デンプン合成酵素類
【課題】植物デンプンを合成する酵素系を遺伝子工学的に改造した酵素系によりデンプン特性の異なる新規なデンプンを製造する方法を提供する。
【解決手段】デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入し元の野生型よりも該酵素を過剰に発現させる方法及び当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体製造する方法、そしてそれによって得られるデンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体。イネのイソアミラーゼのプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子の上流にプロモーターを配置してなる遺伝子を植物に導入して、デンプンの製造の際のイソアミラーゼの発現がイネと同様に制御されたデンプンを製造する方法。
【解決手段】デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入し元の野生型よりも該酵素を過剰に発現させる方法及び当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体製造する方法、そしてそれによって得られるデンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体。イネのイソアミラーゼのプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子の上流にプロモーターを配置してなる遺伝子を植物に導入して、デンプンの製造の際のイソアミラーゼの発現がイネと同様に制御されたデンプンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物デンプンを改変する方法、植物デンプンを合成する酵素系を遺伝子工学的に改造した酵素系によりデンプン特性の異なる新規なデンプンを製造する方法に関する。
【０００２】
本発明は、植物のデンプンを合成する酵素群である、デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））、デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））、及びデンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））の遺伝子工学的な改変によるデンプン特性の異なる新規なデンプンを製造する方法、そのための酵素類、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００３】
詳細には、本発明は、デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））のサブタイプのひとつであるスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。本発明者らは、イネの種類に応じたデンプンの構造や物性の相違がイネのデンプン合成構成酵素のひとつであるスターチシンターゼＩＩａに起因していることを解明し、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造を解明したことによるものである。より詳細には、本発明は、ジャポニカの例として日本晴（品種名）を、そしてインディカの例としてカサラス（品種名）を用いて、その各々のスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造を比較することにより、その構造上の相違とデンプンの構造や物性の相違との相関関係を明らかにし、この関連性を利用してイネが産生するデンプンの構造や物性を改変させる方法、そのための遺伝子が改変されたイネ、またイネのスターチシンターゼＩＩａに特異的な塩基配列を有する遺伝子断片を用いてイネの種類を検出又は同定する方法を提供するものである。
【０００４】
また、本発明は、デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））に関する。生体においては、通常は代謝反応ネットワークにおけるある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例である。本発明者らは、生体において特定の酵素が過剰に発現する系を見出した。即ち、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素（ＳＢＥ）の１種を過剰に発現させる方法、当該酵素の発現量がもとの野生型とは異なる変異体、及びその製造方法に関する。本発明は、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法、その方法で製造された形質の異なるデンプン、及び当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。
【０００５】
さらに、本発明はデンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））のプロモーターに関する。本発明は、デンプンのアミロペクチンの生合成の重要な役割を果たしているイソアミラーゼの遺伝子を発現させるための新規なプロモーターを提供するものである。より詳細には、本発明は、イソアミラーゼ発現用のイネ由来の新規なプロモーターに関する。また、本発明は、これらのプロモーターを含有するベクター、形質転換体、及びイソアミラーゼの発現方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
米は穀物植物として全世界で広く栽培され、世界の人口の約１／３は米食によっている。米は栽培される地域により物理化学的な特性が異なっていることはよく知られている。そして、米の味覚は米のデンプンの質に大きく依存しており、各地域によりその地域に応じた米の種類が選択されてきた。
【０００７】
米の栽培品種としては、オリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）とグラベリマステウド（ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ Ｓｔｅｕｄ）の２種類がある。前者はアジアで栽培され熱帯、亜熱帯及び温帯地域に広く分布しているが、後者は西アフリカ地域に極限されている。
【０００８】
雑種の花粉の不捻における遺伝学的分析に基づいて、加藤らはオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）をジャポニカ（ｊａｐｏｎｉｃａ）とインディカ（ｉｎｄｉｃａ）に分類した（Ｓ．Ｋａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐ．Ｂｕｌ．Ｆａｋ．Ｔｅｒｋｕｌｔ，Ｋｙｕｓｈｕ Ｉｒａｐｅｒ．Ｕｎｉｖ．１９２８，３，１３２−１４７．）。また、森永（Ｔ．Ｍｏｒｉｎａｇａ．，Ｉｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｒｉｃｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ａ ｓｅｐａｒａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．）１９５４，４，１−１４．）及びチャング（Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １９７６，２５，４２５−４４１．）は、インディカ（ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ（ｊａｐｏｎｉｃａ）及びジャバニカ（ｊａｖａｎｉｃａ）の３種に分類することを提唱した。
【０００９】
このようにオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（以下、イネという。）の分類については種々の意見が提案され、遺伝学的な分析やイネの種子に含まれているデンプンや脂質の違いなどに基づくイネの分類が報告されてきている。本明細書においては、エステラーゼのアイソザイムの分析、並びに生理学的及び生化学的特性からイネをインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）及び中国インディカ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｄｉｃａ）、並びに、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）及び熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）の４種に分類することにする。
【００１０】
イネの味覚は主としてそのデンプンによるものであり、ジャポニカのねっとりとした味覚や、インディカのパサパサとした味覚は、それらのデンプンの質の相違によるものであることがわかってきている。また、デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
【００１１】
そもそもデンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、これは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
【００１２】
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、植物の種類や品種によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの微細な化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
【００１３】
デンプンは主としてアミロース（Ａｍｙｌｏｓｅ）とアミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）からできているものであり、これらによって植物のデンプン粒が形成さているが、デンプン粒の形成にはアミロースは必須ではないとされている。
【００１４】
アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がり、少量のα−１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０−８０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα−１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。アミロペクチンのこの特徴的な構造は”クラスター”構造と呼ばれている。
【００１５】
また、動物やバクテリアの貯蔵エネルギーであるグリコーゲン（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）もデンプンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、アミロペクチンのようなクラスター構造は持っておらず、グリコーゲンは”ｔｒｅｅ ｌｉｋｅ”や”ｂｕｓｈ ｌｉｋｅ”構造と呼ばれる不規則な枝分かれ構造であると報告されている。
【００１６】
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
【００１７】
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα−１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
【００１８】
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類や品種によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカと、パサパサとしたデンプンを有するインディカのアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
【００１９】
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。アミロペクチンは次の４つのクラスの酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））
である。
【００２０】
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。デンプン合成酵素（以下、ＳＳと略す。）は、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα−１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、デンプン枝作り酵素（以下、ＳＢＥと略す）は、アミロペクチンのα−１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
【００２１】
図４にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの合成過程をまとめた。図４の左側のグリコーゲンの合成は主として動物や細菌類の場合であり、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。図４の中側は、高等植物の場合のアミロペクチンの合成過程を示すものであり、図中のＳＳＳは水溶性ＳＳのことである。図４の右側は高等植物におけるアミロースの合成過程を示すものであり、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素Ｉ（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅＩ（ＧＢＳＳＩ））のことである。
【００２２】
このように、高等植物においては、前記した４種類の酵素群により植物の種類に応じたアミロペクチンを産生している。そして、植物の種類によるアミロペクチンの構造の相違は、これらの酵素の種類の違いによるところが大きいと考えられる。
【００２３】
デンプン合成酵素（ＳＳ）には、図４に示されるように３種類のサブタイプが知られており、それぞれスターチシンターゼＩ（ＳＳＩと略す。）、スターチシンターゼＩＩ（ＳＳＩＩと略す。）、及びスターチシンターゼＩＩＩ（ＳＳＩＩＩと略す。）と呼ばれている。ＳＳＩＩａはスターチシンターゼＩＩ（ＳＳＩＩ）のさらにサブタイプである。
【００２４】
一般にイネの胚乳における各スターチシンターゼのサブタイプの含有率は、全スターチシンターゼの約７０％がＳＳＩであり、約２５％がＳＳＩＩＩであり、残りの約５％がそれ以外のＳＳ（ＳＳＩＩａを含む）であるとされており、アミロペクチンのα−１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳＩＩＩにより形成されるものであると考えられていた。
【００２５】
ＳＳはアミロペクチンの鎖を伸ばす酵素であり、アミロペクチンにおけるα−１，４−グルコシド鎖のα−１，４−グルコースの数（以下、ＤＰと略す。）と深く係わっていると考えられている。本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告（Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓａｔｏｈ，Ｋ．Ｔｅｒａｓｈｉｍａ．，Ｓｔａｒｃｈ，１９９９，５１，５８−６２．；Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｉｎａｂａ，Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｗａ，Ｔ．Ｎａｇａｍｉｎｅ．，Ｓｔａｒｃｈ ２００２，５４，１１７−１３１；Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙａｎｏ，Ａ．Ｓｈｏｍｕｒａ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００２，１０４，１−８）してきており、α−１，４−グルコースの数（ＤＰ）がＳＳの活性と関係していると考えられているが、その詳細は不明であった。
【００２６】
また、デンプン枝作り酵素（ＳＢＥ）は、デンプンやグリコーゲンのα−１，６グリコシル結合を作成する唯一の酵素で、本酵素の働きによってグルコース分子を無数に結合した巨大分子、即ちデンプンの主成分であるアミロペクチンやグリコーゲンが形成される。一方、植物細胞で合成されるアミロペクチンと動物やバクテリアで生産されるグリコーゲンでは、高分子内における分岐様式が大きく異なっている。グリコーゲンでは、前者ではα−１，６分岐結合が分子全体にランダムに形成されるのに対し、アミロペクチンでは、分岐構造が規則性を持って形成されるために、単位構造（クラスターと呼ばれる）が多数タンデム状に連結した構造を示す。この構造の違いが、両者の物性の大きな違いを生む原因となっている。植物のアミロベクチン特有の分岐構造には、ＳＢＥの働きが関与している。
【００２７】
植物のＳＢＥには大きく、ＢＥＩ型とＢＥＩＩ型の２つのサブタイプが存在するが、両タイプの機能の違いはまだ十分には解明されていない。
【００２８】
さらに、従来、ＳＳとＳＢＥがアミロペクチンの枝の頻度を決め、クラスター構造を形成するのに重要な役割を果たしているのではないかと考えられてきた。即ち、前記したデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）はクラスターの形成に必要ない酵素であると考えられていた。しかし、この分解酵素が欠損した植物ではアミロペクチンのクラスターを形成することができないことが明らかにされ、ＤＢＥがクラスター構造の形成に不可欠であることを示すことが報告されている（Ｍ．Ｇ．Ｊａｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９５）７，４１７−４２９；Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，（１９９７）１２（１），１４３−１５３；Ａ．Ｋｕｂｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．，（１９９９）１２１，３９９−４０９）。
【００２９】
ＤＢＥについてのこれらの報告から、アミロペクチンにおけるクラスター構造の形成は、ＳＳとＳＢＥによる新たな結合の形成だけなく、ＳＢＥにより余分に形成された枝分かれを、ＤＢＥにより分解してクラスター構造が規則正しく維持されることが分かってきた。
α−１，６グルコシド結合の枝を分解するＤＢＥは、基質の違いから２種類のものが知られている。そのひとつはイソアミラーゼ（Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）であり、他のひとつがプルラナーゼ（Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ（また、Ｒ−ｅｎｚｙｍｅやｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎａｓｅと呼ばれることもある））である。これらの２種類のＤＢＥのうちイソアミラーゼは、グリコーゲンやフィトグリコーゲン（ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）のα−１，６グルコシド結合の枝を分解することが出来るが、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）には作用しない。一方、プルラナーゼはプルランには作用するが、グリコーゲンやフィトグリコーゲンには作用しない。
【００３０】
デンプンのクラスター構造を形成させるのに重要な存在であるイソアミラーゼは植物の種類により微妙に異なっているものと推測され、各植物固有のアミロペクチンを形成するものと推測される。また、枝切り酵素のイソアミラーゼが必要なときに必要な量だけ発現させるように、イソアミラーゼの発現の時期や量を制御しているプロモーターも植物に固有のものと考えられ、このような制御により植物固有のアミロペクチンが産生ものと考えられている。
【００３１】
例えば、ジャポニカ米のイソアミラーゼのプロモーターをインディカ米のイソアミラーゼのプロモーターとして導入することにより、イソアミラーゼの発現がジャポニカ米のアミロペクチンの合成時と同じように制御され、枝切り酵素自体はインディカ米のイソアミラーゼであるが、その発現はジャポニカ米のイソアミラーゼの発現と同様に制御され、ジャポニカ米のデンプンとインディカ米のデンプンとのミックスされたデンプンを作る植物体を得ることができるようになるかもしれない。また、イソアミラーゼが同じであるなら、別の植物のプロモーターを導入することによりもとの植物と同様なデンプンをその植物に産生させることができるようになるかもしれない。例えば、耐寒性のあるイネに、おいしいデンプンを作るイネのプロモーターを導入することにより、耐寒性でおいしいデンプンを作るイネを作出することができるかもしれない。
【００３２】
このように、イソアミラーゼのプロモーターは、イソアミラーゼ自体と同様に植物が植物固有のデンプンを作るためのキーとなっているものであり、イソアミラーゼのプロモーターを単離、同定することは、そのメカニズムの解明や植物の改変のみならず、新種のデンプンを創出ということも重要である。
【００３３】
本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告してきた（Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓａｔｏｈ，Ｋ．Ｔｅｒａｓｈｉｍａ．，Ｓｔａｒｃｈ，１９９９，５１，５８−６２．；Ｔ，Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙａｎｏ，Ａ．Ｓｈｏｍｕｒａ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００２，１０４，１−８）。
【００３４】
本発明者らは、本明細書に記載しているようにさらに各種のイネについてアミロペクチンの微細構造を比較検討し、その原因となる遺伝子を見出した。即ち、本発明者らは、これらのアミロペクチンの微細構造の相違の原因となっている遺伝子が、スターチシンターゼＩＩａ（以下、ＳＳＩＩａと略す。）の遺伝子と同じ位置である第６染色体上にちょうど位置していることを見出した。このことはアミロペクチンのＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）が１０以下という短いα−１，４−グルコシド鎖を伸長して長い鎖を形成することに、ＳＳＩＩａが極めて重要な役割を果たしていることを示している。
【００３５】
従来、アミロペクチンのα−１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳＩＩＩにより形成されるものであると考えられていたのであるが、ジャポニカとインディカのアミロペクチンの微細な構造上の相違がＳＳＩＩ、特にＳＳＩＩａの機能の相違に起因していたとする本発明者らの知見は驚くべきことである。
【００３６】
そして、本発明者らは、インディカ米カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）とジャポニカ米日本晴のアミロペクチンの構造の相違を検討し、その構造の相違がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）によるものであるものであることを解明し、そして、インディカ米Ｋａｓａｌａｔｈとジャポニカ米日本晴のＳＳＩＩａ遺伝子の全塩基配列を決定した。両遺伝子構造の違いがＳＳＩＩａの活性の強弱に影響し、その結果アミロペクチンの構造の違いを生じると考えられる。
【００３７】
イネのＳＳＩＩａはアミロペクチンの側鎖の伸長に関わっている。この酵素の強弱がアミロペクチンの側鎖の長短に影響し、これによりデンプンの物性や味が劇的に変化する。その原因が今回明らかにされた塩基配列に起因しており、今後、変異部分の改変により、側鎖の長さを自由に改変させ、新規デンプン形質を作成することができることになる。
【００３８】
また、イネのデンプン枝作り酵素（ＳＢＥ）にはＢＥＩ、ＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂの３つのアイゾザイムが存在すると考えられている。本発明者らによるＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損したａｅ変異体（ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｅｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）の変異体）の解析から、ＢＥＩＩｂの機能が明らかになりつつある（Ａ．Ｎｉｓｈｉ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．Ｔａｎａｋａ ａｎｄ Ｈ．Ｓａｔｏｈ，（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２７，４５９−４７２）。即ち、本発明者らは、当該ａｅ変異体にＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換し、デンプンの性質が野生型に回復するかを検証することで、ＢＥＩＩｂの特異的な機能を明らかにし、同時に、形質転換イネにおいて、導入したＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の強弱によって、さまざまな性質を示す新形質デンプンが出来る事を初めて明らかにした。通常代謝反応ネットワークにおいては、ある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例である。それに対して本発明の場合には、ＢＥＩＩｂの活性に応じて、全く性質の異なるデンプンが生産されるようになることを本発明者らは初めて見出した。本発明の過剰発現によるＢＥＩＩｂ遺伝子の制御によって酵素の活性をさまざまなレベルに変動させ、多様なデンプンを生産する方法が初めて明らかにされた。
【００３９】
即ち、本発明者らは、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入することにより、当該酵素の発現量が変化することを見出した。また、当該酵素の発現量に応じて形質の異なるデンプンが生産されることも見出した。より詳細には、イネのＢＥＩＩｂの遺伝子が欠損したａｅ変異体にＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換することにより、形質転換イネにおいて、導入したＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の強弱によって、さまざまな性質を示す新形質のデンプンを生産することができる新規な変異体が生成することを見出した。通常の代謝反応ネットワークにおいては、ある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例であるが、それに対して本発明では、導入した遺伝子が野生型とは当該酵素の発現量を異にし、それに応じてＢＥＩＩｂの活性が異なることから、元の野生型が生産するデンプンとは全く性質の異なるデンプンが生産されるようになることは驚くべきことである。
【００４０】
さらに、本発明者らは、イネ、特にジャポニカ米におけるイソアミラーゼのプロモーターを見出した。
【００４１】
本発明は、植物のデンプン合成酵素系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子工学的に改変して、野生型の植物が製造するデンプンとは異なる特性を有する新規なデンプンを製造する方法を提供するものである。即ち、本発明は、植物が生産するデンプンの形質を改質する方法、元の野生型とは形質が異なるデンプンを製造する方法、及び形質が改変されたデンプンを提供するものである。
【００４２】
詳細には、本発明は、第一にデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）に関するものであり、第二にデンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）に関するものであり、第三にデンプン枝切り酵素の１種であるイソアミラーゼのプロモーターに関するものである。
【００４３】
より詳細には、本発明は、インディカ米、ジャポニカ米のアミロペクチンの鎖長分布や、デンプンの物性や味に影響を与えている原因となる遺伝子を解明し、その構造の相違やそれに基づく機能を明らかにすることを目的としている。
【００４４】
また、本発明は、この遺伝子構造の相違を利用し、その機能を制御することによりデンプンの物性や味が改変されたデンプンを製造する方法を提供することを目的としている。
【００４５】
さらに、本発明は、イネ、特にジャポニカ米におけるイソアミラーゼのプロモーターを提供するものである。また、本発明は前記したイソアミラーゼのプロモーターが導入された植物、及び当該植物が産生する新規なデンプンの製造方法を提供するものである。
【００４６】
さらに詳細には、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。より詳細には、イネが、ジャポニカ米の日本晴（品種名）又はインディカ米のカサラス（品種名）のであるスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。さらに詳細には、スターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子が、配列表の配列番号１若しくは２に示される塩基配列、又はストリージェントな条件下でそれとハイブダイズし得る塩基配列を有するものであるイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。本発明のスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子はプロモーター領域を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。
【００４７】
また、本発明は、前記したイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターに関する。
【００４８】
さらに、本発明は、前記したイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列、又はそれと相同性を有するようにイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列が改変された遺伝子改変イネデンプンに関する。
【００４９】
また、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子とそのプロモーター領域の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を、他の種類のイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子とそのプロモーター領域の遺伝子の塩基配列に対応するように改変された遺伝子改変イネを用いて、元のイネとは異なる鎖長分布、物性又は味を有するデンプンを製造する方法に関する。
【００５０】
さらに、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列になかの、イネのスターチシンターゼＩＩａ遺伝子に特異的な塩基配列を含有してなるオリゴヌクレオチド、及びそれを用いたイネの種類を検出又は同定する方法に関する。
【００５１】
また、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が、元の野生型の生物とは異なる量発現する変異体を用いて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型の生物とは異なる変異体を用いて、元のイネが生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法に関する。
【００５２】
さらに、本発明は、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンに関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型の生物とは異なる変異体を用いた、元のイネが生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンに関する。本発明のデンプンの形質は、好ましくはデンプンの糊化の特性により示されるものであり、また、デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれとは異なることを特徴とするデンプンである。
【００５３】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。より詳細には、イネの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。
【００５４】
また、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素を元の野生型よりも過剰に発現させる方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）を野生型よりも過剰に発現させる方法に関する。
【００５５】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる種を選別することからなる、デンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法に関する。そして、当該酵素の発現量の相違により、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産することを特徴とする変異体の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法に関する。
【００５６】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体に関する。そして、当該酵素の発現量の相違により、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産することを特徴とする変異体に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型とは異なる変異体に関する。
【００５７】
また、本発明は、イネのイソアミラーゼのプロモーターに関する。好ましくは配列表の配列番号１に記載された塩基配列、この一部の塩基は置換、欠失、もしくは他の塩基が付加されてなる塩基配列、又はこれらの塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するイネのイソアミラーゼのプロモーターに関する。
【００５８】
また、本発明は、植物のイソアミラーゼのプロモーターが、前記した本発明のプロモーターで置換された形質転換植物に関する。
【００５９】
さらに、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に前記した本発明のプロモーターを配置してなる遺伝子を植物に導入して、デンプンの製造の際のイソアミラーゼの発現がイネと同様に制御されたデンプンを製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明は、第一にデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）による改変、第二にデンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）による改変、及び第三にデンプン枝切り酵素の１種であるイソアミラーゼのプロモーターによるデンプンの改変に関するものである。以下、これらを順に説明する。
【００６１】
１．デンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）による改変
本発明者らは、各種のイネのデンプンの物性や構造を調べた（Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｉｎａｂａ，Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｗａ，Ｔ．Ｎａｇａｍｉｎｅ．Ｓｔａｒｃｈ ２００２，５４，１１７−１３１．）。そして、イネの種類によるデンプンの違いを物性面のみならず、アミロペクチンの構造から分析し、次いでこのようなアミロペクチンの構造の違いが生じる原因となる遺伝子を解明することにした。
【００６２】
まず、本発明者らは世界各地で栽培されている各種のイネの中から、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）４７品種、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）３４品種、インディカ２３品種、および中国のインディカ２５品種を収集し、それぞれのデンプンを解析して検討した。その結果を以下の表１〜表４に示す。
アミロペクチンの微細構造を分析するために、アミロペクチンをイソアミラーゼで分解し、各アミロペクチンのα−１，４−鎖の鎖長のモル分布をキャピラリー電気泳動で分析した。この方法は、各々のα−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数（鎖長（ＤＰ））を１００個まで、各々の鎖長における全体に対するモル分率として定量的に調べることができるので、種々の品種におけるアミロペクチンの微細構造を検討には好都合のものである。本発明者らは、先にジャポニカは、インディカに比べて、鎖長（ＤＰ）が２５以上のものについては両者に明確な相違はないが、鎖長が１１以下のものが多く分布し、鎖長が１２〜２４のものは少ないことを報告してきた。アミロペクチンのクラスターの長さは、アミロペクチンのソースとして使用される植物の品種の依存していることはよくしられており、インディカとジャポニカのアミロペクチンの微細構造の相違が前述したような極僅かなものであることは驚くべきことであった。
【００６３】
また、アミロペクチンのクラスター内の鎖長、即ちＡ鎖とＢ１鎖の最大長は２４であることが報告されており（Ｈａｎａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、そこで各イネについて、鎖長が２４までについて、鎖長が２４までの量に対する鎖長が１０以下である量の比（ＤＰが１０以下の量／ＤＰが２４以下の量）を算出した。この比は、アミロペクチンのクラスターに占める短い鎖の割合（存在比）を表す。
【００６４】
各イネについてのこれらの結果を次の表１〜表４に示す。表１は４７品種についての温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり、表２は３４品種についての熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり、表３は２３品種についてのインディカのものであり、表４は２５品種についての中国のインディカのものである。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
【表４】
【００６９】
各表の左欄から、整理番号（Ｎｏ）、品種名、パスポート番号、アミロペクチンの差長が１０以下の割合、糊化開始温度と糊化最大温度の温度特性、アミロース含有量、及びフェノール色素反応の結果を示している。整理番号は、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）を１００番台とし、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）を２００番台とし、インディカを３００番台とし、そして中国のインディカを４００番台として、各種類において連続番号がふされている。パスポート番号は、筑波の独立行政法人農業生物資源研究所で使用されている番号であり、アミロペクチンの鎖長が１０以下の割合は、前記してきた鎖長が２４以下の全量に対する鎖長が１０以下の量の割合（モル）を示し、アミロース含有量は胚乳の全デンプンに対するアミロースのわりあい（重量％）を示し、フェノール色素反応はフェノール溶液において反応が有ったものを「１」と表記し、反応が無いものを「０」と表記している。
【００７０】
ジャポニカとインディカの鎖長分布の相違の一つの典型例として、ジャポニカの整理番号１４３（以下＃１４３と記載する。）とインディカの整理番号３０３（＃３０３）についての鎖長分布を図５に示す。図５の上段の図（図５Ａ）は各々の鎖長の分布を示し、横軸は鎖長（α−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を示し、縦軸は頻度（モル％）を示す。白抜きはジャポニカ（＃１４３）を示し、黒塗りはインディカ（＃３０３）を示す。図５の下の図（図５Ｂ）は、各々の鎖長におけるジャポニカ（＃１４３）の頻度からインディカ（＃３０３）の頻度を引いた（＃１４３−＃３０３）差を頻度（％）として示している。
【００７１】
この結果、ジャポニカは、インディカに比べて鎖長が１１以下のものが多く（図５Ｂにおいて大きくプラスになっている。）、鎖長が１２〜２４のものがすくなくなっている（図５Ｂにおいて大きくマイナスになっている。）ことがわかる。また、鎖長が２５以上のものについては両者に殆ど差がないことがわかる。この結果は以前の報告とよく一致するものであった。
【００７２】
さらに、いくつかの種類のイネについてインディカ（＃３０３）との鎖長の分布の差を同様にしてみてみた結果を図６に示す。図６は左側の上から＃１０３との差、＃２３４との差、＃３１０との差、及び＃４０９との差を示し、右側は＃２１５との差、＃２０２との差、＃３０２殿差、及び＃４０８との差をそれぞれ示す。図６の左側と右側では鎖長分布の差のパターンが異なっていることがわかる。即ち、左側のパターンは前記したジャポニカ（＃１４３）との差のパターンとよく似ているが、右側のパターンは鎖長分布に差が余りみられない、即ちインディカ＃３０３とほぼ同じ鎖長分布をしているパターンとなっている。
【００７３】
本発明者らは、さらに、鎖長が２４以下の全量に対する鎖長が１０以下の量の比（以下、本明細書ではこの比をＡＣＲと称する。）を計算してみた。各品種のこの値は前記表１〜表４に記載されている。
【００７４】
図７は今回調査した１２９品種について算出されたＡＣＲの値におけるヒストグラムを示している。横軸はＡＣＲの値を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【００７５】
この結果から、ＡＣＲの値に基づいてイネを大きくふたつのグループに分類できることがわかる。ひとつのグループはＡＣＲが０．１５９〜０．２００のグループであり、他のひとつのグループは０．２４０〜０．２８７のグループである。しかし、唯１種だけがこの分類に適合しないのものがある。これはＡＣＲの値が０．２２０の＃２１５のクァークヨエ（Ｋｈａｕｋ Ｙｏｅ）である。この１品種を除けば、今回調査した１２９品種のうちの１２８品種はＡＣＲの値に基づいて２グループに完全に分類し得ることがわかる。
【００７６】
図８は今回調査した各種類のイネについて図７と同様にヒストグラム化したものである。図８に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は４７）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３４）、左下はインディカのものであり（個数は２３）、右下は中国のインディカのものである（個数は２５）。
【００７７】
これによれば、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）は典型的にＡＣＲの値が大きいものであり（図８左上）、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）では両者のグループが存在し（図８左上）、インディカや中国のインディカではＡＣＲの値が小さいのものが主流ではあるが、ＡＣＲの値が大きいものも有ることがわかる。
【００７８】
本発明者らは、前記したＡＣＲの値に基づくグループを、Ｌ−タイプ、Ｓ−タイプ及びＭ−タイプと命名した。即ち、Ｌ−タイプは短い鎖長の分布が少なくＡＣＲの値が小さい（約０．１９以下）もののグループであり、Ｓ−タイプは比較的長い鎖長の分布が多くＡＣＲの値が大きい（約０．２４以上）もののグループである。Ｍ−タイプはその中間のものであり、今回の調査では＃２１５の１種のみである。
【００７９】
振り返って図６を見ると、図６の左側の４種は、いずれもＳ−タイプに属するイネである。これらの４種は、今までの種類分けでは、温帯ジャポニカ（＃１０３）、熱帯ジャポニカ（＃２３４）、インディカ（＃３１０）、及び中国のインディカ（＃４０９）に分類されているものであるが、前記のＡＣＲの値や図６に示される鎖長分布の差からみればこれらが同種のアミロペクチン構造をゆうしていることがわかる。図６の右側の上はＭ−タイプの＃２１５のものであり、この品種はＡＣＲの値はＬ−タイプともＳ−タイプとも異なっているが、鎖長の分布は比較的Ｓ−タイプに似ている。図６の右側の下３個はＬ−タイプのものである。これらのＬ−タイプのものの鎖長の差の分布はさまざまパターンをしめしているが、いずれの鎖長においても＃３０３との差が小さいことが特徴である。
【００８０】
各品種の胚乳のデンプンの熱特性を示差熱量測定法（ＤＳＣ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｙｍｅｔｒｙ）により分析した結果を表１〜表４に記載した。これらの幾つかの品種について更に詳細な熱特性を検討した結果を次の表５に示す。
【００８１】
【表５】
表５の左側から、整理番号、品種名、糊化開始温度（Ｔｏ）、糊化最大温度（Ｔｐ）、糊化終了温度（Ｔｃ）、糊化範囲、ゲラチン化エンタルピー、前記したＡＣＲの値によるタイプ（Ａｐ）、アミロース含有量（％）を示している。この結果Ｌ−タイプのアミロペクチンを有するイネのデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ）及び糊化最大温度（Ｔｐ）は、Ｓ−タイプのものに比べて極めて高くなっていることがわかる。また、Ｍ−タイプのものはこの中間となっていることがわかる。
【００８２】
アミロペクチンの微細構造とデンプンの熱特性の相関をさらに詳細に検討した結果を図９に示す。図９の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はアミロペクチンのＤＰが１０以下の量の比（ＡＣＲ）を示している。図９の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。温帯ジャポニカは比較的左上側に集中しているが、他の種類はバラバラの分布している。しかし、糊化開始温度が高くなるにつれてＡＣＲの値が小さくなることが明瞭にしめされており、その相関係数は−０．８０２５と極めて高い相関が両者にあることを示している。
【００８３】
このことから、アミロペクチンのＡＣＲの値がデンプンの熱特性に大きな影響を与えていることがわかる。
【００８４】
アミロペクチンのクラスターの側鎖は、ＤＰが約１０以上のものであればダブルヘリックス構造を形成しており、このダブルヘリックス構造の長さが糊化開始温度（Ｔｏ）と相関していることが報告されている（Ｔ，Ｕｍｅｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．；Ｍ．Ｊ．Ｇｉｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９８７，１６１，２９１−３００．；Ｍ．Ｊ．Ｇｉｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．１９９５，２８，２３−３１．；Ｇ．Ｋ．Ｍｏａｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７，２９８，３２７−３３３．）。このダブルヘリックス構造に基づく考え方によれば、ＡＣＲの値と糊化開始温度との相関を説明することができる。即ち、ＡＣＲの値が大きい（Ｓ−タイプ）ということはＤＰが１０以下のものが比較的多く、ダブルヘリックス構造を形成できる側鎖が少ないということになり、反対にＡＣＲの値が小さい（Ｌ−タイプ）ものではＤＰが１１以上のものが比較的多く、ダブルヘリックス構造を形成できる側鎖が多くなるからである。
【００８５】
また、同じＡＣＲの値であるにもかかわらず糊化開始温度が比較的広く分布する傾向が見られる。このことは特にＡＣＲの値が０．２４以上の場合に顕著である。このことは、糊化開始温度がＡＣＲの値のみに左右されるものではなく、他の要因によっても左右されていることを示していると考えられる。
【００８６】
次に、各種のイネの胚乳のデンプンのアミロースの含有量についても調査し、この結果を表１〜表４に記載した。
【００８７】
図１０は今回調査した１２９品種のうちの１００品種についてのアミロース含有量のヒストグラムを示している。横軸はアミロース含有量（全デンプンに対する割合（％））を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【００８８】
図１１は今回調査した各種類のイネについて第１０図と同様にヒストグラム化したものである。図１１に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３８）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は２５）、左下はインディカのものであり（個数は１９）、右下は中国のインディカのものである（個数は１８）。
【００８９】
アミロースの含有量が３０％を越えるものもみられたが、このアミロース含有量と前記したアミロペクチンの構造との相関は特にみられなかった。
【００９０】
デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度との相関を検討した結果を図１２に示す。図１２の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はデンプンのアミロース含有率（％）を示している。図１２の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【００９１】
この結果、デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度とには、格別の相関は見出せなかった（相関係数＝０．２４６０）。
【００９２】
本発明は、従来のインディカとジャポニカという分類法とは異なる、アミロペクチンの微細構造に基づいてＬ−タイプ、Ｓ−タイプ、及びそれらの中間のＭ−タイプという３種類にイネを分類することができることを見出したものである。これらのタイプにおけるアミロペクチンのクラスターのα−１，６−結合による枝の位置や数に違いは無いのであるが、ひとつのクラスターにおける短いα−１，４−グルコシド鎖や中間程度の長さのα−１，４−グルコシド鎖の数にのみ違いが見られる。このようなＬ−タイプとＳ−タイプの違いを模式的にしめしたものが図３であるということもできる。即ち、図３の（ａ）は一つのクラスターの中にα−１，４−グルコシド鎖の短いものの数が相対的に多くなっており、これが本発明のＳ−タイプに相当するものであり、図３の（ｂ）は反対に一つのクラスターの中に比較的長いα−１，４−グルコシド鎖の数が相対的に多くなっており、これが本発明のＬ−タイプに相当するものである。従来は図３の（ａ）をジャポニカ−タイプ、（ｂ）をインディカ−タイプといっていたが、インディカやジャポニカの中にも品種によってＬ−タイプもあり、Ｓ−タイプのものもあるということをアミロペクチンの微細構造の分析により初めて明らかにしたものである。
【００９３】
さらに、本発明者らは、日本晴（品種名）とカサラス（品種名）とのアミロペクチンの構造の相違の原因がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）の作用によるものであることを示してきた（特願２０００−７８５５３号）。即ち、本発明者らは、デンプンの性状の差異に起因すると考えられるアルカリ崩壊性の難易を制御する遺伝子（ａｌｋ遺伝子）、デンプンの主要成分であるアミロペクチンの構造を制御する遺伝子、さらにアミロペクチン合成に関与すると考えられる酵素アイソザイムの構造遺伝子が同一の遺伝子座に存在することを示してきた。
【００９４】
本発明においては、世界中で栽培されているイネについて、同じ方法によりアミロペクチンの構造が変化させられていることを明らかにし、そして、イネ胚乳におけるＳＳＩＩａの作用がアミロペクチンのクラスター内における短い鎖の伸長に決定的な役割を演じていること、及びＳＳＩＩａ遺伝子が欠損した場合にはＬ−タイプのアミロペクチンに代わってＳ−タイプのアミロペクチンが蓄積されることを示してきた。
【００９５】
このことから、前記してきたアミロペクチンの微細構造におけるＬ−タイプとＳ−タイプの構造を決定する遺伝子はスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）をコードする遺伝子であると考えられることから、当該遺伝子を単離することを試みた。
【００９６】
このために、まず、リン（Ｌｉｎ）らの方法に準じて（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８））、９８系統の（日本晴×カサラス）×日本晴の戻し交雑後代自殖系統群（Ｂａｃｋｃｒｏｓｓ Ｉｎｂｒｅｄ Ｌｉｎｅｓ，ＢＩＬｓ）を育成した。９８系統のＢＩＬｓは、各々の系統について、１２本ある染色体のどの領域が日本晴あるいはカサラス由来であるかが明らかにされている（イネゲノムプロジェクト公開データ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｆｆ．ｏｒ．ｊｐ）。この遺伝子データと各ＢＩＬのアルカリ崩壊性の難易を対応させることにより、アルカリ崩壊性を制御する遺伝子の座乗位置が決定可能である。この解析を実施した結果、アルカリ崩壊性遺伝子は既報（Ｈａｒｕａｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）の通り、第６染色体のポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）３６．７に座乗することが確認された。
【００９７】
次に、アミロペクチンの枝状構造を制御する遺伝子の染色体上の座乗位置を決定するために、前記の各ＢＩＬｓのアミロペクチンの構造を前述した方法により分析し、それらの鎖長分布が日本晴のそれに類似しているかカサラスのそれに類似しているか判定した。その判定結果とＢＩＬｓの遺伝子型データを対応させることで、アミロペクチンに枝状構造を制御する遺伝子は１つ存在し、前記のアルカリ崩壊性遺伝子と同じく、第６染色体のポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）３６．７に座乗することが明らかとなった。
【００９８】
また、イネＳＳＩＩａ遺伝子の構造を明らかにするため、イネゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を行った。まず、ジャポニカ品種の日本晴とインディカ品種のカサラスのゲノムＤＮＡを幼葉から単離し、その一部をエッペンドルフチューブ内でそれぞれ各ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ａｐａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉの各制限酵素で加水分解した後、精製したＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって分離した。分離ＤＮＡをフィルターに転写し、全長ＥＳＴクローン（Ｅ１１０２５）をプローブとしてして、サザンブロットを行った。その結果、ＢａｍＨ Ｉ断片において、反応する断片が、イネの両品種においてＲＦＬＰ性が認められた。これを利用して、ＢＩＬｓ各系統を、日本晴型（２０ｋｂの断片を含む）、カサラス型（２３ｋｂの断片を含む）、ヘテロ型（２０ｋｂおよび２３ｋｂの断片を含む）の３つのタイプに分類し、イネＳＳＩＩａ遺伝子のマッピングを行った。その結果、ＢＩＬｓ系統間におけるＲＦＬＰパターンの挙動は、アルカリ崩壊性とすべて一致した。従って、イネＳＳＩＩａ遺伝子は、ａｌｋ遺伝子と同一かあるいは極めてその近傍に座乗すると結論した。
【００９９】
なお、イネ胚乳のＥＳＴクローン（Ｅ１１０２５）は、農林水産省農業生物資源研究所イネゲノム研究チームより分譲された。本クローンは、ジャポニカ型イネ品種である日本晴の未熟種子のｍＲＮＡを鋳型にし、ポリＴをプライマーとして、リバーストランスクリプターゼの作用によって作成したｃＤＮＡを、５’末端と３’末端にＳａｌＩとＮｏｔＩ認識塩基配列をそれぞれ付加して、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングしたものである。本プラスミドはさらに大腸菌ＪＭ１０９株に感染させ、形質転換された大腸菌はグリセロールストックして保存してある。本菌体を、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１ｌ当たり１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウムを含む）上にまき、３５℃で終夜培養した。得られたコロニー群からシングルコロニーを選び、このコロニーからＱｉａｇｅｎキット（アミコン、ＵＳＡ）によってプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓａｃ Ｉによって加水分解した後、１％アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、それぞれの長さを測定して、本クローンの制限酵素地図を作成した。
【０１００】
本クローンは全長約１．７〜１．８ｋｂであった。上記制限酵素によって得られる数種類のＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動で分離した後、ゲルネブライザー（Ｇｅｌ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）（アミコン、ＵＳＡ）によって精製し、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）のそれぞれの制限酵素に対応する部位にサブクローニングした。サブクローニングされたクローンを含むプラスミドは大腸菌ＪＭ１０９株に感染させ、形質転換された大腸菌はグリセロールストックして保存してある。Ｅ１１０２５クローン全体およびクローンの断片を含むプラスミドの塩基配列を、ジデオキシ法に基づいて、Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムジャパン、千葉県浦安市）および蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＰＥバイオシステムジャパン、Ｍｏｄｅｌ３７３Ｓ−３６型）を用いて、決定した。各クローンの両側からの塩基配列を求めるため、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた。得られた塩基配列を、核酸およびアミノ酸配列の解析ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ、ソフトウェア開発、東京）を用いて解析した。その結果、本ＥＳＴクローンは１，７２４塩基からなり、４６６アミノ酸をコードすると考えられた。
【０１０１】
このようにして決定されたイネのＳＳＩＩａ遺伝子を含むゲノムの断片が調製された。日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＳＳＩＩａ遺伝子については、独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含む２種類のＰＡＣクローン（Ｐ４４１，Ｐ４５０）を使用した。また、カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）のＳＳＩＩａ遺伝子については、同じく独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含むＢＡＣクローンを使用した。
【０１０２】
これらのＰＡＣクローン、ＢＡＣクローンを種々の制限酵素（ＥｃｏＲ Ｖ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ等）で加水分解した。それぞれの断片を、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋）にサブクローンした後、プラスミドＤＮＡを調製し、それぞれのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
【０１０３】
得られた日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を図１３に示す。また、日本晴の塩基配列を配列表の配列番号１に、カサラスの塩基配列を同配列番号２に示す。また、日本晴のエキソン部分の塩基配列を配列表の配列番号３に、カサラスのものを配列番号４にそれぞれ示す。さらに、日本晴のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、カサラスのものを配列番号６にそれぞれ示す。
【０１０４】
図１３の四角枠はエキソン領域を示し、四角枠の間はイントロンを示す。それぞれの番号は、エキソン及びイントロンの順序を示している。図１３中のアスタリスクは、アミノ酸が変わる部分を示している。図１３には併せて制限酵素による切断位置を示す。
【０１０５】
日本晴の遺伝子のエキソン及びイントロンの位置、数およびサイズを次の表６に、カサラスのそれを表７にそれぞれ示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
それぞれの表は、左から、エキソン又はイントロンの番号、その領域の開始番号、その領域の終了番号、及びその領域の塩基長を示す。
【０１０９】
日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子は、いずれも７個のイントロンによって分断されている８個のエキソンから成る。イントロンの数と位置は両者で同一である。ただし、イントロンの長さは、第３、第６、第７イントロンにおいて、カサラスの遺伝子の方が１塩基づつ長い。イントロンの塩基配列の相同性もかなり高いが、第３、第６、第７イントロンにおいては、比較的多数の違いが見られる。
【０１１０】
図１４〜図１８に、日本晴とカサラスのＳＳＩＩａのゲノム遺伝子の全塩基配列を比較して示している。図１４〜図１８の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。図１４はこのうちの１番目〜１２６０番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１５はこのうちの１２６１番目〜２５２０番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１６はこのうちの２５２１番目〜３７７９番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１７はこのうちの３７８０番目〜５０３７番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１８はこのうちの５０３８番目〜５９３５番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示している。
【０１１１】
全配列のうちのプロモーター部分は、日本晴では１〜１，３４１ｂｐであり、カサラスでは１〜１，３３１ｂｐである。このプロモーター部分では、カサラスには、中ほどに（７０２ｂｐ）９塩基のギャップがある程度で、両者のサイズや塩基配列の相同性はかなり高かった。
【０１１２】
８個のエキソンのサイズは両者間で全く差がない（表１参照）。エキソン部分の塩基配列の比較を図１９〜図２０に示す。図１９〜図２０の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものであり、転写開始点を１番にしている。図１９はこのうちの１番目〜１２６０番目までの比較を示し、図２０はこのうちの１２６１番目〜２６０７番目までの比較を示している。エキソン部分の塩基配列の違いは合計で６箇所ある（図１５中の矢印）。
【０１１３】
図２１に両者のＳＳＩＩａのアミノ酸配列の比較を示す。図２１の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子をもとに、両者のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を比較すると、４箇所において、アミノ酸の種類が異なっていた。これらの違いによって酵素機能の違いが生じる可能性が考えられる。
【０１１４】
興味ある事に、４箇所のアミノ酸置換のうち、７３７番目のアミノ酸配列が、カサラスではＶ（バリン）のところ、日本晴ではＭ（メチオニン）となっている。スターチシンターゼのアミノ酸配列中にはいくつかの保存領域が知られているが、そのうちの１つがＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）で植物のスターチシンターゼにおいて高度に保存されていて、リージョン７（Ｒｅｇｉｏｎ７）と命名されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０：１１４７−１１５５）。イネＳＳＩＩａにおいて、７３７番目のアミノ酸がカサラスではＶで保存されているのに対して日本晴ではＭに変化している。この変化がＳＳＩＩａの機能の低下に関係している可能性がある。
【０１１５】
ジャポニカイネとインディカイネのデンプンの主成分であるアミロペクチンの構造の差異は、両者のＳＳＩＩａ遺伝子の構造と機能の違いが原因であると考えられる。具体的には、ジャポニカイネのＳＳＩＩａ遺伝子の機能が、何らかの変異によって、劣っていると考えられる。その原因としては、遺伝子の発現量が顕著に低下したか、酵素としての触媒能が低下したかのいずれかであろうと思われる。前者はプロモーターの変異によって、後者はアミノ酸置換による変異によって引き起こされる可能性が高い。
【０１１６】
この結果として、ジャポニカイネはアミロペクチンを構成するクラスターの鎖長が短い、即ちＡＣＲの値が大きいＳ−タイプとなり、インディカイネは鎖長が長い、即ちＡＣＲの値が小さいＬ−タイプとなったと考えられる。
【０１１７】
本発明者らはこれを確認し、さらに遺伝子の導入によるデンプンの製造を確認するために、インディカイネの１種である品種ＩＲ３６のデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）遺伝子を、ジャポニカイネに属する品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）にグルテリン（イネの貯蔵タンパク質）のプロモーターに連結させてアグロバクテリウムにより導入した。その結果、品種ＩＲ３６のデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）がジャポニカイネに属する品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）で発現し、当該形質転換体においては、本来Ｓ−タイプのアミロペクチンになるべきものが、形質転換によりＬ−タイプに変化したことが確認された。この結果を図２２に示す。図２２は、各品種が製造するデンプン（アミロペクチン）のＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を測定した結果を示したものである。図２２の上段は品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）のものであり、中段は品種ＩＲ３６のものであり、下段は形質転換体＃７８−１のものである。中段及び下段の右側は、各品種の品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）との差を示している。即ち、中段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と品種ＩＲ３６との差を示したものであり、下段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と形質転換体＃７８−１との差を示したものである。
この結果は、形質転換体において、品種ＩＲ３６のＤＰ値を持ったデンプンが製造されていることを示している。
【０１１８】
イネのデンプンの熱特性などの物性や味覚を決めているがデンプンのアミロペクチンの微細構造の違いによるものである。世界で栽培されているイネのアミロペクチンの微細構造は、Ｌ−タイプとＳ−タイプ、それとその中間のＭ−タイプに分類されることを本発明が初めて示し、そしてアミロペクチンのこれらの構造の違いを生じさせている原因遺伝子がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）であることを本発明が示し、この遺伝子を単離し塩基配列を決定した。
【０１１９】
その結果、Ｌ−タイプのイネ（カサラス）とＳ−タイプのイネ（日本晴）では、遺伝子の塩基配列の相違は少しであったが、この少しの違いがアミロペクチンの微細構造を違いを生じさているのである。
【０１２０】
アミロペクチンのクラスターの合成は、枝作り酵素（ＳＢＥ）により短い枝の分岐が作られ、デンプン合成酵素（ＳＳ）によりクラスターの結晶領域の終端まで鎖が伸長される。クラスター中における短い鎖の割合は、枝作り酵素（ＳＢＥ）と合成酵素（ＳＳ）の活性のバランスによって決定される。Ｓ−タイプのアミロペクチンは、ＳＳＩＩａ遺伝子が障害を受けているために、その結果ＳＢＥ活性がＳＳ活性に比べて相対的に高くなったときに製造されると思われる。これに対してＬ−タイプ様のアミロペクチンは、クラスターの形成に当たってＳＳＩＩａ活性がＳＢＥ活性に比べ優位であることから、ＳＳによる短い枝の伸長が優勢となったときに製造されるものと思われる。
【０１２１】
このように、アミロペクチンのクラスターにおける微細構造の形成は、クラスターの枝の元となる分岐の形成とＳＳＩＩａなどによる鎖の伸長とのバランスによるものであるから、ＳＳＩＩａの活性発現が障害を受けて弱くなっていると考えられるＳ−タイプのイネのＳＳＩＩａの遺伝子を、他のタイプのイネに導入することにより、導入されたイネのＳＢＥとＳＳＩＩａの活性のバランスが微妙に崩れ、アミロペクチンのクラスターが新しいタイプの微細構造を有するデンプンを製造することができることになる。
【０１２２】
また、発育のよいイネに物性や味覚の好ましいデンプンを作るＳＳＩＩａ遺伝子又はそのプロモーターを導入することにより、環境に強くかつ好ましい物性や味覚を有するデンプンを作るイネに改善することも可能となる。
【０１２３】
本発明における遺伝子は、翻訳領域のみをコードする遺伝子であってもよいし、ゲノム由来のものであってもよいし、また場合によってはプロモーター領域を含むものであってもよい。
【０１２４】
また、本発明のプロモーターとしては、イネのＳＳＩＩａ遺伝子を発現させることができるものであればよいが、好ましくは配列表の配列番号１の１番目〜１，３４１番目のもの、又は配列番号２の１番目〜１，３３１番目のものが挙げられる。本発明のプロモーターは、これらの塩基配列の全部又はその一部を用いることができる。
【０１２５】
本発明のイネの改変方法において重要なことは、遺伝子を導入するということではなく、アミロペクチンの微細構造を改変するためにイネのＳＳＩＩａの活性に関連する遺伝子を操作するということである。したがって、本発明の遺伝子改変イネは、イネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子の全長又は部分長のものをイネのゲノムに導入する方法に限定されるものではなく、イネのＳＳＩＩａの活性を変化させる目的でイネゲノムのＳＳＩＩａ遺伝子部分の塩基配列を、ポイントミューテーション法などにより操作することも本発明の方法に包含される。
【０１２６】
本発明の遺伝子改変イネの形態としては、遺伝子が導入などにより改変されたことを判別できるものであればよく、例えば種子、カルス、生育体などのいずれの形態であってもよい。
【０１２７】
本発明のデンプンの製造方法は、前記した遺伝子改変イネを用いてアミロペクチンの微細構造やそれに伴う物性や味が元のイネとは異なるデンプンを製造する方法であり、アミロペクチンの微細構造はイネの枝作り酵素（ＳＢＥ）の活性とデンプン合成酵素（ＳＳ）の活性とのバランスによるものと考えられることから、本発明の遺伝子やプロモーターを用いてＳＳの活性を変化させることにより、イネにおけるＳＢＥとのバランスを微妙にかえることが可能となり、目的に適した特性を有するデンプンを製造することが可能となる。
【０１２８】
また、本発明は、前記した製造方法によりアミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布や物性が元のイネとは異なる新規なデンプン、より詳細には天然のイネ科植物が産生するデンプンとは鎖長分布や物性の異なる新規なデンプンを提供することもできる。
【０１２９】
さらに、本発明はアミロペクチンの微細構造を特徴づけることができるＳＳＩＩａの遺伝子の全塩基配列、及びその相関関係を明らかにするものであり、本発明の塩基配列を用いてイネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子の種類を検出、同定することが可能となる。したがって、本発明はこのような方法に使用されるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲなどを行うためのプライマーや、塩基配列の相違を検出するためのプローブとして使用することができる。好ましいプライマーの例としては次の塩基配列を有するプライマー１〜３が挙げられる。
プライマー１： 5'-cggtggtgtgccctatgg-3'
プライマー２： 5'-cgacgggcagaaaggggtg-3'
プライマー３： 5'-ggcggacatggtctcttcac-3'
【０１３０】
これらのプライマーのうち、プライマー−１とプライマー−３の組み合わせ、プライマー−２とプライマー３の組み合わせにより、イネのＳＳＩＩａ遺伝子に特異的な断片を含むＤＮＡを得ることができる。
【０１３１】
本発明のＳＳＩＩａをコードする遺伝子又はそのプロモーターを用いることにより、イネのデンプンのアミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布を調節又は制御することができ、したがって、本発明はイネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子又はそのプロモーター領域の塩基配列を改変することによる、アミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布を調節又は制御する方法を提供するものである。
【０１３２】
図９に見られるように、アミロペクチンの鎖長分布と糊化開始温度とには強い相関関係があり、特に、アミロペクチン短鎖の比率の増加により（Ｓ−タイプ）、糊化開始温度が低下し、易糊化性が示される。このことは、アミロペクチンの分子構造の改変が、デンプンの物性を変える手段のひとつであることを示している。
【０１３３】
したがって、本発明はこのような鎖長分布の制御によって、熱糊化特性の異なる新規なデンプンを提供することができるものでもあり、食品用デンプンや産業用デンプンとして新規かつ有用なデンプンを提供するものである。
【０１３４】
２．デンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）による改変
次に、デンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）について説明する。
【０１３５】
本発明者らは、イネのＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損したａｅ変異体（ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｅｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）の変異体）の解析から、ＢＥＩＩｂの機能を検討する過程において、ａｅ変異体にイネのＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換し、デンプンの性質が野生型に回復するかを検証することにより、ＢＥＩＩｂの特異的な機能の解析を行ってきた。
【０１３６】
そのために、まずＢＥＩＩｂの遺伝子を次のようにして単離した。
【０１３７】
イネのゲノムＤＮＡライブラリーとして、イネ品種「シモキタ」のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）を利用した。このＢＡＣライブラリーは、マイクロプレートサイズのメンブレンに固定したもので、ゲノムＤＮＡはイネ品種「シモキタ」の緑葉のプロトプラストから調製したものであり、平均インサートサイズは１５５ｋｂである。
【０１３８】
このＢＡＣライブラリーから、イネのＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子をコードするクローンをスクリーニングするために、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをプローブとして用いた。イネ品種フジヒカリのＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、その結果得られた１７４０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動した後、抽出、精製した。このＤＮＡ断片を、ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりラベルし、プローブとして用いた。
【０１３９】
ＢＡＣライブラリーのメンブレンを上述のＢＥＩＩｂのｃＤＮＡ断片プローブとハイブリダイゼーションさせた結果、プローブとハイブリダイズするシグナルを得た。そのシグナルに対応するプラスミドを保持する大腸菌のクローンを得て、それをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミド自動抽出機によりプラスミドを抽出した。
【０１４０】
前述のようにＢＡＣライブラリーの平均インサートサイズは１５５ｋｂであり、そのような長いＤＮＡ断片には複数の遺伝子が存在することも考えられる。ＢＥＩＩｂ遺伝子がコードされている領域のみを得る必要があることから、ポジティブクローンから得たプラスミドについてサザンブロット解析を行なった。
【０１４１】
このプラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレンにＤＮＡ断片を転写させ、上述のプローブを用い、前記したＥＣＬ法により、メンブレンとハイブリダイゼーションさせた。その結果、プローブは１７ｋｂのＤＮＡ断片とハイブリダイズした。そのＤＮＡ断片を単離するために、プラスミドをＳａｌＩで切断した後、低融点アガロースゲルで電気泳動し、目的の１７ｋｂ断片を含む領域のゲルを切り出し、目的のＤＮＡ断片を抽出、精製した。
【０１４２】
アグロバクテリウムを介してイネに遺伝子を導入させるためにバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００を用いた。これをまず、ＳａｌＩで切断した後、ＳａｌＩを失活させた。次に、ＳａｌＩ切断により生じた５’末端を脱リン酸化させた。続いて、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした１７ｋｂのＤＮＡ断片をサブクローニングするために、これをたバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００にライゲーションした後（これをｐＣＢＥＩＩｂと呼ぶ。）、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ）を形質転換した。ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）に生えた大腸菌をＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミドを抽出、精製した。
【０１４３】
このバイナリーベクターにサブクローニングした１７ｋｂＤＮＡ断片の制限酵素地図を決定し、断片化した後、塩基配列を解析した。その結果、１７ｋｂゲノムＤＮＡ断片には、ＢＥＩＩｂ遺伝子の完全長がコードされており、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡの塩基配列との比較により、ＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子は２２エキソン、２１イントロンからなることが明らかになった。また、このＤＮＡ断片には、遺伝子の上流域が約２．２ｋｂ存在し、プロモーター領域は全て含まれていると考えられた。さらに、下流域は約３ｋｂ存在し、ターミネーター領域は全て含まれると考えられた。そこで、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００サブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をコードする１７ｋｂＤＮＡ断片をイネに導入した。
【０１４４】
アグロバクテリウムを介した形質転換法により、上述のバイナリーベクターにサブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子を、イネａｅ変異体であるＥＭ１０（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６９：２５３−２５７．）に導入し、形質転換体を作製した。このイネａｅ変異体であるＥＭ１０は、イネ品種「金南風」を親株とした変異体として作成されたものである。
【０１４５】
イネの組織培養および形質転換は土岐（Ｔｏｋｉ）の方法（Ｔｏｋｉ，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１５：１６−２１．）に準じて行った。まず、ｐＣＢＥＩＩｂをエレクトロポレーシヨン法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＥＨＡ１０５株に導入した。このアグロバクテリウムをＥＭ１０のカルスに感染させ、ＤＮＡ導入し、形質転換させた。形質転換体は、ハイグロマイシンによりスクリーニングした。植物体に再分化したイネ個体はポットに移植し、温室で、自然光、２８／２４℃（６−１８時／１８−６時）の条件で生育させた。
【０１４６】
このようにして得られた形質転換体の中から、６系統を選抜した。この６系統を、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１と命名した。
【０１４７】
これらの６系統の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８についてサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を図面に代わる写真として図２３に示す。対照としてａｅ変異体であるＥＭ１０及びその親株である「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）を用いた。図２３は左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８の各レーンを示し、図２３の上段の（ａ）はＢａｍＨＩを用いた場合であり、下段の（ｂ）はＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合である。
【０１４８】
選抜した形質転換体は、金南風、ＥＭ１０よりも強くプローブとハイブリダイズした（図２３ではより黒く示されている。）。アプライしたゲノムＤＮＡ量は同じであるから、形質転換体には、金南風、ＥＭ１０以上のＢＥＩＩｂをコードするＤＮＡ断片が存在する。つまり、ＢＥＩＩｂを含む断片が導入されていることを示している。
【０１４９】
次に、得られた形質転換体についてノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を図２４に図面に代わる写真として示す。図２４の左から、「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８、ひとつ間を置いて、＃１−１、＃２−６、及び＃９−８の各レーンを示し、縦方向はデンプンを製造する際の各デンプン合成酵素、及びｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を示している。ＢＥＩはデンプン枝作り酵素Ｉを、ＢＥＩＩａはデンプン枝作り酵素ＩＩａを、ＳＳＩはデンプン合成酵素Ｉを、ＳＳＩＩＩはデンプン合成酵素ＩＩＩを、ＩＳＡはイソアミラーゼを、ＰＵＬはプルラナーゼを、それぞれ示している。
【０１５０】
ＢＥＩＩｂのｍＲＮＡは形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１で発現していた。導入したＢＥＩＩｂが確かに発現していることを示している。他のデンプン合成酵素の発現には変化が無かった。＃１０６−１よりも＃３１−１、＃１１３−７の方がｍＲＮＡが多く発現しているのは、導入されたＢＥＩＩｂのコピー数に比例していると思われる。
【０１５１】
また、＃１−１において強く発現しているのは、遺伝子の強い発現を促すゲノムにＢＥＩＩｂ遺伝子が挿入されたためと考えられる。
【０１５２】
これらの６系統についてウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）／活性染色法による解析（図２５上段）、及びネイティブ−ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色法による解析（図２５下段）を行った結果を図２５に図面に代わる写真として示す。図２５の上段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１の各レーンを示し、縦方向はＢＥＩ及びＢＥＩＩｂのブロットを示す。図２５の下段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、ａｅ変異型、相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）、過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）を示し、縦方向はＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ、及びＢＥＩをそれぞれ示す。
【０１５３】
ＢＥＩＩｂのタンパク質は、親株の金南風、並びに形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７で発現していることが確認できた。特に＃１−１では強く発現していた。しかし、ａｅ変異体のＥＭ１０及び形質転換体＃７−８ではその発現を確認することはできなかった。他のデンプン合成酵素（ＢＥＩ、ＩＳＡ及びＰＵＬ）の発現にはいずれの個体においても変化がみられなかった。
【０１５４】
ＢＥＩＩｂ活性は、ａｅ変異体のＥＭ１０では見られないが、親株の金南風では紫色のバンドとして見られる。形質転換体では、ＢＥＩＩｂ活性が＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７で回復しているが、＃１０６−１では非常に薄く確認できた。＃７−８は回復していなかった。この結果、形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７では、導入したＢＥＩＩｂが発現し、機能していることが示された。
【０１５５】
次に、形質転換イネのアミロペクチンの分子構造について検討した。各形質転換体及びａｅ変異体のＥＭ１０について、アミロペクチンの鎖長の分布を野生型（金南風）の鎖長分布を比較した。結果を図２６に示す。図２６の横軸は鎖長の長さを１〜６０まで示しており、数字が大きいほど鎖長が長いものを示している。図２６の縦軸は各鎖長における野生型（金南風）との鎖長分布の割合（％）の差を示している。即ち、まず野生型（金南風）におけるアミロペクチンの鎖長の分布を調べ、それをアミロペクチンの鎖長全体に対する各鎖長の割合（％）、例えば鎖長６のものがａ％、鎖長７のものがｂ％、鎖長８のものがｃ％、鎖長９のものがｄ％、・・・というように各鎖長について全体に対する分布の割合（％）を算出する。次に検定すべき各形質転換体などについて同様にアミロペクチンの鎖長全体に対する各鎖長の割合（％）、例えば鎖長６のものがｋ％、鎖長７のものが１％、鎖長８のものがｍ％、鎖長９のものがｎ％、・・・というように各鎖長について全体に対する分布の割合（％）を算出する。そして、各鎖長についてその差、例えば、鎖長６のものでは（ｋ−ａ）％、鎖長７のものでは（１−ｂ）％、鎖長８のものでは（ｍ−ｃ）％、鎖長９のものでは（ｎ−ｄ）％、・・・というように各鎖長の分布の割合（％）の差を算出し、それをグラフ化したものが図２６である。図２６の縦軸における＋側（図２６では上側）は野生型（金南風）よりも多く分布していることを示し、−側（図２６では下側）は野生型（金南風）よりも少なく分布していることを示している。また、図２６の上段は、ＥＭ１０（黒丸印−●−）、形質転換体の相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）（＃１０６−１）（白丸印−○−）、並びにａｅ変異型（＃７−８）（黒三角印−▲−）及びａｅ変異型（＃９−８）（黒四角印−■−）についてのものであり、図２６の下段は、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃３１−１）（黒丸印−●−）、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１１３−７）（黒四角印−■−）、及び形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１−１）（黒三角印−▲−）についてのものである。
【０１５６】
ＢＥＩＩｂを欠くａｅ変異体のＥＭ１０では、鎖長の短い部分（鎖長が約６〜１３）において野生型（金南風）に比べて分布の割合（％）が低くなっており、鎖長の長い部分（鎖長１５以上の部分）において分布の割合（％）が高くなっている。これは、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が低いためにアミロペクチンの枝分かれが少なくなり、それに伴って鎖長が長くなってきたものと考えられる。これに対して枝作り酵素ＩＩｂの遺伝子が導入されて、それが発現している形質転換体については、その発現の程度に応じて鎖長の分布が変化していることがわかる。通常であれば、欠失した酵素の遺伝子が導入されたとしても、元の野生型に戻る程度の酵素活性が復元されるのであり、図２６に示される各鎖長の分布の割合（％）の差が０になるところで酵素活性が飽和すると考えられるのであるが、本発明の枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）については、過剰な酵素活性が見出された。即ち、図２６の下段に示されるように、鎖長の短い部分（鎖長が約３〜１２）において野生型（金南風）に比べて分布の割合（％）が極端に高くなっており、鎖長の長い部分（特に、鎖長が１２〜２４の部分）において分布の割合（％）が低くなっている。
【０１５７】
これは、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が、遺伝子の過剰な発現により、その活性が高くなり、アミロペクチンの枝分かれがより促進され、それに伴って鎖長が比較的短くなってきたものと考えられる。
【０１５８】
形質転換体として選抜された６系統について、それらの鎖長分布を解析した結果から、これらの６系統を以下の３グループに分類することができた。これらの３グループを以下のように命名した。これらの型の名称を図２６に示している。
（１）ａｅ型：枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が回復されていない、あるいは、わずかに回復しているタイプ。
・・・形質転換体＃７−８、及び＃９−８
（２）相補型（ＣＯ型）：枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が、ほぼ回復 されたタイプ。
・・・形質転換体＃１０６−１
（３）過剰発現型（ＯＥ型）：導入したＢＥＩＩｂ遺伝子が過剰に発現している タイプ。
・・・形質転換体＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１
【０１５９】
図２６に示される鎖長の分布による前記３グループの分類は、前記した図２３〜図２５におけるＢＥＩＩｂ遺伝子についてのバンドの濃淡としても明瞭に示されている。例えば、図２３においても、形質転換体＃７−８は細いバンドであるが、形質転換体＃１０６−１は少し太いバンドとなり、形質転換体＃３１−１及び＃１１３−７ではかなり太いバンドとなって示されているとおりである。
【０１６０】
これらにことから、形質転換体に導入された枝作り酵素（ＳＢＥ）の遺伝子の発現量と、当該形質転換体が生産するデンプンのアミロペクチンの鎖長の分布とに密接な関連性があることが初めて見出された。
【０１６１】
次に、これらの形質転換体が生産するデンプンの特性を調べた。これらの形質転換イネのデンブンの熱糊化特性及び種子の重量をまとめて次の表８に示す。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
表８に糊化特性として、糊化開始温度Ｔｏ（℃）、糊化ピーク温度Ｔｐ（℃）、糊化終了温度Ｔｃ（℃）、糊化熱量（ｍＪ／ｍｇ）を示す。また、参考例としてイソアミラーゼ（ＩＳＡ）遺伝子が欠損したイネｓｕｇ−１変異体が生産するデンプンの糊化特性を示している。種子重量は、２０粒の平均値をｍｇで示している。
【０１６４】
これらのデンプンの糊化特性の結果は、以下のように分析することができ、前記した鎖長の分布に基づく３グループの結果と密接な関連性があることがわかった。
１）ａｅ型の形質転換イネ系統は、ａｅ変異体と同様の糊化特性を示した。ＢＥＩＩｂ活性がわずかに回復している＃９−８では、やや金南風に近い特性を示した。
２）ＣＯ型の形質転換イネは糊化温度は金南風よりやや高い値を示した。糊化熱量には変化がなかった。
３）ＯＥ型は金南風より糊化温度が低く、その程度は鎖長分布が金南風に対して激しければ糊化温度も低かった。糊化熱量には変化が見られなかった。＃１−１は金南風に比べて糊化温度が１０℃以上も低下しており、糊化熱量も５分の１以下であった。
【０１６５】
以上の結果から、ａｅ変異体の原因酵素がＢＥＩＩｂであることが明確になった。また、形質転換イネの中には過剰発現系統が出現し、それらの糊化特性はｓｕｇ−１変異体と類似しており、ＢＥＩＩｂとイソアミラーゼ（ＩＳＡ）は、アミロペクチンの微細構造に対して相反する効果を示す可能性が示された。
【０１６６】
これらの変異体が製造したデンプンを走査型電子顕微鏡で観察した。これらの６系統の形質転換体及びそれらの親系統の胚乳からデンプン粒を精製し、走査型電子顕微鏡でそれらの形態を観察した。結果を図面に代わる写真により図２７として示す。図２７の上段は１０００倍に拡大した場合を示し、下段は４０００倍に拡大した場合を示している。それぞれの写真の白いバーはスケールを示している。図２７の各段の左からＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、その下段の左から金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１をそれぞれ示している。
【０１６７】
金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）は、幅が約５μｍのほぼ均一な多角形のデンプン粒であるが、ＥＭ１０のデンプン粒は、幅１０μｍを越す大きな粒がところどころに存在し、それ以外の小さな粒は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）よりも小さく、多角形の角が崩れた形をしていた。また、互いの粒が接着し、群をなしていた。このようなＥＭ１０でみられた傾向は＃７−８でも見られ、＃９−８及び＃１０６−１へと緩和される傾向が見られた。ＢＥＩＩｂが過剰発現している系統である＃３１−１は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と非常に類似していたが、＃１１３−７では、多くのデンプン粒は、大きさ、形態は金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）とかわらないものの、わずかに形が崩れ、小さくなった粒も見られた。＃１−１では、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）でみられたようなデンプン粒はごくわずかであり、多くのデンプン粒が崩れて１μｍほどの大きさであり、形も不均一であった。
【０１６８】
さらに、これらの新規なデンプン類のＸ線回折パターンを調べた。これらの６系統の形質転換体のうち、デンプン粒が十分に取れなかった＃１−１を以外と、それらの親系統の胚乳からデンプン粒を精製し、それぞれのＸ線回折パターンを調べた。結果を図２８に示す。図２８の縦軸は強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角度（２θ）を示す。図２８の上からＥＭ１０（Ａ）、＃７−８（Ｂ）、＃９−８（Ｃ）、＃１０６−１（Ｄ）、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）（Ｅ）、＃３１−１（Ｆ）、及び＃１１３−７（Ｇ）をそれぞれ示す。
【０１６９】
これらのデンプン粒のＸ線回折パターンは、大きく分けてＡ形とＢ形に分けられた。一般にデンプン粒のＸ線回折パターンは、禾穀類のデンプンはＡ形を示し、芋類はＢ形を示し、豆類は両者の混合パターンであるＣ形を示す。これは、デンプン分子の結晶中の水分子の挿入位置の違いによるとされている。また、Ｘ線回折パターンのピークの高さは、結晶性の高さを示すとされている。トウモロコシのＢＥＩＩｂ変異体（ａｅ ｍｕｔａｎｔ）は、その野生型がＡ形を示すにも関わらず、Ｂ形を示すことが知られている。
【０１７０】
イネにおいても、ＥＭ１０は典型的なＢ形デンプンのパターンを示した。形質転換体では、ＢＥＩＩｂの発現量が多くなるに従ってＢ形からＡ形のパターンに移行していた。また、過剰発現型の＃３１−１は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と同様のパターン、ピークを示したが、＃１１３−７は、ピークが低くなっており、結晶性の低下が見られた。
【０１７１】
以上のことから、デンプンを生産する生物、好ましくは植物、より好ましくはイネのデンプンの枝作り酵素ＩＩｂの遺伝子の発現量に応じて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造することがわかった。ＢＥＩＩｂ遺伝子の導入により、アミロペクチンの鎖長分布を改変することができることも確認された。これらのデンプンは、構造的にはアミロペクチンの鎖長の分布において元の野生型の生物が生産するデンプンとは明らかに相違するものであり、またその特性、例えば糊化特性においても元の野生型の生物が生産するデンプンとは明らかに相違するものであった。
【０１７２】
また、これらの結果から、元の野生型の生物におけるデンプンの枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子の発現量を変化させることにより、元の野生型の生物が生産するデンプンの形質を改質することができ、ＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の程度によって鎖長を連続的に変化させることができることも明確になった。鎖長分布の変化に伴ってデンプンの糊化特性、デンプン粒の形態、デンプンの結晶性に影響を与えることも明確となり、これらの変化も鎖長分布の変化に連動して連続的であり、このことはＢＥＩＩｂ遺伝子の発現量を調節することにより、好みの物性や結晶性をもったデンプンを創製することができることを示している。
【０１７３】
したがって、本発明は、元の野生型の生物に比べて、デンプン合成に関与する酵素を過剰に発現させる方法を提供するものであり、また、新規な形質の異なるデンプンを生産する有用な変異体生物体、及びそれを製造する方法を提供するものである。
【０１７４】
本発明におけるデンプンを生産する生物としては、デンプン枝作り酵素ＩＩ型を有するものであるが、好ましくは植物、より好ましくは米、ムギ、トウモロコシなどの穀物植物、さらに好ましくはイネが挙げられる。
【０１７５】
本発明のデンプンの枝作り酵素の遺伝子の発現量としては、元の野生型のものに比べて多くても少なくてもよく、目的とするデンプンの形質に応じて適度の発現量を有するものを選択することができる。デンプンのアミロペクチンの枝分かれは、枝作り酵素による枝分かれの促進作用と、イソアミラーゼなどの枝切り分解酵素による枝分かれの抑制作用とのバランスによるものと考えられることから、枝分かれの少ないアミロペクチンはイソアミラーゼなどの枝切り分解酵素の活性化などによっても製造可能であるが、アミロペクチンの枝分かれ構造が適度に多い鎖長の比較的短いものの分布が適度に多いデンプンは、本発明の方法により初めて製造できるものであることから、枝作り酵素の発現量が過剰となる場合がより好ましい。
【０１７６】
本発明におけるデンプンの枝作り酵素の発現量を元の野生型と相違させる手段としては、前記した実験による方法、即ち当該酵素の遺伝子が欠損した変異体に当該酵素の遺伝子を導入し、この形質転換体から発現量の多い又は少ない形質転換体を選別する方法が好ましいが、野生型に当該酵素の遺伝子をさらに導入して過剰発現を誘発する方法など他の手段を採用することも可能である。
【０１７７】
また、本発明におけるデンプンの形質としては、糊化特性や鎖長の分布を例示してきたが、これらに限定されるものではなく、デンプンの枝作り酵素の発現量に応じて変化する形質であれば特に制限はない。
【０１７８】
３．デンプン枝切り酵素イソアミラーゼのプロモーターによる改変
次に、デンプン枝切り酵素イソアミラーゼのプロモーターについて説明する。
【０１７９】
本発明者らは、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）のイソアミラーゼの精製、そのｃＤＮＡ構造にについて報告してきた（Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２０８，２８３−２９３（１９９９））。この報告では全長のｃＤＮＡは明らかにされていないが、このイソアミラーゼの遺伝子がイネの第８染色体に位置していることを明らかにしてきた。
【０１８０】
一方、川崎らは、平均インサートサイズ１５５ｋＢ、７ゲノム相当のイネのゲノム（約４５０ＭＢ／ゲノム）のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリーを完成させ、これを公開してきた（川崎ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５５巻、第７号、４８７（１９９７））。
【０１８１】
そこで、本発明者らは、イネのイソアミラーゼの遺伝子の解析を進め、その結果に基づいてプローブを作成して、イネのＢＡＣライブラリーからイソアミラーゼのプロモーターを得ることに成功した。
【０１８２】
ジャポニカイネ（品種キタアケ）のゲノムを平均インサートサイズ１５５ｋＢのクローンをＢＡＣベクターに組み込んだニトロセルロースメンブレン４枚からなるゲノミックＤＮＡライブラリー（川崎ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５５巻、第７号、４８７（１９９７））を遺伝子の起源として用い、イネイソアミラーゼｃＤＮＡ（Ｆｕｊｉｔａら、１９９９年）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１５１７ｂｐ）をプローブＡ（図２９参照）として、ニトロセルロースメンブレン１枚当たり１２０ｎｇを用いて、ＥＣＬ法でサザンブロッティングを行った。図２９は、イネ（Ｏｓ）のイソアミラーゼ（ＩＳＡ）のｃＤＮＡの＃２６クローン（Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２０８，２８３−２９３（１９９９））の制限酵素地図と本発明で使用したプローブＡ及びプローブＢの位置を示す。プローブＡはＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩの１５１７ｂｐからなる断片であり、プローブＢは同じくＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩからなる６５４ｂｐの断片である。
【０１８３】
その結果、ポジティブに反応する候補クローン２種類（＃５９、＃６０）を単離した（図３０参照）。図３０はイネのＢＡＣライブラリーが転写されている４枚（左からＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの４枚）のニトロセルロースメンブレンを用いて、プローブＡによるサザンハイブリダイゼーションを行った（ＥＣＬ法）結果を示す図面に代わる写真である。図３０の左から２枚目（Ｂ）に２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）が得られた（図３０のＢの矢印）。
【０１８４】
得られた２つのポジティブクローン（＃５９、＃６０）を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で大量増殖し、ＤＮＡ抽出機（クラボー社製）でＢＡＣ ＤＮＡを調製した。精製したＢＡＣ ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩの８種類の制限酵素を用いて、３７℃、６時間加水分解し、アガロースゲルで電気泳動を行った。トランスブロッター（Ｓ＆Ｓ社製）を用いてゲルのＤＮＡをメンブレンに２時間転写し、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社製）でＵＶ照射してＤＮＡをメンブレンに結合させた。メンブレン当たり０．３５ｎｇの、プローブＡを用いて４２℃で一晩、穏やかに浸透させながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたメンブレンを洗浄した後、２×ＳＳＣで室温で浸透しながら洗浄した。現像はアマシャム社のＥＣＬキットを用いて行った。Ｘ線フィルムへの感光時間は５分間であった。プローブＡハイブリダイズさせた２日後、同じメンブレンを用いてプローブＢ（６５４ｂｐ）でも同じ条件でハイブリダイズさせた。
【０１８５】
この結果、２つのクローンともにプローブＡ、Ｂに反応したため（図３１及び図３２参照）、これらがイソアミラーゼ遺伝子を含んでいることがわかった。
【０１８６】
図３１は＃５９と＃６０の２つのポジティブクローンを８種類の制限酵素で切断して、プローブＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３１の左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素で切断した断片を示し、各々の断片は＃５９からのもの（各左側）と＃６０からのもの（各右側）を示している。図３１の左右の数値は断片の長さ（ｋｂ）を示している。
【０１８７】
図３２は、プローブとして図２９に示すプローブＢを用いた点を除き図３１と同様である。
【０１８８】
各断片はいずれも、プローブＡ及びプローブＢと反応していることが示された。
【０１８９】
以上の結果を参考にして、イネイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を作製した。得られたイネイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を図３３に示す。図３３のＡは図２９に示したイネのイソアミラーゼの前記ｃＤＮＡに相当するゲノミックＤＮＡであり、四角で示される部分がエキソン領域を示している。図３３のＢはイネのイソアミラーゼの前記ゲノミックＤＮＡの制限酵素地図を拡大して示している。図３３のＡの左側の点線から左側の四角部分であるエキソンがプローブＢに相当する領域のであり、右側の点線の右側がプローブＡに相当する領域のエキソンである。図３３のＣはクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片を示す。図３３のＣは、断片Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、断片ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、断片Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、断片Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋｂ）、断片ＰＳ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、及び断片Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ）をそれぞれ示す。
【０１９０】
また、ＢＡＣクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片（Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋｂ）、Ｐｓ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ））を０．８％低融点アガロースで電気泳動を行った後に切り出した。タカラ社製のβ−アガラーゼＩを用いて、アガロースを分解した後、マイクロコン１００（ミリポア社製）で、溶媒交換して精製し、０．８５ｆｍｏｌの断片ＤＮＡと、それぞれの制限酵素で切断した後、エビアルカリフォスファターゼ（ロッシュ社製）で脱リン酸化処理したｐＣＡＭＢＩＡプラスミド８．５ｆｍｏｌとともに、ＴＯＹＯＢＯ社製ライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）を用いて、１６℃で、一晩ライゲーション反応を行った。それらをエレクトロポーレーション（ＢＴＸ社製）を用いて、１．２９ＫＶで、ＧＩＢＣＯ社製大腸菌（エレクトロマックス、ＤＨ１０Ｂｃｅｌｌ）を、２５μｌ使用）に導入して形質転換させた。得られた形質転換体を３７℃で、２日間培養した後、ブルーホワイトセレクション法で、白コロニーを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、ＬＢ培地で大量増殖した。ｐＣＡＭＢＩＡプラスミドをキアーゲンプラスミドキット（キアゲン社製）で精製した。
【０１９１】
このようにして得られたサブクローリングしたクローンのうち、ＳＥ断片（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３７０を用いて、ダイジオキシ法で決定した。その結果、この断片はイソアミラーゼ遺伝子のプロモーター、翻訳開始、などを含んでいた。
【０１９２】
この遺伝子からイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターを決定した。これを配列表の配列番号７に示す。
【０１９３】
イソアミラーゼは、デンプンを製造するの枝分かれを分解してゆく酵素であり、生物特有のデンプンを製造するためにデンプン製造時の必要な時期に必要な量だけ発現するように制御されている。したがって、本発明のイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターは、イネ特有のデンプンを製造するために必要なイソアミラーゼの発現を制御するものであり、イネ様のデンプンを製造するに有用となる。例えば、本発明のプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子をイネ以外の生物に導入した場合には、イネと同様なデンプンを製造するために、デンプンの枝切り酵素であるイソアミラーゼが発現され、イネ様のデンプンをイネ以外の生物において製造することが可能となる。また、イネ以外の生物に由来するイソアミラーゼを有したまま、本発明のするプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子をイネ以外の生物に導入した場合には、両者の複合された形態のデンプンを製造できる可能性もある。
【０１９４】
このように本発明のイネのイソアミラーゼのプロモーターは、イネのデンプンを製造するために極めて重要な役割を果たすものであり、イネのデンプンの製造のみならず新規な形態を有するデンプンを製造するために極めて有用である。
【０１９５】
本発明のプロモーターは、配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するものとして得られたが、これらの全部の配列が必要ではなく、イソアミラーゼの発現の制御に関係少ない部分の塩基配列は任意に変更することができる。
【０１９６】
現在のところでは、どの部分がイソアミラーゼの発現の制御に重要であるかということは必ずしも明確に分析されてはいないが、転写開始コドンから上流５００塩基、好ましくは７００塩基〜１０００塩基程度は必要であると考えられる。好ましい、塩基配列としては配列表の配列番号７の２５２１−３２８８までの塩基配列を挙げることが出来るが、これに限定されるものではない。さらに、これらの塩基配列についても、これらの塩基配列が配列表の配列番号７のとおりの塩基配列である必要ではなく、イソアミラーゼの発現の制御に関係少ない部分の塩基配列は任意に変更することができる。
【０１９７】
塩基配列の変更としては、配列表の配列番号７の塩基配列の一部を削除し、また他の塩基配列を付加し、他の塩基配列で置換するな、並びにこれらの組み合わせにより、任意にその塩基配列を変更することができる。変更の手段としては、公知の各種の手段を採用することができる。
【０１９８】
このように変更された塩基配列を有するプロモーターも、前記した本発明のプロモーターと同種の作用効果を有する限りにおいては、本発明のプロモーターに包含されるものである。
【０１９９】
本発明のプロモーターは、イネのイソアミラーゼ遺伝子より分離されたものであるが、イソアミラーゼ遺伝子としてはイネのイソアミラーゼ遺伝子に制限されるものではない。イソアミラーゼ遺伝子は生物種により異なってはいるが、本発明のプロモーターにより発現の制御が可能でる限りにおいて、如何なるイソアミラーゼ遺伝子であってもよい。例えば、本発明のプロモーターをコムギのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入したり、他品種のイネのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することもできる。このように、本発明のプロモーターをイソアミラーゼ遺伝子を有する別の生物にそのプロモーター部分のみを導入することにより、デンプンの枝切り酵素の作用が異なった新規な形態や蓄積法をしたデンプンを得ることも可能となる。
【０２００】
また、本発明のプロモーターを有するイネに他の品種または植物のイソアミラーゼ遺伝子を導入して、イネに新規な形態や蓄積法をしたデンプンを製造させることも可能となる。
したがって、本発明は、本発明のプロモーターを用いて新規な形態（アミロペクチンの構造的な解析、また特性や蓄積場所や味覚などの相違により区別可能なデンプンの形態）のデンプンを製造する方法を提供することが可能となる。本発明の方法による新規なデンプンは、本発明のイネに特有なデンプンを製造するようにイソアミラーゼの発現が制御されたプロモーターと、その下流に位置するイソアミラーゼ遺伝子との組み合わせにより可能となる。
【０２０１】
また、本発明は、本発明のプロモーターとイソアミラーゼ遺伝子が発現に適した形態で配置された遺伝子を提供するものでもある。
【０２０２】
前記で具体的に示してきた本発明のプロモーターはジャポニカ米のプロモーターであり、ジャポニカ米のデンプンを製造に必須のプロモーターである。インディカ米は、ジャポニカ米とは異なる形態のデンプンを製造しており、これは主としてデンプンの枝切り酵素であるイソアミラーゼによるところが大きいと考えられている。勿論、両者のイソアミラーゼ酵素自体の相違によるところも考えられるが、両者のデンプンの形態の相違は、そのプロモーターの相違によるところも多い。このように、本発明のプロモーターを、デンプンの形態が異なる他品種のイネのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することも極めて有用な方法である。さらに、本発明のプロモーターを、イネ以外の生物、好ましくは植物のイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することも考えられる。
【０２０３】
本発明のプロモーターが結合しするイソアミラーゼ遺伝子としては、デンプンの形態が異なる他の品種のイネ、コムギやオオムギなどの他の穀物植物、イモやマメ、トウモロコシなどの雑穀植物などや、デンプンを製造する細菌類や藻類などのイソアミラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０２０４】
さらに、本発明の前記したイソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターが配置されてなる遺伝子を通常の方法によりベクターに組み込むことができ、必要に応じて当該ベクターを用いて適当な細胞を形質転換させることができる。したがって、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターが配置されてなる遺伝子を含有してなるベクター、及びそれにより形質転換された形質転換体を提供するものでもある。形質転換される宿主細胞としては、イネやムギなどの高等植物細胞が好ましいが、これに限定されるものではなく、イソアミラーゼを発現し得る細胞であればよい。
【０２０５】
また、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターを配置してなる遺伝子を用いてイソアミラーゼを発現させる方法を提供する。イソアミラーゼはデンプンの製造に必要となる酵素であるが、デンプンの製造に限定されるものではなく、イソアミラーゼ自体を発現させる方法であれば本発明の方法に包含されるものである。
【０２０６】
前述してきたように、アミロペクチンのクラスター構造の微妙な相違が、デンプンの特性を大きく変化させることから（例えば、イネのジャポニカとインディカの相違を参照されたい。）、本発明のイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターは、イネ特にジャポニカ米に特有なデンプンを製造するに必要なイソアミラーゼの発現を制御できるものであり、これを用いた新品種の創製は新しいデンプンの創製に大きな役割を果たすものである。
【０２０７】
なお、特願２００１−２７３１６６明細書、特願２００１−２７７１０９明細書、特願２００１−２７７１２０明細書、及び、特願２００１−２８７０１０明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【０２０８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０２０９】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）の種子は、独立行政法人農業生物資源研究所（筑波）のジーンバンクから譲り受けた。これらの植物は、初夏に自然の条件下で育成され、成熟種子は使用されるまで４〜８℃で保存された。
【０２１０】
実施例１ アミロペクチンの鎖長分布の分析
アミロペクチンのα−１，４−グルカンの鎖長分布を測定するために、キャピラリー電気泳動による以下の方法により行った。
成熟乾燥種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で磨砕し、αポリグルカンの分子構造解析用試料とした。試料粉末５ｍｇに５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％メタノールを５ｍｌ加え二度洗浄した。沈殿に３００μｌの０．２５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５分間煮沸してデンプンを糊化させた。糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水１．０９ｍｌ、０．６Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）１００μｌ、２％アジ化ナトリウム１５μｌを加えた。Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（３５４単位、生化学工業）６μｌを加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃、２４時間反応させた後、２０分間煮沸し、遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。
蛍光標識及びキャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ５０００，Ｂｅｃｋｍａｎ）は、オーシーアら（Ｏ’Ｓｈｅａ，ｅｔ ａｌ）の方法に準じて行った。プロトコルはｅＣＡＰＮ−リンクドオリゴサッカライドプロファイリングキット（ｅＣＡＰ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いることにより製造業者から提供された。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも３回の別々の測定を行った。
この結果を、表１〜４、並びに図５、図６、及び図２６に示す。
【０２１１】
実施例２ （ＤＳＣによる熱糊化特性の測定）
各々のイネの品種から、ランダムに３粒の種子を選択し、種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で均一化した。粉末をエッペンドロッフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）にいれ、１０５℃で２時間加熱乾燥し、使用するまでデシケーターで保存した。デンプンの糊化特性は示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；ＤＳＣ）（ＤＳＣ−７，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により行った。各々５ｍｇのデンプン試料を銀製のサンプルパンに入れ、４０μｌの脱イオン水と混合し、密封した。サンプルは３℃／分の速度で１０℃〜１２０℃まで昇温させた。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回、殆どの場合は３回の別々の測定を行った。
この結果を表１〜４、表５、及び表８に示す。
【０２１２】
実施例３ （アミロース含有量の測定）
各々のイネの品種から、種子を選択し、種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で均一化した。得られた粉末のアミロース含有量は、アミログラフを用いて測定された。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回別々の測定を行った。
この結果を表１〜４、並びに図７及び図８に示す。
【０２１３】
実施例４ （殼のフェノール色素反応）
粒を室温で１．５％フェノール溶液に３〜６時間浸けた。そして、穏やかに乾燥した。殻の着色を染色された染色されなかったかにかかわらず記録した。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回別々の測定を行った。
この結果を表１〜４に示す。
【０２１４】
実施例５ （ＳＳＩＩａをコードする遺伝子の単離と配列の決定）
日本晴のＳＳＩＩａ遺伝子は、独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含む２種類のＰＡＣクローン（Ｐ４４１，Ｐ４５０）を使用した。また、カサラスのＳＳＩＩａ遺伝子は、同じく独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含むＢＡＣクローンを使用した。
このＰＡＣクローン、及びＢＡＣクローンを種々の制限酵素（ＥｃｏＲ Ｖ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ等）で加水分解した。それぞれの断片を、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋）にサブクローンした後、プラスミドＤＮＡを調製し、それぞれのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
得られた日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を図１３に示す。また、日本晴の塩基配列を配列表の配列番号１に、カサラスの塩基配列を同配列番号２に示す。また、日本晴のエキソン部分の塩基配列を配列表の配列番号３に、カサラスのものを配列番号４にそれぞれ示す。さらに、日本晴のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、カサラスのものを配列番号６にそれぞれ示す。
【０２１５】
実施例６ （日本晴のＳＳＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列の決定）
Ｃａｐ Ｓｉｔｅ ｃＤＮＡ ｄＴ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）をＤＮＡの鋳型として、種々のｃＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応産物をプラスミドにサブクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
【０２１６】
実施例７ （日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子の構造決定）
前記実施例６に記載の方法によって求められたゲノミックＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、ｃＤＮＡの塩基配列を比較する事によって、ＳＳＩＩａ遺伝子のイントロン、エキソンの位置を決定した。
【０２１７】
実施例８
（１）ＢＡＣ ライブラリー
イネゲノムＤＮＡライブラリーとして、イネ品種「シモキタ」のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）を利用した。このＢＡＣライブラリーは、マイクロプレートサイズのメンブレンに固定したもので、ゲノムＤＮＡはシモキタの緑葉のプロトプラストから調製したものであり、平均インサートサイズ１５５ｋｂである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）。
（２）植物形質転換用バイナリーベクター
アグロバクテリウムを介してイネに遺伝子を導入させるバイナリーベクターとしてｐＣＡＭＢＩＡ１３００を用いた。このベクターはＣＡＭＢＩＡ（Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のジェファーソン（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）博士より分与されたものである。また、このベクターは、カナマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を保持しており、それら抗生物質をマーカーとして形質転換体をスクリーニングすることができる。
【０２１８】
実施例９ （ＢＥＩＩｂ遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ断片の単離）
ＢＡＣライブラリーから、イネのＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子をコードするクローンをスクリーニングするために、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをプローブとして用いた。イネ品種フジヒカリのＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、その結果得られた１７４０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動した後、ウルトラフリーＤＡ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でアガロースゲルから抽出、精製した。このＤＮＡ断片を、ＥＣＬダイレクト核酸ラベル化及び検出システム（ＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によりラベルしプローブとして用いた。ラベル化の方法は、付属の説明書にしたがった。以下に述べるハイブリダイゼーションおよびメンブレンの洗浄もこのＥＣＬシステムを利用し、方法は説明書にしたがった。
ＢＡＣライブラリーのメンブレンを上述のＢＥＩＩｂのｃＤＮＡ断片プローブとハイブリダイゼーシヨンさせた結果、プローブとハイブリダイズするシグナルを得た。そのシグナルに対応するプラスミドを保持する大腸菌のクローンを得て、それをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミド自動抽出機（ＰＩ−１００Ｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｕｒａｂｏ）によりプラスミドを抽出した。
前述のようにＢＡＣライブラリーの平均インサートサイズは１５５ｋｂであり、そのような長いＤＮＡ断片には複数の遺伝子が存在することも考えられる。ＢＥＩＩｂ遺伝子がコードされている領域のみを得る必要があることから、ポジティブクローンから得たプラスミドについてサザンブロット解析を行なった。プラスミドを制限酵素ＳａｌＩ（ニッポンジーン）で切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｎｙｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にＤＮＡ断片を転写させた。上述のプローブを用い、ＥＣＬシステムにより、メンブレンとハイブリダイゼーシヨンさせた。その結果、プローブは１７ｋｂのＤＮＡ断片とハイブリダイズした。そのＤＮＡ断片を単離するために、プラスミドをＳａｌＩで切断した後、低融点アガロースゲル（ＮＵＳＩＥＶＥ ＧＴＧ，ＦＭＣ）で電気泳動し、目的の１７ｋｂ断片を含む領域のゲルを切り出し、ｂ−アガラーゼ（ニッポンジーン）によりアガロースを分解し、ＤＮＡ断片を抽出、精製した。
【０２１９】
実施例１０ （ＢＥＩＩｂゲノムＤＮＡ断片のサブクローニングおよび塩基配列の解析）
バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＳａｌＩで切断した後、６５℃、１５分の処理によりＳａｌＩを失活させた。次に、エビアルカリホスファターゼ（ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ））を３７℃、１時間反応させ、ＳａｌＩ切断により生じた５’末端を脱リン酸化させた。続いて、６５℃、１５分の処理によりエビアルカリホスファターゼを失活させた。ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした１７ｋｂのＤＮＡ断片をサブクローニングするために、ＳａｌＩ切断およびエビアルカリホスファターゼ処理したｐＣＡＭＢＩＡ１３００とＴ４ＤＮＡリカーゼ（ニッポンジーン）により１６℃、一晩ライゲーションした後（これをｐＣＢＥＩＩｂとした）、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ）を形質転換した。ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）に生えた大腸菌をＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、クイアゲンプラスミドミディキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））によりプラスミドを抽出、精製した。方法はキットに付属の説明書にしたがった。
このバイナリーベクターにサブクローニングした１７ｋｂＤＮＡ断片の制限酵素地図を決定し、断片化した後、塩基配列を解析した。塩基配列の解析は、既知の方法によった（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｄｙｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎまたはＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ともにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、並びにＡＢＩ ３７３ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いた。得られたデータは、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ バージョン１０．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）により解析した。その結果、１７ｋｂゲノムＤＮＡ断片には、ＢＥＩＩｂ遺伝子の完全長がコードされており、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡの塩基配列との比較により、ＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子は２２エキソン、２１イントロンからなることが明らかになった。
また、このＤＮＡ断片には、遺伝子の上流域が約２．２ｋｂ存在し、プロモーター領域は全て含まれていると考えられた。さらに、下流域は約３ｋｂ存在し、ターミネーター領域は全て含まれると考えられた。そこで、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００サブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をコードする１７ｋｂＤＮＡ断片をイネに導入することにした。
【０２２０】
実施例１１ （ＢＥＩＩｂ遺伝子を導入したイネａｅ変異体の形質転換体の作製）
アグロバクテリウムを介した形質転換法により、上述のバイナリーベクターにサブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をイネａｅ変異体であるＥＭ１０（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６９：２５３−２５７．）に導入し、形質転換体を作製した。イネの組織培養および形質転換は土岐（Ｔｏｋｉ）の方法（Ｔｏｋｉ，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５：１６−２１．）にしたがった。
まず、ｐＣＢＥＩＩｂをエレクトロポレーシヨン法によりアグロバクテリウムツネファシエンスＥＨＡ１０５株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株）に導入した。このアグロバクテリウムをＥＭ１０のカルスに感染させ、ＤＮＡ導入し、形質転換させた。形質転換体は、ハイグロマイシンによりスクリーニングした。植物体に再分化したイネ個体はポットに移植し、温室で、自然光、２８／２４℃（６−１８時／１８−６時）の条件で生育させた。
得られた形質転換体の中から６系統を選別し、これらのサザンブロット解析の結果を図２３に示す。ノーザンブロット解析の結果を図２４に示す。また、ウエスタンブロット／活性染色法による解析の結果を図２５に示す。
さらに、これらの形質転換イネのアミロペクチンの分子構造について、それらの鎖長分布解析の結果を図２６にグラフ化して示す。これらの形質転換イネのデンブンの熱糊化特性及び種子重量を表８に示す。
【０２２１】
実施例１２ （プローブＡを用いたＢＡＣライブラリーのメンブレン上でのハイブリダイゼーション）
平均インサートサイズ１５５ｋＢのクローンが転写されたジャポニカイネ（品種キタアケ）のゲノミックＤＮＡのＢＡＣライブラリーのメンブレン４枚について、イネイソアミラーゼｃＤＮＡ（Ｆｕｊｉｔａら、１９９９年）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１５１７ｂｐ）をプローブＡ（図２９参照）として、ニトロセルロースメンブレン１枚当たり１２０ｎｇを用いて、ＥＣＬ法でサザンブロッティングを行った。ＥＣＬ法によるサガンブロッティングは、アマシャム社のマニュアルに従った。その結果、ポジティブに反応する候補クローン２種類（＃５９、＃６０）を単離した。
結果を図３０に示す。図３０の左から２枚目（Ｂ）に２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）（図３０中の矢印）が見られた。
【０２２２】
実施例１３ （ＢＡＣクローンのノーザンブロッティング）
実施例１２で得られた２つのポジティブクローン（＃５９、＃６０）を、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で大量増殖し、ＤＮＡ抽出機（クラボー社製）でＢＡＣ ＤＮＡを調製した。
０．５μｇ相当の精製ＢＡＣ ＤＮＡを８種類の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ）を用いて、３７℃、６時間加水分解し、０．７％アガロースゲルで電気泳動を行った。トランスブロッター（Ｓ＆Ｓ社製）を用いてゲルのＤＮＡをメンブレンに２時間転写（転写液は２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０））、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社製）で３０秒間ＵＶ照射してＤＮＡをメンブレンに結合させた。
メンブレン当たり０．３５ｎｇのプローブＡを用いて４２℃で一晩、穏やかに浸透させながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション用バッファー及びプローブのラベリング試薬はアマシャム社のＥＣＬキットに従って行った。ハイブリダイズさせたメンブレンは、プライマリー洗浄緩衝液（Ｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｕｒｅａ＋）（６Ｍ 尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ））で４２℃で２５分２回洗浄した後、２×ＳＳＣで室温で５分２回浸透しながら洗浄した。現像はアマシャム社のＥＣＬキットを用いて行った。Ｘ線フィルムへの感光時間は５分間であった。結果を図３１に示す。
プローブＡでハイブリダイズさせた２日後、同じメンブレンを用いてプローブＢ（６５４ｂｐ）でも同じ条件でハイブリダイズさせた。結果を図３２に示す。
２つのクローンともにプローブＡ、Ｂに反応したため（図３１及び図３２参照）、これらがイソアミラーゼ遺伝子を含んでいることがわかった。
実施例１３の結果に基づいて、イネのイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を作製した。イネのイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を図３３のＢに示す。
【０２２３】
実施例１４ （ＢＡＣクローン＃６０のサブクローニング）
ＢＡＣクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片（Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋ）、ＰＳ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ））を０．８％低融点アガロースで電気泳動を行った後に切り出した。
タカラ社製のβ−アガラーゼＩを用いて、アガロースを分解した後、マイクロコン１００（ミリポア社製）で、溶媒交換して精製し、０．８５ｆｍｏｌの断片ＤＮＡとそれぞれの制限酵素で切断した後、エビアルカリフォスファターゼ（ロッシュ社製）で脱リン酸化処理したｐＣＡＭＢＩＡプラスミド８．５ｆｍｏｌとともに、ＴＯＹＯＢＯ社製ライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）を用いて１６℃で、一晩ライゲーション反応を行った。それらをエレクトロポーレーション（ＢＴＸ社製）を用いて１．２９ｋＶでＧＩＢＣＯ社製大腸菌（エレクトロマックスＤＨ１０Ｂ細胞を２５μｌ使用）に導入して形質転換させた。エレクトロポーレーションには２ｍｍのスリットの入ったキュッベットを用い、プレカルチャーを５０分行った後、４％Ｘ−ｇａｌを３０μｌ、０．１Ｍ ＩＰＴＧを２５μｌ塗布したシャーレに菌を播いて３７℃で２日間培養した。
ブルーホワイトセレクション法で白コロニーを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で大量増殖した。ｐＣＡＭＢＩＡプラスミドをキアゲンプラスミドキット（キアゲン社製）で精製した。プラスミドの精製法はキアゲンキットのマニュアルの方法で行った。
【０２２４】
実施例１５ （サブクローンのシーケンス）
実施例１４でサブクローリングしたクローンのうち、ＳＥ断片（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３７０を用いて、ジデオキシ法で決定した。シーケンス反応は、ＡＢＩ社製のダイターミネーターキットを用いて行った。その結果、この断片はイソアミラーゼ遺伝子のプロモーター、翻訳開始点などを含んでいた。
得られた本発明のイネのイソアミラーゼのプロモーター部分の塩基配列を配列番号７に示す。
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明は、植物のデンプン合成酵素系における酵素を遺伝子工学的に改変することにより、新規なデンプンを製造する方法、そのための遺伝子、その形質転換体、それのより製造された新規デンプンを提供するものである。デンプンは食糧として重要であるだけでなく、その糊化特性などの物性を利用した産業原料としても重要であり、本発明により提供されるデンプンは食品類のみならず、産業原料としても重要なものである。
【０２２６】
より詳細には、本発明は、イネのデンプンにおけるアミロペクチンの微細構造と、デンプンの物性や味などの性質との相関関係を見出し、アミロペクチンのα−１，４−グリシド鎖の鎖長分布に基づいて世界中で栽培されているイネをＬ−タイプ、Ｓ−タイプ、及びこれらの中間であるＭ−タイプに分類されることを見出した。そして、これらのアミロペクチンの微細構造の違いがデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）の活性によるものであることを明らかにし、各タイプのＳＳＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造及び塩基配列を決定した。
【０２２７】
本発明の遺伝子を用いることにより、目的とするアミロペクチンの微細構造を有するデンプンを製造することができ、目的に応じた物性を有するデンプンを製造することが可能となる。また、本発明の遺伝子の構造や塩基配列に基づいてイネのＳＳＩＩａ遺伝子を改変することにより、有用なデンプンを産生するＳＳＩＩａ遺伝子が改変されたイネを提供することができ、また天然のイネとは異なる鎖長分布や物性を有する新規なデンプンを製造することが可能となり、食品や各種の産業用として新規な有用なデンプンを大量に供給することが可能となる。
【０２２８】
また、本発明は、デンプンの生産に関与している酵素の遺伝子の発現量の相違に基づいて、生産されるデンプンの形質が異なってくることを見出したものであり、また導入した酵素の遺伝子が元の野生型よりも過剰に発現することがあることも本発明により初めて見出されたものである。
【０２２９】
本発明は、このような新規な知見に基づいてデンプン合成酵素を天然のものよりも過剰に発現させる方法、デンプン合成酵素を天然のものとは異なる量発現する変異体、及びその製造方法を提供するものである。
【０２３０】
本発明によれば、現存する生物の生産するデンプンを、デンプン合成酵素、好ましくはデンプンの枝作り酵素が過剰又は不足した系を生物体の中に実現することができ、それにより、元のデンプンとは形質の異なる新たな形質を有するデンプンを任意に製造することができるようになる。
【０２３１】
さらに、本発明は、イネ、より具体的にはジャポニカ米に特有なデンプンを製造するために必要なイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターに関するものであり、イソアミラーゼの発現をジャポニカ米に特有なデンプンを製造するために必要なように制御し得るものである。本発明のプロモーターにより、デンプンの主成分であるアミロペクチンの形態をイネのデンプンの形態に制御することが可能となり、各種の生物に本発明のプロモーターを適用することにより、デンプン合成に関与する酵素遺伝子を本プロモーターに連結することでよって、イネなどの植物の胚乳に、天然には存在しない新規な物性、品質を持つデンプンを多量に合成、蓄積させることが可能となる。また、本発明のプロモーターを有するイネに、他の生物に由来するイソアミラーゼ遺伝子を本発明のプロモーターに連結することによって、導入遺伝子産物をイネの胚乳などに、多量に蓄積させることが可能である。
このように、本発明は、生物、好ましくは植物などのデンプンを生成する生物のデンプンの製造を制御可能にするものであり、新しいデンプンの合成や蓄積手段を提供できるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】図１は、生物における貯蔵性ポリグルカンの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造を示すものである。
【図３】図３は、イネ胚乳におけるジャポニカとインディカとのアミロペクチンのクラスター構造の相違を示すものである。
【図４】図４は、生物における貯蔵性ポリグルカンである、アミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの生合成経路の概要を示すものである。
【図５】図５は、ジャポニカの＃１４３とインディカの＃３０３についての鎖長分布を分析した結果を示すものである。図５の上段の図（図５Ａ）は各々の鎖長の分布を示し、横軸は鎖長（α−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を示し、縦軸は頻度（モル％）を示す。白抜きはジャポニカ（＃１４３）を示し、黒塗りはインディカ（＃３０３）を示す。図５の下の図（図５Ｂ）は、各々の鎖長におけるジャポニカ（＃１４３）の頻度からインディカ（＃３０３）の頻度を引いた（＃１４３−＃３０３）差を頻度（％）として示している。
【図６】図６は、いくつかの種類のイネについてインディカ（＃３０３）との鎖長の分布の差を図５Ｂと同様にして分析した結果を示すものである。図６は左側の上から＃１０３との差、＃２３４との差、＃３１０との差、及び＃４０９との差を示し、右側は＃２１５との差、＃２０２との差、＃３０２との差、及び＃４０８との差をそれぞれ示す。
【図７】図７は、今回調査した１２９品種について算出されたＡＣＲの値におけるヒストグラムを示している。横軸はＡＣＲの値を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【図８】図８は、今回調査した各種類のイネについて図７と同様にヒストグラム化したものである。図８に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は４７）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３４）、左下はインディカのものであり（個数は２３）、右下は中国のインディカのものである（個数は２５）。
【図９】図９は、アミロペクチンの微細構造とデンプンの熱特性の相関を示す相関図である。図９の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はアミロペクチンのＤＰが１０以下の量の比（ＡＣＲ）を示している。図９の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【図１０】図１０は、は今回調査した１２９品種のうちの１００品種についてのアミロース含有量のヒストグラムを示している。横軸はアミロース含有量（全デンプンに対する割合（％））を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【図１１】図１１は、今回調査した各種類のイネについて図１０と同様にヒストグラム化したものである。図１１に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３８）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は２５）、左下はインディカのものであり（個数は１９）、右下は中国のインディカのものである（個数は１８）。
【図１２】図１２は、デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度との相関を示す相関図である。図１２の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はデンプンのアミロース含有率（％）を示している。図１２の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【図１３】図１３は、本発明の日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を示すものである。図１３の四角枠はエキソン領域を示し、四角枠の間はイントロンを示す。それぞれの番号は、エキソン及びイントロンの順序を示している。図１３中のアスタリスクは、アミノ酸が変わる部分を示している。図１３には併せて制限酵素による切断位置を示す。
【図１４】図１４〜図１８は、日本晴（５９３５ｂｐ）とカサラス（５９２８ｂｐ）のゲノムＳＳＩＩａ遺伝子の全配列の比較して示すものである。図１４〜図１８の各図の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。このうちプロモーター部分は日本晴では１〜１，３４１番目までであり、カサラスでは１〜１，３３１番目までである。図１４はこのうちの１番目〜１２６０番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１５】図１５はこのうちの１２６１番目〜２５２０番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１６】図１６はこのうちの２５２１番目〜３７７９番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１７】図１７はこのうちの３７８０番目〜５０３７番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１８】図１８はこのうちの５０３８番目〜５９３５番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１９】図１９〜図２０は、日本晴とカサラスのそれぞれのエキソン部分の塩基配列（２６０７ｂｐ）の比較を示すものである。図１９〜図２０の各図の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものであり、転写開始点を１番にしている。図１９はこのうちの１番目〜１２６０番目までの比較を示している。
【図２０】図２０はこのうちの１２６１番目〜２６０７番目までの比較を示している。
【図２１】図２１は、日本晴とカサラスのＳＳＩＩａのアミノ酸配列の比較を示すものである。図２１の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。
【図２２】図２２は、各品種が製造するデンプン（アミロペクチン）のＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を測定した結果を示したものである。図２２の上段は品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）のものであり、中段は品種ＩＲ３６のものであり、下段は形質転換体＃７８−１のものである。中段及び下段の右側は、各品種の品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）との差を示している。即ち、中段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と品種ＩＲ３６との差を示したものであり、下段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と形質転換体＃７８−１との差を示したものである。
【図２３】図２３は、本発明の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８についてサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２３は左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８の各レーンを示し、図２３の上段の（ａ）はＢａｍＨＩを用いた場合であり、下段の（ｂ）はＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合である。
【図２４】図２４は、本発明の形質転換体についてノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２４の左から、「金南風」、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８、ひとつ間を置いて、＃１−１、＃２−６、及び＃９−８の各レーンを示し、縦方向はデンプンを製造する際の各デンプン合成酵素を示す。ＢＥＩはデンプン枝分かれ酵素Ｉを、ＢＥＩＩａはデンプン枝分かれ酵素ＩＩａを、ＳＳＩはデンプン合成酵素Ｉを、ＳＳＩＩＩはデンプン合成酵素ＩＩＩを、ＩＳＡはイソアミラーゼを、ＰＵＬはプルラナーゼを、それぞれ示している。最下段はｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を示す。
【図２５】図２５は、本発明の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８及び＃１−１についてウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）／活性染色法による解析（図２５上段）、及びネイティブ−ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色法による解析（図２５下段）を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２５の上段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１の各レーンを示し、縦方向はＢＥＩ及びＢＥＩＩｂのブロットを示す。図２５の下段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、ａｅ変異型、相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）、過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）を示し、縦方向はＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ、及びＢＥＩをそれぞれ示す。
【図２６】図２６は、本発明の形質転換体及びａｅ変異体のＥＭ１０について、アミロペクチンの鎖長の分布を野生型（金南風）の鎖長分布を比較した結果を示すグラフである。図２６の横軸は鎖長の長さを１〜６０まで示しており、図２６の縦軸は各鎖長における野生型（金南風）との鎖長分布の割合（％）の差を示している。図２６の上段は、ＥＭ１０（黒丸印−●−）、形質転換体の相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）（＃１０６−５）（白丸印−○−）、並びにａｅ変異型（＃７−８）（黒三角印−▲−）及びａｅ変異型（＃９−８）（黒四角印−■−）についてのものであり、図２６の下段は、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃３１−１）（黒丸印−●−）、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１１３−７）（黒四角印−■−）、及び形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１−１）（黒三角印−▲−）についてのものである。
【図２７】図２７は、本発明の新規なデンプンを走査型電子顕微鏡でそれらの形態を観察した結果を示す図面に代わる写真である。図２７の上段は１０００倍に拡大した場合を示し、下段は４０００倍に拡大した場合を示している。それぞれの写真の白いバーはスケールを示している。図２７の各段の左からＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、その下段の左から金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１をそれぞれ示している。
【図２８】図２８は、本発明の新規なデンプンをＸ線回折パターンを調べた結果を示す。図２８の縦軸は強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角度（２θ）を示す。図２８の上からＥＭ１０（Ａ）、＃７−８（Ｂ）、＃９−８（Ｃ）、＃１０６−１（Ｄ）、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）（Ｅ）、＃３１−１（Ｆ）、及び＃１１３−７（Ｇ）をそれぞれ示す。
【図２９】図２９は、イネのイソアミラーゼｃＤＮＡの＃２６クローンの制限酵素地図と、その下段の本発明の方法で用いたプローブＡ及びプローブＢの位置を示すものである。
【図３０】図３０は、イネ（キタアケ）のＢＡＣライブラリーが転写されている４枚のメンブレンシートを用いて、プローブＡによりサザンハイブリダイゼーション（ＥＣＬ法）を行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｎｏ．２のシートに２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）が得られた（図中の矢印）。
【図３１】図３１は、ポジティブクローン＃５９及び＃６０を８種類の制限酵素で切断し、プローブＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌ、ＳａｌＩ、Ｓｐｅｌ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素を示し、各酵素の左側のレーンはクローン＃５９を、右側はクローン＃６０を示す。縦軸は塩基長を示す。
【図３２】図３２は、ポジティブクローン＃５９及び＃６０を８種類の制限酵素で切断し、プローブＢを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌ、ＳａｌＩ、Ｓｐｅｌ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素を示し、各酵素の左側のレーンはクローン＃５９を、右側はクローン＃６０を示す。縦軸は塩基長を示す。
【図３３】図３３は、本発明の結果から示されるイネのイソアミラーゼのゲノミックＤＮＡを模式的に示したものであり（図３３のＡ）、四角で囲った部分はエキソンをしめす。図３３の中段のＢは、その制限酵素地図を拡大して示したものである。図３３下段のＣは、クローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた各種のサブクローンの領域を模式的に示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物デンプンを改変する方法、植物デンプンを合成する酵素系を遺伝子工学的に改造した酵素系によりデンプン特性の異なる新規なデンプンを製造する方法に関する。
【０００２】
本発明は、植物のデンプンを合成する酵素群である、デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））、デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））、及びデンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））の遺伝子工学的な改変によるデンプン特性の異なる新規なデンプンを製造する方法、そのための酵素類、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００３】
詳細には、本発明は、デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））のサブタイプのひとつであるスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。本発明者らは、イネの種類に応じたデンプンの構造や物性の相違がイネのデンプン合成構成酵素のひとつであるスターチシンターゼＩＩａに起因していることを解明し、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造を解明したことによるものである。より詳細には、本発明は、ジャポニカの例として日本晴（品種名）を、そしてインディカの例としてカサラス（品種名）を用いて、その各々のスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造を比較することにより、その構造上の相違とデンプンの構造や物性の相違との相関関係を明らかにし、この関連性を利用してイネが産生するデンプンの構造や物性を改変させる方法、そのための遺伝子が改変されたイネ、またイネのスターチシンターゼＩＩａに特異的な塩基配列を有する遺伝子断片を用いてイネの種類を検出又は同定する方法を提供するものである。
【０００４】
また、本発明は、デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））に関する。生体においては、通常は代謝反応ネットワークにおけるある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例である。本発明者らは、生体において特定の酵素が過剰に発現する系を見出した。即ち、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素（ＳＢＥ）の１種を過剰に発現させる方法、当該酵素の発現量がもとの野生型とは異なる変異体、及びその製造方法に関する。本発明は、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法、その方法で製造された形質の異なるデンプン、及び当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。
【０００５】
さらに、本発明はデンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））のプロモーターに関する。本発明は、デンプンのアミロペクチンの生合成の重要な役割を果たしているイソアミラーゼの遺伝子を発現させるための新規なプロモーターを提供するものである。より詳細には、本発明は、イソアミラーゼ発現用のイネ由来の新規なプロモーターに関する。また、本発明は、これらのプロモーターを含有するベクター、形質転換体、及びイソアミラーゼの発現方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
米は穀物植物として全世界で広く栽培され、世界の人口の約１／３は米食によっている。米は栽培される地域により物理化学的な特性が異なっていることはよく知られている。そして、米の味覚は米のデンプンの質に大きく依存しており、各地域によりその地域に応じた米の種類が選択されてきた。
【０００７】
米の栽培品種としては、オリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）とグラベリマステウド（ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ Ｓｔｅｕｄ）の２種類がある。前者はアジアで栽培され熱帯、亜熱帯及び温帯地域に広く分布しているが、後者は西アフリカ地域に極限されている。
【０００８】
雑種の花粉の不捻における遺伝学的分析に基づいて、加藤らはオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）をジャポニカ（ｊａｐｏｎｉｃａ）とインディカ（ｉｎｄｉｃａ）に分類した（Ｓ．Ｋａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐ．Ｂｕｌ．Ｆａｋ．Ｔｅｒｋｕｌｔ，Ｋｙｕｓｈｕ Ｉｒａｐｅｒ．Ｕｎｉｖ．１９２８，３，１３２−１４７．）。また、森永（Ｔ．Ｍｏｒｉｎａｇａ．，Ｉｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｒｉｃｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ａ ｓｅｐａｒａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．）１９５４，４，１−１４．）及びチャング（Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １９７６，２５，４２５−４４１．）は、インディカ（ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ（ｊａｐｏｎｉｃａ）及びジャバニカ（ｊａｖａｎｉｃａ）の３種に分類することを提唱した。
【０００９】
このようにオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（以下、イネという。）の分類については種々の意見が提案され、遺伝学的な分析やイネの種子に含まれているデンプンや脂質の違いなどに基づくイネの分類が報告されてきている。本明細書においては、エステラーゼのアイソザイムの分析、並びに生理学的及び生化学的特性からイネをインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）及び中国インディカ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｄｉｃａ）、並びに、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）及び熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）の４種に分類することにする。
【００１０】
イネの味覚は主としてそのデンプンによるものであり、ジャポニカのねっとりとした味覚や、インディカのパサパサとした味覚は、それらのデンプンの質の相違によるものであることがわかってきている。また、デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
【００１１】
そもそもデンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、これは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
【００１２】
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、植物の種類や品種によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの微細な化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
【００１３】
デンプンは主としてアミロース（Ａｍｙｌｏｓｅ）とアミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）からできているものであり、これらによって植物のデンプン粒が形成さているが、デンプン粒の形成にはアミロースは必須ではないとされている。
【００１４】
アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がり、少量のα−１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０−８０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα−１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。アミロペクチンのこの特徴的な構造は”クラスター”構造と呼ばれている。
【００１５】
また、動物やバクテリアの貯蔵エネルギーであるグリコーゲン（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）もデンプンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、アミロペクチンのようなクラスター構造は持っておらず、グリコーゲンは”ｔｒｅｅ ｌｉｋｅ”や”ｂｕｓｈ ｌｉｋｅ”構造と呼ばれる不規則な枝分かれ構造であると報告されている。
【００１６】
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
【００１７】
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα−１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
【００１８】
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類や品種によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカと、パサパサとしたデンプンを有するインディカのアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
【００１９】
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。アミロペクチンは次の４つのクラスの酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））
である。
【００２０】
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。デンプン合成酵素（以下、ＳＳと略す。）は、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα−１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、デンプン枝作り酵素（以下、ＳＢＥと略す）は、アミロペクチンのα−１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
【００２１】
図４にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの合成過程をまとめた。図４の左側のグリコーゲンの合成は主として動物や細菌類の場合であり、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。図４の中側は、高等植物の場合のアミロペクチンの合成過程を示すものであり、図中のＳＳＳは水溶性ＳＳのことである。図４の右側は高等植物におけるアミロースの合成過程を示すものであり、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素Ｉ（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅＩ（ＧＢＳＳＩ））のことである。
【００２２】
このように、高等植物においては、前記した４種類の酵素群により植物の種類に応じたアミロペクチンを産生している。そして、植物の種類によるアミロペクチンの構造の相違は、これらの酵素の種類の違いによるところが大きいと考えられる。
【００２３】
デンプン合成酵素（ＳＳ）には、図４に示されるように３種類のサブタイプが知られており、それぞれスターチシンターゼＩ（ＳＳＩと略す。）、スターチシンターゼＩＩ（ＳＳＩＩと略す。）、及びスターチシンターゼＩＩＩ（ＳＳＩＩＩと略す。）と呼ばれている。ＳＳＩＩａはスターチシンターゼＩＩ（ＳＳＩＩ）のさらにサブタイプである。
【００２４】
一般にイネの胚乳における各スターチシンターゼのサブタイプの含有率は、全スターチシンターゼの約７０％がＳＳＩであり、約２５％がＳＳＩＩＩであり、残りの約５％がそれ以外のＳＳ（ＳＳＩＩａを含む）であるとされており、アミロペクチンのα−１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳＩＩＩにより形成されるものであると考えられていた。
【００２５】
ＳＳはアミロペクチンの鎖を伸ばす酵素であり、アミロペクチンにおけるα−１，４−グルコシド鎖のα−１，４−グルコースの数（以下、ＤＰと略す。）と深く係わっていると考えられている。本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告（Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓａｔｏｈ，Ｋ．Ｔｅｒａｓｈｉｍａ．，Ｓｔａｒｃｈ，１９９９，５１，５８−６２．；Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｉｎａｂａ，Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｗａ，Ｔ．Ｎａｇａｍｉｎｅ．，Ｓｔａｒｃｈ ２００２，５４，１１７−１３１；Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙａｎｏ，Ａ．Ｓｈｏｍｕｒａ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００２，１０４，１−８）してきており、α−１，４−グルコースの数（ＤＰ）がＳＳの活性と関係していると考えられているが、その詳細は不明であった。
【００２６】
また、デンプン枝作り酵素（ＳＢＥ）は、デンプンやグリコーゲンのα−１，６グリコシル結合を作成する唯一の酵素で、本酵素の働きによってグルコース分子を無数に結合した巨大分子、即ちデンプンの主成分であるアミロペクチンやグリコーゲンが形成される。一方、植物細胞で合成されるアミロペクチンと動物やバクテリアで生産されるグリコーゲンでは、高分子内における分岐様式が大きく異なっている。グリコーゲンでは、前者ではα−１，６分岐結合が分子全体にランダムに形成されるのに対し、アミロペクチンでは、分岐構造が規則性を持って形成されるために、単位構造（クラスターと呼ばれる）が多数タンデム状に連結した構造を示す。この構造の違いが、両者の物性の大きな違いを生む原因となっている。植物のアミロベクチン特有の分岐構造には、ＳＢＥの働きが関与している。
【００２７】
植物のＳＢＥには大きく、ＢＥＩ型とＢＥＩＩ型の２つのサブタイプが存在するが、両タイプの機能の違いはまだ十分には解明されていない。
【００２８】
さらに、従来、ＳＳとＳＢＥがアミロペクチンの枝の頻度を決め、クラスター構造を形成するのに重要な役割を果たしているのではないかと考えられてきた。即ち、前記したデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）はクラスターの形成に必要ない酵素であると考えられていた。しかし、この分解酵素が欠損した植物ではアミロペクチンのクラスターを形成することができないことが明らかにされ、ＤＢＥがクラスター構造の形成に不可欠であることを示すことが報告されている（Ｍ．Ｇ．Ｊａｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９５）７，４１７−４２９；Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，（１９９７）１２（１），１４３−１５３；Ａ．Ｋｕｂｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．，（１９９９）１２１，３９９−４０９）。
【００２９】
ＤＢＥについてのこれらの報告から、アミロペクチンにおけるクラスター構造の形成は、ＳＳとＳＢＥによる新たな結合の形成だけなく、ＳＢＥにより余分に形成された枝分かれを、ＤＢＥにより分解してクラスター構造が規則正しく維持されることが分かってきた。
α−１，６グルコシド結合の枝を分解するＤＢＥは、基質の違いから２種類のものが知られている。そのひとつはイソアミラーゼ（Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）であり、他のひとつがプルラナーゼ（Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ（また、Ｒ−ｅｎｚｙｍｅやｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎａｓｅと呼ばれることもある））である。これらの２種類のＤＢＥのうちイソアミラーゼは、グリコーゲンやフィトグリコーゲン（ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）のα−１，６グルコシド結合の枝を分解することが出来るが、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）には作用しない。一方、プルラナーゼはプルランには作用するが、グリコーゲンやフィトグリコーゲンには作用しない。
【００３０】
デンプンのクラスター構造を形成させるのに重要な存在であるイソアミラーゼは植物の種類により微妙に異なっているものと推測され、各植物固有のアミロペクチンを形成するものと推測される。また、枝切り酵素のイソアミラーゼが必要なときに必要な量だけ発現させるように、イソアミラーゼの発現の時期や量を制御しているプロモーターも植物に固有のものと考えられ、このような制御により植物固有のアミロペクチンが産生ものと考えられている。
【００３１】
例えば、ジャポニカ米のイソアミラーゼのプロモーターをインディカ米のイソアミラーゼのプロモーターとして導入することにより、イソアミラーゼの発現がジャポニカ米のアミロペクチンの合成時と同じように制御され、枝切り酵素自体はインディカ米のイソアミラーゼであるが、その発現はジャポニカ米のイソアミラーゼの発現と同様に制御され、ジャポニカ米のデンプンとインディカ米のデンプンとのミックスされたデンプンを作る植物体を得ることができるようになるかもしれない。また、イソアミラーゼが同じであるなら、別の植物のプロモーターを導入することによりもとの植物と同様なデンプンをその植物に産生させることができるようになるかもしれない。例えば、耐寒性のあるイネに、おいしいデンプンを作るイネのプロモーターを導入することにより、耐寒性でおいしいデンプンを作るイネを作出することができるかもしれない。
【００３２】
このように、イソアミラーゼのプロモーターは、イソアミラーゼ自体と同様に植物が植物固有のデンプンを作るためのキーとなっているものであり、イソアミラーゼのプロモーターを単離、同定することは、そのメカニズムの解明や植物の改変のみならず、新種のデンプンを創出ということも重要である。
【００３３】
本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告してきた（Ｔ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓａｔｏｈ，Ｋ．Ｔｅｒａｓｈｉｍａ．，Ｓｔａｒｃｈ，１９９９，５１，５８−６２．；Ｔ，Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙａｎｏ，Ａ．Ｓｈｏｍｕｒａ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００２，１０４，１−８）。
【００３４】
本発明者らは、本明細書に記載しているようにさらに各種のイネについてアミロペクチンの微細構造を比較検討し、その原因となる遺伝子を見出した。即ち、本発明者らは、これらのアミロペクチンの微細構造の相違の原因となっている遺伝子が、スターチシンターゼＩＩａ（以下、ＳＳＩＩａと略す。）の遺伝子と同じ位置である第６染色体上にちょうど位置していることを見出した。このことはアミロペクチンのＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）が１０以下という短いα−１，４−グルコシド鎖を伸長して長い鎖を形成することに、ＳＳＩＩａが極めて重要な役割を果たしていることを示している。
【００３５】
従来、アミロペクチンのα−１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳＩＩＩにより形成されるものであると考えられていたのであるが、ジャポニカとインディカのアミロペクチンの微細な構造上の相違がＳＳＩＩ、特にＳＳＩＩａの機能の相違に起因していたとする本発明者らの知見は驚くべきことである。
【００３６】
そして、本発明者らは、インディカ米カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）とジャポニカ米日本晴のアミロペクチンの構造の相違を検討し、その構造の相違がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）によるものであるものであることを解明し、そして、インディカ米Ｋａｓａｌａｔｈとジャポニカ米日本晴のＳＳＩＩａ遺伝子の全塩基配列を決定した。両遺伝子構造の違いがＳＳＩＩａの活性の強弱に影響し、その結果アミロペクチンの構造の違いを生じると考えられる。
【００３７】
イネのＳＳＩＩａはアミロペクチンの側鎖の伸長に関わっている。この酵素の強弱がアミロペクチンの側鎖の長短に影響し、これによりデンプンの物性や味が劇的に変化する。その原因が今回明らかにされた塩基配列に起因しており、今後、変異部分の改変により、側鎖の長さを自由に改変させ、新規デンプン形質を作成することができることになる。
【００３８】
また、イネのデンプン枝作り酵素（ＳＢＥ）にはＢＥＩ、ＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂの３つのアイゾザイムが存在すると考えられている。本発明者らによるＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損したａｅ変異体（ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｅｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）の変異体）の解析から、ＢＥＩＩｂの機能が明らかになりつつある（Ａ．Ｎｉｓｈｉ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．Ｔａｎａｋａ ａｎｄ Ｈ．Ｓａｔｏｈ，（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２７，４５９−４７２）。即ち、本発明者らは、当該ａｅ変異体にＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換し、デンプンの性質が野生型に回復するかを検証することで、ＢＥＩＩｂの特異的な機能を明らかにし、同時に、形質転換イネにおいて、導入したＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の強弱によって、さまざまな性質を示す新形質デンプンが出来る事を初めて明らかにした。通常代謝反応ネットワークにおいては、ある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例である。それに対して本発明の場合には、ＢＥＩＩｂの活性に応じて、全く性質の異なるデンプンが生産されるようになることを本発明者らは初めて見出した。本発明の過剰発現によるＢＥＩＩｂ遺伝子の制御によって酵素の活性をさまざまなレベルに変動させ、多様なデンプンを生産する方法が初めて明らかにされた。
【００３９】
即ち、本発明者らは、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入することにより、当該酵素の発現量が変化することを見出した。また、当該酵素の発現量に応じて形質の異なるデンプンが生産されることも見出した。より詳細には、イネのＢＥＩＩｂの遺伝子が欠損したａｅ変異体にＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換することにより、形質転換イネにおいて、導入したＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の強弱によって、さまざまな性質を示す新形質のデンプンを生産することができる新規な変異体が生成することを見出した。通常の代謝反応ネットワークにおいては、ある酵素の効果は、一定量以上になるとほとんどあるいは全く変化しないのが通例であるが、それに対して本発明では、導入した遺伝子が野生型とは当該酵素の発現量を異にし、それに応じてＢＥＩＩｂの活性が異なることから、元の野生型が生産するデンプンとは全く性質の異なるデンプンが生産されるようになることは驚くべきことである。
【００４０】
さらに、本発明者らは、イネ、特にジャポニカ米におけるイソアミラーゼのプロモーターを見出した。
【００４１】
本発明は、植物のデンプン合成酵素系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子工学的に改変して、野生型の植物が製造するデンプンとは異なる特性を有する新規なデンプンを製造する方法を提供するものである。即ち、本発明は、植物が生産するデンプンの形質を改質する方法、元の野生型とは形質が異なるデンプンを製造する方法、及び形質が改変されたデンプンを提供するものである。
【００４２】
詳細には、本発明は、第一にデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）に関するものであり、第二にデンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）に関するものであり、第三にデンプン枝切り酵素の１種であるイソアミラーゼのプロモーターに関するものである。
【００４３】
より詳細には、本発明は、インディカ米、ジャポニカ米のアミロペクチンの鎖長分布や、デンプンの物性や味に影響を与えている原因となる遺伝子を解明し、その構造の相違やそれに基づく機能を明らかにすることを目的としている。
【００４４】
また、本発明は、この遺伝子構造の相違を利用し、その機能を制御することによりデンプンの物性や味が改変されたデンプンを製造する方法を提供することを目的としている。
【００４５】
さらに、本発明は、イネ、特にジャポニカ米におけるイソアミラーゼのプロモーターを提供するものである。また、本発明は前記したイソアミラーゼのプロモーターが導入された植物、及び当該植物が産生する新規なデンプンの製造方法を提供するものである。
【００４６】
さらに詳細には、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。より詳細には、イネが、ジャポニカ米の日本晴（品種名）又はインディカ米のカサラス（品種名）のであるスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。さらに詳細には、スターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子が、配列表の配列番号１若しくは２に示される塩基配列、又はストリージェントな条件下でそれとハイブダイズし得る塩基配列を有するものであるイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子に関する。本発明のスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子はプロモーター領域を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。
【００４７】
また、本発明は、前記したイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターに関する。
【００４８】
さらに、本発明は、前記したイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列、又はそれと相同性を有するようにイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列が改変された遺伝子改変イネデンプンに関する。
【００４９】
また、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子とそのプロモーター領域の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を、他の種類のイネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子とそのプロモーター領域の遺伝子の塩基配列に対応するように改変された遺伝子改変イネを用いて、元のイネとは異なる鎖長分布、物性又は味を有するデンプンを製造する方法に関する。
【００５０】
さらに、本発明は、イネのスターチシンターゼＩＩａをコードする遺伝子の塩基配列になかの、イネのスターチシンターゼＩＩａ遺伝子に特異的な塩基配列を含有してなるオリゴヌクレオチド、及びそれを用いたイネの種類を検出又は同定する方法に関する。
【００５１】
また、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が、元の野生型の生物とは異なる量発現する変異体を用いて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型の生物とは異なる変異体を用いて、元のイネが生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法に関する。
【００５２】
さらに、本発明は、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンに関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型の生物とは異なる変異体を用いた、元のイネが生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンに関する。本発明のデンプンの形質は、好ましくはデンプンの糊化の特性により示されるものであり、また、デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれとは異なることを特徴とするデンプンである。
【００５３】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。より詳細には、イネの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法に関する。
【００５４】
また、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素を元の野生型よりも過剰に発現させる方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）を野生型よりも過剰に発現させる方法に関する。
【００５５】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる種を選別することからなる、デンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法に関する。そして、当該酵素の発現量の相違により、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産することを特徴とする変異体の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法に関する。
【００５６】
さらに、本発明は、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体に関する。そして、当該酵素の発現量の相違により、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産することを特徴とする変異体に関する。より詳細には、本発明は、イネのデンプンの枝作り酵素の１種である枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現量が元の野生型とは異なる変異体に関する。
【００５７】
また、本発明は、イネのイソアミラーゼのプロモーターに関する。好ましくは配列表の配列番号１に記載された塩基配列、この一部の塩基は置換、欠失、もしくは他の塩基が付加されてなる塩基配列、又はこれらの塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するイネのイソアミラーゼのプロモーターに関する。
【００５８】
また、本発明は、植物のイソアミラーゼのプロモーターが、前記した本発明のプロモーターで置換された形質転換植物に関する。
【００５９】
さらに、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に前記した本発明のプロモーターを配置してなる遺伝子を植物に導入して、デンプンの製造の際のイソアミラーゼの発現がイネと同様に制御されたデンプンを製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明は、第一にデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）による改変、第二にデンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）による改変、及び第三にデンプン枝切り酵素の１種であるイソアミラーゼのプロモーターによるデンプンの改変に関するものである。以下、これらを順に説明する。
【００６１】
１．デンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）による改変
本発明者らは、各種のイネのデンプンの物性や構造を調べた（Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．Ｉｎａｂａ，Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｗａ，Ｔ．Ｎａｇａｍｉｎｅ．Ｓｔａｒｃｈ ２００２，５４，１１７−１３１．）。そして、イネの種類によるデンプンの違いを物性面のみならず、アミロペクチンの構造から分析し、次いでこのようなアミロペクチンの構造の違いが生じる原因となる遺伝子を解明することにした。
【００６２】
まず、本発明者らは世界各地で栽培されている各種のイネの中から、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）４７品種、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）３４品種、インディカ２３品種、および中国のインディカ２５品種を収集し、それぞれのデンプンを解析して検討した。その結果を以下の表１〜表４に示す。
アミロペクチンの微細構造を分析するために、アミロペクチンをイソアミラーゼで分解し、各アミロペクチンのα−１，４−鎖の鎖長のモル分布をキャピラリー電気泳動で分析した。この方法は、各々のα−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数（鎖長（ＤＰ））を１００個まで、各々の鎖長における全体に対するモル分率として定量的に調べることができるので、種々の品種におけるアミロペクチンの微細構造を検討には好都合のものである。本発明者らは、先にジャポニカは、インディカに比べて、鎖長（ＤＰ）が２５以上のものについては両者に明確な相違はないが、鎖長が１１以下のものが多く分布し、鎖長が１２〜２４のものは少ないことを報告してきた。アミロペクチンのクラスターの長さは、アミロペクチンのソースとして使用される植物の品種の依存していることはよくしられており、インディカとジャポニカのアミロペクチンの微細構造の相違が前述したような極僅かなものであることは驚くべきことであった。
【００６３】
また、アミロペクチンのクラスター内の鎖長、即ちＡ鎖とＢ１鎖の最大長は２４であることが報告されており（Ｈａｎａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、そこで各イネについて、鎖長が２４までについて、鎖長が２４までの量に対する鎖長が１０以下である量の比（ＤＰが１０以下の量／ＤＰが２４以下の量）を算出した。この比は、アミロペクチンのクラスターに占める短い鎖の割合（存在比）を表す。
【００６４】
各イネについてのこれらの結果を次の表１〜表４に示す。表１は４７品種についての温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり、表２は３４品種についての熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり、表３は２３品種についてのインディカのものであり、表４は２５品種についての中国のインディカのものである。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
【表４】
【００６９】
各表の左欄から、整理番号（Ｎｏ）、品種名、パスポート番号、アミロペクチンの差長が１０以下の割合、糊化開始温度と糊化最大温度の温度特性、アミロース含有量、及びフェノール色素反応の結果を示している。整理番号は、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）を１００番台とし、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）を２００番台とし、インディカを３００番台とし、そして中国のインディカを４００番台として、各種類において連続番号がふされている。パスポート番号は、筑波の独立行政法人農業生物資源研究所で使用されている番号であり、アミロペクチンの鎖長が１０以下の割合は、前記してきた鎖長が２４以下の全量に対する鎖長が１０以下の量の割合（モル）を示し、アミロース含有量は胚乳の全デンプンに対するアミロースのわりあい（重量％）を示し、フェノール色素反応はフェノール溶液において反応が有ったものを「１」と表記し、反応が無いものを「０」と表記している。
【００７０】
ジャポニカとインディカの鎖長分布の相違の一つの典型例として、ジャポニカの整理番号１４３（以下＃１４３と記載する。）とインディカの整理番号３０３（＃３０３）についての鎖長分布を図５に示す。図５の上段の図（図５Ａ）は各々の鎖長の分布を示し、横軸は鎖長（α−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を示し、縦軸は頻度（モル％）を示す。白抜きはジャポニカ（＃１４３）を示し、黒塗りはインディカ（＃３０３）を示す。図５の下の図（図５Ｂ）は、各々の鎖長におけるジャポニカ（＃１４３）の頻度からインディカ（＃３０３）の頻度を引いた（＃１４３−＃３０３）差を頻度（％）として示している。
【００７１】
この結果、ジャポニカは、インディカに比べて鎖長が１１以下のものが多く（図５Ｂにおいて大きくプラスになっている。）、鎖長が１２〜２４のものがすくなくなっている（図５Ｂにおいて大きくマイナスになっている。）ことがわかる。また、鎖長が２５以上のものについては両者に殆ど差がないことがわかる。この結果は以前の報告とよく一致するものであった。
【００７２】
さらに、いくつかの種類のイネについてインディカ（＃３０３）との鎖長の分布の差を同様にしてみてみた結果を図６に示す。図６は左側の上から＃１０３との差、＃２３４との差、＃３１０との差、及び＃４０９との差を示し、右側は＃２１５との差、＃２０２との差、＃３０２殿差、及び＃４０８との差をそれぞれ示す。図６の左側と右側では鎖長分布の差のパターンが異なっていることがわかる。即ち、左側のパターンは前記したジャポニカ（＃１４３）との差のパターンとよく似ているが、右側のパターンは鎖長分布に差が余りみられない、即ちインディカ＃３０３とほぼ同じ鎖長分布をしているパターンとなっている。
【００７３】
本発明者らは、さらに、鎖長が２４以下の全量に対する鎖長が１０以下の量の比（以下、本明細書ではこの比をＡＣＲと称する。）を計算してみた。各品種のこの値は前記表１〜表４に記載されている。
【００７４】
図７は今回調査した１２９品種について算出されたＡＣＲの値におけるヒストグラムを示している。横軸はＡＣＲの値を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【００７５】
この結果から、ＡＣＲの値に基づいてイネを大きくふたつのグループに分類できることがわかる。ひとつのグループはＡＣＲが０．１５９〜０．２００のグループであり、他のひとつのグループは０．２４０〜０．２８７のグループである。しかし、唯１種だけがこの分類に適合しないのものがある。これはＡＣＲの値が０．２２０の＃２１５のクァークヨエ（Ｋｈａｕｋ Ｙｏｅ）である。この１品種を除けば、今回調査した１２９品種のうちの１２８品種はＡＣＲの値に基づいて２グループに完全に分類し得ることがわかる。
【００７６】
図８は今回調査した各種類のイネについて図７と同様にヒストグラム化したものである。図８に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は４７）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３４）、左下はインディカのものであり（個数は２３）、右下は中国のインディカのものである（個数は２５）。
【００７７】
これによれば、温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）は典型的にＡＣＲの値が大きいものであり（図８左上）、熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）では両者のグループが存在し（図８左上）、インディカや中国のインディカではＡＣＲの値が小さいのものが主流ではあるが、ＡＣＲの値が大きいものも有ることがわかる。
【００７８】
本発明者らは、前記したＡＣＲの値に基づくグループを、Ｌ−タイプ、Ｓ−タイプ及びＭ−タイプと命名した。即ち、Ｌ−タイプは短い鎖長の分布が少なくＡＣＲの値が小さい（約０．１９以下）もののグループであり、Ｓ−タイプは比較的長い鎖長の分布が多くＡＣＲの値が大きい（約０．２４以上）もののグループである。Ｍ−タイプはその中間のものであり、今回の調査では＃２１５の１種のみである。
【００７９】
振り返って図６を見ると、図６の左側の４種は、いずれもＳ−タイプに属するイネである。これらの４種は、今までの種類分けでは、温帯ジャポニカ（＃１０３）、熱帯ジャポニカ（＃２３４）、インディカ（＃３１０）、及び中国のインディカ（＃４０９）に分類されているものであるが、前記のＡＣＲの値や図６に示される鎖長分布の差からみればこれらが同種のアミロペクチン構造をゆうしていることがわかる。図６の右側の上はＭ−タイプの＃２１５のものであり、この品種はＡＣＲの値はＬ−タイプともＳ−タイプとも異なっているが、鎖長の分布は比較的Ｓ−タイプに似ている。図６の右側の下３個はＬ−タイプのものである。これらのＬ−タイプのものの鎖長の差の分布はさまざまパターンをしめしているが、いずれの鎖長においても＃３０３との差が小さいことが特徴である。
【００８０】
各品種の胚乳のデンプンの熱特性を示差熱量測定法（ＤＳＣ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｙｍｅｔｒｙ）により分析した結果を表１〜表４に記載した。これらの幾つかの品種について更に詳細な熱特性を検討した結果を次の表５に示す。
【００８１】
【表５】
表５の左側から、整理番号、品種名、糊化開始温度（Ｔｏ）、糊化最大温度（Ｔｐ）、糊化終了温度（Ｔｃ）、糊化範囲、ゲラチン化エンタルピー、前記したＡＣＲの値によるタイプ（Ａｐ）、アミロース含有量（％）を示している。この結果Ｌ−タイプのアミロペクチンを有するイネのデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ）及び糊化最大温度（Ｔｐ）は、Ｓ−タイプのものに比べて極めて高くなっていることがわかる。また、Ｍ−タイプのものはこの中間となっていることがわかる。
【００８２】
アミロペクチンの微細構造とデンプンの熱特性の相関をさらに詳細に検討した結果を図９に示す。図９の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はアミロペクチンのＤＰが１０以下の量の比（ＡＣＲ）を示している。図９の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。温帯ジャポニカは比較的左上側に集中しているが、他の種類はバラバラの分布している。しかし、糊化開始温度が高くなるにつれてＡＣＲの値が小さくなることが明瞭にしめされており、その相関係数は−０．８０２５と極めて高い相関が両者にあることを示している。
【００８３】
このことから、アミロペクチンのＡＣＲの値がデンプンの熱特性に大きな影響を与えていることがわかる。
【００８４】
アミロペクチンのクラスターの側鎖は、ＤＰが約１０以上のものであればダブルヘリックス構造を形成しており、このダブルヘリックス構造の長さが糊化開始温度（Ｔｏ）と相関していることが報告されている（Ｔ，Ｕｍｅｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．；Ｍ．Ｊ．Ｇｉｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９８７，１６１，２９１−３００．；Ｍ．Ｊ．Ｇｉｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．１９９５，２８，２３−３１．；Ｇ．Ｋ．Ｍｏａｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７，２９８，３２７−３３３．）。このダブルヘリックス構造に基づく考え方によれば、ＡＣＲの値と糊化開始温度との相関を説明することができる。即ち、ＡＣＲの値が大きい（Ｓ−タイプ）ということはＤＰが１０以下のものが比較的多く、ダブルヘリックス構造を形成できる側鎖が少ないということになり、反対にＡＣＲの値が小さい（Ｌ−タイプ）ものではＤＰが１１以上のものが比較的多く、ダブルヘリックス構造を形成できる側鎖が多くなるからである。
【００８５】
また、同じＡＣＲの値であるにもかかわらず糊化開始温度が比較的広く分布する傾向が見られる。このことは特にＡＣＲの値が０．２４以上の場合に顕著である。このことは、糊化開始温度がＡＣＲの値のみに左右されるものではなく、他の要因によっても左右されていることを示していると考えられる。
【００８６】
次に、各種のイネの胚乳のデンプンのアミロースの含有量についても調査し、この結果を表１〜表４に記載した。
【００８７】
図１０は今回調査した１２９品種のうちの１００品種についてのアミロース含有量のヒストグラムを示している。横軸はアミロース含有量（全デンプンに対する割合（％））を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【００８８】
図１１は今回調査した各種類のイネについて第１０図と同様にヒストグラム化したものである。図１１に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３８）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は２５）、左下はインディカのものであり（個数は１９）、右下は中国のインディカのものである（個数は１８）。
【００８９】
アミロースの含有量が３０％を越えるものもみられたが、このアミロース含有量と前記したアミロペクチンの構造との相関は特にみられなかった。
【００９０】
デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度との相関を検討した結果を図１２に示す。図１２の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はデンプンのアミロース含有率（％）を示している。図１２の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【００９１】
この結果、デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度とには、格別の相関は見出せなかった（相関係数＝０．２４６０）。
【００９２】
本発明は、従来のインディカとジャポニカという分類法とは異なる、アミロペクチンの微細構造に基づいてＬ−タイプ、Ｓ−タイプ、及びそれらの中間のＭ−タイプという３種類にイネを分類することができることを見出したものである。これらのタイプにおけるアミロペクチンのクラスターのα−１，６−結合による枝の位置や数に違いは無いのであるが、ひとつのクラスターにおける短いα−１，４−グルコシド鎖や中間程度の長さのα−１，４−グルコシド鎖の数にのみ違いが見られる。このようなＬ−タイプとＳ−タイプの違いを模式的にしめしたものが図３であるということもできる。即ち、図３の（ａ）は一つのクラスターの中にα−１，４−グルコシド鎖の短いものの数が相対的に多くなっており、これが本発明のＳ−タイプに相当するものであり、図３の（ｂ）は反対に一つのクラスターの中に比較的長いα−１，４−グルコシド鎖の数が相対的に多くなっており、これが本発明のＬ−タイプに相当するものである。従来は図３の（ａ）をジャポニカ−タイプ、（ｂ）をインディカ−タイプといっていたが、インディカやジャポニカの中にも品種によってＬ−タイプもあり、Ｓ−タイプのものもあるということをアミロペクチンの微細構造の分析により初めて明らかにしたものである。
【００９３】
さらに、本発明者らは、日本晴（品種名）とカサラス（品種名）とのアミロペクチンの構造の相違の原因がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）の作用によるものであることを示してきた（特願２０００−７８５５３号）。即ち、本発明者らは、デンプンの性状の差異に起因すると考えられるアルカリ崩壊性の難易を制御する遺伝子（ａｌｋ遺伝子）、デンプンの主要成分であるアミロペクチンの構造を制御する遺伝子、さらにアミロペクチン合成に関与すると考えられる酵素アイソザイムの構造遺伝子が同一の遺伝子座に存在することを示してきた。
【００９４】
本発明においては、世界中で栽培されているイネについて、同じ方法によりアミロペクチンの構造が変化させられていることを明らかにし、そして、イネ胚乳におけるＳＳＩＩａの作用がアミロペクチンのクラスター内における短い鎖の伸長に決定的な役割を演じていること、及びＳＳＩＩａ遺伝子が欠損した場合にはＬ−タイプのアミロペクチンに代わってＳ−タイプのアミロペクチンが蓄積されることを示してきた。
【００９５】
このことから、前記してきたアミロペクチンの微細構造におけるＬ−タイプとＳ−タイプの構造を決定する遺伝子はスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）をコードする遺伝子であると考えられることから、当該遺伝子を単離することを試みた。
【００９６】
このために、まず、リン（Ｌｉｎ）らの方法に準じて（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８））、９８系統の（日本晴×カサラス）×日本晴の戻し交雑後代自殖系統群（Ｂａｃｋｃｒｏｓｓ Ｉｎｂｒｅｄ Ｌｉｎｅｓ，ＢＩＬｓ）を育成した。９８系統のＢＩＬｓは、各々の系統について、１２本ある染色体のどの領域が日本晴あるいはカサラス由来であるかが明らかにされている（イネゲノムプロジェクト公開データ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｆｆ．ｏｒ．ｊｐ）。この遺伝子データと各ＢＩＬのアルカリ崩壊性の難易を対応させることにより、アルカリ崩壊性を制御する遺伝子の座乗位置が決定可能である。この解析を実施した結果、アルカリ崩壊性遺伝子は既報（Ｈａｒｕａｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）の通り、第６染色体のポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）３６．７に座乗することが確認された。
【００９７】
次に、アミロペクチンの枝状構造を制御する遺伝子の染色体上の座乗位置を決定するために、前記の各ＢＩＬｓのアミロペクチンの構造を前述した方法により分析し、それらの鎖長分布が日本晴のそれに類似しているかカサラスのそれに類似しているか判定した。その判定結果とＢＩＬｓの遺伝子型データを対応させることで、アミロペクチンに枝状構造を制御する遺伝子は１つ存在し、前記のアルカリ崩壊性遺伝子と同じく、第６染色体のポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）３６．７に座乗することが明らかとなった。
【００９８】
また、イネＳＳＩＩａ遺伝子の構造を明らかにするため、イネゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を行った。まず、ジャポニカ品種の日本晴とインディカ品種のカサラスのゲノムＤＮＡを幼葉から単離し、その一部をエッペンドルフチューブ内でそれぞれ各ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ａｐａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉの各制限酵素で加水分解した後、精製したＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって分離した。分離ＤＮＡをフィルターに転写し、全長ＥＳＴクローン（Ｅ１１０２５）をプローブとしてして、サザンブロットを行った。その結果、ＢａｍＨ Ｉ断片において、反応する断片が、イネの両品種においてＲＦＬＰ性が認められた。これを利用して、ＢＩＬｓ各系統を、日本晴型（２０ｋｂの断片を含む）、カサラス型（２３ｋｂの断片を含む）、ヘテロ型（２０ｋｂおよび２３ｋｂの断片を含む）の３つのタイプに分類し、イネＳＳＩＩａ遺伝子のマッピングを行った。その結果、ＢＩＬｓ系統間におけるＲＦＬＰパターンの挙動は、アルカリ崩壊性とすべて一致した。従って、イネＳＳＩＩａ遺伝子は、ａｌｋ遺伝子と同一かあるいは極めてその近傍に座乗すると結論した。
【００９９】
なお、イネ胚乳のＥＳＴクローン（Ｅ１１０２５）は、農林水産省農業生物資源研究所イネゲノム研究チームより分譲された。本クローンは、ジャポニカ型イネ品種である日本晴の未熟種子のｍＲＮＡを鋳型にし、ポリＴをプライマーとして、リバーストランスクリプターゼの作用によって作成したｃＤＮＡを、５’末端と３’末端にＳａｌＩとＮｏｔＩ認識塩基配列をそれぞれ付加して、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングしたものである。本プラスミドはさらに大腸菌ＪＭ１０９株に感染させ、形質転換された大腸菌はグリセロールストックして保存してある。本菌体を、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１ｌ当たり１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウムを含む）上にまき、３５℃で終夜培養した。得られたコロニー群からシングルコロニーを選び、このコロニーからＱｉａｇｅｎキット（アミコン、ＵＳＡ）によってプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓａｃ Ｉによって加水分解した後、１％アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、それぞれの長さを測定して、本クローンの制限酵素地図を作成した。
【０１００】
本クローンは全長約１．７〜１．８ｋｂであった。上記制限酵素によって得られる数種類のＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動で分離した後、ゲルネブライザー（Ｇｅｌ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）（アミコン、ＵＳＡ）によって精製し、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）のそれぞれの制限酵素に対応する部位にサブクローニングした。サブクローニングされたクローンを含むプラスミドは大腸菌ＪＭ１０９株に感染させ、形質転換された大腸菌はグリセロールストックして保存してある。Ｅ１１０２５クローン全体およびクローンの断片を含むプラスミドの塩基配列を、ジデオキシ法に基づいて、Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムジャパン、千葉県浦安市）および蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＰＥバイオシステムジャパン、Ｍｏｄｅｌ３７３Ｓ−３６型）を用いて、決定した。各クローンの両側からの塩基配列を求めるため、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた。得られた塩基配列を、核酸およびアミノ酸配列の解析ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ、ソフトウェア開発、東京）を用いて解析した。その結果、本ＥＳＴクローンは１，７２４塩基からなり、４６６アミノ酸をコードすると考えられた。
【０１０１】
このようにして決定されたイネのＳＳＩＩａ遺伝子を含むゲノムの断片が調製された。日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＳＳＩＩａ遺伝子については、独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含む２種類のＰＡＣクローン（Ｐ４４１，Ｐ４５０）を使用した。また、カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）のＳＳＩＩａ遺伝子については、同じく独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含むＢＡＣクローンを使用した。
【０１０２】
これらのＰＡＣクローン、ＢＡＣクローンを種々の制限酵素（ＥｃｏＲ Ｖ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ等）で加水分解した。それぞれの断片を、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋）にサブクローンした後、プラスミドＤＮＡを調製し、それぞれのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
【０１０３】
得られた日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を図１３に示す。また、日本晴の塩基配列を配列表の配列番号１に、カサラスの塩基配列を同配列番号２に示す。また、日本晴のエキソン部分の塩基配列を配列表の配列番号３に、カサラスのものを配列番号４にそれぞれ示す。さらに、日本晴のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、カサラスのものを配列番号６にそれぞれ示す。
【０１０４】
図１３の四角枠はエキソン領域を示し、四角枠の間はイントロンを示す。それぞれの番号は、エキソン及びイントロンの順序を示している。図１３中のアスタリスクは、アミノ酸が変わる部分を示している。図１３には併せて制限酵素による切断位置を示す。
【０１０５】
日本晴の遺伝子のエキソン及びイントロンの位置、数およびサイズを次の表６に、カサラスのそれを表７にそれぞれ示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
それぞれの表は、左から、エキソン又はイントロンの番号、その領域の開始番号、その領域の終了番号、及びその領域の塩基長を示す。
【０１０９】
日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子は、いずれも７個のイントロンによって分断されている８個のエキソンから成る。イントロンの数と位置は両者で同一である。ただし、イントロンの長さは、第３、第６、第７イントロンにおいて、カサラスの遺伝子の方が１塩基づつ長い。イントロンの塩基配列の相同性もかなり高いが、第３、第６、第７イントロンにおいては、比較的多数の違いが見られる。
【０１１０】
図１４〜図１８に、日本晴とカサラスのＳＳＩＩａのゲノム遺伝子の全塩基配列を比較して示している。図１４〜図１８の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。図１４はこのうちの１番目〜１２６０番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１５はこのうちの１２６１番目〜２５２０番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１６はこのうちの２５２１番目〜３７７９番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１７はこのうちの３７８０番目〜５０３７番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示し、図１８はこのうちの５０３８番目〜５９３５番目（上段の日本晴による番号）までの比較を示している。
【０１１１】
全配列のうちのプロモーター部分は、日本晴では１〜１，３４１ｂｐであり、カサラスでは１〜１，３３１ｂｐである。このプロモーター部分では、カサラスには、中ほどに（７０２ｂｐ）９塩基のギャップがある程度で、両者のサイズや塩基配列の相同性はかなり高かった。
【０１１２】
８個のエキソンのサイズは両者間で全く差がない（表１参照）。エキソン部分の塩基配列の比較を図１９〜図２０に示す。図１９〜図２０の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものであり、転写開始点を１番にしている。図１９はこのうちの１番目〜１２６０番目までの比較を示し、図２０はこのうちの１２６１番目〜２６０７番目までの比較を示している。エキソン部分の塩基配列の違いは合計で６箇所ある（図１５中の矢印）。
【０１１３】
図２１に両者のＳＳＩＩａのアミノ酸配列の比較を示す。図２１の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子をもとに、両者のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を比較すると、４箇所において、アミノ酸の種類が異なっていた。これらの違いによって酵素機能の違いが生じる可能性が考えられる。
【０１１４】
興味ある事に、４箇所のアミノ酸置換のうち、７３７番目のアミノ酸配列が、カサラスではＶ（バリン）のところ、日本晴ではＭ（メチオニン）となっている。スターチシンターゼのアミノ酸配列中にはいくつかの保存領域が知られているが、そのうちの１つがＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）で植物のスターチシンターゼにおいて高度に保存されていて、リージョン７（Ｒｅｇｉｏｎ７）と命名されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０：１１４７−１１５５）。イネＳＳＩＩａにおいて、７３７番目のアミノ酸がカサラスではＶで保存されているのに対して日本晴ではＭに変化している。この変化がＳＳＩＩａの機能の低下に関係している可能性がある。
【０１１５】
ジャポニカイネとインディカイネのデンプンの主成分であるアミロペクチンの構造の差異は、両者のＳＳＩＩａ遺伝子の構造と機能の違いが原因であると考えられる。具体的には、ジャポニカイネのＳＳＩＩａ遺伝子の機能が、何らかの変異によって、劣っていると考えられる。その原因としては、遺伝子の発現量が顕著に低下したか、酵素としての触媒能が低下したかのいずれかであろうと思われる。前者はプロモーターの変異によって、後者はアミノ酸置換による変異によって引き起こされる可能性が高い。
【０１１６】
この結果として、ジャポニカイネはアミロペクチンを構成するクラスターの鎖長が短い、即ちＡＣＲの値が大きいＳ−タイプとなり、インディカイネは鎖長が長い、即ちＡＣＲの値が小さいＬ−タイプとなったと考えられる。
【０１１７】
本発明者らはこれを確認し、さらに遺伝子の導入によるデンプンの製造を確認するために、インディカイネの１種である品種ＩＲ３６のデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）遺伝子を、ジャポニカイネに属する品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）にグルテリン（イネの貯蔵タンパク質）のプロモーターに連結させてアグロバクテリウムにより導入した。その結果、品種ＩＲ３６のデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）がジャポニカイネに属する品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）で発現し、当該形質転換体においては、本来Ｓ−タイプのアミロペクチンになるべきものが、形質転換によりＬ−タイプに変化したことが確認された。この結果を図２２に示す。図２２は、各品種が製造するデンプン（アミロペクチン）のＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を測定した結果を示したものである。図２２の上段は品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）のものであり、中段は品種ＩＲ３６のものであり、下段は形質転換体＃７８−１のものである。中段及び下段の右側は、各品種の品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）との差を示している。即ち、中段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と品種ＩＲ３６との差を示したものであり、下段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と形質転換体＃７８−１との差を示したものである。
この結果は、形質転換体において、品種ＩＲ３６のＤＰ値を持ったデンプンが製造されていることを示している。
【０１１８】
イネのデンプンの熱特性などの物性や味覚を決めているがデンプンのアミロペクチンの微細構造の違いによるものである。世界で栽培されているイネのアミロペクチンの微細構造は、Ｌ−タイプとＳ−タイプ、それとその中間のＭ−タイプに分類されることを本発明が初めて示し、そしてアミロペクチンのこれらの構造の違いを生じさせている原因遺伝子がスターチシンターゼＩＩａ（ＳＳＩＩａ）であることを本発明が示し、この遺伝子を単離し塩基配列を決定した。
【０１１９】
その結果、Ｌ−タイプのイネ（カサラス）とＳ−タイプのイネ（日本晴）では、遺伝子の塩基配列の相違は少しであったが、この少しの違いがアミロペクチンの微細構造を違いを生じさているのである。
【０１２０】
アミロペクチンのクラスターの合成は、枝作り酵素（ＳＢＥ）により短い枝の分岐が作られ、デンプン合成酵素（ＳＳ）によりクラスターの結晶領域の終端まで鎖が伸長される。クラスター中における短い鎖の割合は、枝作り酵素（ＳＢＥ）と合成酵素（ＳＳ）の活性のバランスによって決定される。Ｓ−タイプのアミロペクチンは、ＳＳＩＩａ遺伝子が障害を受けているために、その結果ＳＢＥ活性がＳＳ活性に比べて相対的に高くなったときに製造されると思われる。これに対してＬ−タイプ様のアミロペクチンは、クラスターの形成に当たってＳＳＩＩａ活性がＳＢＥ活性に比べ優位であることから、ＳＳによる短い枝の伸長が優勢となったときに製造されるものと思われる。
【０１２１】
このように、アミロペクチンのクラスターにおける微細構造の形成は、クラスターの枝の元となる分岐の形成とＳＳＩＩａなどによる鎖の伸長とのバランスによるものであるから、ＳＳＩＩａの活性発現が障害を受けて弱くなっていると考えられるＳ−タイプのイネのＳＳＩＩａの遺伝子を、他のタイプのイネに導入することにより、導入されたイネのＳＢＥとＳＳＩＩａの活性のバランスが微妙に崩れ、アミロペクチンのクラスターが新しいタイプの微細構造を有するデンプンを製造することができることになる。
【０１２２】
また、発育のよいイネに物性や味覚の好ましいデンプンを作るＳＳＩＩａ遺伝子又はそのプロモーターを導入することにより、環境に強くかつ好ましい物性や味覚を有するデンプンを作るイネに改善することも可能となる。
【０１２３】
本発明における遺伝子は、翻訳領域のみをコードする遺伝子であってもよいし、ゲノム由来のものであってもよいし、また場合によってはプロモーター領域を含むものであってもよい。
【０１２４】
また、本発明のプロモーターとしては、イネのＳＳＩＩａ遺伝子を発現させることができるものであればよいが、好ましくは配列表の配列番号１の１番目〜１，３４１番目のもの、又は配列番号２の１番目〜１，３３１番目のものが挙げられる。本発明のプロモーターは、これらの塩基配列の全部又はその一部を用いることができる。
【０１２５】
本発明のイネの改変方法において重要なことは、遺伝子を導入するということではなく、アミロペクチンの微細構造を改変するためにイネのＳＳＩＩａの活性に関連する遺伝子を操作するということである。したがって、本発明の遺伝子改変イネは、イネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子の全長又は部分長のものをイネのゲノムに導入する方法に限定されるものではなく、イネのＳＳＩＩａの活性を変化させる目的でイネゲノムのＳＳＩＩａ遺伝子部分の塩基配列を、ポイントミューテーション法などにより操作することも本発明の方法に包含される。
【０１２６】
本発明の遺伝子改変イネの形態としては、遺伝子が導入などにより改変されたことを判別できるものであればよく、例えば種子、カルス、生育体などのいずれの形態であってもよい。
【０１２７】
本発明のデンプンの製造方法は、前記した遺伝子改変イネを用いてアミロペクチンの微細構造やそれに伴う物性や味が元のイネとは異なるデンプンを製造する方法であり、アミロペクチンの微細構造はイネの枝作り酵素（ＳＢＥ）の活性とデンプン合成酵素（ＳＳ）の活性とのバランスによるものと考えられることから、本発明の遺伝子やプロモーターを用いてＳＳの活性を変化させることにより、イネにおけるＳＢＥとのバランスを微妙にかえることが可能となり、目的に適した特性を有するデンプンを製造することが可能となる。
【０１２８】
また、本発明は、前記した製造方法によりアミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布や物性が元のイネとは異なる新規なデンプン、より詳細には天然のイネ科植物が産生するデンプンとは鎖長分布や物性の異なる新規なデンプンを提供することもできる。
【０１２９】
さらに、本発明はアミロペクチンの微細構造を特徴づけることができるＳＳＩＩａの遺伝子の全塩基配列、及びその相関関係を明らかにするものであり、本発明の塩基配列を用いてイネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子の種類を検出、同定することが可能となる。したがって、本発明はこのような方法に使用されるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲなどを行うためのプライマーや、塩基配列の相違を検出するためのプローブとして使用することができる。好ましいプライマーの例としては次の塩基配列を有するプライマー１〜３が挙げられる。
プライマー１： 5'-cggtggtgtgccctatgg-3'
プライマー２： 5'-cgacgggcagaaaggggtg-3'
プライマー３： 5'-ggcggacatggtctcttcac-3'
【０１３０】
これらのプライマーのうち、プライマー−１とプライマー−３の組み合わせ、プライマー−２とプライマー３の組み合わせにより、イネのＳＳＩＩａ遺伝子に特異的な断片を含むＤＮＡを得ることができる。
【０１３１】
本発明のＳＳＩＩａをコードする遺伝子又はそのプロモーターを用いることにより、イネのデンプンのアミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布を調節又は制御することができ、したがって、本発明はイネのＳＳＩＩａをコードする遺伝子又はそのプロモーター領域の塩基配列を改変することによる、アミロペクチンのα−１，４−グルコース鎖の鎖長分布を調節又は制御する方法を提供するものである。
【０１３２】
図９に見られるように、アミロペクチンの鎖長分布と糊化開始温度とには強い相関関係があり、特に、アミロペクチン短鎖の比率の増加により（Ｓ−タイプ）、糊化開始温度が低下し、易糊化性が示される。このことは、アミロペクチンの分子構造の改変が、デンプンの物性を変える手段のひとつであることを示している。
【０１３３】
したがって、本発明はこのような鎖長分布の制御によって、熱糊化特性の異なる新規なデンプンを提供することができるものでもあり、食品用デンプンや産業用デンプンとして新規かつ有用なデンプンを提供するものである。
【０１３４】
２．デンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）による改変
次に、デンプン枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）について説明する。
【０１３５】
本発明者らは、イネのＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損したａｅ変異体（ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｅｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）の変異体）の解析から、ＢＥＩＩｂの機能を検討する過程において、ａｅ変異体にイネのＢＥＩＩｂ遺伝子を形質転換し、デンプンの性質が野生型に回復するかを検証することにより、ＢＥＩＩｂの特異的な機能の解析を行ってきた。
【０１３６】
そのために、まずＢＥＩＩｂの遺伝子を次のようにして単離した。
【０１３７】
イネのゲノムＤＮＡライブラリーとして、イネ品種「シモキタ」のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）を利用した。このＢＡＣライブラリーは、マイクロプレートサイズのメンブレンに固定したもので、ゲノムＤＮＡはイネ品種「シモキタ」の緑葉のプロトプラストから調製したものであり、平均インサートサイズは１５５ｋｂである。
【０１３８】
このＢＡＣライブラリーから、イネのＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子をコードするクローンをスクリーニングするために、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをプローブとして用いた。イネ品種フジヒカリのＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、その結果得られた１７４０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動した後、抽出、精製した。このＤＮＡ断片を、ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりラベルし、プローブとして用いた。
【０１３９】
ＢＡＣライブラリーのメンブレンを上述のＢＥＩＩｂのｃＤＮＡ断片プローブとハイブリダイゼーションさせた結果、プローブとハイブリダイズするシグナルを得た。そのシグナルに対応するプラスミドを保持する大腸菌のクローンを得て、それをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミド自動抽出機によりプラスミドを抽出した。
【０１４０】
前述のようにＢＡＣライブラリーの平均インサートサイズは１５５ｋｂであり、そのような長いＤＮＡ断片には複数の遺伝子が存在することも考えられる。ＢＥＩＩｂ遺伝子がコードされている領域のみを得る必要があることから、ポジティブクローンから得たプラスミドについてサザンブロット解析を行なった。
【０１４１】
このプラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレンにＤＮＡ断片を転写させ、上述のプローブを用い、前記したＥＣＬ法により、メンブレンとハイブリダイゼーションさせた。その結果、プローブは１７ｋｂのＤＮＡ断片とハイブリダイズした。そのＤＮＡ断片を単離するために、プラスミドをＳａｌＩで切断した後、低融点アガロースゲルで電気泳動し、目的の１７ｋｂ断片を含む領域のゲルを切り出し、目的のＤＮＡ断片を抽出、精製した。
【０１４２】
アグロバクテリウムを介してイネに遺伝子を導入させるためにバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００を用いた。これをまず、ＳａｌＩで切断した後、ＳａｌＩを失活させた。次に、ＳａｌＩ切断により生じた５’末端を脱リン酸化させた。続いて、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした１７ｋｂのＤＮＡ断片をサブクローニングするために、これをたバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００にライゲーションした後（これをｐＣＢＥＩＩｂと呼ぶ。）、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ）を形質転換した。ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）に生えた大腸菌をＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミドを抽出、精製した。
【０１４３】
このバイナリーベクターにサブクローニングした１７ｋｂＤＮＡ断片の制限酵素地図を決定し、断片化した後、塩基配列を解析した。その結果、１７ｋｂゲノムＤＮＡ断片には、ＢＥＩＩｂ遺伝子の完全長がコードされており、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡの塩基配列との比較により、ＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子は２２エキソン、２１イントロンからなることが明らかになった。また、このＤＮＡ断片には、遺伝子の上流域が約２．２ｋｂ存在し、プロモーター領域は全て含まれていると考えられた。さらに、下流域は約３ｋｂ存在し、ターミネーター領域は全て含まれると考えられた。そこで、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００サブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をコードする１７ｋｂＤＮＡ断片をイネに導入した。
【０１４４】
アグロバクテリウムを介した形質転換法により、上述のバイナリーベクターにサブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子を、イネａｅ変異体であるＥＭ１０（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６９：２５３−２５７．）に導入し、形質転換体を作製した。このイネａｅ変異体であるＥＭ１０は、イネ品種「金南風」を親株とした変異体として作成されたものである。
【０１４５】
イネの組織培養および形質転換は土岐（Ｔｏｋｉ）の方法（Ｔｏｋｉ，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１５：１６−２１．）に準じて行った。まず、ｐＣＢＥＩＩｂをエレクトロポレーシヨン法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＥＨＡ１０５株に導入した。このアグロバクテリウムをＥＭ１０のカルスに感染させ、ＤＮＡ導入し、形質転換させた。形質転換体は、ハイグロマイシンによりスクリーニングした。植物体に再分化したイネ個体はポットに移植し、温室で、自然光、２８／２４℃（６−１８時／１８−６時）の条件で生育させた。
【０１４６】
このようにして得られた形質転換体の中から、６系統を選抜した。この６系統を、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１と命名した。
【０１４７】
これらの６系統の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８についてサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を図面に代わる写真として図２３に示す。対照としてａｅ変異体であるＥＭ１０及びその親株である「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）を用いた。図２３は左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８の各レーンを示し、図２３の上段の（ａ）はＢａｍＨＩを用いた場合であり、下段の（ｂ）はＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合である。
【０１４８】
選抜した形質転換体は、金南風、ＥＭ１０よりも強くプローブとハイブリダイズした（図２３ではより黒く示されている。）。アプライしたゲノムＤＮＡ量は同じであるから、形質転換体には、金南風、ＥＭ１０以上のＢＥＩＩｂをコードするＤＮＡ断片が存在する。つまり、ＢＥＩＩｂを含む断片が導入されていることを示している。
【０１４９】
次に、得られた形質転換体についてノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を図２４に図面に代わる写真として示す。図２４の左から、「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８、ひとつ間を置いて、＃１−１、＃２−６、及び＃９−８の各レーンを示し、縦方向はデンプンを製造する際の各デンプン合成酵素、及びｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を示している。ＢＥＩはデンプン枝作り酵素Ｉを、ＢＥＩＩａはデンプン枝作り酵素ＩＩａを、ＳＳＩはデンプン合成酵素Ｉを、ＳＳＩＩＩはデンプン合成酵素ＩＩＩを、ＩＳＡはイソアミラーゼを、ＰＵＬはプルラナーゼを、それぞれ示している。
【０１５０】
ＢＥＩＩｂのｍＲＮＡは形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１で発現していた。導入したＢＥＩＩｂが確かに発現していることを示している。他のデンプン合成酵素の発現には変化が無かった。＃１０６−１よりも＃３１−１、＃１１３−７の方がｍＲＮＡが多く発現しているのは、導入されたＢＥＩＩｂのコピー数に比例していると思われる。
【０１５１】
また、＃１−１において強く発現しているのは、遺伝子の強い発現を促すゲノムにＢＥＩＩｂ遺伝子が挿入されたためと考えられる。
【０１５２】
これらの６系統についてウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）／活性染色法による解析（図２５上段）、及びネイティブ−ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色法による解析（図２５下段）を行った結果を図２５に図面に代わる写真として示す。図２５の上段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１の各レーンを示し、縦方向はＢＥＩ及びＢＥＩＩｂのブロットを示す。図２５の下段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、ａｅ変異型、相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）、過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）を示し、縦方向はＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ、及びＢＥＩをそれぞれ示す。
【０１５３】
ＢＥＩＩｂのタンパク質は、親株の金南風、並びに形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７で発現していることが確認できた。特に＃１−１では強く発現していた。しかし、ａｅ変異体のＥＭ１０及び形質転換体＃７−８ではその発現を確認することはできなかった。他のデンプン合成酵素（ＢＥＩ、ＩＳＡ及びＰＵＬ）の発現にはいずれの個体においても変化がみられなかった。
【０１５４】
ＢＥＩＩｂ活性は、ａｅ変異体のＥＭ１０では見られないが、親株の金南風では紫色のバンドとして見られる。形質転換体では、ＢＥＩＩｂ活性が＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７で回復しているが、＃１０６−１では非常に薄く確認できた。＃７−８は回復していなかった。この結果、形質転換体＃１０６−１、＃３１−１、及び＃１１３−７では、導入したＢＥＩＩｂが発現し、機能していることが示された。
【０１５５】
次に、形質転換イネのアミロペクチンの分子構造について検討した。各形質転換体及びａｅ変異体のＥＭ１０について、アミロペクチンの鎖長の分布を野生型（金南風）の鎖長分布を比較した。結果を図２６に示す。図２６の横軸は鎖長の長さを１〜６０まで示しており、数字が大きいほど鎖長が長いものを示している。図２６の縦軸は各鎖長における野生型（金南風）との鎖長分布の割合（％）の差を示している。即ち、まず野生型（金南風）におけるアミロペクチンの鎖長の分布を調べ、それをアミロペクチンの鎖長全体に対する各鎖長の割合（％）、例えば鎖長６のものがａ％、鎖長７のものがｂ％、鎖長８のものがｃ％、鎖長９のものがｄ％、・・・というように各鎖長について全体に対する分布の割合（％）を算出する。次に検定すべき各形質転換体などについて同様にアミロペクチンの鎖長全体に対する各鎖長の割合（％）、例えば鎖長６のものがｋ％、鎖長７のものが１％、鎖長８のものがｍ％、鎖長９のものがｎ％、・・・というように各鎖長について全体に対する分布の割合（％）を算出する。そして、各鎖長についてその差、例えば、鎖長６のものでは（ｋ−ａ）％、鎖長７のものでは（１−ｂ）％、鎖長８のものでは（ｍ−ｃ）％、鎖長９のものでは（ｎ−ｄ）％、・・・というように各鎖長の分布の割合（％）の差を算出し、それをグラフ化したものが図２６である。図２６の縦軸における＋側（図２６では上側）は野生型（金南風）よりも多く分布していることを示し、−側（図２６では下側）は野生型（金南風）よりも少なく分布していることを示している。また、図２６の上段は、ＥＭ１０（黒丸印−●−）、形質転換体の相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）（＃１０６−１）（白丸印−○−）、並びにａｅ変異型（＃７−８）（黒三角印−▲−）及びａｅ変異型（＃９−８）（黒四角印−■−）についてのものであり、図２６の下段は、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃３１−１）（黒丸印−●−）、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１１３−７）（黒四角印−■−）、及び形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１−１）（黒三角印−▲−）についてのものである。
【０１５６】
ＢＥＩＩｂを欠くａｅ変異体のＥＭ１０では、鎖長の短い部分（鎖長が約６〜１３）において野生型（金南風）に比べて分布の割合（％）が低くなっており、鎖長の長い部分（鎖長１５以上の部分）において分布の割合（％）が高くなっている。これは、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が低いためにアミロペクチンの枝分かれが少なくなり、それに伴って鎖長が長くなってきたものと考えられる。これに対して枝作り酵素ＩＩｂの遺伝子が導入されて、それが発現している形質転換体については、その発現の程度に応じて鎖長の分布が変化していることがわかる。通常であれば、欠失した酵素の遺伝子が導入されたとしても、元の野生型に戻る程度の酵素活性が復元されるのであり、図２６に示される各鎖長の分布の割合（％）の差が０になるところで酵素活性が飽和すると考えられるのであるが、本発明の枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）については、過剰な酵素活性が見出された。即ち、図２６の下段に示されるように、鎖長の短い部分（鎖長が約３〜１２）において野生型（金南風）に比べて分布の割合（％）が極端に高くなっており、鎖長の長い部分（特に、鎖長が１２〜２４の部分）において分布の割合（％）が低くなっている。
【０１５７】
これは、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が、遺伝子の過剰な発現により、その活性が高くなり、アミロペクチンの枝分かれがより促進され、それに伴って鎖長が比較的短くなってきたものと考えられる。
【０１５８】
形質転換体として選抜された６系統について、それらの鎖長分布を解析した結果から、これらの６系統を以下の３グループに分類することができた。これらの３グループを以下のように命名した。これらの型の名称を図２６に示している。
（１）ａｅ型：枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が回復されていない、あるいは、わずかに回復しているタイプ。
・・・形質転換体＃７−８、及び＃９−８
（２）相補型（ＣＯ型）：枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の活性が、ほぼ回復 されたタイプ。
・・・形質転換体＃１０６−１
（３）過剰発現型（ＯＥ型）：導入したＢＥＩＩｂ遺伝子が過剰に発現している タイプ。
・・・形質転換体＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１
【０１５９】
図２６に示される鎖長の分布による前記３グループの分類は、前記した図２３〜図２５におけるＢＥＩＩｂ遺伝子についてのバンドの濃淡としても明瞭に示されている。例えば、図２３においても、形質転換体＃７−８は細いバンドであるが、形質転換体＃１０６−１は少し太いバンドとなり、形質転換体＃３１−１及び＃１１３−７ではかなり太いバンドとなって示されているとおりである。
【０１６０】
これらにことから、形質転換体に導入された枝作り酵素（ＳＢＥ）の遺伝子の発現量と、当該形質転換体が生産するデンプンのアミロペクチンの鎖長の分布とに密接な関連性があることが初めて見出された。
【０１６１】
次に、これらの形質転換体が生産するデンプンの特性を調べた。これらの形質転換イネのデンブンの熱糊化特性及び種子の重量をまとめて次の表８に示す。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
表８に糊化特性として、糊化開始温度Ｔｏ（℃）、糊化ピーク温度Ｔｐ（℃）、糊化終了温度Ｔｃ（℃）、糊化熱量（ｍＪ／ｍｇ）を示す。また、参考例としてイソアミラーゼ（ＩＳＡ）遺伝子が欠損したイネｓｕｇ−１変異体が生産するデンプンの糊化特性を示している。種子重量は、２０粒の平均値をｍｇで示している。
【０１６４】
これらのデンプンの糊化特性の結果は、以下のように分析することができ、前記した鎖長の分布に基づく３グループの結果と密接な関連性があることがわかった。
１）ａｅ型の形質転換イネ系統は、ａｅ変異体と同様の糊化特性を示した。ＢＥＩＩｂ活性がわずかに回復している＃９−８では、やや金南風に近い特性を示した。
２）ＣＯ型の形質転換イネは糊化温度は金南風よりやや高い値を示した。糊化熱量には変化がなかった。
３）ＯＥ型は金南風より糊化温度が低く、その程度は鎖長分布が金南風に対して激しければ糊化温度も低かった。糊化熱量には変化が見られなかった。＃１−１は金南風に比べて糊化温度が１０℃以上も低下しており、糊化熱量も５分の１以下であった。
【０１６５】
以上の結果から、ａｅ変異体の原因酵素がＢＥＩＩｂであることが明確になった。また、形質転換イネの中には過剰発現系統が出現し、それらの糊化特性はｓｕｇ−１変異体と類似しており、ＢＥＩＩｂとイソアミラーゼ（ＩＳＡ）は、アミロペクチンの微細構造に対して相反する効果を示す可能性が示された。
【０１６６】
これらの変異体が製造したデンプンを走査型電子顕微鏡で観察した。これらの６系統の形質転換体及びそれらの親系統の胚乳からデンプン粒を精製し、走査型電子顕微鏡でそれらの形態を観察した。結果を図面に代わる写真により図２７として示す。図２７の上段は１０００倍に拡大した場合を示し、下段は４０００倍に拡大した場合を示している。それぞれの写真の白いバーはスケールを示している。図２７の各段の左からＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、その下段の左から金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１をそれぞれ示している。
【０１６７】
金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）は、幅が約５μｍのほぼ均一な多角形のデンプン粒であるが、ＥＭ１０のデンプン粒は、幅１０μｍを越す大きな粒がところどころに存在し、それ以外の小さな粒は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）よりも小さく、多角形の角が崩れた形をしていた。また、互いの粒が接着し、群をなしていた。このようなＥＭ１０でみられた傾向は＃７−８でも見られ、＃９−８及び＃１０６−１へと緩和される傾向が見られた。ＢＥＩＩｂが過剰発現している系統である＃３１−１は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と非常に類似していたが、＃１１３−７では、多くのデンプン粒は、大きさ、形態は金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）とかわらないものの、わずかに形が崩れ、小さくなった粒も見られた。＃１−１では、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）でみられたようなデンプン粒はごくわずかであり、多くのデンプン粒が崩れて１μｍほどの大きさであり、形も不均一であった。
【０１６８】
さらに、これらの新規なデンプン類のＸ線回折パターンを調べた。これらの６系統の形質転換体のうち、デンプン粒が十分に取れなかった＃１−１を以外と、それらの親系統の胚乳からデンプン粒を精製し、それぞれのＸ線回折パターンを調べた。結果を図２８に示す。図２８の縦軸は強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角度（２θ）を示す。図２８の上からＥＭ１０（Ａ）、＃７−８（Ｂ）、＃９−８（Ｃ）、＃１０６−１（Ｄ）、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）（Ｅ）、＃３１−１（Ｆ）、及び＃１１３−７（Ｇ）をそれぞれ示す。
【０１６９】
これらのデンプン粒のＸ線回折パターンは、大きく分けてＡ形とＢ形に分けられた。一般にデンプン粒のＸ線回折パターンは、禾穀類のデンプンはＡ形を示し、芋類はＢ形を示し、豆類は両者の混合パターンであるＣ形を示す。これは、デンプン分子の結晶中の水分子の挿入位置の違いによるとされている。また、Ｘ線回折パターンのピークの高さは、結晶性の高さを示すとされている。トウモロコシのＢＥＩＩｂ変異体（ａｅ ｍｕｔａｎｔ）は、その野生型がＡ形を示すにも関わらず、Ｂ形を示すことが知られている。
【０１７０】
イネにおいても、ＥＭ１０は典型的なＢ形デンプンのパターンを示した。形質転換体では、ＢＥＩＩｂの発現量が多くなるに従ってＢ形からＡ形のパターンに移行していた。また、過剰発現型の＃３１−１は、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と同様のパターン、ピークを示したが、＃１１３−７は、ピークが低くなっており、結晶性の低下が見られた。
【０１７１】
以上のことから、デンプンを生産する生物、好ましくは植物、より好ましくはイネのデンプンの枝作り酵素ＩＩｂの遺伝子の発現量に応じて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造することがわかった。ＢＥＩＩｂ遺伝子の導入により、アミロペクチンの鎖長分布を改変することができることも確認された。これらのデンプンは、構造的にはアミロペクチンの鎖長の分布において元の野生型の生物が生産するデンプンとは明らかに相違するものであり、またその特性、例えば糊化特性においても元の野生型の生物が生産するデンプンとは明らかに相違するものであった。
【０１７２】
また、これらの結果から、元の野生型の生物におけるデンプンの枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子の発現量を変化させることにより、元の野生型の生物が生産するデンプンの形質を改質することができ、ＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の程度によって鎖長を連続的に変化させることができることも明確になった。鎖長分布の変化に伴ってデンプンの糊化特性、デンプン粒の形態、デンプンの結晶性に影響を与えることも明確となり、これらの変化も鎖長分布の変化に連動して連続的であり、このことはＢＥＩＩｂ遺伝子の発現量を調節することにより、好みの物性や結晶性をもったデンプンを創製することができることを示している。
【０１７３】
したがって、本発明は、元の野生型の生物に比べて、デンプン合成に関与する酵素を過剰に発現させる方法を提供するものであり、また、新規な形質の異なるデンプンを生産する有用な変異体生物体、及びそれを製造する方法を提供するものである。
【０１７４】
本発明におけるデンプンを生産する生物としては、デンプン枝作り酵素ＩＩ型を有するものであるが、好ましくは植物、より好ましくは米、ムギ、トウモロコシなどの穀物植物、さらに好ましくはイネが挙げられる。
【０１７５】
本発明のデンプンの枝作り酵素の遺伝子の発現量としては、元の野生型のものに比べて多くても少なくてもよく、目的とするデンプンの形質に応じて適度の発現量を有するものを選択することができる。デンプンのアミロペクチンの枝分かれは、枝作り酵素による枝分かれの促進作用と、イソアミラーゼなどの枝切り分解酵素による枝分かれの抑制作用とのバランスによるものと考えられることから、枝分かれの少ないアミロペクチンはイソアミラーゼなどの枝切り分解酵素の活性化などによっても製造可能であるが、アミロペクチンの枝分かれ構造が適度に多い鎖長の比較的短いものの分布が適度に多いデンプンは、本発明の方法により初めて製造できるものであることから、枝作り酵素の発現量が過剰となる場合がより好ましい。
【０１７６】
本発明におけるデンプンの枝作り酵素の発現量を元の野生型と相違させる手段としては、前記した実験による方法、即ち当該酵素の遺伝子が欠損した変異体に当該酵素の遺伝子を導入し、この形質転換体から発現量の多い又は少ない形質転換体を選別する方法が好ましいが、野生型に当該酵素の遺伝子をさらに導入して過剰発現を誘発する方法など他の手段を採用することも可能である。
【０１７７】
また、本発明におけるデンプンの形質としては、糊化特性や鎖長の分布を例示してきたが、これらに限定されるものではなく、デンプンの枝作り酵素の発現量に応じて変化する形質であれば特に制限はない。
【０１７８】
３．デンプン枝切り酵素イソアミラーゼのプロモーターによる改変
次に、デンプン枝切り酵素イソアミラーゼのプロモーターについて説明する。
【０１７９】
本発明者らは、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）のイソアミラーゼの精製、そのｃＤＮＡ構造にについて報告してきた（Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２０８，２８３−２９３（１９９９））。この報告では全長のｃＤＮＡは明らかにされていないが、このイソアミラーゼの遺伝子がイネの第８染色体に位置していることを明らかにしてきた。
【０１８０】
一方、川崎らは、平均インサートサイズ１５５ｋＢ、７ゲノム相当のイネのゲノム（約４５０ＭＢ／ゲノム）のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリーを完成させ、これを公開してきた（川崎ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５５巻、第７号、４８７（１９９７））。
【０１８１】
そこで、本発明者らは、イネのイソアミラーゼの遺伝子の解析を進め、その結果に基づいてプローブを作成して、イネのＢＡＣライブラリーからイソアミラーゼのプロモーターを得ることに成功した。
【０１８２】
ジャポニカイネ（品種キタアケ）のゲノムを平均インサートサイズ１５５ｋＢのクローンをＢＡＣベクターに組み込んだニトロセルロースメンブレン４枚からなるゲノミックＤＮＡライブラリー（川崎ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５５巻、第７号、４８７（１９９７））を遺伝子の起源として用い、イネイソアミラーゼｃＤＮＡ（Ｆｕｊｉｔａら、１９９９年）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１５１７ｂｐ）をプローブＡ（図２９参照）として、ニトロセルロースメンブレン１枚当たり１２０ｎｇを用いて、ＥＣＬ法でサザンブロッティングを行った。図２９は、イネ（Ｏｓ）のイソアミラーゼ（ＩＳＡ）のｃＤＮＡの＃２６クローン（Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２０８，２８３−２９３（１９９９））の制限酵素地図と本発明で使用したプローブＡ及びプローブＢの位置を示す。プローブＡはＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩの１５１７ｂｐからなる断片であり、プローブＢは同じくＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩからなる６５４ｂｐの断片である。
【０１８３】
その結果、ポジティブに反応する候補クローン２種類（＃５９、＃６０）を単離した（図３０参照）。図３０はイネのＢＡＣライブラリーが転写されている４枚（左からＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの４枚）のニトロセルロースメンブレンを用いて、プローブＡによるサザンハイブリダイゼーションを行った（ＥＣＬ法）結果を示す図面に代わる写真である。図３０の左から２枚目（Ｂ）に２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）が得られた（図３０のＢの矢印）。
【０１８４】
得られた２つのポジティブクローン（＃５９、＃６０）を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で大量増殖し、ＤＮＡ抽出機（クラボー社製）でＢＡＣ ＤＮＡを調製した。精製したＢＡＣ ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩの８種類の制限酵素を用いて、３７℃、６時間加水分解し、アガロースゲルで電気泳動を行った。トランスブロッター（Ｓ＆Ｓ社製）を用いてゲルのＤＮＡをメンブレンに２時間転写し、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社製）でＵＶ照射してＤＮＡをメンブレンに結合させた。メンブレン当たり０．３５ｎｇの、プローブＡを用いて４２℃で一晩、穏やかに浸透させながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたメンブレンを洗浄した後、２×ＳＳＣで室温で浸透しながら洗浄した。現像はアマシャム社のＥＣＬキットを用いて行った。Ｘ線フィルムへの感光時間は５分間であった。プローブＡハイブリダイズさせた２日後、同じメンブレンを用いてプローブＢ（６５４ｂｐ）でも同じ条件でハイブリダイズさせた。
【０１８５】
この結果、２つのクローンともにプローブＡ、Ｂに反応したため（図３１及び図３２参照）、これらがイソアミラーゼ遺伝子を含んでいることがわかった。
【０１８６】
図３１は＃５９と＃６０の２つのポジティブクローンを８種類の制限酵素で切断して、プローブＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３１の左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素で切断した断片を示し、各々の断片は＃５９からのもの（各左側）と＃６０からのもの（各右側）を示している。図３１の左右の数値は断片の長さ（ｋｂ）を示している。
【０１８７】
図３２は、プローブとして図２９に示すプローブＢを用いた点を除き図３１と同様である。
【０１８８】
各断片はいずれも、プローブＡ及びプローブＢと反応していることが示された。
【０１８９】
以上の結果を参考にして、イネイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を作製した。得られたイネイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を図３３に示す。図３３のＡは図２９に示したイネのイソアミラーゼの前記ｃＤＮＡに相当するゲノミックＤＮＡであり、四角で示される部分がエキソン領域を示している。図３３のＢはイネのイソアミラーゼの前記ゲノミックＤＮＡの制限酵素地図を拡大して示している。図３３のＡの左側の点線から左側の四角部分であるエキソンがプローブＢに相当する領域のであり、右側の点線の右側がプローブＡに相当する領域のエキソンである。図３３のＣはクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片を示す。図３３のＣは、断片Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、断片ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、断片Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、断片Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋｂ）、断片ＰＳ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、及び断片Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ）をそれぞれ示す。
【０１９０】
また、ＢＡＣクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片（Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋｂ）、Ｐｓ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ））を０．８％低融点アガロースで電気泳動を行った後に切り出した。タカラ社製のβ−アガラーゼＩを用いて、アガロースを分解した後、マイクロコン１００（ミリポア社製）で、溶媒交換して精製し、０．８５ｆｍｏｌの断片ＤＮＡと、それぞれの制限酵素で切断した後、エビアルカリフォスファターゼ（ロッシュ社製）で脱リン酸化処理したｐＣＡＭＢＩＡプラスミド８．５ｆｍｏｌとともに、ＴＯＹＯＢＯ社製ライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）を用いて、１６℃で、一晩ライゲーション反応を行った。それらをエレクトロポーレーション（ＢＴＸ社製）を用いて、１．２９ＫＶで、ＧＩＢＣＯ社製大腸菌（エレクトロマックス、ＤＨ１０Ｂｃｅｌｌ）を、２５μｌ使用）に導入して形質転換させた。得られた形質転換体を３７℃で、２日間培養した後、ブルーホワイトセレクション法で、白コロニーを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、ＬＢ培地で大量増殖した。ｐＣＡＭＢＩＡプラスミドをキアーゲンプラスミドキット（キアゲン社製）で精製した。
【０１９１】
このようにして得られたサブクローリングしたクローンのうち、ＳＥ断片（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３７０を用いて、ダイジオキシ法で決定した。その結果、この断片はイソアミラーゼ遺伝子のプロモーター、翻訳開始、などを含んでいた。
【０１９２】
この遺伝子からイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターを決定した。これを配列表の配列番号７に示す。
【０１９３】
イソアミラーゼは、デンプンを製造するの枝分かれを分解してゆく酵素であり、生物特有のデンプンを製造するためにデンプン製造時の必要な時期に必要な量だけ発現するように制御されている。したがって、本発明のイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターは、イネ特有のデンプンを製造するために必要なイソアミラーゼの発現を制御するものであり、イネ様のデンプンを製造するに有用となる。例えば、本発明のプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子をイネ以外の生物に導入した場合には、イネと同様なデンプンを製造するために、デンプンの枝切り酵素であるイソアミラーゼが発現され、イネ様のデンプンをイネ以外の生物において製造することが可能となる。また、イネ以外の生物に由来するイソアミラーゼを有したまま、本発明のするプロモーター及びイソアミラーゼ遺伝子をイネ以外の生物に導入した場合には、両者の複合された形態のデンプンを製造できる可能性もある。
【０１９４】
このように本発明のイネのイソアミラーゼのプロモーターは、イネのデンプンを製造するために極めて重要な役割を果たすものであり、イネのデンプンの製造のみならず新規な形態を有するデンプンを製造するために極めて有用である。
【０１９５】
本発明のプロモーターは、配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するものとして得られたが、これらの全部の配列が必要ではなく、イソアミラーゼの発現の制御に関係少ない部分の塩基配列は任意に変更することができる。
【０１９６】
現在のところでは、どの部分がイソアミラーゼの発現の制御に重要であるかということは必ずしも明確に分析されてはいないが、転写開始コドンから上流５００塩基、好ましくは７００塩基〜１０００塩基程度は必要であると考えられる。好ましい、塩基配列としては配列表の配列番号７の２５２１−３２８８までの塩基配列を挙げることが出来るが、これに限定されるものではない。さらに、これらの塩基配列についても、これらの塩基配列が配列表の配列番号７のとおりの塩基配列である必要ではなく、イソアミラーゼの発現の制御に関係少ない部分の塩基配列は任意に変更することができる。
【０１９７】
塩基配列の変更としては、配列表の配列番号７の塩基配列の一部を削除し、また他の塩基配列を付加し、他の塩基配列で置換するな、並びにこれらの組み合わせにより、任意にその塩基配列を変更することができる。変更の手段としては、公知の各種の手段を採用することができる。
【０１９８】
このように変更された塩基配列を有するプロモーターも、前記した本発明のプロモーターと同種の作用効果を有する限りにおいては、本発明のプロモーターに包含されるものである。
【０１９９】
本発明のプロモーターは、イネのイソアミラーゼ遺伝子より分離されたものであるが、イソアミラーゼ遺伝子としてはイネのイソアミラーゼ遺伝子に制限されるものではない。イソアミラーゼ遺伝子は生物種により異なってはいるが、本発明のプロモーターにより発現の制御が可能でる限りにおいて、如何なるイソアミラーゼ遺伝子であってもよい。例えば、本発明のプロモーターをコムギのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入したり、他品種のイネのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することもできる。このように、本発明のプロモーターをイソアミラーゼ遺伝子を有する別の生物にそのプロモーター部分のみを導入することにより、デンプンの枝切り酵素の作用が異なった新規な形態や蓄積法をしたデンプンを得ることも可能となる。
【０２００】
また、本発明のプロモーターを有するイネに他の品種または植物のイソアミラーゼ遺伝子を導入して、イネに新規な形態や蓄積法をしたデンプンを製造させることも可能となる。
したがって、本発明は、本発明のプロモーターを用いて新規な形態（アミロペクチンの構造的な解析、また特性や蓄積場所や味覚などの相違により区別可能なデンプンの形態）のデンプンを製造する方法を提供することが可能となる。本発明の方法による新規なデンプンは、本発明のイネに特有なデンプンを製造するようにイソアミラーゼの発現が制御されたプロモーターと、その下流に位置するイソアミラーゼ遺伝子との組み合わせにより可能となる。
【０２０１】
また、本発明は、本発明のプロモーターとイソアミラーゼ遺伝子が発現に適した形態で配置された遺伝子を提供するものでもある。
【０２０２】
前記で具体的に示してきた本発明のプロモーターはジャポニカ米のプロモーターであり、ジャポニカ米のデンプンを製造に必須のプロモーターである。インディカ米は、ジャポニカ米とは異なる形態のデンプンを製造しており、これは主としてデンプンの枝切り酵素であるイソアミラーゼによるところが大きいと考えられている。勿論、両者のイソアミラーゼ酵素自体の相違によるところも考えられるが、両者のデンプンの形態の相違は、そのプロモーターの相違によるところも多い。このように、本発明のプロモーターを、デンプンの形態が異なる他品種のイネのイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することも極めて有用な方法である。さらに、本発明のプロモーターを、イネ以外の生物、好ましくは植物のイソアミラーゼ遺伝子の上流に導入することも考えられる。
【０２０３】
本発明のプロモーターが結合しするイソアミラーゼ遺伝子としては、デンプンの形態が異なる他の品種のイネ、コムギやオオムギなどの他の穀物植物、イモやマメ、トウモロコシなどの雑穀植物などや、デンプンを製造する細菌類や藻類などのイソアミラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０２０４】
さらに、本発明の前記したイソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターが配置されてなる遺伝子を通常の方法によりベクターに組み込むことができ、必要に応じて当該ベクターを用いて適当な細胞を形質転換させることができる。したがって、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターが配置されてなる遺伝子を含有してなるベクター、及びそれにより形質転換された形質転換体を提供するものでもある。形質転換される宿主細胞としては、イネやムギなどの高等植物細胞が好ましいが、これに限定されるものではなく、イソアミラーゼを発現し得る細胞であればよい。
【０２０５】
また、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子の上流に本発明のプロモーターを配置してなる遺伝子を用いてイソアミラーゼを発現させる方法を提供する。イソアミラーゼはデンプンの製造に必要となる酵素であるが、デンプンの製造に限定されるものではなく、イソアミラーゼ自体を発現させる方法であれば本発明の方法に包含されるものである。
【０２０６】
前述してきたように、アミロペクチンのクラスター構造の微妙な相違が、デンプンの特性を大きく変化させることから（例えば、イネのジャポニカとインディカの相違を参照されたい。）、本発明のイネのイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターは、イネ特にジャポニカ米に特有なデンプンを製造するに必要なイソアミラーゼの発現を制御できるものであり、これを用いた新品種の創製は新しいデンプンの創製に大きな役割を果たすものである。
【０２０７】
なお、特願２００１−２７３１６６明細書、特願２００１−２７７１０９明細書、特願２００１−２７７１２０明細書、及び、特願２００１−２８７０１０明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【０２０８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０２０９】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）の種子は、独立行政法人農業生物資源研究所（筑波）のジーンバンクから譲り受けた。これらの植物は、初夏に自然の条件下で育成され、成熟種子は使用されるまで４〜８℃で保存された。
【０２１０】
実施例１ アミロペクチンの鎖長分布の分析
アミロペクチンのα−１，４−グルカンの鎖長分布を測定するために、キャピラリー電気泳動による以下の方法により行った。
成熟乾燥種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で磨砕し、αポリグルカンの分子構造解析用試料とした。試料粉末５ｍｇに５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％メタノールを５ｍｌ加え二度洗浄した。沈殿に３００μｌの０．２５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５分間煮沸してデンプンを糊化させた。糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水１．０９ｍｌ、０．６Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）１００μｌ、２％アジ化ナトリウム１５μｌを加えた。Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（３５４単位、生化学工業）６μｌを加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃、２４時間反応させた後、２０分間煮沸し、遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。
蛍光標識及びキャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ５０００，Ｂｅｃｋｍａｎ）は、オーシーアら（Ｏ’Ｓｈｅａ，ｅｔ ａｌ）の方法に準じて行った。プロトコルはｅＣＡＰＮ−リンクドオリゴサッカライドプロファイリングキット（ｅＣＡＰ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いることにより製造業者から提供された。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも３回の別々の測定を行った。
この結果を、表１〜４、並びに図５、図６、及び図２６に示す。
【０２１１】
実施例２ （ＤＳＣによる熱糊化特性の測定）
各々のイネの品種から、ランダムに３粒の種子を選択し、種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で均一化した。粉末をエッペンドロッフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）にいれ、１０５℃で２時間加熱乾燥し、使用するまでデシケーターで保存した。デンプンの糊化特性は示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；ＤＳＣ）（ＤＳＣ−７，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により行った。各々５ｍｇのデンプン試料を銀製のサンプルパンに入れ、４０μｌの脱イオン水と混合し、密封した。サンプルは３℃／分の速度で１０℃〜１２０℃まで昇温させた。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回、殆どの場合は３回の別々の測定を行った。
この結果を表１〜４、表５、及び表８に示す。
【０２１２】
実施例３ （アミロース含有量の測定）
各々のイネの品種から、種子を選択し、種子から外内穎および胚を取り除き、乳鉢と乳棒で均一化した。得られた粉末のアミロース含有量は、アミログラフを用いて測定された。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回別々の測定を行った。
この結果を表１〜４、並びに図７及び図８に示す。
【０２１３】
実施例４ （殼のフェノール色素反応）
粒を室温で１．５％フェノール溶液に３〜６時間浸けた。そして、穏やかに乾燥した。殻の着色を染色された染色されなかったかにかかわらず記録した。
イネの各々の品種のランダムに選択された異なる種子を用いて、少なくとも２回別々の測定を行った。
この結果を表１〜４に示す。
【０２１４】
実施例５ （ＳＳＩＩａをコードする遺伝子の単離と配列の決定）
日本晴のＳＳＩＩａ遺伝子は、独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含む２種類のＰＡＣクローン（Ｐ４４１，Ｐ４５０）を使用した。また、カサラスのＳＳＩＩａ遺伝子は、同じく独立行政法人・農業生物資源研究所イネゲノム研究チームが調製したＳＳＩＩａ遺伝子を含むＢＡＣクローンを使用した。
このＰＡＣクローン、及びＢＡＣクローンを種々の制限酵素（ＥｃｏＲ Ｖ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ等）で加水分解した。それぞれの断片を、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋）にサブクローンした後、プラスミドＤＮＡを調製し、それぞれのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
得られた日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を図１３に示す。また、日本晴の塩基配列を配列表の配列番号１に、カサラスの塩基配列を同配列番号２に示す。また、日本晴のエキソン部分の塩基配列を配列表の配列番号３に、カサラスのものを配列番号４にそれぞれ示す。さらに、日本晴のＳＳＩＩａのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、カサラスのものを配列番号６にそれぞれ示す。
【０２１５】
実施例６ （日本晴のＳＳＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列の決定）
Ｃａｐ Ｓｉｔｅ ｃＤＮＡ ｄＴ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）をＤＮＡの鋳型として、種々のｃＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応産物をプラスミドにサブクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を、ジデオキシ法によってＤＮＡシーケンサーで決定した。
【０２１６】
実施例７ （日本晴とカサラスのＳＳＩＩａ遺伝子の構造決定）
前記実施例６に記載の方法によって求められたゲノミックＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、ｃＤＮＡの塩基配列を比較する事によって、ＳＳＩＩａ遺伝子のイントロン、エキソンの位置を決定した。
【０２１７】
実施例８
（１）ＢＡＣ ライブラリー
イネゲノムＤＮＡライブラリーとして、イネ品種「シモキタ」のＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）を利用した。このＢＡＣライブラリーは、マイクロプレートサイズのメンブレンに固定したもので、ゲノムＤＮＡはシモキタの緑葉のプロトプラストから調製したものであり、平均インサートサイズ１５５ｋｂである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２０．）。
（２）植物形質転換用バイナリーベクター
アグロバクテリウムを介してイネに遺伝子を導入させるバイナリーベクターとしてｐＣＡＭＢＩＡ１３００を用いた。このベクターはＣＡＭＢＩＡ（Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のジェファーソン（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）博士より分与されたものである。また、このベクターは、カナマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を保持しており、それら抗生物質をマーカーとして形質転換体をスクリーニングすることができる。
【０２１８】
実施例９ （ＢＥＩＩｂ遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ断片の単離）
ＢＡＣライブラリーから、イネのＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子をコードするクローンをスクリーニングするために、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをプローブとして用いた。イネ品種フジヒカリのＢＥＩＩｂのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、その結果得られた１７４０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動した後、ウルトラフリーＤＡ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でアガロースゲルから抽出、精製した。このＤＮＡ断片を、ＥＣＬダイレクト核酸ラベル化及び検出システム（ＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によりラベルしプローブとして用いた。ラベル化の方法は、付属の説明書にしたがった。以下に述べるハイブリダイゼーションおよびメンブレンの洗浄もこのＥＣＬシステムを利用し、方法は説明書にしたがった。
ＢＡＣライブラリーのメンブレンを上述のＢＥＩＩｂのｃＤＮＡ断片プローブとハイブリダイゼーシヨンさせた結果、プローブとハイブリダイズするシグナルを得た。そのシグナルに対応するプラスミドを保持する大腸菌のクローンを得て、それをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、プラスミド自動抽出機（ＰＩ−１００Ｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｕｒａｂｏ）によりプラスミドを抽出した。
前述のようにＢＡＣライブラリーの平均インサートサイズは１５５ｋｂであり、そのような長いＤＮＡ断片には複数の遺伝子が存在することも考えられる。ＢＥＩＩｂ遺伝子がコードされている領域のみを得る必要があることから、ポジティブクローンから得たプラスミドについてサザンブロット解析を行なった。プラスミドを制限酵素ＳａｌＩ（ニッポンジーン）で切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｎｙｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にＤＮＡ断片を転写させた。上述のプローブを用い、ＥＣＬシステムにより、メンブレンとハイブリダイゼーシヨンさせた。その結果、プローブは１７ｋｂのＤＮＡ断片とハイブリダイズした。そのＤＮＡ断片を単離するために、プラスミドをＳａｌＩで切断した後、低融点アガロースゲル（ＮＵＳＩＥＶＥ ＧＴＧ，ＦＭＣ）で電気泳動し、目的の１７ｋｂ断片を含む領域のゲルを切り出し、ｂ−アガラーゼ（ニッポンジーン）によりアガロースを分解し、ＤＮＡ断片を抽出、精製した。
【０２１９】
実施例１０ （ＢＥＩＩｂゲノムＤＮＡ断片のサブクローニングおよび塩基配列の解析）
バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００をＳａｌＩで切断した後、６５℃、１５分の処理によりＳａｌＩを失活させた。次に、エビアルカリホスファターゼ（ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ））を３７℃、１時間反応させ、ＳａｌＩ切断により生じた５’末端を脱リン酸化させた。続いて、６５℃、１５分の処理によりエビアルカリホスファターゼを失活させた。ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした１７ｋｂのＤＮＡ断片をサブクローニングするために、ＳａｌＩ切断およびエビアルカリホスファターゼ処理したｐＣＡＭＢＩＡ１３００とＴ４ＤＮＡリカーゼ（ニッポンジーン）により１６℃、一晩ライゲーションした後（これをｐＣＢＥＩＩｂとした）、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ）を形質転換した。ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）に生えた大腸菌をＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で一晩培養し、クイアゲンプラスミドミディキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））によりプラスミドを抽出、精製した。方法はキットに付属の説明書にしたがった。
このバイナリーベクターにサブクローニングした１７ｋｂＤＮＡ断片の制限酵素地図を決定し、断片化した後、塩基配列を解析した。塩基配列の解析は、既知の方法によった（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｄｙｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎまたはＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ともにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、並びにＡＢＩ ３７３ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いた。得られたデータは、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ バージョン１０．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）により解析した。その結果、１７ｋｂゲノムＤＮＡ断片には、ＢＥＩＩｂ遺伝子の完全長がコードされており、ＢＥＩＩｂのｃＤＮＡの塩基配列との比較により、ＢＥＩＩｂゲノミック遺伝子は２２エキソン、２１イントロンからなることが明らかになった。
また、このＤＮＡ断片には、遺伝子の上流域が約２．２ｋｂ存在し、プロモーター領域は全て含まれていると考えられた。さらに、下流域は約３ｋｂ存在し、ターミネーター領域は全て含まれると考えられた。そこで、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００サブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をコードする１７ｋｂＤＮＡ断片をイネに導入することにした。
【０２２０】
実施例１１ （ＢＥＩＩｂ遺伝子を導入したイネａｅ変異体の形質転換体の作製）
アグロバクテリウムを介した形質転換法により、上述のバイナリーベクターにサブクローニングしたＢＥＩＩｂ遺伝子をイネａｅ変異体であるＥＭ１０（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６９：２５３−２５７．）に導入し、形質転換体を作製した。イネの組織培養および形質転換は土岐（Ｔｏｋｉ）の方法（Ｔｏｋｉ，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５：１６−２１．）にしたがった。
まず、ｐＣＢＥＩＩｂをエレクトロポレーシヨン法によりアグロバクテリウムツネファシエンスＥＨＡ１０５株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株）に導入した。このアグロバクテリウムをＥＭ１０のカルスに感染させ、ＤＮＡ導入し、形質転換させた。形質転換体は、ハイグロマイシンによりスクリーニングした。植物体に再分化したイネ個体はポットに移植し、温室で、自然光、２８／２４℃（６−１８時／１８−６時）の条件で生育させた。
得られた形質転換体の中から６系統を選別し、これらのサザンブロット解析の結果を図２３に示す。ノーザンブロット解析の結果を図２４に示す。また、ウエスタンブロット／活性染色法による解析の結果を図２５に示す。
さらに、これらの形質転換イネのアミロペクチンの分子構造について、それらの鎖長分布解析の結果を図２６にグラフ化して示す。これらの形質転換イネのデンブンの熱糊化特性及び種子重量を表８に示す。
【０２２１】
実施例１２ （プローブＡを用いたＢＡＣライブラリーのメンブレン上でのハイブリダイゼーション）
平均インサートサイズ１５５ｋＢのクローンが転写されたジャポニカイネ（品種キタアケ）のゲノミックＤＮＡのＢＡＣライブラリーのメンブレン４枚について、イネイソアミラーゼｃＤＮＡ（Ｆｕｊｉｔａら、１９９９年）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１５１７ｂｐ）をプローブＡ（図２９参照）として、ニトロセルロースメンブレン１枚当たり１２０ｎｇを用いて、ＥＣＬ法でサザンブロッティングを行った。ＥＣＬ法によるサガンブロッティングは、アマシャム社のマニュアルに従った。その結果、ポジティブに反応する候補クローン２種類（＃５９、＃６０）を単離した。
結果を図３０に示す。図３０の左から２枚目（Ｂ）に２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）（図３０中の矢印）が見られた。
【０２２２】
実施例１３ （ＢＡＣクローンのノーザンブロッティング）
実施例１２で得られた２つのポジティブクローン（＃５９、＃６０）を、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で大量増殖し、ＤＮＡ抽出機（クラボー社製）でＢＡＣ ＤＮＡを調製した。
０．５μｇ相当の精製ＢＡＣ ＤＮＡを８種類の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ）を用いて、３７℃、６時間加水分解し、０．７％アガロースゲルで電気泳動を行った。トランスブロッター（Ｓ＆Ｓ社製）を用いてゲルのＤＮＡをメンブレンに２時間転写（転写液は２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０））、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社製）で３０秒間ＵＶ照射してＤＮＡをメンブレンに結合させた。
メンブレン当たり０．３５ｎｇのプローブＡを用いて４２℃で一晩、穏やかに浸透させながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション用バッファー及びプローブのラベリング試薬はアマシャム社のＥＣＬキットに従って行った。ハイブリダイズさせたメンブレンは、プライマリー洗浄緩衝液（Ｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｕｒｅａ＋）（６Ｍ 尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ））で４２℃で２５分２回洗浄した後、２×ＳＳＣで室温で５分２回浸透しながら洗浄した。現像はアマシャム社のＥＣＬキットを用いて行った。Ｘ線フィルムへの感光時間は５分間であった。結果を図３１に示す。
プローブＡでハイブリダイズさせた２日後、同じメンブレンを用いてプローブＢ（６５４ｂｐ）でも同じ条件でハイブリダイズさせた。結果を図３２に示す。
２つのクローンともにプローブＡ、Ｂに反応したため（図３１及び図３２参照）、これらがイソアミラーゼ遺伝子を含んでいることがわかった。
実施例１３の結果に基づいて、イネのイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を作製した。イネのイソアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を図３３のＢに示す。
【０２２３】
実施例１４ （ＢＡＣクローン＃６０のサブクローニング）
ＢＡＣクローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた断片（Ｅ１（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、７．２ｋｂ）、ＳＥ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、２．４ｋｂ）、Ｐ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、５．１ｋ）、ＰＳ（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ、４．８ｋｂ）、Ｅ２（ＥｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、５．８ｋｂ））を０．８％低融点アガロースで電気泳動を行った後に切り出した。
タカラ社製のβ−アガラーゼＩを用いて、アガロースを分解した後、マイクロコン１００（ミリポア社製）で、溶媒交換して精製し、０．８５ｆｍｏｌの断片ＤＮＡとそれぞれの制限酵素で切断した後、エビアルカリフォスファターゼ（ロッシュ社製）で脱リン酸化処理したｐＣＡＭＢＩＡプラスミド８．５ｆｍｏｌとともに、ＴＯＹＯＢＯ社製ライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）を用いて１６℃で、一晩ライゲーション反応を行った。それらをエレクトロポーレーション（ＢＴＸ社製）を用いて１．２９ｋＶでＧＩＢＣＯ社製大腸菌（エレクトロマックスＤＨ１０Ｂ細胞を２５μｌ使用）に導入して形質転換させた。エレクトロポーレーションには２ｍｍのスリットの入ったキュッベットを用い、プレカルチャーを５０分行った後、４％Ｘ−ｇａｌを３０μｌ、０．１Ｍ ＩＰＴＧを２５μｌ塗布したシャーレに菌を播いて３７℃で２日間培養した。
ブルーホワイトセレクション法で白コロニーを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で大量増殖した。ｐＣＡＭＢＩＡプラスミドをキアゲンプラスミドキット（キアゲン社製）で精製した。プラスミドの精製法はキアゲンキットのマニュアルの方法で行った。
【０２２４】
実施例１５ （サブクローンのシーケンス）
実施例１４でサブクローリングしたクローンのうち、ＳＥ断片（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ、４．８ｋｂ）の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３７０を用いて、ジデオキシ法で決定した。シーケンス反応は、ＡＢＩ社製のダイターミネーターキットを用いて行った。その結果、この断片はイソアミラーゼ遺伝子のプロモーター、翻訳開始点などを含んでいた。
得られた本発明のイネのイソアミラーゼのプロモーター部分の塩基配列を配列番号７に示す。
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明は、植物のデンプン合成酵素系における酵素を遺伝子工学的に改変することにより、新規なデンプンを製造する方法、そのための遺伝子、その形質転換体、それのより製造された新規デンプンを提供するものである。デンプンは食糧として重要であるだけでなく、その糊化特性などの物性を利用した産業原料としても重要であり、本発明により提供されるデンプンは食品類のみならず、産業原料としても重要なものである。
【０２２６】
より詳細には、本発明は、イネのデンプンにおけるアミロペクチンの微細構造と、デンプンの物性や味などの性質との相関関係を見出し、アミロペクチンのα−１，４−グリシド鎖の鎖長分布に基づいて世界中で栽培されているイネをＬ−タイプ、Ｓ−タイプ、及びこれらの中間であるＭ−タイプに分類されることを見出した。そして、これらのアミロペクチンの微細構造の違いがデンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）の活性によるものであることを明らかにし、各タイプのＳＳＩＩａをコードする遺伝子を単離し、その構造及び塩基配列を決定した。
【０２２７】
本発明の遺伝子を用いることにより、目的とするアミロペクチンの微細構造を有するデンプンを製造することができ、目的に応じた物性を有するデンプンを製造することが可能となる。また、本発明の遺伝子の構造や塩基配列に基づいてイネのＳＳＩＩａ遺伝子を改変することにより、有用なデンプンを産生するＳＳＩＩａ遺伝子が改変されたイネを提供することができ、また天然のイネとは異なる鎖長分布や物性を有する新規なデンプンを製造することが可能となり、食品や各種の産業用として新規な有用なデンプンを大量に供給することが可能となる。
【０２２８】
また、本発明は、デンプンの生産に関与している酵素の遺伝子の発現量の相違に基づいて、生産されるデンプンの形質が異なってくることを見出したものであり、また導入した酵素の遺伝子が元の野生型よりも過剰に発現することがあることも本発明により初めて見出されたものである。
【０２２９】
本発明は、このような新規な知見に基づいてデンプン合成酵素を天然のものよりも過剰に発現させる方法、デンプン合成酵素を天然のものとは異なる量発現する変異体、及びその製造方法を提供するものである。
【０２３０】
本発明によれば、現存する生物の生産するデンプンを、デンプン合成酵素、好ましくはデンプンの枝作り酵素が過剰又は不足した系を生物体の中に実現することができ、それにより、元のデンプンとは形質の異なる新たな形質を有するデンプンを任意に製造することができるようになる。
【０２３１】
さらに、本発明は、イネ、より具体的にはジャポニカ米に特有なデンプンを製造するために必要なイソアミラーゼ遺伝子のプロモーターに関するものであり、イソアミラーゼの発現をジャポニカ米に特有なデンプンを製造するために必要なように制御し得るものである。本発明のプロモーターにより、デンプンの主成分であるアミロペクチンの形態をイネのデンプンの形態に制御することが可能となり、各種の生物に本発明のプロモーターを適用することにより、デンプン合成に関与する酵素遺伝子を本プロモーターに連結することでよって、イネなどの植物の胚乳に、天然には存在しない新規な物性、品質を持つデンプンを多量に合成、蓄積させることが可能となる。また、本発明のプロモーターを有するイネに、他の生物に由来するイソアミラーゼ遺伝子を本発明のプロモーターに連結することによって、導入遺伝子産物をイネの胚乳などに、多量に蓄積させることが可能である。
このように、本発明は、生物、好ましくは植物などのデンプンを生成する生物のデンプンの製造を制御可能にするものであり、新しいデンプンの合成や蓄積手段を提供できるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】図１は、生物における貯蔵性ポリグルカンの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造を示すものである。
【図３】図３は、イネ胚乳におけるジャポニカとインディカとのアミロペクチンのクラスター構造の相違を示すものである。
【図４】図４は、生物における貯蔵性ポリグルカンである、アミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの生合成経路の概要を示すものである。
【図５】図５は、ジャポニカの＃１４３とインディカの＃３０３についての鎖長分布を分析した結果を示すものである。図５の上段の図（図５Ａ）は各々の鎖長の分布を示し、横軸は鎖長（α−１，４−鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を示し、縦軸は頻度（モル％）を示す。白抜きはジャポニカ（＃１４３）を示し、黒塗りはインディカ（＃３０３）を示す。図５の下の図（図５Ｂ）は、各々の鎖長におけるジャポニカ（＃１４３）の頻度からインディカ（＃３０３）の頻度を引いた（＃１４３−＃３０３）差を頻度（％）として示している。
【図６】図６は、いくつかの種類のイネについてインディカ（＃３０３）との鎖長の分布の差を図５Ｂと同様にして分析した結果を示すものである。図６は左側の上から＃１０３との差、＃２３４との差、＃３１０との差、及び＃４０９との差を示し、右側は＃２１５との差、＃２０２との差、＃３０２との差、及び＃４０８との差をそれぞれ示す。
【図７】図７は、今回調査した１２９品種について算出されたＡＣＲの値におけるヒストグラムを示している。横軸はＡＣＲの値を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【図８】図８は、今回調査した各種類のイネについて図７と同様にヒストグラム化したものである。図８に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は４７）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３４）、左下はインディカのものであり（個数は２３）、右下は中国のインディカのものである（個数は２５）。
【図９】図９は、アミロペクチンの微細構造とデンプンの熱特性の相関を示す相関図である。図９の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はアミロペクチンのＤＰが１０以下の量の比（ＡＣＲ）を示している。図９の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【図１０】図１０は、は今回調査した１２９品種のうちの１００品種についてのアミロース含有量のヒストグラムを示している。横軸はアミロース含有量（全デンプンに対する割合（％））を示し、縦軸は出現頻度を示している。
【図１１】図１１は、今回調査した各種類のイネについて図１０と同様にヒストグラム化したものである。図１１に左上は温帯ジャポニカ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は３８）、右上は熱帯ジャポニカ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｊａｐｏｎｉｃａ）のものであり（個数は２５）、左下はインディカのものであり（個数は１９）、右下は中国のインディカのものである（個数は１８）。
【図１２】図１２は、デンプンのアミロース含有率と糊化開始温度との相関を示す相関図である。図１２の横軸はデンプンの糊化開始温度（Ｔｏ（℃））を示している。縦軸はデンプンのアミロース含有率（％）を示している。図１２の黒菱形印（◆）は温帯ジャポニカを示し、黒四角印（■）は熱帯ジャポニカを示し、黒三角印（▲）はインディカを示し、バツ印（×）は中国インディカをそれぞれ示している。
【図１３】図１３は、本発明の日本晴とカサラスのスターチシンターゼＩＩａ（ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳＩＩａ）遺伝子の構造を示すものである。図１３の四角枠はエキソン領域を示し、四角枠の間はイントロンを示す。それぞれの番号は、エキソン及びイントロンの順序を示している。図１３中のアスタリスクは、アミノ酸が変わる部分を示している。図１３には併せて制限酵素による切断位置を示す。
【図１４】図１４〜図１８は、日本晴（５９３５ｂｐ）とカサラス（５９２８ｂｐ）のゲノムＳＳＩＩａ遺伝子の全配列の比較して示すものである。図１４〜図１８の各図の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。このうちプロモーター部分は日本晴では１〜１，３４１番目までであり、カサラスでは１〜１，３３１番目までである。図１４はこのうちの１番目〜１２６０番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１５】図１５はこのうちの１２６１番目〜２５２０番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１６】図１６はこのうちの２５２１番目〜３７７９番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１７】図１７はこのうちの３７８０番目〜５０３７番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１８】図１８はこのうちの５０３８番目〜５９３５番目（日本晴）までの比較を示している。
【図１９】図１９〜図２０は、日本晴とカサラスのそれぞれのエキソン部分の塩基配列（２６０７ｂｐ）の比較を示すものである。図１９〜図２０の各図の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものであり、転写開始点を１番にしている。図１９はこのうちの１番目〜１２６０番目までの比較を示している。
【図２０】図２０はこのうちの１２６１番目〜２６０７番目までの比較を示している。
【図２１】図２１は、日本晴とカサラスのＳＳＩＩａのアミノ酸配列の比較を示すものである。図２１の各行の上段が日本晴のものであり、下段がカサラスのものである。
【図２２】図２２は、各品種が製造するデンプン（アミロペクチン）のＤＰ（α−１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）を測定した結果を示したものである。図２２の上段は品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）のものであり、中段は品種ＩＲ３６のものであり、下段は形質転換体＃７８−１のものである。中段及び下段の右側は、各品種の品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）との差を示している。即ち、中段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と品種ＩＲ３６との差を示したものであり、下段の右側は各ＤＰにおける品種金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）と形質転換体＃７８−１との差を示したものである。
【図２３】図２３は、本発明の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８についてサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２３は左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃７−８の各レーンを示し、図２３の上段の（ａ）はＢａｍＨＩを用いた場合であり、下段の（ｂ）はＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合である。
【図２４】図２４は、本発明の形質転換体についてノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２４の左から、「金南風」、ＥＭ１０、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８、ひとつ間を置いて、＃１−１、＃２−６、及び＃９−８の各レーンを示し、縦方向はデンプンを製造する際の各デンプン合成酵素を示す。ＢＥＩはデンプン枝分かれ酵素Ｉを、ＢＥＩＩａはデンプン枝分かれ酵素ＩＩａを、ＳＳＩはデンプン合成酵素Ｉを、ＳＳＩＩＩはデンプン合成酵素ＩＩＩを、ＩＳＡはイソアミラーゼを、ＰＵＬはプルラナーゼを、それぞれ示している。最下段はｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を示す。
【図２５】図２５は、本発明の形質転換体の中から＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、＃７−８及び＃１−１についてウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）／活性染色法による解析（図２５上段）、及びネイティブ−ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色法による解析（図２５下段）を行った結果を示す、図面に代わる写真である。図２５の上段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１の各レーンを示し、縦方向はＢＥＩ及びＢＥＩＩｂのブロットを示す。図２５の下段の左から「金南風」（Ｋｉｎｍａｚｅ）、ＥＭ１０、ａｅ変異型、相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）、過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）を示し、縦方向はＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ、及びＢＥＩをそれぞれ示す。
【図２６】図２６は、本発明の形質転換体及びａｅ変異体のＥＭ１０について、アミロペクチンの鎖長の分布を野生型（金南風）の鎖長分布を比較した結果を示すグラフである。図２６の横軸は鎖長の長さを１〜６０まで示しており、図２６の縦軸は各鎖長における野生型（金南風）との鎖長分布の割合（％）の差を示している。図２６の上段は、ＥＭ１０（黒丸印−●−）、形質転換体の相補型（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ型）（＃１０６−５）（白丸印−○−）、並びにａｅ変異型（＃７−８）（黒三角印−▲−）及びａｅ変異型（＃９−８）（黒四角印−■−）についてのものであり、図２６の下段は、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃３１−１）（黒丸印−●−）、形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１１３−７）（黒四角印−■−）、及び形質転換体の過剰発現型（Ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ型）（＃１−１）（黒三角印−▲−）についてのものである。
【図２７】図２７は、本発明の新規なデンプンを走査型電子顕微鏡でそれらの形態を観察した結果を示す図面に代わる写真である。図２７の上段は１０００倍に拡大した場合を示し、下段は４０００倍に拡大した場合を示している。それぞれの写真の白いバーはスケールを示している。図２７の各段の左からＥＭ１０、＃７−８、＃９−８、＃１０６−１、その下段の左から金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）、＃３１−１、＃１１３−７、及び＃１−１をそれぞれ示している。
【図２８】図２８は、本発明の新規なデンプンをＸ線回折パターンを調べた結果を示す。図２８の縦軸は強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角度（２θ）を示す。図２８の上からＥＭ１０（Ａ）、＃７−８（Ｂ）、＃９−８（Ｃ）、＃１０６−１（Ｄ）、金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）（Ｅ）、＃３１−１（Ｆ）、及び＃１１３−７（Ｇ）をそれぞれ示す。
【図２９】図２９は、イネのイソアミラーゼｃＤＮＡの＃２６クローンの制限酵素地図と、その下段の本発明の方法で用いたプローブＡ及びプローブＢの位置を示すものである。
【図３０】図３０は、イネ（キタアケ）のＢＡＣライブラリーが転写されている４枚のメンブレンシートを用いて、プローブＡによりサザンハイブリダイゼーション（ＥＣＬ法）を行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｎｏ．２のシートに２つのポジティブクローン（＃５９及び＃６０）が得られた（図中の矢印）。
【図３１】図３１は、ポジティブクローン＃５９及び＃６０を８種類の制限酵素で切断し、プローブＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌ、ＳａｌＩ、Ｓｐｅｌ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素を示し、各酵素の左側のレーンはクローン＃５９を、右側はクローン＃６０を示す。縦軸は塩基長を示す。
【図３２】図３２は、ポジティブクローン＃５９及び＃６０を８種類の制限酵素で切断し、プローブＢを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面に代わる写真である。左からＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌ、ＳａｌＩ、Ｓｐｅｌ、ＰｓｔＩ、及びＸｂａＩの８種類の制限酵素を示し、各酵素の左側のレーンはクローン＃５９を、右側はクローン＃６０を示す。縦軸は塩基長を示す。
【図３３】図３３は、本発明の結果から示されるイネのイソアミラーゼのゲノミックＤＮＡを模式的に示したものであり（図３３のＡ）、四角で囲った部分はエキソンをしめす。図３３の中段のＢは、その制限酵素地図を拡大して示したものである。図３３下段のＣは、クローン＃６０をいくつかの制限酵素で切断して得られた各種のサブクローンの領域を模式的に示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型よりも過剰となる種を選別することからなる、当該酵素を元の野生型よりも過剰に発現させる方法。
【請求項２】
生物が、イネである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる種を選別することからなる、デンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法。
【請求項５】
変異体が、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なることにより、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産する変異体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該酵素の発現量が、元の野生型に比べて過剰量である請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
生物が、イネである請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造された変異体。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造された変異体を用いて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法。
【請求項１１】
変異体が、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素を過剰に発現する変異体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デンプンの形質が、デンプンの糊化の特性により示されるものである請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物が、イネである請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法により製造されたデンプン。
【請求項１６】
デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれとは異なることを特徴とする請求項１５に記載のデンプン。
【請求項１７】
デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれよりも短いものである請求項１６に記載のデンプン。
【請求項１８】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法。
【請求項１９】
デンプンの形質が、デンプンの糊化の特性により示されるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
変異体Ｂが、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素を過剰に発現する変異体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物が、イネである請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
デンプンの糊化開始温度が、元の野生型の生物が生産するデンプンよりも低いデンプンである請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型よりも過剰となる種を選別することからなる、当該酵素を元の野生型よりも過剰に発現させる方法。
【請求項２】
生物が、イネである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体に、当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる種を選別することからなる、デンプンの枝作り酵素の１種の発現量が元の野生型とは異なる変異体を製造する方法。
【請求項５】
変異体が、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なることにより、元の野生型の生物とは異なる形質を有するデンプンを生産する変異体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該酵素の発現量が、元の野生型に比べて過剰量である請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
生物が、イネである請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造された変異体。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造された変異体を用いて、元の野生型の生物が生産するデンプンとは異なる形質を有するデンプンを製造する方法。
【請求項１１】
変異体が、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素を過剰に発現する変異体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デンプンの形質が、デンプンの糊化の特性により示されるものである請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物が、イネである請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法により製造されたデンプン。
【請求項１６】
デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれとは異なることを特徴とする請求項１５に記載のデンプン。
【請求項１７】
デンプンの単位構造（クラスター）を形成する鎖の長さが、元の野生型の生物が生産するデンプンのそれよりも短いものである請求項１６に記載のデンプン。
【請求項１８】
デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素の１種が欠損した変異体Ａを製造し、次いでこの変異体Ａに当該酵素をコードする遺伝子を導入して、当該酵素の発現量が元の野生型とは異なる変異体Ｂを選別し、当該変異体Ｂを用いて元の野生型が生産するデンプンの形質を改質する方法。
【請求項１９】
デンプンの形質が、デンプンの糊化の特性により示されるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
変異体Ｂが、デンプンを生産する生物のデンプンの枝作り酵素を過剰に発現する変異体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物が、イネである請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
デンプンの枝作り酵素が、枝作り酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
デンプンの糊化開始温度が、元の野生型の生物が生産するデンプンよりも低いデンプンである請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公開番号】特開２００９−１１２（Ｐ２００９−１１２Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５６１１２（Ｐ２００８−１５６１１２）
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【分割の表示】特願２００３−５２７０８９（Ｐ２００３−５２７０８９）の分割
【原出願日】平成１４年９月１０日（２００２．９．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【分割の表示】特願２００３−５２７０８９（Ｐ２００３−５２７０８９）の分割
【原出願日】平成１４年９月１０日（２００２．９．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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