チップ
【課題】検体中の成分を簡便で迅速に検出する。
【解決手段】チップ１００は、基板に、試料中の成分を検出する検出部１１０が設けられた構成である。検出部１１０は、基板に設けられ成分を捕捉する捕捉部、捕捉部から上方に向かって設けられ試料が導入される流入路、および捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに流入路より幅狭に設けられ、試料が排出される複数の排出路を含む。捕捉部に成分を捕捉する捕捉物質が設けられている。
【解決手段】チップ１００は、基板に、試料中の成分を検出する検出部１１０が設けられた構成である。検出部１１０は、基板に設けられ成分を捕捉する捕捉部、捕捉部から上方に向かって設けられ試料が導入される流入路、および捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに流入路より幅狭に設けられ、試料が排出される複数の排出路を含む。捕捉部に成分を捕捉する捕捉物質が設けられている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チップに関し、特に、微生物を検出するチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体チップに関する技術として、特許文献１に記載のものがある。同文献に記載のマイクロ流体チップにおいては、マイクロチャンネル底面に１０種類の生体分子（抗体）がチャンネル延在方向に沿って固定化された構成が示されている。
【特許文献１】特開２００７−１０１２２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところが、上記特許文献１に記載のチップを用いて試料中の成分を検出しようとすると、以下の点で改善の余地があった。
まず、特許文献１のチップにおいては、基板面に水平な一方向に延在する流路中を試料が流れ、試料中の成分を流路の底部に固定化されている抗体により捕捉する構造となっている。このため、試料中の成分の抗体への衝突確率が低いことがあった。これにより、検出対象の成分が抗体に接触せずおよび捕捉されずに検出部を素通りしてしまい、捕捉効率が充分でない場合があった。
【０００４】
また、上記捕捉効率を高めるために、試料の流速を低下させると、時間あたりの流量が低下することになるため、試料の処理速度が遅くなってしまう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、
基板に、試料中の成分を検出する検出部が設けられたチップであって、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップが提供される。
【０００６】
本発明においては、試料が導入される流入路が捕捉部から上方に向かって配置されている。このため、検出対象の成分を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して検出部の上方から下向きに流れ込むことにより、捕捉部への成分の衝突確率を高めることができる。
また、流入路を捕捉部から上方に向かって配置するとともに、排出路を基板面方向に延在させた構成となっているため、試料が捕捉部の上方からチップに流入した試料が、捕捉部にて試料の流向を基板面方向に変更することになる。このため、試料中の成分と捕捉物質の接触率を高めることができるため、捕捉物質による成分の捕捉率を向上することができる。
【０００７】
また、試料が捕捉部の上方から捕捉部に向かって流れ込む構成においては、捕捉部に導入された試料を効率よく捕捉部外に排出することが、試料の処理速度の向上の観点で重要となる。そこで、本発明においては、導入より幅狭の複数の排水路を基板面の異なる方向に配置している。これにより、流出路の抵抗を相対的に高め、捕捉部付近での試料の流速を相対的に遅くすることができる。よって、検体の捕捉率を向上することができる。また、複数の排出路により試料の排出流量を大きくすることができるため、処理速度を高めることができる。
【０００８】
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。
【０００９】
たとえば、本発明によれば、前記本発明におけるチップを用いた検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように本発明によれば、試料中の成分を簡便で迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には共通の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１２】
（第一の実施形態）
図１は、本実施形態のチップの構成を示す平面図である。図２は、図１のチップ１００の検出部１１０を拡大して示す平面図である。図３（ａ）は、図１のチップ１００の検出部１１０の捕捉部周辺の構成を示す平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。
【００１３】
図１〜３に示したチップ１００は、基板（接合基板１０１の基板１４１）に、試料中の成分を検出する検出部１１０が設けられたチップである。
本実施形態において、接合基板１０１は、基板１４１（図３（ｂ））上に上板１３５（図７）を接合したものである。また、図１においては、１つの接合基板１０１に複数の検出部１１０が一列に配置されている。
検出部１１０は、捕捉部１０５、流入路１０３、および複数の排出路１０７を含む。
【００１４】
捕捉部１０５は、接合基板１０１中の基板１４１に設けられ、検出対象の成分（検体）を捕捉する。捕捉部１０５は液溜状に形成されており、液溜の底部に、検出対象の成分を捕捉する捕捉物質が固定化されている。検出対象成分はたとえば微生物であり、このとき捕捉物質としてたとえば当該微生物に対する親和性を有する抗体が用いられる。
図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状が矩形である。捕捉部１０５の大きさは、たとえば矩形の縦、横を１０〜５０００μｍ、高さを１０〜１０００μｍとする。
【００１５】
流入路１０３は、捕捉部１０５から上方（鉛直上方）に向かって設けられている。流入路１０３から検出部１１０に試料が導入される。図３において、流入路１０３の直径は、たとえば１０〜３０００μｍとする。
【００１６】
複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内の異なる方向に互いに延在している。複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内に放射状に延びている。図１に示したチップ１００では、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が設けられている。同じ辺に設けられた排出路１０７は、当該辺に直交して互いに平行に延びている。また、同じ辺に設けられた排出路１０７は等間隔で設けられている。
【００１７】
また、排出路１０７は流入路１０３より幅狭に設けられている。排出路１０７は、たとえば流路幅１〜５００μｍ程度、流路高（深さ）１〜５００μｍ程度に形成される。捕捉部１０５に導入された試料は排出路１０７から捕捉部外部に排出される。排出路１０７は、基板１４１と上板１３５との間に形成されている。
【００１８】
また、検出部１１０は、接続流路１０９、環状流路１１１および廃液溜１１３をさらに含む。
環状流路１１１は、捕捉部１０５の外側に捕捉部１０５の周囲を取り囲んで設けられた環状の流路である。図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状に対応して、環状流路１１１も矩形の環状となっている。環状流路１１１は、たとえば基板１４１と上板１３５との間隙として形成される。
排出路１０７は、一端で捕捉部１０５に連通し、他端で環状流路１１１に連通している。
【００１９】
また、環状流路１１１は、接続流路１０９を介して廃液溜１１３に連通している。流入路１０３から検出部１１０に導入された液体は、捕捉部１０５、排出路１０７、環状流路１１１および接続流路１０９をこの順に経由して廃液溜１１３に排出される。
【００２０】
次に、図４〜図７を参照して、図１に示したチップの製造方法を説明する。本実施形態では、上板１３５としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコンエラストマーを用い、ＰＤＭＳ加工用のモールド材料として、シリコンモールドを用いる方法を例示する。
【００２１】
この方法は、以下の工程を含む。
第一工程：マイクロ流路チップ用シリコンモールドの作成
第二工程：ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）の作成
第三工程：抗体の固相化
以下、各工程を順に説明する。
【００２２】
（第一工程）
第一工程では、光リソグラフィー技術を用いて、上板１３５を形成するためのモールドを準備する。モールドは、シリコンウェーハ上にフォトレジストをパターニングすることにより形成される。また、レジスト材をそのまま流路用モールドとして使用する場合と、耐久性を向上させるため、その後エッチングの工程を行いシリコンそのものに加工を施しモールドとする場合がある。
【００２３】
図４（ａ）〜図４（ｄ）は、シリコンモールドの製造工程を示す断面図である。
まず、図４（ａ）に示したように、シリコンウェーハ１１５上に、スピンコート法によりフォトレジスト１１７を塗布する。フォトレジスト１１７の材料は上板１３５の材料等に応じて選択されるが、たとえばＳＵ−８（SU-8 2000 MicroChem社製）等を用いる。
【００２４】
次に、コンタクトリソグラフィーを用いて、フォトレジスト１１７上にマイクロ流路のパターンを描画したフォトマスク１１９を配置し、チップ１００のマイクロ流路デザインをフォトレジスト１１７に露光・転写する（図４（ｂ））。そして、現像により、シリコンウェーハ１１５上の所定の位置に選択的にフォトレジスト１１７を残す（図４（ｃ））。そして、フォトレジストが残ったままのシリコン基板をモールドとして用いる。ただし、フォトレジストは強度的に脆弱な場合があるため、強度が必用な場合は、その後、フォトレジスト１１７をマスクとしてシリコンウェーハ１１５をエッチングし、シリコンモールド１２１を得てもよい（図４（ｄ））。
【００２５】
（第二工程）
第二工程では、第一工程で得られたシリコンモールド１２１を用いて上板１３５を作製し、ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）を作製する。
【００２６】
図５（ａ）〜図５（ｄ）および図６（ａ）〜図６（ｅ）は、接合基板１０１の作成手順を示す断面図である。
まず、第一工程で準備したシリコンモールド１２１を、シャーレ１２３等の所定の容器内に接着し、固定する（図５（ａ））。そして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入する（図５（ｂ））。シャーレ１２３に注入する溶液として、たとえばシリコンエラストマー作製キット等を用いることができ、具体的には、シルガード１８４（東レ・ダウコーニング社製）が用いられる。
【００２７】
そして、シャーレ１２３を６０〜７０℃程度のオーブン内で約２〜３時間加熱する。この間、ＰＤＭＳは架橋し、固形状の下層ＰＤＭＳ１２５となる。その後、シリコンモールド１２１の凸部の排出路１０７の端部に対応する位置つまりリザーバ部分に、針１２９が挿入されたチューブ１２７を垂直に挿入する（図５（ｃ））。
【００２８】
続いて、下層ＰＤＭＳ１２５上に上層ＰＤＭＳ１３１を形成する。図５（ｂ）と同様にして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入し（図５（ｄ））、オーブン加熱することにより、下層ＰＤＭＳ１２５と上層ＰＤＭＳ１３１とが一体化し、流入路としてのチューブ１２７が固定されたＰＤＭＳ層１３３を得る（図６（ａ））。
【００２９】
次いで、チューブ１２７内の針１２９を除去し（図６（ｂ））、ＰＤＭＳ層１３３をシャーレ１２３およびシリコンモールド１２１から取り出して、上板１３５を得る（図６（ｃ））。得られた上板１３５と基板１４１とを接着することにより、マイクロ流路を有する接合基板１０１を得る（図６（ｅ））。なお、基板１４１の材料は上板１３５の材料と同じでも異なってもよい。基板１４１の材料の具体例として、シリコン、ガラス、ＰＤＭＳやポリスチレン等の樹脂が挙げられる。
【００３０】
（第三工程）
第三工程では、第二工程で得られた接合基板１０１に、捕捉物質として機能する抗体を固定化する。図７（ａ）〜図７（ｃ）は、抗体の固定化手順を示す図である。図７（ａ）〜図７（ｃ）の各図において、右図は検出部１１０近傍の構成を示す平面図であり、左図は右図の排出路１０７に沿った断面を示す図である。
【００３１】
まず、図７（ａ）に示したように、抗体を含んだリン緩衝溶液（たとえばＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を接合基板１０１の捕捉部１０５に注入する。抗体を含んだＰＢＳを検出部に充填した状態で、接合基板１０１を１０分〜数時間程度放置し、抗体を固相化する（図７（ｂ））。さらに、抗体を含んだＰＢＳを排水しＰＢＳのみを用いて数回洗浄を行う（図７（ｃ））。こうして、基板１４１上に抗体層１３９が形成される。
【００３２】
なお、図７（ｃ）では、抗体が基板１４１上に層状に固定化された構成を例示したが、捕捉部１０５において検出対象物質を実用上支障ない程度に検知できる程度の抗体が捕捉部１０５に固定されていればよく、層をなしていなくてもよい。
【００３３】
以上の手順により、図１に示したチップ１００が得られる。なお、以上の方法では、抗体が捕捉部１０５から排出路１０７にわたって固定化されるが、抗体は捕捉部１０５の少なくとも一部の領域に設けられていればよい。また、抗体は捕捉部１０５の底面に物理的吸着により固定化していてもよいし、化学結合により固定化されていてもよい。
【００３４】
得られたチップ１００は、液体試料中の検出対象成分の有無または量を検出するセンサーとして用いることができる。
チップ１００の捕捉部１０５に捕捉された成分を検知する装置の構成に特に制限はなく、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
【００３５】
また、たとえば細菌数の計測にのみ用いる場合においては、蛍光検出装置を図８に示す構成としてもよい。図８においては、励起用光源からの出射光が、ダイクロイックミラー、鏡および対物レンズを経由してセンサーチップ（チップ１００）の捕捉部１０５に照射される。捕捉部１０５からの出射光は、対物レンズを経由して鏡で反射し、ダイクロイックミラーを通過し、光学フィルターにより不要な光を排除し、結像レンズにより結像され、電荷結合素子（Charge Coupled Device：ＣＣＤ）により検知される。
また、他の例として、表面プラズモン共鳴センサーを検出装置として用いることも可能である。
【００３６】
次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態においては、流入路１０３が基板の法線方向に延在して捕捉部１０５の上部から捕捉部１０５に液体試料が導入されるとともに、捕捉部１０５に導入された試料が、流入路１０３より細い複数の排出路１０７から基板面内方向に排出される構成となっている。このため、以下の作用効果が得られる。
【００３７】
まず、流入路１０３を垂直方向に配置し、検体を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して鉛直方向から流入することで、基板１４１上に固定化された捕捉物質に、試料中の成分を効率よく接触させることができる。このため、捕捉部１０５における捕捉効率を高め、検出効率を向上させることができる。
さらに、捕捉部１０５において、試料の流れの主方向を基板に鉛直な方向から水平な方向へと直角に変える構成となっている。このため、捕捉部１０５における検出対象成分と固定化物質との接触効率が高まり、捕捉率が向上する。
【００３８】
また、流入路１０３を捕捉部１０５の上部に配置した構造とすることにより、基板１４１と上板１３５との圧着後、捕捉物質を流入路１０３より検出部１１０に導入して捕捉部１０５に配置する加工法を容易に行うことが可能となる。また、基板１４１と上板１３５との接着部において、これらの間に捕捉物質の層が介在しないため、接着強度を高めることができる。
【００３９】
また、本実施形態では、流入路１０３より細い複数の排出路１０７が設けられ、これらの排出路１０７が捕捉部１０５の端部から互いに異なる基板面内の複数方向に延びた構成となっている。このため、捕捉部１０５の内部から外部に排出される試料の流量を効果的に増し、処理速度を高めることができる。また、試料を捕捉部１０５の上部から導入する場合にも、排出路１０７の入口付近等に気泡や不純物が付着して排出路１０７が詰まるのを抑制し、捕捉部１０５からの試料の排液を確実に行うことができる。
また、排出路１０７を流入路１０３より細くすることにより、排出路１０７の抵抗をあげ、捕捉部１０５に固定化された抗体付近での試料の流速を遅くして、検出対象成分の捕捉率を向上させることができる。
【００４０】
こうした作用効果は、複数の排出路１０７が放射状に設けられた構成において顕著に発揮される。
ここで、複数の排出路１０７が放射状に設けられているとは、複数の排出路１０７が捕捉部１０５から面内の異なる方向に広がっていることをいう。排出路１０７の平面配置は捕捉部１０５の形状等により決めてよく、たとえば図９（ａ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して線対称な配置であってもよいし、図９（ｂ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して点対称な配置であってもよい。
【００４１】
上記図９（ａ）および図９（ｂ）は、捕捉部１０５および排出路１０７の構成例を示す平面図である。このうち、図９（ａ）は、図１〜図３に示したチップ１００の構成に対応している。図９（ａ）のように、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が連通する構成とすることにより、液体を各辺からより一層効率よく排出することができる。
【００４２】
また、捕捉部１０５の平面形状は、矩形には限られず、たとえば正多角形としてもよい。また、図９（ｂ）に示したように、円形としてもよい。図９（ｂ）では、円形の流入路１０３の外周に排出路１０７が等間隔で配置され、各排出路１０７は捕捉部１０５との接続部において接線に垂直な方向に延びている。
【００４３】
また、背景技術の項で前述した特許文献１に記載のチップでは、複数の流路が基板面に平行に配置されており、各流路の延在方向に対して直交して、生体分子が帯状に固定化されている。このようなチップは、構造上、２枚の基板を貼り合わせて製造することになる。具体的には、下の基板に生体分子を固定化した後、流路が加工された上の基板を接着することになる。このため、プラズマクリーナー等を用いた表面処理を施すことが困難であり、上下基板の接着性が低い場合があった。また、加熱等により接着強度を高めようとすると、固定化された生体分子が変性する懸念があった。また、基板の貼り合わせ以外の方法でチップを製造しようとすると、製造工程が煩雑であった。
【００４４】
これに対し、本実施形態においては、捕捉部から鉛直方向に延びる流入路が設けられたチップ構成のため、接合基板１０１を形成した後、捕捉物質を捕捉部に固定化することが容易な構成となっている。このため、製造安定性に優れたチップを安定的に得ることができる。
【００４５】
本実施形態は、たとえばバクテリア（細菌）、菌類等の微生物の検出に好適に用いられる。微生物の検出に用いたときの利点として、たとえば以下のことが挙げられる。以下においては、バクテリアを検出する場合を例に説明する。
（ｉ）検出感度の向上
イムノクロマト法、酵素固定化免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等に比べて、バクテリアを微小な領域で捕捉することで、捕捉部におけるバクテリアの密度を高め、検出感度を向上させることができる。
（ｉｉ）全量検査が可能
イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法といった他方法では、全試料のうち抽出した試料についてしか検査することができないが、本実施形態のチップ１０１は試料を継続的に流入して検出対象の成分を捕捉する構造のため、試料の全量を用いた検査が可能である。このことにより検査の統計学的信頼性が向上する。
（ｉｉｉ）検出速度の高速化
バクテリアを流路中で捕捉し、直接検出することで、培養法、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法のような時間を要する工程が不要となり、測定全体に要する時間が高速化される。
（ｉｖ）標識試薬および捕捉物質（たとえば、抗体）の消費量の減少
抗体を固定化する領域が微小であるので、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等の方法に比べて、抗体の使用量が少なくてすむ。
さらに、検出対象の成分が微小領域に集中しているので、標識試薬として用いる蛍光試薬も少なくてすむ。
（ｖ）生死菌の判別が可能
捕捉した成分を検知する際に、たとえば市販の蛍光染色試薬を用いて、生死菌の判別が可能となる。生死菌の判別が可能となることにより、たとえば食品衛生検査や抗菌剤の感受性試験等への応用が可能となる。
【００４６】
以下の実施形態においては、第一の実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００４７】
（第二の実施形態）
第一の実施形態においては、ＰＤＭＳをシリコンモールドにより加工して、チップ１００の接合基板１０１を製造する方法を例示したが、樹脂の射出成型による接合基板１０１を製造してもよい。
【００４８】
図１０（ａ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【００４９】
まず、マイクロ流路を配置した金型１５１に樹脂を射出し、基板１５３（図１０（ａ））および上板１５５（図１０（ｂ））を成型する。その後、得られた両板（図１１（ａ））を圧着または接着して、マイクロ流路チップ（接合基板１５７、図１１（ｂ））を得る。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
【００５０】
本実施形態における樹脂の射出成型による加工法は、第一の実施形態に記載の方法に比べて、たとえば量産する際の製造コストを低減する点でさらに効果的である。
【００５１】
（第三の実施形態）
本実施形態は、接合基板１０１のさらに別の製造方法に関する。本実施形態では、フォトリソグラフィー技術を用いて接合基板を得る。
【００５２】
図１２（ａ）〜図１２（ｄ）、図１３（ａ）および図１３（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【００５３】
まず、図１２（ａ）に示したように、基板１６１上にレジスト１６３を成膜し（図１２（ａ））、フォトマスク１６５を用いて（図１２（ｂ））レジスト１６３を選択的に除去する（図１２（ｃ））。こうして所定の形状に加工されたレジスト１６３をマスクとして、基板１６１をエッチング等により加工する（図１２（ｄ））。
【００５４】
また、要求される加工精度や加工形状により、リソグラフィー、切削または射出成型等の加工法を選択し、上板１６９の成型を行う。
【００５５】
そして、基板１６１上の所定の位置に上板１６９を配置して（図１３（ａ））、圧着することにより、接合基板１７１を得る（図１３（ｂ））。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
【００５６】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５７】
たとえば、基板を含むチップの素材として使用可能な材料の例としては、ガラス、石英ガラス、シリコンおよび樹脂が挙げられる。
【００５８】
また、以上の実施形態においては、バクテリアを検出する場合を主に例示したが、検出対象はバクテリアには限られず、ウイルス等の他の微生物としてもよい。また、タンパク質、核酸等の生体高分子や他の生体分子、生体分子に対する親和性を有する化合物等も対象となる。
【００５９】
また、以上の実施形態においては、検出対象を捕捉して基板上に固定化する捕捉物質として、微生物に対する抗体を代表例に挙げたが、検出対象の成分に対して相互作用するものであればこれには限られず、たとえば検出対象の成分に対する特異的相互作用を有する物質が挙げられる。このような物質は、検出対象の成分に応じて適宜選択されるが、たとえば人工抗体（Molecular imprint）が挙げられる。
【００６０】
また、以上の実施形態においては、マイクロ流路チップの加工法として、上記のＰＤＭＳ法、射出成型法およびフォトリソグラフィー法を代表例に挙げたが、これらの加工法には限られず、加工精度や製造コストに応じて適宜選択されるが、たとえばホットエンボス法が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
本実施例では、２つの方法で大腸菌の検出実験を行った。
図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、本実施例における検出方法を説明する斜視図である。
【００６２】
図１４（ｂ）では、第一の実施形態に記載の方法に準じて、マイクロ流路チップを作製した。チップの構成を以下に示す。
基板１４１の材料：ガラス
上板１３５の材料：ＰＤＭＳ
流入路１０３の直径：３００μｍ
捕捉部１０５の大きさ：２ｍｍ
排出路１０７：幅２０μｍ、深さ１０μｍ
捕捉物質：抗体（抗大腸菌抗体；Goat IgG; GeneTex社）
検出対象成分：大腸菌
検出方法：蛍光顕微鏡観察
【００６３】
このマイクロ流路チップの捕捉部に大腸菌を含んだリン酸緩衝液の試料（１０6個／ｍＬ）を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。
【００６４】
また、比較のため、捕捉部を流路の一部に配置したチップを用いて、上記方法に準じて大腸菌の検出を行った。図１４（ａ）は、捕捉部を流路の一部に配置した場合の検出方法を説明する図である。
【００６５】
図１５（ａ）は、図１４（ａ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１５（ａ）より、図１４（ａ）に示したチップを用いた場合、捕捉部に捕捉された大腸菌が少ないことがわかる。
【００６６】
一方、図１５（ｂ）は、図１４（ｂ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１４（ｂ）に示したチップを用いた場合、図１５（ａ）に比べて非常に多くの大腸菌が捕捉されていることが図１５（ｂ）よりわかる。また、図１５（ｂ）より計数された捕捉された大腸菌数は約１５０個であった。
図１４（ｂ）に示したチップを用いることにより、一方向に延在する流路の一部に捕捉部を設けて流路に試料を流す図１４（ａ）の方法に比べて、捕集効率が著しく高まることがわかる。
【００６７】
（実施例２）
本実施例では、図１４（ｂ）に示したチップを用いて、複合蛍光染色法と蛍光観察による大腸菌検出と生死判定を行った。
チップによるバクテリアの捕捉は、実施例１に記載の方法に準じて行った。試料として、大腸菌を含んだリン酸緩衝液（１０7個／ｍＬ）を用いた。また、バクテリアに対する抗体として抗大腸菌抗体、Goat IgGを用いた。本実施例においても、試料を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。
【００６８】
その後、複合蛍光染色法を用いて、特異的に捕捉された大腸菌の生死と個体数を判別した。複合蛍光染色試薬として、LIVE/DEAD BacLight（商標） Bacterial Viability Kits（Invitrogen社製）を用いた。
【００６９】
複合蛍光染色試薬を含む緩衝溶液をチップの捕捉部に導入した。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のよう化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、よう化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した後、バクテリア抗体グレーティング部の蛍光顕微鏡観察を行った。
【００７０】
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）は、観察結果を示す図である。図１６（ａ）は、すべての菌の観察結果を示し、図１６（ｂ）および図１６（ｃ）は、それぞれ、図１６（ａ）の画像解析により生菌および死菌を抽出した結果を示す。
【００７１】
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）より、本実施形態においても、大腸菌を短時間で感度よく検出することができた。また、蛍光固体の色、個数、場所を検出することで、抗体により特異的に捕捉された細菌の個体数、生死を一度に検出することができる。
【００７２】
（実施例３）
本実施例では、大腸菌の抗菌剤感受性試験を行った。具体的には、実施例２で大腸菌を捕捉したチップの捕捉部に、抗菌剤（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）を投与し、捕捉部に捕捉されている大腸菌の生死の経過観察を行った。観察は実施例２に記載の方法に準じて行った。
【００７３】
図１７（ａ）〜図１７（ｃ）は、順に、抗菌剤投与直後、２時間後および４時間後の観察結果を示す図である。図１７（ａ）〜図１７（ｃ）より、抗菌剤を投与してから時間が経過するにつれ、死菌が増加し生菌が減少する過程を直接把握できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】実施形態におけるチップの構成を示す平面図である。
【図２】図１のチップの検出部を拡大して示す平面図である。
【図３】図１のチップの検出部の捕捉部周辺の構成を示す図である。
【図４】実施形態におけるシリコンモールドの製造工程を示す断面図である。
【図５】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図６】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図７】実施形態におけるチップへの抗体の固定化方法を説明する図である。
【図８】実施例における検出装置の構成を示す図である。
【図９】実施形態におけるチップの捕捉部および排出路の構成を示す平面図である。
【図１０】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１１】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１２】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１３】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１４】実施例におけるチップを用いた検出方法を説明する図である。
【図１５】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【図１６】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【図１７】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７５】
１００ チップ
１０１ 接合基板
１０３ 流入路
１０５ 捕捉部
１０７ 排出路
１０９ 接続流路
１１０ 検出部
１１１ 環状流路
１１３ 廃液溜
１１５ シリコンウェーハ
１１７ フォトレジスト
１１９ フォトマスク
１２０ 試料
１２１ シリコンモールド
１２３ シャーレ
１２５ 下層ＰＤＭＳ
１２７ チューブ
１２９ 針
１３１ 上層ＰＤＭＳ
１３３ ＰＤＭＳ層
１３５ 上板
１３７ 抗体液
１３９ 抗体層
１４１ 基板
１５１ 金型
１５３ 基板
１５５ 上板
１５７ 接合基板
１６１ 基板
１６３ レジスト
１６５ フォトマスク
１６９ 上板
１７１ 接合基板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チップに関し、特に、微生物を検出するチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体チップに関する技術として、特許文献１に記載のものがある。同文献に記載のマイクロ流体チップにおいては、マイクロチャンネル底面に１０種類の生体分子（抗体）がチャンネル延在方向に沿って固定化された構成が示されている。
【特許文献１】特開２００７−１０１２２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところが、上記特許文献１に記載のチップを用いて試料中の成分を検出しようとすると、以下の点で改善の余地があった。
まず、特許文献１のチップにおいては、基板面に水平な一方向に延在する流路中を試料が流れ、試料中の成分を流路の底部に固定化されている抗体により捕捉する構造となっている。このため、試料中の成分の抗体への衝突確率が低いことがあった。これにより、検出対象の成分が抗体に接触せずおよび捕捉されずに検出部を素通りしてしまい、捕捉効率が充分でない場合があった。
【０００４】
また、上記捕捉効率を高めるために、試料の流速を低下させると、時間あたりの流量が低下することになるため、試料の処理速度が遅くなってしまう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、
基板に、試料中の成分を検出する検出部が設けられたチップであって、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップが提供される。
【０００６】
本発明においては、試料が導入される流入路が捕捉部から上方に向かって配置されている。このため、検出対象の成分を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して検出部の上方から下向きに流れ込むことにより、捕捉部への成分の衝突確率を高めることができる。
また、流入路を捕捉部から上方に向かって配置するとともに、排出路を基板面方向に延在させた構成となっているため、試料が捕捉部の上方からチップに流入した試料が、捕捉部にて試料の流向を基板面方向に変更することになる。このため、試料中の成分と捕捉物質の接触率を高めることができるため、捕捉物質による成分の捕捉率を向上することができる。
【０００７】
また、試料が捕捉部の上方から捕捉部に向かって流れ込む構成においては、捕捉部に導入された試料を効率よく捕捉部外に排出することが、試料の処理速度の向上の観点で重要となる。そこで、本発明においては、導入より幅狭の複数の排水路を基板面の異なる方向に配置している。これにより、流出路の抵抗を相対的に高め、捕捉部付近での試料の流速を相対的に遅くすることができる。よって、検体の捕捉率を向上することができる。また、複数の排出路により試料の排出流量を大きくすることができるため、処理速度を高めることができる。
【０００８】
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。
【０００９】
たとえば、本発明によれば、前記本発明におけるチップを用いた検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように本発明によれば、試料中の成分を簡便で迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には共通の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１２】
（第一の実施形態）
図１は、本実施形態のチップの構成を示す平面図である。図２は、図１のチップ１００の検出部１１０を拡大して示す平面図である。図３（ａ）は、図１のチップ１００の検出部１１０の捕捉部周辺の構成を示す平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。
【００１３】
図１〜３に示したチップ１００は、基板（接合基板１０１の基板１４１）に、試料中の成分を検出する検出部１１０が設けられたチップである。
本実施形態において、接合基板１０１は、基板１４１（図３（ｂ））上に上板１３５（図７）を接合したものである。また、図１においては、１つの接合基板１０１に複数の検出部１１０が一列に配置されている。
検出部１１０は、捕捉部１０５、流入路１０３、および複数の排出路１０７を含む。
【００１４】
捕捉部１０５は、接合基板１０１中の基板１４１に設けられ、検出対象の成分（検体）を捕捉する。捕捉部１０５は液溜状に形成されており、液溜の底部に、検出対象の成分を捕捉する捕捉物質が固定化されている。検出対象成分はたとえば微生物であり、このとき捕捉物質としてたとえば当該微生物に対する親和性を有する抗体が用いられる。
図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状が矩形である。捕捉部１０５の大きさは、たとえば矩形の縦、横を１０〜５０００μｍ、高さを１０〜１０００μｍとする。
【００１５】
流入路１０３は、捕捉部１０５から上方（鉛直上方）に向かって設けられている。流入路１０３から検出部１１０に試料が導入される。図３において、流入路１０３の直径は、たとえば１０〜３０００μｍとする。
【００１６】
複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内の異なる方向に互いに延在している。複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内に放射状に延びている。図１に示したチップ１００では、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が設けられている。同じ辺に設けられた排出路１０７は、当該辺に直交して互いに平行に延びている。また、同じ辺に設けられた排出路１０７は等間隔で設けられている。
【００１７】
また、排出路１０７は流入路１０３より幅狭に設けられている。排出路１０７は、たとえば流路幅１〜５００μｍ程度、流路高（深さ）１〜５００μｍ程度に形成される。捕捉部１０５に導入された試料は排出路１０７から捕捉部外部に排出される。排出路１０７は、基板１４１と上板１３５との間に形成されている。
【００１８】
また、検出部１１０は、接続流路１０９、環状流路１１１および廃液溜１１３をさらに含む。
環状流路１１１は、捕捉部１０５の外側に捕捉部１０５の周囲を取り囲んで設けられた環状の流路である。図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状に対応して、環状流路１１１も矩形の環状となっている。環状流路１１１は、たとえば基板１４１と上板１３５との間隙として形成される。
排出路１０７は、一端で捕捉部１０５に連通し、他端で環状流路１１１に連通している。
【００１９】
また、環状流路１１１は、接続流路１０９を介して廃液溜１１３に連通している。流入路１０３から検出部１１０に導入された液体は、捕捉部１０５、排出路１０７、環状流路１１１および接続流路１０９をこの順に経由して廃液溜１１３に排出される。
【００２０】
次に、図４〜図７を参照して、図１に示したチップの製造方法を説明する。本実施形態では、上板１３５としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコンエラストマーを用い、ＰＤＭＳ加工用のモールド材料として、シリコンモールドを用いる方法を例示する。
【００２１】
この方法は、以下の工程を含む。
第一工程：マイクロ流路チップ用シリコンモールドの作成
第二工程：ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）の作成
第三工程：抗体の固相化
以下、各工程を順に説明する。
【００２２】
（第一工程）
第一工程では、光リソグラフィー技術を用いて、上板１３５を形成するためのモールドを準備する。モールドは、シリコンウェーハ上にフォトレジストをパターニングすることにより形成される。また、レジスト材をそのまま流路用モールドとして使用する場合と、耐久性を向上させるため、その後エッチングの工程を行いシリコンそのものに加工を施しモールドとする場合がある。
【００２３】
図４（ａ）〜図４（ｄ）は、シリコンモールドの製造工程を示す断面図である。
まず、図４（ａ）に示したように、シリコンウェーハ１１５上に、スピンコート法によりフォトレジスト１１７を塗布する。フォトレジスト１１７の材料は上板１３５の材料等に応じて選択されるが、たとえばＳＵ−８（SU-8 2000 MicroChem社製）等を用いる。
【００２４】
次に、コンタクトリソグラフィーを用いて、フォトレジスト１１７上にマイクロ流路のパターンを描画したフォトマスク１１９を配置し、チップ１００のマイクロ流路デザインをフォトレジスト１１７に露光・転写する（図４（ｂ））。そして、現像により、シリコンウェーハ１１５上の所定の位置に選択的にフォトレジスト１１７を残す（図４（ｃ））。そして、フォトレジストが残ったままのシリコン基板をモールドとして用いる。ただし、フォトレジストは強度的に脆弱な場合があるため、強度が必用な場合は、その後、フォトレジスト１１７をマスクとしてシリコンウェーハ１１５をエッチングし、シリコンモールド１２１を得てもよい（図４（ｄ））。
【００２５】
（第二工程）
第二工程では、第一工程で得られたシリコンモールド１２１を用いて上板１３５を作製し、ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）を作製する。
【００２６】
図５（ａ）〜図５（ｄ）および図６（ａ）〜図６（ｅ）は、接合基板１０１の作成手順を示す断面図である。
まず、第一工程で準備したシリコンモールド１２１を、シャーレ１２３等の所定の容器内に接着し、固定する（図５（ａ））。そして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入する（図５（ｂ））。シャーレ１２３に注入する溶液として、たとえばシリコンエラストマー作製キット等を用いることができ、具体的には、シルガード１８４（東レ・ダウコーニング社製）が用いられる。
【００２７】
そして、シャーレ１２３を６０〜７０℃程度のオーブン内で約２〜３時間加熱する。この間、ＰＤＭＳは架橋し、固形状の下層ＰＤＭＳ１２５となる。その後、シリコンモールド１２１の凸部の排出路１０７の端部に対応する位置つまりリザーバ部分に、針１２９が挿入されたチューブ１２７を垂直に挿入する（図５（ｃ））。
【００２８】
続いて、下層ＰＤＭＳ１２５上に上層ＰＤＭＳ１３１を形成する。図５（ｂ）と同様にして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入し（図５（ｄ））、オーブン加熱することにより、下層ＰＤＭＳ１２５と上層ＰＤＭＳ１３１とが一体化し、流入路としてのチューブ１２７が固定されたＰＤＭＳ層１３３を得る（図６（ａ））。
【００２９】
次いで、チューブ１２７内の針１２９を除去し（図６（ｂ））、ＰＤＭＳ層１３３をシャーレ１２３およびシリコンモールド１２１から取り出して、上板１３５を得る（図６（ｃ））。得られた上板１３５と基板１４１とを接着することにより、マイクロ流路を有する接合基板１０１を得る（図６（ｅ））。なお、基板１４１の材料は上板１３５の材料と同じでも異なってもよい。基板１４１の材料の具体例として、シリコン、ガラス、ＰＤＭＳやポリスチレン等の樹脂が挙げられる。
【００３０】
（第三工程）
第三工程では、第二工程で得られた接合基板１０１に、捕捉物質として機能する抗体を固定化する。図７（ａ）〜図７（ｃ）は、抗体の固定化手順を示す図である。図７（ａ）〜図７（ｃ）の各図において、右図は検出部１１０近傍の構成を示す平面図であり、左図は右図の排出路１０７に沿った断面を示す図である。
【００３１】
まず、図７（ａ）に示したように、抗体を含んだリン緩衝溶液（たとえばＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を接合基板１０１の捕捉部１０５に注入する。抗体を含んだＰＢＳを検出部に充填した状態で、接合基板１０１を１０分〜数時間程度放置し、抗体を固相化する（図７（ｂ））。さらに、抗体を含んだＰＢＳを排水しＰＢＳのみを用いて数回洗浄を行う（図７（ｃ））。こうして、基板１４１上に抗体層１３９が形成される。
【００３２】
なお、図７（ｃ）では、抗体が基板１４１上に層状に固定化された構成を例示したが、捕捉部１０５において検出対象物質を実用上支障ない程度に検知できる程度の抗体が捕捉部１０５に固定されていればよく、層をなしていなくてもよい。
【００３３】
以上の手順により、図１に示したチップ１００が得られる。なお、以上の方法では、抗体が捕捉部１０５から排出路１０７にわたって固定化されるが、抗体は捕捉部１０５の少なくとも一部の領域に設けられていればよい。また、抗体は捕捉部１０５の底面に物理的吸着により固定化していてもよいし、化学結合により固定化されていてもよい。
【００３４】
得られたチップ１００は、液体試料中の検出対象成分の有無または量を検出するセンサーとして用いることができる。
チップ１００の捕捉部１０５に捕捉された成分を検知する装置の構成に特に制限はなく、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
【００３５】
また、たとえば細菌数の計測にのみ用いる場合においては、蛍光検出装置を図８に示す構成としてもよい。図８においては、励起用光源からの出射光が、ダイクロイックミラー、鏡および対物レンズを経由してセンサーチップ（チップ１００）の捕捉部１０５に照射される。捕捉部１０５からの出射光は、対物レンズを経由して鏡で反射し、ダイクロイックミラーを通過し、光学フィルターにより不要な光を排除し、結像レンズにより結像され、電荷結合素子（Charge Coupled Device：ＣＣＤ）により検知される。
また、他の例として、表面プラズモン共鳴センサーを検出装置として用いることも可能である。
【００３６】
次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態においては、流入路１０３が基板の法線方向に延在して捕捉部１０５の上部から捕捉部１０５に液体試料が導入されるとともに、捕捉部１０５に導入された試料が、流入路１０３より細い複数の排出路１０７から基板面内方向に排出される構成となっている。このため、以下の作用効果が得られる。
【００３７】
まず、流入路１０３を垂直方向に配置し、検体を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して鉛直方向から流入することで、基板１４１上に固定化された捕捉物質に、試料中の成分を効率よく接触させることができる。このため、捕捉部１０５における捕捉効率を高め、検出効率を向上させることができる。
さらに、捕捉部１０５において、試料の流れの主方向を基板に鉛直な方向から水平な方向へと直角に変える構成となっている。このため、捕捉部１０５における検出対象成分と固定化物質との接触効率が高まり、捕捉率が向上する。
【００３８】
また、流入路１０３を捕捉部１０５の上部に配置した構造とすることにより、基板１４１と上板１３５との圧着後、捕捉物質を流入路１０３より検出部１１０に導入して捕捉部１０５に配置する加工法を容易に行うことが可能となる。また、基板１４１と上板１３５との接着部において、これらの間に捕捉物質の層が介在しないため、接着強度を高めることができる。
【００３９】
また、本実施形態では、流入路１０３より細い複数の排出路１０７が設けられ、これらの排出路１０７が捕捉部１０５の端部から互いに異なる基板面内の複数方向に延びた構成となっている。このため、捕捉部１０５の内部から外部に排出される試料の流量を効果的に増し、処理速度を高めることができる。また、試料を捕捉部１０５の上部から導入する場合にも、排出路１０７の入口付近等に気泡や不純物が付着して排出路１０７が詰まるのを抑制し、捕捉部１０５からの試料の排液を確実に行うことができる。
また、排出路１０７を流入路１０３より細くすることにより、排出路１０７の抵抗をあげ、捕捉部１０５に固定化された抗体付近での試料の流速を遅くして、検出対象成分の捕捉率を向上させることができる。
【００４０】
こうした作用効果は、複数の排出路１０７が放射状に設けられた構成において顕著に発揮される。
ここで、複数の排出路１０７が放射状に設けられているとは、複数の排出路１０７が捕捉部１０５から面内の異なる方向に広がっていることをいう。排出路１０７の平面配置は捕捉部１０５の形状等により決めてよく、たとえば図９（ａ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して線対称な配置であってもよいし、図９（ｂ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して点対称な配置であってもよい。
【００４１】
上記図９（ａ）および図９（ｂ）は、捕捉部１０５および排出路１０７の構成例を示す平面図である。このうち、図９（ａ）は、図１〜図３に示したチップ１００の構成に対応している。図９（ａ）のように、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が連通する構成とすることにより、液体を各辺からより一層効率よく排出することができる。
【００４２】
また、捕捉部１０５の平面形状は、矩形には限られず、たとえば正多角形としてもよい。また、図９（ｂ）に示したように、円形としてもよい。図９（ｂ）では、円形の流入路１０３の外周に排出路１０７が等間隔で配置され、各排出路１０７は捕捉部１０５との接続部において接線に垂直な方向に延びている。
【００４３】
また、背景技術の項で前述した特許文献１に記載のチップでは、複数の流路が基板面に平行に配置されており、各流路の延在方向に対して直交して、生体分子が帯状に固定化されている。このようなチップは、構造上、２枚の基板を貼り合わせて製造することになる。具体的には、下の基板に生体分子を固定化した後、流路が加工された上の基板を接着することになる。このため、プラズマクリーナー等を用いた表面処理を施すことが困難であり、上下基板の接着性が低い場合があった。また、加熱等により接着強度を高めようとすると、固定化された生体分子が変性する懸念があった。また、基板の貼り合わせ以外の方法でチップを製造しようとすると、製造工程が煩雑であった。
【００４４】
これに対し、本実施形態においては、捕捉部から鉛直方向に延びる流入路が設けられたチップ構成のため、接合基板１０１を形成した後、捕捉物質を捕捉部に固定化することが容易な構成となっている。このため、製造安定性に優れたチップを安定的に得ることができる。
【００４５】
本実施形態は、たとえばバクテリア（細菌）、菌類等の微生物の検出に好適に用いられる。微生物の検出に用いたときの利点として、たとえば以下のことが挙げられる。以下においては、バクテリアを検出する場合を例に説明する。
（ｉ）検出感度の向上
イムノクロマト法、酵素固定化免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等に比べて、バクテリアを微小な領域で捕捉することで、捕捉部におけるバクテリアの密度を高め、検出感度を向上させることができる。
（ｉｉ）全量検査が可能
イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法といった他方法では、全試料のうち抽出した試料についてしか検査することができないが、本実施形態のチップ１０１は試料を継続的に流入して検出対象の成分を捕捉する構造のため、試料の全量を用いた検査が可能である。このことにより検査の統計学的信頼性が向上する。
（ｉｉｉ）検出速度の高速化
バクテリアを流路中で捕捉し、直接検出することで、培養法、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法のような時間を要する工程が不要となり、測定全体に要する時間が高速化される。
（ｉｖ）標識試薬および捕捉物質（たとえば、抗体）の消費量の減少
抗体を固定化する領域が微小であるので、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等の方法に比べて、抗体の使用量が少なくてすむ。
さらに、検出対象の成分が微小領域に集中しているので、標識試薬として用いる蛍光試薬も少なくてすむ。
（ｖ）生死菌の判別が可能
捕捉した成分を検知する際に、たとえば市販の蛍光染色試薬を用いて、生死菌の判別が可能となる。生死菌の判別が可能となることにより、たとえば食品衛生検査や抗菌剤の感受性試験等への応用が可能となる。
【００４６】
以下の実施形態においては、第一の実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００４７】
（第二の実施形態）
第一の実施形態においては、ＰＤＭＳをシリコンモールドにより加工して、チップ１００の接合基板１０１を製造する方法を例示したが、樹脂の射出成型による接合基板１０１を製造してもよい。
【００４８】
図１０（ａ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【００４９】
まず、マイクロ流路を配置した金型１５１に樹脂を射出し、基板１５３（図１０（ａ））および上板１５５（図１０（ｂ））を成型する。その後、得られた両板（図１１（ａ））を圧着または接着して、マイクロ流路チップ（接合基板１５７、図１１（ｂ））を得る。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
【００５０】
本実施形態における樹脂の射出成型による加工法は、第一の実施形態に記載の方法に比べて、たとえば量産する際の製造コストを低減する点でさらに効果的である。
【００５１】
（第三の実施形態）
本実施形態は、接合基板１０１のさらに別の製造方法に関する。本実施形態では、フォトリソグラフィー技術を用いて接合基板を得る。
【００５２】
図１２（ａ）〜図１２（ｄ）、図１３（ａ）および図１３（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【００５３】
まず、図１２（ａ）に示したように、基板１６１上にレジスト１６３を成膜し（図１２（ａ））、フォトマスク１６５を用いて（図１２（ｂ））レジスト１６３を選択的に除去する（図１２（ｃ））。こうして所定の形状に加工されたレジスト１６３をマスクとして、基板１６１をエッチング等により加工する（図１２（ｄ））。
【００５４】
また、要求される加工精度や加工形状により、リソグラフィー、切削または射出成型等の加工法を選択し、上板１６９の成型を行う。
【００５５】
そして、基板１６１上の所定の位置に上板１６９を配置して（図１３（ａ））、圧着することにより、接合基板１７１を得る（図１３（ｂ））。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
【００５６】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５７】
たとえば、基板を含むチップの素材として使用可能な材料の例としては、ガラス、石英ガラス、シリコンおよび樹脂が挙げられる。
【００５８】
また、以上の実施形態においては、バクテリアを検出する場合を主に例示したが、検出対象はバクテリアには限られず、ウイルス等の他の微生物としてもよい。また、タンパク質、核酸等の生体高分子や他の生体分子、生体分子に対する親和性を有する化合物等も対象となる。
【００５９】
また、以上の実施形態においては、検出対象を捕捉して基板上に固定化する捕捉物質として、微生物に対する抗体を代表例に挙げたが、検出対象の成分に対して相互作用するものであればこれには限られず、たとえば検出対象の成分に対する特異的相互作用を有する物質が挙げられる。このような物質は、検出対象の成分に応じて適宜選択されるが、たとえば人工抗体（Molecular imprint）が挙げられる。
【００６０】
また、以上の実施形態においては、マイクロ流路チップの加工法として、上記のＰＤＭＳ法、射出成型法およびフォトリソグラフィー法を代表例に挙げたが、これらの加工法には限られず、加工精度や製造コストに応じて適宜選択されるが、たとえばホットエンボス法が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
本実施例では、２つの方法で大腸菌の検出実験を行った。
図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、本実施例における検出方法を説明する斜視図である。
【００６２】
図１４（ｂ）では、第一の実施形態に記載の方法に準じて、マイクロ流路チップを作製した。チップの構成を以下に示す。
基板１４１の材料：ガラス
上板１３５の材料：ＰＤＭＳ
流入路１０３の直径：３００μｍ
捕捉部１０５の大きさ：２ｍｍ
排出路１０７：幅２０μｍ、深さ１０μｍ
捕捉物質：抗体（抗大腸菌抗体；Goat IgG; GeneTex社）
検出対象成分：大腸菌
検出方法：蛍光顕微鏡観察
【００６３】
このマイクロ流路チップの捕捉部に大腸菌を含んだリン酸緩衝液の試料（１０6個／ｍＬ）を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。
【００６４】
また、比較のため、捕捉部を流路の一部に配置したチップを用いて、上記方法に準じて大腸菌の検出を行った。図１４（ａ）は、捕捉部を流路の一部に配置した場合の検出方法を説明する図である。
【００６５】
図１５（ａ）は、図１４（ａ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１５（ａ）より、図１４（ａ）に示したチップを用いた場合、捕捉部に捕捉された大腸菌が少ないことがわかる。
【００６６】
一方、図１５（ｂ）は、図１４（ｂ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１４（ｂ）に示したチップを用いた場合、図１５（ａ）に比べて非常に多くの大腸菌が捕捉されていることが図１５（ｂ）よりわかる。また、図１５（ｂ）より計数された捕捉された大腸菌数は約１５０個であった。
図１４（ｂ）に示したチップを用いることにより、一方向に延在する流路の一部に捕捉部を設けて流路に試料を流す図１４（ａ）の方法に比べて、捕集効率が著しく高まることがわかる。
【００６７】
（実施例２）
本実施例では、図１４（ｂ）に示したチップを用いて、複合蛍光染色法と蛍光観察による大腸菌検出と生死判定を行った。
チップによるバクテリアの捕捉は、実施例１に記載の方法に準じて行った。試料として、大腸菌を含んだリン酸緩衝液（１０7個／ｍＬ）を用いた。また、バクテリアに対する抗体として抗大腸菌抗体、Goat IgGを用いた。本実施例においても、試料を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。
【００６８】
その後、複合蛍光染色法を用いて、特異的に捕捉された大腸菌の生死と個体数を判別した。複合蛍光染色試薬として、LIVE/DEAD BacLight（商標） Bacterial Viability Kits（Invitrogen社製）を用いた。
【００６９】
複合蛍光染色試薬を含む緩衝溶液をチップの捕捉部に導入した。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のよう化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、よう化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した後、バクテリア抗体グレーティング部の蛍光顕微鏡観察を行った。
【００７０】
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）は、観察結果を示す図である。図１６（ａ）は、すべての菌の観察結果を示し、図１６（ｂ）および図１６（ｃ）は、それぞれ、図１６（ａ）の画像解析により生菌および死菌を抽出した結果を示す。
【００７１】
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）より、本実施形態においても、大腸菌を短時間で感度よく検出することができた。また、蛍光固体の色、個数、場所を検出することで、抗体により特異的に捕捉された細菌の個体数、生死を一度に検出することができる。
【００７２】
（実施例３）
本実施例では、大腸菌の抗菌剤感受性試験を行った。具体的には、実施例２で大腸菌を捕捉したチップの捕捉部に、抗菌剤（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）を投与し、捕捉部に捕捉されている大腸菌の生死の経過観察を行った。観察は実施例２に記載の方法に準じて行った。
【００７３】
図１７（ａ）〜図１７（ｃ）は、順に、抗菌剤投与直後、２時間後および４時間後の観察結果を示す図である。図１７（ａ）〜図１７（ｃ）より、抗菌剤を投与してから時間が経過するにつれ、死菌が増加し生菌が減少する過程を直接把握できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】実施形態におけるチップの構成を示す平面図である。
【図２】図１のチップの検出部を拡大して示す平面図である。
【図３】図１のチップの検出部の捕捉部周辺の構成を示す図である。
【図４】実施形態におけるシリコンモールドの製造工程を示す断面図である。
【図５】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図６】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図７】実施形態におけるチップへの抗体の固定化方法を説明する図である。
【図８】実施例における検出装置の構成を示す図である。
【図９】実施形態におけるチップの捕捉部および排出路の構成を示す平面図である。
【図１０】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１１】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１２】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１３】実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。
【図１４】実施例におけるチップを用いた検出方法を説明する図である。
【図１５】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【図１６】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【図１７】実施例におけるチップの捕捉部の観察結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７５】
１００ チップ
１０１ 接合基板
１０３ 流入路
１０５ 捕捉部
１０７ 排出路
１０９ 接続流路
１１０ 検出部
１１１ 環状流路
１１３ 廃液溜
１１５ シリコンウェーハ
１１７ フォトレジスト
１１９ フォトマスク
１２０ 試料
１２１ シリコンモールド
１２３ シャーレ
１２５ 下層ＰＤＭＳ
１２７ チューブ
１２９ 針
１３１ 上層ＰＤＭＳ
１３３ ＰＤＭＳ層
１３５ 上板
１３７ 抗体液
１３９ 抗体層
１４１ 基板
１５１ 金型
１５３ 基板
１５５ 上板
１５７ 接合基板
１６１ 基板
１６３ レジスト
１６５ フォトマスク
１６９ 上板
１７１ 接合基板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に、試料中の成分を検出する検出部が設けられたチップであって、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップ。
【請求項２】
請求項１に記載のチップにおいて、
前記複数の排出路が、前記捕捉部から前記基板面内に放射線状に延びている、チップ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のチップにおいて、
前記捕捉部の平面形状が矩形であって、
前記矩形の各辺から、複数の前記排出路が辺に直行して延びる、チップ。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載のチップにおいて、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記捕捉部の外周を取り囲む環状流路と、
前記環状流路に連通する廃液溜と、
をさらに含み、
前記複数の排出路が、前記環状流路に連通する、チップ。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載のチップにおいて、一つの前記基板に前記検出部が複数設けられた、チップ。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のチップにおいて、前記成分が微生物であって、前記捕捉物質が前記微生物に対する抗体である、チップ。
【請求項１】
基板に、試料中の成分を検出する検出部が設けられたチップであって、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップ。
【請求項２】
請求項１に記載のチップにおいて、
前記複数の排出路が、前記捕捉部から前記基板面内に放射線状に延びている、チップ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のチップにおいて、
前記捕捉部の平面形状が矩形であって、
前記矩形の各辺から、複数の前記排出路が辺に直行して延びる、チップ。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載のチップにおいて、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記捕捉部の外周を取り囲む環状流路と、
前記環状流路に連通する廃液溜と、
をさらに含み、
前記複数の排出路が、前記環状流路に連通する、チップ。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載のチップにおいて、一つの前記基板に前記検出部が複数設けられた、チップ。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のチップにおいて、前記成分が微生物であって、前記捕捉物質が前記微生物に対する抗体である、チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−２１０３９２（Ｐ２００９−２１０３９２Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２０９（Ｐ２００８−５３２０９）
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（５０６０２７９４１）株式会社ＥＳＰＩＮＥＸ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（５０６０２７９４１）株式会社ＥＳＰＩＮＥＸ (6)
【Ｆターム（参考）】
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