トランスサイレチンアミロイド線維形成の阻害剤
トランスサイレチンのアミロイド線維形成を阻害するために効果的な、ビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾンが示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチンアミロイド線維形成の阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、トランスサイレチンアミロイド線維形成の阻害剤としてのビスアリールオキシムエーテルに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイド形成の過程は、末梢神経障害、臓器不全、そしてまれに中枢神経系の病態をもたらす（Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，８３，４０９−４１７；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２，６６５６−６６６３；Ｇａｒｚｕｌｙ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９６，４７，１５６２−１５６７；Ｉｋｅｄａ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２，５８，１００１−１００７；Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，２８４３−２８４５；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６−４７３；Ｓｉｐｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１９９４，３１，３２５−３５４）。野生型（ＷＴ）ＴＴＲ沈着により引き起こされる疾患である、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）は、８０歳を超える集団の１０〜２５％を冒す遅発性心筋症である（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，２８４３−２８４５）。点突然変異に関連する、残りのＴＴＲに基づくアミロイド病は、広く２つの分類：家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６−４７３）および家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）（Ｓｉｐｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１９９４，３１，３２５−３５４）に分けられる。家族性アミロイドーシスを引き起こすＴＴＲ突然変異は１００を超え、家族性アミロイドーシスの発症の正確な年齢、組織選択性ならびに重症度は、特定の突然変異、個人の遺伝的背景、およびおそらく環境因子のエネルギー論に左右される（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｔ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１，９８，１３０１９−１３０２４；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，１６４２７−１６４３２）。
【０００３】
現在利用可能なＦＡＰの唯一の治療法は、折りたたみ不全になりやすいＴＴＲを血流へ分泌している患者の肝臓を外科的に交換することによる遺伝子療法である（Ｈｅｒｌｅｎｉｕｓ，Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００４，７７，６４−７１）。このアプローチの欠点としては、ドナーとレシピエントの双方に対して侵襲的であること、生涯にわたって免疫抑制が必要であること、および未だ明らかになっていない理由のために数個の突然変異に対する有効性が制限されていることが挙げられる（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．−Ｏ．；ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００２，７３，７４５−７５１）。現在、ＷＴ−ＴＴＲ沈着に関連するＳＳＡの有効な治療法はない。従って、一般的に適用される、全てのＴＴＲに基づくアミロイド疾患に対する小分子治療戦略が歓迎される。
【０００４】
Ｔ１１９Ｍトランスサイレチンサブユニットを、その他の点では疾患関連サブユニット（Ｖ３０Ｍ）で構成される四量体へ包括することにより可能となる、複合へテロ接合体ファミリーにおける対立遺伝子間のトランス抑制は、ＴＴＲの動的安定化がＦＡＰを寛解するのに充分であることを実証する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９３，２０，１７９；Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１９９６，６，２７）。トランス抑制の有効性は、小分子の天然の状態の動的安定化がアミロイドーシスも寛解するはずであることを示唆する（Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９）。疾患に関連する折りたたみ不全を防ぐためにタンパク質の自由エネルギー地形を調整する小分子の有用性が、現在いくつかの事例において証明されている（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，１１，１０６５−１０８４；Ｈａｒｄｙ，Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７，３５３−３５６；Ｒａｙ，Ｓ．Ｓ．；Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１，５７０１−５７０２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２）。
【０００５】
ＴＴＲは、２２２の分子対称性を特徴とする１２７残基のβシートリッチなホモ四量体であり、２つのチロキシン（Ｔ4）結合部位を有する（Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７４，８８，１−１２；Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７８，１２１，３３９−５６）。脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿の双方におけるＴＴＲ Ｔ4結合能の大部分（＞９９％）は、ＴＴＲの濃度が高いこと、ならびに甲状腺結合グロブリン（血液）および、同様にＴ4を有するアルブミン（血液およびＣＳＦ）が存在することのために利用されていない（Ｂａｒｔａｌｅｎａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９３，１３，５８３−５９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，１１６，１３７−１６０；Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６）。律速な四量体の解離がアミロイド形成には必要とされる（Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２，３１，８６５４−８６６０；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９３，２４５９−２４６２；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，６４７０−６４８２；Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，１７８５１−１７８６４）が、充分ではない（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１１４４２−１１４５２）。結果として生じる折りたたまれた単量体も部分的な変性を受けて構築不全となるに違いないからである（Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２，３１，８６５４−８６６０；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，６４７０−６４８２；Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，１７８５１−１７８６４；Ｊｉａｎｇ，Ｘ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１１４４２−１１４５２；Ｌｉｕ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，７５４−７５７）。これまでの研究は、Ｔ4結合が、天然の状態の動的安定化によりＴＴＲの凝集を阻害することを実証する。解離のための活性化障壁は、解離の遷移状態に対して天然の四量体が優先的に安定化することにより増加する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０）。
【０００６】
スクリーニング、構造に基づく設計、および平行合成によるリード化合物の最適化は、いくつかのその他の構造上異なるクラスの強力なＴＴＲアミロイド形成阻害剤を導く（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。効果的な阻害剤は、一般に、直接結合しているかまたはスペーサー（アミン、エーテル、またはエチレン架橋など）を介して結合している２つのアリールを有する。好ましくは、１つのアリールがハロゲンまたは脂肪族基（一般にチロキシン結合部位の内部の空洞を占有）で官能化され、もう１つのアリールがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸により官能化されている（外側の結合空洞の周辺でＬｙｓ−１５ ｅ−ＮＨ3+および／またはＧｌｕ−５４カルボキシル基と静電気的に相互作用することができる）（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。双方の空洞はハロゲン結合ポケットと呼ばれる疎水性の陥凹部を有し、アリール部分構造およびそれらの疎水性置換基により補完される。
【発明の開示】
【０００７】
多数のＴＴＲ・（阻害剤）2共結晶構造における置換芳香族の配向および配置、合成のしやすさ、ならびに未来のハイスループット動的コンビナトリアルライブラリー解析の可能性を考慮した後（Ｎａｚａｒｐａｃｋ−Ｋａｎｄｌｏｕｓｙ，Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１９９−２０６；Ｈｏｃｈｇｕｅｒｔｅｌ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，３３８２−３３８７）、本発明者らは２つのアリール環と結合するアルドキシムエーテル部分を検討することを選択した。オキシムエーテル部分を含有するＦＤＡ認可抗菌薬がいくつかあることから、この部分構造がヒト生物学に適合することが示唆される（オキシムエーテル部分を含有するＦＤＡ認可抗菌薬は、医薬品の開発に関するデータを含有するＰｒｏｕｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ提供のＤｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔをスキャンする、ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤＤＲ ２００３．２ （２５．１１）データベース提供のＭＤＬ ＩＳＩＳ／Ｂａｓｅ ２．５を用いて見出された）。本研究の目的は、ヒト血漿において高い親和性でＴＴＲと結合し（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）、アミロイド形成に対して天然の状態を安定化させる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，ｎｏ．６９６８，９０５−９０９）、ビスアリールアルドキシムエーテル構造を見出すことである。
【０００８】
律速な四量体の解離および単量体の折りたたみ不全を必要とする、血漿タンパク質トランスサイレチン（ＴＴＲ）によるアミロイド線維形成は、いくつかのヒト疾患に関わっている。アミロイド形成は、ＴＴＲの主として未使用の甲状腺ホルモン結合部位と結合している小分子に媒介される、天然の状態の安定化によって阻害することができる。アリールアルデヒドをアリールオキシアミンで簡便に縮合することにより新規な天然の状態の安定化剤が本明細書において見出され、ビスアリールアルドキシムエーテルライブラリーをもたらした。ライブラリーの９５種類の化合物のうち、３１種類はインビトロでのＴＴＲアミロイド形成の活性阻害剤であった。ビスアリールオキシムエーテルは、アミロイド形成条件下で、解離の遷移状態の間、ＴＴＲの天然の四量体状態を選択的に安定化させ、解離の活性化障壁の増大を引き起こす。いくつかのビスアリールオキシムエーテルは、ヒト血漿中の多量のその他の血漿タンパク質よりもＴＴＲと選択的に結合し、これはインビボでの有効性に必要な特性である。ビスアリールアルドキシムエーテルはＮ−Ｏ結合の切断による分解に対して感受性が高いが、この過程はそれらがＴＴＲと結合することにより遅くなる。さらに、多くのビスアリールアルドキシムエーテルの分解速度は、血漿ＴＴＲの半減期と比較して遅い。ビスアリールオキシムエーテルライブラリーは、当然必要であると分かる、優れた安定性プロフィールを有する構造上類似の阻害剤の開発のために、価値のある構造活性相関の洞察をもたらす。
【０００９】
本発明の一態様は、下の式Ｉ
【化１】
に表されるビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンを対象とする。
式Ｉにおいて、Ｒ’は、存在しないか、または、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｉ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、およびＣＦ3からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；Ｒは、存在しないか、または、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、およびＣＦ3からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；さらに、Ｘは、−ＮＨ−および−Ｏ−からなる群から選択されるジラジカルである。好ましい実施形態では、Ｘは、−Ｏ−であり；別の好ましい実施形態では、Ｘは、−ＮＨ−である。さらに好ましい実施形態では、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンは下の式ＩＩ：
【化２】
で表される。
式ＩＩにおいて、ラジカルＡは以下の群
【化３】
から選択される。
さらに好ましい実施形態では、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンは、下の式ＩＩＩ
【化４】
で表される。
式ＩＩＩにおいて、ラジカルＢは以下の群：
【化５Ａ】
【化５Ｂ】
から選択される。
【００１０】
本発明の別の態様はトランスサイレチンのアミロイド線維形成を阻害するための方法を対象とする。この方法は、トランスサイレチンを阻害濃度の式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンと接触させる段階を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾンのＸ線結晶解析は、両者が同じ構造であることを示す。ヒドラゾンライブラリー活性に基づいて合成された９５のオキシムエーテルライブラリーメンバーのうちほぼ１／３が、濃度７．２μＭで優れたＴＴＲアミロイド形成阻害剤であり、四量体ＷＴ−ＴＴＲの濃度の２倍である（ｐＨ４．４で７２時間、阻害＞９０％）。最も優れた阻害剤は、カルボン酸で置換された１つの芳香環を有するが、もう一方のアリール環はハロゲンまたはトリフルオロメチル基を有する。チロキシンのような置換パターンのアリールアルデヒドから調製したオキシムエーテルも、優れた活性および顕著なＴＴＲ血漿結合選択性を示す。いくつかのものは２のうち１．５を超える結合化学論量を示す。オキシムエーテルは、解離の遷移状態に対してＴＴＲの天然の状態を選択的に安定化させるだけでなく、実質的に四量体の解離およびアミロイドーシスを遅らせるが、ビスアリールオキシムエーテルが不安定性を示す場合には、ＴＴＲ結合によって、それらの分解はバッファーのみと比較して顕著に遅くなる。
【００１２】
オキシムエーテルライブラリーの設計。アリールオキシアミンは、アリールアルデヒドと結合して所望のビスアリールオキシムエーテルライブラリーを生成するための出発物質として必要である（図１、Ｘ＝Ｏ）。この反応は、イミン結合に関して２つの立体異性体（図１のｓｙｎおよびａｎｔｉで示される、すなわち、アルデヒドプロトンがＸで表されるフェノキシ酸素に対してそれぞれｃｉｓまたはｔｒａｎｓに配向し得る）を作成する可能性があり得る；しかし、文献による先例に基づくとｓｙｎ−異性体のみが予期された（かつ観察された、下記参照）（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５；Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｚ．；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｂ，Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．１９６７，９，８９８−９０３）。
【００１３】
その他の有力なＴＴＲアミロイド形成阻害剤において同定された構造上の特性に基づいて、オキシムエーテル置換基および置換パターンを選択した（図２）（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。選択されたアリールオキシアミン（１〜８）は、アリールオキシアミン中にパラ−ＣＦ3（ｉ）およびチロキシンのような置換パターン（ｅおよびｆ）がないことを除いてアリールアルデヒドと同じ置換パターンを有した。残念ながら、市販されている唯一のアリールオキシアミンはフェノキシアミンである；従って、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するために必要なアリールオキシアミンの構成単位の合成のための方法は、本明細書または他の場所に記載されている（Ａｂｅｌｅ，Ｅ．；Ｌｕｋｅｖｉｃｓ，Ｅ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．２０００，３２，２３５−２６４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２；Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００；Ｃｈｏｏｎｇ，Ｉ．Ｃ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，６５２８−６５２９）。対照的に、容易に入手できるアリールアルデヒドと結合してビスアリールヒドラゾンライブラリーを作成するための、１５０種類を超えるアリールヒドラジンが市販されている（図１、Ｘ＝ＮＨ）。類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾン（以下、それぞれオキシムエーテルおよびヒドラゾンと称される）が互いに同じ構造であると考えられるため、ヒドラゾンライブラリーの迅速な自動合成（図３）を行って、阻害剤のこの構造クラスが活性を有するかどうかクエリーした（図４）。
【００１４】
オキシムエーテルとヒドラゾンの特性決定および結晶学的比較。推定された同じ構造である性質を確認するため、それぞれスキャフォールド５ｂ／ｄ（図２）およびスキャフォールド２６ｂ／ｄ（図３）を基にして類似するオキシムエーテルとヒドラゾンの対を合成し、結晶化し、それらの構造をＸ線回折により決定した。オキシムエーテルとヒドラゾン構造を結晶学により比較すると、この類似する化合物が互いにほぼ重ね合わせることができることが明らかとなる（図５）。４種類の全ての結晶構造はｓｙｎ−イミン結合を示し、この異性体の優勢をさらに裏付けている（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５；Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｚ．；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｂ，Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．１９６７，９，８９８−９０３）。
【００１５】
ヒドラゾン（純度＞９４％）およびオキシムエーテル（純度＞９５％）ライブラリー作成に関連する全ての粗反応混合物のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの痕跡は、主に１つのピークを示し、単一の異性体（先例から推論され、Ｘ線結晶学により裏付けたｓｙｎ−イミン結合）が優勢であることを示唆する。原則として、ｓｙｎ−およびａｎｔｉ−異性体の双方が同時に溶出するか急速に相互転換し、ｓｙｎ−異性体として選択的に結晶化することは可能である；しかし、伝統的な手段で合成されたヒドラゾンおよびオキシムエーテルの1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、単独の異性体のものと一致する共鳴を示す（文献による先例は、好ましいｓｙｎ−異性体が、室温でＮＭＲによってｔｒａｎｓ−異性体と区別されることを証明している）（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５）。
【００１６】
オキシムエーテルライブラリーの合成および活性。ヒドラゾン（全て純度＞９４％）が阻害剤活性を示したので、同等のオキシムエーテルライブラリーもＴＴＲアミロイド形成阻害剤を作成することができると仮定した。この仮定を本明細書で確認する。いくつかのビスアリールヒドラゾンは、ＴＴＲアミロイド形成の強力な阻害を示し（図４）、類似するオキシムエーテルライブラリーの調製および評価が正当であることを証明した。水性ヒドラゾンの不安定性（主にシッフ塩基の加水分解による）およびヒドラゾンの生物学的毒性は、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するさらなる意欲をもたらす。ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを作製するために必要なアリールオキシアミンの調製のための２つの合成戦略を用いた。最初に、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）のアリールボロン酸との銅触媒による架橋により、ヒドラジン分解の後に所望のアリールオキシアミンが得られた（図６）（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。遊離塩基として単離された（３、６、および７）か、またはそれらの塩酸塩として沈殿した（１および８）アリールオキシアミンを、この方法論を用いて良好から中程度の全収率で合成した。
【００１７】
銅触媒による結合の方法論は、アリールボロン酸上のオルト−ハロゲン化物またはオルト−ＣＦ3置換基に不耐性であるように思われる（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。さらに、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド中間体の脱保護に必要とされるヒドラジン分解は、オルト−カルボキシル置換基を有するアリールオキシアミンに対して成功しない。その他の方法をいくつか検討した後、エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による電子欠損フルオロベンゼンの芳香族求核置換を選択して最初の方法を補完した（図７）（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）。２−トリフルオロメチルフルオロベンゼンへのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸の求核攻撃は優れた収量の１５（８９％）をもたらし、これは酸加水分解時にアリールオキシアミン５（収量９６％）をもたらし、そのＨＣｌ塩として利用した。この方法論の変化形を用いて、２および４の同等物に由来するオキシムエーテルを調製した（下記参照）。
【００１８】
アリールオキシアミン１および５〜８を用いてオキシムエーテルライブラリーの一部を作成した（図２）。ＤＭＳＯ中の酢酸（０．０８Ｍ）の存在下、アリールアルデヒド（０．１Ｍ）とアリールオキシアミン（０．１２５Ｍ）の反応により、２５℃にて２４時間以内にオキシムエーテルをほぼ定量的収率で得た（全てのフェノキシアミンおよびヒドラジンをＴＴＲアミロイド阻害剤として試験したが、ライブラリー合成にそれらを過度に用いたため、阻害は明らかとならなかった）。５種類のアリールオキシアミン（１および５〜８）および１２種類のアルデヒド（ａ〜ｌ）をあらゆる可能性のある組合せで縮合し、ウェルフォーマット毎に単一の化合物でＧｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて６０種類のオキシムエーテルを得た。反応をＬＣ−ＭＳにより解析して、すべてのウェルで収量（９８〜１００％、アルデヒド消費に基づく、実験の項を参照）および生成物の純度（＞９５％）を決定した（全ての生成物はその予測質量を示す）。純粋な化合物を従来通り合成し、完全な特性決定を行った（実験の項の裏付けとなる情報を参照）７つの場合において（１ｅ、５ｄ〜ｆ、７ｅ、および８ｅ〜ｆ）、ＨＰＬＣでの同時溶出により生成物の構造および純度を確認した。
【００１９】
オキシムエーテルライブラリーの残りのメンバーを伝統的な合成手順で調製し、ｍｇ量で単離した（完全な特性決定データについては実験の項および裏付けとなる情報を参照、さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定された化合物の純度については図８を参照）。触媒のＨＣｌの存在下、Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン（３）をアリールアルデヒドａ〜ｌで縮合し、中程度から優れた収量のオキシムエーテル３ａ〜ｌを得た。エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸のＳNＡｒ手順を用いて、化合物２０および２１をそれぞれ全収率４５％および５１％で調製した（図９）。アリールアセトイミド酸エステルは加水分解して対応するアリールオキシアミン２および４とならなかった。その代わり、アリールアセトイミド酸エステルを酸性条件下で化学量論的な量のアリールアルデヒドと混合して、中程度から優れた収量のオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを直接得た（オキシムエーテル２ｂは不安定な性質のために単離できなかった）。
【００２０】
酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２μＭ）の阻害活性を表１０にまとめている。合成した９５種類のオキシムエーテルのうち、３１種類が良好な有効性を示し、阻害剤の不在下でＷＴ−ＴＴＲにより示されるものの＜１０％までＴＴＲアミロイド形成を低下させ（９０％の阻害、青色）、９種類が中程度の活性を示し（１１〜３０％の線維形成、緑色）、そして残りの５５種類は不良な活性を示した（黄色）。
【００２１】
チロキシンのような置換パターンを有するベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテル（図１０、ｅ列およびｆ列）は、たとえ非置換フェノキシアミンと結合した場合でも非常に有効である（１６種類全てが＞９０％の阻害を示した）。非置換フェノキシアミンとの結合は、一般的に結果として弱いオキシムエーテル阻害剤となる。これらの結果は、阻害を達成するために双方の環に適切な置換基が必要とされるというこれまでの見解に挑戦する。
【００２２】
ハロゲン化アリールオキシアミンとメタ−もしくはパラ−カルボキシベンズアルデヒドとの縮合から得られたさらなるオキシムエーテル（またはその逆も同様）は、環に関係なくカルボン酸置換基を有する強力な阻害剤を生成した。これらの結果は結合の配向性が、Ｌｙｓ−１５のε−ＮＨ3+基との静電相互作用を保存するように変化する可能性のあることを示唆する。オルト−カルボキシベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテルからは良好な阻害剤が生成されない。オキシムエーテル由来のカルボキシベンズアルデヒドの活性を、最高から最悪までランク付けすると、メタ＞パラ＞オルトとなり、カルボキシフェノキシアミンに由来するオキシムエーテルの活性のランク：メタ≒パラ＞オルトに類似する。双方の環にカルボン酸またはハロゲンを有するオキシムエーテル（Ｔ4のような置換を除く）は、よくても中程度の活性を示した。
【００２３】
アリールアルデヒドおよびフェノキシアミンが縮合する能力自体は動的コンビナトリアルライブラリーアプローチに役立つが（Ｎａｚａｒｐａｃｋ−Ｋａｎｄｌｏｕｓｙ，Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１９９−２０６；Ｈｏｃｈｇｕｅｒｔｅｌ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，３３８２−３３８７）、一般に、阻害は、２つの結合部位間のアロステリックな情報伝達により結合している２つの異なる小分子で最大であるという、起こり得る複雑な問題が既に報告されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４）。従って、構造活性相関データは、動的コンビナトリアルライブラリーで生じる阻害剤の組合せの影響により複雑化する可能性がある。
【００２４】
ビスアリールアルドキシムエーテルの安定性。多くのビスアリールアルドキシムエーテルはＴＴＲアミロイド形成の強力な阻害剤であるが（図１０）、それらは酸性かまたは塩基性の水性媒質中で安定性の幅を示す（一次分解半減期はＴＴＲの不在下で数時間〜数日の範囲である）。ヒドラゾンとは違って、オキシムエーテルは中性および塩基性条件でシッフ塩基加水分解に対して安定しているように思われるが、それらは、明らかにオキシムエーテルのＮ−Ｏ結合の切断による一次反応速度でなおゆっくりと分解し、フェノールおよびアリールニトリルをもたらすことができる。このＮ−Ｏ結合の切断は、高い温度での先例はあるものも、このような軽度の条件下では予期されていなかった （Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｌｏｕｄｏｎ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７５，４０，１２６−１２７；Ｓｕｐｓａｎａ，Ｐ．；Ｔｓｏｕｏｎｇａｓ，Ｐ．Ｇ．；Ｖａｒｖｏｕｎｉｓ，Ｇ．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２０００，４１，１８４５−１８４７；Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．；Ｓｎｙｄｅｒ，Ｈ．Ｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３９，３３４３−３３４６；Ｇｏｍｅｚ，Ｖ．；Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｄｒａｎｏ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，１２１９−１２２１；Ｃｈｏ，Ｂ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，５５１３−５５１７；Ｒｏｙｅｒ，Ｒ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２９，１７９９−１８０１；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ａ．Ｊ．；Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６，５１，１００６−１０１１；Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，６９，３１１２−３１２０）。
【００２５】
オキシムエーテルは、それらの明白な分解「半減期」によると、類似するヒドラゾンよりも質的に安定している（分解過程は一次的でないので、明白なヒドラゾン「半減期」は５０％消失に要する時間を指す）。いずれかの芳香環上の電子供与基およびオルト−置換基は、ビスアリールアルドキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾンの双方の分解速度を増加させるように思われる。
【００２６】
概して、阻害剤（７．２μＭ）のＴＴＲ（３．６μＭ）との結合は、酸に媒介される線維形成条件下で（ｐＨ４．４、３７℃、７２時間）、化合物を分解から安定化させる働きをする。最もよい阻害剤（線維形成＜１０％）の中の１１種類に関して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、酸に媒介される線維形成アッセイの終わりに初期のオキシムエーテルの＞７４％が残っていることが明らかとなる（図１１）。最も安定していない阻害剤（１ｅ、１ｆ、２ｋ、３ｇ、５ｄ*）は、ＴＴＲの不在下で７２時間以内にほぼ完全に分解される；しかし、阻害剤の存在は初回量の＞７４％を維持する。特に、阻害剤５ｅはＴＴＲの存在下で分解を示さなかった。このことは、なぜ多くの不安定なビスアリールオキシム阻害剤がＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤であることが分かるのかを説明する助けとなる。つまり、阻害剤がＴＴＲの甲状腺ホルモン結合部位と結合してＴＴＲ四量体に動的な安定化を課すだけでなく（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６）、ＴＴＲ結合も阻害剤を分解に対して安定させる。
【００２７】
また、分析を行って、活性が主として個々のオキシムエーテルによるものであってそれらの提案される分解生成物によるものでないことを確認するのに役立てた。分解性の副生成物が観察した阻害剤の有効性に寄与するかどうかを判定するため、対応するフェノールおよびニトリル（オキシムエーテルの場合）、アニリン（ヒドラゾンの場合）、ならびにアルデヒド（オキシムエーテルとヒドラゾンの双方の場合）をそれらの線維形成阻害特性について分析した。３，５−ジハロ−４−ヒドロキシベンゾニトリルおよび類似するアルデヒド分解生成物は、四量体のＴＴＲの２倍の濃度でＴＴＲ線維形成の強力な阻害剤である（図１２）。３，５−ジクロロフェノールも、四量体のＴＴＲ（３．６μＭ）の濃度の２倍の濃度（７．２μＭ）で線維形成を８６％阻害する。しかし、その他の分解生成物（ニトリル、フェノール、またはアニリン）はどれも目に見えるほどの活性を示さない。従って、大部分のアミロイド形成阻害剤の有効性が、親ビスアリールオキシムエーテルに起因するものであり、分解性の副生成物に起因するものでないと結論付けるのが妥当であり、それにより分解の機構的要件を理解するため、および医化学目的のためにこれらの構造または関連する構造を安定させるための意欲がもたらされた。
【００２８】
アミロイド形成条件下、阻害剤８ｆの存在下でのＴＴＲの四量体構造の分析用超遠心分離評価。沈降速度と平衡分析用超遠心分離実験の双方を用いて、一般的に四量体を解離させ、単量体を構築不全の構成成分とするアミロイド形成条件下で、阻害剤８ｆのＴＴＲの四量体構造への影響を評価した（７２時間、ｐＨ４．４、３７℃）。ＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）と結合したオキシムエーテル８ｆ（７．２μＭ）を、これらの条件下で５０，０００ｒｐｍにて沈降速度分析に付し（図１３）、ＴＴＲがＳ値３．７（分子量４８．４±０．２ｋＤａに相当する）の、単一の種類として沈降している四量体のままであることが示された。阻害剤を欠く同一の実験では四量体のＴＴＲは検出されなかった−アミロイド形成の過程に一致する、高分子量のＴＴＲの凝集体のみが観察された。沈降平衡分析（１７，０００ｒｐｍ）によるさらなる精査は、単一の理想的な種類のモデル（図１４；５２．１±０．２ｋＤａ）に適合するデータを示し、四量体ＷＴ−ＴＴＲ・（８ｆ）2の計算された分子量（５６，３７４Ｄａ）と充分一致している。濃度の関数としての細胞全体の分子量分布の分析も、僅かに５０ｋＤａを超える分子量の単一の種類を示した。
【００２９】
ヒト血漿中のＴＴＲと結合するオキシムエーテルの選択性。臨床研究に小分子を用いてアミロイドについての仮説（アミロイド形成の過程が神経毒性または組織損傷をもたらすという考え）を検証するためには、小分子はその他の全ての血漿タンパク質の存在下で血漿中のＴＴＲと選択的に結合する必要がある。最も活性の高いオキシムエーテルとヒト血漿中のＴＴＲとの結合化学量論量を、既に報告されている抗体捕捉／ＨＰＬＣ法を用いて評価した（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。手短に言えば、試験化合物を１０．８μＭの濃度（ＴＴＲの血漿濃度の約２〜３倍）でヒト血漿に溶解する。２４時間（３７℃）のインキュベーションの後、ＴＴＲおよびそれと結合している任意の小分子を、セファロース樹脂と共有結合したポリクローナルＴＴＲ抗体を用いて免疫沈降させる。樹脂を洗浄し、ＴＴＲ・（小分子）n<2複合体を高いｐＨで解離させ、次にＴＴＲと結合した小分子の化学量論量を、阻害剤およびＴＴＲの相対量を定量化するための標準曲線を用いる分析用逆相ＨＰＬＣにより判定する（ＴＴＲの２つのチロキシン結合部位により最大阻害剤化学量論量は２である）。阻害剤の中には抗体捕捉の後に必要な洗浄段階で失われるものもあり得るため、本方法は、阻害剤の結合化学量論量の下限値を確立する。
【００３０】
血漿ＴＴＲに対して＞９０％のアミロイド阻害（７．２μＭ）を示すビスアリールオキシムエーテルの結合化学量論量の下限値を、図１５に示す。試験した３１種類の化合物のうち、１１種類が１．０を超えるＴＴＲ結合化学量論量を示し、３種類が１．５当量を越える結合を示す。最も高い結合化学量論量を示すオキシムエーテルは、１つの芳香環がチロキシンのような置換パターン（例えば３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ）を１つ有するアルデヒドに由来する。この結果は、３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ置換アリール環の組み込みが、大多数のその他の血漿タンパク質（ＴＴＲよりも約１５０倍高い濃度を有するチロキシン輸送タンパク質アルブミンを含む）を上回る血漿結合選択性をＴＴＲに与えることを意味するので、非常に重要である（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，６４４０−６４４５）。しかし、これらの結果は、これらの化合物が血液中で主なチロキシン輸送タンパク質である、ＴＢＧと（ＴＴＲの約１／１０の濃度で）結合する可能性に対応していない。従って、ＴＢＧの結合能力が飽和しても、ＴＴＲの結合選択性結果にあまり影響を及ぼさない（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６）。自動化された手順によって合成された、０．５を超える結合化学量論量を示す数個のオキシムエーテル（１ｅ、５ｄ〜ｆ、７ｅ、および８ｅ〜ｆ）も、従来法によりｍｇ量で合成し、単離し、それらの結合化学量論量を再評価した。全ての場合において同じ結果が得られ、自動化により調製されたオキシムエーテルと、従来法により調製されたオキシムエーテルが同一であることが証明された。
【００３１】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶構造。ビスアリールオキシムエーテルによるアミロイド阻害のための構造基盤を解明するため、強力な凝集阻害と血漿選択性の双方を示すいくつかの化合物の共結晶構造に着手した。ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の複合体は、分解能１．５３Åの最良の共結晶構造データをもたらし、本明細書に提示されている（図１６および図１７）。高分解能データにもかかわらず、トリフルオロメチル置換芳香環は、電子密度オミットマップの輪郭を示す１σ未満でようやく目に見え、それらの領域の比較的高い柔軟性を示している。しかし、側鎖の配向および震動「ｎ」とゆがみのオミットマップ（Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００３，５９，２２００−２２１０）から、ほぼ最小のエネルギー構造におけるタンパク質の中心チャネル（各甲状腺ホルモン結合ポケットに１つ）内に結合した２つの分子の最終的な配向および位置を得た。各ホルモン部位には、結合チャネルを二分する２重の回転軸により、２つの対称な同等の結合構造が含有される。
【００３２】
阻害剤５ｄは「順方向」結合モードのＴＴＲ中にあり、それは、外側の空洞にあってＬｙｓ−１５と好ましい静電相互作用をするカルボン酸置換芳香環を有する阻害剤と呼ばれる（Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１）。カルボキシル基は、Ｔｈｒ−１０６（２．７３Å）およびＬｙｓ−１５残基と水素結合を形成する。Ｌｙｓ−１５の側鎖は阻害剤との疎水性相互作用（ε−ＣＨ2）および静電（ε−ＮＨ3+−３．３Å）相互作用の双方に寄与する。また、Ｌｅｕ−１７、Ｌｅｕ−１７’、Ａｌａ−１０８、Ａｌａ−１０８’、Ｌｅｕ−１１０、Ｌｅｕ−１１０’、Ｔｈｒ−１１９、Ｔｈｒ−１１９’、Ｖａｌ−１２１、およびＶａｌ−１２１’の疎水性側鎖間に阻害剤が積み重なる時に、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用の双方により結合が安定化される。トリフルオロメチル置換基は、内部の空洞のハロゲン結合ポケット３（ＨＢＰ−３）の一部を占有する。内部空洞のＳｅｒ−１１７ヒドロキシル基は阻害剤から離れて配向し、それらのβ−ＣＨ2部分構造によるさらなる疎水性相互作用に寄与する。リンカーである酸素と窒素は、ＴＴＲと静電相互作用を行わないと思われ、従ってその結合および活性にあまり寄与しない可能性があり、オキシムエーテルおよびヒドラゾンにより提示される類似の活性、ならびにスチルベン、ジアリールアミン、およびジアリールエーテルは全て活性があるという以前の報告に一致する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ε．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ε．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Εｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。しかし、リンカーが採った構造は２つの芳香環を配向させるために極めて重要であると思われる。
【００３３】
実験の項
一般的な合成法
特に明記しない限り、全ての化学物質は民間の供給業者から購入し、さらなる精製を行わずに用いた。反応の進行は、シリカゲル６０ Ｆ２５４をコートしたガラス板（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での薄層クロマトグラフィーにより、かつ／または分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。全てのフラッシュクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲル６０（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ３００、４００、５００、または６００ＭＨｚ分光器のいずれかで記録した。化学シフトは、ＣＤＣｌ3溶液の内部標準Ｍｅ4Ｓｉ（０．０ｐｐｍ）から低磁場の百万分の１の単位で報告されるか、または、Ｍｅ4Ｓｉが13Ｃ−ＮＭＲスペクトルに見られない場合は溶媒ピーク（ＣＤＣｌ3 ７７．１６ｐｐｍ）の較正を行った。ｄ6−ＤＭＳＯ、ｄ6−アセトン、またはＣＤ3ＯＤ中の試料に関して、1Ｈ−ＮＭＲについてそれぞれ３．４９、２．０５、および３．３１ｐｐｍで、さらに13Ｃ−ＮＭＲについてそれぞれ３９．５２、２９．８４、および４９．００ｐｐｍで、溶媒ピークの較正を行った。Ｗａｔｅｒｓ ４８６ チューナブル吸光度検出器およびＷａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラーを用いるＷａｔｅｒｓ ６００ Ｅ多溶媒送達系で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行った。ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｂｅｔａｂａｓｉｃ−１８カラムを分析用逆相ＨＰＬＣ分析（７１５０３−０３４６３０モデル、孔径１５０Å、粒径３μＭ）に用い、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムを分取ＨＰＬＣ（２１８ＴＰ１０２２モデル、孔径３００Å、粒径５μＭ、内径２２ｍｍ×２５０ｍｍ）に用いた。溶媒系Ａは、９５：５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮと０．２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶媒Ｂは、５：９５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮと０．２５％ＴＦＡであり、直線勾配は、Ａ：Ｂ ０：１００、８０：２０、または６０：４０のいずれかからＡ：Ｂ ０：１００で流した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（５ｍｍ、２．１×５０ｍｍ）カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰＬＣ−ＭＳで高速液体クロマトグラフィー・質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を行い、Ｇｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて溶媒送達を行った。全ての質量分析データは質量分析のためにＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｎｔｅｒで収集された。
【００３４】
フェノキシアミンの調製のための、フェニルボロン酸とＮ−ヒドロキシフタルイミドの銅触媒による結合の代表的手順（方法１）：９の合成。
２０ｍＬシンチレーションバイアルを、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１６３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）（９９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、活性化したばかりの４Åモレキュラーシーブス（約２５０ｍｇ）、およびフェニルボロン酸（２４４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）で満たした。１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）を添加し、続いてピリジン（９０μＬ、１．１ｍｍｏｌ）を添加すると、淡褐色の懸濁液が生じた。反応懸濁液が空気に触れるようにキャップを緩め、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによる検出が完了するまで室温にて攪拌した（反応が進行するにつれて混合物の色は褐色からエメラルドグリーンへ変化した）。完了すると（約４８時間）、混合物はシリカゲルに吸収され、濃縮されて粉末となった。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）によりＮ−フェノキシフタルイミド９を白色の固体として得た（２１６ｍｇ、９０％）；特性決定データについては下記参照。
【００３５】
Ｎ−フェノキシフタルイミド（９）。
９の調製は、上記に代表的手順（方法１）として記載した。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．１２−７．２０（ｍ，３Ｈ）、７．３２−７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．８０−７．８４（ｍ，２Ｈ）、７．９０−７．９４（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１４．４、１２４．０、１２８．８、１２９．７、１３４．９、１５８．９、１６２．９；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４０．０６５６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ10ＮＯ3の要求値２４０．０６５５。
【００３６】
Ｎ−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）フタルイミド（１０）。
３−トリフルオロメチルフェニルボロン酸（３８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）との代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ）により、１０を白色の固体として得た（２７０ｍｇ、８８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．３４−７．３８（ｍ，１Ｈ）、７．４０−７．４５（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｍ，Ｊ＝０．９，８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８７（ｍ，２Ｈ）、７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１１．６、１１７．８、１１８．１、１２１．４、１２２．３、１２４．２、１２８．８、１３０．５、１３２．２、１３５．１、１５９．０、１６２．８；ＬＣ−ＭＳ ３０９ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ15Ｈ9Ｆ3ＮＯ3の要求値３０９。
【００３７】
Ｎ−（３，５−ジクロロフェノキシ）フタルイミド（１１）。
３，５−ジクロロフェニルボロン酸（３８２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮＨＰとの代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５０％ＣＨ2Ｃｌ2）により、１１を白色の固体として得た（１３９ｍｇ、４５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．０７（ｍ，２Ｈ）、７．１３−７．１６（ｍ，１Ｈ）、７．８１−７．８６（ｍ，２Ｈ）、７．７１−７．９６（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１３．７、１２４．２、１２５．０、１２８．８、１３５．２、１３５．９、１５９．７、１６２．５；ＬＣ−ＭＳ ２７６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ8Ｃｌ2ＮＯ3の要求値２７６。
【００３８】
Ｎ−（３，５−ジフルオロフェノキシ）フタルイミド（１２）。
３，５−ジフルオロフェニルボロン酸（３１６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮＨＰとの代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（トルエン中１０％ＣＨ2Ｃｌ2）により、１２を白色の固体として得た（１９７ｍｇ、７２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．５８−６．６３（ｍ，１Ｈ）、６．６８−６．７３（ｍ，２Ｈ）、７．８２−７．８７（ｍ，２Ｈ）、７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ９８．５（ｍ）、１００．３（ｔ，ＪC-F＝２５．３Ｈｚ）、１２４．４、１２８．７、１３５．４、１６０．５（ｔ，ＪC-F＝１３．８Ｈｚ）、１６２．６、１６３．６（ｄｄ，ＪC-F＝１３．８，２４９Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２７６．０４５６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ8Ｆ2ＮＯ3の要求値２７６．０４６７。
【００３９】
Ｎ−（３−メトキシカルボニルフェノキシ）フタルイミド（１３）。
３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸を、上に概説されるＮＨＰとの同様の結合手順（方法１）に付した。１００ｍＬ丸底フラスコを、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２．１９ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）（１．３４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、活性化したばかりの４Åモレキュラーシーブス（約５ｇ）、および３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸（４．７９ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）で満たした。１，２−ジクロロエタン（６０ｍＬ）を添加し、続いてピリジン（１．２０ｍＬ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応懸濁液を室温にて空気雰囲気中で攪拌した。４日後、混合物をシリカゲルに吸着させ、濃縮して粉末とした。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中３３〜５０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１３を白色の固体として得た（１．８５ｇ、４６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．９０（ｓ，３Ｈ）、７．３８−７．４１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，２．５，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．４４（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８６（ｍ，３Ｈ）、７．９２−７．９６（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５２．５、１１５．０、１１９．３、１２４．３、１２５．９、１２９．０、１３０．０、１３２．１、１３５．２、１５９．０、１６３．０、１６６．２；ＥＳＩ−ＭＳ ２９８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ16Ｈ12ＮＯ5の要求値２９８。
【００４０】
Ｎ−アリールオキシフタルイミドの、対応するＯ−アリールヒドロキシルアミンへのヒドラジン分解のための代表的手順（方法１Ａ）：化合物１の合成。
ヒドラジン一水和物（０．４０１ｍＬ、８．２ｍｍｏｌ）を、Ｎ−フェノキシフタルイミド９（６５２ｍｇ、２．７３ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ3（２５ｍＬ）中１０％ＭｅＯＨ溶液にゆっくり添加し、反応物を室温にて攪拌した。完了すると（ＴＬＣモニタリング、１２時間）、無色の反応溶液中に白色の沈殿が現れた（フタリジン）。反応混合物をシリカゲルのプラグに通し、ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃで洗浄した。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを除去すると僅かに淡黄色の油状物質が生成され、それをＫ2ＣＯ3（＜１０ｍｇ）からクーゲルロール蒸留すると、純粋なフェノキシアミン１を透明な無色の油状物質として得た（２３８ｍｇ、８０％）；特性決定データについては下記参照。あるいは、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを除去した後、黄色の油状物質をＥｔ2Ｏに溶かし、０℃まで冷却した。０℃にて１０分後、ｐＨ３に達するまでジオキサン中４Ｎ ＨＣｌを滴下した。得られる白色の固体を濾過し、Ｅｔ2Ｏ（２×１０ｍＬ）で洗浄して１を純粋なＨＣｌ塩として得た（３０６ｍｇ、７７％）。
【００４１】
Ｏ−フェニルヒドロキシルアミン塩酸塩（１）。
１の調製は、上記に代表的手順（方法１Ａ）として記載した。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ６．８４−６．８９（ｍ，１Ｈ）、７．０３−７．０９（ｍ，２Ｈ）、７．１９−７．２５（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１１４．１、１２１．６、１３０．３、１６３．１；ＬＣ−ＭＳ １１０ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ8ＮＯの要求値１１０。
【００４２】
Ｏ−（３−トリフルオロメチルフェニル）ヒドロキシルアミン（６）。
Ｎ−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）フタルイミド１０（１．１２ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。蒸留（８５℃／６ｍｍ）により純粋な６を透明な無色の液体として得た（５８２ｍｇ、９０％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．００（ｓ，２Ｈ）、７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３８（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５−７．４７（ｍ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１０．４、１１７．２、１１７．９、１３０．９、１６２．１；ＬＣ−ＭＳ １７８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ7Ｈ7Ｆ3ＮＯの要求値１７８。
【００４３】
Ｏ−（３，５−ジクロロフェニル）ヒドロキシルアミン（７）。
Ｎ−（３，５−ジクロロフェノキシ）フタルイミド１１（７１１ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。反応混合物をシリカゲルプラグからの溶出した結果、遊離塩基７が白色の固体として凝固した（３７８ｍｇ、９２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．９１（ｓ，２Ｈ）、６．９１−６．９３（ｍ，１Ｈ）、７．０６−７．０９（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１２．９、１２１．９、１３５．９、１６３．２；ＬＣ−ＭＳ １７９ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ6Ｃｌ2ＮＯの要求値１７９。
【００４４】
Ｏ−（３，５−ジフルオロフェニル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（８）。
Ｎ−（３，５−ジフルオロフェノキシ）フタルイミド１２（１．７４ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。ＨＣｌ塩の沈殿により、８を白色の固体として得た（９８０ｍｇ、８６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ６．８３−６．９０（ｍ，３Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ９９．３（ｄｄ，ＪC-F＝８．０，２４．９Ｈｚ）、１０１．１（ｔ，ＪC-F＝２６．４Ｈｚ）、１６０．０、１６５．８（ｄｄ，ＪC-F＝１５，２４８Ｈｚ）；ＬＣ−ＭＳ １４６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ6Ｆ2ＮＯの要求値１４６。
【００４５】
Ｏ−（３−メトキシカルボニルフェニル）ヒドロキシルアミン（１４）。
Ｎ−（３−メトキシカルボニルフェノキシ）フタルイミド１３（２７１ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付し、１４を淡黄色のシロップとして得た（１４６ｍｇ、９６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．９１（ｓ，３Ｈ）、５．９２（ｓ，２Ｈ）、７．２９−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．３３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．６３（ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８４（ｍ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５２．３、１１４．２、１１８．１、１２２．５、１２９．３、１３１．４、１６１．４、１６７．１；ＧＣ−ＭＳ １６７ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ8Ｈ9ＮＯ3の要求値１６７、１５２ ｍ／ｚ［Ｍ−ＮＨ］+、Ｃ8Ｈ8Ｏ3の要求値１５２。
【００４６】
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン（３）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（９１．０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を、Ｏ−（３−メトキシカルボニル−フェニル）ヒドロキシルアミン１４（９０．４ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの３／１／１ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。２４時間後、反応物をＨ2Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約３〜４に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（２５ｍＬ）および塩水（brine）（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して３を白色の固体として得た（７８．７ｍｇ、９５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ７．０１（ｓ，２Ｈ）、７．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．４，２．８，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４６（ｄｔ、Ｊ＝１．４、７．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．６８（ｄｄ，Ｊ＝１．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１３．５、１１７．８、１２１．３、１２９．２、１３１．８、１６１．７、１６７．３；ＥＳＩ−ＭＳ １６２ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ+］-、Ｃ7Ｈ6ＮＯ3の要求値１６２。
【００４７】
エチル−Ｎ−（２−トリフルオロメチルフェノキシ）アセトイミデート（１５）。
Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）の手順を用いて調製したtＢｕＯＫ（０．７８ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下、０℃にてエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（１．００ｇ、６．０６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６ｍＬ）中の攪拌溶液に添加した。tＢｕＯＫの添加が完了した後、反応物を室温にて攪拌した。３０分後、２−フルオロベンゾトリフルオリド（１．２９ｍＬ、６．０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を８０℃で２時間加熱した。冷却しながら反応混合物を氷水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水（brine）（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して暗色の油状物質を得た。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により、１５を透明な液体として得た（１．３３ｇ、８９％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）、２．１５（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、６．９９（明白なｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（明白なｄｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．５２−７．５７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．３、１４．５、６３．２、１１４．２、１１６．２（ｑ，ＪC-F＝３１Ｈｚ）、１２０．３、１２３．７（ｑ，ＪC-F＝２７２Ｈｚ）、１２６．４（ｑ，ＪC-F＝４．８Ｈｚ）、１３３．２、１５７．２（ｑ，ＪC-F＝１．９Ｈｚ）、１６７．１；ＬＣ−ＭＳ ２４８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ13Ｆ3ＮＯ2の要求値２４８。
【００４８】
Ｏ−（２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（５）。
Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）の手順を用いて調製した７０％ ＨＣｌＯ4（１２ｍＬ）を、０℃にて１５（４．１４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１９ｍＬ）溶液に滴下し、次に反応物を室温にて一晩攪拌した。次に、反応混合物を氷水（１５０ｍＬ）に注ぎ、固体のＮａＯＨペレットでｐＨ１３に調節した。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を塩水（brine）（２×７５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して暗色の残渣を得た。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１５％ＥｔＯＡｃ）の後、他のアリールオキシアミンについて上に記載されるようにＨＣｌ塩が沈殿し、５を白色の固体として得た（３．４２ｇ、９６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ７．３７−７．４１（ｍ，１Ｈ）、７．４８−７．５１（ｍ，１Ｈ）、７．７６−７．７９（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１１４．６、１２５．０、１２６．３、１２７．６（ｑ，ＪC-F＝５．７Ｈｚ）、１２８．３ １３４．５；ＬＣ−ＭＳ １７８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ7Ｈ7Ｆ3ＮＯの要求値１７８。
【００４９】
アリールオキシアミン１および５〜８に基づくオキシムエーテルのライブラリー合成。
ウェルフォーマット毎に単一の化合物でライブラリーを調製した。全てのアルデヒド（０．５Ｍ）およびアリールオキシアミン（０．４Ｍ）の保存溶液をＤＭＳＯ中に調製した。１ｍＬシリンジ、１．１ｍＬチューブ、および内径１３ｍｍのプローブを備えたＧｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて全ての溶液を９６ウェル（容量２ｍＬ）ポリプロピレンプレートに０．３ｍＬ／分の速度で分注した。各オキシムエーテルの０．１Ｍ溶液を０．５ｍＬ作成するため、１００μＬ（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）のアルデヒド、１５６μＬ（０．６３ｍｍｏｌ、１．２５当量）のアリールオキシアミン、および２４４μＬの０．１６４Ｍ酢酸をプレートの各ウェルに分注した。プレートに蓋をして、デュアルアクションシェーカーを用いて室温にて２４時間攪拌した。反応物をＤＭＳＯ中７２０μＭに希釈し、ＬＣ−ＭＳで分析して収量、純度、および識別点を決定した。合成後、化合物を−２０℃で冷凍保存した。
【００５０】
反応混合物中に残っていたアルデヒドの積算値を用いて反応収量を測定した。全てのアルデヒドの較正曲線を作り、定量的に反応した全てのアルデヒドがオキシムエーテルを形成したと仮定して各オキシムエーテルの収量を計算した；すなわち、アルデヒドの５％が反応混合物中に残っていた場合、オキシムエーテルの収量は９５％となるとした。収量は９８〜１００％の範囲であり、全てのウェルで純度＞９５％であった。
【００５１】
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン３とアリールアルデヒドａ〜ｌの結合のための代表的手順（方法２）。
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン３（約０．２ｍｍｏｌ、１当量）の１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中の攪拌溶液に、アルデヒド（１当量）を添加した後、０．５Ｎ ＨＣｌを１滴添加し、次に反応物を室温にて攪拌した。逆相ＨＰＬＣで判定される反応完了の時点で（３〜１８時間）、反応物をＨ2Ｏ（１５ｍＬ）で希釈し、沈殿を濾過し、Ｈ2Ｏで洗浄し、回収し、真空乾燥した。具体的な合成の細部、および下の３ａについて報告されているものと同様の阻害剤３ｂ〜ｌの特性決定データについての裏付けとなる情報を参照のこと。
【００５２】
ベンズアルデヒド−Ｏ−（３−カルボキシフェニル）オキシム（３ａ）。
ベンズアルデヒド（２１．０μＬ、０．２０７ｍｍｏｌ）を、上に概説される３（３１．８ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）との代表的結合手順（方法２）に付し、３ａを白色の固体として得た（２９．０ｍｇ、５８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，１：１ＣＤ3ＯＤ：ｄ6−ＤＭＳＯ）δ７．３９−７．４５（ｍ，５Ｈ）、７．５９−７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．７８（ｍ，３Ｈ）、８．５８（ｓ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１４．５、１１８．８、１２３．３、１２７．７、１２９．１、１２９．３、１３０．８、１３１．１、１３２．３、１５３．３、１５８．９、１６６．９；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４２．０８１２ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ12ＮＯ3の要求値２４２．０８１２。ＲＰ−ＨＰＬＣ：純度９８％。
【００５３】
ベンジル−２−フルオロベンゾエート（１６）。
ベンジルアルコール（２．６０ｍＬ、２５．１ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下、室温にて２−フルオロ安息香酸（２．９２ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２５１ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）、および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．１６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2中の攪拌溶液にゆっくり添加した。１８時間後、沈殿を濾去し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、濾液をシリカで濃縮して粉末とした。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％〜２０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１６を透明な無色の液体として得た（４．２０ｇ、８８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．３９（ｓ，２Ｈ）、７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１，８．４，９．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．２０（ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１−７．３６（ｍ，１Ｈ）、７．３７−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４４−７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．４９−７．５５（ｍ，１Ｈ）、７．９６（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．３Ｈｚ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６６．９３、１１７．０（ｄ，ＪC-F＝２２．１Ｈｚ）、１１８．７（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１２４．０（ｄ，ＪC-F＝３．８Ｈｚ）、１２８．１、１２８．２、１２８．６、１３２．２、１３４．６（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１３５．７、１６２．１（ｄ，ＪC-F＝２６０Ｈｚ）、１６４．２（ｄ，ＪC-F＝３．８Ｈｚ）；ＧＣ−ＭＳ ２３０ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ14Ｈ11ＦＯ2の要求値２３０。
【００５４】
ベンジル−４−フルオロベンゾエート（１７）。
ベンジルアルコール（４．０５ｍＬ、３９．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、室温にて４−フルオロ安息香酸（５．００ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４３２ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）、および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８．１５ｇ、３９．５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2中の攪拌溶液にゆっくり添加した。１８時間後、反応物を、１６の合成に概説した手順に従って後処理した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により、１７を透明な無色の液体として得た（７．７５ｇ、９４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．３５（ｓ，２Ｈ）、７．０６−１４（ｍ，２Ｈ）、７．３２−７．４１（ｍ，３Ｈ）、７．４１−７．４７（ｍ，２Ｈ）、８．０６−８．１２（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６６．８４、１１５．５（ｄ，ＪC-F＝２２．０Ｈｚ）、１２６．４（ｄ，ＪC-F＝２．９Ｈｚ）、１２８．２、１２８．３、１２８．６、１３２．３（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１３５．９、１６５．５、１６５．８（ｄ，ＪC-F＝２５３Ｈｚ）；ＧＣ−ＭＳ ２３０ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ14Ｈ11ＦＯ2の要求値２３０。
【００５５】
エチル−Ｎ−（２−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート（１８）。
エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（２．０６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）中の攪拌溶液に、Ａｒ下、tＢｕＯＫ（２．２１ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）を一度に添加した。３０分後、ベンジル−２−フルオロベンゾエート１６（４．１３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液として添加し、反応物を室温にて攪拌した。３時間後、反応物をＨ2Ｏ（４００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＨ2Ｏ（３×５０ｍＬ）および塩水(brine)（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５〜１０％勾配ＥｔＯＡｃ）により１８を透明なシロップとして得た（３．６１ｇ、６４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、４．１８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、６．９６（ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３０−７．３５（ｍ，１Ｈ）、７．３５−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．４２−７．４８（ｍ，３Ｈ）、７．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．１，８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．７Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．４、１４．５、６３．１、６６．６、１１４．５、１１７．０、１２０．４、１２８．２、１２８．４、１２８．５、１３１．７、１３３．８、１３６．１、１５９．５、１６５．８、１６６．７；ＧＣ−ＭＳ ３１３ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ18Ｈ19ＮＯ4の要求値３１３、２２８ ｍ／ｚ［Ｍ−８５］+、ベンジル−２−ヒドロキシベンゾエート Ｃ14Ｈ12Ｏ3の要求値２２８。
【００５６】
エチル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート（１９）。
エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（３．７９ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の攪拌溶液に、Ａｒ下、tＢｕＯＫ（４．０９ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を一度に添加した。４０分後、ベンジル−４−フルオロベンゾエート１７（７．６３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温にて攪拌した。４時間後、反応物をＨ2Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＨ2Ｏ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５〜１０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１９を透明なシロップとして得た（６．０２ｇ、５８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、７．１５−７．１９（ｍ，２Ｈ）、７．３１−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３６−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４２−７．３６（ｍ，２Ｈ）、８．００−８．１４（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．３、１４．４、６３．１、６６．４、１１３．４、１２２．９、１２８．１、１２８．１、１２８．６、１３１．５、１３６．３、１６３．５、１６６．３、１６６．４；ＧＣ−ＭＳ ２２８ ｍ／ｚ［Ｍ−８５］+、ベンジル−４−ヒドロキシベンゾエート Ｃ14Ｈ12Ｏ3の要求値２２８。
【００５７】
エチル−Ｎ−（２−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート（２０）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（４３１ｍｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、エチル−Ｎ−（２−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート１８（８０２ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの９／３／３ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。６時間後、反応物をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×３０ｍＬ）で洗浄し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約５．０〜５．５に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（brine)（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して２０を白色の固体として得た（４５９ｍｇ、８０％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ１．３４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．１８（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，７．３，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．８，７．３，８．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０（ｄｄ，Ｊ＝０．９，８．７Ｈｚ，１Ｈ）７．８６（ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ１４．６、１４．７、６３．８、１１５．２、１１８．５、１２１．３、１３２．４、１３４．５、１６０．２、１６６．８、１６７．４；ＥＳＩ−ＭＳ ２２４ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ14ＮＯ4の要求値２２４。
【００５８】
エチル−Ｎ−（４−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート（２１）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（５５０ｍｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を、エチル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート１９（１．０４ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの９／３／３ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。２４時間後、反応物をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×３０ｍＬ）で洗浄し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約５．０〜５．５に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（brine)（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して２１を白色の結晶質固体として得た（６９８ｍｇ、９４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．１４（ｓ，３Ｈ）、４．２２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．１８−７．２２（ｍ，２Ｈ）、８．０４−８．０８（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．５、１４．６、６３．３、１１３．７、１２２．１、１３２．３、１６４．２、１６６．７、１７２．０；ＥＳＩ−ＭＳ ２２４ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ14ＮＯ4の要求値２２４。
【００５９】
それぞれオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを生じる、エチル−Ｎ−（２−カルボキシフェノキシ）−アセトイミデート２０またはエチル−Ｎ−（４−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート２１のアリールアルデヒドａ〜ｌとの結合のための代表的手順（方法３）。
アセトイミデート２０または２１（約０．１〜０．３ｍｍｏｌ、１当量）およびアルデヒド（約０．１〜０．３ｍｍｏｌ、１当量）の１，４−ジオキサン（２．０ｍＬ）溶液に、７０％ ＨＣｌＯ4（０．９当量）を添加し、反応物を室温にて攪拌した。逆相ＨＰＬＣで判定される反応完了の時点で（２〜６時間）、反応物をＨ2Ｏ（２０ｍＬ）で希釈し、沈殿を濾過し、Ｈ2Ｏで洗浄し、回収し、真空乾燥した。具体的な合成の細部、および下の２ａについて報告されているものと同様の阻害剤２ｃ〜ｌおよび４ｂ〜ｌの特性決定データについての裏付けとなる情報を参照のこと。
【００６０】
ベンズアルデヒド−Ｏ−（２−カルボキシフェニル）オキシム（２ａ）。
７０％ ＨＣｌＯ4（１４．０μＬ、０．１６３ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（１８．０ｍＬ、０．１７７ｍｍｏｌ）、および２０（３９．０ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を、上に概説される代表的結合手順（方法３）に付し、２ａを白色の固体として得た（２６．１ｍｇ、６２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ７．１５（ｄｔ，Ｊ＝０．９，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４８−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５９（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３−７．８９（ｍ，３Ｈ）、８．６６（ｓ，１Ｈ）、１０．８−１１．５（幅広いｓ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１５．７、１１９．７、１２２．１、１２７．８、１２９．０、１３０．８、１３０．９、１３１．１、１３３．１、１５３．４、１５７．７、１６６．８；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４２．０８１１ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ12ＮＯ3の要求値２４２．０８１２。ＲＰ−ＨＰＬＣ：純度＞９９％。
【００６１】
線維形成アッセイ。
野生型ＴＴＲを、前述の大腸菌発現系（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０−１３５７３）から精製した。使い捨てキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ ＃１４ ３８５ ９３８）を、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２％ ＮａＮ3中、ＴＴＲ（７．２μＭ）の０．４ｍｇ／ｍＬ保存液４９５μＬで満たした。ＤＭＳＯ（１．４４ｍＭ）中５μＬの阻害剤をＴＴＲ溶液に添加し、試料を３７℃にて３０分間インキュベートした。次に、各キュベットに０．５ｍＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮａＮ3）を添加してｐＨを４．４まで下げた。キュベットを３７℃にて７２時間乱さずに静置し、次にボルテックスして沈殿を試料中に均一に分布した。濁度をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５３モデル ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で３５０および４００、または５００ｎｍで測定した。全ての試料は２通りまたは３通りに実行され、報告される結果は少なくとも３回の分析の代表例である。
【００６２】
オキシムエーテル阻害剤のヒト血漿中ＴＴＲへの分液
ヒト血漿におけるＴＴＲに対する阻害剤結合化学量論を評価するための抗体捕捉アプローチの手順は別の場所に詳細に記載されている（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。手短に言えば、ヒト血漿（１．５ｍＬ）を２ｍＬエッペンドルフチューブに添加し、その後に試験化合物の２．１６ｍＭ ＤＭＳＯ溶液７．５μＬを添加した。この溶液を３７℃にて２４時間インキュベートした（この時点で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ ＮａＮ3（ＴＳＡ）中、官能化されていないセファロース樹脂の１：１（ｖ：ｖ）スラリーは１８７μＬであった）。これを４℃にてさらに１時間インキュベートした後、遠心分離した。上清を４００μＬの分割単位へ３分割し、各分割単位に、ＴＳＡ中、抗ＴＴＲ抗体と複合体化したセファロース樹脂の１：１スラリー２００μＬを添加した。４℃にて２０分間穏やかに攪拌した後、試料を遠心分離し、上清を除去し、抗ＴＴＲ樹脂を４℃にて１ｍＬのＴＳＡ／０．０５％ サポニン（３×１０分）で、次に１ｍＬのＴＳＡ（２×１０分）で洗浄した。遠心分離および上清の除去の後、１５５μＬの１００ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）を添加してＴＴＲおよび結合した試験化合物を樹脂結合抗体から解離する。３０分後、懸濁液を遠心分離し、ＴＴＲおよび試験化合物を含有する上清１４５μＬを除去した。次に、上清（１３５μＬ）をＨＰＬＣに注入してＴＴＲと結合している小分子の化学量論量を測定した。ＨＰＬＣ条件下、試験化合物−ＴＴＲ複合体は解離し、小分子とタンパク質を分離させることができる。ＨＰＬＣ条件：８分間の２０〜１００％または４０〜１００％のいずれかの溶媒Ｂ勾配を用いる、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ ３ｃｍ Ｃ１８逆相カラム（溶媒Ａ：９５：５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、０．２５％ ＴＦＡ；溶媒Ｂ：５：９５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、０．２５％ＴＦＡ）。試験化合物およびＴＴＲの定量化は、標準曲線に対してクロマトグラムの統合されたピーク面積を比較することにより達成できる。つまり、ＴＴＲに対する試験化合物の量の比から結合化学量論量を得る（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。
【００６３】
分析用超遠心分離：オキシムエーテルを基にした阻害剤の存在下、線維形成条件下でのＴＴＲの沈降速度プロフィール分析。
線維形成アッセイで既に用いた試料（上記参照）の沈降分析をｐＨ４．４で行った。オキシムエーテル阻害剤８ｆの存在下および不在下での組換えＷＴ−ＴＴＲ溶液の沈降特性を、Ａｎ６０Ｔｉ 回転子および光電式スキャナーを備えた、温度制御されたＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ｉ 分析用超遠心機で分析した。０．００１ｃｍのステップサイズを用い、２８０ｎｍで検出する、２０℃にて連続モードで３，０００および５０，０００ｒｐｍの速度のデータを収集した。
【００６４】
直接境界を適合させるアプローチを適用して、ｐＨ４．４で７．２μＭの８ｆでインキュベートした３．６μＭのＴＴＲ溶液から生じた沈降速度データを評価した。Ｓｖｅｄｂｅｒｇというプログラムを用いて複数濃度を半径方向のデータセットに対して同時に適合させ、Ｌａｍｍ方程式に対する近似解を得た（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．；Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）。フィッティングアルゴリズムから、以下の方程式を用いて分子量をもたらす沈降係数および拡散係数を得た（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．；Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）
【数１】
（式中、ＭＷは分子量（Ｄａ）であり、ｓは沈降係数（スベドベリ、１０-13ｓ）であり、Ｒは普遍気体定数（８．３１４×１０7 ｅｒｇ／ｍｏｌ）であり、
【数２】
は偏比容（ｃｍ3／ｇ）であり、ρは溶媒密度（ｇ／ｃｍ3）である。バッファーの密度Ｄ（１．００８４８ｇ／ｃｍ3）を表形式データから計算し、ＷＴ−ＴＴＲ（０．７３４６ｃｍ3／ｇ）の偏比容をそのアミノ酸組成から計算した）。
【００６５】
分析用超遠心分離：オキシムエーテルを基にした阻害剤の存在下、線維形成条件下でのＴＴＲの沈降平衡分析。
線維形成アッセイで既に用いた試料（上記参照）の沈降分析をｐＨ４．４で行った。ＴＴＲ（３．６μＭ）およびオキシムエーテル８ｆ（７．２ｍＭ）の溶液１２０〜１４０μＬを、１２−ｍｍエポンセンターピースおよびサファイアもしくは石英窓を備えたダブルセクターセルに負荷することにより、沈降平衡測定を行った。最初に３，０００ｒｐｍの回転子速度でデータを収集して、最初に沈降する高分子量のオリゴマーが存在していないことを確認し、次に１７，０００ｒｐｍでセル全体に平衡を確立した。３時間おきに２８５〜２９０ｎｍでモニターした沈降プロフィールをオーバーレイして平衡が達成されたことを立証した。Ｂｅｃｋｍａｎ提供のオリジンソフトウェアパッケージ中の非線形最小二乗法を用いてデータ分析を行った。データをいくつかの異なるモデル（単一の理想的な種類および数個の多重な種類のモデルを含む）に合わせて、データに最も適合する最も単純なモデルを同定した。単一の理想的な種類のモデルに対応する以下の方程式は、理論上のデータと実験データ（前記）との間の僅かな差異に最も基づくデータに適合する。
【数３】
（式中、Ａrは半径ｘでの吸光度であり、Ａoは対照半径ｘo（通常メニスカス）での吸光度であり、
【数４】
はタンパク質の偏比容であり、ｒは溶媒の密度であり（ｇ／ｃｍ3）、ωは回転子の角速度であり（ラジアン／秒）、Ｅはベースラインエラー訂正因数であり、Ｍは分子量であり、Ｒは普遍気体定数である）。実験のデータポイントと適合したデータポイントとの間の差異（残差）を無作為に分散させると、差異の規模は小さかった（データが単一の理想的な種類のモデル（ＴＴＲ四量体）と適合した場合）。その他のモデルは、セル全体の残差を無作為でない分散で識別したため、データにうまく適合しなかった。
【００６６】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶化およびＸ線データ収集。
懸滴実験において、２Ｍ硫酸アンモニウムに対して平衡化したタンパク質溶液７ｍｇ／ｍＬ（１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．３５〜０．５０Ｍ硫酸アンモニウム）から、ＷＴ−ＴＴＲ結晶を得た。１０倍モル過剰の阻害剤５ｄで３週間を越えて浸漬したＷＴ−ＴＴＲ結晶からＴＴＲ・（５ｄ）2複合体を調製した。結晶を冷凍保護剤としてのパラトンオイル中に入れ、１００Ｋまで冷却した。単色の高エネルギー源の１４−ＢＭ−Ｃ、ＢＩＯＣＡＲＳ、Ａｄｖａｎｃｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅを備えたＱｕａｎｔｕｍ−４検出器を用いてデータ収集を行った。ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶は、単位格子寸法がａ＝４３Å、ｂ＝８５Å、およびｃ＝６６Åに近いアポＴＴＲ結晶形態（非対称単位中の２つの単量体を含む空間群Ｐ２1２1２）と同形である。ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣを用いてデータを減少させた（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．；Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ Ａ．Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ Ａ；Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ，Ｅｄｓ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，３０７−３２６）。
【００６７】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2結晶構造の決定および精密化。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（受託番号１ＢＭＺ）から得たアポＴＴＲのタンパク質原子座標を、ＴＴＲ・（５ｄ）2の１．５３Åデータセットに対しＣＮＳの分子動力学およびエネルギー最小化プロトコールで精密化した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９８，５４，９０５−９２１）。得られる差フーリエ図は、外側の結合の空洞に有意な電子密度を示した；しかし、内部の空洞の阻害剤の電子密度は、おそらくその領域の柔軟性のため、電子密度図が１ｓ以下で輪郭が示される場合のみ目に見えた。不充分なリンカー密度にもかかわらず、リガンドは明確に配置することができ（外側の結合の空洞での電子密度のため）、結晶学的精密化に含まれた。結合チャネルを二分する２重の結晶学的回転軸のため、統計的無秩序モデルを適用して四量体ＴＴＲ毎に２つのリガンド結合モードを生じさせた。模擬アニーリングおよびその後の位置および温度因子の精密化を数サイクル繰り返した後、水分子を異なる差フーリエ図に置いた。震動／ゆがみバイアス除去プロトコールにより計算した不偏加重電子密度図を用いてマップフィッティングの最終サイクルを行った（Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００３，５９，２２００−２２１０）。各結合ポケットのリガンドの対称関連結合構造の双方は、不偏のアニールされたオミットマップならびに阻害剤の不在下で段階的に行われた震動／ゆがみ不偏加重図と充分一致していた。ＣＣＰ４−Ｒｅｆｍａｃを用いる最尤法により精密化の最終サイクルを行った（Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９４，５０，７６０−７６３；Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９７，５３，２４０−２５５）。最終のマップには解釈可能な電子密度がなかったため、９つのＮ末端および３つのＣ末端残基は最終モデルに含まれなかった。結晶学的分析データの要約を表Ｓ４に示す。
【００６８】
図の詳細な説明
図１は、ビスアリールオキシムエーテル（Ｘ＝Ｏ）およびビスアリールヒドラゾン（Ｘ＝ＮＨ）ライブラリーの形成のための一般的アプローチを示す模式図である。この反応は、イミン結合に関して２つの立体異性体（ｓｙｎおよびａｎｔｉで示される、すなわち、アルデヒドプロトンがＸで表されるフェノキシ酸素に対してそれぞれｃｉｓまたはｔｒａｎｓに配向し得る）を作成する可能性があり得る；しかし、文献による先例に基づくとｓｙｎ−異性体のみが予期された（また観察された、本文参照）。
【００６９】
図２は、ビスアリールオキシムエーテルライブラリー（図１参照）を合成するために用いられるアリールオキシアミン（１〜８）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）構成成分の構造を示す。選択されたアリールオキシアミン（１〜８）は、アリールオキシアミン中にパラ−ＣＦ3（ｉ）およびチロキシンのような置換パターン（ｅおよびｆ）がないことを除いてアリールアルデヒドと同じ置換パターンを有した。残念ながら、市販されている唯一のアリールオキシアミンはフェノキシアミンである；従って、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するために必要なアリールオキシアミンの構成単位の合成のための方法が開発され、本明細書において開示されていた。
【００７０】
図３は、ビスアリールヒドラゾンライブラリーを合成するために用いられるアリールヒドラジン（２２〜２９）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）化合物の構造を示す。類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾン（以下、それぞれオキシムエーテルおよびヒドラゾンと称される）を互いに同じ構造であると仮定したので、このクラスも合成した。
【００７１】
図４は、線維形成の阻害について試験した９６種類のビスアリールヒドラゾンの活性を示す表である。ｐＨ４．４でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド線維形成（７２時間）に対するビスアリールヒドラゾン活性（７．２μＭ）。値は線維形成の程度を表し、従って阻害剤の不在下でのＷＴ−ＴＴＲ線維形成（１００％となるよう割り当てられる）に対する阻害剤の有効性を表す。完全な阻害は０％の線維形成に相当する。測定誤差は、±５％である。ハイスループット自動化手順により合成された全ての阻害剤は、ＲＰ−ＬＣＭＳにより純度＞９５％を示し、予測された質量が観察された。
【００７２】
図５は、オキシムエーテルおよびヒドラゾン阻害剤の構造を示す。オキシムエーテルとヒドラゾン構造の結晶学による比較により、類似の化合物が互いにほぼ重ね合わせることができることが明らかとなる。４種類の全ての結晶構造はｓｙｎ−イミン結合を示し、この異性体の優勢をさらに裏付ける。
【００７３】
図６は、必要とされるアリールオキシアミンの合成のための模式図である。Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）とアリールボロン酸の銅触媒による架橋により、ヒドラジン分解の後に所望のアリールオキシアミンが得られた（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。Ｎ−ヒドロキシフタルイミドとアリールボロン酸の銅触媒による架橋：ａ）ＣｕＣｌ、ピリジン、４Å モレキュラーシーブス、１，２−ジクロロエタン；ｂ）Ｈ2ＮＮＨ2・Ｈ2Ｏ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3；ｃ）ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ。
【００７４】
図７は、オルト−トリフルオロメチルアリールオキシアミンの合成のための模式図である。この合成は、電子欠損フルオロベンゼンのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による芳香族求核置換を必要とする（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）。２−トリフルオロメチルフルオロベンゼンへのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸の求核攻撃は優れた収量の１５（８９％）をもたらし、これはそのＨＣｌ塩として利用すると酸加水分解時にアリールオキシアミン５（収量９６％）をもたらした。この方法論の変化形を用いて、２および４の同等物に由来するオキシムエーテルを調製した（下記参照）。エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による電子欠損フルオロベンゼンの芳香族求核置換：ｄ）tＢｕＯＫ、ＤＭＦ、８０℃；ｅ）ＨＣｌＯ4、１，４−ジオキサン。
【００７５】
図８は、従来通り合成し、ｍｇ量で単離したオキシムエーテルのＲＰ−ＨＰＬＣ純度の表である。高分解能ＭＳおよび1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲデータを含む、完全な構造特性決定データについては実験の項を参照のこと。ハイスループット自動化手順により合成された全ての阻害剤は、ＲＰ−ＬＣＭＳにより純度＞９５％を示し、予測された質量が観察された。
【００７６】
図９は、トランス−イミノ化アプローチによるビスアリールオキシムエーテルの合成を示す模式図である。ａ）ベンジルアルコール、ＤＣＣ、触媒ＤＭＡＰ、ＣＨ2Ｃｌ2；ｂ）エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸、tＢｕＯＫ、ＤＭＦ；ｃ）ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ；ｄ）Ｒ’−ベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）、７０％ ＨＣｌＯ4、１，４−ジオキサン。アリールアセトイミド酸は加水分解して対応するアリールオキシアミン２および４とならなかった。その代わり、アリールアセトイミド酸を酸性条件下で化学量論的な量のアリールアルデヒドと混合して、中程度から優れた収量のオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを直接得た（オキシムエーテル２ｂは不安定な性質のために単離できなかった）。
【００７７】
図１０は、酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２μＭ）の阻害活性をまとめた表である。合成した９５種類のオキシムエーテルのうち、３１種類が良好な有効性を示し、阻害剤の不在下でＷＴ−ＴＴＲにより示されるものの＜１０％までＴＴＲアミロイド形成を低下させ（９０％の阻害、青色）、９種類が中程度の活性を示し（１１〜３０％の線維形成、緑色）、そして残りの５５種類は不良な活性を示した（黄色）。チロキシンのような置換パターンを有するベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテル（ｅ列およびｆ列）は、たとえ非置換フェノキシアミンと結合した場合でも非常に有効である（１６種類全てが＞９０％の阻害を示した）。結合は、一般的に結果として弱いオキシムエーテル阻害剤となる。これらの結果は、阻害を達成するために双方の環に適切な置換基が必要とされるというこれまでの見解に挑戦する。
【００７８】
図１１は、酸に媒介される線維形成アッセイ（７２時間）の終わりに、残留しているオキシムエーテル阻害剤のパーセントを示す表である。阻害剤（７．２μＭ）を暗所で３．６μＭ ＷＴ−ＴＴＲの不在下で、さらに３．６μＭ ＷＴ−ＴＴＲとともにインキュベートした（ｐＨ４．４、３７℃）。５ｄ*エントリーのためのデータは、バッファーをｐＨ７．２で維持したことを除いて同一の条件下である。値は、アッセイの終了時点の阻害剤の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣピーク面積とアッセイの開始時点で得られるそれとを比較することにより決定された。測定誤差は、±４％である。最も安定していない阻害剤（１ｅ、１ｆ、２ｋ、３ｇ、５ｄ*）は、ＴＴＲの不在下で７２時間以内にほぼ完全に分解される；しかし、ＴＴＲの存在は初回量の＞７４％を保つ。特に、阻害剤５ｅはＴＴＲの存在下で分解を示さなかった。このことは、なぜ多くの不安定なビスアリールオキシム阻害剤がＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤であることが分かるのかを説明する助けとなる。つまり、阻害剤がＴＴＲの甲状腺ホルモン結合部位と結合してＴＴＲ四量体に動的な安定化を課すだけでなく（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６）、ＴＴＲ結合も阻害剤を分解に対して安定させる。
【００７９】
図１２は、ｐＨ４．４（７２時間）でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド線維形成に対する主なオキシムエーテルおよびヒドラゾンの分解および加水分解生成物（７．２μＭ）の阻害活性を示す表である。値は線維形成の程度を表し、従って阻害剤の不在下でのＷＴ−ＴＴＲ線維形成（１００％となるよう割り当てられる）に対する阻害剤の有効性を表す。完全な阻害は０％の線維形成に相当する。測定誤差は、±５％である。
【００８０】
図１３は、８ｆでプレインキュベートし（７．２μＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６μＭ）の沈降速度（Ａ）のグラフである。Ａ．速度分析−５０，０００ｒｐｍにて約１５分別々に得たデータセットの重ね合わせ。データ（記号）は、ＭＷ４８．４±０．２ｋＤａの単一の理想的な種類のモデル（実線）に適合する。
【００８１】
図１４は、８ｆでプレインキュベートし（７．２μＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６μＭ）の平衡超遠心法研究のグラフである。平衡分析−１７，０００ｒｐｍの速度で２４時間後に観察された平衡濃度勾配。データ（○）は、ＭＷ５２．１±０．２ｋＤａの単一の理想的な種類のモデル（実線）に適合する。残差、つまり実験データと適合データとの間の差異を挿入図に示す。
【００８２】
図１５は、血漿ＴＴＲに対して＞９０％のアミロイド阻害（７．２μＭ）を示すビスアリールオキシムエーテルの結合化学量論量の下限値を示す表である。ヒト血漿中のＴＴＲに対するビスアリールオキシムエーテル結合化学量論量。ＴＴＲを様々なオキシムエーテル（１０．８μＭ）で処理し、抗体捕捉／ＨＰＬＣ法により化学量論量を測定した。この方法は、洗浄に関連する損失のため最小の結合化学量論量をもたらす（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。試験した３１種類の化合物のうち、１１種類が１．０を超えるＴＴＲ結合化学量論量を示し、３種類が１．５当量を越える結合を示す。最も高い結合化学量論量を示すオキシムエーテルは、１つの芳香環がチロキシンのような置換パターン（例えば３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ）を１つ有するアルデヒドに由来する。この結果は、３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ置換アリール環の組み込みが、大多数のその他の血漿タンパク質（ＴＴＲよりも約１５０倍高い濃度を有するチロキシン輸送タンパク質アルブミンを含む）を上回る血漿結合選択性をＴＴＲに与えることを意味するので、非常に重要である（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，６４４０−６４４５）。
【００８３】
図１６は、Ｘ線結晶学的データに基づく、双方のＷＴ−ＴＴＲチロキシン結合空洞（白色の四角形部分）と結合したビスアリールオキシムエーテル５ｄを表すリボン図を示す。部位の中の１つの拡大図（上部）は、対称性に関連のあるその結合モードの双方にある５ｄ（緑色および白色）と、灰色で示されたＴＴＲ結合部位表面を示す。主要な残基およびハロゲン結合ポケット（ＨＢＰ）は標識されている；刺激された残基またはＨＢＰおよび未刺激の残基またはＨＢＰは２つの隣接する対称性に関連のある、Ｔ4部位を含む単量体にあてはまる。外側の結合ポケットのカルボン酸塩置換基がＬｙｓ−１５ε−ＮＨ3+基と静電相互作用していると思われる。
【００８４】
図１７は、オキシムエーテル５ｄで浸漬したＷＴ−ＴＴＲのＸ線結晶構造データを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ビスアリールオキシムエーテル（Ｘ＝Ｏ）およびビスアリールヒドラゾン（Ｘ＝ＮＨ）ライブラリーの形成のための一般的なアプローチを示す模式図である。
【図２】ビスアリールオキシムエーテルライブラリー（図１参照）を合成するために用いられるアリールオキシアミン（１〜８）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）の構成成分の構造を示す。
【図３】ビスアリールヒドラゾンライブラリーを合成するために用いられるアリールヒドラジン（２２〜２９）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）化合物の構造を示す。
【図４】線維形成の阻害について試験した９６種類のビスアリールヒドラゾンの活性を示す表である。
【図５】オキシムエーテルおよびヒドラゾン阻害剤の構造を示す。
【図６】必要とされるアリールオキシアミンの合成の模式図である。
【図７】オルト−トリフルオロメチルアリールオキシアミンの合成の模式図である。
【図８】従来通り合成し、ｍｇ量で単離したオキシムエーテルのＲＰ−ＨＰＬＣ純度を示す表である。
【図９】トランス−イミノ化アプローチによるビスアリールオキシムエーテルの合成を示す模式図である。
【図１０】酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６ｍＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２ｍＭ）の阻害活性をまとめた表を示す。
【図１１】酸に媒介される線維形成アッセイ（７２時間）の終わりに、残留しているオキシムエーテル阻害剤のパーセントを示す表である。
【図１２】ｐＨ４．４でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６ｍＭ）アミロイド線維形成（７２時間）に対する主なオキシムエーテルおよびヒドラゾンの分解および加水分解生成物（７．２ｍＭ）の阻害活性を示す表である。
【図１３】８ｆでプレインキュベートし（７．２ｍＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６ｍＭ）の沈降速度（Ａ）を示すグラフである。
【図１４】８ｆでプレインキュベートし（７．２ｍＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６ｍＭ）の平衡超遠心法研究を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチンアミロイド線維形成の阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、トランスサイレチンアミロイド線維形成の阻害剤としてのビスアリールオキシムエーテルに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイド形成の過程は、末梢神経障害、臓器不全、そしてまれに中枢神経系の病態をもたらす（Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，８３，４０９−４１７；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２，６６５６−６６６３；Ｇａｒｚｕｌｙ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９６，４７，１５６２−１５６７；Ｉｋｅｄａ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２，５８，１００１−１００７；Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，２８４３−２８４５；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６−４７３；Ｓｉｐｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１９９４，３１，３２５−３５４）。野生型（ＷＴ）ＴＴＲ沈着により引き起こされる疾患である、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）は、８０歳を超える集団の１０〜２５％を冒す遅発性心筋症である（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，２８４３−２８４５）。点突然変異に関連する、残りのＴＴＲに基づくアミロイド病は、広く２つの分類：家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６−４７３）および家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）（Ｓｉｐｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１９９４，３１，３２５−３５４）に分けられる。家族性アミロイドーシスを引き起こすＴＴＲ突然変異は１００を超え、家族性アミロイドーシスの発症の正確な年齢、組織選択性ならびに重症度は、特定の突然変異、個人の遺伝的背景、およびおそらく環境因子のエネルギー論に左右される（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｔ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１，９８，１３０１９−１３０２４；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，１６４２７−１６４３２）。
【０００３】
現在利用可能なＦＡＰの唯一の治療法は、折りたたみ不全になりやすいＴＴＲを血流へ分泌している患者の肝臓を外科的に交換することによる遺伝子療法である（Ｈｅｒｌｅｎｉｕｓ，Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００４，７７，６４−７１）。このアプローチの欠点としては、ドナーとレシピエントの双方に対して侵襲的であること、生涯にわたって免疫抑制が必要であること、および未だ明らかになっていない理由のために数個の突然変異に対する有効性が制限されていることが挙げられる（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．−Ｏ．；ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００２，７３，７４５−７５１）。現在、ＷＴ−ＴＴＲ沈着に関連するＳＳＡの有効な治療法はない。従って、一般的に適用される、全てのＴＴＲに基づくアミロイド疾患に対する小分子治療戦略が歓迎される。
【０００４】
Ｔ１１９Ｍトランスサイレチンサブユニットを、その他の点では疾患関連サブユニット（Ｖ３０Ｍ）で構成される四量体へ包括することにより可能となる、複合へテロ接合体ファミリーにおける対立遺伝子間のトランス抑制は、ＴＴＲの動的安定化がＦＡＰを寛解するのに充分であることを実証する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９３，２０，１７９；Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１９９６，６，２７）。トランス抑制の有効性は、小分子の天然の状態の動的安定化がアミロイドーシスも寛解するはずであることを示唆する（Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９）。疾患に関連する折りたたみ不全を防ぐためにタンパク質の自由エネルギー地形を調整する小分子の有用性が、現在いくつかの事例において証明されている（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，１１，１０６５−１０８４；Ｈａｒｄｙ，Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７，３５３−３５６；Ｒａｙ，Ｓ．Ｓ．；Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１，５７０１−５７０２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２）。
【０００５】
ＴＴＲは、２２２の分子対称性を特徴とする１２７残基のβシートリッチなホモ四量体であり、２つのチロキシン（Ｔ4）結合部位を有する（Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７４，８８，１−１２；Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７８，１２１，３３９−５６）。脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿の双方におけるＴＴＲ Ｔ4結合能の大部分（＞９９％）は、ＴＴＲの濃度が高いこと、ならびに甲状腺結合グロブリン（血液）および、同様にＴ4を有するアルブミン（血液およびＣＳＦ）が存在することのために利用されていない（Ｂａｒｔａｌｅｎａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９３，１３，５８３−５９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，１１６，１３７−１６０；Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６）。律速な四量体の解離がアミロイド形成には必要とされる（Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２，３１，８６５４−８６６０；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９３，２４５９−２４６２；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，６４７０−６４８２；Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，１７８５１−１７８６４）が、充分ではない（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１１４４２−１１４５２）。結果として生じる折りたたまれた単量体も部分的な変性を受けて構築不全となるに違いないからである（Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２，３１，８６５４−８６６０；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，６４７０−６４８２；Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；Ｌａｉ，Ｚ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，１７８５１−１７８６４；Ｊｉａｎｇ，Ｘ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１１４４２−１１４５２；Ｌｉｕ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，７５４−７５７）。これまでの研究は、Ｔ4結合が、天然の状態の動的安定化によりＴＴＲの凝集を阻害することを実証する。解離のための活性化障壁は、解離の遷移状態に対して天然の四量体が優先的に安定化することにより増加する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０）。
【０００６】
スクリーニング、構造に基づく設計、および平行合成によるリード化合物の最適化は、いくつかのその他の構造上異なるクラスの強力なＴＴＲアミロイド形成阻害剤を導く（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。効果的な阻害剤は、一般に、直接結合しているかまたはスペーサー（アミン、エーテル、またはエチレン架橋など）を介して結合している２つのアリールを有する。好ましくは、１つのアリールがハロゲンまたは脂肪族基（一般にチロキシン結合部位の内部の空洞を占有）で官能化され、もう１つのアリールがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸により官能化されている（外側の結合空洞の周辺でＬｙｓ−１５ ｅ−ＮＨ3+および／またはＧｌｕ−５４カルボキシル基と静電気的に相互作用することができる）（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。双方の空洞はハロゲン結合ポケットと呼ばれる疎水性の陥凹部を有し、アリール部分構造およびそれらの疎水性置換基により補完される。
【発明の開示】
【０００７】
多数のＴＴＲ・（阻害剤）2共結晶構造における置換芳香族の配向および配置、合成のしやすさ、ならびに未来のハイスループット動的コンビナトリアルライブラリー解析の可能性を考慮した後（Ｎａｚａｒｐａｃｋ−Ｋａｎｄｌｏｕｓｙ，Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１９９−２０６；Ｈｏｃｈｇｕｅｒｔｅｌ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，３３８２−３３８７）、本発明者らは２つのアリール環と結合するアルドキシムエーテル部分を検討することを選択した。オキシムエーテル部分を含有するＦＤＡ認可抗菌薬がいくつかあることから、この部分構造がヒト生物学に適合することが示唆される（オキシムエーテル部分を含有するＦＤＡ認可抗菌薬は、医薬品の開発に関するデータを含有するＰｒｏｕｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ提供のＤｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔをスキャンする、ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤＤＲ ２００３．２ （２５．１１）データベース提供のＭＤＬ ＩＳＩＳ／Ｂａｓｅ ２．５を用いて見出された）。本研究の目的は、ヒト血漿において高い親和性でＴＴＲと結合し（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）、アミロイド形成に対して天然の状態を安定化させる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，ｎｏ．６９６８，９０５−９０９）、ビスアリールアルドキシムエーテル構造を見出すことである。
【０００８】
律速な四量体の解離および単量体の折りたたみ不全を必要とする、血漿タンパク質トランスサイレチン（ＴＴＲ）によるアミロイド線維形成は、いくつかのヒト疾患に関わっている。アミロイド形成は、ＴＴＲの主として未使用の甲状腺ホルモン結合部位と結合している小分子に媒介される、天然の状態の安定化によって阻害することができる。アリールアルデヒドをアリールオキシアミンで簡便に縮合することにより新規な天然の状態の安定化剤が本明細書において見出され、ビスアリールアルドキシムエーテルライブラリーをもたらした。ライブラリーの９５種類の化合物のうち、３１種類はインビトロでのＴＴＲアミロイド形成の活性阻害剤であった。ビスアリールオキシムエーテルは、アミロイド形成条件下で、解離の遷移状態の間、ＴＴＲの天然の四量体状態を選択的に安定化させ、解離の活性化障壁の増大を引き起こす。いくつかのビスアリールオキシムエーテルは、ヒト血漿中の多量のその他の血漿タンパク質よりもＴＴＲと選択的に結合し、これはインビボでの有効性に必要な特性である。ビスアリールアルドキシムエーテルはＮ−Ｏ結合の切断による分解に対して感受性が高いが、この過程はそれらがＴＴＲと結合することにより遅くなる。さらに、多くのビスアリールアルドキシムエーテルの分解速度は、血漿ＴＴＲの半減期と比較して遅い。ビスアリールオキシムエーテルライブラリーは、当然必要であると分かる、優れた安定性プロフィールを有する構造上類似の阻害剤の開発のために、価値のある構造活性相関の洞察をもたらす。
【０００９】
本発明の一態様は、下の式Ｉ
【化１】
に表されるビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンを対象とする。
式Ｉにおいて、Ｒ’は、存在しないか、または、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｉ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、およびＣＦ3からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；Ｒは、存在しないか、または、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、およびＣＦ3からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；さらに、Ｘは、−ＮＨ−および−Ｏ−からなる群から選択されるジラジカルである。好ましい実施形態では、Ｘは、−Ｏ−であり；別の好ましい実施形態では、Ｘは、−ＮＨ−である。さらに好ましい実施形態では、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンは下の式ＩＩ：
【化２】
で表される。
式ＩＩにおいて、ラジカルＡは以下の群
【化３】
から選択される。
さらに好ましい実施形態では、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンは、下の式ＩＩＩ
【化４】
で表される。
式ＩＩＩにおいて、ラジカルＢは以下の群：
【化５Ａ】
【化５Ｂ】
から選択される。
【００１０】
本発明の別の態様はトランスサイレチンのアミロイド線維形成を阻害するための方法を対象とする。この方法は、トランスサイレチンを阻害濃度の式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンと接触させる段階を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾンのＸ線結晶解析は、両者が同じ構造であることを示す。ヒドラゾンライブラリー活性に基づいて合成された９５のオキシムエーテルライブラリーメンバーのうちほぼ１／３が、濃度７．２μＭで優れたＴＴＲアミロイド形成阻害剤であり、四量体ＷＴ−ＴＴＲの濃度の２倍である（ｐＨ４．４で７２時間、阻害＞９０％）。最も優れた阻害剤は、カルボン酸で置換された１つの芳香環を有するが、もう一方のアリール環はハロゲンまたはトリフルオロメチル基を有する。チロキシンのような置換パターンのアリールアルデヒドから調製したオキシムエーテルも、優れた活性および顕著なＴＴＲ血漿結合選択性を示す。いくつかのものは２のうち１．５を超える結合化学論量を示す。オキシムエーテルは、解離の遷移状態に対してＴＴＲの天然の状態を選択的に安定化させるだけでなく、実質的に四量体の解離およびアミロイドーシスを遅らせるが、ビスアリールオキシムエーテルが不安定性を示す場合には、ＴＴＲ結合によって、それらの分解はバッファーのみと比較して顕著に遅くなる。
【００１２】
オキシムエーテルライブラリーの設計。アリールオキシアミンは、アリールアルデヒドと結合して所望のビスアリールオキシムエーテルライブラリーを生成するための出発物質として必要である（図１、Ｘ＝Ｏ）。この反応は、イミン結合に関して２つの立体異性体（図１のｓｙｎおよびａｎｔｉで示される、すなわち、アルデヒドプロトンがＸで表されるフェノキシ酸素に対してそれぞれｃｉｓまたはｔｒａｎｓに配向し得る）を作成する可能性があり得る；しかし、文献による先例に基づくとｓｙｎ−異性体のみが予期された（かつ観察された、下記参照）（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５；Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｚ．；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｂ，Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．１９６７，９，８９８−９０３）。
【００１３】
その他の有力なＴＴＲアミロイド形成阻害剤において同定された構造上の特性に基づいて、オキシムエーテル置換基および置換パターンを選択した（図２）（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。選択されたアリールオキシアミン（１〜８）は、アリールオキシアミン中にパラ−ＣＦ3（ｉ）およびチロキシンのような置換パターン（ｅおよびｆ）がないことを除いてアリールアルデヒドと同じ置換パターンを有した。残念ながら、市販されている唯一のアリールオキシアミンはフェノキシアミンである；従って、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するために必要なアリールオキシアミンの構成単位の合成のための方法は、本明細書または他の場所に記載されている（Ａｂｅｌｅ，Ｅ．；Ｌｕｋｅｖｉｃｓ，Ｅ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．２０００，３２，２３５−２６４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２；Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００；Ｃｈｏｏｎｇ，Ｉ．Ｃ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，６５２８−６５２９）。対照的に、容易に入手できるアリールアルデヒドと結合してビスアリールヒドラゾンライブラリーを作成するための、１５０種類を超えるアリールヒドラジンが市販されている（図１、Ｘ＝ＮＨ）。類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾン（以下、それぞれオキシムエーテルおよびヒドラゾンと称される）が互いに同じ構造であると考えられるため、ヒドラゾンライブラリーの迅速な自動合成（図３）を行って、阻害剤のこの構造クラスが活性を有するかどうかクエリーした（図４）。
【００１４】
オキシムエーテルとヒドラゾンの特性決定および結晶学的比較。推定された同じ構造である性質を確認するため、それぞれスキャフォールド５ｂ／ｄ（図２）およびスキャフォールド２６ｂ／ｄ（図３）を基にして類似するオキシムエーテルとヒドラゾンの対を合成し、結晶化し、それらの構造をＸ線回折により決定した。オキシムエーテルとヒドラゾン構造を結晶学により比較すると、この類似する化合物が互いにほぼ重ね合わせることができることが明らかとなる（図５）。４種類の全ての結晶構造はｓｙｎ−イミン結合を示し、この異性体の優勢をさらに裏付けている（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５；Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｚ．；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｂ，Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．１９６７，９，８９８−９０３）。
【００１５】
ヒドラゾン（純度＞９４％）およびオキシムエーテル（純度＞９５％）ライブラリー作成に関連する全ての粗反応混合物のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの痕跡は、主に１つのピークを示し、単一の異性体（先例から推論され、Ｘ線結晶学により裏付けたｓｙｎ−イミン結合）が優勢であることを示唆する。原則として、ｓｙｎ−およびａｎｔｉ−異性体の双方が同時に溶出するか急速に相互転換し、ｓｙｎ−異性体として選択的に結晶化することは可能である；しかし、伝統的な手段で合成されたヒドラゾンおよびオキシムエーテルの1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、単独の異性体のものと一致する共鳴を示す（文献による先例は、好ましいｓｙｎ−異性体が、室温でＮＭＲによってｔｒａｎｓ−異性体と区別されることを証明している）（Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，８４，７５３−７５５；Ｌｕｓｔｉｇ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６１，６５，４９１−４９５；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２７８４−２７８８；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｔａｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３６２４−３６２９；Ｓｈｅｒａｄｓｋｙ，Ｔ．；Ｎｏｖ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９８０，１２，２７８１−２７８６；Ｋａｒａｂａｔｓｏｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｉｓ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７，２３，１０７９−１０９５）。
【００１６】
オキシムエーテルライブラリーの合成および活性。ヒドラゾン（全て純度＞９４％）が阻害剤活性を示したので、同等のオキシムエーテルライブラリーもＴＴＲアミロイド形成阻害剤を作成することができると仮定した。この仮定を本明細書で確認する。いくつかのビスアリールヒドラゾンは、ＴＴＲアミロイド形成の強力な阻害を示し（図４）、類似するオキシムエーテルライブラリーの調製および評価が正当であることを証明した。水性ヒドラゾンの不安定性（主にシッフ塩基の加水分解による）およびヒドラゾンの生物学的毒性は、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するさらなる意欲をもたらす。ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを作製するために必要なアリールオキシアミンの調製のための２つの合成戦略を用いた。最初に、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）のアリールボロン酸との銅触媒による架橋により、ヒドラジン分解の後に所望のアリールオキシアミンが得られた（図６）（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。遊離塩基として単離された（３、６、および７）か、またはそれらの塩酸塩として沈殿した（１および８）アリールオキシアミンを、この方法論を用いて良好から中程度の全収率で合成した。
【００１７】
銅触媒による結合の方法論は、アリールボロン酸上のオルト−ハロゲン化物またはオルト−ＣＦ3置換基に不耐性であるように思われる（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。さらに、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド中間体の脱保護に必要とされるヒドラジン分解は、オルト−カルボキシル置換基を有するアリールオキシアミンに対して成功しない。その他の方法をいくつか検討した後、エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による電子欠損フルオロベンゼンの芳香族求核置換を選択して最初の方法を補完した（図７）（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）。２−トリフルオロメチルフルオロベンゼンへのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸の求核攻撃は優れた収量の１５（８９％）をもたらし、これは酸加水分解時にアリールオキシアミン５（収量９６％）をもたらし、そのＨＣｌ塩として利用した。この方法論の変化形を用いて、２および４の同等物に由来するオキシムエーテルを調製した（下記参照）。
【００１８】
アリールオキシアミン１および５〜８を用いてオキシムエーテルライブラリーの一部を作成した（図２）。ＤＭＳＯ中の酢酸（０．０８Ｍ）の存在下、アリールアルデヒド（０．１Ｍ）とアリールオキシアミン（０．１２５Ｍ）の反応により、２５℃にて２４時間以内にオキシムエーテルをほぼ定量的収率で得た（全てのフェノキシアミンおよびヒドラジンをＴＴＲアミロイド阻害剤として試験したが、ライブラリー合成にそれらを過度に用いたため、阻害は明らかとならなかった）。５種類のアリールオキシアミン（１および５〜８）および１２種類のアルデヒド（ａ〜ｌ）をあらゆる可能性のある組合せで縮合し、ウェルフォーマット毎に単一の化合物でＧｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて６０種類のオキシムエーテルを得た。反応をＬＣ−ＭＳにより解析して、すべてのウェルで収量（９８〜１００％、アルデヒド消費に基づく、実験の項を参照）および生成物の純度（＞９５％）を決定した（全ての生成物はその予測質量を示す）。純粋な化合物を従来通り合成し、完全な特性決定を行った（実験の項の裏付けとなる情報を参照）７つの場合において（１ｅ、５ｄ〜ｆ、７ｅ、および８ｅ〜ｆ）、ＨＰＬＣでの同時溶出により生成物の構造および純度を確認した。
【００１９】
オキシムエーテルライブラリーの残りのメンバーを伝統的な合成手順で調製し、ｍｇ量で単離した（完全な特性決定データについては実験の項および裏付けとなる情報を参照、さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定された化合物の純度については図８を参照）。触媒のＨＣｌの存在下、Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン（３）をアリールアルデヒドａ〜ｌで縮合し、中程度から優れた収量のオキシムエーテル３ａ〜ｌを得た。エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸のＳNＡｒ手順を用いて、化合物２０および２１をそれぞれ全収率４５％および５１％で調製した（図９）。アリールアセトイミド酸エステルは加水分解して対応するアリールオキシアミン２および４とならなかった。その代わり、アリールアセトイミド酸エステルを酸性条件下で化学量論的な量のアリールアルデヒドと混合して、中程度から優れた収量のオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを直接得た（オキシムエーテル２ｂは不安定な性質のために単離できなかった）。
【００２０】
酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２μＭ）の阻害活性を表１０にまとめている。合成した９５種類のオキシムエーテルのうち、３１種類が良好な有効性を示し、阻害剤の不在下でＷＴ−ＴＴＲにより示されるものの＜１０％までＴＴＲアミロイド形成を低下させ（９０％の阻害、青色）、９種類が中程度の活性を示し（１１〜３０％の線維形成、緑色）、そして残りの５５種類は不良な活性を示した（黄色）。
【００２１】
チロキシンのような置換パターンを有するベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテル（図１０、ｅ列およびｆ列）は、たとえ非置換フェノキシアミンと結合した場合でも非常に有効である（１６種類全てが＞９０％の阻害を示した）。非置換フェノキシアミンとの結合は、一般的に結果として弱いオキシムエーテル阻害剤となる。これらの結果は、阻害を達成するために双方の環に適切な置換基が必要とされるというこれまでの見解に挑戦する。
【００２２】
ハロゲン化アリールオキシアミンとメタ−もしくはパラ−カルボキシベンズアルデヒドとの縮合から得られたさらなるオキシムエーテル（またはその逆も同様）は、環に関係なくカルボン酸置換基を有する強力な阻害剤を生成した。これらの結果は結合の配向性が、Ｌｙｓ−１５のε−ＮＨ3+基との静電相互作用を保存するように変化する可能性のあることを示唆する。オルト−カルボキシベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテルからは良好な阻害剤が生成されない。オキシムエーテル由来のカルボキシベンズアルデヒドの活性を、最高から最悪までランク付けすると、メタ＞パラ＞オルトとなり、カルボキシフェノキシアミンに由来するオキシムエーテルの活性のランク：メタ≒パラ＞オルトに類似する。双方の環にカルボン酸またはハロゲンを有するオキシムエーテル（Ｔ4のような置換を除く）は、よくても中程度の活性を示した。
【００２３】
アリールアルデヒドおよびフェノキシアミンが縮合する能力自体は動的コンビナトリアルライブラリーアプローチに役立つが（Ｎａｚａｒｐａｃｋ−Ｋａｎｄｌｏｕｓｙ，Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１９９−２０６；Ｈｏｃｈｇｕｅｒｔｅｌ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，９９，３３８２−３３８７）、一般に、阻害は、２つの結合部位間のアロステリックな情報伝達により結合している２つの異なる小分子で最大であるという、起こり得る複雑な問題が既に報告されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４）。従って、構造活性相関データは、動的コンビナトリアルライブラリーで生じる阻害剤の組合せの影響により複雑化する可能性がある。
【００２４】
ビスアリールアルドキシムエーテルの安定性。多くのビスアリールアルドキシムエーテルはＴＴＲアミロイド形成の強力な阻害剤であるが（図１０）、それらは酸性かまたは塩基性の水性媒質中で安定性の幅を示す（一次分解半減期はＴＴＲの不在下で数時間〜数日の範囲である）。ヒドラゾンとは違って、オキシムエーテルは中性および塩基性条件でシッフ塩基加水分解に対して安定しているように思われるが、それらは、明らかにオキシムエーテルのＮ−Ｏ結合の切断による一次反応速度でなおゆっくりと分解し、フェノールおよびアリールニトリルをもたらすことができる。このＮ−Ｏ結合の切断は、高い温度での先例はあるものも、このような軽度の条件下では予期されていなかった （Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｌｏｕｄｏｎ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７５，４０，１２６−１２７；Ｓｕｐｓａｎａ，Ｐ．；Ｔｓｏｕｏｎｇａｓ，Ｐ．Ｇ．；Ｖａｒｖｏｕｎｉｓ，Ｇ．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２０００，４１，１８４５−１８４７；Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．；Ｓｎｙｄｅｒ，Ｈ．Ｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３９，３３４３−３３４６；Ｇｏｍｅｚ，Ｖ．；Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｄｒａｎｏ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，１２１９−１２２１；Ｃｈｏ，Ｂ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，５５１３−５５１７；Ｒｏｙｅｒ，Ｒ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２９，１７９９−１８０１；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ａ．Ｊ．；Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６，５１，１００６−１０１１；Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，６９，３１１２−３１２０）。
【００２５】
オキシムエーテルは、それらの明白な分解「半減期」によると、類似するヒドラゾンよりも質的に安定している（分解過程は一次的でないので、明白なヒドラゾン「半減期」は５０％消失に要する時間を指す）。いずれかの芳香環上の電子供与基およびオルト−置換基は、ビスアリールアルドキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾンの双方の分解速度を増加させるように思われる。
【００２６】
概して、阻害剤（７．２μＭ）のＴＴＲ（３．６μＭ）との結合は、酸に媒介される線維形成条件下で（ｐＨ４．４、３７℃、７２時間）、化合物を分解から安定化させる働きをする。最もよい阻害剤（線維形成＜１０％）の中の１１種類に関して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、酸に媒介される線維形成アッセイの終わりに初期のオキシムエーテルの＞７４％が残っていることが明らかとなる（図１１）。最も安定していない阻害剤（１ｅ、１ｆ、２ｋ、３ｇ、５ｄ*）は、ＴＴＲの不在下で７２時間以内にほぼ完全に分解される；しかし、阻害剤の存在は初回量の＞７４％を維持する。特に、阻害剤５ｅはＴＴＲの存在下で分解を示さなかった。このことは、なぜ多くの不安定なビスアリールオキシム阻害剤がＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤であることが分かるのかを説明する助けとなる。つまり、阻害剤がＴＴＲの甲状腺ホルモン結合部位と結合してＴＴＲ四量体に動的な安定化を課すだけでなく（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６）、ＴＴＲ結合も阻害剤を分解に対して安定させる。
【００２７】
また、分析を行って、活性が主として個々のオキシムエーテルによるものであってそれらの提案される分解生成物によるものでないことを確認するのに役立てた。分解性の副生成物が観察した阻害剤の有効性に寄与するかどうかを判定するため、対応するフェノールおよびニトリル（オキシムエーテルの場合）、アニリン（ヒドラゾンの場合）、ならびにアルデヒド（オキシムエーテルとヒドラゾンの双方の場合）をそれらの線維形成阻害特性について分析した。３，５−ジハロ−４−ヒドロキシベンゾニトリルおよび類似するアルデヒド分解生成物は、四量体のＴＴＲの２倍の濃度でＴＴＲ線維形成の強力な阻害剤である（図１２）。３，５−ジクロロフェノールも、四量体のＴＴＲ（３．６μＭ）の濃度の２倍の濃度（７．２μＭ）で線維形成を８６％阻害する。しかし、その他の分解生成物（ニトリル、フェノール、またはアニリン）はどれも目に見えるほどの活性を示さない。従って、大部分のアミロイド形成阻害剤の有効性が、親ビスアリールオキシムエーテルに起因するものであり、分解性の副生成物に起因するものでないと結論付けるのが妥当であり、それにより分解の機構的要件を理解するため、および医化学目的のためにこれらの構造または関連する構造を安定させるための意欲がもたらされた。
【００２８】
アミロイド形成条件下、阻害剤８ｆの存在下でのＴＴＲの四量体構造の分析用超遠心分離評価。沈降速度と平衡分析用超遠心分離実験の双方を用いて、一般的に四量体を解離させ、単量体を構築不全の構成成分とするアミロイド形成条件下で、阻害剤８ｆのＴＴＲの四量体構造への影響を評価した（７２時間、ｐＨ４．４、３７℃）。ＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）と結合したオキシムエーテル８ｆ（７．２μＭ）を、これらの条件下で５０，０００ｒｐｍにて沈降速度分析に付し（図１３）、ＴＴＲがＳ値３．７（分子量４８．４±０．２ｋＤａに相当する）の、単一の種類として沈降している四量体のままであることが示された。阻害剤を欠く同一の実験では四量体のＴＴＲは検出されなかった−アミロイド形成の過程に一致する、高分子量のＴＴＲの凝集体のみが観察された。沈降平衡分析（１７，０００ｒｐｍ）によるさらなる精査は、単一の理想的な種類のモデル（図１４；５２．１±０．２ｋＤａ）に適合するデータを示し、四量体ＷＴ−ＴＴＲ・（８ｆ）2の計算された分子量（５６，３７４Ｄａ）と充分一致している。濃度の関数としての細胞全体の分子量分布の分析も、僅かに５０ｋＤａを超える分子量の単一の種類を示した。
【００２９】
ヒト血漿中のＴＴＲと結合するオキシムエーテルの選択性。臨床研究に小分子を用いてアミロイドについての仮説（アミロイド形成の過程が神経毒性または組織損傷をもたらすという考え）を検証するためには、小分子はその他の全ての血漿タンパク質の存在下で血漿中のＴＴＲと選択的に結合する必要がある。最も活性の高いオキシムエーテルとヒト血漿中のＴＴＲとの結合化学量論量を、既に報告されている抗体捕捉／ＨＰＬＣ法を用いて評価した（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。手短に言えば、試験化合物を１０．８μＭの濃度（ＴＴＲの血漿濃度の約２〜３倍）でヒト血漿に溶解する。２４時間（３７℃）のインキュベーションの後、ＴＴＲおよびそれと結合している任意の小分子を、セファロース樹脂と共有結合したポリクローナルＴＴＲ抗体を用いて免疫沈降させる。樹脂を洗浄し、ＴＴＲ・（小分子）n<2複合体を高いｐＨで解離させ、次にＴＴＲと結合した小分子の化学量論量を、阻害剤およびＴＴＲの相対量を定量化するための標準曲線を用いる分析用逆相ＨＰＬＣにより判定する（ＴＴＲの２つのチロキシン結合部位により最大阻害剤化学量論量は２である）。阻害剤の中には抗体捕捉の後に必要な洗浄段階で失われるものもあり得るため、本方法は、阻害剤の結合化学量論量の下限値を確立する。
【００３０】
血漿ＴＴＲに対して＞９０％のアミロイド阻害（７．２μＭ）を示すビスアリールオキシムエーテルの結合化学量論量の下限値を、図１５に示す。試験した３１種類の化合物のうち、１１種類が１．０を超えるＴＴＲ結合化学量論量を示し、３種類が１．５当量を越える結合を示す。最も高い結合化学量論量を示すオキシムエーテルは、１つの芳香環がチロキシンのような置換パターン（例えば３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ）を１つ有するアルデヒドに由来する。この結果は、３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ置換アリール環の組み込みが、大多数のその他の血漿タンパク質（ＴＴＲよりも約１５０倍高い濃度を有するチロキシン輸送タンパク質アルブミンを含む）を上回る血漿結合選択性をＴＴＲに与えることを意味するので、非常に重要である（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，６４４０−６４４５）。しかし、これらの結果は、これらの化合物が血液中で主なチロキシン輸送タンパク質である、ＴＢＧと（ＴＴＲの約１／１０の濃度で）結合する可能性に対応していない。従って、ＴＢＧの結合能力が飽和しても、ＴＴＲの結合選択性結果にあまり影響を及ぼさない（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６）。自動化された手順によって合成された、０．５を超える結合化学量論量を示す数個のオキシムエーテル（１ｅ、５ｄ〜ｆ、７ｅ、および８ｅ〜ｆ）も、従来法によりｍｇ量で合成し、単離し、それらの結合化学量論量を再評価した。全ての場合において同じ結果が得られ、自動化により調製されたオキシムエーテルと、従来法により調製されたオキシムエーテルが同一であることが証明された。
【００３１】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶構造。ビスアリールオキシムエーテルによるアミロイド阻害のための構造基盤を解明するため、強力な凝集阻害と血漿選択性の双方を示すいくつかの化合物の共結晶構造に着手した。ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の複合体は、分解能１．５３Åの最良の共結晶構造データをもたらし、本明細書に提示されている（図１６および図１７）。高分解能データにもかかわらず、トリフルオロメチル置換芳香環は、電子密度オミットマップの輪郭を示す１σ未満でようやく目に見え、それらの領域の比較的高い柔軟性を示している。しかし、側鎖の配向および震動「ｎ」とゆがみのオミットマップ（Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００３，５９，２２００−２２１０）から、ほぼ最小のエネルギー構造におけるタンパク質の中心チャネル（各甲状腺ホルモン結合ポケットに１つ）内に結合した２つの分子の最終的な配向および位置を得た。各ホルモン部位には、結合チャネルを二分する２重の回転軸により、２つの対称な同等の結合構造が含有される。
【００３２】
阻害剤５ｄは「順方向」結合モードのＴＴＲ中にあり、それは、外側の空洞にあってＬｙｓ−１５と好ましい静電相互作用をするカルボン酸置換芳香環を有する阻害剤と呼ばれる（Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１）。カルボキシル基は、Ｔｈｒ−１０６（２．７３Å）およびＬｙｓ−１５残基と水素結合を形成する。Ｌｙｓ−１５の側鎖は阻害剤との疎水性相互作用（ε−ＣＨ2）および静電（ε−ＮＨ3+−３．３Å）相互作用の双方に寄与する。また、Ｌｅｕ−１７、Ｌｅｕ−１７’、Ａｌａ−１０８、Ａｌａ−１０８’、Ｌｅｕ−１１０、Ｌｅｕ−１１０’、Ｔｈｒ−１１９、Ｔｈｒ−１１９’、Ｖａｌ−１２１、およびＶａｌ−１２１’の疎水性側鎖間に阻害剤が積み重なる時に、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用の双方により結合が安定化される。トリフルオロメチル置換基は、内部の空洞のハロゲン結合ポケット３（ＨＢＰ−３）の一部を占有する。内部空洞のＳｅｒ−１１７ヒドロキシル基は阻害剤から離れて配向し、それらのβ−ＣＨ2部分構造によるさらなる疎水性相互作用に寄与する。リンカーである酸素と窒素は、ＴＴＲと静電相互作用を行わないと思われ、従ってその結合および活性にあまり寄与しない可能性があり、オキシムエーテルおよびヒドラゾンにより提示される類似の活性、ならびにスチルベン、ジアリールアミン、およびジアリールエーテルは全て活性があるという以前の報告に一致する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００２，１，２６７−２７５；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ε．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２６，６９６８，９０５−９０９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５−５５２；Ｍｉｒｏｙ，Ｇ．Ｊ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，１５０５１−１５０５６；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９５，１２９５６−１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ε．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５−３７４；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４０４−１３４１４；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８−２１９２；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９−１４０１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，１−６；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９−１３４７；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２−３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１−３３２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Εｄ．２００３，４２，２７５８−２７６１）。しかし、リンカーが採った構造は２つの芳香環を配向させるために極めて重要であると思われる。
【００３３】
実験の項
一般的な合成法
特に明記しない限り、全ての化学物質は民間の供給業者から購入し、さらなる精製を行わずに用いた。反応の進行は、シリカゲル６０ Ｆ２５４をコートしたガラス板（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での薄層クロマトグラフィーにより、かつ／または分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。全てのフラッシュクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲル６０（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ３００、４００、５００、または６００ＭＨｚ分光器のいずれかで記録した。化学シフトは、ＣＤＣｌ3溶液の内部標準Ｍｅ4Ｓｉ（０．０ｐｐｍ）から低磁場の百万分の１の単位で報告されるか、または、Ｍｅ4Ｓｉが13Ｃ−ＮＭＲスペクトルに見られない場合は溶媒ピーク（ＣＤＣｌ3 ７７．１６ｐｐｍ）の較正を行った。ｄ6−ＤＭＳＯ、ｄ6−アセトン、またはＣＤ3ＯＤ中の試料に関して、1Ｈ−ＮＭＲについてそれぞれ３．４９、２．０５、および３．３１ｐｐｍで、さらに13Ｃ−ＮＭＲについてそれぞれ３９．５２、２９．８４、および４９．００ｐｐｍで、溶媒ピークの較正を行った。Ｗａｔｅｒｓ ４８６ チューナブル吸光度検出器およびＷａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラーを用いるＷａｔｅｒｓ ６００ Ｅ多溶媒送達系で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行った。ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｂｅｔａｂａｓｉｃ−１８カラムを分析用逆相ＨＰＬＣ分析（７１５０３−０３４６３０モデル、孔径１５０Å、粒径３μＭ）に用い、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムを分取ＨＰＬＣ（２１８ＴＰ１０２２モデル、孔径３００Å、粒径５μＭ、内径２２ｍｍ×２５０ｍｍ）に用いた。溶媒系Ａは、９５：５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮと０．２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶媒Ｂは、５：９５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮと０．２５％ＴＦＡであり、直線勾配は、Ａ：Ｂ ０：１００、８０：２０、または６０：４０のいずれかからＡ：Ｂ ０：１００で流した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（５ｍｍ、２．１×５０ｍｍ）カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰＬＣ−ＭＳで高速液体クロマトグラフィー・質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を行い、Ｇｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて溶媒送達を行った。全ての質量分析データは質量分析のためにＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｎｔｅｒで収集された。
【００３４】
フェノキシアミンの調製のための、フェニルボロン酸とＮ−ヒドロキシフタルイミドの銅触媒による結合の代表的手順（方法１）：９の合成。
２０ｍＬシンチレーションバイアルを、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１６３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）（９９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、活性化したばかりの４Åモレキュラーシーブス（約２５０ｍｇ）、およびフェニルボロン酸（２４４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）で満たした。１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）を添加し、続いてピリジン（９０μＬ、１．１ｍｍｏｌ）を添加すると、淡褐色の懸濁液が生じた。反応懸濁液が空気に触れるようにキャップを緩め、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによる検出が完了するまで室温にて攪拌した（反応が進行するにつれて混合物の色は褐色からエメラルドグリーンへ変化した）。完了すると（約４８時間）、混合物はシリカゲルに吸収され、濃縮されて粉末となった。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）によりＮ−フェノキシフタルイミド９を白色の固体として得た（２１６ｍｇ、９０％）；特性決定データについては下記参照。
【００３５】
Ｎ−フェノキシフタルイミド（９）。
９の調製は、上記に代表的手順（方法１）として記載した。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．１２−７．２０（ｍ，３Ｈ）、７．３２−７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．８０−７．８４（ｍ，２Ｈ）、７．９０−７．９４（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１４．４、１２４．０、１２８．８、１２９．７、１３４．９、１５８．９、１６２．９；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４０．０６５６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ10ＮＯ3の要求値２４０．０６５５。
【００３６】
Ｎ−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）フタルイミド（１０）。
３−トリフルオロメチルフェニルボロン酸（３８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）との代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ）により、１０を白色の固体として得た（２７０ｍｇ、８８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．３４−７．３８（ｍ，１Ｈ）、７．４０−７．４５（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｍ，Ｊ＝０．９，８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８７（ｍ，２Ｈ）、７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１１．６、１１７．８、１１８．１、１２１．４、１２２．３、１２４．２、１２８．８、１３０．５、１３２．２、１３５．１、１５９．０、１６２．８；ＬＣ−ＭＳ ３０９ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ15Ｈ9Ｆ3ＮＯ3の要求値３０９。
【００３７】
Ｎ−（３，５−ジクロロフェノキシ）フタルイミド（１１）。
３，５−ジクロロフェニルボロン酸（３８２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮＨＰとの代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５０％ＣＨ2Ｃｌ2）により、１１を白色の固体として得た（１３９ｍｇ、４５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．０７（ｍ，２Ｈ）、７．１３−７．１６（ｍ，１Ｈ）、７．８１−７．８６（ｍ，２Ｈ）、７．７１−７．９６（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１３．７、１２４．２、１２５．０、１２８．８、１３５．２、１３５．９、１５９．７、１６２．５；ＬＣ−ＭＳ ２７６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ8Ｃｌ2ＮＯ3の要求値２７６。
【００３８】
Ｎ−（３，５−ジフルオロフェノキシ）フタルイミド（１２）。
３，５−ジフルオロフェニルボロン酸（３１６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、上に概説されるＮＨＰとの代表的結合手順（方法１）に付した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（トルエン中１０％ＣＨ2Ｃｌ2）により、１２を白色の固体として得た（１９７ｍｇ、７２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．５８−６．６３（ｍ，１Ｈ）、６．６８−６．７３（ｍ，２Ｈ）、７．８２−７．８７（ｍ，２Ｈ）、７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ９８．５（ｍ）、１００．３（ｔ，ＪC-F＝２５．３Ｈｚ）、１２４．４、１２８．７、１３５．４、１６０．５（ｔ，ＪC-F＝１３．８Ｈｚ）、１６２．６、１６３．６（ｄｄ，ＪC-F＝１３．８，２４９Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２７６．０４５６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ8Ｆ2ＮＯ3の要求値２７６．０４６７。
【００３９】
Ｎ−（３−メトキシカルボニルフェノキシ）フタルイミド（１３）。
３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸を、上に概説されるＮＨＰとの同様の結合手順（方法１）に付した。１００ｍＬ丸底フラスコを、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２．１９ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）（１．３４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、活性化したばかりの４Åモレキュラーシーブス（約５ｇ）、および３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸（４．７９ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）で満たした。１，２−ジクロロエタン（６０ｍＬ）を添加し、続いてピリジン（１．２０ｍＬ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応懸濁液を室温にて空気雰囲気中で攪拌した。４日後、混合物をシリカゲルに吸着させ、濃縮して粉末とした。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中３３〜５０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１３を白色の固体として得た（１．８５ｇ、４６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．９０（ｓ，３Ｈ）、７．３８−７．４１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，２．５，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．４４（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８６（ｍ，３Ｈ）、７．９２−７．９６（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５２．５、１１５．０、１１９．３、１２４．３、１２５．９、１２９．０、１３０．０、１３２．１、１３５．２、１５９．０、１６３．０、１６６．２；ＥＳＩ−ＭＳ ２９８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ16Ｈ12ＮＯ5の要求値２９８。
【００４０】
Ｎ−アリールオキシフタルイミドの、対応するＯ−アリールヒドロキシルアミンへのヒドラジン分解のための代表的手順（方法１Ａ）：化合物１の合成。
ヒドラジン一水和物（０．４０１ｍＬ、８．２ｍｍｏｌ）を、Ｎ−フェノキシフタルイミド９（６５２ｍｇ、２．７３ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ3（２５ｍＬ）中１０％ＭｅＯＨ溶液にゆっくり添加し、反応物を室温にて攪拌した。完了すると（ＴＬＣモニタリング、１２時間）、無色の反応溶液中に白色の沈殿が現れた（フタリジン）。反応混合物をシリカゲルのプラグに通し、ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃで洗浄した。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを除去すると僅かに淡黄色の油状物質が生成され、それをＫ2ＣＯ3（＜１０ｍｇ）からクーゲルロール蒸留すると、純粋なフェノキシアミン１を透明な無色の油状物質として得た（２３８ｍｇ、８０％）；特性決定データについては下記参照。あるいは、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを除去した後、黄色の油状物質をＥｔ2Ｏに溶かし、０℃まで冷却した。０℃にて１０分後、ｐＨ３に達するまでジオキサン中４Ｎ ＨＣｌを滴下した。得られる白色の固体を濾過し、Ｅｔ2Ｏ（２×１０ｍＬ）で洗浄して１を純粋なＨＣｌ塩として得た（３０６ｍｇ、７７％）。
【００４１】
Ｏ−フェニルヒドロキシルアミン塩酸塩（１）。
１の調製は、上記に代表的手順（方法１Ａ）として記載した。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ６．８４−６．８９（ｍ，１Ｈ）、７．０３−７．０９（ｍ，２Ｈ）、７．１９−７．２５（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１１４．１、１２１．６、１３０．３、１６３．１；ＬＣ−ＭＳ １１０ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ8ＮＯの要求値１１０。
【００４２】
Ｏ−（３−トリフルオロメチルフェニル）ヒドロキシルアミン（６）。
Ｎ−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）フタルイミド１０（１．１２ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。蒸留（８５℃／６ｍｍ）により純粋な６を透明な無色の液体として得た（５８２ｍｇ、９０％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６．００（ｓ，２Ｈ）、７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３８（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５−７．４７（ｍ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１０．４、１１７．２、１１７．９、１３０．９、１６２．１；ＬＣ−ＭＳ １７８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ7Ｈ7Ｆ3ＮＯの要求値１７８。
【００４３】
Ｏ−（３，５−ジクロロフェニル）ヒドロキシルアミン（７）。
Ｎ−（３，５−ジクロロフェノキシ）フタルイミド１１（７１１ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。反応混合物をシリカゲルプラグからの溶出した結果、遊離塩基７が白色の固体として凝固した（３７８ｍｇ、９２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．９１（ｓ，２Ｈ）、６．９１−６．９３（ｍ，１Ｈ）、７．０６−７．０９（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１１２．９、１２１．９、１３５．９、１６３．２；ＬＣ−ＭＳ １７９ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ6Ｃｌ2ＮＯの要求値１７９。
【００４４】
Ｏ−（３，５−ジフルオロフェニル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（８）。
Ｎ−（３，５−ジフルオロフェノキシ）フタルイミド１２（１．７４ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付した。ＨＣｌ塩の沈殿により、８を白色の固体として得た（９８０ｍｇ、８６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ６．８３−６．９０（ｍ，３Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ９９．３（ｄｄ，ＪC-F＝８．０，２４．９Ｈｚ）、１０１．１（ｔ，ＪC-F＝２６．４Ｈｚ）、１６０．０、１６５．８（ｄｄ，ＪC-F＝１５，２４８Ｈｚ）；ＬＣ−ＭＳ １４６ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ6Ｈ6Ｆ2ＮＯの要求値１４６。
【００４５】
Ｏ−（３−メトキシカルボニルフェニル）ヒドロキシルアミン（１４）。
Ｎ−（３−メトキシカルボニルフェノキシ）フタルイミド１３（２７１ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）を、上記の代表的なヒドラジン分解反応（方法１Ａ）に付し、１４を淡黄色のシロップとして得た（１４６ｍｇ、９６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．９１（ｓ，３Ｈ）、５．９２（ｓ，２Ｈ）、７．２９−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．３３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．６３（ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．８２−７．８４（ｍ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５２．３、１１４．２、１１８．１、１２２．５、１２９．３、１３１．４、１６１．４、１６７．１；ＧＣ−ＭＳ １６７ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ8Ｈ9ＮＯ3の要求値１６７、１５２ ｍ／ｚ［Ｍ−ＮＨ］+、Ｃ8Ｈ8Ｏ3の要求値１５２。
【００４６】
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン（３）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（９１．０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を、Ｏ−（３−メトキシカルボニル−フェニル）ヒドロキシルアミン１４（９０．４ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの３／１／１ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。２４時間後、反応物をＨ2Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約３〜４に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（２５ｍＬ）および塩水（brine）（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して３を白色の固体として得た（７８．７ｍｇ、９５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ７．０１（ｓ，２Ｈ）、７．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．４，２．８，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４６（ｄｔ、Ｊ＝１．４、７．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．６８（ｄｄ，Ｊ＝１．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１３．５、１１７．８、１２１．３、１２９．２、１３１．８、１６１．７、１６７．３；ＥＳＩ−ＭＳ １６２ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ+］-、Ｃ7Ｈ6ＮＯ3の要求値１６２。
【００４７】
エチル−Ｎ−（２−トリフルオロメチルフェノキシ）アセトイミデート（１５）。
Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）の手順を用いて調製したtＢｕＯＫ（０．７８ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下、０℃にてエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（１．００ｇ、６．０６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６ｍＬ）中の攪拌溶液に添加した。tＢｕＯＫの添加が完了した後、反応物を室温にて攪拌した。３０分後、２−フルオロベンゾトリフルオリド（１．２９ｍＬ、６．０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を８０℃で２時間加熱した。冷却しながら反応混合物を氷水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水（brine）（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して暗色の油状物質を得た。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により、１５を透明な液体として得た（１．３３ｇ、８９％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）、２．１５（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、６．９９（明白なｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（明白なｄｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．５２−７．５７（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．３、１４．５、６３．２、１１４．２、１１６．２（ｑ，ＪC-F＝３１Ｈｚ）、１２０．３、１２３．７（ｑ，ＪC-F＝２７２Ｈｚ）、１２６．４（ｑ，ＪC-F＝４．８Ｈｚ）、１３３．２、１５７．２（ｑ，ＪC-F＝１．９Ｈｚ）、１６７．１；ＬＣ−ＭＳ ２４８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ13Ｆ3ＮＯ2の要求値２４８。
【００４８】
Ｏ−（２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（５）。
Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）の手順を用いて調製した７０％ ＨＣｌＯ4（１２ｍＬ）を、０℃にて１５（４．１４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１９ｍＬ）溶液に滴下し、次に反応物を室温にて一晩攪拌した。次に、反応混合物を氷水（１５０ｍＬ）に注ぎ、固体のＮａＯＨペレットでｐＨ１３に調節した。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を塩水（brine）（２×７５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して暗色の残渣を得た。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１５％ＥｔＯＡｃ）の後、他のアリールオキシアミンについて上に記載されるようにＨＣｌ塩が沈殿し、５を白色の固体として得た（３．４２ｇ、９６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ７．３７−７．４１（ｍ，１Ｈ）、７．４８−７．５１（ｍ，１Ｈ）、７．７６−７．７９（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１１４．６、１２５．０、１２６．３、１２７．６（ｑ，ＪC-F＝５．７Ｈｚ）、１２８．３ １３４．５；ＬＣ−ＭＳ １７８ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ7Ｈ7Ｆ3ＮＯの要求値１７８。
【００４９】
アリールオキシアミン１および５〜８に基づくオキシムエーテルのライブラリー合成。
ウェルフォーマット毎に単一の化合物でライブラリーを調製した。全てのアルデヒド（０．５Ｍ）およびアリールオキシアミン（０．４Ｍ）の保存溶液をＤＭＳＯ中に調製した。１ｍＬシリンジ、１．１ｍＬチューブ、および内径１３ｍｍのプローブを備えたＧｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いて全ての溶液を９６ウェル（容量２ｍＬ）ポリプロピレンプレートに０．３ｍＬ／分の速度で分注した。各オキシムエーテルの０．１Ｍ溶液を０．５ｍＬ作成するため、１００μＬ（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）のアルデヒド、１５６μＬ（０．６３ｍｍｏｌ、１．２５当量）のアリールオキシアミン、および２４４μＬの０．１６４Ｍ酢酸をプレートの各ウェルに分注した。プレートに蓋をして、デュアルアクションシェーカーを用いて室温にて２４時間攪拌した。反応物をＤＭＳＯ中７２０μＭに希釈し、ＬＣ−ＭＳで分析して収量、純度、および識別点を決定した。合成後、化合物を−２０℃で冷凍保存した。
【００５０】
反応混合物中に残っていたアルデヒドの積算値を用いて反応収量を測定した。全てのアルデヒドの較正曲線を作り、定量的に反応した全てのアルデヒドがオキシムエーテルを形成したと仮定して各オキシムエーテルの収量を計算した；すなわち、アルデヒドの５％が反応混合物中に残っていた場合、オキシムエーテルの収量は９５％となるとした。収量は９８〜１００％の範囲であり、全てのウェルで純度＞９５％であった。
【００５１】
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン３とアリールアルデヒドａ〜ｌの結合のための代表的手順（方法２）。
Ｏ−（３−カルボキシフェニル）ヒドロキシルアミン３（約０．２ｍｍｏｌ、１当量）の１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中の攪拌溶液に、アルデヒド（１当量）を添加した後、０．５Ｎ ＨＣｌを１滴添加し、次に反応物を室温にて攪拌した。逆相ＨＰＬＣで判定される反応完了の時点で（３〜１８時間）、反応物をＨ2Ｏ（１５ｍＬ）で希釈し、沈殿を濾過し、Ｈ2Ｏで洗浄し、回収し、真空乾燥した。具体的な合成の細部、および下の３ａについて報告されているものと同様の阻害剤３ｂ〜ｌの特性決定データについての裏付けとなる情報を参照のこと。
【００５２】
ベンズアルデヒド−Ｏ−（３−カルボキシフェニル）オキシム（３ａ）。
ベンズアルデヒド（２１．０μＬ、０．２０７ｍｍｏｌ）を、上に概説される３（３１．８ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）との代表的結合手順（方法２）に付し、３ａを白色の固体として得た（２９．０ｍｇ、５８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，１：１ＣＤ3ＯＤ：ｄ6−ＤＭＳＯ）δ７．３９−７．４５（ｍ，５Ｈ）、７．５９−７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．７８（ｍ，３Ｈ）、８．５８（ｓ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１４．５、１１８．８、１２３．３、１２７．７、１２９．１、１２９．３、１３０．８、１３１．１、１３２．３、１５３．３、１５８．９、１６６．９；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４２．０８１２ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ12ＮＯ3の要求値２４２．０８１２。ＲＰ−ＨＰＬＣ：純度９８％。
【００５３】
ベンジル−２−フルオロベンゾエート（１６）。
ベンジルアルコール（２．６０ｍＬ、２５．１ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下、室温にて２−フルオロ安息香酸（２．９２ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２５１ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）、および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．１６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2中の攪拌溶液にゆっくり添加した。１８時間後、沈殿を濾去し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、濾液をシリカで濃縮して粉末とした。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％〜２０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１６を透明な無色の液体として得た（４．２０ｇ、８８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．３９（ｓ，２Ｈ）、７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１，８．４，９．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．２０（ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１−７．３６（ｍ，１Ｈ）、７．３７−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４４−７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．４９−７．５５（ｍ，１Ｈ）、７．９６（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．３Ｈｚ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６６．９３、１１７．０（ｄ，ＪC-F＝２２．１Ｈｚ）、１１８．７（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１２４．０（ｄ，ＪC-F＝３．８Ｈｚ）、１２８．１、１２８．２、１２８．６、１３２．２、１３４．６（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１３５．７、１６２．１（ｄ，ＪC-F＝２６０Ｈｚ）、１６４．２（ｄ，ＪC-F＝３．８Ｈｚ）；ＧＣ−ＭＳ ２３０ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ14Ｈ11ＦＯ2の要求値２３０。
【００５４】
ベンジル−４−フルオロベンゾエート（１７）。
ベンジルアルコール（４．０５ｍＬ、３９．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、室温にて４−フルオロ安息香酸（５．００ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４３２ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）、および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８．１５ｇ、３９．５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2中の攪拌溶液にゆっくり添加した。１８時間後、反応物を、１６の合成に概説した手順に従って後処理した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により、１７を透明な無色の液体として得た（７．７５ｇ、９４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．３５（ｓ，２Ｈ）、７．０６−１４（ｍ，２Ｈ）、７．３２−７．４１（ｍ，３Ｈ）、７．４１−７．４７（ｍ，２Ｈ）、８．０６−８．１２（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ６６．８４、１１５．５（ｄ，ＪC-F＝２２．０Ｈｚ）、１２６．４（ｄ，ＪC-F＝２．９Ｈｚ）、１２８．２、１２８．３、１２８．６、１３２．３（ｄ，ＪC-F＝９．６Ｈｚ）、１３５．９、１６５．５、１６５．８（ｄ，ＪC-F＝２５３Ｈｚ）；ＧＣ−ＭＳ ２３０ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ14Ｈ11ＦＯ2の要求値２３０。
【００５５】
エチル−Ｎ−（２−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート（１８）。
エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（２．０６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）中の攪拌溶液に、Ａｒ下、tＢｕＯＫ（２．２１ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）を一度に添加した。３０分後、ベンジル−２−フルオロベンゾエート１６（４．１３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液として添加し、反応物を室温にて攪拌した。３時間後、反応物をＨ2Ｏ（４００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＨ2Ｏ（３×５０ｍＬ）および塩水(brine)（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５〜１０％勾配ＥｔＯＡｃ）により１８を透明なシロップとして得た（３．６１ｇ、６４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、４．１８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、６．９６（ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３０−７．３５（ｍ，１Ｈ）、７．３５−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．４２−７．４８（ｍ，３Ｈ）、７．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．１，８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．７Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．４、１４．５、６３．１、６６．６、１１４．５、１１７．０、１２０．４、１２８．２、１２８．４、１２８．５、１３１．７、１３３．８、１３６．１、１５９．５、１６５．８、１６６．７；ＧＣ−ＭＳ ３１３ ｍ／ｚ［Ｍ］+、Ｃ18Ｈ19ＮＯ4の要求値３１３、２２８ ｍ／ｚ［Ｍ−８５］+、ベンジル−２−ヒドロキシベンゾエート Ｃ14Ｈ12Ｏ3の要求値２２８。
【００５６】
エチル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート（１９）。
エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸（３．７９ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の攪拌溶液に、Ａｒ下、tＢｕＯＫ（４．０９ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を一度に添加した。４０分後、ベンジル−４−フルオロベンゾエート１７（７．６３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温にて攪拌した。４時間後、反応物をＨ2Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＨ2Ｏ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー精製（ヘキサン中５〜１０％勾配ＥｔＯＡｃ）により、１９を透明なシロップとして得た（６．０２ｇ、５８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、７．１５−７．１９（ｍ，２Ｈ）、７．３１−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３６−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４２−７．３６（ｍ，２Ｈ）、８．００−８．１４（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．３、１４．４、６３．１、６６．４、１１３．４、１２２．９、１２８．１、１２８．１、１２８．６、１３１．５、１３６．３、１６３．５、１６６．３、１６６．４；ＧＣ−ＭＳ ２２８ ｍ／ｚ［Ｍ−８５］+、ベンジル−４−ヒドロキシベンゾエート Ｃ14Ｈ12Ｏ3の要求値２２８。
【００５７】
エチル−Ｎ−（２−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート（２０）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（４３１ｍｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、エチル−Ｎ−（２−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート１８（８０２ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの９／３／３ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。６時間後、反応物をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×３０ｍＬ）で洗浄し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約５．０〜５．５に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（brine)（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して２０を白色の固体として得た（４５９ｍｇ、８０％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ１．３４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．１８（ｓ，３Ｈ）、４．２０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，７．３，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．８，７．３，８．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０（ｄｄ，Ｊ＝０．９，８．７Ｈｚ，１Ｈ）７．８６（ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ１４．６、１４．７、６３．８、１１５．２、１１８．５、１２１．３、１３２．４、１３４．５、１６０．２、１６６．８、１６７．４；ＥＳＩ−ＭＳ ２２４ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ14ＮＯ4の要求値２２４。
【００５８】
エチル−Ｎ−（４−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート（２１）。
ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（５５０ｍｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を、エチル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェノキシ）アセトイミデート１９（１．０４ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏの９／３／３ｍＬ混合物中の溶液に添加し、反応物を室温にて攪拌した。２４時間後、反応物をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×３０ｍＬ）で洗浄し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ約５．０〜５．５に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ2Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（brine)（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して２１を白色の結晶質固体として得た（６９８ｍｇ、９４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．１４（ｓ，３Ｈ）、４．２２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．１８−７．２２（ｍ，２Ｈ）、８．０４−８．０８（ｍ，２Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．５、１４．６、６３．３、１１３．７、１２２．１、１３２．３、１６４．２、１６６．７、１７２．０；ＥＳＩ−ＭＳ ２２４ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ11Ｈ14ＮＯ4の要求値２２４。
【００５９】
それぞれオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを生じる、エチル−Ｎ−（２−カルボキシフェノキシ）−アセトイミデート２０またはエチル−Ｎ−（４−カルボキシフェノキシ）アセトイミデート２１のアリールアルデヒドａ〜ｌとの結合のための代表的手順（方法３）。
アセトイミデート２０または２１（約０．１〜０．３ｍｍｏｌ、１当量）およびアルデヒド（約０．１〜０．３ｍｍｏｌ、１当量）の１，４−ジオキサン（２．０ｍＬ）溶液に、７０％ ＨＣｌＯ4（０．９当量）を添加し、反応物を室温にて攪拌した。逆相ＨＰＬＣで判定される反応完了の時点で（２〜６時間）、反応物をＨ2Ｏ（２０ｍＬ）で希釈し、沈殿を濾過し、Ｈ2Ｏで洗浄し、回収し、真空乾燥した。具体的な合成の細部、および下の２ａについて報告されているものと同様の阻害剤２ｃ〜ｌおよび４ｂ〜ｌの特性決定データについての裏付けとなる情報を参照のこと。
【００６０】
ベンズアルデヒド−Ｏ−（２−カルボキシフェニル）オキシム（２ａ）。
７０％ ＨＣｌＯ4（１４．０μＬ、０．１６３ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（１８．０ｍＬ、０．１７７ｍｍｏｌ）、および２０（３９．０ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を、上に概説される代表的結合手順（方法３）に付し、２ａを白色の固体として得た（２６．１ｍｇ、６２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ6−アセトン）δ７．１５（ｄｔ，Ｊ＝０．９，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４８−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５９（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３−７．８９（ｍ，３Ｈ）、８．６６（ｓ，１Ｈ）、１０．８−１１．５（幅広いｓ，１Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１１５．７、１１９．７、１２２．１、１２７．８、１２９．０、１３０．８、１３０．９、１３１．１、１３３．１、１５３．４、１５７．７、１６６．８；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ（ＤＨＢ）２４２．０８１１ ｍ／ｚ［ＭＨ］+、Ｃ14Ｈ12ＮＯ3の要求値２４２．０８１２。ＲＰ−ＨＰＬＣ：純度＞９９％。
【００６１】
線維形成アッセイ。
野生型ＴＴＲを、前述の大腸菌発現系（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０−１３５７３）から精製した。使い捨てキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ ＃１４ ３８５ ９３８）を、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２％ ＮａＮ3中、ＴＴＲ（７．２μＭ）の０．４ｍｇ／ｍＬ保存液４９５μＬで満たした。ＤＭＳＯ（１．４４ｍＭ）中５μＬの阻害剤をＴＴＲ溶液に添加し、試料を３７℃にて３０分間インキュベートした。次に、各キュベットに０．５ｍＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮａＮ3）を添加してｐＨを４．４まで下げた。キュベットを３７℃にて７２時間乱さずに静置し、次にボルテックスして沈殿を試料中に均一に分布した。濁度をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５３モデル ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で３５０および４００、または５００ｎｍで測定した。全ての試料は２通りまたは３通りに実行され、報告される結果は少なくとも３回の分析の代表例である。
【００６２】
オキシムエーテル阻害剤のヒト血漿中ＴＴＲへの分液
ヒト血漿におけるＴＴＲに対する阻害剤結合化学量論を評価するための抗体捕捉アプローチの手順は別の場所に詳細に記載されている（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。手短に言えば、ヒト血漿（１．５ｍＬ）を２ｍＬエッペンドルフチューブに添加し、その後に試験化合物の２．１６ｍＭ ＤＭＳＯ溶液７．５μＬを添加した。この溶液を３７℃にて２４時間インキュベートした（この時点で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ ＮａＮ3（ＴＳＡ）中、官能化されていないセファロース樹脂の１：１（ｖ：ｖ）スラリーは１８７μＬであった）。これを４℃にてさらに１時間インキュベートした後、遠心分離した。上清を４００μＬの分割単位へ３分割し、各分割単位に、ＴＳＡ中、抗ＴＴＲ抗体と複合体化したセファロース樹脂の１：１スラリー２００μＬを添加した。４℃にて２０分間穏やかに攪拌した後、試料を遠心分離し、上清を除去し、抗ＴＴＲ樹脂を４℃にて１ｍＬのＴＳＡ／０．０５％ サポニン（３×１０分）で、次に１ｍＬのＴＳＡ（２×１０分）で洗浄した。遠心分離および上清の除去の後、１５５μＬの１００ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）を添加してＴＴＲおよび結合した試験化合物を樹脂結合抗体から解離する。３０分後、懸濁液を遠心分離し、ＴＴＲおよび試験化合物を含有する上清１４５μＬを除去した。次に、上清（１３５μＬ）をＨＰＬＣに注入してＴＴＲと結合している小分子の化学量論量を測定した。ＨＰＬＣ条件下、試験化合物−ＴＴＲ複合体は解離し、小分子とタンパク質を分離させることができる。ＨＰＬＣ条件：８分間の２０〜１００％または４０〜１００％のいずれかの溶媒Ｂ勾配を用いる、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ ３ｃｍ Ｃ１８逆相カラム（溶媒Ａ：９５：５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、０．２５％ ＴＦＡ；溶媒Ｂ：５：９５ Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、０．２５％ＴＦＡ）。試験化合物およびＴＴＲの定量化は、標準曲線に対してクロマトグラムの統合されたピーク面積を比較することにより達成できる。つまり、ＴＴＲに対する試験化合物の量の比から結合化学量論量を得る（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。
【００６３】
分析用超遠心分離：オキシムエーテルを基にした阻害剤の存在下、線維形成条件下でのＴＴＲの沈降速度プロフィール分析。
線維形成アッセイで既に用いた試料（上記参照）の沈降分析をｐＨ４．４で行った。オキシムエーテル阻害剤８ｆの存在下および不在下での組換えＷＴ−ＴＴＲ溶液の沈降特性を、Ａｎ６０Ｔｉ 回転子および光電式スキャナーを備えた、温度制御されたＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ｉ 分析用超遠心機で分析した。０．００１ｃｍのステップサイズを用い、２８０ｎｍで検出する、２０℃にて連続モードで３，０００および５０，０００ｒｐｍの速度のデータを収集した。
【００６４】
直接境界を適合させるアプローチを適用して、ｐＨ４．４で７．２μＭの８ｆでインキュベートした３．６μＭのＴＴＲ溶液から生じた沈降速度データを評価した。Ｓｖｅｄｂｅｒｇというプログラムを用いて複数濃度を半径方向のデータセットに対して同時に適合させ、Ｌａｍｍ方程式に対する近似解を得た（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．；Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）。フィッティングアルゴリズムから、以下の方程式を用いて分子量をもたらす沈降係数および拡散係数を得た（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．；Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）
【数１】
（式中、ＭＷは分子量（Ｄａ）であり、ｓは沈降係数（スベドベリ、１０-13ｓ）であり、Ｒは普遍気体定数（８．３１４×１０7 ｅｒｇ／ｍｏｌ）であり、
【数２】
は偏比容（ｃｍ3／ｇ）であり、ρは溶媒密度（ｇ／ｃｍ3）である。バッファーの密度Ｄ（１．００８４８ｇ／ｃｍ3）を表形式データから計算し、ＷＴ−ＴＴＲ（０．７３４６ｃｍ3／ｇ）の偏比容をそのアミノ酸組成から計算した）。
【００６５】
分析用超遠心分離：オキシムエーテルを基にした阻害剤の存在下、線維形成条件下でのＴＴＲの沈降平衡分析。
線維形成アッセイで既に用いた試料（上記参照）の沈降分析をｐＨ４．４で行った。ＴＴＲ（３．６μＭ）およびオキシムエーテル８ｆ（７．２ｍＭ）の溶液１２０〜１４０μＬを、１２−ｍｍエポンセンターピースおよびサファイアもしくは石英窓を備えたダブルセクターセルに負荷することにより、沈降平衡測定を行った。最初に３，０００ｒｐｍの回転子速度でデータを収集して、最初に沈降する高分子量のオリゴマーが存在していないことを確認し、次に１７，０００ｒｐｍでセル全体に平衡を確立した。３時間おきに２８５〜２９０ｎｍでモニターした沈降プロフィールをオーバーレイして平衡が達成されたことを立証した。Ｂｅｃｋｍａｎ提供のオリジンソフトウェアパッケージ中の非線形最小二乗法を用いてデータ分析を行った。データをいくつかの異なるモデル（単一の理想的な種類および数個の多重な種類のモデルを含む）に合わせて、データに最も適合する最も単純なモデルを同定した。単一の理想的な種類のモデルに対応する以下の方程式は、理論上のデータと実験データ（前記）との間の僅かな差異に最も基づくデータに適合する。
【数３】
（式中、Ａrは半径ｘでの吸光度であり、Ａoは対照半径ｘo（通常メニスカス）での吸光度であり、
【数４】
はタンパク質の偏比容であり、ｒは溶媒の密度であり（ｇ／ｃｍ3）、ωは回転子の角速度であり（ラジアン／秒）、Ｅはベースラインエラー訂正因数であり、Ｍは分子量であり、Ｒは普遍気体定数である）。実験のデータポイントと適合したデータポイントとの間の差異（残差）を無作為に分散させると、差異の規模は小さかった（データが単一の理想的な種類のモデル（ＴＴＲ四量体）と適合した場合）。その他のモデルは、セル全体の残差を無作為でない分散で識別したため、データにうまく適合しなかった。
【００６６】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶化およびＸ線データ収集。
懸滴実験において、２Ｍ硫酸アンモニウムに対して平衡化したタンパク質溶液７ｍｇ／ｍＬ（１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．３５〜０．５０Ｍ硫酸アンモニウム）から、ＷＴ−ＴＴＲ結晶を得た。１０倍モル過剰の阻害剤５ｄで３週間を越えて浸漬したＷＴ−ＴＴＲ結晶からＴＴＲ・（５ｄ）2複合体を調製した。結晶を冷凍保護剤としてのパラトンオイル中に入れ、１００Ｋまで冷却した。単色の高エネルギー源の１４−ＢＭ−Ｃ、ＢＩＯＣＡＲＳ、Ａｄｖａｎｃｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅを備えたＱｕａｎｔｕｍ−４検出器を用いてデータ収集を行った。ＴＴＲ・（５ｄ）2の結晶は、単位格子寸法がａ＝４３Å、ｂ＝８５Å、およびｃ＝６６Åに近いアポＴＴＲ結晶形態（非対称単位中の２つの単量体を含む空間群Ｐ２1２1２）と同形である。ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣを用いてデータを減少させた（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．；Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ Ａ．Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ Ａ；Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ，Ｅｄｓ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，３０７−３２６）。
【００６７】
ＷＴ−ＴＴＲ・（５ｄ）2結晶構造の決定および精密化。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（受託番号１ＢＭＺ）から得たアポＴＴＲのタンパク質原子座標を、ＴＴＲ・（５ｄ）2の１．５３Åデータセットに対しＣＮＳの分子動力学およびエネルギー最小化プロトコールで精密化した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９８，５４，９０５−９２１）。得られる差フーリエ図は、外側の結合の空洞に有意な電子密度を示した；しかし、内部の空洞の阻害剤の電子密度は、おそらくその領域の柔軟性のため、電子密度図が１ｓ以下で輪郭が示される場合のみ目に見えた。不充分なリンカー密度にもかかわらず、リガンドは明確に配置することができ（外側の結合の空洞での電子密度のため）、結晶学的精密化に含まれた。結合チャネルを二分する２重の結晶学的回転軸のため、統計的無秩序モデルを適用して四量体ＴＴＲ毎に２つのリガンド結合モードを生じさせた。模擬アニーリングおよびその後の位置および温度因子の精密化を数サイクル繰り返した後、水分子を異なる差フーリエ図に置いた。震動／ゆがみバイアス除去プロトコールにより計算した不偏加重電子密度図を用いてマップフィッティングの最終サイクルを行った（Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００３，５９，２２００−２２１０）。各結合ポケットのリガンドの対称関連結合構造の双方は、不偏のアニールされたオミットマップならびに阻害剤の不在下で段階的に行われた震動／ゆがみ不偏加重図と充分一致していた。ＣＣＰ４−Ｒｅｆｍａｃを用いる最尤法により精密化の最終サイクルを行った（Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９４，５０，７６０−７６３；Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．；ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．１９９７，５３，２４０−２５５）。最終のマップには解釈可能な電子密度がなかったため、９つのＮ末端および３つのＣ末端残基は最終モデルに含まれなかった。結晶学的分析データの要約を表Ｓ４に示す。
【００６８】
図の詳細な説明
図１は、ビスアリールオキシムエーテル（Ｘ＝Ｏ）およびビスアリールヒドラゾン（Ｘ＝ＮＨ）ライブラリーの形成のための一般的アプローチを示す模式図である。この反応は、イミン結合に関して２つの立体異性体（ｓｙｎおよびａｎｔｉで示される、すなわち、アルデヒドプロトンがＸで表されるフェノキシ酸素に対してそれぞれｃｉｓまたはｔｒａｎｓに配向し得る）を作成する可能性があり得る；しかし、文献による先例に基づくとｓｙｎ−異性体のみが予期された（また観察された、本文参照）。
【００６９】
図２は、ビスアリールオキシムエーテルライブラリー（図１参照）を合成するために用いられるアリールオキシアミン（１〜８）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）構成成分の構造を示す。選択されたアリールオキシアミン（１〜８）は、アリールオキシアミン中にパラ−ＣＦ3（ｉ）およびチロキシンのような置換パターン（ｅおよびｆ）がないことを除いてアリールアルデヒドと同じ置換パターンを有した。残念ながら、市販されている唯一のアリールオキシアミンはフェノキシアミンである；従って、ビスアリールオキシムエーテルライブラリーを調製するために必要なアリールオキシアミンの構成単位の合成のための方法が開発され、本明細書において開示されていた。
【００７０】
図３は、ビスアリールヒドラゾンライブラリーを合成するために用いられるアリールヒドラジン（２２〜２９）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）化合物の構造を示す。類似するビスアリールオキシムエーテルおよびビスアリールヒドラゾン（以下、それぞれオキシムエーテルおよびヒドラゾンと称される）を互いに同じ構造であると仮定したので、このクラスも合成した。
【００７１】
図４は、線維形成の阻害について試験した９６種類のビスアリールヒドラゾンの活性を示す表である。ｐＨ４．４でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド線維形成（７２時間）に対するビスアリールヒドラゾン活性（７．２μＭ）。値は線維形成の程度を表し、従って阻害剤の不在下でのＷＴ−ＴＴＲ線維形成（１００％となるよう割り当てられる）に対する阻害剤の有効性を表す。完全な阻害は０％の線維形成に相当する。測定誤差は、±５％である。ハイスループット自動化手順により合成された全ての阻害剤は、ＲＰ−ＬＣＭＳにより純度＞９５％を示し、予測された質量が観察された。
【００７２】
図５は、オキシムエーテルおよびヒドラゾン阻害剤の構造を示す。オキシムエーテルとヒドラゾン構造の結晶学による比較により、類似の化合物が互いにほぼ重ね合わせることができることが明らかとなる。４種類の全ての結晶構造はｓｙｎ−イミン結合を示し、この異性体の優勢をさらに裏付ける。
【００７３】
図６は、必要とされるアリールオキシアミンの合成のための模式図である。Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）とアリールボロン酸の銅触媒による架橋により、ヒドラジン分解の後に所望のアリールオキシアミンが得られた（Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１３９−１４２）。Ｎ−ヒドロキシフタルイミドとアリールボロン酸の銅触媒による架橋：ａ）ＣｕＣｌ、ピリジン、４Å モレキュラーシーブス、１，２−ジクロロエタン；ｂ）Ｈ2ＮＮＨ2・Ｈ2Ｏ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3；ｃ）ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ。
【００７４】
図７は、オルト−トリフルオロメチルアリールオキシアミンの合成のための模式図である。この合成は、電子欠損フルオロベンゼンのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による芳香族求核置換を必要とする（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．１９９７，２９，５９４−６００）。２−トリフルオロメチルフルオロベンゼンへのエチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸の求核攻撃は優れた収量の１５（８９％）をもたらし、これはそのＨＣｌ塩として利用すると酸加水分解時にアリールオキシアミン５（収量９６％）をもたらした。この方法論の変化形を用いて、２および４の同等物に由来するオキシムエーテルを調製した（下記参照）。エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸による電子欠損フルオロベンゼンの芳香族求核置換：ｄ）tＢｕＯＫ、ＤＭＦ、８０℃；ｅ）ＨＣｌＯ4、１，４−ジオキサン。
【００７５】
図８は、従来通り合成し、ｍｇ量で単離したオキシムエーテルのＲＰ−ＨＰＬＣ純度の表である。高分解能ＭＳおよび1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲデータを含む、完全な構造特性決定データについては実験の項を参照のこと。ハイスループット自動化手順により合成された全ての阻害剤は、ＲＰ−ＬＣＭＳにより純度＞９５％を示し、予測された質量が観察された。
【００７６】
図９は、トランス−イミノ化アプローチによるビスアリールオキシムエーテルの合成を示す模式図である。ａ）ベンジルアルコール、ＤＣＣ、触媒ＤＭＡＰ、ＣＨ2Ｃｌ2；ｂ）エチル−Ｎ−ヒドロキシアセトイミド酸、tＢｕＯＫ、ＤＭＦ；ｃ）ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ；ｄ）Ｒ’−ベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）、７０％ ＨＣｌＯ4、１，４−ジオキサン。アリールアセトイミド酸は加水分解して対応するアリールオキシアミン２および４とならなかった。その代わり、アリールアセトイミド酸を酸性条件下で化学量論的な量のアリールアルデヒドと混合して、中程度から優れた収量のオキシムエーテル２ａ〜ｌおよび４ａ〜ｌを直接得た（オキシムエーテル２ｂは不安定な性質のために単離できなかった）。
【００７７】
図１０は、酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２μＭ）の阻害活性をまとめた表である。合成した９５種類のオキシムエーテルのうち、３１種類が良好な有効性を示し、阻害剤の不在下でＷＴ−ＴＴＲにより示されるものの＜１０％までＴＴＲアミロイド形成を低下させ（９０％の阻害、青色）、９種類が中程度の活性を示し（１１〜３０％の線維形成、緑色）、そして残りの５５種類は不良な活性を示した（黄色）。チロキシンのような置換パターンを有するベンズアルデヒドに由来するオキシムエーテル（ｅ列およびｆ列）は、たとえ非置換フェノキシアミンと結合した場合でも非常に有効である（１６種類全てが＞９０％の阻害を示した）。結合は、一般的に結果として弱いオキシムエーテル阻害剤となる。これらの結果は、阻害を達成するために双方の環に適切な置換基が必要とされるというこれまでの見解に挑戦する。
【００７８】
図１１は、酸に媒介される線維形成アッセイ（７２時間）の終わりに、残留しているオキシムエーテル阻害剤のパーセントを示す表である。阻害剤（７．２μＭ）を暗所で３．６μＭ ＷＴ−ＴＴＲの不在下で、さらに３．６μＭ ＷＴ−ＴＴＲとともにインキュベートした（ｐＨ４．４、３７℃）。５ｄ*エントリーのためのデータは、バッファーをｐＨ７．２で維持したことを除いて同一の条件下である。値は、アッセイの終了時点の阻害剤の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣピーク面積とアッセイの開始時点で得られるそれとを比較することにより決定された。測定誤差は、±４％である。最も安定していない阻害剤（１ｅ、１ｆ、２ｋ、３ｇ、５ｄ*）は、ＴＴＲの不在下で７２時間以内にほぼ完全に分解される；しかし、ＴＴＲの存在は初回量の＞７４％を保つ。特に、阻害剤５ｅはＴＴＲの存在下で分解を示さなかった。このことは、なぜ多くの不安定なビスアリールオキシム阻害剤がＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤であることが分かるのかを説明する助けとなる。つまり、阻害剤がＴＴＲの甲状腺ホルモン結合部位と結合してＴＴＲ四量体に動的な安定化を課すだけでなく（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３−７１６）、ＴＴＲ結合も阻害剤を分解に対して安定させる。
【００７９】
図１２は、ｐＨ４．４（７２時間）でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６μＭ）アミロイド線維形成に対する主なオキシムエーテルおよびヒドラゾンの分解および加水分解生成物（７．２μＭ）の阻害活性を示す表である。値は線維形成の程度を表し、従って阻害剤の不在下でのＷＴ−ＴＴＲ線維形成（１００％となるよう割り当てられる）に対する阻害剤の有効性を表す。完全な阻害は０％の線維形成に相当する。測定誤差は、±５％である。
【００８０】
図１３は、８ｆでプレインキュベートし（７．２μＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６μＭ）の沈降速度（Ａ）のグラフである。Ａ．速度分析−５０，０００ｒｐｍにて約１５分別々に得たデータセットの重ね合わせ。データ（記号）は、ＭＷ４８．４±０．２ｋＤａの単一の理想的な種類のモデル（実線）に適合する。
【００８１】
図１４は、８ｆでプレインキュベートし（７．２μＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６μＭ）の平衡超遠心法研究のグラフである。平衡分析−１７，０００ｒｐｍの速度で２４時間後に観察された平衡濃度勾配。データ（○）は、ＭＷ５２．１±０．２ｋＤａの単一の理想的な種類のモデル（実線）に適合する。残差、つまり実験データと適合データとの間の差異を挿入図に示す。
【００８２】
図１５は、血漿ＴＴＲに対して＞９０％のアミロイド阻害（７．２μＭ）を示すビスアリールオキシムエーテルの結合化学量論量の下限値を示す表である。ヒト血漿中のＴＴＲに対するビスアリールオキシムエーテル結合化学量論量。ＴＴＲを様々なオキシムエーテル（１０．８μＭ）で処理し、抗体捕捉／ＨＰＬＣ法により化学量論量を測定した。この方法は、洗浄に関連する損失のため最小の結合化学量論量をもたらす（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２００１，９８，５５６６−５５７１）。試験した３１種類の化合物のうち、１１種類が１．０を超えるＴＴＲ結合化学量論量を示し、３種類が１．５当量を越える結合を示す。最も高い結合化学量論量を示すオキシムエーテルは、１つの芳香環がチロキシンのような置換パターン（例えば３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ）を１つ有するアルデヒドに由来する。この結果は、３，５−ジハロ−４−ヒドロキシ置換アリール環の組み込みが、大多数のその他の血漿タンパク質（ＴＴＲよりも約１５０倍高い濃度を有するチロキシン輸送タンパク質アルブミンを含む）を上回る血漿結合選択性をＴＴＲに与えることを意味するので、非常に重要である（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｄｅｇｒｏｏｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９４，１３１４−１３２６；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，６４４０−６４４５）。
【００８３】
図１６は、Ｘ線結晶学的データに基づく、双方のＷＴ−ＴＴＲチロキシン結合空洞（白色の四角形部分）と結合したビスアリールオキシムエーテル５ｄを表すリボン図を示す。部位の中の１つの拡大図（上部）は、対称性に関連のあるその結合モードの双方にある５ｄ（緑色および白色）と、灰色で示されたＴＴＲ結合部位表面を示す。主要な残基およびハロゲン結合ポケット（ＨＢＰ）は標識されている；刺激された残基またはＨＢＰおよび未刺激の残基またはＨＢＰは２つの隣接する対称性に関連のある、Ｔ4部位を含む単量体にあてはまる。外側の結合ポケットのカルボン酸塩置換基がＬｙｓ−１５ε−ＮＨ3+基と静電相互作用していると思われる。
【００８４】
図１７は、オキシムエーテル５ｄで浸漬したＷＴ−ＴＴＲのＸ線結晶構造データを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ビスアリールオキシムエーテル（Ｘ＝Ｏ）およびビスアリールヒドラゾン（Ｘ＝ＮＨ）ライブラリーの形成のための一般的なアプローチを示す模式図である。
【図２】ビスアリールオキシムエーテルライブラリー（図１参照）を合成するために用いられるアリールオキシアミン（１〜８）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）の構成成分の構造を示す。
【図３】ビスアリールヒドラゾンライブラリーを合成するために用いられるアリールヒドラジン（２２〜２９）およびベンズアルデヒド（ａ〜ｌ）化合物の構造を示す。
【図４】線維形成の阻害について試験した９６種類のビスアリールヒドラゾンの活性を示す表である。
【図５】オキシムエーテルおよびヒドラゾン阻害剤の構造を示す。
【図６】必要とされるアリールオキシアミンの合成の模式図である。
【図７】オルト−トリフルオロメチルアリールオキシアミンの合成の模式図である。
【図８】従来通り合成し、ｍｇ量で単離したオキシムエーテルのＲＰ−ＨＰＬＣ純度を示す表である。
【図９】トランス−イミノ化アプローチによるビスアリールオキシムエーテルの合成を示す模式図である。
【図１０】酸に媒介される（ｐＨ４．４）ＴＴＲ（３．６ｍＭ）アミロイド形成に対する、オキシムエーテル（７．２ｍＭ）の阻害活性をまとめた表を示す。
【図１１】酸に媒介される線維形成アッセイ（７２時間）の終わりに、残留しているオキシムエーテル阻害剤のパーセントを示す表である。
【図１２】ｐＨ４．４でのＷＴ−ＴＴＲ（３．６ｍＭ）アミロイド線維形成（７２時間）に対する主なオキシムエーテルおよびヒドラゾンの分解および加水分解生成物（７．２ｍＭ）の阻害活性を示す表である。
【図１３】８ｆでプレインキュベートし（７．２ｍＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６ｍＭ）の沈降速度（Ａ）を示すグラフである。
【図１４】８ｆでプレインキュベートし（７．２ｍＭ；３０分）、ｐＨ４．４にて７２時間の変性ストレス後に評価したＴＴＲ（３．６ｍＭ）の平衡超遠心法研究を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ’は、存在しないか、または
−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｉ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、およびＣＦ3
からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；
Ｒは、存在しないか、または
−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、およびＣＦ3
からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；かつ
Ｘは、−ＮＨ−および−Ｏ−からなる群から選択されるジラジカルである）
で表される、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項２】
Ｘが−Ｏ−である、請求項１に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項３】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項１に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項４】
式ＩＩ
【化２】
（式中、ラジカルＡは以下の群：
【化３】
から選択される）
で表される、請求項２または３に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項５】
Ｘが−Ｏ−である、請求項４に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項６】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項４に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項７】
式ＩＩＩ
【化４】
（式中、ラジカルＢは以下の群：
【化５】
から選択される）
で表される、請求項１に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項８】
Ｘが−Ｏ−である、請求項７に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項９】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項７に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項１０】
トランスサイレチンのアミロイド線維の形成を阻害するための方法であって、トランスサイレチンを阻害濃度の請求項１〜１０のいずれか一項に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンと接触させる段階を含む、方法。
【請求項１】
以下の式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ’は、存在しないか、または
−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｉ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、およびＣＦ3
からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；
Ｒは、存在しないか、または
−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、およびＣＦ3
からなる群から選択される１個以上のラジカルであり；かつ
Ｘは、−ＮＨ−および−Ｏ−からなる群から選択されるジラジカルである）
で表される、ビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項２】
Ｘが−Ｏ−である、請求項１に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項３】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項１に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項４】
式ＩＩ
【化２】
（式中、ラジカルＡは以下の群：
【化３】
から選択される）
で表される、請求項２または３に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項５】
Ｘが−Ｏ−である、請求項４に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項６】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項４に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項７】
式ＩＩＩ
【化４】
（式中、ラジカルＢは以下の群：
【化５】
から選択される）
で表される、請求項１に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾン。
【請求項８】
Ｘが−Ｏ−である、請求項７に記載のビスアリールオキシムエーテル。
【請求項９】
Ｘが−ＮＨ−である、請求項７に記載のビスアリールヒドラゾン。
【請求項１０】
トランスサイレチンのアミロイド線維の形成を阻害するための方法であって、トランスサイレチンを阻害濃度の請求項１〜１０のいずれか一項に記載のビスアリールオキシムエーテルまたはビスアリールヒドラゾンと接触させる段階を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００８−５３０１０４（Ｐ２００８−５３０１０４Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５２０６（Ｐ２００７−５５５２０６）
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００４５１２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８６５１７
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００４５１２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８６５１７
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]