タンパク質凝集を抑制する製剤
医薬上許容される量のタンパク質を含有する安定な医薬上許容される製剤を開示する。そのような製剤の製造方法、ならびにタンパク質製剤の加工、製造、輸送および保存に関連した物理的ストレス、特に凍結／解凍ストレスにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を含有する医薬製剤ならびにそのような製剤の製造方法および使用方法に関する。より詳しくは、本発明は、製造および輸送中のタンパク質凝集体の生成を抑制しうるタンパク質含有医薬製剤に関する。本発明はまた、タンパク質凝集体の生成を抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素および抗体のようなタンパク質ならびにタンパク質断片は水溶液中および低温（すなわち、０℃以下）での保存時に不安定であり、活性の低下および／または可溶性もしくは不溶性凝集物の生成を引き起こしやすい。医薬産業においては、タンパク質医薬製品は、過酷な条件（例えば、酸溶出、加熱、極端なｐＨなど）を伴う精製操作；シリンジ操作、限外濾過およびダイアフィルトレーション（高圧およびせん断力）；攪拌および凍結／解凍サイクルを含む、製造および輸送中の多数のストレスにさらされる。長期保存には、タンパク質組成物（溶液／凍結乾燥物）は、種々の分解過程の速度を遅くすることにより該タンパク質の分解を防ぐために、好ましくは、凍結される。これはタンパク質活性の維持を可能にする。しかし、通常は氷形成の際の氷−水／タンパク質界面相互作用および浸透圧ショックのため、凍結状態においてもタンパク質分解が生じることがある（Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９６；８５（１２）：１３２５−１３３０；ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｒｏｗ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８；２５：２４４−２５５）。特に、凍結／解凍サイクルの繰返しは、溶液中で生じて溶液を濁らせうる（濁り）タンパク質凝集体生成を促進する傾向にある。もう１つのタンパク質凝集原因は攪拌である。特に、輸送中、抗体のような治療用タンパク質は、水陸上輸送および空輸による移動による攪拌にさらされる。輸送中、タンパク質はガラス容器またはプラスチックシリンジ上の疎水性表面ならびに溶液中の微小気泡または容器内の空気表面と相互作用しうる。疎水性物質とのタンパク質のそのような相互作用はタンパク質凝集を誘発しうる。不溶性凝集体の生成はタンパク質物質を使用不可能にしてしまうため、抗体のような治療用タンパク質製品の開発、製剤化、保存および輸送中の不溶性凝集体生成の抑制は薬物物質の維持のために極めて重要である。
【０００３】
溶液中のタンパク質の安定化のための多数の方法および添加剤が公知である。例えば、ＨＳＰ２５のような熱ショックタンパク質の添加によるタンパク質の安定化がＥＰ−Ａ ０５９９３４４に記載されている。ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンから構成されるブロック重合体をリン脂質と共に加えることによる抗体の安定化がＥＰ−Ａ ０３１８０８１に記載されている。免疫グロブリンは、アルギニン、グアニジンまたはイミダゾールのような窒素含有塩基の塩を加えることにより安定化されている。安定化のための他の適当な添加剤としては、ポリエーテル（ＥＰ−Ａ ００１８６０９）、グリセリン、アルブミンおよび硫酸デキストラン（米国特許第４，８０８，７０５号）、洗剤および界面活性剤、例えばポリソルベートに基づく界面活性剤（ＤＥ ２６５２６３６、ＧＢ ８５１４３４９）、シャペロン、例えばＧｒｏＥＬ（Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．，（１０）１９９１ ５３５−５４０）、クエン酸バッファー（ＷＯ ９３／２２３３５）またはキレート化剤（ＷＯ ９１／１５５０９）が挙げられる。これらの添加剤は、タンパク質が溶液中で或る程度安定化されることを可能にするが、それらは、例えば添加剤の除去のための追加的な処理工程を要するなどの欠点を伴う。さらに、先行技術において記載されている方法はいずれも、操作中に可溶性または不溶性凝集物が全く生成しない（または治療目的には無視しうる量しか生成しない）ような、凍結および解凍の繰返し過程中のタンパク質の安定化には適していない（米国特許第６，２３８，６６４号）。
【０００４】
凍結乾燥は、タンパク質を含む多数の生物活性物質の維持に有用かつ有効であると考えられる（Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，米国特許第６，０２０，４６９号）。しかし、凍結乾燥は、製品の不安定性を招きうる、それ自体のストレス（凍結過程および水分除去中のタンパク質の極端な濃度など）を誘発する。したがって、凍結乾燥は、脱アミノ化および酸化（これらは共に、凍結乾燥状態および液体状態で生じうる）に加えて、架橋（共有結合オリゴマー生成）および非共有結合凝集の速度の上昇を招きうる。
【０００５】
したがって、加工、製造、輸送および保存中の安定性が向上したタンパク質製剤が当技術分野において依然として必要とされている。特に、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成を抑制するタンパク質製剤が当技術分野において特に有用であろう。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ａ、抗体Ｂおよび抗体Ｅから選ばれる抗体またはそのフラグメントの医薬上許容される量を不溶性凝集体生成のインヒビターと共に含むタンパク質製剤に関する。ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。抗体Ａ〜Ｅの製造方法および使用方法を含むそれらの詳細な説明は米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）（図面を含むそれらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されうる。
【０００７】
本発明はまた、不溶性凝集体生成のインヒビターを含む、１以上の凍結／解凍サイクルにより及び攪拌により誘発されるタンパク質凝集体の生成を抑制するタンパク質製剤に関する。ある実施形態においては、ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。
【０００８】
本発明はまた、（ａ）１以上の凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前にバッファー系を選択し、（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む、１以上の凍結／解凍サイクルおよび攪拌に付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法に関する。ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルによって生じる不溶性凝集体の生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含むタンパク質製剤、ならびに１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法、および１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法を提供する。該方法は、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させる点で共通している。
【００１０】
本明細書中で引用されているすべての参考文献の全体を、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００１１】
本明細書中で用いる、タンパク質凝集体生成を「抑制（する）」は、タンパク質含有溶液におけるタンパク質凝集体の量を減少させ又は更なるタンパク質凝集体の生成を予防することを意味する。したがって、抑制は、タンパク質製剤または溶液におけるタンパク質凝集体の量を減少させ及びそれを予防することの両方を含みうる。減少または予防は、不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含むタンパク質含有溶液中に存在する凝集体の量を、不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含まないタンパク質含有溶液中に存在する凝集体の量と比較することにより測定される。
【００１２】
本明細書中で用いる「タンパク質製剤」および「タンパク質溶液」なる語は交換可能である。さらに、「タンパク質」なる語は、本発明の意義においては、天然に存在する及び組換えタンパク質またはタンパク質断片、ならびに化学修飾されたタンパク質、ならびにアミノ酸の置換および付加を含有するタンパク質であると理解される。医薬組成物用に安定化されるタンパク質は、好ましくは、抗体、抗体融合タンパク質、例えばイムノトキシン、酵素およびタンパク質ホルモン、例えばエリスロポエチン、ソマトスタチン、インスリン、サイトカイン、インターフェロンまたはプラスミノーゲンアクチベーターであり、任意のアミノ酸配列、特にポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体など、および／またはそれらの断片（フラグメント）を含むと意図される。
【００１３】
タンパク質または抗体の「医薬上有効な量」は、種々の投与計画において治療効果をもたらす量を意味する。そのような量は当業者により容易に決定される。有効成分の量は、治療される状態の重症度、投与経路などに左右されるであろう。本発明の組成物は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ以上のタンパク質量を含有するよう製造されうる。抗体Ａ〜Ｅの場合、医薬上有効な量は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、あるいは米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）に開示されているとおりである。
【００１４】
「抗体Ａ」なる語は、米国特許出願第１０／１８０，６４８号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１５】
「抗体Ｂ」なる語は、米国特許出願第１０／８９１，６５８号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１６】
「抗体Ｃ」なる語は、米国特許および米国特許出願第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１７】
「抗体Ｄ」なる語は、米国特許出願第６０／６３８，９６１号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１８】
「抗体Ｅ」なる語は、米国特許第６，２３５，８８３号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１９】
「不溶性凝集体生成のインヒビター」は、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液におけるタンパク質凝集体の生成を有効に抑制しうる任意の化合物または状態である。好ましい実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターは、ｐＨ；無機金属アルカリおよびアルカリ性塩、例えばＭｇＣｌ２など；ポリオール、例えばプロピレングリコールなど；重合体、例えばブロック重合体およびブロック共重合体（ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８など）；低級アルコール、例えばエタノールなど；またはそれらの２以上の組合せから選ばれる。
【００２０】
一般に、本発明の製剤は、好ましくは、安定な形態の製剤を損なわない量かつ有効で安全な医薬投与に適した量の他の成分を含有しうる。
【００２１】
ある態様においては、本発明は、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅよりなる群から選ばれる抗体またはそのフラグメント；バッファー；および不溶性凝集体生成のインヒビターの医薬上許容される量を含む製剤を提供する。
【００２２】
もう１つの態様においては、本発明は、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含む、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤を提供する。
【００２３】
もう１つの態様においては、本発明は、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含む、攪拌ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤を提供する。本明細書中で用いる「攪拌ストレス」は、該タンパク質製剤に受動的または能動的に加えられる物理的運動を意味すると理解される。攪拌ストレスの非限定的な具体例には、衝突、落下、振とう、回転、ボルテックス、デカント、注入、引き込み（容器または入れ物からシリンジへの）などが含まれる。本発明の好ましいタンパク質製剤は特に、輸送および運搬の力（影響力）に対して安定化される。
【００２４】
ある態様においては、本発明は、熱ストレス、化学ストレス（例えば、ｐＨ、低／高塩など）、流体ストレス（例えば、圧縮ストレス、例えば、締めつけられた開口部を通る流体運動により生じるもの）などを非限定的な例として含む１以上の外的な物理的または化学的ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上した、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含むタンパク質製剤を提供する。
【００２５】
前記態様の好ましい実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターは、ｐＨ、ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる。１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２であり、ここで、ＭｇＣｌ２の濃度は約０．１ｍＭ〜約３００ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、より一層好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭである。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはプロピレングリコールであり、ここで、プロピレングリコールの濃度は約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１％〜約１０％である。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはプルロニック−Ｆ６８であり、ここで、プルロニック−Ｆ６８の濃度は約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％〜約１％である。もう１つの実施形態においては、もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはエタノールであり、ここで、エタノールの濃度は約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％〜約１０％、より一層好ましくは０．１％〜約３％である。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはｐＨであり、ここで、ｐＨは該製剤のタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）から約±１．０ｐＨ単位またはそれ以上に維持される。より好ましくは、ｐＨは該等電点ｐＨ（ｐＩ）から約±２．０ｐＨ単位またはそれ以上に維持される。
【００２６】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法を提供する。この態様においては、本発明の方法は、１以上の凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む。この態様の他の実施形態においては、該方法は、該凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。したがって、該製剤への添加の順序は交換可能であるが、関心のあるタンパク質は、該凍結／解凍サイクルの開始前には溶解状態になければならない。
【００２７】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前にバッファー系を選択し、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法を提供する。前記態様の場合と同様に、この方法の或る実施形態は、該凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。
【００２８】
もう１つの態様においては、本発明は、攪拌ストレスにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法を提供する。この態様においては、本発明の方法は、攪拌ストレスが加わる前（または攪拌ストレスが加わる恐れ／可能性がある前）にバッファー系を選択し、攪拌ストレスが加わる前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、攪拌ストレスが加わる前または攪拌ストレスが加わる恐れ若しくは可能性がある前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む。この態様の他の実施形態においては、該方法は、該攪拌ストレスの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。したがって、該製剤への添加の順序は交換可能であるが、関心のあるタンパク質は、該攪拌ストレスの開始前には溶解状態になければならない。
【００２９】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の物理的攪拌ストレスにさらされるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成を抑制するための方法であって、該攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、該攪拌ストレスの前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、該攪拌ストレスの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む方法を提供する。前記態様の場合と同様に、この方法の或る実施形態は、物理的攪拌ストレスの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。
【００３０】
本発明はまた、医薬上有効な量のタンパク質を、適当な希釈剤、補助剤および／または担体と共に含む製剤を含む。当業者によく知られた他の医薬上許容される賦形剤も本組成物の一部分を構成しうる。これらには、例えば、種々の増量剤、追加的な緩衝剤（バッファー）、キレート化剤、抗酸化剤、保存剤、共存溶媒などが含まれ、これらの具体例には、トリメチルアミン塩（「Ｔｒｉｓ（トリス）バッファー」）およびＥＤＴＡが含まれうるであろう。１つの実施形態においては、２以上のタイプのタンパク質が該製剤中に含まれる。もう１つの実施形態においては、関心のある１つのタンパク質以外のいずれのタンパク質も該製剤の一部分ではない。
【００３１】
該製剤の製剤化のための適当なｐＨ範囲は、関心のある個々のタンパク質またはタンパク質断片に左右されるであろう。関心のあるタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）より１ｐＨ単位以上大きい又は小さい範囲内の緩衝能を維持するｐＨ範囲のバッファーを選択することが特に好都合である。より好ましくは、バッファー系のｐＨは、該タンパク質のｐＩより２ｐＨ単位以上大きい又は小さい範囲内で安定である。さらに、大きな温度範囲、特に約−８０℃〜約２５℃にわたってｐＨを維持するバッファー系を選択することが特に好都合である。すなわち、該バッファー系のｐＨは、好ましくは、有意には温度依存性または応答性ではない。１つの実施形態においては、該バッファーは、約４〜約８のｐＨ範囲および約１ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度範囲を有するリン酸カリウム／酢酸カリウム混合バッファー系である。
【００３２】
本明細書中で用いる「タンパク質凝集体」または「タンパク質凝集」は、もはや溶解状態にないタンパク質を意味すると理解される。タンパク質凝集体は、２以上の個々のタンパク質分子のアグロメレーションまたはオリゴマー化を意味しうるが、それはそのような定義に限定されない。当技術分野で用いられるタンパク質凝集体は可溶性または不溶性でありうるが、本発明の目的においては、特に示さない限りタンパク質凝集体は通常は不溶性であるとみなされる。本発明の方法において生成を防ぐべき不溶性凝集体は本質的には、通常は少なくとも１μｍのサイズを有するタンパク質凝集体であると理解されるが、１０μｍ以上の範囲のものであってもよい。該粒子は、市販の粒子計数装置、例えばＰＳＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）の粒子計数装置ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ ７００、またはＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用する適当な粒子計数法により測定されうる。ＵＳＰ（米国薬局方）によれば、医薬製剤の注射用量当たり１０μｍを超える範囲内の最大６０００個の粒子および２５μｍを超える範囲内の最大６００個の粒子が許容される。これは、タンパク質の治療用組成物のための簡便な方法で本発明により達成されうる。
【００３３】
本発明においては、任意のタンパク質が使用されうる。本発明の或る態様は、水性緩衝溶液、および特許請求の範囲の幾つかに記載のタンパク質凝集体生成のインヒビターの使用に基づくものであり、それに溶解している特定のタンパク質に限定されると解釈されるべきではない。
【００３４】
該製剤は一般に、自体公知の一般的に利用可能な医薬組合せ技術を用いて該成分を組合せることにより製造される。その医薬製剤の製造するための特定の方法は、任意の標準的なタンパク質精製法により精製されたタンパク質、および抗体Ａ〜Ｅを記載している特許および特許出願に開示されているタンパク質を使用することを含む。
【００３５】
実施例
実施例において使用する種々の抗体は、米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）（すべてをを参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。
【００３６】
材料： ＣＨＯ由来抗体を発現させ、精製した。該抗体を蒸留脱イオン水に対して十分に透析し、〜３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。実施例に要求されるバッファー範囲（ｐＨ４〜８）に基づき、リン酸カリウムバッファーおよび酢酸カリウムバッファーの組合せを使用した。カリウムに基づくバッファーを選択したのは、それらが、ナトリウムに基づくバッファーに比べて凍結ｐＨ安定性に優れているからである。リン酸カリウム（Ｋ／ＰＯ４）（一および二塩基性）および酢酸カリウム（Ｋ／ＯＡｃ）はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔから購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）六水和物はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。プルロニック−Ｆ６８（ポロキサマー）はＳｉｇｍａから購入した。エタノール（ＥｔＯＨ）および１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。
【実施例１】
【００３７】
製剤の製造
凍結／解凍により誘発される凝集体生成を抑制する被検物質のそれぞれに関する一連の製剤を製造した。各製剤は同様に製造した。Ｄａｉｋｙｏ栓を備えた５ｍＬバイアル内で試験サンプル（２ｍＬ）を調製した。濃縮バッファーストック（２０ｍＭ Ｋ／ＯＡｃ、２０ｍＭ Ｋ／ＰＯ４（各試験ｐＨ値のもの））を、試験する各ｐＨ範囲における５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃ、５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４の最終濃度まで各サンプルに加えた。個々のタンパク質ストック溶液（〜３０ｍｇ／ｍＬ）を〜１０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度まで各製剤に加えた。調製した凝集体生成抑制物質の追加的なストック溶液には、５．０Ｍ ＭｇＣｌ２、５％ プルロニック−Ｆ６８、１００％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨおよび１００％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールが含まれる。これらのストック溶液を、以下の開示に記載の最終濃度範囲、典型的には３０〜３００ｍＭ（ＭｇＣｌ２）、０．０１〜１．０％（プルロニック−Ｆ６８）、０．２〜１０％（ＥｔＯＨ）および１〜１０％（プロピレングリコール）まで該製剤に加えた。必要に応じて、脱イオン水を加えて最終体積にした。
【００３８】
凍結／解凍法
各製剤を製造した後、該サンプルバイアルを栓で密封し、適当なバイアルスペーサーインサートを含有する５ｃｃ×１６の箱の中に配置した。該箱を穏やかに回転させて、該サンプルの穏やかな完全な混合を促した。混合後、該サンプルを冷凍庫（−８０℃）内に一晩配置した。翌朝、該サンプルを該冷凍庫から取り出し、外界温度（室温ないし２０〜２３℃）に配置してそれらを解凍した。該サンプルが完全に解凍し外界温度に平衡化した後、該箱の中のサンプルを穏やかな回転により再び混合した。この凍結／解凍プロセスを合計３サイクル繰返した。
【００３９】
サンプル分析
３サイクルの凍結／解凍が完了した後、該サンプルの不溶性凝集体生成の初期目視検査を行った。ついで、ＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用して、不溶性凝集体を計数した。不溶性凝集体の総合評価を、＞２μｍの検出限界を用いて定量した。該装置の検出限界は約１８，０００計数（カウント）／ｍＬである。著しい沈殿／凝集体生成が生じたようである場合には、凝集体生成をより正確に定量し装置の限界を避けるために該サンプルを希釈した（典型的には１：２５希釈）。
【００４０】
結果
Ａ．ｐＨに対する不溶性凝集体生成の依存性
不溶性凝集およびそのｐＨ依存性に関して、試験した全てのＩｇＧの間で共通の傾向が認められる。試験した全てのＩｇＧに関して、４．０〜５．０のｐＨ値は不溶性凝集体生成に関して一貫して低い粒子計数を与えた。ｐＨ６．０〜８．０では、不溶性凝集体の計数は具体的なタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）に著しく依存した。抗体Ａ、抗体Ｃおよび抗体Ｄ（それぞれ８．５、９．２および８．７のｐＩ値）に関して認められるとおり、全粒子計数は、抗体Ｂおよび抗体Ｅ（それぞれ７．８および６．５のｐＩ値）と比べてかなり低かった（＜１５００）。ｐＨ６．０における抗体Ｂおよび抗体Ｅに関する全粒子計数はそれぞれ〜１１，０００および〜７，４００である。抗体Ｂは、ｐＨが該タンパク質のｐＩに近づくにつれて、異常に高レベルの不溶性凝集体を示している。抗体Ｃおよび抗体Ｄは、凍結／解凍中およびｐＨ変化における不溶性凝集体の生成に対して若干抵抗性であるらしい。その原因は十中八九、試験したｐＨ範囲によるものであろう。これらの２つのタンパク質は９．２および８．７のｐＩを有し、それらは、この研究で試験した全てのタンパク質における最高のｐＩである（図１）。不溶性凝集体生成を抑制するためにはバッファーｐＨ範囲は製剤中の個々のタンパク質のｐＩにより決定されるべきであることを、これらの傾向は示している。理想的には、バッファー系のｐＨは該タンパク質のｐＩ値より高い又は低い少なくとも最大限度（ｆｕｌｌ）のｐＨ単位であるべきである。
【００４１】
Ｂ．塩化マグネシウムに対する不溶性凝集体生成の依存性
比較のために前記（Ａ）に記載のｐＨスクリーン（ｓｃｒｅｅｎ）を用いた場合、３０〜３００ｍＭ ＭｇＣｌ２の添加は、３サイクルの凍結／解凍により誘発される不溶性凝集体生成を抑制しうる。抗体Ｅにおける最も多量の不溶性凝集体を産生する状態はＭｇＣｌ２の導入で有意に抑制される。これは６〜７のｐＨ範囲で最も顕著に認められる。図２は、抗体Ｅのみに関する３０〜３００ｍＭ ＭｇＣｌ２での不溶性凝集体の抑制を示す。図３は、１００ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２による、抗体Ａ〜Ｄに関する不溶性凝集に対する効果を示す。ＭｇＣｌ２による不溶性凝集の抑制は、抗体Ｄ以外の全てのタンパク質に共通して認められる現象である。抗体Ａは、凍結／解凍中、よく機能するタンパク質である。不溶性凝集体は、ｐＨ８以外のほとんどの試験条件において少量である。これはおそらく、ｐＨ８が抗体ＡのｐＩ（８．５）に近いことによるものであろう（相当な不溶性凝集体を含有する（〜１６，０００計数／ｍＬ））。抗体Ａに関してｐＨ８でＭｇＣｌ２を含有させると、不溶性凝集体計数が＜５０計数／ｍＬへと有意に減少する。抗体Ｂは、ＭｇＣｌ２の添加後、不溶性凝集体生成に対して最小量の防護しか示していない。抗体Ｂに関しては、すべての条件下、ＭｇＣｌ２の添加は単なる緩衝溶液と比べて少量または同等量の不溶性凝集体の含有を示す。抗体Ｄはこの観察の例外のようである。製剤へのＭｇＣｌ２の添加は、バッファーのみと比べて不溶性凝集体のレベルを維持するか、または７〜８のｐＨ範囲において不溶性凝集体の数を増加させる。
【００４２】
Ｃ．エタノールに対する不溶性凝集体生成の依存性
抗体Ｅで多量の不溶性凝集体を生成することが判明した前記の条件を用いた場合、低濃度のエタノールの添加は不溶性凝集体の数を減少させる。これらの不溶性凝集体生成性バッファーは塩化カリウムまたはナトリウム（ｐＨ５．０または７．０の１００ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ５または６の１００ｍＭ ＮａＣｌ）の存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。前記バッファー条件における抗体Ｅの３サイクルの凍結／解凍は約１５，０００計数／ｍＬの凝集体生成を誘発する。同じ条件下、エタノール（０．１％（ｖ／ｖ））の添加は不溶性凝集体生成の量を５０％以上減少させた。０．２％（ｖ／ｖ）エタノールの添加は不溶性凝集体の量を約２０倍減少させる。０．８〜１０％（ｖ／ｖ）の量で添加されたエタノールは、３サイクルの凍結／解凍により誘発された不溶性凝集体をほぼ消失させる。図４は、（Ａ）ＫＣｌ含有バッファー系および（Ｂ）ＮａＣｌ含有バッファー系における、抗体Ｅに関する不溶性凝集体生成に対するエタノールの効果を示す。
【００４３】
Ｄ．プロピレングリコールに対する不溶性凝集体生成の依存性
最高の不溶性凝集体生成のための前記条件（前記（Ｃ））を用いた場合、種々の量のプロピレングリコールの添加は抗体Ｅの沈殿を減少させる。試験した全ての条件（５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ ＫＯＡｃ、＋／− １００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ５または７）において、１％ プロピレングリコールの添加は不溶性凝集体の量を〜１５倍減少させた。プロピレングリコールの量の更なる増加は沈殿のレベルを（＞２０倍）減少させた。図５は、不安定化バッファー系においてプロピレングリコールが不溶性凝集体生成に及ぼす抑制効果を示す。
【００４４】
Ｅ．乳化／湿潤剤に対する不溶性凝集体生成の依存性
ポロキサマー１８８およびプルロニック−Ｆ６８は、０．０１〜５％の濃度範囲で存在する場合には脂肪乳化剤および湿潤剤として分類される（Ｒｏｗｅら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｅｌｌｅｒ，ＰＪ．（編）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（Ｌｏｎｄｏｎ） ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．），２００３．ｐｐ．４４７−４４９）。前記（Ｃ、Ｄ）の不安定化バッファー系を使用して、プルロニック−Ｆ６８を０．０１〜１％の濃度まで加えた。この濃度範囲内のプルロニック−Ｆ６８の添加は不溶性凝集体の生成を抑制した（図６）。
【実施例２】
【００４５】
攪拌ストレス中のタンパク質凝集体生成の抑制
（ａ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）（対照サンプル）；（ｂ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７）；（ｃ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、０．１％ プルロニックＦ６８（ｐＨ７）；および（ｄ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、１０％ プロピレングリコール（ｐＨ７）を含むバッファー条件と共に実施例１に記載の抗体を使用して各製剤を製造する。これらの製剤は、当業者に公知のいずれかの方法、例えば透析、ダイアフィルトレーション、バッファー交換（クロマトグラフィー、遠心濾過など）を用いて製造する。当業者は、そのような製造に必要な適当な材料・物質（ダイアフィルトレーション膜および透析管の分子量カットオフなど）を特定することが可能である。典型的なタンパク質濃度（例えば、〜１０ｍｇ／ｍＬ）が得られたら、該サンプルバイアルを栓で密封し、適当なバイアルスペーサーインサートを含有する５ｃｃ×１６の箱の中に配置する。該サンプルの穏やかで十分な混合が促され保証されるよう、該箱を穏やかに回転させる。
【００４６】
混合後、該サンプルを輸送刺激（トラックおよび航空機の場合の代表例としての、１２時間の地上の振動および１２時間の空中の振動）にさらす。輸送刺激を用いることができない場合には、５００ｒｐｍで７２時間以上（ＶＷＲ ＯＳ−５００オービタルシェーカー）作動させるオービタルシェーカー（例えば、ＶＷＲ ＯＳ−５００オービタルシェーカー）のような種々の方法により模擬輸送条件を達成することが可能である。
【００４７】
サンプル分析
該攪拌ストレスが完了した後、該サンプルの不溶性凝集体生成の初期目視検査を行う。ついで、ＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用して、不溶性凝集体を計数する。不溶性凝集体の総合評価を、＞２μｍの検出限界を用いて定量する。該装置の検出限界は約１８，０００計数（カウント）／ｍＬである。著しい沈殿／凝集体生成が生じたようである場合には、凝集体生成をより正確に定量し装置の限界を避けるために該サンプルを希釈する（典型的には１：２５希釈）。
【００４８】
本発明は特定の態様および実施形態に関して記載されているが、前記の説明および実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、当業者に明らかであり添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる種々の修飾および同等の製剤を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃバッファーにおける４．０〜８．０の範囲のｐＨに対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。各タンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）は以下のとおりである：抗体Ｅ＝６．５；抗体Ｂ＝７．８；抗体Ｄ＝８．１；抗体Ａ＝８．５；および抗体Ｃ＝９．２。
【図２】図２は、図１と同じｐＨ範囲にわたる抗体Ｅに関するＭｇＣｌ２濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。データは、０．０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭおよび３００ｍＭの全製剤ＭｇＣｌ２濃度に関して集めた。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、図１と同じｐＨ範囲にわたる抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃおよび抗体Ｄに関するＭｇＣｌ２濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。データは、０．０ｍＭおよび１００ｍＭの全配合ＭｇＣｌ２濃度に関して集めた。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、抗体Ｅに関するエタノール濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。このデータ収集のために使用したバッファー系は１００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０および７．０の１００ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ５および６の１００ｍＭ ＮａＣｌ）の存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。エタノール濃度は０〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲であった。
【図５】図５は、抗体Ｅに関するプロピレングリコール濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。このデータ収集のために使用したバッファー系はｐＨ５．０および７．０の１００ｍＭ ＫＣｌの存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。ポリエチレングリコール濃度は０〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲であった。
【図６】図６は、プルロニック−Ｆ６８濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を含有する医薬製剤ならびにそのような製剤の製造方法および使用方法に関する。より詳しくは、本発明は、製造および輸送中のタンパク質凝集体の生成を抑制しうるタンパク質含有医薬製剤に関する。本発明はまた、タンパク質凝集体の生成を抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素および抗体のようなタンパク質ならびにタンパク質断片は水溶液中および低温（すなわち、０℃以下）での保存時に不安定であり、活性の低下および／または可溶性もしくは不溶性凝集物の生成を引き起こしやすい。医薬産業においては、タンパク質医薬製品は、過酷な条件（例えば、酸溶出、加熱、極端なｐＨなど）を伴う精製操作；シリンジ操作、限外濾過およびダイアフィルトレーション（高圧およびせん断力）；攪拌および凍結／解凍サイクルを含む、製造および輸送中の多数のストレスにさらされる。長期保存には、タンパク質組成物（溶液／凍結乾燥物）は、種々の分解過程の速度を遅くすることにより該タンパク質の分解を防ぐために、好ましくは、凍結される。これはタンパク質活性の維持を可能にする。しかし、通常は氷形成の際の氷−水／タンパク質界面相互作用および浸透圧ショックのため、凍結状態においてもタンパク質分解が生じることがある（Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９６；８５（１２）：１３２５−１３３０；ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｒｏｗ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８；２５：２４４−２５５）。特に、凍結／解凍サイクルの繰返しは、溶液中で生じて溶液を濁らせうる（濁り）タンパク質凝集体生成を促進する傾向にある。もう１つのタンパク質凝集原因は攪拌である。特に、輸送中、抗体のような治療用タンパク質は、水陸上輸送および空輸による移動による攪拌にさらされる。輸送中、タンパク質はガラス容器またはプラスチックシリンジ上の疎水性表面ならびに溶液中の微小気泡または容器内の空気表面と相互作用しうる。疎水性物質とのタンパク質のそのような相互作用はタンパク質凝集を誘発しうる。不溶性凝集体の生成はタンパク質物質を使用不可能にしてしまうため、抗体のような治療用タンパク質製品の開発、製剤化、保存および輸送中の不溶性凝集体生成の抑制は薬物物質の維持のために極めて重要である。
【０００３】
溶液中のタンパク質の安定化のための多数の方法および添加剤が公知である。例えば、ＨＳＰ２５のような熱ショックタンパク質の添加によるタンパク質の安定化がＥＰ−Ａ ０５９９３４４に記載されている。ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンから構成されるブロック重合体をリン脂質と共に加えることによる抗体の安定化がＥＰ−Ａ ０３１８０８１に記載されている。免疫グロブリンは、アルギニン、グアニジンまたはイミダゾールのような窒素含有塩基の塩を加えることにより安定化されている。安定化のための他の適当な添加剤としては、ポリエーテル（ＥＰ−Ａ ００１８６０９）、グリセリン、アルブミンおよび硫酸デキストラン（米国特許第４，８０８，７０５号）、洗剤および界面活性剤、例えばポリソルベートに基づく界面活性剤（ＤＥ ２６５２６３６、ＧＢ ８５１４３４９）、シャペロン、例えばＧｒｏＥＬ（Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．，（１０）１９９１ ５３５−５４０）、クエン酸バッファー（ＷＯ ９３／２２３３５）またはキレート化剤（ＷＯ ９１／１５５０９）が挙げられる。これらの添加剤は、タンパク質が溶液中で或る程度安定化されることを可能にするが、それらは、例えば添加剤の除去のための追加的な処理工程を要するなどの欠点を伴う。さらに、先行技術において記載されている方法はいずれも、操作中に可溶性または不溶性凝集物が全く生成しない（または治療目的には無視しうる量しか生成しない）ような、凍結および解凍の繰返し過程中のタンパク質の安定化には適していない（米国特許第６，２３８，６６４号）。
【０００４】
凍結乾燥は、タンパク質を含む多数の生物活性物質の維持に有用かつ有効であると考えられる（Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，米国特許第６，０２０，４６９号）。しかし、凍結乾燥は、製品の不安定性を招きうる、それ自体のストレス（凍結過程および水分除去中のタンパク質の極端な濃度など）を誘発する。したがって、凍結乾燥は、脱アミノ化および酸化（これらは共に、凍結乾燥状態および液体状態で生じうる）に加えて、架橋（共有結合オリゴマー生成）および非共有結合凝集の速度の上昇を招きうる。
【０００５】
したがって、加工、製造、輸送および保存中の安定性が向上したタンパク質製剤が当技術分野において依然として必要とされている。特に、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成を抑制するタンパク質製剤が当技術分野において特に有用であろう。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ａ、抗体Ｂおよび抗体Ｅから選ばれる抗体またはそのフラグメントの医薬上許容される量を不溶性凝集体生成のインヒビターと共に含むタンパク質製剤に関する。ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。抗体Ａ〜Ｅの製造方法および使用方法を含むそれらの詳細な説明は米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）（図面を含むそれらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されうる。
【０００７】
本発明はまた、不溶性凝集体生成のインヒビターを含む、１以上の凍結／解凍サイクルにより及び攪拌により誘発されるタンパク質凝集体の生成を抑制するタンパク質製剤に関する。ある実施形態においては、ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。
【０００８】
本発明はまた、（ａ）１以上の凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前にバッファー系を選択し、（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む、１以上の凍結／解凍サイクルおよび攪拌に付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法に関する。ある実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せである。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルによって生じる不溶性凝集体の生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含むタンパク質製剤、ならびに１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法、および１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法を提供する。該方法は、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させる点で共通している。
【００１０】
本明細書中で引用されているすべての参考文献の全体を、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００１１】
本明細書中で用いる、タンパク質凝集体生成を「抑制（する）」は、タンパク質含有溶液におけるタンパク質凝集体の量を減少させ又は更なるタンパク質凝集体の生成を予防することを意味する。したがって、抑制は、タンパク質製剤または溶液におけるタンパク質凝集体の量を減少させ及びそれを予防することの両方を含みうる。減少または予防は、不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含むタンパク質含有溶液中に存在する凝集体の量を、不溶性凝集体生成のインヒビターの少なくとも１つを含まないタンパク質含有溶液中に存在する凝集体の量と比較することにより測定される。
【００１２】
本明細書中で用いる「タンパク質製剤」および「タンパク質溶液」なる語は交換可能である。さらに、「タンパク質」なる語は、本発明の意義においては、天然に存在する及び組換えタンパク質またはタンパク質断片、ならびに化学修飾されたタンパク質、ならびにアミノ酸の置換および付加を含有するタンパク質であると理解される。医薬組成物用に安定化されるタンパク質は、好ましくは、抗体、抗体融合タンパク質、例えばイムノトキシン、酵素およびタンパク質ホルモン、例えばエリスロポエチン、ソマトスタチン、インスリン、サイトカイン、インターフェロンまたはプラスミノーゲンアクチベーターであり、任意のアミノ酸配列、特にポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体など、および／またはそれらの断片（フラグメント）を含むと意図される。
【００１３】
タンパク質または抗体の「医薬上有効な量」は、種々の投与計画において治療効果をもたらす量を意味する。そのような量は当業者により容易に決定される。有効成分の量は、治療される状態の重症度、投与経路などに左右されるであろう。本発明の組成物は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ以上のタンパク質量を含有するよう製造されうる。抗体Ａ〜Ｅの場合、医薬上有効な量は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、あるいは米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）に開示されているとおりである。
【００１４】
「抗体Ａ」なる語は、米国特許出願第１０／１８０，６４８号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１５】
「抗体Ｂ」なる語は、米国特許出願第１０／８９１，６５８号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１６】
「抗体Ｃ」なる語は、米国特許および米国特許出願第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１７】
「抗体Ｄ」なる語は、米国特許出願第６０／６３８，９６１号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１８】
「抗体Ｅ」なる語は、米国特許第６，２３５，８８３号に開示されている抗体、またはその１以上のフラグメント、突然変異体、欠失体、付加体、変異体、トランケート化体またはオルソログを意味すると理解される。
【００１９】
「不溶性凝集体生成のインヒビター」は、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液におけるタンパク質凝集体の生成を有効に抑制しうる任意の化合物または状態である。好ましい実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターは、ｐＨ；無機金属アルカリおよびアルカリ性塩、例えばＭｇＣｌ２など；ポリオール、例えばプロピレングリコールなど；重合体、例えばブロック重合体およびブロック共重合体（ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８など）；低級アルコール、例えばエタノールなど；またはそれらの２以上の組合せから選ばれる。
【００２０】
一般に、本発明の製剤は、好ましくは、安定な形態の製剤を損なわない量かつ有効で安全な医薬投与に適した量の他の成分を含有しうる。
【００２１】
ある態様においては、本発明は、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅよりなる群から選ばれる抗体またはそのフラグメント；バッファー；および不溶性凝集体生成のインヒビターの医薬上許容される量を含む製剤を提供する。
【００２２】
もう１つの態様においては、本発明は、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含む、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤を提供する。
【００２３】
もう１つの態様においては、本発明は、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含む、攪拌ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤を提供する。本明細書中で用いる「攪拌ストレス」は、該タンパク質製剤に受動的または能動的に加えられる物理的運動を意味すると理解される。攪拌ストレスの非限定的な具体例には、衝突、落下、振とう、回転、ボルテックス、デカント、注入、引き込み（容器または入れ物からシリンジへの）などが含まれる。本発明の好ましいタンパク質製剤は特に、輸送および運搬の力（影響力）に対して安定化される。
【００２４】
ある態様においては、本発明は、熱ストレス、化学ストレス（例えば、ｐＨ、低／高塩など）、流体ストレス（例えば、圧縮ストレス、例えば、締めつけられた開口部を通る流体運動により生じるもの）などを非限定的な例として含む１以上の外的な物理的または化学的ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上した、タンパク質またはタンパク質断片、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターおよびバッファー系を含むタンパク質製剤を提供する。
【００２５】
前記態様の好ましい実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターは、ｐＨ、ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる。１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはＭｇＣｌ２であり、ここで、ＭｇＣｌ２の濃度は約０．１ｍＭ〜約３００ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、より一層好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭである。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはプロピレングリコールであり、ここで、プロピレングリコールの濃度は約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１％〜約１０％である。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはプルロニック−Ｆ６８であり、ここで、プルロニック−Ｆ６８の濃度は約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％〜約１％である。もう１つの実施形態においては、もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはエタノールであり、ここで、エタノールの濃度は約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％〜約１０％、より一層好ましくは０．１％〜約３％である。もう１つの実施形態においては、不溶性凝集体生成のインヒビターはｐＨであり、ここで、ｐＨは該製剤のタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）から約±１．０ｐＨ単位またはそれ以上に維持される。より好ましくは、ｐＨは該等電点ｐＨ（ｐＩ）から約±２．０ｐＨ単位またはそれ以上に維持される。
【００２６】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法を提供する。この態様においては、本発明の方法は、１以上の凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む。この態様の他の実施形態においては、該方法は、該凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。したがって、該製剤への添加の順序は交換可能であるが、関心のあるタンパク質は、該凍結／解凍サイクルの開始前には溶解状態になければならない。
【００２７】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前にバッファー系を選択し、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルまたは攪拌の前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法を提供する。前記態様の場合と同様に、この方法の或る実施形態は、該凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。
【００２８】
もう１つの態様においては、本発明は、攪拌ストレスにより誘発される凝集体生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法を提供する。この態様においては、本発明の方法は、攪拌ストレスが加わる前（または攪拌ストレスが加わる恐れ／可能性がある前）にバッファー系を選択し、攪拌ストレスが加わる前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、攪拌ストレスが加わる前または攪拌ストレスが加わる恐れ若しくは可能性がある前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む。この態様の他の実施形態においては、該方法は、該攪拌ストレスの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。したがって、該製剤への添加の順序は交換可能であるが、関心のあるタンパク質は、該攪拌ストレスの開始前には溶解状態になければならない。
【００２９】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の物理的攪拌ストレスにさらされるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成を抑制するための方法であって、該攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、該攪拌ストレスの前に、該バッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、該攪拌ストレスの前に、該バッファー系および不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含む方法を提供する。前記態様の場合と同様に、この方法の或る実施形態は、物理的攪拌ストレスの前、途中または後に、不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含みうる。
【００３０】
本発明はまた、医薬上有効な量のタンパク質を、適当な希釈剤、補助剤および／または担体と共に含む製剤を含む。当業者によく知られた他の医薬上許容される賦形剤も本組成物の一部分を構成しうる。これらには、例えば、種々の増量剤、追加的な緩衝剤（バッファー）、キレート化剤、抗酸化剤、保存剤、共存溶媒などが含まれ、これらの具体例には、トリメチルアミン塩（「Ｔｒｉｓ（トリス）バッファー」）およびＥＤＴＡが含まれうるであろう。１つの実施形態においては、２以上のタイプのタンパク質が該製剤中に含まれる。もう１つの実施形態においては、関心のある１つのタンパク質以外のいずれのタンパク質も該製剤の一部分ではない。
【００３１】
該製剤の製剤化のための適当なｐＨ範囲は、関心のある個々のタンパク質またはタンパク質断片に左右されるであろう。関心のあるタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）より１ｐＨ単位以上大きい又は小さい範囲内の緩衝能を維持するｐＨ範囲のバッファーを選択することが特に好都合である。より好ましくは、バッファー系のｐＨは、該タンパク質のｐＩより２ｐＨ単位以上大きい又は小さい範囲内で安定である。さらに、大きな温度範囲、特に約−８０℃〜約２５℃にわたってｐＨを維持するバッファー系を選択することが特に好都合である。すなわち、該バッファー系のｐＨは、好ましくは、有意には温度依存性または応答性ではない。１つの実施形態においては、該バッファーは、約４〜約８のｐＨ範囲および約１ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度範囲を有するリン酸カリウム／酢酸カリウム混合バッファー系である。
【００３２】
本明細書中で用いる「タンパク質凝集体」または「タンパク質凝集」は、もはや溶解状態にないタンパク質を意味すると理解される。タンパク質凝集体は、２以上の個々のタンパク質分子のアグロメレーションまたはオリゴマー化を意味しうるが、それはそのような定義に限定されない。当技術分野で用いられるタンパク質凝集体は可溶性または不溶性でありうるが、本発明の目的においては、特に示さない限りタンパク質凝集体は通常は不溶性であるとみなされる。本発明の方法において生成を防ぐべき不溶性凝集体は本質的には、通常は少なくとも１μｍのサイズを有するタンパク質凝集体であると理解されるが、１０μｍ以上の範囲のものであってもよい。該粒子は、市販の粒子計数装置、例えばＰＳＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）の粒子計数装置ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ ７００、またはＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用する適当な粒子計数法により測定されうる。ＵＳＰ（米国薬局方）によれば、医薬製剤の注射用量当たり１０μｍを超える範囲内の最大６０００個の粒子および２５μｍを超える範囲内の最大６００個の粒子が許容される。これは、タンパク質の治療用組成物のための簡便な方法で本発明により達成されうる。
【００３３】
本発明においては、任意のタンパク質が使用されうる。本発明の或る態様は、水性緩衝溶液、および特許請求の範囲の幾つかに記載のタンパク質凝集体生成のインヒビターの使用に基づくものであり、それに溶解している特定のタンパク質に限定されると解釈されるべきではない。
【００３４】
該製剤は一般に、自体公知の一般的に利用可能な医薬組合せ技術を用いて該成分を組合せることにより製造される。その医薬製剤の製造するための特定の方法は、任意の標準的なタンパク質精製法により精製されたタンパク質、および抗体Ａ〜Ｅを記載している特許および特許出願に開示されているタンパク質を使用することを含む。
【００３５】
実施例
実施例において使用する種々の抗体は、米国特許および米国特許出願第１０／１８０，６４８号（抗体Ａ）；第１０／８９１，６５８号（抗体Ｂ）；第５，７８９，５５４号、第６，２５４，８６８号、第０９／０３８，９５５号、第０９／５９０，２８４号、第１０／１５３，８８２号（抗体Ｃ）；第６０／６３８，９６１号（抗体Ｄ）；第６，２３５，８８３号（抗体Ｅ）（すべてをを参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。
【００３６】
材料： ＣＨＯ由来抗体を発現させ、精製した。該抗体を蒸留脱イオン水に対して十分に透析し、〜３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。実施例に要求されるバッファー範囲（ｐＨ４〜８）に基づき、リン酸カリウムバッファーおよび酢酸カリウムバッファーの組合せを使用した。カリウムに基づくバッファーを選択したのは、それらが、ナトリウムに基づくバッファーに比べて凍結ｐＨ安定性に優れているからである。リン酸カリウム（Ｋ／ＰＯ４）（一および二塩基性）および酢酸カリウム（Ｋ／ＯＡｃ）はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔから購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）六水和物はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。プルロニック−Ｆ６８（ポロキサマー）はＳｉｇｍａから購入した。エタノール（ＥｔＯＨ）および１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。
【実施例１】
【００３７】
製剤の製造
凍結／解凍により誘発される凝集体生成を抑制する被検物質のそれぞれに関する一連の製剤を製造した。各製剤は同様に製造した。Ｄａｉｋｙｏ栓を備えた５ｍＬバイアル内で試験サンプル（２ｍＬ）を調製した。濃縮バッファーストック（２０ｍＭ Ｋ／ＯＡｃ、２０ｍＭ Ｋ／ＰＯ４（各試験ｐＨ値のもの））を、試験する各ｐＨ範囲における５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃ、５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４の最終濃度まで各サンプルに加えた。個々のタンパク質ストック溶液（〜３０ｍｇ／ｍＬ）を〜１０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度まで各製剤に加えた。調製した凝集体生成抑制物質の追加的なストック溶液には、５．０Ｍ ＭｇＣｌ２、５％ プルロニック−Ｆ６８、１００％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨおよび１００％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールが含まれる。これらのストック溶液を、以下の開示に記載の最終濃度範囲、典型的には３０〜３００ｍＭ（ＭｇＣｌ２）、０．０１〜１．０％（プルロニック−Ｆ６８）、０．２〜１０％（ＥｔＯＨ）および１〜１０％（プロピレングリコール）まで該製剤に加えた。必要に応じて、脱イオン水を加えて最終体積にした。
【００３８】
凍結／解凍法
各製剤を製造した後、該サンプルバイアルを栓で密封し、適当なバイアルスペーサーインサートを含有する５ｃｃ×１６の箱の中に配置した。該箱を穏やかに回転させて、該サンプルの穏やかな完全な混合を促した。混合後、該サンプルを冷凍庫（−８０℃）内に一晩配置した。翌朝、該サンプルを該冷凍庫から取り出し、外界温度（室温ないし２０〜２３℃）に配置してそれらを解凍した。該サンプルが完全に解凍し外界温度に平衡化した後、該箱の中のサンプルを穏やかな回転により再び混合した。この凍結／解凍プロセスを合計３サイクル繰返した。
【００３９】
サンプル分析
３サイクルの凍結／解凍が完了した後、該サンプルの不溶性凝集体生成の初期目視検査を行った。ついで、ＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用して、不溶性凝集体を計数した。不溶性凝集体の総合評価を、＞２μｍの検出限界を用いて定量した。該装置の検出限界は約１８，０００計数（カウント）／ｍＬである。著しい沈殿／凝集体生成が生じたようである場合には、凝集体生成をより正確に定量し装置の限界を避けるために該サンプルを希釈した（典型的には１：２５希釈）。
【００４０】
結果
Ａ．ｐＨに対する不溶性凝集体生成の依存性
不溶性凝集およびそのｐＨ依存性に関して、試験した全てのＩｇＧの間で共通の傾向が認められる。試験した全てのＩｇＧに関して、４．０〜５．０のｐＨ値は不溶性凝集体生成に関して一貫して低い粒子計数を与えた。ｐＨ６．０〜８．０では、不溶性凝集体の計数は具体的なタンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）に著しく依存した。抗体Ａ、抗体Ｃおよび抗体Ｄ（それぞれ８．５、９．２および８．７のｐＩ値）に関して認められるとおり、全粒子計数は、抗体Ｂおよび抗体Ｅ（それぞれ７．８および６．５のｐＩ値）と比べてかなり低かった（＜１５００）。ｐＨ６．０における抗体Ｂおよび抗体Ｅに関する全粒子計数はそれぞれ〜１１，０００および〜７，４００である。抗体Ｂは、ｐＨが該タンパク質のｐＩに近づくにつれて、異常に高レベルの不溶性凝集体を示している。抗体Ｃおよび抗体Ｄは、凍結／解凍中およびｐＨ変化における不溶性凝集体の生成に対して若干抵抗性であるらしい。その原因は十中八九、試験したｐＨ範囲によるものであろう。これらの２つのタンパク質は９．２および８．７のｐＩを有し、それらは、この研究で試験した全てのタンパク質における最高のｐＩである（図１）。不溶性凝集体生成を抑制するためにはバッファーｐＨ範囲は製剤中の個々のタンパク質のｐＩにより決定されるべきであることを、これらの傾向は示している。理想的には、バッファー系のｐＨは該タンパク質のｐＩ値より高い又は低い少なくとも最大限度（ｆｕｌｌ）のｐＨ単位であるべきである。
【００４１】
Ｂ．塩化マグネシウムに対する不溶性凝集体生成の依存性
比較のために前記（Ａ）に記載のｐＨスクリーン（ｓｃｒｅｅｎ）を用いた場合、３０〜３００ｍＭ ＭｇＣｌ２の添加は、３サイクルの凍結／解凍により誘発される不溶性凝集体生成を抑制しうる。抗体Ｅにおける最も多量の不溶性凝集体を産生する状態はＭｇＣｌ２の導入で有意に抑制される。これは６〜７のｐＨ範囲で最も顕著に認められる。図２は、抗体Ｅのみに関する３０〜３００ｍＭ ＭｇＣｌ２での不溶性凝集体の抑制を示す。図３は、１００ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２による、抗体Ａ〜Ｄに関する不溶性凝集に対する効果を示す。ＭｇＣｌ２による不溶性凝集の抑制は、抗体Ｄ以外の全てのタンパク質に共通して認められる現象である。抗体Ａは、凍結／解凍中、よく機能するタンパク質である。不溶性凝集体は、ｐＨ８以外のほとんどの試験条件において少量である。これはおそらく、ｐＨ８が抗体ＡのｐＩ（８．５）に近いことによるものであろう（相当な不溶性凝集体を含有する（〜１６，０００計数／ｍＬ））。抗体Ａに関してｐＨ８でＭｇＣｌ２を含有させると、不溶性凝集体計数が＜５０計数／ｍＬへと有意に減少する。抗体Ｂは、ＭｇＣｌ２の添加後、不溶性凝集体生成に対して最小量の防護しか示していない。抗体Ｂに関しては、すべての条件下、ＭｇＣｌ２の添加は単なる緩衝溶液と比べて少量または同等量の不溶性凝集体の含有を示す。抗体Ｄはこの観察の例外のようである。製剤へのＭｇＣｌ２の添加は、バッファーのみと比べて不溶性凝集体のレベルを維持するか、または７〜８のｐＨ範囲において不溶性凝集体の数を増加させる。
【００４２】
Ｃ．エタノールに対する不溶性凝集体生成の依存性
抗体Ｅで多量の不溶性凝集体を生成することが判明した前記の条件を用いた場合、低濃度のエタノールの添加は不溶性凝集体の数を減少させる。これらの不溶性凝集体生成性バッファーは塩化カリウムまたはナトリウム（ｐＨ５．０または７．０の１００ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ５または６の１００ｍＭ ＮａＣｌ）の存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。前記バッファー条件における抗体Ｅの３サイクルの凍結／解凍は約１５，０００計数／ｍＬの凝集体生成を誘発する。同じ条件下、エタノール（０．１％（ｖ／ｖ））の添加は不溶性凝集体生成の量を５０％以上減少させた。０．２％（ｖ／ｖ）エタノールの添加は不溶性凝集体の量を約２０倍減少させる。０．８〜１０％（ｖ／ｖ）の量で添加されたエタノールは、３サイクルの凍結／解凍により誘発された不溶性凝集体をほぼ消失させる。図４は、（Ａ）ＫＣｌ含有バッファー系および（Ｂ）ＮａＣｌ含有バッファー系における、抗体Ｅに関する不溶性凝集体生成に対するエタノールの効果を示す。
【００４３】
Ｄ．プロピレングリコールに対する不溶性凝集体生成の依存性
最高の不溶性凝集体生成のための前記条件（前記（Ｃ））を用いた場合、種々の量のプロピレングリコールの添加は抗体Ｅの沈殿を減少させる。試験した全ての条件（５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ ＫＯＡｃ、＋／− １００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ５または７）において、１％ プロピレングリコールの添加は不溶性凝集体の量を〜１５倍減少させた。プロピレングリコールの量の更なる増加は沈殿のレベルを（＞２０倍）減少させた。図５は、不安定化バッファー系においてプロピレングリコールが不溶性凝集体生成に及ぼす抑制効果を示す。
【００４４】
Ｅ．乳化／湿潤剤に対する不溶性凝集体生成の依存性
ポロキサマー１８８およびプルロニック−Ｆ６８は、０．０１〜５％の濃度範囲で存在する場合には脂肪乳化剤および湿潤剤として分類される（Ｒｏｗｅら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｅｌｌｅｒ，ＰＪ．（編）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（Ｌｏｎｄｏｎ） ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．），２００３．ｐｐ．４４７−４４９）。前記（Ｃ、Ｄ）の不安定化バッファー系を使用して、プルロニック−Ｆ６８を０．０１〜１％の濃度まで加えた。この濃度範囲内のプルロニック−Ｆ６８の添加は不溶性凝集体の生成を抑制した（図６）。
【実施例２】
【００４５】
攪拌ストレス中のタンパク質凝集体生成の抑制
（ａ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）（対照サンプル）；（ｂ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７）；（ｃ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、０．１％ プルロニックＦ６８（ｐＨ７）；および（ｄ）５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５ｍＭ リン酸カリウム、１０％ プロピレングリコール（ｐＨ７）を含むバッファー条件と共に実施例１に記載の抗体を使用して各製剤を製造する。これらの製剤は、当業者に公知のいずれかの方法、例えば透析、ダイアフィルトレーション、バッファー交換（クロマトグラフィー、遠心濾過など）を用いて製造する。当業者は、そのような製造に必要な適当な材料・物質（ダイアフィルトレーション膜および透析管の分子量カットオフなど）を特定することが可能である。典型的なタンパク質濃度（例えば、〜１０ｍｇ／ｍＬ）が得られたら、該サンプルバイアルを栓で密封し、適当なバイアルスペーサーインサートを含有する５ｃｃ×１６の箱の中に配置する。該サンプルの穏やかで十分な混合が促され保証されるよう、該箱を穏やかに回転させる。
【００４６】
混合後、該サンプルを輸送刺激（トラックおよび航空機の場合の代表例としての、１２時間の地上の振動および１２時間の空中の振動）にさらす。輸送刺激を用いることができない場合には、５００ｒｐｍで７２時間以上（ＶＷＲ ＯＳ−５００オービタルシェーカー）作動させるオービタルシェーカー（例えば、ＶＷＲ ＯＳ−５００オービタルシェーカー）のような種々の方法により模擬輸送条件を達成することが可能である。
【００４７】
サンプル分析
該攪拌ストレスが完了した後、該サンプルの不溶性凝集体生成の初期目視検査を行う。ついで、ＬＤ４００レーザーカウンターを備えたＰａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＩＡＣ Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数系モデル９７０３を使用して、不溶性凝集体を計数する。不溶性凝集体の総合評価を、＞２μｍの検出限界を用いて定量する。該装置の検出限界は約１８，０００計数（カウント）／ｍＬである。著しい沈殿／凝集体生成が生じたようである場合には、凝集体生成をより正確に定量し装置の限界を避けるために該サンプルを希釈する（典型的には１：２５希釈）。
【００４８】
本発明は特定の態様および実施形態に関して記載されているが、前記の説明および実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、当業者に明らかであり添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる種々の修飾および同等の製剤を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃバッファーにおける４．０〜８．０の範囲のｐＨに対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。各タンパク質の等電点ｐＨ（ｐＩ）は以下のとおりである：抗体Ｅ＝６．５；抗体Ｂ＝７．８；抗体Ｄ＝８．１；抗体Ａ＝８．５；および抗体Ｃ＝９．２。
【図２】図２は、図１と同じｐＨ範囲にわたる抗体Ｅに関するＭｇＣｌ２濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。データは、０．０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭおよび３００ｍＭの全製剤ＭｇＣｌ２濃度に関して集めた。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、図１と同じｐＨ範囲にわたる抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃおよび抗体Ｄに関するＭｇＣｌ２濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。データは、０．０ｍＭおよび１００ｍＭの全配合ＭｇＣｌ２濃度に関して集めた。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、抗体Ｅに関するエタノール濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。このデータ収集のために使用したバッファー系は１００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０および７．０の１００ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ５および６の１００ｍＭ ＮａＣｌ）の存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。エタノール濃度は０〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲であった。
【図５】図５は、抗体Ｅに関するプロピレングリコール濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。このデータ収集のために使用したバッファー系はｐＨ５．０および７．０の１００ｍＭ ＫＣｌの存在下または非存在下の５ｍＭ Ｋ／ＰＯ４、５ｍＭ Ｋ／ＯＡｃであった。ポリエチレングリコール濃度は０〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲であった。
【図６】図６は、プルロニック−Ｆ６８濃度に対する累積全粒子計数の依存性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅよりなる群から選ばれる抗体またはそのフラグメントの医薬上許容される量、
ｂ）バッファー、および
ｃ）不溶性凝集体生成のインヒビター
を含んでなる製剤。
【請求項２】
該バッファーが約４．０〜約８．０のｐＨ範囲を有する、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
不溶性凝集体生成のインヒビターがＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せの少なくとも１つである、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
該バッファーがリン酸バッファーである、請求項２記載の製剤。
【請求項５】
不溶性凝集体生成のインヒビターがＭｇＣｌ２である、請求項３記載の製剤。
【請求項６】
ＭｇＣｌ２の量が約０．１ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
不溶性凝集体生成のインヒビターがプロピレングリコールである、請求項３記載の製剤。
【請求項８】
プロピレングリコールの量が約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）である、請求項７記載の製剤。
【請求項９】
不溶性凝集体生成のインヒビターがプルロニック−Ｆ６８である、請求項３記載の製剤。
【請求項１０】
プルロニック−Ｆ６８の量が約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）である、請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
不溶性凝集体生成のインヒビターがポロキサマー１８８である、請求項３記載の製剤。
【請求項１２】
ポロキサマー１８８の量が約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）である、請求項１１記載の製剤。
【請求項１３】
不溶性凝集体生成のインヒビターがエタノールである、請求項３記載の製剤。
【請求項１４】
エタノールの量が約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）である、請求項１３記載の製剤。
【請求項１５】
（ａ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法。
【請求項１６】
（ａ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項１８】
（ａ）バッファー系を選択し、
（ｂ）（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法。
【請求項１９】
ａ）タンパク質またはタンパク質断片、
ｂ）ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビター、および
ｃ）バッファー系
を含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤。
【請求項２０】
該バッファー系が（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片の等電点（ｐＩ）に基づいて選択される、請求項１９記載のタンパク質製剤。
【請求項２１】
該バッファー系が、（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片のｐＩに等しい又はそれより２ｐＨ単位以上高い若しくは低い、請求項２０記載のタンパク質製剤。
【請求項２２】
該バッファーが、（ａ）の抗体の等電点ｐＨより２ｐＨ単位以上高い又は低い、請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
該抗体が抗体Ｅである、請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２４】
（ａ）攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）攪拌ストレスの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発される凝集生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法。
【請求項２５】
（ａ）攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）攪拌ストレスの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項２６】
攪拌ストレスの前、途中または後に、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項２７】
（ａ）バッファー系を選択し、
（ｂ）（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法。
【請求項２８】
ａ）タンパク質またはタンパク質断片、
ｂ）ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビター、および
ｃ）バッファー系
を含んでなる、攪拌ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤。
【請求項２９】
該バッファー系が（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片の等電点（ｐＩ）に基づいて選択される、請求項２８記載のタンパク質製剤。
【請求項３０】
該バッファー系が、（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片のｐＩに等しい又はそれより２ｐＨ単位以上高い若しくは低い、請求項２９記載のタンパク質製剤。
【請求項３１】
該攪拌ストレスが陸上、海上または空中の輸送中にサンプルに加えられる、請求項２８記載の製剤。
【請求項１】
ａ）抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅよりなる群から選ばれる抗体またはそのフラグメントの医薬上許容される量、
ｂ）バッファー、および
ｃ）不溶性凝集体生成のインヒビター
を含んでなる製剤。
【請求項２】
該バッファーが約４．０〜約８．０のｐＨ範囲を有する、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
不溶性凝集体生成のインヒビターがＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−Ｆ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、エタノールまたはそれらの組合せの少なくとも１つである、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
該バッファーがリン酸バッファーである、請求項２記載の製剤。
【請求項５】
不溶性凝集体生成のインヒビターがＭｇＣｌ２である、請求項３記載の製剤。
【請求項６】
ＭｇＣｌ２の量が約０．１ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
不溶性凝集体生成のインヒビターがプロピレングリコールである、請求項３記載の製剤。
【請求項８】
プロピレングリコールの量が約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）である、請求項７記載の製剤。
【請求項９】
不溶性凝集体生成のインヒビターがプルロニック−Ｆ６８である、請求項３記載の製剤。
【請求項１０】
プルロニック−Ｆ６８の量が約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）である、請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
不溶性凝集体生成のインヒビターがポロキサマー１８８である、請求項３記載の製剤。
【請求項１２】
ポロキサマー１８８の量が約０．０１％〜約５％（ｖ／ｖ）である、請求項１１記載の製剤。
【請求項１３】
不溶性凝集体生成のインヒビターがエタノールである、請求項３記載の製剤。
【請求項１４】
エタノールの量が約０．０１％〜約１０％（ｖ／ｖ）である、請求項１３記載の製剤。
【請求項１５】
（ａ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される凝集生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法。
【請求項１６】
（ａ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前、途中または後に、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項１８】
（ａ）バッファー系を選択し、
（ｂ）（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）少なくとも１つの凍結／解凍サイクルの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法。
【請求項１９】
ａ）タンパク質またはタンパク質断片、
ｂ）ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビター、および
ｃ）バッファー系
を含んでなる、１以上の凍結／解凍サイクルにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤。
【請求項２０】
該バッファー系が（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片の等電点（ｐＩ）に基づいて選択される、請求項１９記載のタンパク質製剤。
【請求項２１】
該バッファー系が、（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片のｐＩに等しい又はそれより２ｐＨ単位以上高い若しくは低い、請求項２０記載のタンパク質製剤。
【請求項２２】
該バッファーが、（ａ）の抗体の等電点ｐＨより２ｐＨ単位以上高い又は低い、請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
該抗体が抗体Ｅである、請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２４】
（ａ）攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）攪拌ストレスの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発される凝集生成に対してタンパク質製剤を安定化するための方法。
【請求項２５】
（ａ）攪拌ストレスの前にバッファー系を選択し、
（ｂ）攪拌ストレスの前に、（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスに付されるタンパク質溶液におけるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項２６】
攪拌ストレスの前、途中または後に、タンパク質またはタンパク質断片を含む溶液を不溶性凝集体生成のインヒビターの或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発されるタンパク質凝集体生成の抑制方法。
【請求項２７】
（ａ）バッファー系を選択し、
（ｂ）（ａ）のバッファー系を、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビターと接触させ、
（ｃ）攪拌ストレスの前に、該バッファー系および（ｂ）の不溶性凝集体生成のインヒビターをタンパク質またはタンパク質断片の或る量と接触させることを含んでなる、攪拌ストレスにより誘発されるタンパク質凝集体生成に対して安定化されたタンパク質製剤の製造方法。
【請求項２８】
ａ）タンパク質またはタンパク質断片、
ｂ）ＭｇＣｌ２、プロピレングリコール、プルロニック−Ｆ６８、ポロキサマー１８８またはエタノールから選ばれる、不溶性凝集体生成を抑制するのに有効な量の不溶性凝集体生成のインヒビター、および
ｃ）バッファー系
を含んでなる、攪拌ストレスにより誘発される不溶性凝集体生成に対する安定性が向上したタンパク質製剤。
【請求項２９】
該バッファー系が（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片の等電点（ｐＩ）に基づいて選択される、請求項２８記載のタンパク質製剤。
【請求項３０】
該バッファー系が、（ａ）のタンパク質またはタンパク質断片のｐＩに等しい又はそれより２ｐＨ単位以上高い若しくは低い、請求項２９記載のタンパク質製剤。
【請求項３１】
該攪拌ストレスが陸上、海上または空中の輸送中にサンプルに加えられる、請求項２８記載の製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５０２９７２（Ｐ２００９−５０２９７２Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４２７９（Ｐ２００８−５２４２７９）
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１６５６２
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１６５６２
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
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