タンパク質グリコシル化
本発明は、タンパク質をグリコシル化するための方法であって、タンパク質がアルキン基および／またはアジド基を含むように修飾される方法に関する。本発明はさらに、これらの方法によってグリコシル化されたタンパク質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、タンパク質のグリコシル化のための方法、およびこれらの方法によって提供される糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の翻訳と同時の（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）グリコシル化および翻訳後の（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）グリコシル化は、それらの生物学的性質および安定性において重要な役割を果たす（Ｒ．Ｄｗｅｋ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９６：６８３−７２０（１９９６））。例えば、グリコシル化は、細胞のシグナル伝達および調節、発達および免疫のような本質的な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。これらの事象の研究は、同じペプチド骨格を保有するが、グリコシル化の種類および部位の両方が異なる、いわゆる糖型の混合物として糖タンパク質が自然に生じるという事実によって困難になる。さらに、タンパク質のグリコシル化は、直接に遺伝子の制御下にはないので、哺乳動物細胞培養における治療用糖タンパク質の発現は、糖型の不均一の混合物をもたらす。従って、均一の糖タンパク質の糖型を合成できることは、正確な研究の目的に必須であるだけでなく、複数の糖型の混合物として現在市販されている治療用糖タンパク質（例えば、エリスロポエチンおよびインターロイキン）を調製する場合にも重要性を増している。従って、タンパク質のグリコシル化の程度および種類を制御することによって、生物学的システムにおけるその性質を研究および制御することが可能になる。
【０００３】
化学合成を含む、タンパク質のグリコシル化のための多数の方法が公知である。糖タンパク質の化学合成は、特定の利点、特に、純粋な糖タンパク質の糖型を得る手段の可能性を提供する。１つの公知の合成方法は、チオール選択的炭水化物試薬、グリコシルメタンチオスルホネート試薬（糖−ＭＴＳ）を利用する。このようなグリコシルメタンチオスルホネート試薬は、タンパク質のチオール基と反応して、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されるグリコシル残基を導入する（例えば、国際公開第００／０１７１２号を参照されたい）。
【０００４】
Ｃｕ（Ｉ）が触媒するトリアゾールの形成は、合成においてのみならず（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７（９）：３０５７−３０６４，２００２）、多数の標識を用いる研究のために用いられている（Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１１６４−１１１６５，２００３；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１０５９８−１０６０２，２００４；およびＳｐｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：５３５−５４６，２００４）。この反応の魅力的な特徴は、アジドとアルキンの反応の高い選択性、ならびに種々の他の官能基の存在下において水性条件下で反応を行うことができることである。
【０００５】
最近の文献では（Ｋｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（１８）：３１２３−３１２６，２００４）、適切に官能基化され保護された炭水化物および保護されたアミノ酸／ペプチドからの、トリアゾールが結合したグリコシルアミノ酸および低分子糖ペプチドの合成が証明されている。また、他のタイプのトリアゾール結合複合炭水化物が報告されており（Ｃｈｉｔｔａｂｏｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４６：２３３１−２３３６，２００５）、これは、保護された炭水化物誘導体を利用して合成された。
【０００６】
ＬｉｎおよびＷａｌｓｈは、１０アミノ酸の環状ペプチドであるＮ−アセチルシステアミンチオエステル（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ ｔｈｏｉｅｓｔｅｒ）（ＳＮＡＣ）を修飾してペプチドにアルキンの官能基を導入した。この方法は、ペプチド中のアミノ酸を、そのペプチド中の異なる位置に、非天然のアミノ酸類似体であるプロパルギルグリシン（ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）に置換する工程を包含する（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１２８２−１２８８（２０００）およびＫｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６：９４８７−９４９３（２０００））。次いで、この修飾されたペプチドをアジド糖に結合させ、グリコシル化環状ペプチドを生成する。
【０００７】
簡易な方法、例えば、先行技術に記載されたよりも、より複雑な構造のグリコシル化、例えばタンパク質のグリコシル化のために保護されたグリコシル化試薬の使用を必要とせず、そして広範囲のタンパク質における複数の部位でのグリコシル化を可能にする方法が必要である。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第一の態様に従って、タンパク質を修飾する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つのアルキン基および／またはアジド基を含むようにこのタンパク質を修飾する工程を包含する。
【０００９】
本明細書において用いる場合、「アジド」基とは、（Ｎ＝Ｎ＝Ｎ）を指し、そして「アルキン」基は、ＣＣの三重結合を指す。
【００１０】
タンパク質の修飾は一般には、アルキン基および／またはアジド基を含む１つ以上のアミノ酸類似体で、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸を置換することを包含する。あるいは、または前述のものに加えて、タンパク質の修飾は、本明細書で論じられているタンパク質に１つ以上の天然のアミノ酸を導入することを包含し得る。別の手段としては、タンパク質の修飾は、化学基、例えば、チオール基を含むようにアミノ酸の側鎖を修飾することを包含してもよい。アジド基、アルキン基またはチオール基を含むようにタンパク質を修飾することは代表的には、タンパク質のアミノ酸配列内の所定の位置で生じる。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、タンパク質の修飾は、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸を、１つ以上の非天然（すなわち、天然には存在しない）アミノ酸類似体で置換することを包含する。非天然アミノ酸類似体は、メチオニンの類似体であってもよい。このメチオニンの類似体は、ホモプロパルギルグリシン（Ｈｐｇ）（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，１２８２−１２８８（２０００））、ホモアリルグリシン（Ｈａｇ）（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，６８−７０（１９９８））および／またはアジドホモアラニン（Ａｈａ）（Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１９−２４（２００２）、好ましくはホモプロパルギルグリシンであってもよい。
【００１２】
１つ以上の非天然のアミノ酸、例えば、メチオニンの類似体を導入するためのタンパク質の修飾は、当分野で公知の方法によって達成され得る。例えば、Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，１２８２−１２８８（２０００）を参照されたい。詳細には、１つ以上のメチオニンの類似体を導入するためのタンパク質の修飾は、タンパク質をコードする核酸配列に、メチオニンをコードするコドンＡＵＧを挿入するための部位特異的突然変異誘発を包含する。好ましくは、メチオニンのコドンの挿入は、タンパク質をコードする核酸配列内の所定の位置で、例えば、そのタンパク質のＮ末端（すなわちアミノ末端）をコードする核酸配列の領域内の位置で起こる。次いで、タンパク質の発現は、メチオニンの類似体、例えば、ＡｈａまたはＨｐｇの存在下で、栄養要求性メチオニン欠損細菌株において、挿入されたメチオニンコドンを含有する核酸配列を翻訳することによって達成され得る。
【００１３】
本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸を、ホモプロパルギルグリシンまたはホモアリルグリシンで置換する工程によってアルキン基を含むための修飾を包含し得る。
【００１４】
あるいは、またはさらに、本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸をアジドホモアラニンで置換する工程によってアジド基を包含するための修飾を包含し得る。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、アジド基（本明細書に記載）およびアルキン基（本明細書に記載）を包含するための修飾を包含する。
【００１６】
「タンパク質」という用語は、本明細書において、大まかに言えば、ペプチド結合によって結合した複数（最小２つのアミノ酸）のアミノ酸残基（一般には１０より多い）を意味する。タンパク質中に含まれる任意のアミノ酸は好ましくはαアミノ酸である。任意のアミノ酸は、Ｄ型またはＬ型であってよい。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、タンパク質は例えば１つ以上のシステイン残基に存在するチオール（−ＳＨ）基を含む。このシステイン残基は、タンパク質中に天然に存在し得る。タンパク質がシステイン残基を含まない場合、タンパク質は、１つ以上のシステイン残基を含むように修飾され得る。チオール基は、例えば、チオール基をアミノ酸の側鎖に導入するための、または１つ以上のシステイン残基を導入するための、タンパク質の化学修飾によってタンパク質に導入され得る。あるいは、チオール含有タンパク質は、システイン残基を導入するための部位特異的な突然変異誘発を介して調製され得る。部位特異的な突然変異誘発は、当分野で公知の技術である（例えば、国際公開第００／０１７１２号を参照されたい）。詳細には、システイン残基は、タンパク質をコードする核酸配列にコドンＵＧＵを挿入することによってタンパク質に導入されてもよい。好ましくはシステインのコドンの挿入は、タンパク質をコードする核酸配列内の所定の位置で、例えば、タンパク質のＣ末端（すなわちカルボキシル末端）をコードする核酸配列の領域内の位置で生じる。その後に、修飾されたタンパク質は、例えば、細胞発現系で発現され得る。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、「タンパク質」という用語は、大まかに言えば、ペプチド結合によって結合される複数のアミノ酸残基を意味する。これは交換可能に用いられて、ペプチドおよびポリペプチドと同じものを意味する。
【００１９】
「タンパク質」という用語はまた、タンパク質のフラグメント、類似体および誘導体を含むものとし、ここでこのフラグメント、類似体または誘導体は、参照タンパク質と本質的に同じ生物学的活性または機能を保持する。
【００２０】
このタンパク質は、直線構造を有してもよいが、好ましくは、折り畳まれた、例えば、三次元または四次元の立体構造を有する非直線構造である。このタンパク質は、それに結合された１つ以上の補欠分子族を有してもよく、例えば、このタンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質、または色素タンパク質であってもよい。好ましくは、このタンパク質は複合タンパク質である。
【００２１】
好ましくは、このタンパク質は、１０〜１０００のアミノ酸、例えば、１０〜６００のアミノ酸、例えば、１０〜２００のアミノ酸または１０〜１００のアミノ酸を含む。従って、このタンパク質は、１０〜２０、５０、１００、１５０、２００または５００のアミノ酸を含んでもよい。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、このタンパク質は、１０ｋＤａより大きい分子量を有する。このタンパク質は、少なくとも２０ｋＤａまたは少なくとも６０ｋＤａ、例えば、１０〜１００ｋＤａの分子量を有してもよい。
【００２３】
このタンパク質は、線維状タンパク質または球状タンパク質のグループに属し得る。好ましくは、このタンパク質は球状タンパク質である。
【００２４】
好ましくは、このタンパク質は生物学的に活性なタンパク質である。例えば、このタンパク質は、糖タンパク質、血清アルブミンおよび他の血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択されてもよい。
【００２５】
タンパク質の例としては、増殖因子、分化因子、サイトカイン、例えば、インターロイキン、（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０またはＩＬ−２１、αまたはβのいずれか）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘発因子（ＩＧＩＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）；サイトカインレセプター；フリーラジカル消去酵素を含んでもよい。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、タンパク質はホルモンである。好ましくは、ホルモンはエチスロポエチン（Ｅｐｏ）である。
【００２７】
本発明の方法によって修飾されるタンパク質は有利には、固有のタンパク質の機能／活性を保持している。
【００２８】
本発明のさらなる好ましい態様では、タンパク質は酵素である。好ましくは、この酵素はグルコシルセラミダーゼ（Ｄ−グルコセレブロシダーゼ）（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのβ−グリコシダーゼ（ＳＳｂＧ）である。
【００２９】
本発明はさらに、タンパク質のアミノ酸配列内の所定の部位におけるアミノ酸の側鎖へのアルキン基、アジド基またはチオール基のようなタグの部位選択的な導入（本明細書において以前に考察）に基づいており、その後、各々のそれぞれのタグについて選択的である、連続的および直交性のグリコシル化反応が起こる。このように、特異的な複数部位の化学的タンパク質グリコシル化が達成される。
【００３０】
従って、本発明の第二の態様では、タンパク質をグリコシル化するための方法が提供され、この方法は、
ｉ）本発明の第一の態様の方法に従ってタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）において修飾されたタンパク質と、
（ａ）アジド基を含むように修飾された炭水化物部分；および／または
（ｂ）アルキン基を含むように修飾された炭水化物部分とを、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下で反応させる工程と、を包含する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「グリコシル化」とは、共有結合を介する別の部分へのグリコシル単位の付加の一般的なプロセスをいう。
【００３２】
典型的には、タンパク質が、工程（ｉ）においてアルキン基を含むように修飾される場合、工程（ｉｉ）における反応は（ａ）における炭水化物部分との反応である。さらに、タンパク質が工程（ｉ）においてアジド基を含むように修飾される場合、工程（ｉｉ）における反応は（ｂ）における炭水化物部分との反応である。
【００３３】
好ましくは、タンパク質（工程ｉ）の修飾はさらに、例えば、システイン残基の挿入を通じて、チオール基を含むように本明細書において規定されるようにタンパク質を修飾する工程を包含する。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、タンパク質をグリコシル化する方法が提供され、この方法は、
ｉ）（ａ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
（ｂ）（ａ）におけるタンパク質の修飾の前または後に、任意選択的にチオール基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）で修飾されたタンパク質と、炭水化物部分（ｃ）との、チオール選択的炭水化物試薬（ｄ）との反応の前または後の、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下における連続的な反応であって、
（ｃ）がアジド基を含むように修飾された炭水化物部分、および／またはアルキン基を含むように修飾された炭水化物部分；ならびに
（ｄ）がチオール選択的炭水化物試薬である、反応、
を包含する。
【００３５】
工程（ｉ）の（ａ）および（ｂ）は本明細書に記載されるとおりである。修飾されるべきタンパク質がシステイン残基を含有する場合、チオール基を含むためのタンパク質の修飾は、必要でないかもしれない。あるいは、このタンパク質に既に存在するチオール基に加えて１つ以上のチオール基を含むことが所望され得る。
【００３６】
チオール選択的炭水化物試薬は、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されたグリコシル残基を導入するために、タンパク質のチオール基と反応する任意の試薬を含んでもよい。このチオール選択的炭水化物試薬は、グリコアルカンチオスルホナート試薬、例えば、グリコメタンチオスルホナート試薬（糖−ＭＴＳ）（国際公開第００／０１７１２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）、グリコセレニルスルフィド試薬（国際公開第２００５／０００８６２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）、およびグリコチオスルホナート試薬（国際公開第２００５／０００８６２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）を含んでもよいが、これらに限定されない。グリコメタンチオスルホネート試薬は、式ＣＨ3−ＳＯ2−Ｓ−炭水化物部分の試薬である。
【００３７】
グリコチオスルホネート試薬およびグリコセレニルスルフィド（ＳｅＳ）試薬は一般には、国際公開第２００５／０００８６２号（引用することによって本明細書の一部をなすものとする）における式Ｉの試薬である。詳細には、グリコセレニルスルフィド（ＳｅＳ）試薬は、式Ｒ−Ｓ−Ｘ−炭水化物部分の試薬であって、ここでＸはＳｅであり、そしてＲは、任意選択的に置換される、Ｃ１−１０アルキル基、フェニル基、ピリジル基またはナフチル基である。グリコチオスルホネート試薬は、式Ｒ−Ｓ−Ｘ−炭水化物部分の試薬であって、ここでＸはＳＯ2であり、そしてＲは、任意選択的に置換される、フェニル基、ピリジル基またはナフチル基である。このような試薬は、ジスルフィド結合を介してタンパク質に対する炭水化物の部位選択的な結合を提供する。
【００３８】
好ましくは、修飾される炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖および他の多糖類を含み、天然に存在する糖タンパク質に、または生物学的システムに存在する任意の炭水化物部分を含む。含まれるのは、グリコシル誘導体またはグリコシド誘導体、例えば、グルコシル誘導体、グルコシド誘導体、ガラクトシル誘導体またはガラクトシド誘導体である。グリコシル基およびグリコシド基は、α基およびβ基の両方を含む。適切な炭水化物部分としては、グルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、シアル酸、およびマンノース、ならびに少なくとも１つのグルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮａｃ、シアル酸、および／またはマンノース残基を含む多糖類を含む。
【００３９】
炭水化物部分としては、Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、Ｇｌｃ（Ｂｎ）4β−、Ｇａｌ（Ａｃ）4β−、Ｇａｌ（Ｂｎ）4β−、Ｇｌｃ（Ａｃ）4α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）3α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、β−Ｇｌｃ、β−Ｇａｌ、α−Ｍａｎ、α−Ｍａｎ（Ａｃ）4、Ｍａｎ（１，６）Ｍａｎα−、Ｍａｎ（１−６）Ｍａｎ（１−３）Ｍａｎα−、（Ａｃ）4Ｍａｎ（１−６）（Ａｃ）4Ｍａｎ（１−３）（ＡＣ）2Ｍａｎα−、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ、Ｅｔ−α−Ｇｌｃ、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ、−Ｅｔ−Ｌａｃ、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）5、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）6、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）7、およびこれらの脱保護された等価物を含んでもよい。
【００４０】
天然に存在する糖に由来する炭水化物部分を形成する任意の糖単位は各々が、天然に存在するエナンチオマーの形態であり、これは、Ｄ型（例えば、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトース）またはＬ型（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）のいずれであってもよく、任意のアノマー結合はα結合であってもまたはβ結合であってもよい。
【００４１】
本発明の一つの実施形態では、アジド基を含むように修飾された炭水化物は、グリコシルアジドである。
【００４２】
本発明の一つの実施形態では、アルキン基を含むように修飾された炭水化物は、アルキニルグリコシドである。
【００４３】
好ましくは、アジドおよび／またはアルキンで修飾された炭水化物部分（例えば、グリコシルアジドおよび／またはアルキニルグリコシド）は、保護基を含まず、すなわち、保護されていない。この保護されていないアジドおよび／またはアルキンで修飾された炭水化物部分は、保護された糖にアジド基またはアルキン基を付加することによって調製され得る。炭水化物部分における任意の−ＯＨ基のための適切な保護基は、アセテート（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、シリル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＭＤＰＳｉ））、アセタール、ケタールおよびメトキシメチル（ＭＯＭ）を含む。次いで、保護基は、タンパク質に炭水化物部分を付加する前または後に除去される。このように、工程（ｉｉ）で規定される反応は、保護されていないグリコシドで行われる。
【００４４】
本発明の好ましい態様では、Ｃｕ（Ｉ）触媒はＣｕＢｒまたはＣｕＩである。好ましくは、触媒はＣｕＢｒである。Ｃｕ（Ｉ）触媒は、反応においてＣｕ（ＩＩ）塩（例えば、Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ4）を使用することによって提供され得、これは、反応混合物中にインサイチュで還元剤（例えば、アスコルビン酸、ヒドロキシルアミン、亜硫酸ナトリウムまたは銅元素）を添加することによってＣｕ（Ｉ）に還元される。好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）触媒は、この反応へのＣｕ（Ｉ）Ｂｒの直接の添加によって提供される。好ましくはＣｕ（Ｉ）Ｂｒは高純度で、例えば、９９．９９９％のように少なくとも９９％の純度で提供される。さらに好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ）は、安定化リガンド、例えば、窒素塩基の存在下で溶媒中に提供される。このリガンドは、反応混合物中においてＣｕ（Ｉ）を安定化する。の非存在下では、Ｃｕ（ＩＩ）への酸化が急速に起こる。好ましくは、このリガンドはトリストリアゾリルアミンリガンド（ｔｒｉｓｔｒｉａｚｏｌｙｌ ａｍｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ）である（ＷｏｒｍａｌｄおよびＤｗｅｋ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７，Ｒ１５５−Ｒ１６０（１９９９））。この触媒の溶媒は、７．２〜８．２のｐＨを有していてもよい。この溶媒は、水混和性の有機溶媒（例えば、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、または、リン酸緩衝液のような水性の緩衝液であってもよい。好ましくは、この溶媒はアセトニトリルである。
【００４５】
工程（ｉｉ）における反応は、（タンパク質および／またはグリコシド上の）アルキン基と（タンパク質および／またはグリコシド上の）アジド基との間の［３＋２］付加環化反応であって、置換された１，２，３−トリアゾールを生成し（Ｈｕｉｇｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３５７−３６９（１９６１））、これがタンパク質と糖との間の結合を提供する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一の態様または第二の態様の方法によって修飾されるタンパク質を提供する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のタンパク質を提供する。
【化１】
式中、ａおよびｂは０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）であり；ｐおよびｑは、１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；このタンパク質は本明細書に規定されるとおりである。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の第二の態様の方法によって修飾されるグリコシル化タンパク質を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、式（ＩＶ）のグリコシル化タンパク質を提供する。
【化２】
式中、ｔは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であって；スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分である。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、スペーサーは置換または非置換のＣ１−６アルキル基である。好ましくは、スペーサーは存在しないか、メチルまたはエチルである。
【００５１】
本発明のさらなる好ましい態様では、スペーサーはヘテロアルキルであって、このヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳであり、このアルキルは、メチルまたはエチルである。好ましくはこのヘテロアルキル基は、式ＣＨ2（Ｘ）yであって、式中、ＸはＯ、ＮまたはＳであり、Ｙは０または１である。典型的にはこのヘテロ原子は、炭水化物部分に直接結合される。
【００５２】
置換基は、Ｈおよびハロから選択される一価の原子のみならず、ハロゲン、またはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＳｉから選択される１〜３０個の複数の原子価を有する部分である。１つの化合物群では、置換基は、存在する場合は、例えば、水素およびハロゲンから選択される一価の原子のみならず、ハロゲンおよび１、２、３、４または５つの複数の原子価の原子を有する部分より選択される。複数の原子価の原子は、例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢ、例えば、Ｃ、Ｎ、ＳおよびＯから選択されてもよい。
【００５３】
「置換された」という用語は、ある部分または基に関して本明細書において用いられる場合、それぞれの部分における１つ以上の水素原子、特に水素原子のうち１、２または３つが、対応する数の記載された置換基によって互いに独立して置換されることを意味する。
【００５４】
当然ながら、置換はそれらが化学的に可能である位置のみであることが理解され、当業者は、特定の置換が可能であるかどうかを、不適切な労力なしに、（実験的にまたは理論的にのいずれかで）決定し得る。例えば、遊離の水素を有するアミノ基またはヒドロキシ基は、不飽和（例えば、オレフィン）結合で炭素原子に結合する場合、不安定であり得る。さらに、当然ながら、本明細書に記載される置換基はそれ自体、当業者によって認識されるような適切な置換基に対する前述の制限を条件として、任意の置換基で置換され得ることが理解される。
【００５５】
従って、置換されたアルキル基は例えば、前回規定されたアルキルであってもよく、１つ以上の置換基で置換されてもよく、この置換基は、同じであっても異なってもよく、ヒドロキシ、エーテル化ヒドロキシル、ハロゲン（例えば、フッ素）、ヒドロキシアルキル（例えば、２−ヒドロキシエチル）、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチルまたは２，２，２−トリフルオロエチル）、アミノ、置換アミノ（例えば、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノまたはＮ−アルカノイルアミノ）、アルコキシカルボニル、フェニルアルコキシカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドロキシグアニジノ、ホルムアミジノ、イソチオウレイド、ウレイド、メルカプト、アシル、アシルオキシ、例えば、エステル化カルボキシ、例えば、カルボキシ、スルホ、スルファモイル、カルバモイル、シアノ、アゾ、ニトロなどから選択される。
【００５６】
本発明の好ましい態様では、このグリコシル化タンパク質は式（Ｖ）：
【化３】
のタンパク質であり、式中、ｐおよびｑは、０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）であり；ｔは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；タンパク質および炭水化物部分は本明細書に規定されるとおりである。
【００５７】
タンパク質または炭水化物部分は、下の式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）に示されるような１または２の位置で１，２，３，−トリアゾールに結合され得る。従って、本発明のグリコシル化タンパク質は、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）
【化４】
のタンパク質であってもよく、式中、タンパク質、炭水化物部分、ｐ、ｑおよびｔは、本明細書に規定されるとおりである。
【００５８】
好ましくはｐは２である。
【００５９】
好ましくはｑは０である。
【００６０】
本発明はさらに、式（ＶＩＩＩ）
【化５】
のグリコシル化タンパク質を提供し、式中、ｕは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；スペーサーおよびｔは、本明細書に規定されたとおりであり、ＷおよびＺは炭水化物部分であって、これは同じであっても異なってもよい。
【００６１】
好ましくは、グリコシル化タンパク質は式（ＩＸ）
【化６】
のタンパク質であり、式中、スペーサー、ｐ、ｑ、ｔおよびｕは、本明細書に規定されたとおりであり；ｒおよびｓは、０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）である。
【００６２】
さらに好ましくは、グリコシル化タンパク質は式（Ｘ）または（ＸＩ）
【化７】
のタンパク質であり、式中、タンパク質、スペーサー、炭水化物部分、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、本明細書に規定されたとおりである。
【００６３】
本発明のグリコシル化タンパク質は典型的には、それらの固有の機能を保持し、一部のタンパク質は、本明細書に記載されるようなグリコシル化の後、機能の向上、例えば、（非グリコシル化酵素と比較して）酵素活性の増加を実証し得る。本発明のグリコシル化タンパク質はまた、他の種々のタンパク質との付加的なタンパク質間結合能力、例えば、レクチン結合能力を示し得る。従って本発明の方法は、他の種々のタンパク質、例えば、レクチンとのタンパク質間結合能力などの、付加的な、固有ではないタンパク質の機能性を含むように、タンパク質機能を操作するのに有用である。
【００６４】
本発明のグリコシル化タンパク質は、医薬において、例えば、疾患または病態の治療または予防において有用であり得る。従って、本発明は、製薬学的に受容可能な担体または希釈剤と組み合わせて、本発明によるグリコシル化タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。本発明のタンパク質は、例えば、貧血症またはゴーシェ病の治療のために有用であり得る。
【００６５】
本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲を通じて、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む、包含する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、ならびに用語の変形、例えば、「含んでいる、包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味し、そして他の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することは意図していない（そして排除しない）。
【００６６】
本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲を通じて、単数形は、文脈が他のことを要求しない限り、複数を包含する。詳細には、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈が他のことを要求しない限り、単数だけでなく複数も意図するものと理解されるべきである。
【００６７】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と結び付けて記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または化学基は、本明細書と矛盾しない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であることが理解されるべきである。
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例に関連してここに記載される。
【実施例】
【００６９】
複数の部位特異的な突然変異誘発：
β−ガラクトシダーゼＳｓβＧの多数の変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されているＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ［カタログ番号２００５１４］を用いて作成した。ＳｓβＧ Ｃ３４４Ｓを担持するプラスミドｐＥＴ２８ｄをテンプレートとして用いた1。対応する変異誘発プライマーは、ＩｌｅによるＭｅｔ残基の置換のために設計され、そしてＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓによってカスタム合成され、以下のとおりであった：
【表１】
【００７０】
この方法では、所望の数（１〜１０）のＭｅｔ残基を有する変異体が誘導され得る。さらなる変異が、以下の相補的なフォワードおよびリバースの変異誘発プライマーのセットを用いた単一の部位特異的な突然変異によって導入された：
【表２】
【００７１】
対応する変異体タンパク質は、以下に概説されるプロトコルを用いて発現され得る。
【００７２】
Ｍｅｔ類似体組み込みによるタンパク質発現：
培地交換プロトコル（ｍｅｄｉｕｍ ｓｈｉｆｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）2を用いたタンパク質発現による、ホモプロパルギルグリシン（Ｈｐｇ）またはアジドホモアラニン（Ａｈａ）のタンパク質への組み込み。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ８３４（ＤＥ３）の一晩培養物、ｐＥＴ２８ｄ ＳｓβＧ Ｃ３４４Ｓを、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびＬ−メチオニン（４０μｇ／ｍＬ）を補充したｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓの培地中で増殖した（約１６時間）。この一晩培養物を用いて、予め温めた（３７℃）培養培地（１．０Ｌ、上記と同じ組成）に植菌し、細胞を３時間増殖させた（ＯＤ600約１．２）。培地の交換は、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、メチオニンが含まれていない培地（０．５ｌ）中での再懸濁、および非天然のアミノ酸（ＤＬ−Ｈｐｇは８０μｇ／ｍＬ、Ｌ−Ａｈａは４０μｇ／ｍＬ）を含有する、予め温めた（３７℃）培養培地（１．０Ｌ）への移行によって行った。その培養物を２９℃で１５分間振盪し、次いで１．０ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導した。タンパク質発現は２９℃で１２時間継続させた。
この培養物を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。そのタンパク質をニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。細胞ペレットを結合緩衝液（５０ｍｌ）に移して、細胞を超音波処理（３×３０ｓ、６０％振幅）によって破壊して、懸濁物を遠心分離した（２０，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。その上清を濾過して（０．８μｍ）そのタンパク質を、漸増濃度のイミダゾールを用いて溶出するニッケルアフィニティーカラムで精製した。溶出を２８０ｎｍにおける紫外吸光度によってモニターし、画分を適宜合わせた。その合わせた画分を２２℃で一晩、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５、４．０ｌ）に対して透析した（ＭＷＣＯ １２〜１４ｋＤａ）。タンパク質溶液を濾過して（０．２μｍ）、４℃で保管した。
【００７３】
試薬の合成
【化８】
Ｌ−ホモアジドアラニンをホフマン転位、ジアゾ転移および文献3に記載の脱保護ストラテジーを介して合成した。
【化９】
ＤＬ−ホモプロパルギルグリシンを、前に記載のとおり2、ホモプロパルギルアルキル化、加水分解および脱炭酸反応によってジエチルアセトアミドマロネートから調製した。
【００７４】
１−アジド−２−アセトイミド−２−デオキシβ−Ｄ−グルコピラノシド１
【化１０】
Ｎ−Ａｃ−グルコシルアジドを、対応するアセチル保護グリコシルクロリドから合成し、続いてＺｅｍｐｌｅｎ脱アセチル化4を行った。
【００７５】
キトバイオシルアジド２
【化１１】
キトバイオシルアジド（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｙｌ ａｚｉｄｅ）は、Ｍａｃｍｉｌｌａｎら5によって記載されるように調製した。
【００７６】
（２−メタンチオスルホネート−エチル）α−Ｄ−グルコピラノシド７
【化１２】
α−グルコピラノシルＭＴＳ試薬を、参考文献6に記載のように保護基の除去およびメタンチオスルホネート置換を介して公知のブロミドから調製した。
【００７７】
（２−アジド−エチル）α−Ｄ−マンノピラノシド３
【化１３】
アジドエチルα−マンノピラノシド３は、ブロモエタノールを用いてグリコシル化し、その後アジド置換をすることによってマンノースペンタアセテートから文献の手順に従って合成した6、7。
【００７８】
ｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１
【化１４】
ｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１は、記載されるとおりに8、アジドエチルアセテートおよびトリプロパルギルアミンから調製した。
【００７９】
エチニルＣ−ガラクトシド５
エチニルβ−Ｃ−ガラクトシドは、Ｘｕ，Ｊｉｎｗａｎｇ；Ｅｇｇｅｒ，Ａｎｉｔａ；Ｂｅｒｎｅｔ，Ｂｒｕｎｏ；Ｖａｓｅｌｌａ，Ａｎｄｒｅａ；Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ；７９（７），１９９６，２００４−２０２２の方法に従って公知のＣ−グルコシドと同じ方法で調製した。
【化１５】
【００８０】
低分子モデル糖−ＣＣＨＡ反応
【化１６】
ジエチルホモプロパルギルアセトアミドマロネート（５５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯ3ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ3１（１０１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（２０２ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）およびトリス−トリアゾールイルアミンリガンド１１（６ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５、０．２Ｍ；４．０ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２．０ｍＬ）の混合物中に溶解した。硫酸銅（ＩＩ）溶液（０．１Ｍ、１００μＬ、０．０１ｍｍｏｌ）を撹拌した溶液に添加して、その反応混合物を室温で２８時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させて、残りの残滓を（シリカ、ＡｃＯＥｔ〜ＡｃＯＥｔに１５％ＭｅＯＨを含有）でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。その生成物は、無色のフィルムとして出現した（８３ｍｇ、７９％）。
【００８１】
メチル（Ｓ）−２−［Ｎ−アセチル−アミノ］−４−｛１−（２−デオキシ−Ｎ−アセチルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）［１，２，３，］トリアゾール−４−イル｝ブタノエート：
【化１７】
臭化第一銅（１０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解して、リガンド（０．５８ｍＬ、アセトニトリル中で０．１２Ｍ）を添加した。この溶液（３８μＬ、５％の触媒充填）を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５ｍＬ、０．１５Ｍ、ｐＨ８．２）のアルキンアミノ酸（１５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および糖２（３１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応混合物を、アルゴン下において室温で１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析によって、アルキン出発物質の消失を示した。その混合物を酢酸エチルで希釈し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、その水層をＡｃＯＥｔで洗浄した。その水層を減圧下で乾燥するまでエバポレートした。その残滓をカラムクロマトグラフィー（シリカ、１：１のエチルＡｃＯＥｔ／ｉＰｒＯＨ〜４：４：２のＨ2Ｏ／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ）によって精製して、所望の１，２，３−トリアゾール（２６ｍｇ、７４％）を無色のガラス状固体として得た。
【００８２】
メチル（Ｓ）−２−［Ｎ−アセチル−アミノ］−４−｛４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）［１，２，３］トリアゾール−１−イル｝ブタノエート：
【化１８】
臭化第一銅（１０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）に溶解して、トリストリアゾリルアミンリガンド（０．５８ｍＬ、アセトニトリル中で０．１２Ｍ）を添加した。この溶液（４５μＬ、５％の触媒充填）を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５ｍＬ、０．１５Ｍ、ｐＨ８．２）中のアミノ酸（２０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および糖５（２８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応混合物を、アルゴン下において室温で３時間撹拌した。その反応混合物を減圧下で乾燥するまでエバポレートして、その残滓をカラムクロマトグラフィー（シリカ、９：１のＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ〜４：４：２のＨ2Ｏ／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ）によって精製し、所望の１，２，３−トリアゾール（３７ｍｇ、９７％）を白色の固体として得た。
【化１９】
図ｘｘ：Ｏ−プロパルギル−Ｎ−アセチルグルコサミンＡからのＯ−プロパルギルＳｉａＬａｃＮＡｃの合成 ＳｉａＬａｃＮＡｃの極めて単純な高収率の酵素合成を使用した（参考文献Ｂａｉｓｃｈら）。任意の生成物を得るためには、フラッシュカラムクロマトグラフィー以外の精製はどの段階においても必要なかった。
【００８３】
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−β−Ｄ−グルコピラノシド
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドは以前に記載されている。本発明者らの目的のために、Ｖａｕｚｅｉｌｌｅｓ，Ｂｏｒｉｓ；Ｄａｕｓｓｅ，Ｂｒｕｎｏ；Ｐａｌｍｉｅｒ，Ｓａｒａ；Ｂｅａｕ，Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４２（４３）２００１，７５６７−７５７０の方法に従って下に示されるとおりにそれを調製した。
【化２０】
【００８４】
２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−β−ｄ−ガラクトピラノシル−１−プロパルギル−Ｄ−グルコピラノシド
【化２１】
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１５．０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）およびウリジン−５’−ジホスホガラクトース二ナトリウム塩（５９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのカコジル酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、２５ｍＭのＭｎＣｌ2、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４７）に溶解した。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｅｃ ２．４．１．２２、０．８Ｕ）およびアルカリホスファターゼ（ｅｃ ３．１．３．１、３９Ｕ）を添加し、その混合物を３７℃で２１時間穏やかに振盪した。このときｔｌｃ（１：２：２の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）は、アクセプターである糖の完全な消失を示した（Ｒf０．８）。この反応混合物は、シリカ上で凍結乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２：５：６の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）によって精製して、２３．７ｍｇ（９７％の収率）の白色非晶質固体を得た。
【００８５】
プロパルギル−（５−アセトイミド−３，５−ジデオキシ−ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトイミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド
【化２２】
２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−β−ｄ−ガラクトピラノシル−１−プロパルギル−Ｄ−グルコピラノシド（１２ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）を１．４ｍＬの水に溶解した。カコジル酸ナトリウムを添加し（６０ｍｇ、０．２８モル、最終濃度：０．２Ｍ）、塩化マンガン四水和物（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、最終濃度２９ｍＭ）およびウシ血清アルブミン（２ｍｇ）も同様に添加した。ｐＨを、７．１に調節して、その後に、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩（１９．８ｍｇ、１当量）およびα−２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加した。組み換え体（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｅｃ ２．４．９９．６、３０ｍＵ）およびアルカリホスファターゼ（ｅｃ ３．１．３．１、３０Ｕ）を添加して、その混合物を３７℃で７０時間穏やかに振盪し、その後に反応混合物をシリカ上で凍結乾燥して、フラッシュカラムクロマトグラフィー（５：１１：１５の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）によって精製し、２０．９ｍｇの非晶質固体（９５％の収率）を得た。
【００８６】
[Ｐ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ結合におけるスルホチロシンの役割を計測するためのＥＬＩＳＡアッセイ]
本発明によりグリコシル化されたタンパク質が、変更された生物学的結合特性を有することを示すために実験を行った。
【００８７】
ＥＬＩＳＡアッセイは以前に公開されたアッセイから変更した。修飾されたＳｓβＧタンパク質を２００ｎｇ／ウェルでコーティングした（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、２μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）。
【００８８】
ジチオスレイトール（５μＬ／ウェル、水中に５０ｍｇ／ｍＬ）を適切なレーンに添加し、硫酸化チロシン模倣体を還元した。このプレートを４℃で１５時間インキュベートした。このウェルをウシ血清アルブミン（アッセイ緩衝液中に２５ｍｇ／ｍＬ：２ｍＭのＣａＣｌ2、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、１ウェル当たり２００μＬ）を用いて３７℃で２時間ブロックした。
【００８９】
このプレートを洗浄緩衝液（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含むアッセイ緩衝液、１ウェル当たり３×４００μＬ）で洗浄し、その後にＰ−セレクチン（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６１３０６、ＣＨＯ細胞における組み換え体、短縮配列、膜貫通および細胞質ドメインを欠損、１００μＬの洗浄緩衝液中に異なる修飾をされたＳｓβＧ変異体の各々について４００ｎｇ／ウェル〜１．６ｎｇ／ウェルの連続２倍希釈法）を添加した。このプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
【００９０】
洗浄緩衝液を用いて２回洗浄した後、このウェルを抗Ｐ−セレクチン抗体（ＩｇＧ１サブタイプ、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ、クローンＡＫ−６、１００μＬのアッセイ緩衝液中に１００ｎｇ／ウェル）とともに、２１℃で１時間インキュベートし（さらに３つのコントロールウェル）、そして洗浄緩衝液（３×３００μＬ／ウェル）で洗浄した。
【００９１】
各々のウェルを抗マウスＩｇＧ特異的ＨＲＰコンジュゲート（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａ０１６８）とともに１時間２１℃でインキュベートした。このウェルを洗浄緩衝液（３×３００μＬ）で洗浄した。この結合は、ＴＭＢ−基質溶液（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ０４４０、１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、３７０ｍｍにおける吸光度の読み取りが直線域に入るまで（約１５分）、２２℃で暗所でインキュベートすることによって可視化した。
【００９２】
（（Ｓ）−２−アミノ−４−｛４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）［１，２，３］トリアゾール−１−イル｝ブタノエート
【化２３】
上記と同じ方法を用いて、Ａｈａに対して１．５当量のエチニルＣ−ガラクトシド５を用いて、最適化の研究を行なった。
【表３】
【００９３】
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌフラグメント調製物：
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ（ＴＨｐ）ペプチドフラグメント（２９５〜３０６；Ｈ2Ｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）12の類似体である（Ｈ2Ｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｈａ／Ｈｐｇ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）を、マイクロ波を用いたリバティー（Ｌｉｂｅｒｔｙ）ＣＥＭペプチド合成装置を用いて、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ−ポリスチレン樹脂［１％ジビニルベンゼン、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号０１−６４−００３７］上でＦｍｏｃ法によって合成した。
【００９４】
アジドタンパク質Ａｈａ含有タンパク質の糖−付加環化のための代表的な手順：
エチニル−β−Ｃ−ガラクトシド（５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）５を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．２、２００μＬ）に溶解した。タンパク質溶液（３００μＬ中に０．２ｍｇ）を、上記の溶液に添加して、十分に混合した。新たに調製されたアセトニトリル中の臭化銅（Ｉ）（９９．９９９％）の溶液（３３μＬの１０ｍｇ／ｍＬ）を、トリス−トリアゾリルアミンリガンド１１（１２０ｍｇ／ｍＬを１２．５μＬ）のアセトニトリル溶液と前もって混合した。予め形成したＣｕ−錯体溶液（４５μＬ）を混合物に添加して、その反応物をローテーターで１時間、室温で撹拌した。次いで、この反応混合物を遠心分離して、任意のＣｕ（ＩＩ）塩の沈殿を除去し、上清を、脱塩水（３．５ｍＬ）を用いて溶出するＰＤ１０カラムで脱塩した。その溶離液をビバスピン膜濃縮器（１０ｋＤａの分画分子量）で濃縮して、５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液で、次いで脱塩水（３×５００μＬ）で洗浄した。最終的に、溶液を１００μＬに濃縮し、その生成物を、ＬＣ−ＭＳ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ＣＤ、トリプシン消化物およびトリプシン消化物−ＬＣＭＳ／ＭＳによって特性を明らかにした。
【表４】
【表５】
【００９５】
アルキニルタンパク質Ｈｐｇ含有タンパク質の糖−付加環化：
類似の手順をＨｐｇ含有タンパク質の修飾のために使用した。この場合、アジドを有する炭水化物（ＨＯ3ＧｌｃＮＡｃＮ3）１を、アルキニル−β−Ｃ−グリコシドの代わりに反応相手として用いた。
【００９６】
ＴＨｐフラグメント二重特異的グリココンジュゲーション（ｄｕａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）：
新たに合成されたペプチド（Ｈｐｇ−またはＡｈａ−取り込み、０．５ｍｇ）を含有する水性のリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．２、０．３ｍＬ）の溶液に、グルコシドＭＴＳ−試薬７を含有する水溶液（５０μＬ、３３ｍＭ、５当量）を添加した。この反応物を回転式（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）ローテーターに１時間おいて、その後に、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５μ Ｃ１８ １１０Ａカラム（流速：１．０ｍＬ／分、移動相勾配：０．０５％ギ酸含有Ｈ2Ｏから０．０５％ギ酸含有ＭｅＣＮへ２０分以上かける）を用いて一定分量についてＬＣＴ−ＭＳ分析を行った。
【００９７】
銅触媒錯体の溶液は、臭化第一銅（５ｍｇ、９９．９９９％純粋）およびｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１（１８ｍｇ）をＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）に溶解することによって作成した。エチニル糖５またはアジド糖１（６ｍｇ）を、ジスルフィド結合を形成するグリココンジュゲートの反応混合物に溶解し、その後に銅（Ｉ）錯体（１５μＬ）を添加した。Ａｈａ提示ペプチドとエチニル糖との間の反応を、ＬＣ−ＭＳ分析によって完了を検出し、室温で１時間後に完了させた。１時間後に、Ｈｐｇ提示ペプチドおよびアジド糖の反応物に、余分な量の銅（Ｉ）錯体溶液（１０μＬ）を添加した。さらなる１時間の期間の後に、ＬＣ−ＭＳ分析によって、出発物質が所望のコンジュゲート化生成物へ完全に変換したことを実証した。反応部位は、丸で印を付ける。
【化２４】
【化２５】
【００９８】
糖−付加環化のための反応条件の最適化に対するコメント：
トリストリアゾールリガンド１１は、水性の反応混合物中でＣｕ（Ｉ）を安定化するのに有用であることが文献13において以前に示されている。それが存在しない場合、Ｃｕ（ＩＩ）への酸化が急速に生じる。他の溶媒におけるＣｕＢｒの溶解度が低いため、アセトニトリルが選択された。
【００９９】
弱アルカリ性の緩衝系（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５）が、修飾反応のために最も適切であることが見出された。文献中の多くの以前の例は、反応混合物に還元剤を添加することによってＣｕ（ＩＩ）塩のインサイチュでの還元に依存している。タンパク質修飾の触媒のために、Ｃｕ（ＩＩ）のインサイチュでの還元を使用する本発明者らの全ての試みは、不満足であることが判明した。対応するサンプルのスペクトルの質は低く、デコンボリューションによって不十分なシグナル対ノイズ比が得られた。
【０１００】
酵素活性：
速度論的解析を行い、変異体タンパク質およびグリココンジュゲートが酵素活性を保持することを示した（データ示さず）。
【０１０１】
レクチン結合研究：
グリココンジュゲート化された糖が生物学的標的化に影響することを示すため、実験を行った。
【０１０２】
グリココンジュゲート化されたＳｓβＧ変異体のレクチン結合特性15は、固定化されたレクチンアフィニティカラムでの残留分析によってキャラクタライズ［Ｇａｌａｂカタログ番号ＰＮＡ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ：０５１０６１、Ｃｏｎ Ａ：０５１０４１、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｋ−ＷＧＡ−１００１］。溶出画分は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬14で可視化して、吸光度を５９５ｎｍで測定した。
【表６】
Ｇｌｃ−コンジュゲート（Ｇｌｃ ＳｓβＧ）が、バックグラウンドを上回る有意な結合を示さなかったのに対し、Ｍａｎ ＳｓβＧは、マメ科植物のレクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対する結合を明確に実証した。この有意な結合はまた、ガラクトフィリック（ｇａｌａｃｔｏｐｈｉｌｉｃ）レクチンのピーナツのアグルチニン（ＰＮＡ）に対するβ−Ｇａｌ−トリアゾールグリココンジュゲート化ＳｓβＧの結合の場合にも見出された。しかし、キトビオース（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）（ＧｌｃＮＡｃ ＳｓβＧ）コンジュゲート、およびＧｌｃＮＡｃコンジュゲートは少しばかり、スピンアフィニティーカラムのネオグリコペプチド（ｎｅｏ−ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）の溶出を遅らせることによって、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）レクチンに結合することが見出された。マンノースコンジュゲートと反対にグルコースコンジュゲートの結合の欠失は、ＣｏｎＡのグルコースに対する低い親和性によって説明され得る可能性がある16。ＣｏｎＡによる単糖類の相対的な結合は、ＭｅαＭａｎ：Ｍａｎ：ＭｅαＧｌｕ：Ｇｌｕが２１：４：５：１の比であることが見出されている。従って、マンノース単糖類は、グルコース単糖類よりもＣｏｎＡによって４倍強固に結合される。芳香族トリアゾールはまた、ジスルフィド結合したグルコシドより増大したマンノシドの結合に寄与し得る17。
【０１０３】
上述の構築物のいくつかで見出され、その他では見出されなかった結合の欠失によって、糖タンパク質の正確な調製の必要性が強調される。
【０１０４】
溶媒露出度（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）：
現在まで化学反応におけるタンパク質反応性のほんのわずかな研究しか、アミノ酸残基露出度（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の統合的な評価18を示していない19〜21。
【０１０５】
ＳｓβＧのタンパク質結晶構造は、引用文献22から得た。ＳｓβＧの二量体の単量体Ａの溶媒露出度は、Ｎａｃｃｅｓｓ23によって評価した。単量体Ｂの露出度データは、ほぼ同一の値を与えた。相対的な側鎖露出度の総計として与えられた値が本研究において重要である。これらは、トリペプチドＡｌａ−Ｘ−Ａｌａにおける同じ側鎖の露出度に対する所定のアミノ酸Ｘの側鎖の露出度の指標である。従って、研究されたＳｓβＧ変異体のＮ末端残基Ｍｅｔ１の露出度は、算出されたＷＴタンパク質のものよりもさらに高いことが予想される。なぜなら発現された変異体は、Ｈｉｓ7−タグ（番号付けなし）によって残その他の配列から隔てられたＭｅｔ１−Ｇｌｙ２を有するからである。
【０１０６】
溶媒露出度はさらに、天然のアミノ酸配列に基づいており、例えば、組み込まれたホモアジドアラニンおよびホモプロパルギルグリシン変異体には基づかない。
【０１０７】
計算は、種々のプローブサイズ（１．０Å、１．４Åおよび２．８Å）を用いて行われた。アミノ酸側鎖が少ないほどプローブサイズ増大によって接近可能になる。
【０１０８】
これらのデータ（下の表を参照されたい）に基づいて、位置１、４３、２７５、２８０のメチオニン残基が比較的接近可能であることが理解される。それらのメチオニン類似体の変異体についても同じことが期待され得る。
【表７】
下の図は、色で、ＷＴ−ＳｓβＧの相対的な露出度を示す。
【０１０９】
ＴＩＭバレルについて：
タンパク質結晶構造で観察された最も共通の三次の折り畳みはＴＩＭバレルである。これは、全てのタンパク質のほぼ１０％に存在すると考えられている24。
【０１１０】
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ（ＴＨｐ）糖タンパク質について：
ＴＨｐは、哺乳動物における最も豊富な糖タンパク質である12、25。Ｎ−グリコシル化パターンおよびＯ−グリコシル化パターンは、Ｔｈｐの生物学的機能において重要な役割を果たすことが知られている26。８つの考えられるＮ−グリコシル化部位のうち、７つがグリコシル化されることが既知である。これらのうちにはＡｓｎ−２９８残基がある27。
【０１１１】
エリスロポエチンのグリコシル化およびグルコシルセラミダーゼ
エリスロポエチンについて、個々のグリコシル化部位は、Ｎ結合型炭水化物のためのＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３である。このタンパク質は、Ｓｅｒ１２６に単独のＯ結合型グリコシル化部位を含有する。複数の部位特異的な突然変異誘発、および新しく導入されたＭｅｔ部位でのメチオン類似体の取り込みを用いて（Ｅｐｏの天然の配列は、単一のメチオニン（Ｍ５４）しか含有しない）、このタンパク質を修飾してもよい。
【０１１２】
ゴーシェ病の進行において重要な役割を果たす６０ｋＤの糖タンパク質であるグリコシルセラミダーゼ（Ｄ−グルコセレブロシダーゼ）も、この方法によってグリコシル化される。
【０１１３】
引用文献
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２２．Ａｇｕｉｌａｒ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈｅｏｎ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ：ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ ａｓ ａ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１１，７８９−８０２（１９９７）．
２４．Ｆａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｋ．Ａｎ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ ｆｕｌｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒｏｕｂｌｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４０９−４１２（１９９３）．
２５．Ｔａｍｍ，Ｉ．＆ Ｈｏｒｓｆａｌｌ，Ｆ．Ｌ．Ａ ｍｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ｍｕｍｐｓ，ａｎｄ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｅｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９５，７１−７９（１９５２）．
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【技術分野】
【０００１】
本出願は、タンパク質のグリコシル化のための方法、およびこれらの方法によって提供される糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の翻訳と同時の（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）グリコシル化および翻訳後の（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）グリコシル化は、それらの生物学的性質および安定性において重要な役割を果たす（Ｒ．Ｄｗｅｋ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９６：６８３−７２０（１９９６））。例えば、グリコシル化は、細胞のシグナル伝達および調節、発達および免疫のような本質的な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。これらの事象の研究は、同じペプチド骨格を保有するが、グリコシル化の種類および部位の両方が異なる、いわゆる糖型の混合物として糖タンパク質が自然に生じるという事実によって困難になる。さらに、タンパク質のグリコシル化は、直接に遺伝子の制御下にはないので、哺乳動物細胞培養における治療用糖タンパク質の発現は、糖型の不均一の混合物をもたらす。従って、均一の糖タンパク質の糖型を合成できることは、正確な研究の目的に必須であるだけでなく、複数の糖型の混合物として現在市販されている治療用糖タンパク質（例えば、エリスロポエチンおよびインターロイキン）を調製する場合にも重要性を増している。従って、タンパク質のグリコシル化の程度および種類を制御することによって、生物学的システムにおけるその性質を研究および制御することが可能になる。
【０００３】
化学合成を含む、タンパク質のグリコシル化のための多数の方法が公知である。糖タンパク質の化学合成は、特定の利点、特に、純粋な糖タンパク質の糖型を得る手段の可能性を提供する。１つの公知の合成方法は、チオール選択的炭水化物試薬、グリコシルメタンチオスルホネート試薬（糖−ＭＴＳ）を利用する。このようなグリコシルメタンチオスルホネート試薬は、タンパク質のチオール基と反応して、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されるグリコシル残基を導入する（例えば、国際公開第００／０１７１２号を参照されたい）。
【０００４】
Ｃｕ（Ｉ）が触媒するトリアゾールの形成は、合成においてのみならず（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７（９）：３０５７−３０６４，２００２）、多数の標識を用いる研究のために用いられている（Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１１６４−１１１６５，２００３；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１０５９８−１０６０２，２００４；およびＳｐｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：５３５−５４６，２００４）。この反応の魅力的な特徴は、アジドとアルキンの反応の高い選択性、ならびに種々の他の官能基の存在下において水性条件下で反応を行うことができることである。
【０００５】
最近の文献では（Ｋｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（１８）：３１２３−３１２６，２００４）、適切に官能基化され保護された炭水化物および保護されたアミノ酸／ペプチドからの、トリアゾールが結合したグリコシルアミノ酸および低分子糖ペプチドの合成が証明されている。また、他のタイプのトリアゾール結合複合炭水化物が報告されており（Ｃｈｉｔｔａｂｏｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４６：２３３１−２３３６，２００５）、これは、保護された炭水化物誘導体を利用して合成された。
【０００６】
ＬｉｎおよびＷａｌｓｈは、１０アミノ酸の環状ペプチドであるＮ−アセチルシステアミンチオエステル（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ ｔｈｏｉｅｓｔｅｒ）（ＳＮＡＣ）を修飾してペプチドにアルキンの官能基を導入した。この方法は、ペプチド中のアミノ酸を、そのペプチド中の異なる位置に、非天然のアミノ酸類似体であるプロパルギルグリシン（ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）に置換する工程を包含する（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１２８２−１２８８（２０００）およびＫｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６：９４８７−９４９３（２０００））。次いで、この修飾されたペプチドをアジド糖に結合させ、グリコシル化環状ペプチドを生成する。
【０００７】
簡易な方法、例えば、先行技術に記載されたよりも、より複雑な構造のグリコシル化、例えばタンパク質のグリコシル化のために保護されたグリコシル化試薬の使用を必要とせず、そして広範囲のタンパク質における複数の部位でのグリコシル化を可能にする方法が必要である。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第一の態様に従って、タンパク質を修飾する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つのアルキン基および／またはアジド基を含むようにこのタンパク質を修飾する工程を包含する。
【０００９】
本明細書において用いる場合、「アジド」基とは、（Ｎ＝Ｎ＝Ｎ）を指し、そして「アルキン」基は、ＣＣの三重結合を指す。
【００１０】
タンパク質の修飾は一般には、アルキン基および／またはアジド基を含む１つ以上のアミノ酸類似体で、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸を置換することを包含する。あるいは、または前述のものに加えて、タンパク質の修飾は、本明細書で論じられているタンパク質に１つ以上の天然のアミノ酸を導入することを包含し得る。別の手段としては、タンパク質の修飾は、化学基、例えば、チオール基を含むようにアミノ酸の側鎖を修飾することを包含してもよい。アジド基、アルキン基またはチオール基を含むようにタンパク質を修飾することは代表的には、タンパク質のアミノ酸配列内の所定の位置で生じる。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、タンパク質の修飾は、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸を、１つ以上の非天然（すなわち、天然には存在しない）アミノ酸類似体で置換することを包含する。非天然アミノ酸類似体は、メチオニンの類似体であってもよい。このメチオニンの類似体は、ホモプロパルギルグリシン（Ｈｐｇ）（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，１２８２−１２８８（２０００））、ホモアリルグリシン（Ｈａｇ）（Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，６８−７０（１９９８））および／またはアジドホモアラニン（Ａｈａ）（Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１９−２４（２００２）、好ましくはホモプロパルギルグリシンであってもよい。
【００１２】
１つ以上の非天然のアミノ酸、例えば、メチオニンの類似体を導入するためのタンパク質の修飾は、当分野で公知の方法によって達成され得る。例えば、Ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，１２８２−１２８８（２０００）を参照されたい。詳細には、１つ以上のメチオニンの類似体を導入するためのタンパク質の修飾は、タンパク質をコードする核酸配列に、メチオニンをコードするコドンＡＵＧを挿入するための部位特異的突然変異誘発を包含する。好ましくは、メチオニンのコドンの挿入は、タンパク質をコードする核酸配列内の所定の位置で、例えば、そのタンパク質のＮ末端（すなわちアミノ末端）をコードする核酸配列の領域内の位置で起こる。次いで、タンパク質の発現は、メチオニンの類似体、例えば、ＡｈａまたはＨｐｇの存在下で、栄養要求性メチオニン欠損細菌株において、挿入されたメチオニンコドンを含有する核酸配列を翻訳することによって達成され得る。
【００１３】
本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸を、ホモプロパルギルグリシンまたはホモアリルグリシンで置換する工程によってアルキン基を含むための修飾を包含し得る。
【００１４】
あるいは、またはさらに、本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、そのタンパク質中の１つ以上のアミノ酸をアジドホモアラニンで置換する工程によってアジド基を包含するための修飾を包含し得る。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法は、タンパク質の修飾であって、アジド基（本明細書に記載）およびアルキン基（本明細書に記載）を包含するための修飾を包含する。
【００１６】
「タンパク質」という用語は、本明細書において、大まかに言えば、ペプチド結合によって結合した複数（最小２つのアミノ酸）のアミノ酸残基（一般には１０より多い）を意味する。タンパク質中に含まれる任意のアミノ酸は好ましくはαアミノ酸である。任意のアミノ酸は、Ｄ型またはＬ型であってよい。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、タンパク質は例えば１つ以上のシステイン残基に存在するチオール（−ＳＨ）基を含む。このシステイン残基は、タンパク質中に天然に存在し得る。タンパク質がシステイン残基を含まない場合、タンパク質は、１つ以上のシステイン残基を含むように修飾され得る。チオール基は、例えば、チオール基をアミノ酸の側鎖に導入するための、または１つ以上のシステイン残基を導入するための、タンパク質の化学修飾によってタンパク質に導入され得る。あるいは、チオール含有タンパク質は、システイン残基を導入するための部位特異的な突然変異誘発を介して調製され得る。部位特異的な突然変異誘発は、当分野で公知の技術である（例えば、国際公開第００／０１７１２号を参照されたい）。詳細には、システイン残基は、タンパク質をコードする核酸配列にコドンＵＧＵを挿入することによってタンパク質に導入されてもよい。好ましくはシステインのコドンの挿入は、タンパク質をコードする核酸配列内の所定の位置で、例えば、タンパク質のＣ末端（すなわちカルボキシル末端）をコードする核酸配列の領域内の位置で生じる。その後に、修飾されたタンパク質は、例えば、細胞発現系で発現され得る。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、「タンパク質」という用語は、大まかに言えば、ペプチド結合によって結合される複数のアミノ酸残基を意味する。これは交換可能に用いられて、ペプチドおよびポリペプチドと同じものを意味する。
【００１９】
「タンパク質」という用語はまた、タンパク質のフラグメント、類似体および誘導体を含むものとし、ここでこのフラグメント、類似体または誘導体は、参照タンパク質と本質的に同じ生物学的活性または機能を保持する。
【００２０】
このタンパク質は、直線構造を有してもよいが、好ましくは、折り畳まれた、例えば、三次元または四次元の立体構造を有する非直線構造である。このタンパク質は、それに結合された１つ以上の補欠分子族を有してもよく、例えば、このタンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質、または色素タンパク質であってもよい。好ましくは、このタンパク質は複合タンパク質である。
【００２１】
好ましくは、このタンパク質は、１０〜１０００のアミノ酸、例えば、１０〜６００のアミノ酸、例えば、１０〜２００のアミノ酸または１０〜１００のアミノ酸を含む。従って、このタンパク質は、１０〜２０、５０、１００、１５０、２００または５００のアミノ酸を含んでもよい。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、このタンパク質は、１０ｋＤａより大きい分子量を有する。このタンパク質は、少なくとも２０ｋＤａまたは少なくとも６０ｋＤａ、例えば、１０〜１００ｋＤａの分子量を有してもよい。
【００２３】
このタンパク質は、線維状タンパク質または球状タンパク質のグループに属し得る。好ましくは、このタンパク質は球状タンパク質である。
【００２４】
好ましくは、このタンパク質は生物学的に活性なタンパク質である。例えば、このタンパク質は、糖タンパク質、血清アルブミンおよび他の血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択されてもよい。
【００２５】
タンパク質の例としては、増殖因子、分化因子、サイトカイン、例えば、インターロイキン、（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０またはＩＬ−２１、αまたはβのいずれか）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘発因子（ＩＧＩＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）；サイトカインレセプター；フリーラジカル消去酵素を含んでもよい。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、タンパク質はホルモンである。好ましくは、ホルモンはエチスロポエチン（Ｅｐｏ）である。
【００２７】
本発明の方法によって修飾されるタンパク質は有利には、固有のタンパク質の機能／活性を保持している。
【００２８】
本発明のさらなる好ましい態様では、タンパク質は酵素である。好ましくは、この酵素はグルコシルセラミダーゼ（Ｄ−グルコセレブロシダーゼ）（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのβ−グリコシダーゼ（ＳＳｂＧ）である。
【００２９】
本発明はさらに、タンパク質のアミノ酸配列内の所定の部位におけるアミノ酸の側鎖へのアルキン基、アジド基またはチオール基のようなタグの部位選択的な導入（本明細書において以前に考察）に基づいており、その後、各々のそれぞれのタグについて選択的である、連続的および直交性のグリコシル化反応が起こる。このように、特異的な複数部位の化学的タンパク質グリコシル化が達成される。
【００３０】
従って、本発明の第二の態様では、タンパク質をグリコシル化するための方法が提供され、この方法は、
ｉ）本発明の第一の態様の方法に従ってタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）において修飾されたタンパク質と、
（ａ）アジド基を含むように修飾された炭水化物部分；および／または
（ｂ）アルキン基を含むように修飾された炭水化物部分とを、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下で反応させる工程と、を包含する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「グリコシル化」とは、共有結合を介する別の部分へのグリコシル単位の付加の一般的なプロセスをいう。
【００３２】
典型的には、タンパク質が、工程（ｉ）においてアルキン基を含むように修飾される場合、工程（ｉｉ）における反応は（ａ）における炭水化物部分との反応である。さらに、タンパク質が工程（ｉ）においてアジド基を含むように修飾される場合、工程（ｉｉ）における反応は（ｂ）における炭水化物部分との反応である。
【００３３】
好ましくは、タンパク質（工程ｉ）の修飾はさらに、例えば、システイン残基の挿入を通じて、チオール基を含むように本明細書において規定されるようにタンパク質を修飾する工程を包含する。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、タンパク質をグリコシル化する方法が提供され、この方法は、
ｉ）（ａ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
（ｂ）（ａ）におけるタンパク質の修飾の前または後に、任意選択的にチオール基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）で修飾されたタンパク質と、炭水化物部分（ｃ）との、チオール選択的炭水化物試薬（ｄ）との反応の前または後の、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下における連続的な反応であって、
（ｃ）がアジド基を含むように修飾された炭水化物部分、および／またはアルキン基を含むように修飾された炭水化物部分；ならびに
（ｄ）がチオール選択的炭水化物試薬である、反応、
を包含する。
【００３５】
工程（ｉ）の（ａ）および（ｂ）は本明細書に記載されるとおりである。修飾されるべきタンパク質がシステイン残基を含有する場合、チオール基を含むためのタンパク質の修飾は、必要でないかもしれない。あるいは、このタンパク質に既に存在するチオール基に加えて１つ以上のチオール基を含むことが所望され得る。
【００３６】
チオール選択的炭水化物試薬は、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されたグリコシル残基を導入するために、タンパク質のチオール基と反応する任意の試薬を含んでもよい。このチオール選択的炭水化物試薬は、グリコアルカンチオスルホナート試薬、例えば、グリコメタンチオスルホナート試薬（糖−ＭＴＳ）（国際公開第００／０１７１２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）、グリコセレニルスルフィド試薬（国際公開第２００５／０００８６２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）、およびグリコチオスルホナート試薬（国際公開第２００５／０００８６２号を参照されたい。この内容が全体として本明細書の一部をなすものとする）を含んでもよいが、これらに限定されない。グリコメタンチオスルホネート試薬は、式ＣＨ3−ＳＯ2−Ｓ−炭水化物部分の試薬である。
【００３７】
グリコチオスルホネート試薬およびグリコセレニルスルフィド（ＳｅＳ）試薬は一般には、国際公開第２００５／０００８６２号（引用することによって本明細書の一部をなすものとする）における式Ｉの試薬である。詳細には、グリコセレニルスルフィド（ＳｅＳ）試薬は、式Ｒ−Ｓ−Ｘ−炭水化物部分の試薬であって、ここでＸはＳｅであり、そしてＲは、任意選択的に置換される、Ｃ１−１０アルキル基、フェニル基、ピリジル基またはナフチル基である。グリコチオスルホネート試薬は、式Ｒ−Ｓ−Ｘ−炭水化物部分の試薬であって、ここでＸはＳＯ2であり、そしてＲは、任意選択的に置換される、フェニル基、ピリジル基またはナフチル基である。このような試薬は、ジスルフィド結合を介してタンパク質に対する炭水化物の部位選択的な結合を提供する。
【００３８】
好ましくは、修飾される炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖および他の多糖類を含み、天然に存在する糖タンパク質に、または生物学的システムに存在する任意の炭水化物部分を含む。含まれるのは、グリコシル誘導体またはグリコシド誘導体、例えば、グルコシル誘導体、グルコシド誘導体、ガラクトシル誘導体またはガラクトシド誘導体である。グリコシル基およびグリコシド基は、α基およびβ基の両方を含む。適切な炭水化物部分としては、グルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、シアル酸、およびマンノース、ならびに少なくとも１つのグルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮａｃ、シアル酸、および／またはマンノース残基を含む多糖類を含む。
【００３９】
炭水化物部分としては、Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、Ｇｌｃ（Ｂｎ）4β−、Ｇａｌ（Ａｃ）4β−、Ｇａｌ（Ｂｎ）4β−、Ｇｌｃ（Ａｃ）4α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）3α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）4β−、β−Ｇｌｃ、β−Ｇａｌ、α−Ｍａｎ、α−Ｍａｎ（Ａｃ）4、Ｍａｎ（１，６）Ｍａｎα−、Ｍａｎ（１−６）Ｍａｎ（１−３）Ｍａｎα−、（Ａｃ）4Ｍａｎ（１−６）（Ａｃ）4Ｍａｎ（１−３）（ＡＣ）2Ｍａｎα−、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ、Ｅｔ−α−Ｇｌｃ、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ、−Ｅｔ−Ｌａｃ、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）2、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）3、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）4、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）5、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）6、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）7、およびこれらの脱保護された等価物を含んでもよい。
【００４０】
天然に存在する糖に由来する炭水化物部分を形成する任意の糖単位は各々が、天然に存在するエナンチオマーの形態であり、これは、Ｄ型（例えば、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトース）またはＬ型（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）のいずれであってもよく、任意のアノマー結合はα結合であってもまたはβ結合であってもよい。
【００４１】
本発明の一つの実施形態では、アジド基を含むように修飾された炭水化物は、グリコシルアジドである。
【００４２】
本発明の一つの実施形態では、アルキン基を含むように修飾された炭水化物は、アルキニルグリコシドである。
【００４３】
好ましくは、アジドおよび／またはアルキンで修飾された炭水化物部分（例えば、グリコシルアジドおよび／またはアルキニルグリコシド）は、保護基を含まず、すなわち、保護されていない。この保護されていないアジドおよび／またはアルキンで修飾された炭水化物部分は、保護された糖にアジド基またはアルキン基を付加することによって調製され得る。炭水化物部分における任意の−ＯＨ基のための適切な保護基は、アセテート（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、シリル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＭＤＰＳｉ））、アセタール、ケタールおよびメトキシメチル（ＭＯＭ）を含む。次いで、保護基は、タンパク質に炭水化物部分を付加する前または後に除去される。このように、工程（ｉｉ）で規定される反応は、保護されていないグリコシドで行われる。
【００４４】
本発明の好ましい態様では、Ｃｕ（Ｉ）触媒はＣｕＢｒまたはＣｕＩである。好ましくは、触媒はＣｕＢｒである。Ｃｕ（Ｉ）触媒は、反応においてＣｕ（ＩＩ）塩（例えば、Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ4）を使用することによって提供され得、これは、反応混合物中にインサイチュで還元剤（例えば、アスコルビン酸、ヒドロキシルアミン、亜硫酸ナトリウムまたは銅元素）を添加することによってＣｕ（Ｉ）に還元される。好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）触媒は、この反応へのＣｕ（Ｉ）Ｂｒの直接の添加によって提供される。好ましくはＣｕ（Ｉ）Ｂｒは高純度で、例えば、９９．９９９％のように少なくとも９９％の純度で提供される。さらに好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ）は、安定化リガンド、例えば、窒素塩基の存在下で溶媒中に提供される。このリガンドは、反応混合物中においてＣｕ（Ｉ）を安定化する。の非存在下では、Ｃｕ（ＩＩ）への酸化が急速に起こる。好ましくは、このリガンドはトリストリアゾリルアミンリガンド（ｔｒｉｓｔｒｉａｚｏｌｙｌ ａｍｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ）である（ＷｏｒｍａｌｄおよびＤｗｅｋ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７，Ｒ１５５−Ｒ１６０（１９９９））。この触媒の溶媒は、７．２〜８．２のｐＨを有していてもよい。この溶媒は、水混和性の有機溶媒（例えば、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、または、リン酸緩衝液のような水性の緩衝液であってもよい。好ましくは、この溶媒はアセトニトリルである。
【００４５】
工程（ｉｉ）における反応は、（タンパク質および／またはグリコシド上の）アルキン基と（タンパク質および／またはグリコシド上の）アジド基との間の［３＋２］付加環化反応であって、置換された１，２，３−トリアゾールを生成し（Ｈｕｉｇｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３５７−３６９（１９６１））、これがタンパク質と糖との間の結合を提供する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一の態様または第二の態様の方法によって修飾されるタンパク質を提供する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のタンパク質を提供する。
【化１】
式中、ａおよびｂは０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）であり；ｐおよびｑは、１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；このタンパク質は本明細書に規定されるとおりである。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の第二の態様の方法によって修飾されるグリコシル化タンパク質を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、式（ＩＶ）のグリコシル化タンパク質を提供する。
【化２】
式中、ｔは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であって；スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分である。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、スペーサーは置換または非置換のＣ１−６アルキル基である。好ましくは、スペーサーは存在しないか、メチルまたはエチルである。
【００５１】
本発明のさらなる好ましい態様では、スペーサーはヘテロアルキルであって、このヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳであり、このアルキルは、メチルまたはエチルである。好ましくはこのヘテロアルキル基は、式ＣＨ2（Ｘ）yであって、式中、ＸはＯ、ＮまたはＳであり、Ｙは０または１である。典型的にはこのヘテロ原子は、炭水化物部分に直接結合される。
【００５２】
置換基は、Ｈおよびハロから選択される一価の原子のみならず、ハロゲン、またはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＳｉから選択される１〜３０個の複数の原子価を有する部分である。１つの化合物群では、置換基は、存在する場合は、例えば、水素およびハロゲンから選択される一価の原子のみならず、ハロゲンおよび１、２、３、４または５つの複数の原子価の原子を有する部分より選択される。複数の原子価の原子は、例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢ、例えば、Ｃ、Ｎ、ＳおよびＯから選択されてもよい。
【００５３】
「置換された」という用語は、ある部分または基に関して本明細書において用いられる場合、それぞれの部分における１つ以上の水素原子、特に水素原子のうち１、２または３つが、対応する数の記載された置換基によって互いに独立して置換されることを意味する。
【００５４】
当然ながら、置換はそれらが化学的に可能である位置のみであることが理解され、当業者は、特定の置換が可能であるかどうかを、不適切な労力なしに、（実験的にまたは理論的にのいずれかで）決定し得る。例えば、遊離の水素を有するアミノ基またはヒドロキシ基は、不飽和（例えば、オレフィン）結合で炭素原子に結合する場合、不安定であり得る。さらに、当然ながら、本明細書に記載される置換基はそれ自体、当業者によって認識されるような適切な置換基に対する前述の制限を条件として、任意の置換基で置換され得ることが理解される。
【００５５】
従って、置換されたアルキル基は例えば、前回規定されたアルキルであってもよく、１つ以上の置換基で置換されてもよく、この置換基は、同じであっても異なってもよく、ヒドロキシ、エーテル化ヒドロキシル、ハロゲン（例えば、フッ素）、ヒドロキシアルキル（例えば、２−ヒドロキシエチル）、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチルまたは２，２，２−トリフルオロエチル）、アミノ、置換アミノ（例えば、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノまたはＮ−アルカノイルアミノ）、アルコキシカルボニル、フェニルアルコキシカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドロキシグアニジノ、ホルムアミジノ、イソチオウレイド、ウレイド、メルカプト、アシル、アシルオキシ、例えば、エステル化カルボキシ、例えば、カルボキシ、スルホ、スルファモイル、カルバモイル、シアノ、アゾ、ニトロなどから選択される。
【００５６】
本発明の好ましい態様では、このグリコシル化タンパク質は式（Ｖ）：
【化３】
のタンパク質であり、式中、ｐおよびｑは、０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）であり；ｔは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；タンパク質および炭水化物部分は本明細書に規定されるとおりである。
【００５７】
タンパク質または炭水化物部分は、下の式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）に示されるような１または２の位置で１，２，３，−トリアゾールに結合され得る。従って、本発明のグリコシル化タンパク質は、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）
【化４】
のタンパク質であってもよく、式中、タンパク質、炭水化物部分、ｐ、ｑおよびｔは、本明細書に規定されるとおりである。
【００５８】
好ましくはｐは２である。
【００５９】
好ましくはｑは０である。
【００６０】
本発明はさらに、式（ＶＩＩＩ）
【化５】
のグリコシル化タンパク質を提供し、式中、ｕは１〜５の整数（例えば、１、２、３、４または５）であり；スペーサーおよびｔは、本明細書に規定されたとおりであり、ＷおよびＺは炭水化物部分であって、これは同じであっても異なってもよい。
【００６１】
好ましくは、グリコシル化タンパク質は式（ＩＸ）
【化６】
のタンパク質であり、式中、スペーサー、ｐ、ｑ、ｔおよびｕは、本明細書に規定されたとおりであり；ｒおよびｓは、０〜５の整数（例えば、０、１、２、３、４または５）である。
【００６２】
さらに好ましくは、グリコシル化タンパク質は式（Ｘ）または（ＸＩ）
【化７】
のタンパク質であり、式中、タンパク質、スペーサー、炭水化物部分、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、本明細書に規定されたとおりである。
【００６３】
本発明のグリコシル化タンパク質は典型的には、それらの固有の機能を保持し、一部のタンパク質は、本明細書に記載されるようなグリコシル化の後、機能の向上、例えば、（非グリコシル化酵素と比較して）酵素活性の増加を実証し得る。本発明のグリコシル化タンパク質はまた、他の種々のタンパク質との付加的なタンパク質間結合能力、例えば、レクチン結合能力を示し得る。従って本発明の方法は、他の種々のタンパク質、例えば、レクチンとのタンパク質間結合能力などの、付加的な、固有ではないタンパク質の機能性を含むように、タンパク質機能を操作するのに有用である。
【００６４】
本発明のグリコシル化タンパク質は、医薬において、例えば、疾患または病態の治療または予防において有用であり得る。従って、本発明は、製薬学的に受容可能な担体または希釈剤と組み合わせて、本発明によるグリコシル化タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。本発明のタンパク質は、例えば、貧血症またはゴーシェ病の治療のために有用であり得る。
【００６５】
本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲を通じて、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む、包含する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、ならびに用語の変形、例えば、「含んでいる、包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味し、そして他の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することは意図していない（そして排除しない）。
【００６６】
本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲を通じて、単数形は、文脈が他のことを要求しない限り、複数を包含する。詳細には、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈が他のことを要求しない限り、単数だけでなく複数も意図するものと理解されるべきである。
【００６７】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と結び付けて記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または化学基は、本明細書と矛盾しない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であることが理解されるべきである。
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例に関連してここに記載される。
【実施例】
【００６９】
複数の部位特異的な突然変異誘発：
β−ガラクトシダーゼＳｓβＧの多数の変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されているＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ［カタログ番号２００５１４］を用いて作成した。ＳｓβＧ Ｃ３４４Ｓを担持するプラスミドｐＥＴ２８ｄをテンプレートとして用いた1。対応する変異誘発プライマーは、ＩｌｅによるＭｅｔ残基の置換のために設計され、そしてＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓによってカスタム合成され、以下のとおりであった：
【表１】
【００７０】
この方法では、所望の数（１〜１０）のＭｅｔ残基を有する変異体が誘導され得る。さらなる変異が、以下の相補的なフォワードおよびリバースの変異誘発プライマーのセットを用いた単一の部位特異的な突然変異によって導入された：
【表２】
【００７１】
対応する変異体タンパク質は、以下に概説されるプロトコルを用いて発現され得る。
【００７２】
Ｍｅｔ類似体組み込みによるタンパク質発現：
培地交換プロトコル（ｍｅｄｉｕｍ ｓｈｉｆｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）2を用いたタンパク質発現による、ホモプロパルギルグリシン（Ｈｐｇ）またはアジドホモアラニン（Ａｈａ）のタンパク質への組み込み。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ８３４（ＤＥ３）の一晩培養物、ｐＥＴ２８ｄ ＳｓβＧ Ｃ３４４Ｓを、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびＬ−メチオニン（４０μｇ／ｍＬ）を補充したｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓの培地中で増殖した（約１６時間）。この一晩培養物を用いて、予め温めた（３７℃）培養培地（１．０Ｌ、上記と同じ組成）に植菌し、細胞を３時間増殖させた（ＯＤ600約１．２）。培地の交換は、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、メチオニンが含まれていない培地（０．５ｌ）中での再懸濁、および非天然のアミノ酸（ＤＬ−Ｈｐｇは８０μｇ／ｍＬ、Ｌ−Ａｈａは４０μｇ／ｍＬ）を含有する、予め温めた（３７℃）培養培地（１．０Ｌ）への移行によって行った。その培養物を２９℃で１５分間振盪し、次いで１．０ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導した。タンパク質発現は２９℃で１２時間継続させた。
この培養物を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。そのタンパク質をニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。細胞ペレットを結合緩衝液（５０ｍｌ）に移して、細胞を超音波処理（３×３０ｓ、６０％振幅）によって破壊して、懸濁物を遠心分離した（２０，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。その上清を濾過して（０．８μｍ）そのタンパク質を、漸増濃度のイミダゾールを用いて溶出するニッケルアフィニティーカラムで精製した。溶出を２８０ｎｍにおける紫外吸光度によってモニターし、画分を適宜合わせた。その合わせた画分を２２℃で一晩、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５、４．０ｌ）に対して透析した（ＭＷＣＯ １２〜１４ｋＤａ）。タンパク質溶液を濾過して（０．２μｍ）、４℃で保管した。
【００７３】
試薬の合成
【化８】
Ｌ−ホモアジドアラニンをホフマン転位、ジアゾ転移および文献3に記載の脱保護ストラテジーを介して合成した。
【化９】
ＤＬ−ホモプロパルギルグリシンを、前に記載のとおり2、ホモプロパルギルアルキル化、加水分解および脱炭酸反応によってジエチルアセトアミドマロネートから調製した。
【００７４】
１−アジド−２−アセトイミド−２−デオキシβ−Ｄ−グルコピラノシド１
【化１０】
Ｎ−Ａｃ−グルコシルアジドを、対応するアセチル保護グリコシルクロリドから合成し、続いてＺｅｍｐｌｅｎ脱アセチル化4を行った。
【００７５】
キトバイオシルアジド２
【化１１】
キトバイオシルアジド（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｙｌ ａｚｉｄｅ）は、Ｍａｃｍｉｌｌａｎら5によって記載されるように調製した。
【００７６】
（２−メタンチオスルホネート−エチル）α−Ｄ−グルコピラノシド７
【化１２】
α−グルコピラノシルＭＴＳ試薬を、参考文献6に記載のように保護基の除去およびメタンチオスルホネート置換を介して公知のブロミドから調製した。
【００７７】
（２−アジド−エチル）α−Ｄ−マンノピラノシド３
【化１３】
アジドエチルα−マンノピラノシド３は、ブロモエタノールを用いてグリコシル化し、その後アジド置換をすることによってマンノースペンタアセテートから文献の手順に従って合成した6、7。
【００７８】
ｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１
【化１４】
ｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１は、記載されるとおりに8、アジドエチルアセテートおよびトリプロパルギルアミンから調製した。
【００７９】
エチニルＣ−ガラクトシド５
エチニルβ−Ｃ−ガラクトシドは、Ｘｕ，Ｊｉｎｗａｎｇ；Ｅｇｇｅｒ，Ａｎｉｔａ；Ｂｅｒｎｅｔ，Ｂｒｕｎｏ；Ｖａｓｅｌｌａ，Ａｎｄｒｅａ；Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ；７９（７），１９９６，２００４−２０２２の方法に従って公知のＣ−グルコシドと同じ方法で調製した。
【化１５】
【００８０】
低分子モデル糖−ＣＣＨＡ反応
【化１６】
ジエチルホモプロパルギルアセトアミドマロネート（５５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯ3ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ3１（１０１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（２０２ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）およびトリス−トリアゾールイルアミンリガンド１１（６ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５、０．２Ｍ；４．０ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２．０ｍＬ）の混合物中に溶解した。硫酸銅（ＩＩ）溶液（０．１Ｍ、１００μＬ、０．０１ｍｍｏｌ）を撹拌した溶液に添加して、その反応混合物を室温で２８時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させて、残りの残滓を（シリカ、ＡｃＯＥｔ〜ＡｃＯＥｔに１５％ＭｅＯＨを含有）でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。その生成物は、無色のフィルムとして出現した（８３ｍｇ、７９％）。
【００８１】
メチル（Ｓ）−２−［Ｎ−アセチル−アミノ］−４−｛１−（２−デオキシ−Ｎ−アセチルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）［１，２，３，］トリアゾール−４−イル｝ブタノエート：
【化１７】
臭化第一銅（１０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解して、リガンド（０．５８ｍＬ、アセトニトリル中で０．１２Ｍ）を添加した。この溶液（３８μＬ、５％の触媒充填）を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５ｍＬ、０．１５Ｍ、ｐＨ８．２）のアルキンアミノ酸（１５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および糖２（３１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応混合物を、アルゴン下において室温で１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析によって、アルキン出発物質の消失を示した。その混合物を酢酸エチルで希釈し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、その水層をＡｃＯＥｔで洗浄した。その水層を減圧下で乾燥するまでエバポレートした。その残滓をカラムクロマトグラフィー（シリカ、１：１のエチルＡｃＯＥｔ／ｉＰｒＯＨ〜４：４：２のＨ2Ｏ／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ）によって精製して、所望の１，２，３−トリアゾール（２６ｍｇ、７４％）を無色のガラス状固体として得た。
【００８２】
メチル（Ｓ）−２−［Ｎ−アセチル−アミノ］−４−｛４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）［１，２，３］トリアゾール−１−イル｝ブタノエート：
【化１８】
臭化第一銅（１０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）に溶解して、トリストリアゾリルアミンリガンド（０．５８ｍＬ、アセトニトリル中で０．１２Ｍ）を添加した。この溶液（４５μＬ、５％の触媒充填）を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５ｍＬ、０．１５Ｍ、ｐＨ８．２）中のアミノ酸（２０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および糖５（２８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応混合物を、アルゴン下において室温で３時間撹拌した。その反応混合物を減圧下で乾燥するまでエバポレートして、その残滓をカラムクロマトグラフィー（シリカ、９：１のＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ〜４：４：２のＨ2Ｏ／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ）によって精製し、所望の１，２，３−トリアゾール（３７ｍｇ、９７％）を白色の固体として得た。
【化１９】
図ｘｘ：Ｏ−プロパルギル−Ｎ−アセチルグルコサミンＡからのＯ−プロパルギルＳｉａＬａｃＮＡｃの合成 ＳｉａＬａｃＮＡｃの極めて単純な高収率の酵素合成を使用した（参考文献Ｂａｉｓｃｈら）。任意の生成物を得るためには、フラッシュカラムクロマトグラフィー以外の精製はどの段階においても必要なかった。
【００８３】
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−β−Ｄ−グルコピラノシド
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドは以前に記載されている。本発明者らの目的のために、Ｖａｕｚｅｉｌｌｅｓ，Ｂｏｒｉｓ；Ｄａｕｓｓｅ，Ｂｒｕｎｏ；Ｐａｌｍｉｅｒ，Ｓａｒａ；Ｂｅａｕ，Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４２（４３）２００１，７５６７−７５７０の方法に従って下に示されるとおりにそれを調製した。
【化２０】
【００８４】
２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−β−ｄ−ガラクトピラノシル−１−プロパルギル−Ｄ−グルコピラノシド
【化２１】
２−アセトアミド−２−デオキシ−１−プロパルギル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１５．０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）およびウリジン−５’−ジホスホガラクトース二ナトリウム塩（５９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのカコジル酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、２５ｍＭのＭｎＣｌ2、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４７）に溶解した。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｅｃ ２．４．１．２２、０．８Ｕ）およびアルカリホスファターゼ（ｅｃ ３．１．３．１、３９Ｕ）を添加し、その混合物を３７℃で２１時間穏やかに振盪した。このときｔｌｃ（１：２：２の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）は、アクセプターである糖の完全な消失を示した（Ｒf０．８）。この反応混合物は、シリカ上で凍結乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２：５：６の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）によって精製して、２３．７ｍｇ（９７％の収率）の白色非晶質固体を得た。
【００８５】
プロパルギル−（５−アセトイミド−３，５−ジデオキシ−ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトイミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド
【化２２】
２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−β−ｄ−ガラクトピラノシル−１−プロパルギル−Ｄ−グルコピラノシド（１２ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）を１．４ｍＬの水に溶解した。カコジル酸ナトリウムを添加し（６０ｍｇ、０．２８モル、最終濃度：０．２Ｍ）、塩化マンガン四水和物（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、最終濃度２９ｍＭ）およびウシ血清アルブミン（２ｍｇ）も同様に添加した。ｐＨを、７．１に調節して、その後に、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩（１９．８ｍｇ、１当量）およびα−２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加した。組み換え体（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｅｃ ２．４．９９．６、３０ｍＵ）およびアルカリホスファターゼ（ｅｃ ３．１．３．１、３０Ｕ）を添加して、その混合物を３７℃で７０時間穏やかに振盪し、その後に反応混合物をシリカ上で凍結乾燥して、フラッシュカラムクロマトグラフィー（５：１１：１５の水：イソプロピルアルコール：酢酸エチル）によって精製し、２０．９ｍｇの非晶質固体（９５％の収率）を得た。
【００８６】
[Ｐ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ結合におけるスルホチロシンの役割を計測するためのＥＬＩＳＡアッセイ]
本発明によりグリコシル化されたタンパク質が、変更された生物学的結合特性を有することを示すために実験を行った。
【００８７】
ＥＬＩＳＡアッセイは以前に公開されたアッセイから変更した。修飾されたＳｓβＧタンパク質を２００ｎｇ／ウェルでコーティングした（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、２μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）。
【００８８】
ジチオスレイトール（５μＬ／ウェル、水中に５０ｍｇ／ｍＬ）を適切なレーンに添加し、硫酸化チロシン模倣体を還元した。このプレートを４℃で１５時間インキュベートした。このウェルをウシ血清アルブミン（アッセイ緩衝液中に２５ｍｇ／ｍＬ：２ｍＭのＣａＣｌ2、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、１ウェル当たり２００μＬ）を用いて３７℃で２時間ブロックした。
【００８９】
このプレートを洗浄緩衝液（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含むアッセイ緩衝液、１ウェル当たり３×４００μＬ）で洗浄し、その後にＰ−セレクチン（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６１３０６、ＣＨＯ細胞における組み換え体、短縮配列、膜貫通および細胞質ドメインを欠損、１００μＬの洗浄緩衝液中に異なる修飾をされたＳｓβＧ変異体の各々について４００ｎｇ／ウェル〜１．６ｎｇ／ウェルの連続２倍希釈法）を添加した。このプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
【００９０】
洗浄緩衝液を用いて２回洗浄した後、このウェルを抗Ｐ−セレクチン抗体（ＩｇＧ１サブタイプ、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ、クローンＡＫ−６、１００μＬのアッセイ緩衝液中に１００ｎｇ／ウェル）とともに、２１℃で１時間インキュベートし（さらに３つのコントロールウェル）、そして洗浄緩衝液（３×３００μＬ／ウェル）で洗浄した。
【００９１】
各々のウェルを抗マウスＩｇＧ特異的ＨＲＰコンジュゲート（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａ０１６８）とともに１時間２１℃でインキュベートした。このウェルを洗浄緩衝液（３×３００μＬ）で洗浄した。この結合は、ＴＭＢ−基質溶液（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ０４４０、１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、３７０ｍｍにおける吸光度の読み取りが直線域に入るまで（約１５分）、２２℃で暗所でインキュベートすることによって可視化した。
【００９２】
（（Ｓ）−２−アミノ−４−｛４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）［１，２，３］トリアゾール−１−イル｝ブタノエート
【化２３】
上記と同じ方法を用いて、Ａｈａに対して１．５当量のエチニルＣ−ガラクトシド５を用いて、最適化の研究を行なった。
【表３】
【００９３】
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌフラグメント調製物：
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ（ＴＨｐ）ペプチドフラグメント（２９５〜３０６；Ｈ2Ｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）12の類似体である（Ｈ2Ｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｈａ／Ｈｐｇ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）を、マイクロ波を用いたリバティー（Ｌｉｂｅｒｔｙ）ＣＥＭペプチド合成装置を用いて、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ−ポリスチレン樹脂［１％ジビニルベンゼン、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号０１−６４−００３７］上でＦｍｏｃ法によって合成した。
【００９４】
アジドタンパク質Ａｈａ含有タンパク質の糖−付加環化のための代表的な手順：
エチニル−β−Ｃ−ガラクトシド（５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）５を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．２、２００μＬ）に溶解した。タンパク質溶液（３００μＬ中に０．２ｍｇ）を、上記の溶液に添加して、十分に混合した。新たに調製されたアセトニトリル中の臭化銅（Ｉ）（９９．９９９％）の溶液（３３μＬの１０ｍｇ／ｍＬ）を、トリス−トリアゾリルアミンリガンド１１（１２０ｍｇ／ｍＬを１２．５μＬ）のアセトニトリル溶液と前もって混合した。予め形成したＣｕ−錯体溶液（４５μＬ）を混合物に添加して、その反応物をローテーターで１時間、室温で撹拌した。次いで、この反応混合物を遠心分離して、任意のＣｕ（ＩＩ）塩の沈殿を除去し、上清を、脱塩水（３．５ｍＬ）を用いて溶出するＰＤ１０カラムで脱塩した。その溶離液をビバスピン膜濃縮器（１０ｋＤａの分画分子量）で濃縮して、５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液で、次いで脱塩水（３×５００μＬ）で洗浄した。最終的に、溶液を１００μＬに濃縮し、その生成物を、ＬＣ−ＭＳ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ＣＤ、トリプシン消化物およびトリプシン消化物−ＬＣＭＳ／ＭＳによって特性を明らかにした。
【表４】
【表５】
【００９５】
アルキニルタンパク質Ｈｐｇ含有タンパク質の糖−付加環化：
類似の手順をＨｐｇ含有タンパク質の修飾のために使用した。この場合、アジドを有する炭水化物（ＨＯ3ＧｌｃＮＡｃＮ3）１を、アルキニル−β−Ｃ−グリコシドの代わりに反応相手として用いた。
【００９６】
ＴＨｐフラグメント二重特異的グリココンジュゲーション（ｄｕａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）：
新たに合成されたペプチド（Ｈｐｇ−またはＡｈａ−取り込み、０．５ｍｇ）を含有する水性のリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．２、０．３ｍＬ）の溶液に、グルコシドＭＴＳ−試薬７を含有する水溶液（５０μＬ、３３ｍＭ、５当量）を添加した。この反応物を回転式（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）ローテーターに１時間おいて、その後に、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５μ Ｃ１８ １１０Ａカラム（流速：１．０ｍＬ／分、移動相勾配：０．０５％ギ酸含有Ｈ2Ｏから０．０５％ギ酸含有ＭｅＣＮへ２０分以上かける）を用いて一定分量についてＬＣＴ−ＭＳ分析を行った。
【００９７】
銅触媒錯体の溶液は、臭化第一銅（５ｍｇ、９９．９９９％純粋）およびｔｒｉｓ−トリアゾールリガンド１１（１８ｍｇ）をＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）に溶解することによって作成した。エチニル糖５またはアジド糖１（６ｍｇ）を、ジスルフィド結合を形成するグリココンジュゲートの反応混合物に溶解し、その後に銅（Ｉ）錯体（１５μＬ）を添加した。Ａｈａ提示ペプチドとエチニル糖との間の反応を、ＬＣ−ＭＳ分析によって完了を検出し、室温で１時間後に完了させた。１時間後に、Ｈｐｇ提示ペプチドおよびアジド糖の反応物に、余分な量の銅（Ｉ）錯体溶液（１０μＬ）を添加した。さらなる１時間の期間の後に、ＬＣ−ＭＳ分析によって、出発物質が所望のコンジュゲート化生成物へ完全に変換したことを実証した。反応部位は、丸で印を付ける。
【化２４】
【化２５】
【００９８】
糖−付加環化のための反応条件の最適化に対するコメント：
トリストリアゾールリガンド１１は、水性の反応混合物中でＣｕ（Ｉ）を安定化するのに有用であることが文献13において以前に示されている。それが存在しない場合、Ｃｕ（ＩＩ）への酸化が急速に生じる。他の溶媒におけるＣｕＢｒの溶解度が低いため、アセトニトリルが選択された。
【００９９】
弱アルカリ性の緩衝系（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５）が、修飾反応のために最も適切であることが見出された。文献中の多くの以前の例は、反応混合物に還元剤を添加することによってＣｕ（ＩＩ）塩のインサイチュでの還元に依存している。タンパク質修飾の触媒のために、Ｃｕ（ＩＩ）のインサイチュでの還元を使用する本発明者らの全ての試みは、不満足であることが判明した。対応するサンプルのスペクトルの質は低く、デコンボリューションによって不十分なシグナル対ノイズ比が得られた。
【０１００】
酵素活性：
速度論的解析を行い、変異体タンパク質およびグリココンジュゲートが酵素活性を保持することを示した（データ示さず）。
【０１０１】
レクチン結合研究：
グリココンジュゲート化された糖が生物学的標的化に影響することを示すため、実験を行った。
【０１０２】
グリココンジュゲート化されたＳｓβＧ変異体のレクチン結合特性15は、固定化されたレクチンアフィニティカラムでの残留分析によってキャラクタライズ［Ｇａｌａｂカタログ番号ＰＮＡ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ：０５１０６１、Ｃｏｎ Ａ：０５１０４１、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｋ−ＷＧＡ−１００１］。溶出画分は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬14で可視化して、吸光度を５９５ｎｍで測定した。
【表６】
Ｇｌｃ−コンジュゲート（Ｇｌｃ ＳｓβＧ）が、バックグラウンドを上回る有意な結合を示さなかったのに対し、Ｍａｎ ＳｓβＧは、マメ科植物のレクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対する結合を明確に実証した。この有意な結合はまた、ガラクトフィリック（ｇａｌａｃｔｏｐｈｉｌｉｃ）レクチンのピーナツのアグルチニン（ＰＮＡ）に対するβ−Ｇａｌ−トリアゾールグリココンジュゲート化ＳｓβＧの結合の場合にも見出された。しかし、キトビオース（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）（ＧｌｃＮＡｃ ＳｓβＧ）コンジュゲート、およびＧｌｃＮＡｃコンジュゲートは少しばかり、スピンアフィニティーカラムのネオグリコペプチド（ｎｅｏ−ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）の溶出を遅らせることによって、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）レクチンに結合することが見出された。マンノースコンジュゲートと反対にグルコースコンジュゲートの結合の欠失は、ＣｏｎＡのグルコースに対する低い親和性によって説明され得る可能性がある16。ＣｏｎＡによる単糖類の相対的な結合は、ＭｅαＭａｎ：Ｍａｎ：ＭｅαＧｌｕ：Ｇｌｕが２１：４：５：１の比であることが見出されている。従って、マンノース単糖類は、グルコース単糖類よりもＣｏｎＡによって４倍強固に結合される。芳香族トリアゾールはまた、ジスルフィド結合したグルコシドより増大したマンノシドの結合に寄与し得る17。
【０１０３】
上述の構築物のいくつかで見出され、その他では見出されなかった結合の欠失によって、糖タンパク質の正確な調製の必要性が強調される。
【０１０４】
溶媒露出度（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）：
現在まで化学反応におけるタンパク質反応性のほんのわずかな研究しか、アミノ酸残基露出度（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の統合的な評価18を示していない19〜21。
【０１０５】
ＳｓβＧのタンパク質結晶構造は、引用文献22から得た。ＳｓβＧの二量体の単量体Ａの溶媒露出度は、Ｎａｃｃｅｓｓ23によって評価した。単量体Ｂの露出度データは、ほぼ同一の値を与えた。相対的な側鎖露出度の総計として与えられた値が本研究において重要である。これらは、トリペプチドＡｌａ−Ｘ−Ａｌａにおける同じ側鎖の露出度に対する所定のアミノ酸Ｘの側鎖の露出度の指標である。従って、研究されたＳｓβＧ変異体のＮ末端残基Ｍｅｔ１の露出度は、算出されたＷＴタンパク質のものよりもさらに高いことが予想される。なぜなら発現された変異体は、Ｈｉｓ7−タグ（番号付けなし）によって残その他の配列から隔てられたＭｅｔ１−Ｇｌｙ２を有するからである。
【０１０６】
溶媒露出度はさらに、天然のアミノ酸配列に基づいており、例えば、組み込まれたホモアジドアラニンおよびホモプロパルギルグリシン変異体には基づかない。
【０１０７】
計算は、種々のプローブサイズ（１．０Å、１．４Åおよび２．８Å）を用いて行われた。アミノ酸側鎖が少ないほどプローブサイズ増大によって接近可能になる。
【０１０８】
これらのデータ（下の表を参照されたい）に基づいて、位置１、４３、２７５、２８０のメチオニン残基が比較的接近可能であることが理解される。それらのメチオニン類似体の変異体についても同じことが期待され得る。
【表７】
下の図は、色で、ＷＴ−ＳｓβＧの相対的な露出度を示す。
【０１０９】
ＴＩＭバレルについて：
タンパク質結晶構造で観察された最も共通の三次の折り畳みはＴＩＭバレルである。これは、全てのタンパク質のほぼ１０％に存在すると考えられている24。
【０１１０】
Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ（ＴＨｐ）糖タンパク質について：
ＴＨｐは、哺乳動物における最も豊富な糖タンパク質である12、25。Ｎ−グリコシル化パターンおよびＯ−グリコシル化パターンは、Ｔｈｐの生物学的機能において重要な役割を果たすことが知られている26。８つの考えられるＮ−グリコシル化部位のうち、７つがグリコシル化されることが既知である。これらのうちにはＡｓｎ−２９８残基がある27。
【０１１１】
エリスロポエチンのグリコシル化およびグルコシルセラミダーゼ
エリスロポエチンについて、個々のグリコシル化部位は、Ｎ結合型炭水化物のためのＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３である。このタンパク質は、Ｓｅｒ１２６に単独のＯ結合型グリコシル化部位を含有する。複数の部位特異的な突然変異誘発、および新しく導入されたＭｅｔ部位でのメチオン類似体の取り込みを用いて（Ｅｐｏの天然の配列は、単一のメチオニン（Ｍ５４）しか含有しない）、このタンパク質を修飾してもよい。
【０１１２】
ゴーシェ病の進行において重要な役割を果たす６０ｋＤの糖タンパク質であるグリコシルセラミダーゼ（Ｄ−グルコセレブロシダーゼ）も、この方法によってグリコシル化される。
【０１１３】
引用文献
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４．Ｓｚｉｌａｇｙｉ，Ｌ．＆ Ｇｙｏｒｇｙｄｅａｋ，Ｚ．ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｚｉｄｏ ｓｕｇａｒｓ：Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｎｅ−ｂｏｎｄ １３ Ｃ−ＩＨ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１４３，２１−４１（１９８５）．
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８．Ｆａｈｍｉ，Ｃ．Ｊ．＆ Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ａ．Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｖｉａ ３（ｎ，ｐ＊）−ｌ（ｐ，ｐ＊）Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（２００３）．
９．Ｌｏｗａｒｙ，Ｔ．，Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．，Ｈｅｌｍｂｏｌｄｔ，Ａ．，Ｖａｓｅｌｌａ，Ａ．＆ Ｂｏｃｋ，Ｋ．Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ｒｉｇｉｄ Ｃ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｃｅｔｙｌｅｎｅ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，９６５７−９６６８（１９９８）．
１２．Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ｅ．ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ ａｓ ｔｈｅ Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，８３−８８（１９８７）．
１３．Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｒ．，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．＆ Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．Ｐｏｌｙｔｒｉａｚｏｌｅｓ ａｓ Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６，２８５３−２８５５（２００４）．
１４．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４（１９７６）．
１５．Ｐｅａｒｃｅ，Ｏ．Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｇｅｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｍｌ Ｅｄ．４４，１０５７−１０６１（２００５）．
１６．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｆ．Ｐ．，Ｐｕｒｉ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｈａｔ，Ｒ．Ｇ．＆ Ｓｕｒｏｌｉａ，Ａ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ，Ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）Ｌｅｎｔｉｌ，ａｎｄ Ｌｅｎｔｉｌ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）Ｌｅｃｔｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，７６６８−７６７７（１９９３）．
１７．Ｐｏｒｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０，２７２７−２７３９（１９７１）．
１８．Ｌｅｅ，Ｂ．＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｔｉｃ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．５５，３７９−４００（１９７１）．
１９．Ｇｌｏｃｋｅｒ，Ｍ．Ｏ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｓ，Ｃ，Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｗ．，Ｓｕｃｋａｕ，Ｄ．＆ Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉ，Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ Ａｍｉｎｏ−Ａｃｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５，５８３−５９０（１９９４）．
２１．Ｓａｎｔｒｕｃｅｋ，Ｊ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｍ．，Ｋａｄｌｃｉｋ，Ｖ．，Ｈｙｎｅｋ，Ｒ．＆ Ｋｏｄｉｃｅｋ，Ｍ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２３，１１５１−１１５６（２００４）．
２２．Ａｇｕｉｌａｒ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈｅｏｎ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ：ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ ａｓ ａ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１１，７８９−８０２（１９９７）．
２４．Ｆａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｋ．Ａｎ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ ｆｕｌｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒｏｕｂｌｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４０９−４１２（１９９３）．
２５．Ｔａｍｍ，Ｉ．＆ Ｈｏｒｓｆａｌｌ，Ｆ．Ｌ．Ａ ｍｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ｍｕｍｐｓ，ａｎｄ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｅｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９５，７１−７９（１９５２）．
２６．Ｅａｓｔｏｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｐａｔａｎｋａｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｆ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｒ．＆ Ｄｅｌｌ，Ａ．Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ− ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２１９２８−２１９３８（２０００）．
２７．ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｊ．Ｊ．Ｍ．，Ｖｏｓｋａｍｐ，Ａ．Ｆ．，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．＆ Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ，Ｆ．Ｇ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９，２１−３０（１９９９）．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をグリコシル化する方法であって、
ｉ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）において修飾されたタンパク質と、
（ａ）アジド基を含むように修飾された炭水化物部分と；および／または
（ｂ）アルキン基を含むように修飾された炭水化物部分と
を、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下で反応させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質の前記修飾が、１つ以上の非天然のアミノ酸類似体による、前記タンパク質における１つ以上のアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非天然アミノ酸類似体がメチオニン類似体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記メチオニン類似体がホモプロパルギルグリシンまたはアジドホモアラニンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が１０より多いアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が１０〜１０００のアミノ酸を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が１０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、糖タンパク質、血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がホルモンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホルモンがエリスロポエチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質の前記修飾（工程ｉ）が、チオール基を含むように前記タンパク質を修飾する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記チオール基が、前記タンパク質のアミノ酸配列へのシステイン残基の挿入を通じて導入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質をグリコシル化する方法であって、
ｉ）（ａ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
（ｂ）（ａ）におけるタンパク質の修飾の前または後に、任意選択的にチオール基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）チオール選択的炭水化物試薬（ｄ）との反応の前または後の、（ｉ）で修飾されたタンパク質と、炭水化物部分（ｃ）との、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下における連続的な反応であって、
（ｃ）がアジド基を含むように修飾された炭水化物部分、および／またはアルキン基を含むように修飾された炭水化物部分；ならびに
（ｄ）がチオール選択的炭水化物試薬である、反応と
を含む方法。
【請求項１５】
前記チオール選択性炭水化物試薬が、タンパク質中のチオール基と反応して、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されるグリコシル残基を導入する試薬である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記チオール選択的炭水化物試薬が、グリコチオスルホナート試薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコチオスルホナート試薬が、グリコメタンチオスルホナート試薬である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記チオール選択的試薬がグリコセレニルスルフィド試薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒が、ＣｕＢｒおよびＣｕＩからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒がＣｕ（Ｉ）Ｂｒである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒が、固定化アミンリガンドの存在下で提供される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドが、トリストリアゾリルアミンリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式（ＩＩＩ）
【化１】
のタンパク質であって、ａおよびｂが０〜５の整数であって；ｐおよびｑが１〜５の整数である、タンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法によってグリコシル化されるタンパク質。
【請求項２５】
式（ＩＶ）
【化２】
のグリコシル化タンパク質であって、ｔが１〜５の整数であって；前記スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分である、グリコシル化タンパク質。
【請求項２６】
前記スペーサーがＣ１−６のアルキル基およびＣ１−６のヘテロアルキル基からなる群より選択される、請求項２５に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２７】
前記スペーサーがメチル、エチルおよびＣＨ2（Ｘ）yからなる群より選択され、ＸがＯ、ＮまたはＳであり、ｙが０または１である、請求項２６に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質が式（Ｖ）
【化３】
であって、ｐおよびｑが０〜５の整数であり；ｔが１〜５の整数である、請求項２５〜２７のいずれかに記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質が式（ＶＩ）
【化４】
である、請求項２８に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質が式（ＶＩＩ）
【化５】
である、請求項２８に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３１】
式（ＶＩＩＩ）
【化６】
のグリコシル化タンパク質であって、ｕおよびｔが１〜５の整数であって；前記スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分であり；ＷおよびＺは同一であっても異なってもよい炭水化物部分である、グリコシル化タンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質が式（ＩＸ）
【化７】
であって、ｐ、ｑ、ｒおよびｓが０〜５の整数である、請求項３１に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質が式（Ｘ）
【化８】
である、請求項３２に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質が式（ＸＩ）
【化９】
である、請求項３２に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質が、１０より多いアミノ酸を含む、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３６】
前記タンパク質が、１０〜１０００のアミノ酸を含む、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記タンパク質が１０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記タンパク質が１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記タンパク質が、糖タンパク質、血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記タンパク質がホルモンである、請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記ホルモンがエリスロポエチンである、請求項４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
医薬としての使用のための請求項２３〜４１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１】
タンパク質をグリコシル化する方法であって、
ｉ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）（ｉ）において修飾されたタンパク質と、
（ａ）アジド基を含むように修飾された炭水化物部分と；および／または
（ｂ）アルキン基を含むように修飾された炭水化物部分と
を、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下で反応させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質の前記修飾が、１つ以上の非天然のアミノ酸類似体による、前記タンパク質における１つ以上のアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非天然アミノ酸類似体がメチオニン類似体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記メチオニン類似体がホモプロパルギルグリシンまたはアジドホモアラニンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が１０より多いアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が１０〜１０００のアミノ酸を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が１０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、糖タンパク質、血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がホルモンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホルモンがエリスロポエチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質の前記修飾（工程ｉ）が、チオール基を含むように前記タンパク質を修飾する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記チオール基が、前記タンパク質のアミノ酸配列へのシステイン残基の挿入を通じて導入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質をグリコシル化する方法であって、
ｉ）（ａ）アルキン基および／またはアジド基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
（ｂ）（ａ）におけるタンパク質の修飾の前または後に、任意選択的にチオール基を含むようにタンパク質を修飾する工程と；
ｉｉ）チオール選択的炭水化物試薬（ｄ）との反応の前または後の、（ｉ）で修飾されたタンパク質と、炭水化物部分（ｃ）との、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下における連続的な反応であって、
（ｃ）がアジド基を含むように修飾された炭水化物部分、および／またはアルキン基を含むように修飾された炭水化物部分；ならびに
（ｄ）がチオール選択的炭水化物試薬である、反応と
を含む方法。
【請求項１５】
前記チオール選択性炭水化物試薬が、タンパク質中のチオール基と反応して、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合されるグリコシル残基を導入する試薬である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記チオール選択的炭水化物試薬が、グリコチオスルホナート試薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコチオスルホナート試薬が、グリコメタンチオスルホナート試薬である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記チオール選択的試薬がグリコセレニルスルフィド試薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒が、ＣｕＢｒおよびＣｕＩからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒がＣｕ（Ｉ）Ｂｒである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃｕ（Ｉ）触媒が、固定化アミンリガンドの存在下で提供される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドが、トリストリアゾリルアミンリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式（ＩＩＩ）
【化１】
のタンパク質であって、ａおよびｂが０〜５の整数であって；ｐおよびｑが１〜５の整数である、タンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法によってグリコシル化されるタンパク質。
【請求項２５】
式（ＩＶ）
【化２】
のグリコシル化タンパク質であって、ｔが１〜５の整数であって；前記スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分である、グリコシル化タンパク質。
【請求項２６】
前記スペーサーがＣ１−６のアルキル基およびＣ１−６のヘテロアルキル基からなる群より選択される、請求項２５に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２７】
前記スペーサーがメチル、エチルおよびＣＨ2（Ｘ）yからなる群より選択され、ＸがＯ、ＮまたはＳであり、ｙが０または１である、請求項２６に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質が式（Ｖ）
【化３】
であって、ｐおよびｑが０〜５の整数であり；ｔが１〜５の整数である、請求項２５〜２７のいずれかに記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質が式（ＶＩ）
【化４】
である、請求項２８に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質が式（ＶＩＩ）
【化５】
である、請求項２８に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３１】
式（ＶＩＩＩ）
【化６】
のグリコシル化タンパク質であって、ｕおよびｔが１〜５の整数であって；前記スペーサーは存在しなくてもよく、１〜８個のＣ原子を有する脂肪族部分であり；ＷおよびＺは同一であっても異なってもよい炭水化物部分である、グリコシル化タンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質が式（ＩＸ）
【化７】
であって、ｐ、ｑ、ｒおよびｓが０〜５の整数である、請求項３１に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質が式（Ｘ）
【化８】
である、請求項３２に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質が式（ＸＩ）
【化９】
である、請求項３２に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質が、１０より多いアミノ酸を含む、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３６】
前記タンパク質が、１０〜１０００のアミノ酸を含む、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記タンパク質が１０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記タンパク質が１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記タンパク質が、糖タンパク質、血液タンパク質、ホルモン、酵素、レセプター、抗体、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される、請求項２３〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記タンパク質がホルモンである、請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記ホルモンがエリスロポエチンである、請求項４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
医薬としての使用のための請求項２３〜４１のいずれかに記載のタンパク質。
【公表番号】特表２００８−５３４６６５（Ｐ２００８−５３４６６５Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４８４５（Ｐ２００８−５０４８４５）
【出願日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１２７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６３４８
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１２７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６３４８
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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