トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７および組成物ならびにその検出方法
【課題】グリホサート耐性および昆虫抵抗性のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、ならびに植物試料および組成物中でのトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡのアッセイ方法およびその存在を検出する方法を提供する。
【解決手段】ＭＯＮ８８０１７と指定されたトウモロコシ植物およびそれに含まれるＤＮＡ組成物。また、ＤＮＡ配列に基づいたトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の存在を検出するためのアッセイ方法ならびにＤＮＡ検出方法における分子マーカーとしてのこのＤＮＡ配列に基づいたトウモロコシ植物の使用。
【解決手段】ＭＯＮ８８０１７と指定されたトウモロコシ植物およびそれに含まれるＤＮＡ組成物。また、ＤＮＡ配列に基づいたトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の存在を検出するためのアッセイ方法ならびにＤＮＡ検出方法における分子マーカーとしてのこのＤＮＡ配列に基づいたトウモロコシ植物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年１２月１５日に出願された米国仮出願第６０／５２９,４７７号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、植物分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、グリホサート耐性および昆虫抵抗性のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、ならびに植物試料および組成物中でのトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡのアッセイ方法およびその存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
トウモロコシは、世界の多くの領域において重要な作物であって、主食料源である。バイオテクノロジー手法は、その生成物の農業形質および質の改良のためにトウモロコシに適用されている。かかる１つの農業形質は、除草剤耐性、特に、グリホサート除草剤に対する耐性である。トウモロコシにおけるこの形質は、グリホサート抵抗性の５−エノールピルビル−３−シキミ酸リン酸合成酵素（ＣＰ４ ＥＰＳＰＳおよび米国特許第５,６３３,４３５号）を発現するトウモロコシ植物における挿入遺伝子の発現により与えられた。もう一つの農業形質は、昆虫抵抗性、例えば、遺伝子操作されたトウモロコシ植物のコーンボーラーおよびコーンルートワームに対する抵抗性である（米国特許第６,４８９,５４２号および米国特許第６,６２０,９８８号）。有性交雑の子孫が、注目する導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを含むかを決定するために特定の植物の導入遺伝子／ゲノムＤＮＡの存在を検出できることは有利であろう。加えて、組換えの作物植物から由来した食品の市販前承認および標識を必要とする規制に従う場合に、特定の植物の検出方法は有用であろう。
【０００４】
植物における外来遺伝子の発現は、恐らくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）、または組込み部位に近接した転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近接によりそれらの染色体の位置により影響されることが知られている(Weisingら, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988)。この理由のために、導入された注目する遺伝子の最適な発現により特徴づけられた植物を同定するために多数の植物をスクリーニングすることがしばしば必要である。例えば、それは、植物中の導入された導入遺伝子の発現のレベルにおける広い変化が存在する植物および他の生物体中で観察された。また、空間または一時的なパターンの発現における差、例えば、様々な植物組織において導入遺伝子の相対的な発現の差が存在し、それは導入された遺伝子構築体に存在する転写調節エレメントから予期されたパターンに対応しなくてもよい。この理由のために、何百〜何千もの異なるトランスジェニック植物を生成し、商業目的のための所望の導入遺伝子発現レベルおよび発現型を有する単一の植物につきそれらの植物をスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有する植物は、従来の育種方法を用いる有性交雑によりその導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。かかる交雑の子孫は、本来の形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。この戦略を用いて、局所的な生育条件および市場需要に良好に適応した多数の変種における信頼できる形質発現を保証する。
【０００５】
ポリ核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＤＮＡハイブリダイゼーションのごときいずれかのよく知られた核酸検出方法により導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般的に、ＤＮＡ構築体の導入遺伝子の成分であるプロモーター、リーダー、イントロン、コード領域、３’転写ターミネーター、マーカー遺伝子等のごとき遺伝子エレメントに特異的であるＤＮＡプライマーまたはプローブ分子を用いる。結果的に、かかる方法は、挿入された導入遺伝子ＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの配列が知られていない限りは、異なる導入遺伝子の事象、特に、同一の導入遺伝子ＤＮＡ構築体を用いて生成したものを区別するのに有用ではないかもしれない。事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、多数の導入遺伝子の作物植物導入、例えば、甜菜（米国特許第６,５３１,６４９号）、小麦（米国特許公開２００２００６２５０３）、昆虫抵抗性トウモロコシ（米国特許公開２００２０１０２５８２）、およびグリホサート耐性トウモロコシ事象ｎｋ６０３（米国特許公開２００２００１３９６０）につき開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、およびその中に含まれた組成物、ならびにこれらの組成物を含むトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７およびその子孫中の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の検出方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、受入番号ＰＴＡ−５５８２を持つ米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）に寄託された種子を有するＭＯＮ８８０１７と指定されたトランスジェニックトウモロコシ植物に関する。本発明のもう一つの態様は、植物ＭＯＮ８８０１７の植物および種子の子孫植物もしくは種子または再生可能な器官を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、種子、根および葉を含むトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の植物器官を含む。本発明は、グリホサート耐性の表現型およびコーンルートワーム抵抗性の表現型を有するトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、およびＭＯＮ８８０１７のゲノムに含まれた新規な遺伝子組成物に関する。
【０００８】
本発明の１つの態様は、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７からの導入遺伝子／ゲノムの結合領域の存在を検出するＤＮＡ組成物および方法を提供する。配列番号：１および配列番号：２ならびにその相補体よりなる群から選択される少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノムの結合ＤＮＡ分子を含み、ここに、該結合分子は、トウモロコシゲノムに挿入された異種ＤＮＡおよびトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７中の挿入部位に隣接するトウモロコシゲノムＤＮＡを含む導入遺伝子挿入部位にわたる単離されたＤＮＡ分子が提供される。これらのＤＮＡ分子のうちのいずれか１つを含むトウモロコシ種子およびその植物材料は、本発明の１つの態様である。
【０００９】
導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：３またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡは、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：３を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１０】
発明の他の態様により、導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：４またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡ分子はトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：４を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１１】
ＭＯＮ８８０１７の導入遺伝子／ゲノム領域、配列番号：５またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡ分子はトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：５を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１２】
発明のもう一つの態様により、プライマー対を含む２つのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ検出方法における使用ために提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：３のＤＮＡ分子の導入遺伝子ＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号：３のトウモロコシゲノムＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、一緒に用いられる場合にこれらのＤＮＡ分子は、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーセットを含む。ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマー対を用いて生成されたアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号：１を含む場合、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に特徴的である。アンプリコンが配列番号：１を含むＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡから生成されたいずれの長さのアンプリコンも、本発明の１つの態様である。当業者は、第１および第２のＤＮＡ分子が、ＤＮＡよりだけからなることを必要としないだけではく、単独でＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡまたは１以上のポリメラーゼにつき鋳型として作用しない他のヌクレオチドもしくはそのアナログの組合せよりなり得ることを認識するであろう。加えて、当業者は、本明細書に記載されたプローブまたはプライマーが、長さが少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０の連続ヌクレオチドからのものであり、配列番号：１（任意に５’結合という）、配列番号：２（任意に３’結合という）、配列番号：３（任意に指定された５’フランキング配列の一部分）、配列番号：４（任意に指定された３’フランキング配列の一部分）、および配列番号：５（挿入されたヌクレオチド配列の全てまたは一部分）から選択されるべきであることを認識するであろう。長さが少なくとも約２１から５０以上の連続ヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５に記載されたヌクレオチドの群から選択される場合に可能である。
【００１３】
発明のもう一つの態様により、プライマー対を含む２つのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ検出方法における使用のために提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：４のＤＮＡ分子の導入遺伝子ＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号：４またはその相補体のトウモロコシゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、ここに、一緒に用いられた場合にこれらのＤＮＡ分子は、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーセットを含む。ＤＮＡ増幅方法においてＤＮＡプライマー対を用いて生成されたアンプリコンは、それが配列番号：２を含む場合にトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に特徴的である。アンプリコンが配列番号：２を含むＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡから生成されたいずれの長さのアンプリコンも、本発明の１つの態様である。
【００１４】
発明のもう一つの態様により、特に試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡを含む試料とＤＮＡプライマー対とを接触させ；次いで、（ｂ）核酸増幅反応を行い、それによりアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）アンプリコンを検出することを特徴とし、ここに、アンプリコンは配列番号：１または配列番号：２を含む。
【００１５】
発明のもう一つの態様により、特に試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む試料と、配列番号：１または配列番号：２、あるいはトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非ＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしない配列番号：１もしくは配列番号：２に実質的に相同的なＤＮＡ分子とを接触させ；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで、（ｃ）トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする。
【００１６】
発明のもう一つの態様により、グリホサートの適用に耐え、コーンルートワームに抵抗性であるトウモロコシ植物を生成する方法が提供され、その方法は、第１の親トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７と、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性を欠く第２の親トウモロコシ植物とを有性交雑させ、それにより、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性である雑種子孫植物を生成する工程を含む。
【００１７】
発明のもう一つの態様は、（ａ）トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合に、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的である第１のアンプリコンを生成する配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４を含むプライマーセットと試料とを接触させ；次いで、（ｂ）核酸増幅反応を行ない、それにより第１のアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）第１のアンプリコンを検出し；次いで、（ｄ）トウモロコシからのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合に、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７と同定された導入遺伝子挿入のトウモロコシゲノム領域に相同性である本来のトウモロコシゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する前記プライマーセットとトウモロコシＤＮＡを含む試料を接触させ；次いで、（ｅ）核酸増幅反応を行ない、それにより、第２のアンプリコンを生成し；次いで、（ｆ）第２のアンプリコンを検出し；次いで、（ｇ）試料中の第１および第２のアンプリコンを比較することを含むトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７の子孫の接合状態を決定する方法であり、ここに、双方のアンプリコンの存在は、試料が導入遺伝子挿入につき異型接合であることを示す。
【００１８】
有効量のグリホサート含有除草剤をＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物の圃場に適用する工程を含む、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の圃場における雑草を制御する方法。
【００１９】
少なくとも１つの親がＭＯＮ８８０１７である雑種トウモロコシ種子。
【００２０】
ｐＭＯＮ５３６１６の植物発現カセットを含む植物ＤＮＡ構築体で形質転換されたトウモロコシ植物。
【００２１】
本発明の前記および他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐＭＯＮ５３６１６のプラスミド地図。
【図２】トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７における挿入断片のゲノム構成。
【図３】ＭＯＮ８８０１７ ５’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号３）。
【図４Ａ】ＭＯＮ８８０１７ ３’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号４）。
【図４Ｂ】ＭＯＮ８８０１７ ３’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号４）。
【図５Ａ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｂ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｃ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｄ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｅ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において「植物ＭＯＮ８８０１７」または「ＭＯＮ８８０１７」というトランスジェニックトウモロコシ植物は、鞘翅類害虫（Coleopteran pest）コーンルートワーム（Diabrotica spp.）による食害に抵抗性であり、かつグリホサートを含有する農業用除草剤の植物毒素作用に耐性である。この二重形質のトウモロコシ植物は、コーンルートワーム幼虫による食害に対する抵抗性、およびグリホサートに対する植物耐性を与えるAgrobacterium sp.株CP4からのグリホサート抵抗性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ）蛋白質（米国特許第５,６３３,４３５号）を提供するBacillus thuringiensis（亜種 ｋｕｍａｍｏｔｏｅｎｓｉｓ）からのＣＲＹ３Ｂｂ１蛋白質（米国特許第６,５０１,００９号）の改変変異体を発現する。二重形質トウモロコシの使用は、トウモロコシ生産者に主要な利点：ａ）世界の多数のトウモロコシ栽培領域における生育関連における主な害虫のコーンルートワーム幼虫による経済的な損失からの保護、ならびにｂ）広域スペクトルの雑草制御のためのトウモロコシ作物に対する農業用除草剤を含有するグリホサートを適用する能力を提供するであろう。加えて、コーンルートワームおよびグリホサート耐性形質をコードする導入遺伝子を、同一ＤＮＡセグメントに連結し、ＭＯＮ８８０１７のゲノム中の単一座にて生じさせ、これは、育種効率の増強を提供し、育種集団およびその子孫における導入遺伝子挿入断片を追跡するための分子マーカーの使用を可能にする。
【００２４】
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７は、プラスミド構築体ｐＭＯＮ５３６１６での生来のトウモロコシ系のAgrobacterium媒介形質転換プロセスにより生成された（図１）。このプラスミド構築体は、トウモロコシ植物細胞中に、ＣＲＹ３Ｂｂ１蛋白質およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳ蛋白質の発現に必要な調節遺伝エレメントと連結した植物発現カセットを含む。トウモロコシ細胞は、無傷のトウモロコシに再生成され、個々の植物は、植物発現カセットの完全性、およびグリホサートおよびコーンルートワーム幼虫の食害に対する抵抗性を示すその植物集団から選択された。そのゲノム中にｐＭＯＮ５３６１６の連結した植物発現カセットを含むトウモロコシ植物は、本発明の１つの態様である。
【００２５】
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡは、詳細な分子の分析により特徴づけられた。これらの分析は、挿入断片数（トウモロコシゲノム内の組込みサイト数）、コピー数（１つの座内のＴ−ＤＮＡのコピー数）および挿入された遺伝子カセットの完全性を含んだ。無傷のＣＰ４ ＥＰＳＰＳおよびＣＲＹ３Ｂｂ１コード領域およびそれらの各調節エレメント、植物発現カセットのプロモーター、イントロンおよびポリアデニル化配列、ならびにそのプラスミドｐＭＯＮ５３６１６骨格ＤＮＡ領域を含むＤＮＡ分子プローブを用いた。そのデータは、ＭＯＮ８８０１７がＣＲＹ３Ｂｂ１およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳカセットの双方の１コピーを持つ単一のＴ−ＤＮＡ挿入断片を含むことを示す。無傷の遺伝子カセットに連結されたかまたは連結されていない形質転換ベクターｐＭＯＮ５３６１６からのさらなるエレメントは、ＭＯＮ８８０１７のゲノム中に検出されなかった。最後に、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列の分析を行い、５’および３’挿入断片−対−植物ゲノム結合を決定し、挿入断片内のエレメントの組成を確認し（図２）、トウモロコシＭＯＮ８８０１７中の挿入断片の完全なＤＮＡ配列を決定した（配列番号：５）。
【００２６】
グリホサート耐性、コーンルートワーム抵抗性トウモロコシ植物は、ＭＯＮ８８０１７から生長したトウモロコシ植物よりなる第１の親トウモロコシ植物と、グリホサート除草剤に対する耐性を欠く第２の親トウモロコシ植物とをまず有性交雑させて、それにより複数の雑種子孫植物を生成することにより育種できる。生来のトウモロコシ系は、反復親と戻し交雑し、グリホサート処置での選択を含むプロセスにより生成できる。異なった形質および作物に一般的に用いられる他の育種方法の記載は、当該技術分野において知られた参考文献、例えば、Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)に見出すことができる。
【００２７】
特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者による伝統的な用法により理解すべきである。また、分子生物学における共通の用語の定義は、Riegerら, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991;およびLewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994に見出すことができる。３７ＣＦＲ§１.８２２に記載されたＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。
【００２８】
本願明細書に用いた「トウモロコシ」なる用語は、Zea maysを意味し、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７で生育できるすべての植物変異体を含む。
【００２９】
本願明細書に用いた「含む」なる用語は、「限定なくして含む」ことを意味する。
【００３０】
「グリホサート」とは、Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩をいう。Ｎ−ホスホノメチルグリシンは、広域スペクトルの植物種に対する活性を有するよく知られた除草剤である。グリホサートは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．）の有効成分であり、その環境において望ましい短い半減期を有する安全な除草剤である。グリホサートは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ除草剤（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．）の有効成分である。「グリホサート除草剤」での処置とは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＵｌｔｒａＲ、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＰｒｏＲ除草剤またはグリホサートを含有するいずれかの他の除草製剤をいう。グリホサートの商業用製剤の例は、限定なくして、ＲＯＵＮＤＵＰＲ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＵＬＴＲＡＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＢＩＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯＲ、ＰＯＬＡＲＩＳＲ、ＳＰＡＲＫＲおよびＡＣＣＯＲＤＲ除草剤としてモンサント社により販売されるもの、その全てはそのイソプロピルアンモニウム塩としてのグリホサートを含有し；ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＤＲＹおよびＲＩＶＡＬＲ除草剤としてモンサント社により販売されるもの、それらはそのアンモニウム塩としてのグリホサートを含有し；ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＧＥＯＦＯＲＣＥとしてモンサント社により販売されるもの、それはそのナトリウム塩としてのグリホサートを含有し；およびＴＯＵＣＨＤＯＷＮＲ除草剤としてＳｙｎｇｅｎｔａ Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎにより販売されるもの、それはそのトリメチルスルホニウム塩としてのグリホサートを含有するを含む。植物表面に適用された場合、グリホサートは植物を通って全体に移動する。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を供するシキミ酸経路のその抑制による植物毒素である。グリホサートは、植物に見出される酵素５−エノールピルビル−３−ホスホシキマート合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を抑制する。グリホサート耐性は、グリホサートに対する低親和性を有する細菌性ＥＰＳＰＳ変異体および植物ＥＰＳＰＳ変異体の発現により達成でき、従って、グリホサートの存在下でそれらの触媒活性を保持する（米国特許第５,６３３,４３５号、第５,０９４,９４５号、第４,５３５,０６０号および第６,０４０,４９７号）。
【００３１】
コーンルートワーム（ＣＲＷ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｐ）幼虫は、トウモロコシ植物を発育させる根を食べる。実質的な費用および時間は、この害虫により引き起こされた経済損害の制御に向けられる。有機燐化合物、カルバマートおよびピレスロイドを含めた化学殺虫剤は、ＣＲＷを制御するために、毎年１６００万を超えるトウモロコシ・エーカーの土壌に取り込まれる。土壌殺虫剤から導入遺伝子のアプローチまで離れてシフトする利点はめざましく、潜在的なヒトの健康および安全性リスクにおける低下、非標的生物体に対する直接的な衝撃の低下、表面および地下水の供給の汚染の低下、減少した殺虫剤容器の処分問題、ならびに他の害虫管理および農業問題との一般的な適合を含む。
【００３２】
本発明は、高レベルのＣＲＹ３Ｂｂ１デルタエンドトキシンを発現する少なくとも１つの発現カセットならびにグリホサート耐性酵素を発現する少なくとも１つの発現カセットを含むＤＮＡ構築体で形質転換されているＤＮＡで形質転換されたトランスジェニック植物を提供する。本方法によるおよび本明細書に開示されたＤＮＡ構築体で形質転換されたトウモロコシ植物は、ＣＲＷに抵抗性である。また、同一トウモロコシ植物は、グリホサート除草剤に抵抗性である。連結した農業的形質は、育種集団中でこれらの形質をともに維持することにおいて容易さを供する。
【００３３】
トランスジェニック「植物」は、異種のＤＮＡ、すなわち、注目する導入遺伝子を含むポリ核酸構築体での植物細胞の形質転換；その植物細胞のゲノムへの導入遺伝子の挿入に由来する植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入により特徴付けされた特定の植物の選択により生成される。「事象」なる用語とは、異種のＤＮＡを含む本来の形質転換体植物および形質転換体の子孫をいう。また、「事象」なる用語は、その事象と、子孫が異種のＤＮＡを含むもう一つの植物との間の性的外交雑により生じた子孫を含む。反復親への繰り返された戻し交雑の後でさえ、形質転換された親事象からの挿入されたＤＮＡおよび隣接するゲノムＤＮＡは、同一染色体の位置にてその交雑の子孫において存在する。また、「事象」なる用語は、挿入されたＤＮＡおよび、挿入されたＤＮＡに直ちに隣接したフランキングゲノム配列を含む本来の形質転換体からのＤＮＡをいい、それは、挿入されたＤＮＡ、ならびに挿入されたＤＮＡを含まない親系を含む一つの親系の有性交雑（例えば、自配に起因する本来の形質転換体および子孫）の結果としての注目する導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受ける子孫に移されると予期されるであろう。本発明は、導入遺伝子の事象、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、その子孫、およびそこに含有されたＤＮＡ組成物に関する。
【００３４】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤もしくは酵素に結合した単離核酸である。かかるプローブは標的核酸の鎖、本発明の場合に、ＭＯＮ８８０１７植物、またはＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む試料からのいずれかのＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ鎖に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ物質を含む。
【００３５】
ＤＮＡプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長された単離ポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマー対またはＤＮＡプライマーセットとは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来のポリ核酸増幅方法により標的核酸配列の増幅に有用な２つのＤＮＡプライマーをいう。
【００３６】
ＤＮＡプローブおよびＤＮＡプライマーは、一般的に長さが１１個以上のポリヌクレオチドで、しばしば１８個以上のポリヌクレオチド、２４個以上のポリヌクレオチドまたは３０個以上のポリヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであるように選択する。好ましくは、標的配列にハイブリダイズする能力を保持する標的配列とは異なるプローブは、通常の方法により設計し得るが、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有する。
【００３７】
プローブおよびプライマーを調製および用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (以下「Sambrookら, 1989」); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (with periodic updates) (以下「Ausubelら, 1992」);およびInnisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990に記載されている。ＰＣＲ ＤＮＡプライマー対は、例えば、Primer (Version 0.5, c 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)のごときその目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、公知の配列から誘導できる。
【００３８】
本明細書に開示されたフランキングゲノムＤＮＡおよび挿入配列に基づいたプライマーおよびプローブを用いて、例えば、通常の方法、かかるＤＮＡ分子を再クローニングおよび配列決定することにより、開示されたＤＮＡ配列を確認できる（および必要ならば修正できる）。
【００３９】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下、標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。いずれかの通常の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中のトランスジェニック植物からのＤＮＡの存在を同定できる。核酸セグメントともいわれるポリ核酸分子、またはその断片は、ある種の環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズできる。本願明細書に用いた２つのポリ核酸分子は、２つの分子がアンチパラレルの二本鎖の核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると考えられる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であると考えられる。本願明細書に用いた分子は、その分子のうちの１つのすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に、「完全な相補性」を示すと考えられる。２つの分子が、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされるのを可能とするのに十分な安定性をもって、相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であると考えられる。同様に、その分子が、それらが通常の「高ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされるのを可能とするのに十分な安定性をもって、相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると考えられる。通常のストリンジェンシー条件は、Sambrookら, 1989、およびHaymesら, In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)に記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖の構造を形成する分子の能力を完全には排除しない限りは、許容される。核酸分子がプライマーおよびプローブとして機能するために、それは使用された特定の溶媒および塩の濃度下で安定した二本鎖の構造を形成できるように単に十分に、配列において相補的であることを必要とする。
【００４０】
本願明細書に用いた、実質的に相同性の配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されるべき核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促す適当なストリンジェンシー条件、例えば、４５℃での６.０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いての５０℃での２.０×ＳＳＣの洗浄が当業者に知られているか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃の約２.０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０.２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーで選択できる。加えて、洗浄工程の温度は、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に増加できる。温度および塩の双方は変更できるか、または温度または塩濃度のいずれかが一定に保持されていてもよく、一方、他方の変数が変更される。好ましい具体例において、本発明のポリ核酸は、例えば、約２.０×ＳＳＣ、および約６５℃にて中程度のストリンジェントな条件下にて、配列番号１、２、３、４もしくは５に記載された１以上の核酸分子、またはその相補体もしくはいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下にて、配列番号１、２、３、４もしくは５に記載された１以上の核酸分子、またはいずれかの相補体もしくは断片に特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片を有する。本発明のもう一つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片と８０％〜１００％、または９０％〜１００％の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片と９５％〜１００％の配列同一性を共有する。配列番号：１または配列番号：２を植物生育方法におけるマーカーとして用いて、「DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Cregan,ら, eds., Wiley-Liss NYにおける単純な配列反復ＤＮＡマーカー分析に記載された方法に類似する遺伝子交雑の子孫を同定し得る。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られたいくつかの方法により検出でき、それらの方法は、限定されるものではないが、蛍光性タグ、放射活性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含む。
【００４１】
特定の増幅プライマー対を用いた（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」は、対応する野生型配列（またはその相補体）がＤＮＡ熱増幅反応において、ユニークな増幅生成物、アンプリコンに結合および好ましくはそれを生成するであろう標的核酸配列にだけプライマー対がハイブリダイズするのを可能とする条件である。
【００４２】
「（標的配列）に特異的な」なる用語は、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料中の標的配列にだけストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを示す。
【００４３】
本願明細書に用いた「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、ポリ核酸の鋳型の一部である標的ポリ核酸分子に指向されたポリ核酸増幅方法の生成物をいう。例えば、有性交雑に起因するトウモロコシ植物が本発明のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７植物からのトランスジェニック植物ゲノムＤＮＡを含むかを決定するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種のＤＮＡ（導入遺伝子ＤＮＡ）の挿入部位に隣接するＭＯＮ８８０１７植物のゲノムにおけるＤＮＡ配列に由来するプライマー、ならびにＭＯＮ８８０１７植物ＤＮＡの存在につき特徴的であるアンプリコンを生成するために挿入された異種のＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を用いて、ポリ核酸増幅方法に付してもよい。その特徴的なアンプリコンはある長さにあり、また、植物ゲノムＤＮＡについて特徴的であるＤＮＡ配列を有し、そのアンプリコンのＤＮＡ配列は、配列番号：１または配列番号：２を含む。そのアンプリコンは、長さにおいて、そのプライマー対＋一つのヌクレオチド塩基対、好ましくは、＋約５０個のヌクレオチド塩基対、より好ましくは、約２５０個のヌクレオチド塩基対、さらにより好ましくは、＋約４５０個のヌクレオチドまたはそれらを超える、の組み合わせた長さの範囲に有り得る。あるいは、プライマー対は、完全な挿入断片ポリヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するような挿入された異種のＤＮＡの両側におけるゲノム配列から誘導できる（例えば、そのＭＯＮ８８０１７ゲノムに挿入されたｐＭＯＮ５３６１６ ＤＮＡ断片の２つの発現カセットを含み、その挿入断片が配列番号：５の約７１２５個のヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を増幅する配列番号：３のゲノム部分から単離された前方プライマーおよび配列番号：４のゲノム部分から単離された逆プライマ―、図２および図５）。導入遺伝子挿入ＤＮＡに隣接する植物ゲノム配列から誘導されたプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列からのある距離にて位置し、この距離は、１個のヌクレオチド塩基対から約２００００ヌクレオチド塩基対までの範囲とできる。「アンプリコン」なる用語の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成されてもよいプライマー二量体を特に除外する。
【００４４】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当該技術分野において知られた様々なポリ核酸の増幅方法のいずれによっても達成できる。増幅方法は当該技術分野において知られており、とりわけ、米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号ならびにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innisら, Academic Press, San Diego, 1990に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、２２ｋｂ（キロベース）までのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された(Chengら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994)。ＤＮＡ増幅の技術分野において知られたこれらの方法ならびに他の方法を本発明の実施に用いてもよい。その異種のＤＮＡ挿入断片の配列またはＭＯＮ８８０１７からのフランキングゲノムＤＮＡ配列は、本明細書に供された配列から誘導されたプライマーを用いて、受入番号ＰＴＡ−５５８２を有するＡＴＣＣに寄託されたＭＯＮ８８０１７種子、またはその種子から生育した植物からのかかるＤＮＡ分子を増幅し、続いてＰＣＲアンプリコンまたはそのクローン化されたＤＮＡ断片の標準的なＤＮＡ配列決定により確認できる（および必要ならば修正できる）。
【００４５】
ＤＮＡ増幅方法に基づいたＤＮＡ検出キットは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、適当な反応条件下で特徴的なアンプリコンを増幅するＤＮＡプライマー分子を含む。そのキットは、当該技術分野において知られたアガロースゲルベースの検出方法または特徴的なアンプリコンを検出するいずれかの方法を提供し得る。配列番号：３または配列番号：４のトウモロコシゲノム領域のいずれかの部分、および配列番号：５の導入遺伝子挿入領域のいずれかの部分に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーを含むキットは、本発明の目的である。特に、ＤＮＡ増幅方法において有用なプライマー対であると確認されたのは、ＭＯＮ８８０１７の５’導入遺伝子／ゲノム領域の一部分に相同的な特徴的なアンプリコンを増幅する配列番号：６および配列番号：７であり、ここに、そのアンプリコンは配列番号：１を含む。ＤＮＡプライマーとして有用な他のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅の当該技術分野における当業者により、ＭＯＮ８８０１７（配列番号：５）の開示された導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ配列から選択できる。
【００４６】
これらの方法により生成された特徴的なアンプリコンは、複数の技術により検出し得る。隣接した側面に位置するゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されている場合、かかる１つの方法は、遺伝子ビット分析(Nikiforov,ら Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)である。オリゴヌクレオチドは、マイクロタイタープレートのウェルに固定化される。（挿入された配列における１つのプライマー、および隣接したフランキングゲノム配列における１つを用いて）注目する領域のＰＣＲ後、単鎖ＰＣＲ生成物を固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼを用いて単一の塩基伸長反応についての鋳型として機能させ、次いで、予期された次の塩基に特異的なジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）で標識できる。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡベースで有り得る。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一の塩基伸長による導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４７】
もう一つの方法は、Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)により記載されたピロシーケンス手法である。この方法において、隣接したゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップさせたオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）からの単鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’フォスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰは個々に加えられ、取込の結果、光シグナルが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または複数の塩基伸長による導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４８】
Chen,ら, (Genome Res. 9:492-498, 1999)により記載された蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合をオーバーラップしたオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入されたＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列の１つ）からの単鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ、次いでＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一の塩基伸長はｄｄＮＴＰの取込みを生じる。取込みは、蛍光測定器を用いて、極性化における変化として測定できる。極性化における変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一の塩基伸長により導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４９】
ＴａｑｍａｎＲ(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載され、それは製造者により供される説明書において十分に理解される。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップさせたＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。そのＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）は、熱安定性のポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。そのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部位から離れて、蛍光性の部位を切断および放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションにより導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００５０】
分子ビーコン（Molecular Beacon）は、Tyangiら (Nature Biotech.14:303-308, 1996)に記載された配列検出において用いるために記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。そのＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは、蛍光およびクエンチング部分を密接に近接したままとする二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノムの配列における１つ）は、熱安定性のポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＰＣＲ増幅の成功後、標的配列に対するＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、プローブの二次構造を除去し、その蛍光およびクエンチング部分を空間的に分離する。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキング挿入断片配列の存在を示す。
【００５１】
ＤＮＡ検出キットは、本願明細書に示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野においてよく知られた方法を用いて展開できる。そのキットは、試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡの同定に有用であり、ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含むトウモロコシ植物を生育させる方法に適用できる。キットは、プライマーまたはプローブとして有用であり、かつ配列番号：１、２、３、４、または５の少なくとも一部分に相同的または相補的であるＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ）において、またはポリ核酸ハイブリダイゼーション法、すなわち、サザン分析、ノーザン分析におけるプローブとして用いることができる。トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を生成するために用いたプラスミドベクターｐＭＯＮ５３６１６は、２つの発現カセットを含み：発現カセット１は、小麦Ｈｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列に連結したＣＲＹ３Ｂｂ１コード領域に連結したコメアクチン１イントロンに連結した小麦ＣＡＢ ５’リーダーに連結した複製されたエンハンサーを持つＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳコード領域に融合し、ＮＯＳ ３’ポリアデニル化配列に連結した葉緑体シグナルペプチドの転写を駆動するコメアクチン１イントロンに連結したコメアクチン１プロモーターを含む発現ベクター２に連結し、その連結した発現カセットの配列は、配列番号：５に含まれる。
【００５２】
以下の実施例は、発明のある好ましい具体例の実施例を示すために含まれる。以下の実施例において示された技術は、発明者らが発明の実施において良好に機能すると分かったアプローチを表し、かくして、その実施につき好ましい様式の実施例を構成すると考えることができることは当業者ならば十分に理解するであろう。しかしながら、当業者は、本開示に徴して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の変更が開示された特定の具体例においてなすことができ、かつ同様または類似する結果を依然として得ると考えるであろう。
【実施例】
【００５３】
実施例１
トランスジェニックトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７は、ｐＭＯＮ５３６１６から誘導されたＤＮＡ断片を用いてトウモロコシ細胞のAgrobacterium媒介形質転換により生成した（図１）。植物形質転換構築体ｐＭＯＮ５３６１６は、三親性（triparental）交雑手順を用いてAgrobacteriumに交雑させた(Dittaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7347-7351, 1980)。２つの導入遺伝子植物発現カセットを含むｐＭＯＮ５３６１６のＤＮＡ断片は、トウモロコシ植物細胞のゲノムに挿入し、そのトウモロコシ植物細胞をトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に再生した。ＭＯＮ８８０１７のゲノム中への挿入断片の配置を（図２）に示す。ＭＯＮ８８０１７およびその子孫は、グリホサートに対する耐性を有し、コーンルートワーム幼虫食害に抵抗性である。本願明細書に記載のように、トウモロコシ形質転換を本質的に行った。
【００５４】
ｐＭＯＮ５３６１６を含むAgrobacteriumの液体培養物をグリセロールストック、または新たな縞状のプレートから開始し、次いで、振盪（約１５０毎分回転数、ｒｐｍ）しつつ、５０ｍｇ／ｌ（ミリグラム／リットル）カナマイシン、および５０ｍｇ／ｌストレプトマシンもしくは５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンのいずれか、および２００μＭアセトシリンゴン（acetosyringone）（ＡＳ）を含む２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含有するｐＨ７.０の液体ＬＢ培地において中間対数増殖相まで２６℃〜２８℃にて一晩増殖させる。Agrobacterium細胞は、接種培地（米国特許第６,５７３,３６１号の表８に記載される液体ＣＭ４Ｃ）に再懸濁し、細胞密度を、その再懸濁された細胞が６６０ｎｍ（すなわち、ＯＤ６６０）の波長にて分光測光器中で測定される場合に１の光学密度を有するように調整する。新たに単離したタイプＩＩの未熟なＨｉＩＩｘＬＨ１９８およびＨｉＩＩトウモロコシ胚を、Agrobacteriumを接種し、２３℃にて暗所で２〜３日間共培養する。次いで、胚を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)および２０μＭ ＡｇＮＯ３を補足した遅延（delay）培地（Ｎ６ １−１００−１２；米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載）に移し、２８℃にて４〜５日間培養した。引き続いての全ての培養はこの温度に保つ。
【００５５】
トウモロコシ子葉鞘は接種１週間後に取り出す。胚を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび０.５ｍＭグリホサートを補足した第１の選択培地（米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載されたＮ６１−０−１２）に移す。２週間後に、残存する組織を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび１.０ｍＭグリホサートで補足した第２の選択培地（Ｎ６１−０−１２）に移す。残存するカルスを１.０ｍＭグリホサートで２週間毎に約３の継代培養の間継代する。グリホサート耐性組織を同定した場合、その組織を再生のために大きする。再生のために、カルス組織を、０.１μＭアブシジン酸(ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO)を補足した再生培地（米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載されるＭＳＯＤ）に移し、次いで、２週間培養する。再生しているカルスを高スクロース培地に移し、２週間培養する。小植物を培養容器中でＭＳＯＤ培地（ＡＢＡ無し）に移し、２週間培養する。次いで、根を持つ植物を土壌に移す。トウモロコシ細胞の形質転換方法の当該技術分野における当業者は、この方法を変形して、本発明のＤＮＡ構築体を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を提供できるか、またはトランスジェニック単子葉植物植物を提供することが知られた粒子銃のごとき他の方法を用いることができる。
【００５６】
ＭＯＮ８８０１７植物および種子は再生可能な器官を有する。その種子の再生可能な器官は、限定されるものではないが、胚、子葉、および苗条または、根分裂組織を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、苗条、根および葉を含めたトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の植物器官を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、蛋白質、ミール、粉末および油を含めたＭＯＮ８８０１７種子の抽出可能な成分を含む。
【００５７】
実施例２
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７を、グリホサートの栄養性および生殖性障害に対する耐性につき多数のトランスジェニックトウモロコシ植物から選択した。商業的に高品質のトランスジェニック植物の成功した生成は、現在、多数のトランスジェニック植物の生成を必要とする。本発明において、ＭＯＮ８８０１７は、ｐＭＯＮ５３６１６を含む異なるＤＮＡ構築体で形質転換した約４７２Ｒ０事象のうちの１つの植物であった。そのＭＯＮ８８０１７事象を、一連の分子分析、グリホサート耐性スクリーニング、昆虫抵抗性スクリーニングおよび発現分析スクリーニングにより多数の事象から選択した。
【００５８】
トランスジェニックトウモロコシ植物を温室および圃場のスクリーニングによる食害に対するコーンルートワーム抵抗性につきアッセイした。根損傷は、Iowa State UniversityのOlesonおよびTollefsonにより開発された節−損傷スケール（Node-Injury Scale, NIS）を用いて評価し、このスケールは、０〜３の値を用いてトウモロコシの根になされた損傷を評価する。その０.００の値は、食害がないことを示し、最低の格付けであり、１.００は、１つの節、またはその茎の約２インチ内で摂食された節全体の等価物を記載し、２.００は、摂食された２つの完全な節を記載し、また、３.００は、摂食された３以上の節を記載し、最高の格付けである。摂食された完全な節の中間の損傷は、欠けた節のパーセンテージとして記載され、例えば、１.５０は１ １／２節を記載し、０.２５は、摂食された１つの節の１／４を記載する。圃場の小区画に、Ｖ３〜Ｖ４成長段階での作条の直線フィート当たり１５００〜２０００個の卵を適用することによりコーンルートワーム幼虫を人工的にはびこらせた。殺虫剤で処置した列は、１０００フィートの列当たり５オンスの割合にて、テフルスリン（Tefluthrin）殺虫剤(ForceＲ 3G, Zeneca Ag Products)で処置した。ＭＯＮ８８０１７は、複数のテストにおいて、０.０８〜０.１１の根損傷格付け（ＲＤＲ）を示した。非殺虫剤処置した等値線（isoline）は、１.２８の平均ＲＤＲを示した。殺虫剤処置した非殺虫性蛋白質を含むトウモロコシ植物は、０.４４の平均ＲＤＲを示した。
【００５９】
トランスジェニックトウモロコシ植物をグリホサート除草剤で処置して、除草剤に対する耐性のレベルを決定した。テストプロットにグリホサート(RoundupＲ WeatherMax, Monsanto Co, St Louis, MO)を散布し、１.１２５および２.２５ポンド／エーカーの有効成分の割合で、Ｖ４成長段階にて１回およびＶ８成長段階にて１回の生育期間に２回適用した。トウモロコシ種子における収率を、散布していない(WeatherMax 0)ＭＯＮ８８０１７プロットに対しての収量パーセントとして収穫にて測定した。表１に示した結果は、ＭＯＮ８８０１７がグリホサートに高度に耐性であり、かつ収量を低下させず、驚くべきことに、その処置された小区画は、その処置された小区画のそれより収率において平均するとより高くなることを示す。
【００６０】
表１．未処置と比較したグリホサートで処置したＭＯＮ８８０１７の収量パーセント
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１ 説明文：Ｖ４からＶ８までの葉期での各ＷｅａｔｈｅｒＭａｘ処置の収量パーセントを、０からＶ４まで葉期でのＷｅａｔｈｅｒＭａｘ処置についての収量パーセントに比較し、その結果、０−Ｖ４処置は、各処置反復につき１００パーセントの収率ベースラインを確立した。
【００６３】
実施例３
ＭＯＮ８８０１７および対照物質からのゲノムＤＮＡを、最初に細粉に粒を処理することによりトウモロコシ粒から抽出した。約６グラムの処理された粒は、５０ｍｌ（ミリリッター）の円錐管に移し、次いで、約１６ｍｌのＣＴＡＢ抽出緩衝液の［１.５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、７５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０、１.０５Ｍ ＮａＣｌおよび０.７５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ（ＭＷ ４０,０００）］および８マイクロリットルのＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）をその処理した粒に加えた。試料を間欠性の混合を用いて６５℃にて３０〜６０分間インキュベートし、次いで、室温まで冷却させた。約１５ｍｌクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１（ｖ／ｖ））を試料に加えた。その懸濁液を５分間混合し、次いでその２相を室温にて約１６,０００×ｇで５分間の遠心分離により分離した。水性の（上部）層をきれいな５０ｍｌの円錐管に移した。１０％ＣＴＡＢ緩衝液［１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢおよび０.７Ｍ ＮａＣｌ］の約１／１０容（約１.５ｍｌ）および当量のクロロホルム：イソアミルアルコール［２４：１（ｖ／ｖ）］を水相に加え、次いで、それを５分間混合した。試料を約１６,０００×ｇで５分間遠心してそれらの相を分離した。水性（上部）層を取り出し、等容量（約１５ｍｌ）のＣＴＡＢ沈殿緩衝液［１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス ｐＨ８.０および１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０］と混合し、室温にて１〜２時間静置させた。その試料を室温にて１０分間約１０,０００×ｇで遠心して、ＤＮＡをペレットとした。上清を捨て、ペレットを約２ｍｌの高い塩ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０および１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。３７℃での穏やかな混合をペレットの溶解を援助するために行なった。要すれば、試料を室温にて約２３,０００×ｇで２分間遠心して、残骸をペレットとし、除去した。約１／１０容（約１５０μｌ）の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５.２）、および２容（上清に対して約４ｍｌ）の冷却した１００％エタノールを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％エタノールを含む微量遠心試験管にスプールした。そのＤＮＡを最高速度（約１４,０００ｒｐｍ）にて約５分間の微量遠心機にてペレットとし、真空乾燥させ、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）に再溶解した。次いで、ＤＮＡを４℃冷蔵庫に貯蔵した。
【００６４】
１０μｇのゲノムＤＮＡを、選択した制限酵素、例えば、SspI、EcoRV、ScaIおよびSmaIで４時間を超える間３７℃にて２００μｌの酵素制限緩衝液中で消化し、次いで、７０〜８０℃にて１５分間酵素を不活性化した。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＥｔＯＨで沈殿し、次いで２００μｌに溶解した。次いで、そのＤＮＡを４℃にて一晩１ｍｌの連結反応緩衝液およびＴ４ＤＮＡリガーゼ中で自己連結した。連結反応を７０〜８０℃で１５分間不活性化し、ＥｔＯＨで沈殿させ、次いで２００μｌに溶解した。次いで、そのＤＮＡを、High Fidelity Expand System (Roche)を用いて、その製造者により供給されたプロトコールに従い、pＣＰ４ ＥＰＳＰＳまたはＣＲＹ３Ｂｂコード領域内の特定のプライマーでＰＣＲのための鋳型として用いた。ネステッドプライマーでの第２のＰＣＲを特定の増幅に用いた。次いで、そのＰＣＲ生成物をシークエンシング分析のためにクローン化した。ユニバーサルＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキット（カタログ番号K1807-1, Clonetech, Palo Alto, CA）は、それに含まれたアダプターＡＰ１およびＡＰ２ならびにその製造者により提供されたプロトコールを用いて、５’および３’導入遺伝子／ゲノム領域の単離のために用いた。
【００６５】
５’（配列番号：３、図３）および３’（配列番号：４、図４）導入遺伝子／ゲノム領域ＤＮＡをＰＣＲを利用してＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡから単離する。合計のゲノムＤＮＡ（約１０μｇ）を制限酵素で消化する。３７℃で一晩消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラムを用いてそのＤＮＡを精製する。そのＤＮＡは５０μｌの水でカラムから溶出し、次いで、１ｍｌに希釈する。希釈した溶離液（８５μｌ）を１０μｌの緩衝液（１０×）および５μｌのＴ４リガーゼと組合せて、その断片を環状化させる。１６℃、一晩のインキュベーション後、リガーゼを７０℃で熱不活性化させる。その試料を一連のネステッドプライマーでＰＣＲにより増幅させる。３’導入遺伝子／ゲノム領域の単離用のプライマーの組合せは、第１のプライマーとして配列番号：８、配列番号：９、およびＡＰ１、ならびに第２のプライマーとして、配列番号：１０およびＡＰ２、ならびにシークエンシングプライマーとしての使用のための配列番号：１１を含み；５’導入遺伝子／ゲノム領域の単離用のプライマー組合せは、第１のプライマーとして配列番号：１２、配列番号：１４、およびＡＰ１、ならびに第２のプライマーとして、配列番号：１３、配列番号：１５、およびＡＰ２を含んだ。
【００６６】
そのＰＣＲのための条件は：第１のＰＣＲ＝２秒間の９４℃、１０分間の７２℃の７サイクル；２秒間の９４℃、１０分間の６７℃の３７サイクル；１０分間の６７℃の１サイクル；第２、第３のＰＣＲ＝２秒間の９４℃、１０分間の７２℃の５サイクル；２秒間の９４℃、１０分間の６７℃の２４サイクル；１０分間の６７℃の１サイクルを含む。
【００６７】
別法として、ＭＯＮ８８０１７事象の５’および３’の導入遺伝子／ゲノム挿入領域のＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、２５秒間の９４℃の７サイクル、３分間の７２℃；
２５秒間の９４℃、３分間の６７℃の３７サイクル；７分間の６７℃の１サイクルを含む条件で行なうことができる。全ての引き続いての増幅は、以下の条件で行った：２秒間の９４℃、４分間の７２℃の７サイクル；２秒間の９４℃、４分間の６７℃の３７サイクル；７分間の６７℃の１サイクル。全てのアンプリコンは、臭化エチジウムで染色された０.８％のアガロースゲル上で視覚化される。そのＤＮＡは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（カタログ番号 ２８１０４, Qiagen Inc., Valencia, CA）でＰＣＲ試料を直接的に精製することにより、またはそのゲルから適当な断片を抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（カタログ番号２８７０４、Qiagen Inc.）を用いるいずれかにより配列決定するために調製する。ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムの挿入断片のフランキング領域からのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ ＴＡ ＣｌｏｎｉｎｇＲキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、サブクローニングした。５’導入遺伝子／ゲノム領域のＤＮＡ配列を図３に示し、３’導入遺伝子／ゲノム領域のＤＮＡ配列を図４に示し、完全な導入遺伝子挿入断片および連結したフランキングゲノムＤＮＡを図５に示す。
【００６８】
全長の導入遺伝子／ゲノムの挿入断片配列（配列番号：５、図５）を、ＰＣＲ生成物をオーバーラップさせることによりＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡから単離した。一連のＤＮＡプライマーは、導入遺伝子挿入断片のＤＮＡ断片、およびＭＯＮ８８０１７ゲノムからの隣接したフランキングゲノム領域の一部分を含むアンプリコンを生成するように設計した。そのＤＮＡ断片を配列決定し、配列を組合せて、本発明の配列番号：５である断片配列のコンティグを創製した。そのＤＮＡプライマー対の組合せは：配列番号：１６および配列番号：１７、配列番号：１８および配列番号：１７、配列番号：１９および配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６、配列番号：２５および配列番号：２７であった。合計のゲノムＤＮＡを全てのＰＣＲ反応に用いた。すべてのアンプリコンを臭化エチジウムで染色した０.８％アガロースゲル上で視覚化した。ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キットでＰＣＲ試料を精製することにより、またはそのゲルから適当な断片を抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いることによるいずれかにより配列決定するために調製した。ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ塩基配列分析装置(ABI PrismTM 377, PE Biosystems, Foster City, CA)およびＤＮＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェア(DNASTAR Inc., Madison, WI)を用いて生成した。
【００６９】
実施例４
ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する。ＭＯＮ８８０１７に特徴的な１つのアンプリコンは、少なくとも１つの結合配列、配列番号：１または配列番号：２を含む。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対は、ここに、そのプライマー対は、限定されるものではないが、表２に記載された５’アンプリコン配列についての配列番号：６および配列番号：７を含む。プライマー配列番号：６の位置は、ヌクレオチド９５２位にて始まる図３に示すトウモロコシゲノム中にある。プライマー配列番号：７の位置は、ヌクレオチド４５０位で始まる図５に示す導入遺伝子挿入断片中にある。ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡでのＤＮＡ増幅方法における配列番号：６および配列番号：７を用いる予期されたアンプリコンサイズは、約５５０ｂｐである。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応がそのＭＯＮ８８０１７または子孫には特徴的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４から誘導されたいずれのプライマー対も、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３の少なくとも１１個の近接するヌクレオチドまたはその相補体を含むいずれかの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する方法に有用である配列番号：４の少なくとも１１個の近接するヌクレオチドまたはその相補体を含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の１つの態様である。この分析のための増幅条件の一例を表２および表３に示すが、ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成するＭＯＮ８８０１７の導入遺伝子挿入断片（配列番号：５）に含まれた遺伝子エレメントの配列番号：３もしくは配列番号：４またはＤＮＡ配列に相同的または相補的なＤＮＡプライマーのこれらの方法または使用のいずれの変更も当該技術分野内ものである。特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノムの結合ＤＮＡ（配列番号：１または配列番号：２）に相同的または相補的であるＤＮＡ分子またはその実質的な部分を含む。
【００７０】
事象ＭＯＮ８８０１７植物組織試料についての分析は、事象ＭＯＮ８８０１７からのポジティブな組織対照、事象ＭＯＮ８８０１７ではないトウモロコシ植物からのネガティブ対照、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含有しないネガティブ対照を含むであろう。内因性トウモロコシＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件のための内部対照として機能し、それらの例は、約２３９ｂｐ ＤＮＡ断片を増幅する配列番号：２８および配列番号：２９である。さらなるプライマー配列を、表２および表３に示した方法によりアンプリコンの生成につき選択し、その結果、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生じるＤＮＡ増幅方法および条件の当該技術分野における当業者により配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５から選択できる。表２および表３の方法に対する変形を含むこれらのプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。ＭＯＮ８８０１７に特徴的である配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５から誘導された少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列により生成されたアンプリコンは、本発明の１つの態様である。
【００７１】
ＤＮＡ増幅方法に用いられる場合に、ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４または配列番号：５から誘導された少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含むＤＮＡ検出キットは、本発明の１つの態様である。ＤＮＡ増幅方法においてテストされる場合に、そのゲノムがＭＯＮ８８０１７には特徴的なアンプリコンを生成するトウモロコシ植物または種子は、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７アンプリコンについてのアッセイは、表３に示したStratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーを用いることにより、または当業者に知られた方法および装置により行なうことができる。
【００７２】
表２．ＭＯＮ８８０１７ ５’導入遺伝子挿入断片／ゲノム結合領域の同定のためのＰＣＲ手順および反応混合条件。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表３．種々の商業的に入手できるサーモサイクラーについての提案されたＰＣＲパラメーター。
【００７５】
【表３】
【００７６】
Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーにおけるＤＮＡ増幅を以下のサイクリングパラメーターを用いて進める。MJ EngineまたはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーをその計算様式で試行すべきである。Perkin-Elmer 9700サーモサイクラーを最大に設定された温度勾配（ramp）速度で試行する。
【００７７】
実施例５
【００７８】
サザンブロット分析を、実施例３に記載したＭＯＮ８８０１７および対照トウモロコシ組織から単離されたゲノムＤＮＡに行った。ＤＮＡ試料の定量は、ＤＮＡ検量基準としてＲｏｃｈｅ分子サイズマーカーＩＸでHoefer DyNA Quant 200 Fluorometer (Pharmacia, Uppsala, Sweden)を用いて行った。
【００７９】
検体からの約２０μｇのゲノムＤＮＡ、および対照物質からの１０μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素消化に用いた。挿入断片安定性分析のために、検体からの約１０μｇのゲノムＤＮＡを用いた。一晩の消化を、１００単位の適当な制限酵素を用いて、約５００μｌの全容積中で３７℃にて行った。消化後、試料を、１／１０容（５０μｌ）の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５.２）、および２容（本来の消化容積に対して１ｍｌ）１００％エタノールを添加し、少なくとも３０分間−２０℃のフリザー中でインキュベーションして沈殿させた。消化したＤＮＡを微量遠心機中で最大速度にてペレットとし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ＴＥ緩衝液中で再溶解した。
【００８０】
ＤＮＡプローブを、ｐＭＯＮ５３６１６鋳型ＤＮＡの植物発現カセット部分のＰＣＲ増幅により調製した。約２５ｎｇの各プローブ（ＮＯＳ ３’およびＴａＨｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列を除く）をランダムプライミング法(RadPrime DNA Labeling System, Life Technologies)により３２Ｐ−ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。そのＮＯＳ ３’およびＴａｈｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列を以下のように２５ｎｇのＤＮＡプローブ鋳型を用いてＰＣＲにより標識した：２０ｍｌの最終容積における、鋳型に特異的なセンスおよびアンチセンスのプライマー（各０.２５ｍＭ）；１.５ ｍｍ ＭｇＣｌ２；各３ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；約１００ｍＣｉの３２Ｐ−ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）；および２.５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。サイクリング条件は、以下の通り：３分間の９４℃での１サイクル；４５秒間の９４℃、３０秒間の５２℃、２分間の７２℃での２サイクル；１０分間の７２℃での１サイクル。全ての放射標識したプローブは、Sephadex G-50 カラム(Roche, Indianapolis, IN)を用いて精製した。
【００８１】
マーカーに支援された育種方法、または試料中のＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡの検出用プローブとして用いる合成ＤＮＡ分子を作成でき、それは配列番号：１および配列番号：２に記載した導入遺伝子／ゲノム結合ＤＮＡ分子またはその実質的な部分のＤＮＡ配列を含む。
【００８２】
実施例６
事象ＭＯＮ８８０１７を含む同型接合体の子孫からの異型接合を識別するために用いた方法を、接合状態アッセイに記載し、その条件の例を表４および表５に記載する。接合状態アッセイに用いたＤＮＡプライマーは、プライマー（配列番号：３０）、（配列番号：３１）、（配列番号：３２）、６ＦＡＭＴＭ標識プライマー（配列番号：３３）およびＶＩＣＴＭ標識プライマー（配列番号：３４）であり、６ＦＡＭおよびＶＩＣは、そのＤＮＡプライマーに結合したApplied Biosystems (Foster City, CA)の蛍光色素生成物である。
【００８３】
これらの反応方法に用いた場合に、配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２は、非トランスジェニックトウモロコシ用のＤＮＡアンプリコン、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む異型接合のトウモロコシ用の２つのＤＮＡアンプリコン、および他の非ＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物とは異なる同型接合体のＭＯＮ８８０１７トウモロコシ用のＤＮＡアンプリコンを生成する。この分析のための対照は、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む同型接合および異型接合のトウモロコシからのポジティブ対照、非トランスジェニックトウモロコシからのネガティブ対照、および鋳型ＤＮＡを含まないネガティブ対照を含むであろう。このアッセイ方法は、Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700、またはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーでの使用につき最適化される。ＭＯＮ８８０１７植物で作成された交雑の子孫の接合状態を同定するアンプリコンを生成する当業者に知られた他の方法および装置は、当該技術分野における技量の範囲内にある。
【００８４】
表４．接合状態アッセイ反応溶液
【００８５】
【表４】
【００８６】
表５．接合状態アッセイサーモサイクラー条件
【００８７】
【表５】
【００８８】
Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーにおけるＤＮＡ増幅を以下のサイクリングパラメーターを用いて進める。Eppendorf Mastercycler GradientまたはMJ EngineにおけるＰＣＲを試行する場合、そのサーモサイクラーを、その計算様式で試行すべきである。Perkin-Elmer 9700におけるＰＣＲを試行する場合、サーモサイクラーを最大に設定された温度勾配速度で試行する。
【００８９】
前記に開示され、特許請求の範囲に引用されたトウモロコシＭＯＮ８８０１７種子の寄託は、ブダペスト条約下、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）、0801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110でなされた。そのＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ−５５８２である。その寄託は、３０年間の期間、または最終の請求後５年、または特許の有効期間の間のいずれかの長期間寄託施設において維持され、その期間中の必要な場合に交換されるであろう。。
【００９０】
実施例７
食料および商品のごとき生成物は、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７から生成でき、かかる食料および商品は、かかる食料および商品において十分なレベルにて検出される場合、かかる商品および食料内のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７物質の存在に特徴的になり得るヌクレオチド配列を含むと予期される。かかる食料および商品の例は、限定されるものではないが、動物による食料源として消費のための、さもなければ、バルキング剤（bulking agent）として意図された、または化粧品用途のためのメークアップ組成物における成分として意図されたトウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、トウモロコシグルテン、コーンケーキ、コーンスターチおよび他の食料等を含む。配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５に記載された配列よりなる群から選択されるプローブまたはプライマー対に基づいた核酸検出方法および／またはキットが開発され、それは、生物学的試料中の配列番号：１および配列番号：２のごときＭＯＮ８８０１７ヌクレオチド配列の検出を可能とし、かかる検出は、かかる試料中のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的であろう。
【００９１】
本発明の原理を説明および記載したことにより、本発明はかかる原理から逸脱なく、配置および細部において変更できることは当業者に明らかであろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲の精神および範囲内にある全ての変形を特許請求する。
【００９２】
本明細書に引用された全ての刊行物および公開された特許文書をここに出典明示して、個々の刊行物または特許出願が出典明示して組み込まれると具体的にかつ個々に示される同一の範囲にまで本明細書の一部とみなす。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年１２月１５日に出願された米国仮出願第６０／５２９,４７７号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、植物分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、グリホサート耐性および昆虫抵抗性のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、ならびに植物試料および組成物中でのトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡのアッセイ方法およびその存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
トウモロコシは、世界の多くの領域において重要な作物であって、主食料源である。バイオテクノロジー手法は、その生成物の農業形質および質の改良のためにトウモロコシに適用されている。かかる１つの農業形質は、除草剤耐性、特に、グリホサート除草剤に対する耐性である。トウモロコシにおけるこの形質は、グリホサート抵抗性の５−エノールピルビル−３−シキミ酸リン酸合成酵素（ＣＰ４ ＥＰＳＰＳおよび米国特許第５,６３３,４３５号）を発現するトウモロコシ植物における挿入遺伝子の発現により与えられた。もう一つの農業形質は、昆虫抵抗性、例えば、遺伝子操作されたトウモロコシ植物のコーンボーラーおよびコーンルートワームに対する抵抗性である（米国特許第６,４８９,５４２号および米国特許第６,６２０,９８８号）。有性交雑の子孫が、注目する導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを含むかを決定するために特定の植物の導入遺伝子／ゲノムＤＮＡの存在を検出できることは有利であろう。加えて、組換えの作物植物から由来した食品の市販前承認および標識を必要とする規制に従う場合に、特定の植物の検出方法は有用であろう。
【０００４】
植物における外来遺伝子の発現は、恐らくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）、または組込み部位に近接した転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近接によりそれらの染色体の位置により影響されることが知られている(Weisingら, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988)。この理由のために、導入された注目する遺伝子の最適な発現により特徴づけられた植物を同定するために多数の植物をスクリーニングすることがしばしば必要である。例えば、それは、植物中の導入された導入遺伝子の発現のレベルにおける広い変化が存在する植物および他の生物体中で観察された。また、空間または一時的なパターンの発現における差、例えば、様々な植物組織において導入遺伝子の相対的な発現の差が存在し、それは導入された遺伝子構築体に存在する転写調節エレメントから予期されたパターンに対応しなくてもよい。この理由のために、何百〜何千もの異なるトランスジェニック植物を生成し、商業目的のための所望の導入遺伝子発現レベルおよび発現型を有する単一の植物につきそれらの植物をスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有する植物は、従来の育種方法を用いる有性交雑によりその導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。かかる交雑の子孫は、本来の形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。この戦略を用いて、局所的な生育条件および市場需要に良好に適応した多数の変種における信頼できる形質発現を保証する。
【０００５】
ポリ核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＤＮＡハイブリダイゼーションのごときいずれかのよく知られた核酸検出方法により導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般的に、ＤＮＡ構築体の導入遺伝子の成分であるプロモーター、リーダー、イントロン、コード領域、３’転写ターミネーター、マーカー遺伝子等のごとき遺伝子エレメントに特異的であるＤＮＡプライマーまたはプローブ分子を用いる。結果的に、かかる方法は、挿入された導入遺伝子ＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの配列が知られていない限りは、異なる導入遺伝子の事象、特に、同一の導入遺伝子ＤＮＡ構築体を用いて生成したものを区別するのに有用ではないかもしれない。事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、多数の導入遺伝子の作物植物導入、例えば、甜菜（米国特許第６,５３１,６４９号）、小麦（米国特許公開２００２００６２５０３）、昆虫抵抗性トウモロコシ（米国特許公開２００２０１０２５８２）、およびグリホサート耐性トウモロコシ事象ｎｋ６０３（米国特許公開２００２００１３９６０）につき開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、およびその中に含まれた組成物、ならびにこれらの組成物を含むトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７およびその子孫中の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の検出方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、受入番号ＰＴＡ−５５８２を持つ米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）に寄託された種子を有するＭＯＮ８８０１７と指定されたトランスジェニックトウモロコシ植物に関する。本発明のもう一つの態様は、植物ＭＯＮ８８０１７の植物および種子の子孫植物もしくは種子または再生可能な器官を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、種子、根および葉を含むトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の植物器官を含む。本発明は、グリホサート耐性の表現型およびコーンルートワーム抵抗性の表現型を有するトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、およびＭＯＮ８８０１７のゲノムに含まれた新規な遺伝子組成物に関する。
【０００８】
本発明の１つの態様は、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７からの導入遺伝子／ゲノムの結合領域の存在を検出するＤＮＡ組成物および方法を提供する。配列番号：１および配列番号：２ならびにその相補体よりなる群から選択される少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノムの結合ＤＮＡ分子を含み、ここに、該結合分子は、トウモロコシゲノムに挿入された異種ＤＮＡおよびトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７中の挿入部位に隣接するトウモロコシゲノムＤＮＡを含む導入遺伝子挿入部位にわたる単離されたＤＮＡ分子が提供される。これらのＤＮＡ分子のうちのいずれか１つを含むトウモロコシ種子およびその植物材料は、本発明の１つの態様である。
【０００９】
導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：３またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡは、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：３を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１０】
発明の他の態様により、導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：４またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡ分子はトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：４を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１１】
ＭＯＮ８８０１７の導入遺伝子／ゲノム領域、配列番号：５またはその相補体である単離されたＤＮＡ分子が提供され、ここに、このＤＮＡ分子はトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムにおいて新規である。そのゲノム中に配列番号：５を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の１つの態様である。
【００１２】
発明のもう一つの態様により、プライマー対を含む２つのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ検出方法における使用ために提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：３のＤＮＡ分子の導入遺伝子ＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号：３のトウモロコシゲノムＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、一緒に用いられる場合にこれらのＤＮＡ分子は、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーセットを含む。ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマー対を用いて生成されたアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号：１を含む場合、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に特徴的である。アンプリコンが配列番号：１を含むＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡから生成されたいずれの長さのアンプリコンも、本発明の１つの態様である。当業者は、第１および第２のＤＮＡ分子が、ＤＮＡよりだけからなることを必要としないだけではく、単独でＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡまたは１以上のポリメラーゼにつき鋳型として作用しない他のヌクレオチドもしくはそのアナログの組合せよりなり得ることを認識するであろう。加えて、当業者は、本明細書に記載されたプローブまたはプライマーが、長さが少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０の連続ヌクレオチドからのものであり、配列番号：１（任意に５’結合という）、配列番号：２（任意に３’結合という）、配列番号：３（任意に指定された５’フランキング配列の一部分）、配列番号：４（任意に指定された３’フランキング配列の一部分）、および配列番号：５（挿入されたヌクレオチド配列の全てまたは一部分）から選択されるべきであることを認識するであろう。長さが少なくとも約２１から５０以上の連続ヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５に記載されたヌクレオチドの群から選択される場合に可能である。
【００１３】
発明のもう一つの態様により、プライマー対を含む２つのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ検出方法における使用のために提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：４のＤＮＡ分子の導入遺伝子ＤＮＡ領域またはその相補体のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号：４またはその相補体のトウモロコシゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の近接するポリヌクレオチドを含み、ここに、一緒に用いられた場合にこれらのＤＮＡ分子は、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーセットを含む。ＤＮＡ増幅方法においてＤＮＡプライマー対を用いて生成されたアンプリコンは、それが配列番号：２を含む場合にトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に特徴的である。アンプリコンが配列番号：２を含むＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡから生成されたいずれの長さのアンプリコンも、本発明の１つの態様である。
【００１４】
発明のもう一つの態様により、特に試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡを含む試料とＤＮＡプライマー対とを接触させ；次いで、（ｂ）核酸増幅反応を行い、それによりアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）アンプリコンを検出することを特徴とし、ここに、アンプリコンは配列番号：１または配列番号：２を含む。
【００１５】
発明のもう一つの態様により、特に試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む試料と、配列番号：１または配列番号：２、あるいはトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非ＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしない配列番号：１もしくは配列番号：２に実質的に相同的なＤＮＡ分子とを接触させ；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで、（ｃ）トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする。
【００１６】
発明のもう一つの態様により、グリホサートの適用に耐え、コーンルートワームに抵抗性であるトウモロコシ植物を生成する方法が提供され、その方法は、第１の親トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７と、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性を欠く第２の親トウモロコシ植物とを有性交雑させ、それにより、グリホサート耐性およびコーンルートワーム抵抗性である雑種子孫植物を生成する工程を含む。
【００１７】
発明のもう一つの態様は、（ａ）トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合に、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的である第１のアンプリコンを生成する配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４を含むプライマーセットと試料とを接触させ；次いで、（ｂ）核酸増幅反応を行ない、それにより第１のアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）第１のアンプリコンを検出し；次いで、（ｄ）トウモロコシからのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合に、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７と同定された導入遺伝子挿入のトウモロコシゲノム領域に相同性である本来のトウモロコシゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する前記プライマーセットとトウモロコシＤＮＡを含む試料を接触させ；次いで、（ｅ）核酸増幅反応を行ない、それにより、第２のアンプリコンを生成し；次いで、（ｆ）第２のアンプリコンを検出し；次いで、（ｇ）試料中の第１および第２のアンプリコンを比較することを含むトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７の子孫の接合状態を決定する方法であり、ここに、双方のアンプリコンの存在は、試料が導入遺伝子挿入につき異型接合であることを示す。
【００１８】
有効量のグリホサート含有除草剤をＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物の圃場に適用する工程を含む、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の圃場における雑草を制御する方法。
【００１９】
少なくとも１つの親がＭＯＮ８８０１７である雑種トウモロコシ種子。
【００２０】
ｐＭＯＮ５３６１６の植物発現カセットを含む植物ＤＮＡ構築体で形質転換されたトウモロコシ植物。
【００２１】
本発明の前記および他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐＭＯＮ５３６１６のプラスミド地図。
【図２】トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７における挿入断片のゲノム構成。
【図３】ＭＯＮ８８０１７ ５’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号３）。
【図４Ａ】ＭＯＮ８８０１７ ３’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号４）。
【図４Ｂ】ＭＯＮ８８０１７ ３’導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号４）。
【図５Ａ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｂ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｃ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｄ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【図５Ｅ】ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ領域（配列番号５）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において「植物ＭＯＮ８８０１７」または「ＭＯＮ８８０１７」というトランスジェニックトウモロコシ植物は、鞘翅類害虫（Coleopteran pest）コーンルートワーム（Diabrotica spp.）による食害に抵抗性であり、かつグリホサートを含有する農業用除草剤の植物毒素作用に耐性である。この二重形質のトウモロコシ植物は、コーンルートワーム幼虫による食害に対する抵抗性、およびグリホサートに対する植物耐性を与えるAgrobacterium sp.株CP4からのグリホサート抵抗性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ）蛋白質（米国特許第５,６３３,４３５号）を提供するBacillus thuringiensis（亜種 ｋｕｍａｍｏｔｏｅｎｓｉｓ）からのＣＲＹ３Ｂｂ１蛋白質（米国特許第６,５０１,００９号）の改変変異体を発現する。二重形質トウモロコシの使用は、トウモロコシ生産者に主要な利点：ａ）世界の多数のトウモロコシ栽培領域における生育関連における主な害虫のコーンルートワーム幼虫による経済的な損失からの保護、ならびにｂ）広域スペクトルの雑草制御のためのトウモロコシ作物に対する農業用除草剤を含有するグリホサートを適用する能力を提供するであろう。加えて、コーンルートワームおよびグリホサート耐性形質をコードする導入遺伝子を、同一ＤＮＡセグメントに連結し、ＭＯＮ８８０１７のゲノム中の単一座にて生じさせ、これは、育種効率の増強を提供し、育種集団およびその子孫における導入遺伝子挿入断片を追跡するための分子マーカーの使用を可能にする。
【００２４】
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７は、プラスミド構築体ｐＭＯＮ５３６１６での生来のトウモロコシ系のAgrobacterium媒介形質転換プロセスにより生成された（図１）。このプラスミド構築体は、トウモロコシ植物細胞中に、ＣＲＹ３Ｂｂ１蛋白質およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳ蛋白質の発現に必要な調節遺伝エレメントと連結した植物発現カセットを含む。トウモロコシ細胞は、無傷のトウモロコシに再生成され、個々の植物は、植物発現カセットの完全性、およびグリホサートおよびコーンルートワーム幼虫の食害に対する抵抗性を示すその植物集団から選択された。そのゲノム中にｐＭＯＮ５３６１６の連結した植物発現カセットを含むトウモロコシ植物は、本発明の１つの態様である。
【００２５】
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７のゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡは、詳細な分子の分析により特徴づけられた。これらの分析は、挿入断片数（トウモロコシゲノム内の組込みサイト数）、コピー数（１つの座内のＴ−ＤＮＡのコピー数）および挿入された遺伝子カセットの完全性を含んだ。無傷のＣＰ４ ＥＰＳＰＳおよびＣＲＹ３Ｂｂ１コード領域およびそれらの各調節エレメント、植物発現カセットのプロモーター、イントロンおよびポリアデニル化配列、ならびにそのプラスミドｐＭＯＮ５３６１６骨格ＤＮＡ領域を含むＤＮＡ分子プローブを用いた。そのデータは、ＭＯＮ８８０１７がＣＲＹ３Ｂｂ１およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳカセットの双方の１コピーを持つ単一のＴ−ＤＮＡ挿入断片を含むことを示す。無傷の遺伝子カセットに連結されたかまたは連結されていない形質転換ベクターｐＭＯＮ５３６１６からのさらなるエレメントは、ＭＯＮ８８０１７のゲノム中に検出されなかった。最後に、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列の分析を行い、５’および３’挿入断片−対−植物ゲノム結合を決定し、挿入断片内のエレメントの組成を確認し（図２）、トウモロコシＭＯＮ８８０１７中の挿入断片の完全なＤＮＡ配列を決定した（配列番号：５）。
【００２６】
グリホサート耐性、コーンルートワーム抵抗性トウモロコシ植物は、ＭＯＮ８８０１７から生長したトウモロコシ植物よりなる第１の親トウモロコシ植物と、グリホサート除草剤に対する耐性を欠く第２の親トウモロコシ植物とをまず有性交雑させて、それにより複数の雑種子孫植物を生成することにより育種できる。生来のトウモロコシ系は、反復親と戻し交雑し、グリホサート処置での選択を含むプロセスにより生成できる。異なった形質および作物に一般的に用いられる他の育種方法の記載は、当該技術分野において知られた参考文献、例えば、Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)に見出すことができる。
【００２７】
特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者による伝統的な用法により理解すべきである。また、分子生物学における共通の用語の定義は、Riegerら, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991;およびLewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994に見出すことができる。３７ＣＦＲ§１.８２２に記載されたＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。
【００２８】
本願明細書に用いた「トウモロコシ」なる用語は、Zea maysを意味し、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７で生育できるすべての植物変異体を含む。
【００２９】
本願明細書に用いた「含む」なる用語は、「限定なくして含む」ことを意味する。
【００３０】
「グリホサート」とは、Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩をいう。Ｎ−ホスホノメチルグリシンは、広域スペクトルの植物種に対する活性を有するよく知られた除草剤である。グリホサートは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．）の有効成分であり、その環境において望ましい短い半減期を有する安全な除草剤である。グリホサートは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ除草剤（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．）の有効成分である。「グリホサート除草剤」での処置とは、ＲｏｕｎｄｕｐＲ、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＵｌｔｒａＲ、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＰｒｏＲ除草剤またはグリホサートを含有するいずれかの他の除草製剤をいう。グリホサートの商業用製剤の例は、限定なくして、ＲＯＵＮＤＵＰＲ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＵＬＴＲＡＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＢＩＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯＲ、ＰＯＬＡＲＩＳＲ、ＳＰＡＲＫＲおよびＡＣＣＯＲＤＲ除草剤としてモンサント社により販売されるもの、その全てはそのイソプロピルアンモニウム塩としてのグリホサートを含有し；ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＤＲＹおよびＲＩＶＡＬＲ除草剤としてモンサント社により販売されるもの、それらはそのアンモニウム塩としてのグリホサートを含有し；ＲＯＵＮＤＵＰＲ ＧＥＯＦＯＲＣＥとしてモンサント社により販売されるもの、それはそのナトリウム塩としてのグリホサートを含有し；およびＴＯＵＣＨＤＯＷＮＲ除草剤としてＳｙｎｇｅｎｔａ Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎにより販売されるもの、それはそのトリメチルスルホニウム塩としてのグリホサートを含有するを含む。植物表面に適用された場合、グリホサートは植物を通って全体に移動する。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を供するシキミ酸経路のその抑制による植物毒素である。グリホサートは、植物に見出される酵素５−エノールピルビル−３−ホスホシキマート合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を抑制する。グリホサート耐性は、グリホサートに対する低親和性を有する細菌性ＥＰＳＰＳ変異体および植物ＥＰＳＰＳ変異体の発現により達成でき、従って、グリホサートの存在下でそれらの触媒活性を保持する（米国特許第５,６３３,４３５号、第５,０９４,９４５号、第４,５３５,０６０号および第６,０４０,４９７号）。
【００３１】
コーンルートワーム（ＣＲＷ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｐ）幼虫は、トウモロコシ植物を発育させる根を食べる。実質的な費用および時間は、この害虫により引き起こされた経済損害の制御に向けられる。有機燐化合物、カルバマートおよびピレスロイドを含めた化学殺虫剤は、ＣＲＷを制御するために、毎年１６００万を超えるトウモロコシ・エーカーの土壌に取り込まれる。土壌殺虫剤から導入遺伝子のアプローチまで離れてシフトする利点はめざましく、潜在的なヒトの健康および安全性リスクにおける低下、非標的生物体に対する直接的な衝撃の低下、表面および地下水の供給の汚染の低下、減少した殺虫剤容器の処分問題、ならびに他の害虫管理および農業問題との一般的な適合を含む。
【００３２】
本発明は、高レベルのＣＲＹ３Ｂｂ１デルタエンドトキシンを発現する少なくとも１つの発現カセットならびにグリホサート耐性酵素を発現する少なくとも１つの発現カセットを含むＤＮＡ構築体で形質転換されているＤＮＡで形質転換されたトランスジェニック植物を提供する。本方法によるおよび本明細書に開示されたＤＮＡ構築体で形質転換されたトウモロコシ植物は、ＣＲＷに抵抗性である。また、同一トウモロコシ植物は、グリホサート除草剤に抵抗性である。連結した農業的形質は、育種集団中でこれらの形質をともに維持することにおいて容易さを供する。
【００３３】
トランスジェニック「植物」は、異種のＤＮＡ、すなわち、注目する導入遺伝子を含むポリ核酸構築体での植物細胞の形質転換；その植物細胞のゲノムへの導入遺伝子の挿入に由来する植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入により特徴付けされた特定の植物の選択により生成される。「事象」なる用語とは、異種のＤＮＡを含む本来の形質転換体植物および形質転換体の子孫をいう。また、「事象」なる用語は、その事象と、子孫が異種のＤＮＡを含むもう一つの植物との間の性的外交雑により生じた子孫を含む。反復親への繰り返された戻し交雑の後でさえ、形質転換された親事象からの挿入されたＤＮＡおよび隣接するゲノムＤＮＡは、同一染色体の位置にてその交雑の子孫において存在する。また、「事象」なる用語は、挿入されたＤＮＡおよび、挿入されたＤＮＡに直ちに隣接したフランキングゲノム配列を含む本来の形質転換体からのＤＮＡをいい、それは、挿入されたＤＮＡ、ならびに挿入されたＤＮＡを含まない親系を含む一つの親系の有性交雑（例えば、自配に起因する本来の形質転換体および子孫）の結果としての注目する導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受ける子孫に移されると予期されるであろう。本発明は、導入遺伝子の事象、トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７、その子孫、およびそこに含有されたＤＮＡ組成物に関する。
【００３４】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤もしくは酵素に結合した単離核酸である。かかるプローブは標的核酸の鎖、本発明の場合に、ＭＯＮ８８０１７植物、またはＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む試料からのいずれかのＭＯＮ８８０１７からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ鎖に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ物質を含む。
【００３５】
ＤＮＡプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長された単離ポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマー対またはＤＮＡプライマーセットとは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来のポリ核酸増幅方法により標的核酸配列の増幅に有用な２つのＤＮＡプライマーをいう。
【００３６】
ＤＮＡプローブおよびＤＮＡプライマーは、一般的に長さが１１個以上のポリヌクレオチドで、しばしば１８個以上のポリヌクレオチド、２４個以上のポリヌクレオチドまたは３０個以上のポリヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであるように選択する。好ましくは、標的配列にハイブリダイズする能力を保持する標的配列とは異なるプローブは、通常の方法により設計し得るが、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有する。
【００３７】
プローブおよびプライマーを調製および用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (以下「Sambrookら, 1989」); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (with periodic updates) (以下「Ausubelら, 1992」);およびInnisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990に記載されている。ＰＣＲ ＤＮＡプライマー対は、例えば、Primer (Version 0.5, c 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)のごときその目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、公知の配列から誘導できる。
【００３８】
本明細書に開示されたフランキングゲノムＤＮＡおよび挿入配列に基づいたプライマーおよびプローブを用いて、例えば、通常の方法、かかるＤＮＡ分子を再クローニングおよび配列決定することにより、開示されたＤＮＡ配列を確認できる（および必要ならば修正できる）。
【００３９】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下、標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。いずれかの通常の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中のトランスジェニック植物からのＤＮＡの存在を同定できる。核酸セグメントともいわれるポリ核酸分子、またはその断片は、ある種の環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズできる。本願明細書に用いた２つのポリ核酸分子は、２つの分子がアンチパラレルの二本鎖の核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると考えられる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であると考えられる。本願明細書に用いた分子は、その分子のうちの１つのすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に、「完全な相補性」を示すと考えられる。２つの分子が、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされるのを可能とするのに十分な安定性をもって、相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であると考えられる。同様に、その分子が、それらが通常の「高ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされるのを可能とするのに十分な安定性をもって、相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると考えられる。通常のストリンジェンシー条件は、Sambrookら, 1989、およびHaymesら, In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)に記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖の構造を形成する分子の能力を完全には排除しない限りは、許容される。核酸分子がプライマーおよびプローブとして機能するために、それは使用された特定の溶媒および塩の濃度下で安定した二本鎖の構造を形成できるように単に十分に、配列において相補的であることを必要とする。
【００４０】
本願明細書に用いた、実質的に相同性の配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されるべき核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促す適当なストリンジェンシー条件、例えば、４５℃での６.０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いての５０℃での２.０×ＳＳＣの洗浄が当業者に知られているか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃の約２.０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０.２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーで選択できる。加えて、洗浄工程の温度は、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に増加できる。温度および塩の双方は変更できるか、または温度または塩濃度のいずれかが一定に保持されていてもよく、一方、他方の変数が変更される。好ましい具体例において、本発明のポリ核酸は、例えば、約２.０×ＳＳＣ、および約６５℃にて中程度のストリンジェントな条件下にて、配列番号１、２、３、４もしくは５に記載された１以上の核酸分子、またはその相補体もしくはいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下にて、配列番号１、２、３、４もしくは５に記載された１以上の核酸分子、またはいずれかの相補体もしくは断片に特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片を有する。本発明のもう一つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片と８０％〜１００％、または９０％〜１００％の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体あるいはそのいずれかの断片と９５％〜１００％の配列同一性を共有する。配列番号：１または配列番号：２を植物生育方法におけるマーカーとして用いて、「DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Cregan,ら, eds., Wiley-Liss NYにおける単純な配列反復ＤＮＡマーカー分析に記載された方法に類似する遺伝子交雑の子孫を同定し得る。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られたいくつかの方法により検出でき、それらの方法は、限定されるものではないが、蛍光性タグ、放射活性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含む。
【００４１】
特定の増幅プライマー対を用いた（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」は、対応する野生型配列（またはその相補体）がＤＮＡ熱増幅反応において、ユニークな増幅生成物、アンプリコンに結合および好ましくはそれを生成するであろう標的核酸配列にだけプライマー対がハイブリダイズするのを可能とする条件である。
【００４２】
「（標的配列）に特異的な」なる用語は、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料中の標的配列にだけストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを示す。
【００４３】
本願明細書に用いた「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、ポリ核酸の鋳型の一部である標的ポリ核酸分子に指向されたポリ核酸増幅方法の生成物をいう。例えば、有性交雑に起因するトウモロコシ植物が本発明のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７植物からのトランスジェニック植物ゲノムＤＮＡを含むかを決定するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種のＤＮＡ（導入遺伝子ＤＮＡ）の挿入部位に隣接するＭＯＮ８８０１７植物のゲノムにおけるＤＮＡ配列に由来するプライマー、ならびにＭＯＮ８８０１７植物ＤＮＡの存在につき特徴的であるアンプリコンを生成するために挿入された異種のＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を用いて、ポリ核酸増幅方法に付してもよい。その特徴的なアンプリコンはある長さにあり、また、植物ゲノムＤＮＡについて特徴的であるＤＮＡ配列を有し、そのアンプリコンのＤＮＡ配列は、配列番号：１または配列番号：２を含む。そのアンプリコンは、長さにおいて、そのプライマー対＋一つのヌクレオチド塩基対、好ましくは、＋約５０個のヌクレオチド塩基対、より好ましくは、約２５０個のヌクレオチド塩基対、さらにより好ましくは、＋約４５０個のヌクレオチドまたはそれらを超える、の組み合わせた長さの範囲に有り得る。あるいは、プライマー対は、完全な挿入断片ポリヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するような挿入された異種のＤＮＡの両側におけるゲノム配列から誘導できる（例えば、そのＭＯＮ８８０１７ゲノムに挿入されたｐＭＯＮ５３６１６ ＤＮＡ断片の２つの発現カセットを含み、その挿入断片が配列番号：５の約７１２５個のヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を増幅する配列番号：３のゲノム部分から単離された前方プライマーおよび配列番号：４のゲノム部分から単離された逆プライマ―、図２および図５）。導入遺伝子挿入ＤＮＡに隣接する植物ゲノム配列から誘導されたプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列からのある距離にて位置し、この距離は、１個のヌクレオチド塩基対から約２００００ヌクレオチド塩基対までの範囲とできる。「アンプリコン」なる用語の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成されてもよいプライマー二量体を特に除外する。
【００４４】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当該技術分野において知られた様々なポリ核酸の増幅方法のいずれによっても達成できる。増幅方法は当該技術分野において知られており、とりわけ、米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号ならびにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innisら, Academic Press, San Diego, 1990に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、２２ｋｂ（キロベース）までのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された(Chengら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994)。ＤＮＡ増幅の技術分野において知られたこれらの方法ならびに他の方法を本発明の実施に用いてもよい。その異種のＤＮＡ挿入断片の配列またはＭＯＮ８８０１７からのフランキングゲノムＤＮＡ配列は、本明細書に供された配列から誘導されたプライマーを用いて、受入番号ＰＴＡ−５５８２を有するＡＴＣＣに寄託されたＭＯＮ８８０１７種子、またはその種子から生育した植物からのかかるＤＮＡ分子を増幅し、続いてＰＣＲアンプリコンまたはそのクローン化されたＤＮＡ断片の標準的なＤＮＡ配列決定により確認できる（および必要ならば修正できる）。
【００４５】
ＤＮＡ増幅方法に基づいたＤＮＡ検出キットは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、適当な反応条件下で特徴的なアンプリコンを増幅するＤＮＡプライマー分子を含む。そのキットは、当該技術分野において知られたアガロースゲルベースの検出方法または特徴的なアンプリコンを検出するいずれかの方法を提供し得る。配列番号：３または配列番号：４のトウモロコシゲノム領域のいずれかの部分、および配列番号：５の導入遺伝子挿入領域のいずれかの部分に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーを含むキットは、本発明の目的である。特に、ＤＮＡ増幅方法において有用なプライマー対であると確認されたのは、ＭＯＮ８８０１７の５’導入遺伝子／ゲノム領域の一部分に相同的な特徴的なアンプリコンを増幅する配列番号：６および配列番号：７であり、ここに、そのアンプリコンは配列番号：１を含む。ＤＮＡプライマーとして有用な他のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅の当該技術分野における当業者により、ＭＯＮ８８０１７（配列番号：５）の開示された導入遺伝子／ゲノムＤＮＡ配列から選択できる。
【００４６】
これらの方法により生成された特徴的なアンプリコンは、複数の技術により検出し得る。隣接した側面に位置するゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されている場合、かかる１つの方法は、遺伝子ビット分析(Nikiforov,ら Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)である。オリゴヌクレオチドは、マイクロタイタープレートのウェルに固定化される。（挿入された配列における１つのプライマー、および隣接したフランキングゲノム配列における１つを用いて）注目する領域のＰＣＲ後、単鎖ＰＣＲ生成物を固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼを用いて単一の塩基伸長反応についての鋳型として機能させ、次いで、予期された次の塩基に特異的なジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）で標識できる。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡベースで有り得る。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一の塩基伸長による導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４７】
もう一つの方法は、Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)により記載されたピロシーケンス手法である。この方法において、隣接したゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップさせたオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）からの単鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’フォスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰは個々に加えられ、取込の結果、光シグナルが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または複数の塩基伸長による導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４８】
Chen,ら, (Genome Res. 9:492-498, 1999)により記載された蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合をオーバーラップしたオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入されたＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列の１つ）からの単鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ、次いでＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一の塩基伸長はｄｄＮＴＰの取込みを生じる。取込みは、蛍光測定器を用いて、極性化における変化として測定できる。極性化における変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一の塩基伸長により導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００４９】
ＴａｑｍａｎＲ(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載され、それは製造者により供される説明書において十分に理解される。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップさせたＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。そのＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）は、熱安定性のポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。そのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部位から離れて、蛍光性の部位を切断および放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションにより導入遺伝子／ゲノムの配列の存在を示す。
【００５０】
分子ビーコン（Molecular Beacon）は、Tyangiら (Nature Biotech.14:303-308, 1996)に記載された配列検出において用いるために記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入ＤＮＡ結合をオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。そのＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは、蛍光およびクエンチング部分を密接に近接したままとする二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノムの配列における１つ）は、熱安定性のポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＰＣＲ増幅の成功後、標的配列に対するＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、プローブの二次構造を除去し、その蛍光およびクエンチング部分を空間的に分離する。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキング挿入断片配列の存在を示す。
【００５１】
ＤＮＡ検出キットは、本願明細書に示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野においてよく知られた方法を用いて展開できる。そのキットは、試料中のトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡの同定に有用であり、ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含むトウモロコシ植物を生育させる方法に適用できる。キットは、プライマーまたはプローブとして有用であり、かつ配列番号：１、２、３、４、または５の少なくとも一部分に相同的または相補的であるＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ）において、またはポリ核酸ハイブリダイゼーション法、すなわち、サザン分析、ノーザン分析におけるプローブとして用いることができる。トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を生成するために用いたプラスミドベクターｐＭＯＮ５３６１６は、２つの発現カセットを含み：発現カセット１は、小麦Ｈｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列に連結したＣＲＹ３Ｂｂ１コード領域に連結したコメアクチン１イントロンに連結した小麦ＣＡＢ ５’リーダーに連結した複製されたエンハンサーを持つＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；およびＣＰ４ ＥＰＳＰＳコード領域に融合し、ＮＯＳ ３’ポリアデニル化配列に連結した葉緑体シグナルペプチドの転写を駆動するコメアクチン１イントロンに連結したコメアクチン１プロモーターを含む発現ベクター２に連結し、その連結した発現カセットの配列は、配列番号：５に含まれる。
【００５２】
以下の実施例は、発明のある好ましい具体例の実施例を示すために含まれる。以下の実施例において示された技術は、発明者らが発明の実施において良好に機能すると分かったアプローチを表し、かくして、その実施につき好ましい様式の実施例を構成すると考えることができることは当業者ならば十分に理解するであろう。しかしながら、当業者は、本開示に徴して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の変更が開示された特定の具体例においてなすことができ、かつ同様または類似する結果を依然として得ると考えるであろう。
【実施例】
【００５３】
実施例１
トランスジェニックトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７は、ｐＭＯＮ５３６１６から誘導されたＤＮＡ断片を用いてトウモロコシ細胞のAgrobacterium媒介形質転換により生成した（図１）。植物形質転換構築体ｐＭＯＮ５３６１６は、三親性（triparental）交雑手順を用いてAgrobacteriumに交雑させた(Dittaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7347-7351, 1980)。２つの導入遺伝子植物発現カセットを含むｐＭＯＮ５３６１６のＤＮＡ断片は、トウモロコシ植物細胞のゲノムに挿入し、そのトウモロコシ植物細胞をトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７に再生した。ＭＯＮ８８０１７のゲノム中への挿入断片の配置を（図２）に示す。ＭＯＮ８８０１７およびその子孫は、グリホサートに対する耐性を有し、コーンルートワーム幼虫食害に抵抗性である。本願明細書に記載のように、トウモロコシ形質転換を本質的に行った。
【００５４】
ｐＭＯＮ５３６１６を含むAgrobacteriumの液体培養物をグリセロールストック、または新たな縞状のプレートから開始し、次いで、振盪（約１５０毎分回転数、ｒｐｍ）しつつ、５０ｍｇ／ｌ（ミリグラム／リットル）カナマイシン、および５０ｍｇ／ｌストレプトマシンもしくは５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンのいずれか、および２００μＭアセトシリンゴン（acetosyringone）（ＡＳ）を含む２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含有するｐＨ７.０の液体ＬＢ培地において中間対数増殖相まで２６℃〜２８℃にて一晩増殖させる。Agrobacterium細胞は、接種培地（米国特許第６,５７３,３６１号の表８に記載される液体ＣＭ４Ｃ）に再懸濁し、細胞密度を、その再懸濁された細胞が６６０ｎｍ（すなわち、ＯＤ６６０）の波長にて分光測光器中で測定される場合に１の光学密度を有するように調整する。新たに単離したタイプＩＩの未熟なＨｉＩＩｘＬＨ１９８およびＨｉＩＩトウモロコシ胚を、Agrobacteriumを接種し、２３℃にて暗所で２〜３日間共培養する。次いで、胚を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)および２０μＭ ＡｇＮＯ３を補足した遅延（delay）培地（Ｎ６ １−１００−１２；米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載）に移し、２８℃にて４〜５日間培養した。引き続いての全ての培養はこの温度に保つ。
【００５５】
トウモロコシ子葉鞘は接種１週間後に取り出す。胚を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび０.５ｍＭグリホサートを補足した第１の選択培地（米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載されたＮ６１−０−１２）に移す。２週間後に、残存する組織を、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび１.０ｍＭグリホサートで補足した第２の選択培地（Ｎ６１−０−１２）に移す。残存するカルスを１.０ｍＭグリホサートで２週間毎に約３の継代培養の間継代する。グリホサート耐性組織を同定した場合、その組織を再生のために大きする。再生のために、カルス組織を、０.１μＭアブシジン酸(ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO)を補足した再生培地（米国特許第５,４２４,４１２号の表１に記載されるＭＳＯＤ）に移し、次いで、２週間培養する。再生しているカルスを高スクロース培地に移し、２週間培養する。小植物を培養容器中でＭＳＯＤ培地（ＡＢＡ無し）に移し、２週間培養する。次いで、根を持つ植物を土壌に移す。トウモロコシ細胞の形質転換方法の当該技術分野における当業者は、この方法を変形して、本発明のＤＮＡ構築体を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を提供できるか、またはトランスジェニック単子葉植物植物を提供することが知られた粒子銃のごとき他の方法を用いることができる。
【００５６】
ＭＯＮ８８０１７植物および種子は再生可能な器官を有する。その種子の再生可能な器官は、限定されるものではないが、胚、子葉、および苗条または、根分裂組織を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、苗条、根および葉を含めたトウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７の植物器官を含む。また、本発明は、限定されるものではないが、蛋白質、ミール、粉末および油を含めたＭＯＮ８８０１７種子の抽出可能な成分を含む。
【００５７】
実施例２
トウモロコシ植物ＭＯＮ８８０１７を、グリホサートの栄養性および生殖性障害に対する耐性につき多数のトランスジェニックトウモロコシ植物から選択した。商業的に高品質のトランスジェニック植物の成功した生成は、現在、多数のトランスジェニック植物の生成を必要とする。本発明において、ＭＯＮ８８０１７は、ｐＭＯＮ５３６１６を含む異なるＤＮＡ構築体で形質転換した約４７２Ｒ０事象のうちの１つの植物であった。そのＭＯＮ８８０１７事象を、一連の分子分析、グリホサート耐性スクリーニング、昆虫抵抗性スクリーニングおよび発現分析スクリーニングにより多数の事象から選択した。
【００５８】
トランスジェニックトウモロコシ植物を温室および圃場のスクリーニングによる食害に対するコーンルートワーム抵抗性につきアッセイした。根損傷は、Iowa State UniversityのOlesonおよびTollefsonにより開発された節−損傷スケール（Node-Injury Scale, NIS）を用いて評価し、このスケールは、０〜３の値を用いてトウモロコシの根になされた損傷を評価する。その０.００の値は、食害がないことを示し、最低の格付けであり、１.００は、１つの節、またはその茎の約２インチ内で摂食された節全体の等価物を記載し、２.００は、摂食された２つの完全な節を記載し、また、３.００は、摂食された３以上の節を記載し、最高の格付けである。摂食された完全な節の中間の損傷は、欠けた節のパーセンテージとして記載され、例えば、１.５０は１ １／２節を記載し、０.２５は、摂食された１つの節の１／４を記載する。圃場の小区画に、Ｖ３〜Ｖ４成長段階での作条の直線フィート当たり１５００〜２０００個の卵を適用することによりコーンルートワーム幼虫を人工的にはびこらせた。殺虫剤で処置した列は、１０００フィートの列当たり５オンスの割合にて、テフルスリン（Tefluthrin）殺虫剤(ForceＲ 3G, Zeneca Ag Products)で処置した。ＭＯＮ８８０１７は、複数のテストにおいて、０.０８〜０.１１の根損傷格付け（ＲＤＲ）を示した。非殺虫剤処置した等値線（isoline）は、１.２８の平均ＲＤＲを示した。殺虫剤処置した非殺虫性蛋白質を含むトウモロコシ植物は、０.４４の平均ＲＤＲを示した。
【００５９】
トランスジェニックトウモロコシ植物をグリホサート除草剤で処置して、除草剤に対する耐性のレベルを決定した。テストプロットにグリホサート(RoundupＲ WeatherMax, Monsanto Co, St Louis, MO)を散布し、１.１２５および２.２５ポンド／エーカーの有効成分の割合で、Ｖ４成長段階にて１回およびＶ８成長段階にて１回の生育期間に２回適用した。トウモロコシ種子における収率を、散布していない(WeatherMax 0)ＭＯＮ８８０１７プロットに対しての収量パーセントとして収穫にて測定した。表１に示した結果は、ＭＯＮ８８０１７がグリホサートに高度に耐性であり、かつ収量を低下させず、驚くべきことに、その処置された小区画は、その処置された小区画のそれより収率において平均するとより高くなることを示す。
【００６０】
表１．未処置と比較したグリホサートで処置したＭＯＮ８８０１７の収量パーセント
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１ 説明文：Ｖ４からＶ８までの葉期での各ＷｅａｔｈｅｒＭａｘ処置の収量パーセントを、０からＶ４まで葉期でのＷｅａｔｈｅｒＭａｘ処置についての収量パーセントに比較し、その結果、０−Ｖ４処置は、各処置反復につき１００パーセントの収率ベースラインを確立した。
【００６３】
実施例３
ＭＯＮ８８０１７および対照物質からのゲノムＤＮＡを、最初に細粉に粒を処理することによりトウモロコシ粒から抽出した。約６グラムの処理された粒は、５０ｍｌ（ミリリッター）の円錐管に移し、次いで、約１６ｍｌのＣＴＡＢ抽出緩衝液の［１.５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、７５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０、１.０５Ｍ ＮａＣｌおよび０.７５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ（ＭＷ ４０,０００）］および８マイクロリットルのＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）をその処理した粒に加えた。試料を間欠性の混合を用いて６５℃にて３０〜６０分間インキュベートし、次いで、室温まで冷却させた。約１５ｍｌクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１（ｖ／ｖ））を試料に加えた。その懸濁液を５分間混合し、次いでその２相を室温にて約１６,０００×ｇで５分間の遠心分離により分離した。水性の（上部）層をきれいな５０ｍｌの円錐管に移した。１０％ＣＴＡＢ緩衝液［１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢおよび０.７Ｍ ＮａＣｌ］の約１／１０容（約１.５ｍｌ）および当量のクロロホルム：イソアミルアルコール［２４：１（ｖ／ｖ）］を水相に加え、次いで、それを５分間混合した。試料を約１６,０００×ｇで５分間遠心してそれらの相を分離した。水性（上部）層を取り出し、等容量（約１５ｍｌ）のＣＴＡＢ沈殿緩衝液［１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス ｐＨ８.０および１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０］と混合し、室温にて１〜２時間静置させた。その試料を室温にて１０分間約１０,０００×ｇで遠心して、ＤＮＡをペレットとした。上清を捨て、ペレットを約２ｍｌの高い塩ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０および１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。３７℃での穏やかな混合をペレットの溶解を援助するために行なった。要すれば、試料を室温にて約２３,０００×ｇで２分間遠心して、残骸をペレットとし、除去した。約１／１０容（約１５０μｌ）の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５.２）、および２容（上清に対して約４ｍｌ）の冷却した１００％エタノールを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％エタノールを含む微量遠心試験管にスプールした。そのＤＮＡを最高速度（約１４,０００ｒｐｍ）にて約５分間の微量遠心機にてペレットとし、真空乾燥させ、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）に再溶解した。次いで、ＤＮＡを４℃冷蔵庫に貯蔵した。
【００６４】
１０μｇのゲノムＤＮＡを、選択した制限酵素、例えば、SspI、EcoRV、ScaIおよびSmaIで４時間を超える間３７℃にて２００μｌの酵素制限緩衝液中で消化し、次いで、７０〜８０℃にて１５分間酵素を不活性化した。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＥｔＯＨで沈殿し、次いで２００μｌに溶解した。次いで、そのＤＮＡを４℃にて一晩１ｍｌの連結反応緩衝液およびＴ４ＤＮＡリガーゼ中で自己連結した。連結反応を７０〜８０℃で１５分間不活性化し、ＥｔＯＨで沈殿させ、次いで２００μｌに溶解した。次いで、そのＤＮＡを、High Fidelity Expand System (Roche)を用いて、その製造者により供給されたプロトコールに従い、pＣＰ４ ＥＰＳＰＳまたはＣＲＹ３Ｂｂコード領域内の特定のプライマーでＰＣＲのための鋳型として用いた。ネステッドプライマーでの第２のＰＣＲを特定の増幅に用いた。次いで、そのＰＣＲ生成物をシークエンシング分析のためにクローン化した。ユニバーサルＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキット（カタログ番号K1807-1, Clonetech, Palo Alto, CA）は、それに含まれたアダプターＡＰ１およびＡＰ２ならびにその製造者により提供されたプロトコールを用いて、５’および３’導入遺伝子／ゲノム領域の単離のために用いた。
【００６５】
５’（配列番号：３、図３）および３’（配列番号：４、図４）導入遺伝子／ゲノム領域ＤＮＡをＰＣＲを利用してＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡから単離する。合計のゲノムＤＮＡ（約１０μｇ）を制限酵素で消化する。３７℃で一晩消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラムを用いてそのＤＮＡを精製する。そのＤＮＡは５０μｌの水でカラムから溶出し、次いで、１ｍｌに希釈する。希釈した溶離液（８５μｌ）を１０μｌの緩衝液（１０×）および５μｌのＴ４リガーゼと組合せて、その断片を環状化させる。１６℃、一晩のインキュベーション後、リガーゼを７０℃で熱不活性化させる。その試料を一連のネステッドプライマーでＰＣＲにより増幅させる。３’導入遺伝子／ゲノム領域の単離用のプライマーの組合せは、第１のプライマーとして配列番号：８、配列番号：９、およびＡＰ１、ならびに第２のプライマーとして、配列番号：１０およびＡＰ２、ならびにシークエンシングプライマーとしての使用のための配列番号：１１を含み；５’導入遺伝子／ゲノム領域の単離用のプライマー組合せは、第１のプライマーとして配列番号：１２、配列番号：１４、およびＡＰ１、ならびに第２のプライマーとして、配列番号：１３、配列番号：１５、およびＡＰ２を含んだ。
【００６６】
そのＰＣＲのための条件は：第１のＰＣＲ＝２秒間の９４℃、１０分間の７２℃の７サイクル；２秒間の９４℃、１０分間の６７℃の３７サイクル；１０分間の６７℃の１サイクル；第２、第３のＰＣＲ＝２秒間の９４℃、１０分間の７２℃の５サイクル；２秒間の９４℃、１０分間の６７℃の２４サイクル；１０分間の６７℃の１サイクルを含む。
【００６７】
別法として、ＭＯＮ８８０１７事象の５’および３’の導入遺伝子／ゲノム挿入領域のＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、２５秒間の９４℃の７サイクル、３分間の７２℃；
２５秒間の９４℃、３分間の６７℃の３７サイクル；７分間の６７℃の１サイクルを含む条件で行なうことができる。全ての引き続いての増幅は、以下の条件で行った：２秒間の９４℃、４分間の７２℃の７サイクル；２秒間の９４℃、４分間の６７℃の３７サイクル；７分間の６７℃の１サイクル。全てのアンプリコンは、臭化エチジウムで染色された０.８％のアガロースゲル上で視覚化される。そのＤＮＡは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（カタログ番号 ２８１０４, Qiagen Inc., Valencia, CA）でＰＣＲ試料を直接的に精製することにより、またはそのゲルから適当な断片を抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（カタログ番号２８７０４、Qiagen Inc.）を用いるいずれかにより配列決定するために調製する。ＭＯＮ８８０１７導入遺伝子／ゲノムの挿入断片のフランキング領域からのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ ＴＡ ＣｌｏｎｉｎｇＲキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、サブクローニングした。５’導入遺伝子／ゲノム領域のＤＮＡ配列を図３に示し、３’導入遺伝子／ゲノム領域のＤＮＡ配列を図４に示し、完全な導入遺伝子挿入断片および連結したフランキングゲノムＤＮＡを図５に示す。
【００６８】
全長の導入遺伝子／ゲノムの挿入断片配列（配列番号：５、図５）を、ＰＣＲ生成物をオーバーラップさせることによりＭＯＮ８８０１７ゲノムＤＮＡから単離した。一連のＤＮＡプライマーは、導入遺伝子挿入断片のＤＮＡ断片、およびＭＯＮ８８０１７ゲノムからの隣接したフランキングゲノム領域の一部分を含むアンプリコンを生成するように設計した。そのＤＮＡ断片を配列決定し、配列を組合せて、本発明の配列番号：５である断片配列のコンティグを創製した。そのＤＮＡプライマー対の組合せは：配列番号：１６および配列番号：１７、配列番号：１８および配列番号：１７、配列番号：１９および配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６、配列番号：２５および配列番号：２７であった。合計のゲノムＤＮＡを全てのＰＣＲ反応に用いた。すべてのアンプリコンを臭化エチジウムで染色した０.８％アガロースゲル上で視覚化した。ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キットでＰＣＲ試料を精製することにより、またはそのゲルから適当な断片を抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いることによるいずれかにより配列決定するために調製した。ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ塩基配列分析装置(ABI PrismTM 377, PE Biosystems, Foster City, CA)およびＤＮＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェア(DNASTAR Inc., Madison, WI)を用いて生成した。
【００６９】
実施例４
ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する。ＭＯＮ８８０１７に特徴的な１つのアンプリコンは、少なくとも１つの結合配列、配列番号：１または配列番号：２を含む。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対は、ここに、そのプライマー対は、限定されるものではないが、表２に記載された５’アンプリコン配列についての配列番号：６および配列番号：７を含む。プライマー配列番号：６の位置は、ヌクレオチド９５２位にて始まる図３に示すトウモロコシゲノム中にある。プライマー配列番号：７の位置は、ヌクレオチド４５０位で始まる図５に示す導入遺伝子挿入断片中にある。ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡでのＤＮＡ増幅方法における配列番号：６および配列番号：７を用いる予期されたアンプリコンサイズは、約５５０ｂｐである。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応がそのＭＯＮ８８０１７または子孫には特徴的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４から誘導されたいずれのプライマー対も、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３の少なくとも１１個の近接するヌクレオチドまたはその相補体を含むいずれかの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する方法に有用である配列番号：４の少なくとも１１個の近接するヌクレオチドまたはその相補体を含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の１つの態様である。この分析のための増幅条件の一例を表２および表３に示すが、ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成するＭＯＮ８８０１７の導入遺伝子挿入断片（配列番号：５）に含まれた遺伝子エレメントの配列番号：３もしくは配列番号：４またはＤＮＡ配列に相同的または相補的なＤＮＡプライマーのこれらの方法または使用のいずれの変更も当該技術分野内ものである。特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノムの結合ＤＮＡ（配列番号：１または配列番号：２）に相同的または相補的であるＤＮＡ分子またはその実質的な部分を含む。
【００７０】
事象ＭＯＮ８８０１７植物組織試料についての分析は、事象ＭＯＮ８８０１７からのポジティブな組織対照、事象ＭＯＮ８８０１７ではないトウモロコシ植物からのネガティブ対照、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含有しないネガティブ対照を含むであろう。内因性トウモロコシＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件のための内部対照として機能し、それらの例は、約２３９ｂｐ ＤＮＡ断片を増幅する配列番号：２８および配列番号：２９である。さらなるプライマー配列を、表２および表３に示した方法によりアンプリコンの生成につき選択し、その結果、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生じるＤＮＡ増幅方法および条件の当該技術分野における当業者により配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５から選択できる。表２および表３の方法に対する変形を含むこれらのプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。ＭＯＮ８８０１７に特徴的である配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５から誘導された少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列により生成されたアンプリコンは、本発明の１つの態様である。
【００７１】
ＤＮＡ増幅方法に用いられる場合に、ＭＯＮ８８０１７に特徴的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４または配列番号：５から誘導された少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含むＤＮＡ検出キットは、本発明の１つの態様である。ＤＮＡ増幅方法においてテストされる場合に、そのゲノムがＭＯＮ８８０１７には特徴的なアンプリコンを生成するトウモロコシ植物または種子は、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８８０１７アンプリコンについてのアッセイは、表３に示したStratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーを用いることにより、または当業者に知られた方法および装置により行なうことができる。
【００７２】
表２．ＭＯＮ８８０１７ ５’導入遺伝子挿入断片／ゲノム結合領域の同定のためのＰＣＲ手順および反応混合条件。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表３．種々の商業的に入手できるサーモサイクラーについての提案されたＰＣＲパラメーター。
【００７５】
【表３】
【００７６】
Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーにおけるＤＮＡ増幅を以下のサイクリングパラメーターを用いて進める。MJ EngineまたはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーをその計算様式で試行すべきである。Perkin-Elmer 9700サーモサイクラーを最大に設定された温度勾配（ramp）速度で試行する。
【００７７】
実施例５
【００７８】
サザンブロット分析を、実施例３に記載したＭＯＮ８８０１７および対照トウモロコシ組織から単離されたゲノムＤＮＡに行った。ＤＮＡ試料の定量は、ＤＮＡ検量基準としてＲｏｃｈｅ分子サイズマーカーＩＸでHoefer DyNA Quant 200 Fluorometer (Pharmacia, Uppsala, Sweden)を用いて行った。
【００７９】
検体からの約２０μｇのゲノムＤＮＡ、および対照物質からの１０μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素消化に用いた。挿入断片安定性分析のために、検体からの約１０μｇのゲノムＤＮＡを用いた。一晩の消化を、１００単位の適当な制限酵素を用いて、約５００μｌの全容積中で３７℃にて行った。消化後、試料を、１／１０容（５０μｌ）の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５.２）、および２容（本来の消化容積に対して１ｍｌ）１００％エタノールを添加し、少なくとも３０分間−２０℃のフリザー中でインキュベーションして沈殿させた。消化したＤＮＡを微量遠心機中で最大速度にてペレットとし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ＴＥ緩衝液中で再溶解した。
【００８０】
ＤＮＡプローブを、ｐＭＯＮ５３６１６鋳型ＤＮＡの植物発現カセット部分のＰＣＲ増幅により調製した。約２５ｎｇの各プローブ（ＮＯＳ ３’およびＴａＨｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列を除く）をランダムプライミング法(RadPrime DNA Labeling System, Life Technologies)により３２Ｐ−ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。そのＮＯＳ ３’およびＴａｈｓｐ１７ ３’ポリアデニル化配列を以下のように２５ｎｇのＤＮＡプローブ鋳型を用いてＰＣＲにより標識した：２０ｍｌの最終容積における、鋳型に特異的なセンスおよびアンチセンスのプライマー（各０.２５ｍＭ）；１.５ ｍｍ ＭｇＣｌ２；各３ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；約１００ｍＣｉの３２Ｐ−ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）；および２.５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。サイクリング条件は、以下の通り：３分間の９４℃での１サイクル；４５秒間の９４℃、３０秒間の５２℃、２分間の７２℃での２サイクル；１０分間の７２℃での１サイクル。全ての放射標識したプローブは、Sephadex G-50 カラム(Roche, Indianapolis, IN)を用いて精製した。
【００８１】
マーカーに支援された育種方法、または試料中のＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡの検出用プローブとして用いる合成ＤＮＡ分子を作成でき、それは配列番号：１および配列番号：２に記載した導入遺伝子／ゲノム結合ＤＮＡ分子またはその実質的な部分のＤＮＡ配列を含む。
【００８２】
実施例６
事象ＭＯＮ８８０１７を含む同型接合体の子孫からの異型接合を識別するために用いた方法を、接合状態アッセイに記載し、その条件の例を表４および表５に記載する。接合状態アッセイに用いたＤＮＡプライマーは、プライマー（配列番号：３０）、（配列番号：３１）、（配列番号：３２）、６ＦＡＭＴＭ標識プライマー（配列番号：３３）およびＶＩＣＴＭ標識プライマー（配列番号：３４）であり、６ＦＡＭおよびＶＩＣは、そのＤＮＡプライマーに結合したApplied Biosystems (Foster City, CA)の蛍光色素生成物である。
【００８３】
これらの反応方法に用いた場合に、配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２は、非トランスジェニックトウモロコシ用のＤＮＡアンプリコン、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む異型接合のトウモロコシ用の２つのＤＮＡアンプリコン、および他の非ＭＯＮ８８０１７トウモロコシ植物とは異なる同型接合体のＭＯＮ８８０１７トウモロコシ用のＤＮＡアンプリコンを生成する。この分析のための対照は、事象ＭＯＮ８８０１７ ＤＮＡを含む同型接合および異型接合のトウモロコシからのポジティブ対照、非トランスジェニックトウモロコシからのネガティブ対照、および鋳型ＤＮＡを含まないネガティブ対照を含むであろう。このアッセイ方法は、Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700、またはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーでの使用につき最適化される。ＭＯＮ８８０１７植物で作成された交雑の子孫の接合状態を同定するアンプリコンを生成する当業者に知られた他の方法および装置は、当該技術分野における技量の範囲内にある。
【００８４】
表４．接合状態アッセイ反応溶液
【００８５】
【表４】
【００８６】
表５．接合状態アッセイサーモサイクラー条件
【００８７】
【表５】
【００８８】
Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーにおけるＤＮＡ増幅を以下のサイクリングパラメーターを用いて進める。Eppendorf Mastercycler GradientまたはMJ EngineにおけるＰＣＲを試行する場合、そのサーモサイクラーを、その計算様式で試行すべきである。Perkin-Elmer 9700におけるＰＣＲを試行する場合、サーモサイクラーを最大に設定された温度勾配速度で試行する。
【００８９】
前記に開示され、特許請求の範囲に引用されたトウモロコシＭＯＮ８８０１７種子の寄託は、ブダペスト条約下、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）、0801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110でなされた。そのＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ−５５８２である。その寄託は、３０年間の期間、または最終の請求後５年、または特許の有効期間の間のいずれかの長期間寄託施設において維持され、その期間中の必要な場合に交換されるであろう。。
【００９０】
実施例７
食料および商品のごとき生成物は、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７から生成でき、かかる食料および商品は、かかる食料および商品において十分なレベルにて検出される場合、かかる商品および食料内のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７物質の存在に特徴的になり得るヌクレオチド配列を含むと予期される。かかる食料および商品の例は、限定されるものではないが、動物による食料源として消費のための、さもなければ、バルキング剤（bulking agent）として意図された、または化粧品用途のためのメークアップ組成物における成分として意図されたトウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、トウモロコシグルテン、コーンケーキ、コーンスターチおよび他の食料等を含む。配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５に記載された配列よりなる群から選択されるプローブまたはプライマー対に基づいた核酸検出方法および／またはキットが開発され、それは、生物学的試料中の配列番号：１および配列番号：２のごときＭＯＮ８８０１７ヌクレオチド配列の検出を可能とし、かかる検出は、かかる試料中のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に特徴的であろう。
【００９１】
本発明の原理を説明および記載したことにより、本発明はかかる原理から逸脱なく、配置および細部において変更できることは当業者に明らかであろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲の精神および範囲内にある全ての変形を特許請求する。
【００９２】
本明細書に引用された全ての刊行物および公開された特許文書をここに出典明示して、個々の刊行物または特許出願が出典明示して組み込まれると具体的にかつ個々に示される同一の範囲にまで本明細書の一部とみなす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ増幅方法に用いる場合に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４ならびにその完全な相補体の少なくとも１つを含むアンプリコンを生成するＤＮＡプライマー対として有用な組換えＤＮＡ分子対。
【請求項２】
少なくとも第１のＤＮＡ分子が、配列番号：３、配列番号：４もしくは配列番号：５またはその完全な相補体の少なくとも１８の近接するヌクレオチドを含む請求項１記載の組換えＤＮＡ分子対。
【請求項３】
配列番号：６および配列番号：７；配列番号：１６および配列番号：１７；配列番号：１８および配列番号：１７；配列番号：１９および配列番号：２０；配列番号：２１および配列番号：２２；配列番号：２３および配列番号：２４；配列番号：２５および配列番号：２６；または配列番号：２５および配列番号：２７を含む請求項１または２記載の組換えＤＮＡ分子対。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子対、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４またはその完全な相補体の少なくとも１８の近接するヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ検出キット。
【請求項５】
試料中のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に対応するＤＮＡの存在の検出方法であって：
（ａ）ＤＮＡを含む試料と、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子対とを接触させ；
（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、アンプリコンを生成し；次いで
（ｃ）該アンプリコンを検出する
ことを含み、ここに、該アンプリコンは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、ならびにその完全な相補体の少なくとも１つを含むならば、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に対応するＤＮＡが該試料中に存在することを特徴とする該検出方法。
【請求項６】
トウモロコシの鞘翅類害虫の食餌において、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を含むトウモロコシ植物の細胞もしくは組織、またはその器官の殺虫性有効量を提供することを含む昆虫寄生からのトウモロコシ植物の保護方法。
【請求項７】
該鞘翅類害虫が、コーンルートワームであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を含むトウモロコシ植物の圃場における雑草を制御する方法であって、
有効量のグリホサート含有除草剤をトウモロコシ植物の該圃場に適用することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項９】
（ｉ）該グリホサート含有除草剤が該圃場に散布され、次いで
（ｉｉ）該量が、該トウモロコシ植物に損傷を与えない
ことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１】
ＤＮＡ増幅方法に用いる場合に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４ならびにその完全な相補体の少なくとも１つを含むアンプリコンを生成するＤＮＡプライマー対として有用な組換えＤＮＡ分子対。
【請求項２】
少なくとも第１のＤＮＡ分子が、配列番号：３、配列番号：４もしくは配列番号：５またはその完全な相補体の少なくとも１８の近接するヌクレオチドを含む請求項１記載の組換えＤＮＡ分子対。
【請求項３】
配列番号：６および配列番号：７；配列番号：１６および配列番号：１７；配列番号：１８および配列番号：１７；配列番号：１９および配列番号：２０；配列番号：２１および配列番号：２２；配列番号：２３および配列番号：２４；配列番号：２５および配列番号：２６；または配列番号：２５および配列番号：２７を含む請求項１または２記載の組換えＤＮＡ分子対。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子対、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４またはその完全な相補体の少なくとも１８の近接するヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ検出キット。
【請求項５】
試料中のトウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に対応するＤＮＡの存在の検出方法であって：
（ａ）ＤＮＡを含む試料と、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子対とを接触させ；
（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、アンプリコンを生成し；次いで
（ｃ）該アンプリコンを検出する
ことを含み、ここに、該アンプリコンは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、ならびにその完全な相補体の少なくとも１つを含むならば、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７に対応するＤＮＡが該試料中に存在することを特徴とする該検出方法。
【請求項６】
トウモロコシの鞘翅類害虫の食餌において、トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を含むトウモロコシ植物の細胞もしくは組織、またはその器官の殺虫性有効量を提供することを含む昆虫寄生からのトウモロコシ植物の保護方法。
【請求項７】
該鞘翅類害虫が、コーンルートワームであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
トウモロコシ事象ＭＯＮ８８０１７を含むトウモロコシ植物の圃場における雑草を制御する方法であって、
有効量のグリホサート含有除草剤をトウモロコシ植物の該圃場に適用することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項９】
（ｉ）該グリホサート含有除草剤が該圃場に散布され、次いで
（ｉｉ）該量が、該トウモロコシ植物に損傷を与えない
ことを特徴とする請求項８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【公開番号】特開２０１２−７０７３４（Ｐ２０１２−７０７３４Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２０９５３５（Ｐ２０１１−２０９５３５）
【出願日】平成２３年９月２６日（２０１１．９．２６）
【分割の表示】特願２００６−５４５７８１（Ｐ２００６−５４５７８１）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０９５３５（Ｐ２０１１−２０９５３５）
【出願日】平成２３年９月２６日（２０１１．９．２６）
【分割の表示】特願２００６−５４５７８１（Ｐ２００６−５４５７８１）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
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