮＡＲを、（ｉ）ｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクター；又は（ｉｉ）欧州特許出願０３１００６１７．４に記載のｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターを含んで成るベクター、の中にクローニングした。
【００９９】
３．２．タンパク質分泌の測定
３．２．１．プロトコール
コンストラクトを、標準的な脂質媒介型のトランスフェクションプロトコールを用いてＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。分泌型タンパク質を４８時間後に採集した。特異的ＥＬＩＳＡ試験を用い、上清中に分泌型されたＩＦＮＡＲの量を定量した。トランスフェクションは、ＩＦＮＡＲベクターで同時トランスフェクションしたルシフェラーゼコンストラクトで正規化した。標準的なルシフェラーゼアッセイは、標準的な研究マニュアル（Maniatis et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載のとおりに使用した。
【０１００】
３．２．１．ＣＭＶベクターを含んで成るコンストラクト
ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、上清中のＩＦＮＡＲタンパク質の分泌の促進において、天然のシグナルペプチドよりも約２．３倍効率的であった。
【０１０１】
３．２．２．ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子を含んで成るコンストラクト
ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、上清中のＩＦＮＡＲタンパク質の分泌の促進において、天然のシグナルペプチドよりも約４．３倍効率的であった。
【０１０２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、本発明のＩｇＳＰ−プレプロペプチド（配列番号１）と天然のｔＰＡプレプロペプチド（配列番号２）とのアラインメントを示す。
【図２】図２は、ＴＢＰＩタンパク質に融合した異なるシグナルペプチドを構築するために使用したｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰ−１３８０ベクターのスキームを示す。
【図３】図３は、一過性トランスフェクションアッセイにおいてリーダーペプチド−ＴＢＰＩ融合タンパク質を発現するために使用したｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰ−１４０３ベクターのスキームを示す。
【図４】図４は、図示したコンストラクトをトランスフェクションした細胞の上清対細胞質で検出されたＴＢＰＩタンパク質の量を示す。レーンＧＨ＿ＳＰ：成長ホルモンシグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＳＥＡＰ＿ＳＰ：分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＩｇＳＰ：マウスイムノグロブリンＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＩｇＳＰ−ｔＰＡ：本発明のＩｇＳＰプレプロペプチドと融合したＴＢＰＩ。
【図５】図５は、安定なトランスフェクションアッセイにおいてリーダーペプチド−ＴＢＰＩ融合タンパク質を発現させるために使用したＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクターのスキームに相当する。
【図６】図６は、ＴＢＰＩと融合したＩｇＳＰ−ｔＰＡ又はｔＰＡ−ｔＰＡプレプロペプチドでトランスフェクションしたクローンのプールの上清中で検出されたＴＢＰＩタンパク質の量を示す。プールは、ピューロマイシンとネオマイシンとの同時選択（ｎｅｏ／ｐｕｒｏ）、又はピューロマイシンマイナス−ヒポキサンチン−チミジンによる同時選択（ＨＴ／ｐｕｒｏ）のいずれかで維持した。白棒と黒棒は、３７℃で１０％ＦＣＳを含む媒地中での４８時間の２つの異なるパルスを表す。斜線入りの四角と方眼入りの棒は、無血清培地中での３２℃での４８時間の２つの異なるパルスを表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の産生のためのリーダー配列に関する。更に具体的には、本発明は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列をコードするＤＮＡコンストラクトに関する。本発明は更に、哺乳類細胞のタンパク質を産生するためのこれらのＤＮＡコンストラクトの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．タンパク質前駆体のプロセシング
分泌型タンパク質は最初に、細胞の内側で、分泌経路への進入を保証するリーダー配列を含む前駆体型で発現する。このようなリーダー配列は、シグナルペプチドと称され、発現産物が小胞体（ＥＲ）膜を通過するよう指示する。シグナルペプチドは通常ＥＲへの移行の間にシグナルペプチダーゼで開裂する。一旦分泌経路に進入すると、タンパク質はゴルジ体に輸送される。ゴルジ体から、このタンパク質は、細胞液胞又は細胞膜のような区画へと導く異なる経路を辿ることがあり、あるいは細胞の外側に送られ、外側の培地に分泌されることもある(Pfeffer and Rothman (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 829-852)。
【０００３】
分泌型タンパク質の工業生産のために、産生されるタンパク質は宿主細胞又は宿主生物から効率的に分泌されなければならない。シグナルペプチドは、例えば、産生されるタンパク質の天然のシグナルペプチドでも、異種のシグナルペプチドでも、又は天然のシグナルペプチドと異種のシグナルペプチドのハイブリッドであってもよい。多数のシグナルペプチドが分泌型タンパク質の産生に使用されている。それらの１つとして、マウスイムノグロブリンシグナルペプチド(ＩｇＳＰ、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ１３３３１)がある。ＩｇＳＰは１９８３年にLoh等によって最初に同定された(Cell. 33: 85-93)。ＩｇＳＰは哺乳類細胞において良好な発現をもたらすことが知られている。例えば、欧州特許第０３８２７６２号は、ＩｇＳＰと西洋ワサビペルオキシダーゼとの融合ポリペプチドを構築することによる西洋ワサビペルオキシダーゼの産生方法を開示している。
【０００４】
しかしながら、現在知られているシグナルペプチドは幾つかの問題にしばしば直面している。非ヒト宿主細胞又は生物からヒトタンパク質を産生する場合に直面する１つの問題は、天然のシグナルペプチドが効率的な移行及び／又はシグナルペプチドの開裂を保証しないということである。このことは、シグナルペプチドの不正確な開裂によるタンパク質分泌の割合の低下及び／又はＮ末端伸長を示す成熟タンパク質の成熟分泌をもたらす。従って、シグナルペプチドの選択はタンパク質の工業生産にとって非常に重要である。
【０００５】
タンパク質の分泌を指示するリーダー配列に加え、前駆体型は、成熟の間に開裂する補足のリーダー配列を含んで成ることもある。これらの補足のリーダーペプチドは、プロペプチドと称され、通常シグナルペプチドに続いている。事実上全てのペプチドホルモン、多数の生物活性タンパク質（例えば、成長因子、受容体及び細胞接着分子）、並びに多数の細菌毒素及びウイルス性のエンベロープ糖タンパク質は、翻訳後に切り出された結果成熟性で且つ生物学的に活性のタンパク質を生成するプロペプチドを含んで成る(Seidah and Chretien (1999) Brain Res. 848: 45-62)。
【０００６】
プロペプチドは、前駆タンパク質転換酵素と称される酵素により開裂する。哺乳類の前駆タンパク質転換酵素には、例えば、サブチリシン転換酵素、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２及びヒューリンがある。ヒューリンは広範に発現しており、そしてトランスゴルジ網に位置している。ヒューリンはタンパク質分解的に多数の前駆タンパク質基質を分泌経路の区画内で活性化する(Thomas (2002) Nat Rev Mol Cell Biol. 3: 753-766)。更に具体的には、ヒューリンは、トランスゴルジ網、分泌経路タンパク質をそれらの最終的な目的地へと選別するのに重要な後期ゴルジ構造、例えば、細胞表面、エンドソーム、リソソーム及び分泌顆粒、に局在化している。ヒューリンが開裂する部位は広く研究されている。当該開裂部位は、共通配列Ｒ−Ｘ−Ｌ／Ｒ−Ｒ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表しうる）のカルボキシル末端のアルギニンの後に位置する(Nakayama (1997) Biochem. J 327: 625-635)。開裂効率は、Ｘがリジン、バリン、イソロイシン又はアラニンである場合に増大する(Watanabe et al (1992) J Biol. Chem. 267: 8270-8274)。
【０００７】
２．組織型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体
ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体（ｔＰＡ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７５０）は、３５アミノ酸のリーダー配列を含んで成る５６２アミノ酸の前駆体型として合成されている。このリーダー配列は、２３アミノ酸のシグナルペプチド、その後の１２アミノ酸のプロペプチドを含んで成る。
【０００８】
Kohne等(1999, J. Cell. Biochem. 75: 446-461)は、３５アミノ酸のｔＰＡリーダー配列が、全てのＮ結合型グリコシル化部位を欠失しているキメラ腫瘍壊死因子受容体−イムノグロブリンタンパク質（ＴＮＦＲ−Ｉｇ）の細胞内輸送を救助(rescue)することができたことを示した。１９９９年に、Etcheverry等は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸とｔＰＡのプロペプチド全体を含んで成る、１３アミノ酸のリーダー配列が、ＴＮＦＲ天然シグナルペプチドとＴＮＦＲ−Ｉｇポリペプチドとの間に挿入した場合にＴＮＦＲ−Ｉｇ融合体の分泌を増強することができたことを報告した(Etcheverry et al., ESACT meeting, abstract 01.07/P1. 02)。
【０００９】
従って、タンパク質のプロセシングは、効率的なタンパク質分泌にとって基本的な過程であり、リーダー配列の選択は、分泌型ポリペプチドを産生する場合に必須のステップである。多くの場合、リーダー配列は低レベルの分泌をもたらすか、又は分泌を全くもたらさず、あるいは不正確又は不完全なタンパク質分解的なプロセシングをもたらす。従って、本発明の目的は、ポリペプチドのより効率的な分泌及び／又はプロセシングを保証するリーダー配列を提供することである。
【００１０】
本発明の要約
本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列が、他の既知のリーダー配列よりも効率的に注目のタンパク質を分泌させ、そしてプロセシングすることができるという発見に基づくものである。尚、短縮型のヒトｔＰＡプロペプチドを含んで成るリーダー配列であって、ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るものが注目のタンパク質の効率的な分泌及びプロセシングを可能にすることが明らかとなった。
【００１１】
従って、本発明の第一の観点は、ｔＰＡプロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００１２】
第二の観点は、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチド（ｔＰＡ）をコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトであって、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るもの、に関する。
【００１３】
第三の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞に関する。
【００１４】
第四の観点は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法に関する。
【００１５】
第五の観点は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法に関する。
【００１６】
第六の観点は、注目のポリペプチドの産生のための本発明のＤＮＡコンストラクトの使用に関する。
【００１７】
第七の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトがコードする融合ポリペプチドに関する。
【００１８】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００１９】
配列番号２は、ヒトｔＰＡプレプロペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２０】
配列番号３は、マウスＩｇＧμ重鎖シグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２１】
配列番号４は、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２２】
配列番号５は、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドのタンパク質配列に相当する。
【００２３】
配列番号６は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドの核酸配列に相当する。
【００２４】
配列番号７は、ヒトｔＰＡ−プレプロペプチドの核酸配列に相当する。
【００２５】
配列番号８は、マウスＩｇＧμ重鎖シグナルペプチドの核酸配列に相当する。
【００２６】
配列番号９は、ＴＮＦ受容体ｐ５５の可溶性部分のタンパク質配列に相当する。
【００２７】
配列番号１０は、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖のタンパク質配列に相当する。
【００２８】
配列番号１１〜２０は、Ｉｇμ重鎖シグナルペプチドを構築し、増幅するのに使用したプライマーに相当する。
【００２９】
配列番号２１〜３４は、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドを構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３０】
配列番号３５〜４１は、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドを構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３１】
配列番号４２〜４９は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド構築し、増幅するために使用したプライマーに相当する。
【００３２】
配列番号５０は、ｐ５５腫瘍壊死因子の可溶性細胞外部分の核酸配列に相当する。
【００３３】
配列番号５１〜５４は、本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡとｔＰＡプレプロペプチド内に３つのアミノ酸欠失を導入するために使用したプライマーに相当する。
【００３４】
配列番号５５〜５８は、ｔＰＡプレプロペプチドを生成するのに使用したプライマーに相当する。
【００３５】
本発明の詳細な説明
本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るリーダー配列が、他の既知のリーダー配列よりも効率的に注目のタンパク質を分泌させ、そしてプロセシングすることができるという発見に由来するものである。実施例２及び３に示すように、本発明のリーダー配列は、注目のタンパク質の分泌を促進するのに、従来技術のリーダー配列よりも少なくとも２倍超効率的である。
【００３６】
尚、短縮型のヒトｔＰＡプロペプチドを含んで成るリーダー配列であって、ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るものが注目のタンパク質の効率的な分泌及びプロセシングを可能にすることが明らかとなった。
【００３７】
従って、本発明は、（ｉ）組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチド；又は（ｉｉ）カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るｔＰＡプロペプチド、を含んで成る新規リーダー配列を提供する。これらのリーダー配列を哺乳類細胞における注目のタンパク質の産生に使用することは、本発明の追加の観点である。
【００３８】
本発明の第一の観点は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「シグナルペプチド」とは、分泌経路への進入を保証するリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「プロペプチド」とは、シグナルペプチドの後のリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「プレプロペプチド」とは、シグナルペプチド及びプロペプチドを含んで成るリーダー配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「リーダー配列」とは、タンパク質の前駆体のアミノ末端に位置する配列を意味する。リーダー配列は成熟の間に開裂する。
【００４０】
更に本明細書で使用する場合、用語「ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド」は、組織型プラスミノーゲンアチベータープロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成る本発明のリーダー配列を意味する。
【００４１】
実施例１に示すとおり、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、ＴＢＰＩと直接融合した種々のシグナルペプチドより、ＴＮＦ受容体ｐ５５（ＴＢＰＩの可溶性部分を効率的に分泌させることを保証する。実施例２は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、ＴＢＰＩ分泌の促進において、ｔＰＡプレプロペプチド単独よりも効率的である。実施例３は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖（ＩＦＮＡＲ）の分泌の促進において、天然のＩＦＮＡＲシグナルペプチドよりも効率的であることを示す。従って、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、任意な既知のリーダー配列と比較して注目のポリペプチドのより効率的な分泌を保証する。
【００４２】
異なる種に由来する多数のイムノグロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドは既知であり、そして、全て本発明の範囲内に包含されている。好ましい態様において、Ｉｇシグナルペプチドはマウスイムノグロブリンシグナルペプチドである。好ましくは、マウスＩｇシグナルペプチドは配列番号３のマウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドである。
【００４３】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、任意な起源の組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）プロペプチドをコードする配列を含んで成る。例えば、当該ＤＮＡコンストラクトは、ヒト、マウス、ラット又はウシ起源のｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。好ましくは、当該ＤＮＡコンストラクトは、ヒト起源のｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。
【００４４】
更なる態様において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成る、ヒトｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成る。そのようなプロペプチドは、天然のヒトｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端側アミノ酸を欠いている短縮型プロペプチドに相当する（図１を参照のこと）。好ましくは、ヒトｔＰＡプロペプチドは、配列番号２のアミノ酸２４〜３２又は配列番号２のアミノ酸２３〜３２のいずれかから成る。
【００４５】
好ましい態様において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、配列番号１を含んで成るプレプロペプチドをコードする。最も好ましい態様において、当該プレプロペプチドは配列番号１から成る。
【００４６】
用語「を含んで成る」、「から成る」、又は「本質的に〜から成る」とは、異なる意味を有する。しかしながら、各用語は、本発明の範囲を変更するために別のもので置き換えられることがある。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドＢと融合したポリペプチドＡ」との表現は、ポリペプチドＡとＢの配列を含んで成る融合ポリペプチドであって、ポリペプチドＡの配列が前記融合ポリペプチドにおいてポリペプチドＢの配列のアミノ末端に位置するものを意味する。用語「融合」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの直接的な融合に限定されない。例えば、クローニングストラテジーは、ポリペプチドＡとＢの間にアミノ酸の存在をもたらすことがある。しかしながら、ポリペプチドの直接的な融合が好ましい。融合ポリペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトを構築する方法は当業界で周知である。例えば、実施例１〜３に記載の方法を使用してもよい。
【００４８】
本発明の別の好ましい態様は、注目のポリペプチドと融合したＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトに関する。
【００４９】
本発明によると、注目のポリペプチドは、産生が望まれる任意のポリペプチドでよい。例えば、注目のポリペプチドは、例えば、天然の分泌型タンパク質、通常細胞質内にあるタンパク質、通常膜貫通しているタンパク質、又はヒト若しくはヒト化抗体であってもよい。注目のタンパク質が通常細胞質にあるタンパク質又は通常膜貫通しているタンパク質である場合、当該タンパク質は好ましくは可溶性になるように操作されている。注目のポリペプチドは、任意の起源のものでよい。好ましい注目のポリペプチドは、ヒト起源のものである。
【００５０】
好ましくは、注目のポリペプチドの最初のアミノ酸は脂肪族の疎水性アミノ酸ではない。注目の天然ポリペプチドの最初のアミノ酸が脂肪族の疎水性アミノ酸である場合、注目のタンパク質は、好ましくは、その最初のアミノ酸が脂肪族疎水性アミノ酸でないように操作されている。
【００５１】
好ましい態様において、注目のポリペプチドは、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン胎盤性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗ＣＤ１１ａ抗体、及びそれらの変異タンパク質、フラグメント、可溶性型、機能的誘導体、融合タンパク質から成る群から選択される。
【００５２】
注目の他の好ましいポリペプチドには、例えばエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子（例えば、ソマトメジンＣ）、ケラチノサイト増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、及びそれらの変異タンパク質、フラグメント、可溶性型、機能的誘導体、融合タンパク質、が含まれる。
【００５３】
本発明の第二の観点は、カルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成ることを特徴とする、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトに関する。
【００５４】
第一の態様において、本発明のｔＰＡポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２４〜３２又は配列番号２のアミノ酸２３〜３２のいずれかから成る。
【００５５】
第二の態様において、本発明のｔＰＡプロペプチドを含んで成るＤＮＡコンストラクトは、前記ｔＰＡプロペプチドと融合したシグナル配列を更に含んで成る。
【００５６】
タンパク質分泌を促進するために現在当業界で使用されている任意のシグナルペプチドを上記態様において使用することができる。そのようなシグナルペプチドには、例えば、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチド（例えば、欧州特許出願番号０１９９９６５２．９）、欧州特許出願番号０００９０６１０３．７に開示されている分泌する能力のあるポリペプチド、ヒトエリスロポエチンシグナルペプチド、ヒトアルブミンシグナルペプチド、ヒト分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド及びロタウイルスＶＰ７糖タンパク質シグナルペプチドが含まれている。
【００５７】
第三の態様において、本発明のｔＰＡプロペプチドを含んで成るＤＮＡは、注目のポリペプチドと融合した前記ｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードしている。
【００５８】
好ましい態様において、本発明に従うＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド及び／又はｔＰＡプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトは、ベクター内に含まれている。
【００５９】
用語「ベクター」は、外因性ＤＮＡを宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製及び／又は適切な発現のために宿主細胞に外因性ＤＮＡを移動するのに有用な外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの任意な担体を意味する。
【００６０】
更に好ましい態様において、ベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」は、当該ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドの、宿主内での発現を駆動させる適切なシグナルを含んで成る。好ましくは、前記ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドは、注目のポリペプチドをコードしている。適切なシグナルには、種々の制御因子、例えば、ウイルス、哺乳類両方を起源とするエンハンサー及び／又はプロモーターが含まれる。生成物を発現する永続性の安定的な細胞クローンを確立するための、例えば、ドミナントな薬剤選択のための選択マーカーは、それらが薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付ける因子であるため、通常本発明の発現ベクター内に含まれている。
【００６１】
更に好ましい態様において、ベクターは、遺伝子活性化を実施するためのベクターである。遺伝子活性化技術は、注目の遺伝子又はｃＤＮＡを宿主細胞に導入することなく注目のタンパク質の産生を可能にする技術である（例えば、欧州特許第０５０５５００号及び第０７７９３６２号を参照のこと）。例えば、遺伝子活性化技術は、「オフポジション」に設置されている制御ＤＮＡ配列を、「オンポジション」に設置されている制御ＤＮＡ配列でバイパスさせて注目の遺伝子を活性化することもできる。遺伝子活性化ベクターは、前記宿主細胞内に存在するポリヌクレオチド配列の、宿主細胞内での発現を駆動せしめる適切なシグナルを含んで成る。
【００６２】
更に好ましい態様において、ベクターは遺伝子治療ベクターである。遺伝子治療に使用されうる発現ベクターは当業界で周知である。好ましくは、遺伝子治療ベクターは、レンチウイルス由来ベクターであり、これは、遺伝子の移動、特にＣＮＳ内での移動が非常に効率的であることが証明されている。他の十分に確立されているウイルスベクター、例えばアデノウイルス由来ベクターも本発明において使用することができる。
【００６３】
本発明の第三の観点は、本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞に関する。多くの宿主細胞が本発明に適しており、例えば、広範な真核生物由来の初代又は樹立細胞系、例えば植物細胞、動物細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は真核細胞である。最も好ましくは、前記宿主細胞は哺乳類細胞である。
【００６４】
例えば、適当な宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞等、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ベロ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞又は他の不死化細胞及び／又は形質転換細胞が含まれる。
【００６５】
好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、そしてより好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞であり、これらは例えばShotwellらによって説明されている(1982, J Biol. Chem. 257: 2974-2980)。
【００６６】
第四の観点において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法に関する。
【００６７】
第五の観点において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法に関する。
【００６８】
本発明の上記方法は、注目のタンパク質の分泌をもたらし、これは細胞培養上清から採集することができる。目的の用途に応じて、細胞が合成するポリペプチドは、本発明の方法の産物であってもよい。
【００６９】
好ましい態様において、これらの方法は、更に、注目のポリペプチドを宿主細胞から単離するステップを含んで成る。このステップは、注目のタンパク質が細胞培養上清から単純に単離することができるので、特に有利であり、そして実施が容易である。
【００７０】
これらの方法は、一過性、安定、エピソーム又はウイルスの発現系において使用することができる。好ましい態様いおいて、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。
【００７１】
第六の観点において、本発明のＤＮＡコンストラクトは注目のポリペプチドの産生のために使用される。
【００７２】
本発明の第七の観点は、注目のポリペプチドと融合した本発明のＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチド及び／又はｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドに関する。
【００７３】
本発明をこれまで十分に説明してきたが、当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験無しに、広範な同等のパラメーター内で同様のことを実施することができることを理解するであろう。
【００７４】
本発明はその特定の態様に関連して説明してあるが、他の態様も可能であることが理解されるであろう。本願は、任意の変更、使用又は応用を網羅することが意図され、これは通常、本発明の原理に従い、且つ、本発明の当業界で公知又は通常の慣行となっているような、そして特許請求の範囲に記載の必須の特徴に適用することができるような、本願の開示から逸脱しているようなものを含む。
【００７５】
本明細書で引用する全ての文献、例えば学術論文又は抄録、公開された又は公開されていない特許出願、交付済みの特許又は任意な他の文献は、本明細書で引用することにより全体的に組み入れられ、引用文献に存在している全てのデータ、表、図及びテキストが含まれる。更に、本明細書で引用する引用文県内で引用された文献の全内容も、引用により全体的に組み入れられる。
【００７６】
既知の方法のステップ、常用の方法のステップ、既知の方法又は常用の方法に対する言及は、本発明のあらゆる観点、記載又は態様が関連技術において開示され、教示され、又は示唆されていることを何ら認めるものではない。
【００７７】
特定の態様の前記記載は、当業界の技術範囲内の知識（例えば、本明細書で引用する文献の内容）を利用することにより、過度の実験無しに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の態様を容易に修飾することができ、そして／あるいは種々の利用に適合させることができるという本発明の一般的な性質を非常に十分に明らかにしている。従って、そのような適用及び修飾は、本明細書で提示する教示及び手引きを基に、開示された態様の同等の意味及び範囲の中にあることが意図される。本明細書の語法又は用語は、説明を目的とするものであり、限定するためではなく、その結果、本明細書の語法又は用語は、本明細書で提示する教示及び手引きに照らして、当業者の知識と組み合わせて、当業者により解釈されるべきある。
【実施例】
【００７８】
実施例１：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドと、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、マウスイムノグロブリンシグナルペプチドとの比較
１．１．構築
１．１．１ ＩｇＳＰ
配列番号３のマウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチド（ＩｇＳＰ）を以下のようにクローニングした。配列番号１３〜２０のプライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Stratagene)と一緒に２時間３０分３７℃でインキュベートし、そして７５℃で１０分間熱不活性化した。処理済のプライマーは、StratageneのＰｆｕリガーゼを用い、取扱説明書で推奨されているものに従い、以下のサイクル条件でサイクルライゲーションを用いてライゲーションした：
−９５℃で１分間
−９５℃で３０秒間、５７℃で９０秒間、７０℃で２分間を４０サイクル
−７０℃で１０分間
【００７９】
アニーリングしたオリゴを続いてＱＩＡｑｕｉｃｋカラムで精製し、そして配列番号１３〜１７のプライマーを用い、以下のＰＣＲ条件下ＰＦＵターボでＰＣＲ増幅した：
−９５℃で５分間
−９５℃で４５秒間、７０℃で４５秒間を３０サイクル
−７０℃で１０分間
【００８０】
ＰＣＲ産物を精製し、そしてＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩで消化し、そしてｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１３８０ベクター（図２）内にクローニングした。当該産物を配列決定し、そして予想した配列を反映していることが明らかとなった。
【００８１】
１．１．２ ＧＨ＿ＳＰ
配列番号４のヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ＧＨ＿ＳＰ）を、配列番号２１〜３４のプライマーを用いてクローニングした。プライマーは上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号２１と３４のプライマーを用いて再び増幅した。当該産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８２】
１．１．３ ＳＥＡＰ＿ＳＰ
配列番号５のヒト分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ＿ＳＰ）を、配列番号３５〜４１のプライマーを用いてクローニングした。プライマーは上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号３５と４０のプライマーを用いて再び増幅した。当該産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８３】
１．１．４ Ｉｇ−ｔＰＡ
本研究のＩｇＳＰ−ｔＰＡは、（ｉ）マウスＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドと、これと融合した（ｉｉ）天然のｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端アミノ酸を欠失している短縮型ｔＰＡプロペプチド、を含んで成る。このＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、配列番号１に示すとおりである。このＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを以下のとおりクローニングした。
【００８４】
配列番号４２〜４９のプライマーは、上述のとおりアニーリングした。アニーリングの終了時に、生成物を精製し、そして上述のものと同一の条件を用いてＰＣＲで再び増幅した。このＰＣＲ産物を、配列番号４５と４９のプライマーを用いて再び増幅した。精製したＰＣＲ産物をＢｇｌ−ＩＩ及びＢｓｒＧＩクローニング部位でｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ３８０ベクター内にクローニングした。
【００８５】
組換えＰＣＲは、既知のｔＰＡプロペプチドから３つのアミノ酸（ＧＡＲ）を欠失させるために実施した。このコンストラクトの５’末端は、配列番号５１と５２のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そして３’末端は配列番号５３と５４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。完全長のＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトは、配列番号５１と５４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そして２つの組換え産物がこれまでのＰＣＲから得られた。
【００８６】
１．１．５．上記リーダー配列のＴＢＰＩに対する融合
上記リーダー配列を、ＴＮＦ受容体ｐ５５タンパク質（ＴＢＰＩ、配列番号５０）の可溶性部分に融合させた。ヒト伸長因子１（ＥＦ１）プロモーターのもとでのＴＢＰＩの発現を可能にするｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１４０３ベクター（図３）をＮｃｏ−Ｉ及びＸｂａ−Ｉで消化した。リーダー配列をコードしているフラグメントをＮｃｏ−Ｉフラグメント又はＢｓａ−Ｉ−Ｘｂａ−ＩフラグメントとしてｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１４０３内にサブクローニングした。生じたＩｇＳＰ−ＴＢＰＩ、ＧＨ＿ＳＰ−ＴＢＰＩ ＳＥＡＰ＿ＳＰ−ＴＢＰＩ及びＩｇＳＰ−ｔＰＡコンストラクトを配列決定し、そしてこれらが予想した配列を反映していることが明らかとなった。
【００８７】
１．２ タンパク質分泌の測定
各コンストラクトを、標準的な研究マニュアル（Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の標準的な脂質媒介型のトランスフェクションを用い、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、培地と細胞を採集した。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、そしてペレットを氷上で３００μｌのCytobusterバッファー(Novagen)を用い、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)の存在下で溶解させた。細胞片を、４℃で１０分間、１６０００ｇでの遠心により沈降させた。上清を採集し、そして処理する前に−２０℃で維持した。上清又は細胞内区画中に放出されたＴＢＰＩの量をＥＬＩＳＡで解析した。ＴＢＰＩの相対的な発現を測定し、そして報告した。
【００８８】
実験結果を図４に示す。ＩｇＳＰ−ｔＰＡシグナルプロペプチドは、細胞からのＴＢＰＩの分泌を促進することができ、これは上清中で検出されたＴＢＰＩの量の増大対細胞内区画で検出されたＴＢＰＩの量により証明される。従って、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプロペプチドと融合したＴＢＰＩを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトは、ＩｇＳＰシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド又は成長ホルモンシグナルペプチド、と融合したＴＢＰＩタンパク質に相当するコンストラクトと比較して、ＴＢＰＩの分泌を増大させる。
【００８９】
実施例２：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドとｔＰＡプレプロペプチドとの比較
２．１ 構築
２．１．１．ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ
１．１．５に記載のＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトをＸｂａ−Ｉで消化した。ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩを含んで成るフラグメントを、Ｎｃｏ−Ｉ及びＸｂａ−Ｉで消化したｐｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３発現ベクター（図５）内にクローニングした。
【００９０】
２．１．２．ｔＰＡ−ＴＢＰＩ
（ｉ）ｔＰＡシグナルペプチド、及び（ｉｉ）天然のｔＰＡプロペプチドの３つのカルボキシル末端のアミノ酸を欠失している短縮型ｔＰＡプロペプチド、を含んで成る配列番号２のｔＰＡプレプロペプチドは以下のとおり生成させた。
【００９１】
ヒトｔＰＡプレプロペプチドは、鋳型としてＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトを用いることによりクローニングした。最初のＰＣＲを配列番号５５と５６のプライマーを用いて実施し、ｔＰＡプロペプチド及びＴＢＰＩの５’末端を増幅させた。２回目のＰＣＲにおいて、第一段階由来のＰＣＲ産物を、配列番号５７と５８と５６とを用いた再増幅により伸長させた。続いて、ＰＣＲ産物を、Ｂｇｌ−ＩＩとＢｓｒＧＩで消化したｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰＩ−１３８０ベクター（図２）内にクローニングした。組換えＰＣＲを１．１．４．に記載のとおり実施し、プライマーには配列番号５１〜５４を用い、既知のｔＰＡプロペプチド内に３つのアミノ酸（ＧＡＲ）の内部欠失を導入した。
【００９２】
生じたｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトをＢｓａ−ＩとＸｂａ−Ｉで消化した。ｔＰＡ−ＴＢＰＩを含んで成るフラグメントを、Ｎｃｏ−ＩとＸｂａ−Ｉで消化したｐ又はＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３発現ベクター内にクローニングした。
【００９３】
２．２．タンパク質分泌の測定
ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミンを用いてＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトとｔＰＡ−ＴＢＰＩコンストラクトでトランスフェクションした。一連の実験において、ＴＢＰＩ発現ベクターを、選択用のＳＶ４０ｎｅｏベクターとＳＶ４０ｐｕｒｏベクターと同時トランスフェクションした。別の系においては、ＴＢＰＩ発現ベクターは、ＳＶ４０ｄｈｆｒベクターとＳＶ４０ｐｕｒｏベクターと一緒に同時トランスフェクションした。少なくとも１００クローンを表している安定発現クローンのプールは、異なる選択培地中で広げられた（６００μｇ・ｍｌ-1ネオマイシン、６μｇ・ｍｌ-1ピューロマイシン又はＨＴ＋６μｇ・ｍｌ-1ピューロマイシン）。プールを分割し、そして細胞をＦＣＳ含有培地又は無血清培地中で播種した。培地を４８時間後に採集し、そして上清中に放出されたＴＢＰＩの量をＥＬＩＳＡを用いて決定した。この実験結果を図６に示す。各棒はプールを表す。白棒と黒棒は、３７℃で１０％ＦＣＳを含む媒地中での４８時間の２つの異なるパルスを表す。斜線入りの四角と方眼入りの棒は、無血清培地中での３２℃での４８時間の２つの異なるパルスを表す。播種した細胞の最初の数とパルス期間は各実験において同様である。
【００９４】
図６は、研究した全ての条件で、ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞のプールがｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞のプールよりも高い力価を有することを示した。この結果は、ＩｇＳＰ−ｔＰＡコンストラクトが、生成する分泌型タンパク質の量の点でｔＰＡコンストラクトよりも少なくとも２倍優れていることを示す。
【００９５】
従って、ｔＰＡプロペプチドとＩｇＳＰシグナルペプチドとの新規な組み合わせは、ｔＰＡ−プレプロペプチドよりもタンパク質分泌を促進するのにより効率的である。
【００９６】
尚、ＩｇＳＰ−ｔＰＡ−ＴＢＰＩ発現細胞から分泌されるＴＢＰＩタンパク質のＮ末端側の配列は、エドマン分解を用いたＮ末端配列決定により決定した。これにより、１００％のタンパク質がｔＰＡの最後のアルギニン残基の後で開裂していたことが明らかとなった。このように、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、効率的で且つ信頼性のあるポリペプチドのプロセシングを保証する。
【００９７】
実施例３：ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドとインターフェロンガンマの産生用インターフェロンガンマ受容体シグナルペプチドとの比較
３．１．コンストラクト
ＩｇＳＰプレプロペプチドを、ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、成熟インターフェロンガンマ受容体鎖（ＩＦＮＡＲ）に融合させ、そして（ｉ）ｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクター（図３）；又は（ｉｉ）欧州特許出願０３１００６１７．４に記載のｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターを含んで成る発現ベクター、の中にクローニングした。
【００９８】
天然のシグナルペプチドを含んで成る完全長ＩＦＮＡＲを、（ｉ）ｍＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクター；又は（ｉｉ）欧州特許出願０３１００６１７．４に記載のｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターを含んで成るベクター、の中にクローニングした。
【００９９】
３．２．タンパク質分泌の測定
３．２．１．プロトコール
コンストラクトを、標準的な脂質媒介型のトランスフェクションプロトコールを用いてＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。分泌型タンパク質を４８時間後に採集した。特異的ＥＬＩＳＡ試験を用い、上清中に分泌型されたＩＦＮＡＲの量を定量した。トランスフェクションは、ＩＦＮＡＲベクターで同時トランスフェクションしたルシフェラーゼコンストラクトで正規化した。標準的なルシフェラーゼアッセイは、標準的な研究マニュアル（Maniatis et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載のとおりに使用した。
【０１００】
３．２．１．ＣＭＶベクターを含んで成るコンストラクト
ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、上清中のＩＦＮＡＲタンパク質の分泌の促進において、天然のシグナルペプチドよりも約２．３倍効率的であった。
【０１０１】
３．２．２．ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子を含んで成るコンストラクト
ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドは、上清中のＩＦＮＡＲタンパク質の分泌の促進において、天然のシグナルペプチドよりも約４．３倍効率的であった。
【０１０２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、本発明のＩｇＳＰ−プレプロペプチド（配列番号１）と天然のｔＰＡプレプロペプチド（配列番号２）とのアラインメントを示す。
【図２】図２は、ＴＢＰＩタンパク質に融合した異なるシグナルペプチドを構築するために使用したｐＧＬ３−ＧＨ−ＴＢＰ−１３８０ベクターのスキームを示す。
【図３】図３は、一過性トランスフェクションアッセイにおいてリーダーペプチド−ＴＢＰＩ融合タンパク質を発現するために使用したｐＥＦ１−ＧＨ−ＴＢＰ−１４０３ベクターのスキームを示す。
【図４】図４は、図示したコンストラクトをトランスフェクションした細胞の上清対細胞質で検出されたＴＢＰＩタンパク質の量を示す。レーンＧＨ＿ＳＰ：成長ホルモンシグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＳＥＡＰ＿ＳＰ：分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＩｇＳＰ：マウスイムノグロブリンＩｇＧμ−重鎖シグナルペプチドと融合したＴＢＰＩ；レーンＩｇＳＰ−ｔＰＡ：本発明のＩｇＳＰプレプロペプチドと融合したＴＢＰＩ。
【図５】図５は、安定なトランスフェクションアッセイにおいてリーダーペプチド−ＴＢＰＩ融合タンパク質を発現させるために使用したＣＭＶ−ＵｂＢ−ＬＵＣ−１４３３ベクターのスキームに相当する。
【図６】図６は、ＴＢＰＩと融合したＩｇＳＰ−ｔＰＡ又はｔＰＡ−ｔＰＡプレプロペプチドでトランスフェクションしたクローンのプールの上清中で検出されたＴＢＰＩタンパク質の量を示す。プールは、ピューロマイシンとネオマイシンとの同時選択（ｎｅｏ／ｐｕｒｏ）、又はピューロマイシンマイナス−ヒポキサンチン−チミジンによる同時選択（ＨＴ／ｐｕｒｏ）のいずれかで維持した。白棒と黒棒は、３７℃で１０％ＦＣＳを含む媒地中での４８時間の２つの異なるパルスを表す。斜線入りの四角と方眼入りの棒は、無血清培地中での３２℃での４８時間の２つの異なるパルスを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）プロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクト。
【請求項２】
前記イムノグロブリンシグナルペプチドがマウスイムノグロブリンシグナルペプチドである、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３】
前記マウスイムノグロブリンシグナルペプチドが配列番号３を含んで成る、請求項２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項４】
前記ｔＰＡプロペプチドがヒトｔＰＡプロペプチドであり、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
前記ｔＰＡプロペプチドが配列番号２のアミノ酸２３〜３２から成る、請求項４に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
前記プレプロペプチドが配列番号１を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項７】
注目のポリペプチドと融合した前記ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチド（ｔＰＡ）をコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトであって、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
前記ｔＰＡプロペプチドが配列番号２のアミノ酸２３〜３２から成る、請求項８に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
前記ｔＰＡプロペプチドと融合したシグナル配列を更に含んで成る、請求項８又は９に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１１】
注目のポリペプチドと融合した前記ｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１２】
ベクターに含まれている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１３】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１４】
前記ベクターが遺伝子活性化を実施するためのベクターである、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞及びＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ等、Ｎａｍａｌｗａ、ＲＰＭＩ−８２２６、ベロ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５等から成る群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
注目のポリペプチドの産生方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法。
【請求項１９】
注目のポリペプチドの産生方法であって、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法。
【請求項２０】
注目のポリペプチドを前記宿主細胞から単離するステップを更に含んで成る、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
トランスフェクションが安定トランスフェクションである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
注目のポリペプチドの産生のための請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトの使用。
【請求項２３】
請求項７又は１１に記載のＤＮＡコンストラクトでコードされる融合ポリペプチド。
【請求項１】
組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）プロペプチドと融合したイムノグロブリンシグナルペプチドを含んで成るＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドをコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクト。
【請求項２】
前記イムノグロブリンシグナルペプチドがマウスイムノグロブリンシグナルペプチドである、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３】
前記マウスイムノグロブリンシグナルペプチドが配列番号３を含んで成る、請求項２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項４】
前記ｔＰＡプロペプチドがヒトｔＰＡプロペプチドであり、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
前記ｔＰＡプロペプチドが配列番号２のアミノ酸２３〜３２から成る、請求項４に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
前記プレプロペプチドが配列番号１を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項７】
注目のポリペプチドと融合した前記ＩｇＳＰ−ｔＰＡプレプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータープロペプチド（ｔＰＡ）をコードする配列を含んで成るＤＮＡコンストラクトであって、前記ｔＰＡプロペプチドのカルボキシル末端がアミノ酸Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇから成るＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
前記ｔＰＡプロペプチドが配列番号２のアミノ酸２３〜３２から成る、請求項８に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
前記ｔＰＡプロペプチドと融合したシグナル配列を更に含んで成る、請求項８又は９に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１１】
注目のポリペプチドと融合した前記ｔＰＡプロペプチドを含んで成る融合ポリペプチドをコードする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１２】
ベクターに含まれている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１３】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１４】
前記ベクターが遺伝子活性化を実施するためのベクターである、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞及びＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ等、Ｎａｍａｌｗａ、ＲＰＭＩ−８２２６、ベロ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５等から成る群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
注目のポリペプチドの産生方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションするステップを含んで成る方法。
【請求項１９】
注目のポリペプチドの産生方法であって、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含んで成る方法。
【請求項２０】
注目のポリペプチドを前記宿主細胞から単離するステップを更に含んで成る、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
トランスフェクションが安定トランスフェクションである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
注目のポリペプチドの産生のための請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトの使用。
【請求項２３】
請求項７又は１１に記載のＤＮＡコンストラクトでコードされる融合ポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０６４２０（Ｐ２００７−５０６４２０Ａ）
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７４２７（Ｐ２００６−５２７４２７）
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５２３０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９６３
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５２３０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９６３
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
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