ナノキャリアに基づいたトランスフェクション及び形質導入植物
本発明は植物細胞の形質導入及び／又はトランスフェクションのための新規方法を提供する。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は多細胞接合胚と同様に単一植物細胞小胞子へたんぱく質及びオリゴヌクレオチドの送達するためのナノキャリアとして使用するのに成功した。ＣＰＰ内在化の効果及びたんぱく質及び／又はオリゴヌクレオチドを含む高分子カーゴのさらなる送達は接合胚の透過化によって高めるることができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞透過性ペプチドを使用した植物の形質転換のための新規方法及び新規組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特有の形質を示す植物の新種を開発するための従来の植物育成戦略は多大な時間がかかり、そして時々予測し得ない。近年、植物遺伝子形質転換のための方法の開発並びに有用な遺伝子及びそれら生成物の同定及び入手可能性の増化は、それら生成物の望まれる形質を発現させる植物の急速な開発を可能にしている。しかしながら、改良された方法の必要性が未だ残っている。アグロバクテリア媒介形質転換及び粒子衝突のような現在の戦略は、細胞組織及び遺伝子型に大きく依存している。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は新規であり、並びに哺乳類及びヒトの細胞株中の生体膜を越えてたんぱく質及びＤＮＡを含むカーゴ複合体の幅広い範囲の輸送における重要な役割として働くことが知られている短ペプチドの分野で急速に成長している（シュバルツ及びチャン、２０００；ランゲル、２００２；ビベス、２００２）。
【０００３】
ＨＩＶ−１ ＴＡＴたんぱく質形質導入領域（ＰＴＤ）は最もよく研究されている輸送ペプチドの１つである。最近の報告には、哺乳類の細胞における負帯電ＤＮＡとの複合体形成によるプラスミド配送のためのＴＡＴ−ＰＴＤ及びそのオリゴマーの可能性を示している（イグナトビッチら、２００３；ルドルフら、２００３；シプラシビリら、２００３；ヘルグレンら、２００４）。輸送特性を有することを示している他のペプチドはｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、ｐｅｐ−１ペプチド及びそれらの断片を含む。
【０００４】
ＣＰＰに仲介された輸送に関する先行技術のいくつかは以下に議論される。米国特許出願公開２００４／０１２１３２５号明細書は、組み替え植物、又はキシロシルトランスフェラーゼ活性を有する若しくはそれに補完するたんぱく質のためのコードの配列を発現する植物細胞の生産方法が記載されている。
【０００５】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５１１７９９２号パンフレットには、標的細胞への化合物の送達を制御するための組成物が開示されている。前記組成物は細胞透過性ペプチド、細胞透過性ペプチド抑制剤、複合物、及びペプチド抑制剤が細胞透過性ペプチドの輸送活性を阻害する切断部位が含まれる。切断剤による切断部位の切断は細胞透過性ペプチドを脱抑制し、及び脱抑制された細胞透過性ペプチドは目標細胞へ化合物を輸送することを可能にする。しかしながら。この適用は植物細胞の形質転換を開示していない。
【０００６】
米国特許出願公開第２００５／０２６０７５６号明細書は、細胞への二重螺旋ＲＮＡ分子の送達を促進するための膜透過性複合体を開示しいている。前記複合体は、二重螺旋ＲＮＡと細胞透過性ペプチドとを結合している共有結合を有する、二重螺旋ＲＡＮ分子及び細胞透過性ペプチドを含む。この開示は神経細胞の形質転換に限られている。
【０００７】
アンナマライら（ＦＥＢＳ レターズ ５６６（２００４）３０７）は、転写後遺伝子抑制のためのｄｓＲＮＡの送達のためのカチオン性オリゴペプチドポリアルギニンの使用を開示している。
【０００８】
ＣＰＰは哺乳類細胞におけるカーゴ送達を促進することを示している一方、トランスフェクション研究のための植物細胞におけるＣＰＰの使用はいくつかの要因によって制限される。植物にこの技術を適応するための主となる障害は、動物細胞と異なり、植物細胞は
ＣＰＰ及びそれらカーゴの内在化のための二重障害システム（細胞壁及び細胞膜）を示すことである。従って、ＣＰＰは、有効な転座のためにこれら二つの障害に打ち勝たなければならない。
【０００９】
植物ゲノムシークエンシング計画からのますます増加する情報とともに、遺伝子の幅広い配列の機能性ゲノム研究ための、及び望まれる形質を発現する遺伝子組み換え植物の開発のため植物における、素早く、普遍的な方法（組織／遺伝子型と独立した）の開発の緊急な要求がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は遺伝子及び／又はたんぱく質を植物細胞へ送達する新規方法のための要求に取り組んでいる。細胞透過性ペプチドは植物細胞の内部へ所望のカーゴを送達するために使用されていた。
【００１１】
本発明の一態様において、植物細胞へのカーゴ部分の送達のための方法を提供する。この方法は、植物細胞をキャリア部分と結合している少なくとも1つのカーゴ部分を含む複
合体に露出させることを含む。前記植物細胞は好ましくは体細胞又は配偶体細胞である。
【００１２】
好ましい一つの態様において、キャリア部分は、細胞透過性及び核酸結合性を有するポリペプチドである。さらに好ましい態様は、キャリア部分が核局在化シグナルを含有する。
【００１３】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１ペプチド、及びそれらの断片からなる群から選択され得る。細胞透過性を有する他のキャリアはまた、本発明の方法に使用され得る。好ましい態様は、キャリア部分がｔａｔ又はその断片のたんぱく質形質導入領域（ＰＴＤ）、好ましくはＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４９乃至５７を含む。
【００１４】
本発明の一態様において、カーゴ部分は核酸を含む。前記核酸は、ｍＲＡＮ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体、又はそれらの組み合わせを含み得る。好ましい一態様において、核酸はＤＮＡである。他の好ましい態様において、核酸はＲＮＡである。
【００１５】
本発明の他の態様において、カーゴ部分はポリペプチドである。好ましい一態様において、ポリペプチドは細胞代謝を変えるたんぱく質をコードする。たんぱく質はたんぱく質又はその活性領域に関連した胚形成をなし得る。たんぱく質は相同組み換え遺伝子又はその活性領域と関連するポリペプチドであり得る。
【００１６】
本発明の別の態様において、カーゴ部分はまた、さらなるポリペプチド及び／又は核酸の組み合わせを含む。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、体細胞性植物細胞（ａｓｏｍａｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）は複合体の内在化を促進するために細胞透過化剤で前処理される。好ましい透過化剤はトルエンである。
【００１８】
本発明の前記方法に加えて、本発明はまた、植物細胞への活性物質の輸送を仲介するための複合体を提供する。複合体はキャリア部分に結合したカーゴ部分を含むものであって、キャリア部分は植物細胞中へ複合体を送達することができる。
【００１９】
好ましい態様において、カーゴ部分は核酸であり及びキャリア部分は核内在化シグナルを包含する。他の態様において、複合体はカーゴ部分及びキャリア部分からなる融合たんぱく質を含む。標識たんぱく質が複合体の内在化を追跡するために含まれ得る。様々な他種のたんぱく質、例えば部位特異的組込みと関連するたんぱく質もしくは胚形成たんぱく質又はそれらの活性領域は、複合体中に含み得る。
【００２０】
他の好ましい態様において、上記方法はトランスフェクト剤、例えばリポフェクタミン、の添加を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明の方法及び構築体を使用して生産された組み換え遺伝子植物種及び単一の植物細胞を提供する。
【００２２】
本発明のこれら及び他の特徴は添付した図面を参照する下記説明から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は本発明の態様に従うフルオレセイン化された複合体の転座に関する透過性の効果を示す。
【図２】図２は小胞子における摂取Ｔａｔを実証する。
【図３】図３は透過化胚における様々なＣＰＰの効果を実証する。
【図４】図４は透過化胚におけるＴａｔ−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図５】図５は透過化胚におけるＴａｔ２−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図６】図６は透過化胚におけるＰｅｐ−１−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図７】図７は小胞子におけるＰｅｐ−１−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図８】図８は透過化胚におけるｇｕｓ遺伝子発現を実証する。
【図９】図９はＴａｔ−ＤＮＡ複合体で処理された小胞子からの植物を示す。
【図１０】図１０はｇｕｓ遺伝子発現に関するリポフェクタミンの効果を図解する。
【図１１Ａ】図１１ＡはＣＰＰ及びＤＮＡの異なる処理の効果を示す。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＤＮＡ及びＲｅｃＡの種々の組み合わせの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
植物細胞の細胞進入障壁を越えて外来核酸又はポリペプチドの送達は困難である。成功する機会は植物組織をトルエンのような細胞の透過化剤で処理することにより改善されるが、しかしその形質転換の割合は未だに低いままである（マハラクシュミら、２０００）。
【００２５】
本発明は植物細胞へのカーゴの送達のための新規方法を提供する。カーゴは標的細胞において発現する核酸分子であり得、及びポリペプチドであり得る。カーゴは植物細胞への送達を追跡するための標識を含み得る。
【００２６】
本発明の方法において、カーゴは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と結合し、また本明細書において「キャリア」又は「キャリア部分」として呼ばれる。キャリアはカーゴと複合体を形成し、そしてカーゴを細胞中へ運ぶ。
【００２７】
つまり、キャリア部分及びカーゴ部分を含む複合体は作りだされた。キャリア部分は植物細胞膜及び／又は細胞壁を横断することができる作用物質である。
【００２８】
本発明に使用される好ましいキャリアは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。本発明の方法及び複合体に使用されるＣＰＰは、ＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１、及びそれらの断片が含まれるがこれらに制限されない。
【００２９】
カーゴ部分は核酸又はポリペプチドであり得る。キャリアと結合し得る核酸の例は、ｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体、又はそれらの組み合わせを含む。好ましい一態様において、核酸はＤＮＡである。他の好ましい一態様において、核酸はＲＮＡである。キャリアと複合体を形成し得るポリペプチドの例としては、どのたんぱく質又はそのポリペプチド断片を含み得る。例えば、たんぱく質は植物又は植物細胞の表現型を修飾する作用物質であり得る。それはある種のペスト又は除草剤に対する耐性を与えるたんぱく質であり得る。前記ポリペプチドは細胞代謝を変えるたんぱく質、例えばたんぱく質に関する胚形成、部位特異的組込みを含むたんぱく質をコード化しえる。
【００３０】
本発明のキャリア−カーゴ複合体は共有結合及び／又は静電的結合によって種々の方法において形成されることができる。また、複合体はＣＰＰ及びカーゴ、例えばＰｅｐ−１と複合体を形成したＲｅｃＡで被覆されたＤＮＡ、の組合せで作りだされ得る。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、細胞はまずは透過化剤で処理される。移送の驚くほど高い割合がＣＰＰの使用を伴う透過化技術と組み合わせることによって達成できる。透過化処理は、ＣＰＰ単独の輸送に役立たることが可能な、又は細胞壁及び細胞膜によるサイズ制限を克服することによるキャリア−カーゴ複合体として、原形質膜の一時的なポア形成を生じる。又一方で、透過化剤での前処理は全種類の植物細胞に要求されないことは明らか理解される。例えば、小胞子はいずれの全透過化段階なしにキャリア−カーゴ複合体を使用した形質転換を効果的にできる。
【００３２】
種々の透過化剤がキャリア−カーゴ複合体の輸送を増進するために使用されることができる。トルエン及びエタノールを含む透過化溶液は、特に効果的であることを示されている。
【００３３】
いくつかの典型的な実験結果は、本発明の方法及び組成物の効果を実証するために添付した図面に示された。
【００３４】
ここで図１を参照することで、透過化の効果を実証した一連の顕微鏡写真を示す。ライ小麦 ｃｖ ＡＣ Ａｌｔａの未成熟の胚中の蛍光標識化されたＴＡＴ−ＰＴＤの輸送は蛍光顕微鏡によって可視化された。この結果は透過化緩衝液（Ａ）のみで培養化された対照胚及びトルエン透過化緩衝液（Ｂ）で処理した胚は蛍光発色しなかったことを実証した。ＦＩＴＣ−標識化デキストラン硫酸塩（Ｃ）のみで処理した胚は標識化デキストラン硫酸塩のいずれの顕著な取り込みも実証されなかった。一方で、細胞の透過化剤（Ｄ）の存在下においてＦＩＴＣ−標識化デキストランで処理した胚は確かに、蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤのみの（Ｅ）で処理された胚のように、いくらかの蛍光発色を実証した。しかしながら、最も顕著な取り込みは、細胞の透過化剤の存在下で蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤで処理した胚で観察された。このことは、細胞透過化がＴＡＴ−ＰＴＤのような細胞透過性ペプチドの使用を伴う場合、移送の高い効果を実証する。この図１に示した結果は、未成熟の胚の透過化が細胞透過性ペプチドの効果的な輸送を促進することの実証する。
【００３５】
しかしながら、透過化は総ての細胞種にとって必須というわけではない。図２は単一の小胞子による蛍光標識化Ｔａｔの取り込みを図示する。これらの結果はＴａｔ ＣＰＰが細胞中へ透過することができることを示唆する。
【００３６】
種々異なる型の細胞透過性ペプチドが本発明の方法に有用であった。表１は研究された
いくつかのＣＰＰを示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
これらペプチドに関して、Ｎ末端基は“ＦＩ”で示されたように蛍光標識化された。トランスポータンペプチドは、１３番リシンとつながるＮ末端における神経ペプチドガラニンからＣ末端にハチ毒マストパランからの１４番アミノ酸へとつながる１２アミノ酸を含むキメラペプチドである。ｐＶＥＣペプチドはマウス血管内皮カドヘリン（アミノ酸６１５−６３２）から送達された。ＴＡＴ−ＰＴＤペプチドはＨＩＶ−１ ＴＡＴたんぱく質形質導入領域を含む。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２は、未成熟の及び成熟胚が種々の細胞透過性ペプチドに露出された場合に観察された相対的な蛍光発色を示す。
【００４１】
同様の結果が図３にグラフで表されている。この結果は、成熟及び未成熟の胚の両方に生じる種々のペプチドの輸送を示す。輸送の効率は、細胞がトルエンのような透過化剤に露出されたときに、向上する。トルエンは透過化の効果を示す典型的な物質として使用されているが、他の透過化剤も同効果を達成するために使用されることができることは明らかである。３つの異なるＣＰＰを使用している表２及び図３の結果は、他のＣＰＰもまた本発明の方法に有益であるという妥当な予測を示す。
【００４２】
研究された3種のペプチド全ての輸送における顕著な増加が生じたことから、接合体胚
によって生じた細胞障壁はトルエンで組織を透過化させることによって超えられることができることを、この結果は示す。ＦＩＴＣ標識化デキストラン硫酸塩は、それが細胞透過化能を有さないので、陰性対照としての機能を果たす。他の陰性対照としては、Ｍ−ｔａｔもまた、ＣＰＰによる透過化は配列依存性の高いことを示唆している著しく減少した蛍光を示す。
【００４３】
ＧＵＳレポーターシステム（ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ）は植物分子生物学の技術分野においてよく知られているレポーターシステムである。このレポーターシステムは細胞透過化の効果、並びにたんぱく質形質導入及び遺伝子トランスフェクションの効率を高めるのためにＣＰＰの使用を実証するために使用された。
【００４４】
図４は透過化された胚におけるＴａｔ−ＧＵＳ酵素複合体の取り込みを図示している。この顕微鏡写真はたんぱく質形質導入の高効率な方法を明らかに実証している。取り込みをさらに高めるために、Ｔａｔ２ ＣＰＰは特注で合成され、Ｔａｔ２はＨＩＶ ＴａｔのＰＴＤの１８アミノ酸ダイマーである。ＣＰＰとしてのＴａｔ２を使用したこの結果は図５に示されている。本発明の方法に使用することができる他のＣＰＰを再度実証するために、Ｐｅｐ−１−ＧＵＳ酵素複合体は調製された。図６に示されている顕微鏡写真は、この複合体を使用している透過化された未成熟の胚における効果的なたんぱく質形質導入があることを図示している。図６Ａは対照の胚であり、及び図６ＢはＰｅｐ−１による仲介されたＧＵＳ酵素送達を図示している。たんぱく質カーゴの送達のためのＣＰＰとしてのＰｅｐ−１の効率をさらに実証するために、小胞体は同じ複合体で取り扱われ、そして結果は図７に示される。
【００４５】
上記のように、試験されたＣＰＰの輸送は透過化された成熟及び未成熟の胚においてより良好であった。ＴＡＴ−ＰＴＤは未成熟胚の胚域に明らかに蓄積し、そしてＴＡＴ−ＰＴＤの取り込みは未成熟胚における透過処理の後に最高水準（４．７倍）まで増加した。さらに、ＴＡＴ−ＰＴＤは、植物細胞／組織における遺伝子送達のための適したキャリアを形成するためにＤＮＡと結合するための可能性を伴うアルギニンリッチである。
【００４６】
さらなる研究において、ＴＡＴ−ＰＴＤ−プラスミドＤＮＡ複合体は透過化された胚におけるプラスミドによってコード化されたｇｕｓ遺伝子発現を誘導するためのその能力を評価された。その結果は図８に示され、及びＣＰＰ−プラスミドＤＮＡ複合体が植物細胞において発現のための遺伝子を送達するために使用されることができることを明らかに示唆している。透過化胚におけるＧＵＳトランス遺伝子発現は非透過化胚における発現よりも著しく高い。このことは、細胞の透過化がＣＰＰに仲介されたカーゴ複合体の輸送における重要な役割を果たすことを、強く示唆する。この結果はまた、複合体形成及び透過化が輸送されたカーゴ成分の生物学的活性を危険にさらさないことを示唆する。
【００４７】
遺伝子トランスフェクションのための本発明の方法の効率はＴａｔ／Ｔａｔ２−ＤＮＡ複合体を使用してさらに実証された。ＤＮＡは除草剤耐性遺伝子を運ぶ。小胞子はトランスフェクトされ、及び植物が生み出された。図９は、トランス遺伝子植物が本発明の方法
を使用して生み出されることができることを図示している。
【００４８】
植物遺伝子トランスフェクションの効率は、リポフェクタミンのような他の知られているトランスフェクション促進剤を含むことによってさらに高めることができる。リポフェクタミンがＣＰＰ−ＤＮＡ複合体で処理された透過化細胞に加えられた場合、その効率はなお一層向上した。図１０に示された結果は、Ｔａｔ：ＤＮＡ複合体を形成することにより、トランスフェクション割合はリポフェクタミン担体がトランスフェクト剤として使用された場合より高くなる。また一方で、リポフェクタミンとＣＰＰ−ＤＮＡ複合体との組み合わせは最も効果的であった。
【００４９】
ｇｕｓ遺伝子及びたんぱく質リポートシステムがこのシステムの効果を実証するために使用されてきているが、ＧＵＳのような大きな分子が移送可能であり、及び複合体遺伝子生成物が本発明の方法を使用して発現可能ならば、他のたんぱく質は移送可能で、及び他の遺伝子もトランスフェクト可能である、ということは明らかである。
【００５０】
本発明の方法はまた、たんぱく質と植物細胞とを関連付けられた胚形成の形質導入のために使用されている。このことは、胚形成を誘発し及び標識として作用できる。このことはまた、植物細胞へ送達するたんぱく質の新規及び一般的な方法を提供する。興味のあるたんぱく質及び遺伝子に関連する胚形成の共送達は植物遺伝子工学の新規方法を提供する。
【００５１】
詳細に説明された方法の変化もまた包含される。例えば、ペプチドと核酸又は他のオルガネラ局在領域はＣＰＰ−カーゴ複合体に組み込まれ得る。
【００５２】
現在、一種以上の好ましい態様が実施例の方法によって記載されている。いくつもの変化及び修飾が特許請求の範囲に定義された発明の範囲から逸脱しないで行うことができるのは、当業者に明らかであろう。
【００５３】
上記の公開は本発明を一般的に説明する。先の説明を用いて、当業者は、本発明の組成物を作成及び使用し、並びに本発明の方法を実施することができることが確信される。さらに完全に理解することは、下記の詳細な実施例を参照することによって得られえる。これら実施例は単に本発明の好ましい態様を説明するために記載され、及び本発明の範囲を制限することを目的としているものではない。形態及び相当物の置換基の変化は、詳細が方法を提案又は表し得るように、考慮される。他の一般的な形態は当業者にとって明らかである。本明細書で参照される特許又は特許出願等の文献は参照されることによって本明細書に組み込まれた。
【００５４】
専門用語がこれら実施例において使用されるが、そのような用語は記述的な趣旨において意図されており、限定の目的のためではない。微生物学及び物理学の手法は本公開に明白に記載されていないことに言及し、及びこれらの実施例は科学文献に報告され、及び当技術者には周知である。
【実施例１】
【００５５】
実施例１．植物細胞の調製
成熟胚
成熟胚（小麦ｃｖ ＡＣ スパーブ）を単離し、及び表面をマハラクシミら（２０００）による記載のように滅菌した。この滅菌した胚を使用前に１時間、層流フード中で風乾した。
【００５６】
未成熟胚
胚を開花後２週間の穂（胚盤径１−２ｍｍ）から単離した。未成熟種の表面を７０％エタノールで３０秒間殺菌し、続いて、１０％次亜塩素酸塩（クロレックス）と１滴のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）で３分間処理した。滅菌水で各１分間の洗浄を４回した。胚を殺菌下で手で切開した。単離された胚をＣＰＰ輸送研究前に、室温で暗室中に２４時間、ＧＥＭ培地（ユードら、２００３）に置いた。単離された小胞子をアムンセン及びユード、２００５の記載どおり準備した。
【００５７】
実施例２．細胞透過化剤を使用した接合胚における蛍光標識された細胞透過性ペプチドの輸送
ペプチドを特注で合成し、及びＮ末端アミノ基を蛍光標識した（アルバータペプチド機関、カナダ）（表１）。ＦＩＴＣ−デキストラン硫酸塩（４，０００ｋＤａ、シグマアルドリッチ社）及び変異Ｔａｔを陰性対照として使用した。
【００５８】
単離及び殺菌した胚（２０−２５）に、細胞透過化剤トルエン／エタノール（１：４）を透過化緩衝液に対して１：２０の割合で含む透過化緩衝液（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）全量４２０μＬを吸収させた。これに、１ｍMの蛍光標識されたＣＰＰ２．１μＬを加え、５μＭの最終濃度とした。陰性対照にお
いては、胚をＦＩＴＣデキストラン硫酸塩又はＭ−Ｔａｔで処理した。胚を１時間の間、暗所中室温で透過化緩衝液中で混合しながら培養し、続いて透過化緩衝溶液で２回洗浄した。次に、フリーペプチド分子を除去するために、５分間室温で透過化緩衝液に対して１：２の割合でトリプシン：ＥＤＴＡ（０．２５％溶液、シグマ−アルドリッチ社）で胚を処理した。胚を透過化緩衝液で２回洗浄し、そして蛍光顕微鏡検査法か又は蛍光分光分析の対象とした。
【００５９】
蛍光顕微鏡検査法
細胞透過性ペプチドでの処理及び遊離した、細胞外ペプチドの酵素分解後の胚は蛍光顕微鏡検査法に従って可視蛍光が観察された（ＧＦＰフィルタ；励起光４７０ｎｍ／蛍光５２５ｎｍ；ライカ社製、ドイツ国）
【００６０】
蛍光標識されたペプチドの輸送は蛍光顕微鏡検査法に従う観察されたような成熟及び未成熟の胚の両方における透過化剤（トルエン）の存在下において著しく増加する（図１及び表２）。ＦＩＴＣ−デキストラン硫酸塩及びＭ−Ｔａｔで処理されることを含む陰性対照は全くないかとても弱い蛍光発光を示した（図１Ａ−Ｄ）。一般的に、未成熟胚の蛍光強度は透過化及び非透過化条件の両条件下において成熟胚よりも優れていた（表２；図３）。３種のペプチド研究のうち、ｐＶＥＣは細胞透過化剤で処理された胚でさえ、最小の取り込みを示した。興味深いことに、他の２つのペプチドによる透過化胚の処理は蛍光発色の均一な分布を示したけれども、ＴＡＴ−ＰＴＤで処理された透過化未成熟胚は胚盤における異なる層の蓄積、及び胚の胚芽域における局所的な蓄積を示した（図１Ｆ）。
【００６１】
蛍光光度分析法
蛍光分析のために、胚を１％トリトンＸ−１００（透過化緩衝液で調製）５００μＬ、３０分、４℃で処理した。その上清を新しいチューブに集め、そして異なるＣＰＰで胚による相対蛍光摂取を蛍光光度計（バイオラッド、バーサフルーア（Ｖｅｒｓａｆｌｕｏｒ）、アメリカ国、励起光４９０／蛍光５２０）によって評価した。
【００６２】
蛍光分析はまた細胞透過化剤、トルエンで処理された胚における細胞透過性ペプチドの輸送において著しい増大を示した（図３Ａ、Ｂ）。未成熟胚は透過化及び非透過化の未成熟胚において総てのペプチドに関して相関蛍光摂取の高い水準を示した。特に、未成熟胚中のＴＡＴ−ＰＴＤは非透過化の胚と比較して透過化された胚において４．７倍の高い相対蛍光を示した。トランスポータン及びｐＶＥＣ転座はまた、透過化未成熟胚において１
．８倍及び１．７倍の増加であった（図３Ｂ）。しかしながら、蛍光分析は、透過化の及び非透過化の胚中のＴＡＴ−ＰＴＤに関する目視観測と比較したとおりに、トランスポータンの相対的に優れた輸送を明らかにした。
【００６３】
実施例３．透過化未成熟胚によるＣＰＰ−プラスミドＤＮＡ複合体摂取
ＣＰＰ−ＤＮＡ複合体研究のために、非蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤをＤＮＡ（ｐＡｃｔ−１ＧＵＳ）と複合体を形成するために用いた。プラスミドＤＮＡ及びＴＡＴ−ＰＴＤは、透過化緩衝液で１００μＬまで全量をあわせながら、１：１０の比率（５μｇＤＮＡ：５０μｇＴＡＴ−ＰＴＤ、両者とも最適水中に保存）で共に混合された。混合液を添加する前に、透過化緩衝液を吸収した胚を室温で１時間培養した。緩衝液に対して１：２０の比率の透過化剤（トルエン）を胚へ複合体を添加する直前に添加した。胚を１時間の間、透過化剤の存在下においてＴＡＴ−ＰＴＤ及びＤＮＡ複合体と共に培養し、続いて透過化緩衝液で２回洗浄した。胚をセフォタキシムを２５０μｇ／ｍＬ含むＧＥＭ上に、２５度暗所中で３日培養器で培養した。
【００６４】
未成熟胚を、いずれの内因性ＧＵＳ発現を避けるために２０％メタノールを添加したＧＵＳヒストケミカル緩衝溶液（ジェファーソン，１９８７）中、３７度で一晩の間培養した。ＧＵＳ発現％は（ＧＵＳ発現している処理した胚の数／処理した胚の全数）×１００として計算した。
【００６５】
細胞透過化剤の存在下においてＴＡＴ−ＰＴＤ−プラスミドＤＮＡ複合体と培養した未成熟胚は、非処理の陰性対照がいずれのＧＵＳ発現を示さなかったのに対して、一時的なＧＵＳ発現（１２％、図８）を示した。透過化剤の添加なしに、単にＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＮＡ複合体のみで処理した胚は、未成熟胚においてＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＮＡ複合体の取り込みの促進において透過化剤の役割を示すいずれのＧＵＳ発現を示さなかった。
【００６６】
実施例４．種々の植物組織によるＣＰＰ摂取
ライ小麦種を洗浄剤で洗浄し、そして湿綿上で１週間成長させた。根端、葉頂、葉脚及び子葉鞘を切断し、そして５μＬの蛍光標識化されたｐＶＥＣ、スクランブルｐＶＥＣ、及びトランスポータンとともに培養した。根端及び葉客が最大の摂取を示し、続いて子葉鞘及び葉頂であった。トランスポータンは最大の蛍光発光を示し、続いてｐＶＥＣ、スクランブルｐＶＥＣであり、そしてＣＰＰを添加しなかった対照であった。
【００６７】
実施例５．未成熟胚におけるＧＵＳ酵素のＣＰＰ媒介送達
トルエンで透過化したライ小麦未成熟胚を、透過化緩衝液中で１時間の間ＣＰＰ（Ｔａｔ又はＴａｔ２又はＲ９）−ＧＵＳ酵素混合物（４：１ ｗ／ｗ）で処理した。Ｐｅｐ−１に対して、哺乳類動物細胞株中へのたんぱく質形質導入のために計画されたアクティブモチーフ製（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）のチャリオットキット（Ｃｈａｒｉｏｔ ｋｉｔ）に従って行った。ＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体を各々４：１の割合で調製し、そして室温で１時間培養した。処理した胚は、過剰の及び非内在のＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体の分解のために、５分間室温でトリプシン消化（１：１ トリプシン：透過化緩衝液）した。透過化緩衝液で３回洗浄した後、胚を、処理された未成熟胚に青色の出現のために、２０％メタノール含有ＧＵＳヒストケミカル緩衝液（コスギら、１９９０）中３７度で３時間乃至一晩培養した。
【００６８】
実施例６．小胞市中のＧＵＳ酵素のＣＰＰ−仲介送達
ライ小麦小胞子を、ＮＰＢ−９９培地中１時間の間ＣＰＰ（Ｐｅｐ−１、Ｔａｔ、Ｔａｔ２、Ｒ９）及びＧＵＳ酵素複合体（４：１）で処理した。ＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体は先の実施例の記載のように調製した。２回洗浄した後、トリプシン（１：１ ＮＰＢ−９９培地を用いて）消化を５分間室温で行った。小胞子を、小胞子における青色の発現のた
めに３７度で３時間から一晩の間２０％メタノール含有ＧＵＳヒストケミカル緩衝液（コスギら、１９９０）中で培養した。陽性の小胞子は主として小胞中にＧＵＳの蓄積が示された。
【００６９】
実施例７．オニオン表皮細胞におけるＧＵＳ酵素のＣＰＰ−仲介送達
ＣＰＰ Ｒ９による機能的に活性なＧＵＳ酵素の送達のための能力を、玉葱表皮細胞においても研究した。Ｒ９の複合体及びＧＵＳは１乃至４：１の範囲の割合で、先の実施例に従い調製した。玉葱表皮細胞を１時間の間複合体と培養し、ｐＨ７．２のリン酸生理食塩水で３回洗浄した。複合体で処理された細胞は３７℃で３時間ＧＵＳヒストケミカル緩衝液で培養条件で青色の発現した。４：１の割合が最大の青色を示した。
【００７０】
実施例８．胚発生小胞子中のｂａｒ遺伝子のＣＰＰ−仲介送達
ライ小麦小胞子を、室温で１乃至２時間、ＣＰＰ（Ｔａｔ／Ｔａｔ２）と、‘ｔａｐ’プロモーター及びｎｏｓターミネーターによって誘導された断片をコード化する除草剤（ｂｅｒ）遺伝子との複合体で処理した。複合体をｔａｔ／ｔａｔ２及びＤＮＡの４：１（ｗ／ｗ）の割合で調製し、１時間培養し、続いてリポフェクタミン２０００試薬を５−１０μｇ添加した。細胞をＮＰＢ−９９培地で２回洗浄しそしてさらに、子房の存在下ＮＰＢ−９９培地と１０％のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）中で胚発生のために培養した（ユード及びアムンセン、２００５）。
【００７１】
Ｔａｔ／ｔａｔ２ ＤＮＡ複合体＋リポフェクタミンで処理したＰＣＲ陽性カルス（ｃａｌｌｉ）が下記表３中に示された通りに得られた。
【表３】
【００７２】
実施例９．ライ小麦中のＰＨＢ遺伝子
小胞子単離のためのライ小麦腋芽はそれら根元を蒸留水中に及びそれら頭頂部をアルミホイルでつつみ、３週間冷蔵庫（４℃）で保存した。３週±３日の後、単一核小胞子期の半ばから後半を、以前に採取したアセトカルミン染色剤を使用したメジアンフローレットから検証した。NPB99培地の１ｍLあたり２．５×１０5の細胞となるように調製された精
製小胞子懸濁液を得るためにユード及びアムンセン（２００５）に刊行された様にライ小麦へ、小胞子を運んだ。
【００７３】
葉緑体又はミトコンドリアのための２種の輸送ペプチドをＰＨＢ代謝経路の酵素をコードする３種の遺伝子とともにフレーム単位でクローンした。同一の輸送ペプチドを含む等モル量の３種の遺伝子のカセットを同時トランスフェクションに使用した。滅菌水１００μＬに希釈された全ＤＮＡの１μｇを１００μＬに希釈されたＴａｔ２ ４μｇに添加し
、そして穏やかに攪拌し、結果として混合液中のＤＮＡと細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
の１：４の割合を生じた。複合体を室温で３０分間培養した後に、続いてリポフェクタミン５μＬを加え、室温で５分間培養した。２ｍＬ微小遠心管中の上清を除いた混合物を小胞子に加えた。小胞子を１５分間の間キャリア−カーゴ複合体とともに培養し、そしてＮＰＢ−９９の１００μＬを添加し、続いて室温以上で４５分間培養した。トランスフェクトされた小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、次いで遠心分離しそして上清を除去した。１０００μＬのＮＰＢ−９９を２ｍＬ微小遠心管に加え、穏やかに攪拌し続いて５００ｍＬを、セフォタキシム含有のＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマ社 Ｆ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）３ｍLを含む３５ｍｍのペトリ皿中にピペットでとった。
【００７４】
植物から直接採取した同様に滅菌した穂からの４個又は５個の子房を小胞子を含む各々の皿に加えた。皿をパラフィルムで封止し、そして１５０ｍｍペトリ皿中の滅菌蒸留水を含む蓋のない５０ｍｍペトリ皿のまわりにおいた。次いで１５０ｍｍ皿もパラフィルムで封止し、そして暗所中、２８℃で２０乃至３０日間培養した。小胞子培養、胚培養及び植物培養の間、一切抽出を使用しなかった。
【００７５】
再生植物を３種のトランス遺伝子の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。ＲＮＡは、興味ある３種の遺伝子に関してＰＣＲで陽性であった植物から抽出した。ｃＤＮＡは、この選択された植物から成長し、そしてＰＣＲは３種のトランス遺伝子の発現の確認のために実施した。結果は表４に示した。
【表４】
【００７６】
実施例１０．ライ小麦小胞子におけるＤＮＡ−たんぱく質の共輸送
小胞子単離のためのライ小麦腋芽を、それら根元を蒸留水中にいれ及びそれら頭頂部をアルミホイルでつつみ、３週間冷蔵庫（４℃）で保存した。３週±３日の後、単一核小胞子期の半ばから後半を、以前に採取したアセトカルミン染色剤を使用したメジアンフローレットから検証した。ＮＰＢ９９培地の１ｍＬあたり２．５×１０5の細胞となるように
調製された精製小胞子けん濁液を得るためにユード及びアムンセン（２００５）に刊行されたライ小麦へ、単離した小胞子を運んだ。
【００７７】
プラスミド（ｐＡｃｔ−１ ＧＵＳ、〜７．２ｋｂ）をＰｓｔｌ制限酵素を用いて線形化し、そしてＤＮＡをＰＣＲ生成物精製キット（キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、米国）によって精製した。ＧＵＳ ＤＮＡを下記７つの異なる処理（Ｔ）に従い得た。これら実験を５回繰り返した。
Ｔ１）対照：対照処理は滅菌水２００μＬである。
Ｔ２）ＧＵＳ ＤＮＡのみ：２００μＬの滅菌水で希釈したＧＵＳ ＤＮＡ（シグマアルドリッチ）１μｇ。
Ｔ３）ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡ：滅菌水１００μＬに希釈したＤＮＡ１μｇを、１００μＬに希釈したＲｅｃＡ４μｇへ添加し、そして穏やかに攪拌し、混合物中１：４の割合のたんぱく質とＤＮＡを得た。
Ｔ４）ＤＮＡ−Ｔａｔ２：滅菌水１００μＬに希釈したＤＮＡ１μｇを１００μＬに希
釈したＴａｔ２ ４μｇに加え、そして穏やかに攪拌し、結果として、混合物中１：４の割合のＤＮＡと細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をもたらした。
Ｔ５）ＤＮＡ−チャリオットキット：チャリオットたんぱく質形質導入キットを用いたＧＵＳ ＤＮＡを操作手順（アクティブ モチーフ社、米国）により形質転換した。ＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水１００μＬ中に希釈し、そしてチャリオットの６μＬを滅菌水１００μＬに希釈した。ＧＵＳ ＤＮＡ溶液を２ｍＬの微小遠心管中のチャリオット溶液に加え、最終容量を２００μＬにした。
Ｔ６）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオットキット：ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡ溶液をチャリオットたんぱく質形質導入キットを使用して小胞子中に送達し、操作手順は以下に従った。ＲｅｃＡ４μｇを滅菌水５０μＬに希釈し、及びＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水５０μＬに希釈した。ＲｅｃＡ溶液をＤＮＡ溶液に加え、そして１５分間培養した。チャリオット６μＬを滅菌水１００μＬに希釈した。チャリオット溶液を、２ｍＬ微小遠心管中に最終体積が２００μＬになるようにＤＮＡ−ＲｅｃＡ容器にピペットで加えた。
Ｔ７）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２：ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡをＴａｔ２によって小胞子中に送達した。ＲｅｃＡ４μｇを滅菌水５０μＬに希釈し、そしてＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水５０μＬ中に希釈した。ＲｅｃＡ溶液をＤＮＡ溶液に加え、そして１５分間培養した。Ｔａｔ２ ４μｇを滅菌水１００μＬに希釈した。そしてＴａｔ２溶液をＤＮＡ−ＲｅｃＡ溶液中へ加え、２ｍＬ微小遠心管中、最終体積を２００μＬとした。
【００７８】
複合体を１５分間室温で培養し、続いてリポフェクタミン５μLを添加し５分間室温で
培養した。混合物を２ｍLの微小遠心管中の上清を除いて小胞子のみへ添加した。小胞子
をキャリア−カーゴ複合体と１５分間培養し、ＮＰＢ−９９ １００μＬを添加し、さらに４５分以上室温で培養した。トランスフェクトされた小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、遠心分離し、そして上清を除去した。ＮＰＢ−９９ １０００μＬを２ｍＬ微小遠心管に加え、穏やかに混合した。５００ｍＬを、セフォタキシム含有のＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマ社 Ｆ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）３ｍLを含む３５ｍｍのペ
トリ皿中にピペットでとった。
【００７９】
植物から直接採取した同様に滅菌した穂からの４個又は５個の子房を、小胞子を含む各々の皿に加えた。皿をパラフィルムで封止し、そして１５０ｍｍペトリ皿中の滅菌蒸留水を含む蓋のない５０ｍｍペトリ皿のまわりにおいた。次いで１５０ｍｍ皿もパラフィルムで封止し、そして暗所中、２８℃で２０乃至３０日間培養した。
【００８０】
０．５ｍｍより大きい胚をペトリ皿から取り除き、そしてＧＥＭ培地（１０ｃｍのペトリ皿に２０ｍＬ：ユードら、２００３）上で培養した。ペトリ皿をパラフィルムで封止し、１６℃の室温で８０μMｍ-2ｓ-1を送達しているシルバニアグロ−ラックス（Ｓｙｌｖ
ａｎｉａ Ｇｒｏ−ｌｕｘ）広帯域電球（４０ワット）（１６時間で点灯終了）の３０ｃｍ下に設置した。胚が緑色に変化した時点で、同じ条件で、マジェンダ容器中の根付け培地５０ｍＬ上に無菌で移した。植物が２乃至３枚葉段階に達し、及び根が充分な根が生長した時点で、植物を４×８スペンサー−ルーメル育苗箱（スペンサー−ルーメル インダストリー リミテッド、エドモントン）に移し、母植物のように同じ条件で育成棚に置いた。開花後２週間に、倍数性を結実の状態を調べることによって推定した。
【００８１】
４〜５週間で、胚をＧＵＳ組織化学分析を行った。分析は２００ｍＬのＧＵＳ組織化学的緩衝液（５００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ マンニトール、２ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃ、ｐＨ７．０）を小胞子に添加し、続いて３７℃、暗所、一晩で培養することによって実施された。染色剤溶液は除去され、そして胚はＰＢＳによって除去した。青色を示す小胞子はＣＰＰによってＧＵＳ酵素を外生的な取り込みの活性を示唆する。各々の処理における青染色胚の割合は立体顕微鏡を使用して算定した。
【００８２】
胚におけるＴａｔ２及びチャリオットの明らかな転座はトランスフェクションの２ヵ月後に観察された（表５）。ＧＵＳは陰性対照、未処理の小胞子中には観察されなかった。Ｔａｔ２及びチャリオットでの処理でＧＵＳを示した最も高い数の胚は各々２５．８及び２６．４％であった（表５）。２番目の頻度の青染色胚はＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２を用いた処理で観察された。リポフェクタミンを用いた、ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ処理は低頻度で小胞子へのトランスフェクト可能である。これらの研究は、異なるＤＮＡとたんぱく質との複合体がライ小麦小胞子中に内在化されたことを示している。
【００８３】
表５．トランスフェクション後２ヶ月の遺伝子形質転換のための７種の異なる処理により作り出された胚を発現したＧＵＳの総数。
Ｔ１）対照、未処理の胚；Ｔ２）ＤＮＡ；３）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ；Ｔ４）ＤＮＡ−ＴＡｔ２；Ｔ５）ＤＮＡ−チャリオット；Ｔ６）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット；Ｔ７）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２
【表５】
【００８４】
実施例１１：ＤＮアーゼＩ保護アッセイ及び遅延度アッセイ
ＣＰＰ−ＧＵＳ ＤＮＡ複合体を、ライ小麦小胞子ＤＮＡ（Ｔ２）及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ（Ｔ３）中のＤＮＡ及びＣＰＰ複合体の実施例１０における送達のために記述される通りに調製した。リポフェタミンなしであるが、ＤＮアーゼＩ保護アッセイは、ライ小麦小胞子中にＤＮＡとＣＰＰの複合体のＤＮＡ（Ｔ２）及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ（Ｔ３）送達のために記述される通りに機能した。２０分間のペプチド−ＤＮＡの培養後直ちに、ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ−フリーＤＮアーゼセット、キアゲン、米国）４μＬを混合物容積（２００μＬ）へ添加し、そして室温で１５分間培養し、続いて氷上で５分間培養した。ペプチド−プラスミド解離及びプラスミド精製はＤＮＡ精製キット（クイアクイック ＰＣＲ精製キット）を使用して行った。
【００８５】
DNAに対応するバンド（７．２ｋｂ）は明らかに可視化されたので、リポフェクタミン
を伴う、ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲｅｃＡ、ＤＮＡ−Ｔａｔ２、ＤＮＡ−チャリオット、ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット、及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２は感知できるほど保護されており、一方、リポフェクタミンを伴わないＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ複合体はヌクレアーゼで処理されたＤＮＡの分解のもたらしたことを、ＤＮアーゼＩ保護アッセイは示した（図１１Ａ）。
【００８６】
ＲｅｃＡ−ＧＵＳ ＤＮＡ複合体はライ小麦小胞体中へＤＮＡ及びＣＰＰ複合体の送達のために記述されたとおりに調製された。ＧＵＳ ＤＮＡ １μＬを１：０、１：４、１：８、１：１２、１：１６、１：２０及び１：２４の比率になるように異なる濃度のＲｅ
ｃＡたんぱく質に混合した。リポフェクタミンなしに２０分間培養した後、複合体２０μＬを１％アガロースゲルに塗布した。
【００８７】
ＤＮＡ−ＲｅｃＡ複合体のためのゲル遅延度アッセイは、スメアーな蛍光発色が１：８及びその高い割合並びにＧＵＳ ＤＮＡで観察されることを示し、線形プラスミドＤＮＡの減少した移動度に関してＲｅｃＡの高濃度の影響を示唆する（図１１Ｂ）。ＲｅｄＡ１：８及び高い比率でｄｓＤＮＡに結合した。
【００８８】
図１１ＡはＣＰＰ−ＤＮＡ複合体構造を示す。（Ａ）ＣＰＰ及びＤＮＡの組み合わせの異なる処理はＤＮアーゼ保護アッセイのために試験された。Ｔ１）対照、Ｔ２）ＤＮＡ、及びＴ３）リポフェクタミンなしのＤＮＡ−ＲｅｃＡ；Ｔ４）ＤＮＡ、Ｔ５）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ、Ｔ６）ＤＮＡ−Ｔａｔ２、Ｔ７）ＤＮＡ−チャリオット、Ｔ８）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット、及びＴ９）リポフェクタミンとＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２。図１１ＢはＤＮＡ及びＲｅｃＡの種々の濃度の効果を示す。
【００８９】
実施例１２．小麦小胞子ヘトランスフェクトされたアピンループ遺伝子構造
ＴａＡＯＳ遺伝子（ＡＹ１９６００４）はヘアピンループ技術を使用した小麦中のサイレンシングジャスモン酸（ＪＡ）経路として考えられる。２７ｍｅｒシークエンスｇｇｃｃａｔｃｃｇｃｇａｃｃｇｃｃｔｃｇａｃｔｔｃｔａはセンス鎖として選択された。アクチンプロモータ及びＮＯＳターミネータ間の複製された完全遺伝子シークエンスはＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＣＴであった。
【００９０】
滅菌水１００μＬに希釈された総ＤＮＡ１μｇを１００μＬに希釈したＴａｔ２ ４μｇに添加し、そして穏やかに混合し、混合物中、１：４の割合のＤＮＡ及び細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を結果として得た。３０分間室温で複合体培養に続いて、リポフェクタミン５μＬを湿塩で５分間かけて加えた。混合物は２ｍＬの微小遠心管に上清を除いて小胞子にだけ加えた。
【００９１】
小麦栽培品種（フィールダ社）からの小胞子は前の実施例を示されたように集められ、１５分間キャリア−カーゴ複合体とともに培養された。１００μＬのＮＰＢ−９９を添加し、そして混合物を４５分間以上室温で培養した。トランスフェクト化した小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、遠心分離し、そして上清を除去した。１０００μＬのＮＰＢ−９９を２ｍＬ微小遠心管に加え、そして穏やかに攪拌した。５００μＬをセフォタキシムを含む３ｍＬのＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマＦ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）を含む３５ｍｍペトリ皿へピペットで取った。小胞子及び胚は上記実施例の記載通りに培養した。
【００９２】
全９０の小植物を小胞子の２つの抽出からの培養から生産した。土壌に適用させた初日の間に、５５の植物が死んだ。一度、土壌と中空の不純物に露出された小植物死亡の非常に高い割合は、ＪＡサイレンシングの発現に関連している。再生植物（３５）をトランス遺伝子の存在のためにＰＣＲによって検査した。これら植物の３つがトランス遺伝子に対してＰＣＲ陽性であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１２１３２５号明細書
【特許文献２】国際公開２００５１１７９９２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２６０７５６号明細書
【非特許文献】
【００９４】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ レターズ、２００４年、５６６号、ｐ３０７
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞透過性ペプチドを使用した植物の形質転換のための新規方法及び新規組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特有の形質を示す植物の新種を開発するための従来の植物育成戦略は多大な時間がかかり、そして時々予測し得ない。近年、植物遺伝子形質転換のための方法の開発並びに有用な遺伝子及びそれら生成物の同定及び入手可能性の増化は、それら生成物の望まれる形質を発現させる植物の急速な開発を可能にしている。しかしながら、改良された方法の必要性が未だ残っている。アグロバクテリア媒介形質転換及び粒子衝突のような現在の戦略は、細胞組織及び遺伝子型に大きく依存している。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は新規であり、並びに哺乳類及びヒトの細胞株中の生体膜を越えてたんぱく質及びＤＮＡを含むカーゴ複合体の幅広い範囲の輸送における重要な役割として働くことが知られている短ペプチドの分野で急速に成長している（シュバルツ及びチャン、２０００；ランゲル、２００２；ビベス、２００２）。
【０００３】
ＨＩＶ−１ ＴＡＴたんぱく質形質導入領域（ＰＴＤ）は最もよく研究されている輸送ペプチドの１つである。最近の報告には、哺乳類の細胞における負帯電ＤＮＡとの複合体形成によるプラスミド配送のためのＴＡＴ−ＰＴＤ及びそのオリゴマーの可能性を示している（イグナトビッチら、２００３；ルドルフら、２００３；シプラシビリら、２００３；ヘルグレンら、２００４）。輸送特性を有することを示している他のペプチドはｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、ｐｅｐ−１ペプチド及びそれらの断片を含む。
【０００４】
ＣＰＰに仲介された輸送に関する先行技術のいくつかは以下に議論される。米国特許出願公開２００４／０１２１３２５号明細書は、組み替え植物、又はキシロシルトランスフェラーゼ活性を有する若しくはそれに補完するたんぱく質のためのコードの配列を発現する植物細胞の生産方法が記載されている。
【０００５】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５１１７９９２号パンフレットには、標的細胞への化合物の送達を制御するための組成物が開示されている。前記組成物は細胞透過性ペプチド、細胞透過性ペプチド抑制剤、複合物、及びペプチド抑制剤が細胞透過性ペプチドの輸送活性を阻害する切断部位が含まれる。切断剤による切断部位の切断は細胞透過性ペプチドを脱抑制し、及び脱抑制された細胞透過性ペプチドは目標細胞へ化合物を輸送することを可能にする。しかしながら。この適用は植物細胞の形質転換を開示していない。
【０００６】
米国特許出願公開第２００５／０２６０７５６号明細書は、細胞への二重螺旋ＲＮＡ分子の送達を促進するための膜透過性複合体を開示しいている。前記複合体は、二重螺旋ＲＮＡと細胞透過性ペプチドとを結合している共有結合を有する、二重螺旋ＲＡＮ分子及び細胞透過性ペプチドを含む。この開示は神経細胞の形質転換に限られている。
【０００７】
アンナマライら（ＦＥＢＳ レターズ ５６６（２００４）３０７）は、転写後遺伝子抑制のためのｄｓＲＮＡの送達のためのカチオン性オリゴペプチドポリアルギニンの使用を開示している。
【０００８】
ＣＰＰは哺乳類細胞におけるカーゴ送達を促進することを示している一方、トランスフェクション研究のための植物細胞におけるＣＰＰの使用はいくつかの要因によって制限される。植物にこの技術を適応するための主となる障害は、動物細胞と異なり、植物細胞は
ＣＰＰ及びそれらカーゴの内在化のための二重障害システム（細胞壁及び細胞膜）を示すことである。従って、ＣＰＰは、有効な転座のためにこれら二つの障害に打ち勝たなければならない。
【０００９】
植物ゲノムシークエンシング計画からのますます増加する情報とともに、遺伝子の幅広い配列の機能性ゲノム研究ための、及び望まれる形質を発現する遺伝子組み換え植物の開発のため植物における、素早く、普遍的な方法（組織／遺伝子型と独立した）の開発の緊急な要求がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は遺伝子及び／又はたんぱく質を植物細胞へ送達する新規方法のための要求に取り組んでいる。細胞透過性ペプチドは植物細胞の内部へ所望のカーゴを送達するために使用されていた。
【００１１】
本発明の一態様において、植物細胞へのカーゴ部分の送達のための方法を提供する。この方法は、植物細胞をキャリア部分と結合している少なくとも1つのカーゴ部分を含む複
合体に露出させることを含む。前記植物細胞は好ましくは体細胞又は配偶体細胞である。
【００１２】
好ましい一つの態様において、キャリア部分は、細胞透過性及び核酸結合性を有するポリペプチドである。さらに好ましい態様は、キャリア部分が核局在化シグナルを含有する。
【００１３】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１ペプチド、及びそれらの断片からなる群から選択され得る。細胞透過性を有する他のキャリアはまた、本発明の方法に使用され得る。好ましい態様は、キャリア部分がｔａｔ又はその断片のたんぱく質形質導入領域（ＰＴＤ）、好ましくはＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４９乃至５７を含む。
【００１４】
本発明の一態様において、カーゴ部分は核酸を含む。前記核酸は、ｍＲＡＮ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体、又はそれらの組み合わせを含み得る。好ましい一態様において、核酸はＤＮＡである。他の好ましい態様において、核酸はＲＮＡである。
【００１５】
本発明の他の態様において、カーゴ部分はポリペプチドである。好ましい一態様において、ポリペプチドは細胞代謝を変えるたんぱく質をコードする。たんぱく質はたんぱく質又はその活性領域に関連した胚形成をなし得る。たんぱく質は相同組み換え遺伝子又はその活性領域と関連するポリペプチドであり得る。
【００１６】
本発明の別の態様において、カーゴ部分はまた、さらなるポリペプチド及び／又は核酸の組み合わせを含む。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、体細胞性植物細胞（ａｓｏｍａｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）は複合体の内在化を促進するために細胞透過化剤で前処理される。好ましい透過化剤はトルエンである。
【００１８】
本発明の前記方法に加えて、本発明はまた、植物細胞への活性物質の輸送を仲介するための複合体を提供する。複合体はキャリア部分に結合したカーゴ部分を含むものであって、キャリア部分は植物細胞中へ複合体を送達することができる。
【００１９】
好ましい態様において、カーゴ部分は核酸であり及びキャリア部分は核内在化シグナルを包含する。他の態様において、複合体はカーゴ部分及びキャリア部分からなる融合たんぱく質を含む。標識たんぱく質が複合体の内在化を追跡するために含まれ得る。様々な他種のたんぱく質、例えば部位特異的組込みと関連するたんぱく質もしくは胚形成たんぱく質又はそれらの活性領域は、複合体中に含み得る。
【００２０】
他の好ましい態様において、上記方法はトランスフェクト剤、例えばリポフェクタミン、の添加を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明の方法及び構築体を使用して生産された組み換え遺伝子植物種及び単一の植物細胞を提供する。
【００２２】
本発明のこれら及び他の特徴は添付した図面を参照する下記説明から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は本発明の態様に従うフルオレセイン化された複合体の転座に関する透過性の効果を示す。
【図２】図２は小胞子における摂取Ｔａｔを実証する。
【図３】図３は透過化胚における様々なＣＰＰの効果を実証する。
【図４】図４は透過化胚におけるＴａｔ−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図５】図５は透過化胚におけるＴａｔ２−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図６】図６は透過化胚におけるＰｅｐ−１−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図７】図７は小胞子におけるＰｅｐ−１−ＧＵＳ複合体摂取を図解する。
【図８】図８は透過化胚におけるｇｕｓ遺伝子発現を実証する。
【図９】図９はＴａｔ−ＤＮＡ複合体で処理された小胞子からの植物を示す。
【図１０】図１０はｇｕｓ遺伝子発現に関するリポフェクタミンの効果を図解する。
【図１１Ａ】図１１ＡはＣＰＰ及びＤＮＡの異なる処理の効果を示す。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＤＮＡ及びＲｅｃＡの種々の組み合わせの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
植物細胞の細胞進入障壁を越えて外来核酸又はポリペプチドの送達は困難である。成功する機会は植物組織をトルエンのような細胞の透過化剤で処理することにより改善されるが、しかしその形質転換の割合は未だに低いままである（マハラクシュミら、２０００）。
【００２５】
本発明は植物細胞へのカーゴの送達のための新規方法を提供する。カーゴは標的細胞において発現する核酸分子であり得、及びポリペプチドであり得る。カーゴは植物細胞への送達を追跡するための標識を含み得る。
【００２６】
本発明の方法において、カーゴは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と結合し、また本明細書において「キャリア」又は「キャリア部分」として呼ばれる。キャリアはカーゴと複合体を形成し、そしてカーゴを細胞中へ運ぶ。
【００２７】
つまり、キャリア部分及びカーゴ部分を含む複合体は作りだされた。キャリア部分は植物細胞膜及び／又は細胞壁を横断することができる作用物質である。
【００２８】
本発明に使用される好ましいキャリアは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。本発明の方法及び複合体に使用されるＣＰＰは、ＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１、及びそれらの断片が含まれるがこれらに制限されない。
【００２９】
カーゴ部分は核酸又はポリペプチドであり得る。キャリアと結合し得る核酸の例は、ｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体、又はそれらの組み合わせを含む。好ましい一態様において、核酸はＤＮＡである。他の好ましい一態様において、核酸はＲＮＡである。キャリアと複合体を形成し得るポリペプチドの例としては、どのたんぱく質又はそのポリペプチド断片を含み得る。例えば、たんぱく質は植物又は植物細胞の表現型を修飾する作用物質であり得る。それはある種のペスト又は除草剤に対する耐性を与えるたんぱく質であり得る。前記ポリペプチドは細胞代謝を変えるたんぱく質、例えばたんぱく質に関する胚形成、部位特異的組込みを含むたんぱく質をコード化しえる。
【００３０】
本発明のキャリア−カーゴ複合体は共有結合及び／又は静電的結合によって種々の方法において形成されることができる。また、複合体はＣＰＰ及びカーゴ、例えばＰｅｐ−１と複合体を形成したＲｅｃＡで被覆されたＤＮＡ、の組合せで作りだされ得る。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、細胞はまずは透過化剤で処理される。移送の驚くほど高い割合がＣＰＰの使用を伴う透過化技術と組み合わせることによって達成できる。透過化処理は、ＣＰＰ単独の輸送に役立たることが可能な、又は細胞壁及び細胞膜によるサイズ制限を克服することによるキャリア−カーゴ複合体として、原形質膜の一時的なポア形成を生じる。又一方で、透過化剤での前処理は全種類の植物細胞に要求されないことは明らか理解される。例えば、小胞子はいずれの全透過化段階なしにキャリア−カーゴ複合体を使用した形質転換を効果的にできる。
【００３２】
種々の透過化剤がキャリア−カーゴ複合体の輸送を増進するために使用されることができる。トルエン及びエタノールを含む透過化溶液は、特に効果的であることを示されている。
【００３３】
いくつかの典型的な実験結果は、本発明の方法及び組成物の効果を実証するために添付した図面に示された。
【００３４】
ここで図１を参照することで、透過化の効果を実証した一連の顕微鏡写真を示す。ライ小麦 ｃｖ ＡＣ Ａｌｔａの未成熟の胚中の蛍光標識化されたＴＡＴ−ＰＴＤの輸送は蛍光顕微鏡によって可視化された。この結果は透過化緩衝液（Ａ）のみで培養化された対照胚及びトルエン透過化緩衝液（Ｂ）で処理した胚は蛍光発色しなかったことを実証した。ＦＩＴＣ−標識化デキストラン硫酸塩（Ｃ）のみで処理した胚は標識化デキストラン硫酸塩のいずれの顕著な取り込みも実証されなかった。一方で、細胞の透過化剤（Ｄ）の存在下においてＦＩＴＣ−標識化デキストランで処理した胚は確かに、蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤのみの（Ｅ）で処理された胚のように、いくらかの蛍光発色を実証した。しかしながら、最も顕著な取り込みは、細胞の透過化剤の存在下で蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤで処理した胚で観察された。このことは、細胞透過化がＴＡＴ−ＰＴＤのような細胞透過性ペプチドの使用を伴う場合、移送の高い効果を実証する。この図１に示した結果は、未成熟の胚の透過化が細胞透過性ペプチドの効果的な輸送を促進することの実証する。
【００３５】
しかしながら、透過化は総ての細胞種にとって必須というわけではない。図２は単一の小胞子による蛍光標識化Ｔａｔの取り込みを図示する。これらの結果はＴａｔ ＣＰＰが細胞中へ透過することができることを示唆する。
【００３６】
種々異なる型の細胞透過性ペプチドが本発明の方法に有用であった。表１は研究された
いくつかのＣＰＰを示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
これらペプチドに関して、Ｎ末端基は“ＦＩ”で示されたように蛍光標識化された。トランスポータンペプチドは、１３番リシンとつながるＮ末端における神経ペプチドガラニンからＣ末端にハチ毒マストパランからの１４番アミノ酸へとつながる１２アミノ酸を含むキメラペプチドである。ｐＶＥＣペプチドはマウス血管内皮カドヘリン（アミノ酸６１５−６３２）から送達された。ＴＡＴ−ＰＴＤペプチドはＨＩＶ−１ ＴＡＴたんぱく質形質導入領域を含む。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２は、未成熟の及び成熟胚が種々の細胞透過性ペプチドに露出された場合に観察された相対的な蛍光発色を示す。
【００４１】
同様の結果が図３にグラフで表されている。この結果は、成熟及び未成熟の胚の両方に生じる種々のペプチドの輸送を示す。輸送の効率は、細胞がトルエンのような透過化剤に露出されたときに、向上する。トルエンは透過化の効果を示す典型的な物質として使用されているが、他の透過化剤も同効果を達成するために使用されることができることは明らかである。３つの異なるＣＰＰを使用している表２及び図３の結果は、他のＣＰＰもまた本発明の方法に有益であるという妥当な予測を示す。
【００４２】
研究された3種のペプチド全ての輸送における顕著な増加が生じたことから、接合体胚
によって生じた細胞障壁はトルエンで組織を透過化させることによって超えられることができることを、この結果は示す。ＦＩＴＣ標識化デキストラン硫酸塩は、それが細胞透過化能を有さないので、陰性対照としての機能を果たす。他の陰性対照としては、Ｍ−ｔａｔもまた、ＣＰＰによる透過化は配列依存性の高いことを示唆している著しく減少した蛍光を示す。
【００４３】
ＧＵＳレポーターシステム（ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ）は植物分子生物学の技術分野においてよく知られているレポーターシステムである。このレポーターシステムは細胞透過化の効果、並びにたんぱく質形質導入及び遺伝子トランスフェクションの効率を高めるのためにＣＰＰの使用を実証するために使用された。
【００４４】
図４は透過化された胚におけるＴａｔ−ＧＵＳ酵素複合体の取り込みを図示している。この顕微鏡写真はたんぱく質形質導入の高効率な方法を明らかに実証している。取り込みをさらに高めるために、Ｔａｔ２ ＣＰＰは特注で合成され、Ｔａｔ２はＨＩＶ ＴａｔのＰＴＤの１８アミノ酸ダイマーである。ＣＰＰとしてのＴａｔ２を使用したこの結果は図５に示されている。本発明の方法に使用することができる他のＣＰＰを再度実証するために、Ｐｅｐ−１−ＧＵＳ酵素複合体は調製された。図６に示されている顕微鏡写真は、この複合体を使用している透過化された未成熟の胚における効果的なたんぱく質形質導入があることを図示している。図６Ａは対照の胚であり、及び図６ＢはＰｅｐ−１による仲介されたＧＵＳ酵素送達を図示している。たんぱく質カーゴの送達のためのＣＰＰとしてのＰｅｐ−１の効率をさらに実証するために、小胞体は同じ複合体で取り扱われ、そして結果は図７に示される。
【００４５】
上記のように、試験されたＣＰＰの輸送は透過化された成熟及び未成熟の胚においてより良好であった。ＴＡＴ−ＰＴＤは未成熟胚の胚域に明らかに蓄積し、そしてＴＡＴ−ＰＴＤの取り込みは未成熟胚における透過処理の後に最高水準（４．７倍）まで増加した。さらに、ＴＡＴ−ＰＴＤは、植物細胞／組織における遺伝子送達のための適したキャリアを形成するためにＤＮＡと結合するための可能性を伴うアルギニンリッチである。
【００４６】
さらなる研究において、ＴＡＴ−ＰＴＤ−プラスミドＤＮＡ複合体は透過化された胚におけるプラスミドによってコード化されたｇｕｓ遺伝子発現を誘導するためのその能力を評価された。その結果は図８に示され、及びＣＰＰ−プラスミドＤＮＡ複合体が植物細胞において発現のための遺伝子を送達するために使用されることができることを明らかに示唆している。透過化胚におけるＧＵＳトランス遺伝子発現は非透過化胚における発現よりも著しく高い。このことは、細胞の透過化がＣＰＰに仲介されたカーゴ複合体の輸送における重要な役割を果たすことを、強く示唆する。この結果はまた、複合体形成及び透過化が輸送されたカーゴ成分の生物学的活性を危険にさらさないことを示唆する。
【００４７】
遺伝子トランスフェクションのための本発明の方法の効率はＴａｔ／Ｔａｔ２−ＤＮＡ複合体を使用してさらに実証された。ＤＮＡは除草剤耐性遺伝子を運ぶ。小胞子はトランスフェクトされ、及び植物が生み出された。図９は、トランス遺伝子植物が本発明の方法
を使用して生み出されることができることを図示している。
【００４８】
植物遺伝子トランスフェクションの効率は、リポフェクタミンのような他の知られているトランスフェクション促進剤を含むことによってさらに高めることができる。リポフェクタミンがＣＰＰ−ＤＮＡ複合体で処理された透過化細胞に加えられた場合、その効率はなお一層向上した。図１０に示された結果は、Ｔａｔ：ＤＮＡ複合体を形成することにより、トランスフェクション割合はリポフェクタミン担体がトランスフェクト剤として使用された場合より高くなる。また一方で、リポフェクタミンとＣＰＰ−ＤＮＡ複合体との組み合わせは最も効果的であった。
【００４９】
ｇｕｓ遺伝子及びたんぱく質リポートシステムがこのシステムの効果を実証するために使用されてきているが、ＧＵＳのような大きな分子が移送可能であり、及び複合体遺伝子生成物が本発明の方法を使用して発現可能ならば、他のたんぱく質は移送可能で、及び他の遺伝子もトランスフェクト可能である、ということは明らかである。
【００５０】
本発明の方法はまた、たんぱく質と植物細胞とを関連付けられた胚形成の形質導入のために使用されている。このことは、胚形成を誘発し及び標識として作用できる。このことはまた、植物細胞へ送達するたんぱく質の新規及び一般的な方法を提供する。興味のあるたんぱく質及び遺伝子に関連する胚形成の共送達は植物遺伝子工学の新規方法を提供する。
【００５１】
詳細に説明された方法の変化もまた包含される。例えば、ペプチドと核酸又は他のオルガネラ局在領域はＣＰＰ−カーゴ複合体に組み込まれ得る。
【００５２】
現在、一種以上の好ましい態様が実施例の方法によって記載されている。いくつもの変化及び修飾が特許請求の範囲に定義された発明の範囲から逸脱しないで行うことができるのは、当業者に明らかであろう。
【００５３】
上記の公開は本発明を一般的に説明する。先の説明を用いて、当業者は、本発明の組成物を作成及び使用し、並びに本発明の方法を実施することができることが確信される。さらに完全に理解することは、下記の詳細な実施例を参照することによって得られえる。これら実施例は単に本発明の好ましい態様を説明するために記載され、及び本発明の範囲を制限することを目的としているものではない。形態及び相当物の置換基の変化は、詳細が方法を提案又は表し得るように、考慮される。他の一般的な形態は当業者にとって明らかである。本明細書で参照される特許又は特許出願等の文献は参照されることによって本明細書に組み込まれた。
【００５４】
専門用語がこれら実施例において使用されるが、そのような用語は記述的な趣旨において意図されており、限定の目的のためではない。微生物学及び物理学の手法は本公開に明白に記載されていないことに言及し、及びこれらの実施例は科学文献に報告され、及び当技術者には周知である。
【実施例１】
【００５５】
実施例１．植物細胞の調製
成熟胚
成熟胚（小麦ｃｖ ＡＣ スパーブ）を単離し、及び表面をマハラクシミら（２０００）による記載のように滅菌した。この滅菌した胚を使用前に１時間、層流フード中で風乾した。
【００５６】
未成熟胚
胚を開花後２週間の穂（胚盤径１−２ｍｍ）から単離した。未成熟種の表面を７０％エタノールで３０秒間殺菌し、続いて、１０％次亜塩素酸塩（クロレックス）と１滴のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）で３分間処理した。滅菌水で各１分間の洗浄を４回した。胚を殺菌下で手で切開した。単離された胚をＣＰＰ輸送研究前に、室温で暗室中に２４時間、ＧＥＭ培地（ユードら、２００３）に置いた。単離された小胞子をアムンセン及びユード、２００５の記載どおり準備した。
【００５７】
実施例２．細胞透過化剤を使用した接合胚における蛍光標識された細胞透過性ペプチドの輸送
ペプチドを特注で合成し、及びＮ末端アミノ基を蛍光標識した（アルバータペプチド機関、カナダ）（表１）。ＦＩＴＣ−デキストラン硫酸塩（４，０００ｋＤａ、シグマアルドリッチ社）及び変異Ｔａｔを陰性対照として使用した。
【００５８】
単離及び殺菌した胚（２０−２５）に、細胞透過化剤トルエン／エタノール（１：４）を透過化緩衝液に対して１：２０の割合で含む透過化緩衝液（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）全量４２０μＬを吸収させた。これに、１ｍMの蛍光標識されたＣＰＰ２．１μＬを加え、５μＭの最終濃度とした。陰性対照にお
いては、胚をＦＩＴＣデキストラン硫酸塩又はＭ−Ｔａｔで処理した。胚を１時間の間、暗所中室温で透過化緩衝液中で混合しながら培養し、続いて透過化緩衝溶液で２回洗浄した。次に、フリーペプチド分子を除去するために、５分間室温で透過化緩衝液に対して１：２の割合でトリプシン：ＥＤＴＡ（０．２５％溶液、シグマ−アルドリッチ社）で胚を処理した。胚を透過化緩衝液で２回洗浄し、そして蛍光顕微鏡検査法か又は蛍光分光分析の対象とした。
【００５９】
蛍光顕微鏡検査法
細胞透過性ペプチドでの処理及び遊離した、細胞外ペプチドの酵素分解後の胚は蛍光顕微鏡検査法に従って可視蛍光が観察された（ＧＦＰフィルタ；励起光４７０ｎｍ／蛍光５２５ｎｍ；ライカ社製、ドイツ国）
【００６０】
蛍光標識されたペプチドの輸送は蛍光顕微鏡検査法に従う観察されたような成熟及び未成熟の胚の両方における透過化剤（トルエン）の存在下において著しく増加する（図１及び表２）。ＦＩＴＣ−デキストラン硫酸塩及びＭ−Ｔａｔで処理されることを含む陰性対照は全くないかとても弱い蛍光発光を示した（図１Ａ−Ｄ）。一般的に、未成熟胚の蛍光強度は透過化及び非透過化条件の両条件下において成熟胚よりも優れていた（表２；図３）。３種のペプチド研究のうち、ｐＶＥＣは細胞透過化剤で処理された胚でさえ、最小の取り込みを示した。興味深いことに、他の２つのペプチドによる透過化胚の処理は蛍光発色の均一な分布を示したけれども、ＴＡＴ−ＰＴＤで処理された透過化未成熟胚は胚盤における異なる層の蓄積、及び胚の胚芽域における局所的な蓄積を示した（図１Ｆ）。
【００６１】
蛍光光度分析法
蛍光分析のために、胚を１％トリトンＸ−１００（透過化緩衝液で調製）５００μＬ、３０分、４℃で処理した。その上清を新しいチューブに集め、そして異なるＣＰＰで胚による相対蛍光摂取を蛍光光度計（バイオラッド、バーサフルーア（Ｖｅｒｓａｆｌｕｏｒ）、アメリカ国、励起光４９０／蛍光５２０）によって評価した。
【００６２】
蛍光分析はまた細胞透過化剤、トルエンで処理された胚における細胞透過性ペプチドの輸送において著しい増大を示した（図３Ａ、Ｂ）。未成熟胚は透過化及び非透過化の未成熟胚において総てのペプチドに関して相関蛍光摂取の高い水準を示した。特に、未成熟胚中のＴＡＴ−ＰＴＤは非透過化の胚と比較して透過化された胚において４．７倍の高い相対蛍光を示した。トランスポータン及びｐＶＥＣ転座はまた、透過化未成熟胚において１
．８倍及び１．７倍の増加であった（図３Ｂ）。しかしながら、蛍光分析は、透過化の及び非透過化の胚中のＴＡＴ−ＰＴＤに関する目視観測と比較したとおりに、トランスポータンの相対的に優れた輸送を明らかにした。
【００６３】
実施例３．透過化未成熟胚によるＣＰＰ−プラスミドＤＮＡ複合体摂取
ＣＰＰ−ＤＮＡ複合体研究のために、非蛍光標識化ＴＡＴ−ＰＴＤをＤＮＡ（ｐＡｃｔ−１ＧＵＳ）と複合体を形成するために用いた。プラスミドＤＮＡ及びＴＡＴ−ＰＴＤは、透過化緩衝液で１００μＬまで全量をあわせながら、１：１０の比率（５μｇＤＮＡ：５０μｇＴＡＴ−ＰＴＤ、両者とも最適水中に保存）で共に混合された。混合液を添加する前に、透過化緩衝液を吸収した胚を室温で１時間培養した。緩衝液に対して１：２０の比率の透過化剤（トルエン）を胚へ複合体を添加する直前に添加した。胚を１時間の間、透過化剤の存在下においてＴＡＴ−ＰＴＤ及びＤＮＡ複合体と共に培養し、続いて透過化緩衝液で２回洗浄した。胚をセフォタキシムを２５０μｇ／ｍＬ含むＧＥＭ上に、２５度暗所中で３日培養器で培養した。
【００６４】
未成熟胚を、いずれの内因性ＧＵＳ発現を避けるために２０％メタノールを添加したＧＵＳヒストケミカル緩衝溶液（ジェファーソン，１９８７）中、３７度で一晩の間培養した。ＧＵＳ発現％は（ＧＵＳ発現している処理した胚の数／処理した胚の全数）×１００として計算した。
【００６５】
細胞透過化剤の存在下においてＴＡＴ−ＰＴＤ−プラスミドＤＮＡ複合体と培養した未成熟胚は、非処理の陰性対照がいずれのＧＵＳ発現を示さなかったのに対して、一時的なＧＵＳ発現（１２％、図８）を示した。透過化剤の添加なしに、単にＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＮＡ複合体のみで処理した胚は、未成熟胚においてＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＮＡ複合体の取り込みの促進において透過化剤の役割を示すいずれのＧＵＳ発現を示さなかった。
【００６６】
実施例４．種々の植物組織によるＣＰＰ摂取
ライ小麦種を洗浄剤で洗浄し、そして湿綿上で１週間成長させた。根端、葉頂、葉脚及び子葉鞘を切断し、そして５μＬの蛍光標識化されたｐＶＥＣ、スクランブルｐＶＥＣ、及びトランスポータンとともに培養した。根端及び葉客が最大の摂取を示し、続いて子葉鞘及び葉頂であった。トランスポータンは最大の蛍光発光を示し、続いてｐＶＥＣ、スクランブルｐＶＥＣであり、そしてＣＰＰを添加しなかった対照であった。
【００６７】
実施例５．未成熟胚におけるＧＵＳ酵素のＣＰＰ媒介送達
トルエンで透過化したライ小麦未成熟胚を、透過化緩衝液中で１時間の間ＣＰＰ（Ｔａｔ又はＴａｔ２又はＲ９）−ＧＵＳ酵素混合物（４：１ ｗ／ｗ）で処理した。Ｐｅｐ−１に対して、哺乳類動物細胞株中へのたんぱく質形質導入のために計画されたアクティブモチーフ製（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）のチャリオットキット（Ｃｈａｒｉｏｔ ｋｉｔ）に従って行った。ＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体を各々４：１の割合で調製し、そして室温で１時間培養した。処理した胚は、過剰の及び非内在のＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体の分解のために、５分間室温でトリプシン消化（１：１ トリプシン：透過化緩衝液）した。透過化緩衝液で３回洗浄した後、胚を、処理された未成熟胚に青色の出現のために、２０％メタノール含有ＧＵＳヒストケミカル緩衝液（コスギら、１９９０）中３７度で３時間乃至一晩培養した。
【００６８】
実施例６．小胞市中のＧＵＳ酵素のＣＰＰ−仲介送達
ライ小麦小胞子を、ＮＰＢ−９９培地中１時間の間ＣＰＰ（Ｐｅｐ−１、Ｔａｔ、Ｔａｔ２、Ｒ９）及びＧＵＳ酵素複合体（４：１）で処理した。ＣＰＰ−ＧＵＳ酵素複合体は先の実施例の記載のように調製した。２回洗浄した後、トリプシン（１：１ ＮＰＢ−９９培地を用いて）消化を５分間室温で行った。小胞子を、小胞子における青色の発現のた
めに３７度で３時間から一晩の間２０％メタノール含有ＧＵＳヒストケミカル緩衝液（コスギら、１９９０）中で培養した。陽性の小胞子は主として小胞中にＧＵＳの蓄積が示された。
【００６９】
実施例７．オニオン表皮細胞におけるＧＵＳ酵素のＣＰＰ−仲介送達
ＣＰＰ Ｒ９による機能的に活性なＧＵＳ酵素の送達のための能力を、玉葱表皮細胞においても研究した。Ｒ９の複合体及びＧＵＳは１乃至４：１の範囲の割合で、先の実施例に従い調製した。玉葱表皮細胞を１時間の間複合体と培養し、ｐＨ７．２のリン酸生理食塩水で３回洗浄した。複合体で処理された細胞は３７℃で３時間ＧＵＳヒストケミカル緩衝液で培養条件で青色の発現した。４：１の割合が最大の青色を示した。
【００７０】
実施例８．胚発生小胞子中のｂａｒ遺伝子のＣＰＰ−仲介送達
ライ小麦小胞子を、室温で１乃至２時間、ＣＰＰ（Ｔａｔ／Ｔａｔ２）と、‘ｔａｐ’プロモーター及びｎｏｓターミネーターによって誘導された断片をコード化する除草剤（ｂｅｒ）遺伝子との複合体で処理した。複合体をｔａｔ／ｔａｔ２及びＤＮＡの４：１（ｗ／ｗ）の割合で調製し、１時間培養し、続いてリポフェクタミン２０００試薬を５−１０μｇ添加した。細胞をＮＰＢ−９９培地で２回洗浄しそしてさらに、子房の存在下ＮＰＢ−９９培地と１０％のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）中で胚発生のために培養した（ユード及びアムンセン、２００５）。
【００７１】
Ｔａｔ／ｔａｔ２ ＤＮＡ複合体＋リポフェクタミンで処理したＰＣＲ陽性カルス（ｃａｌｌｉ）が下記表３中に示された通りに得られた。
【表３】
【００７２】
実施例９．ライ小麦中のＰＨＢ遺伝子
小胞子単離のためのライ小麦腋芽はそれら根元を蒸留水中に及びそれら頭頂部をアルミホイルでつつみ、３週間冷蔵庫（４℃）で保存した。３週±３日の後、単一核小胞子期の半ばから後半を、以前に採取したアセトカルミン染色剤を使用したメジアンフローレットから検証した。NPB99培地の１ｍLあたり２．５×１０5の細胞となるように調製された精
製小胞子懸濁液を得るためにユード及びアムンセン（２００５）に刊行された様にライ小麦へ、小胞子を運んだ。
【００７３】
葉緑体又はミトコンドリアのための２種の輸送ペプチドをＰＨＢ代謝経路の酵素をコードする３種の遺伝子とともにフレーム単位でクローンした。同一の輸送ペプチドを含む等モル量の３種の遺伝子のカセットを同時トランスフェクションに使用した。滅菌水１００μＬに希釈された全ＤＮＡの１μｇを１００μＬに希釈されたＴａｔ２ ４μｇに添加し
、そして穏やかに攪拌し、結果として混合液中のＤＮＡと細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
の１：４の割合を生じた。複合体を室温で３０分間培養した後に、続いてリポフェクタミン５μＬを加え、室温で５分間培養した。２ｍＬ微小遠心管中の上清を除いた混合物を小胞子に加えた。小胞子を１５分間の間キャリア−カーゴ複合体とともに培養し、そしてＮＰＢ−９９の１００μＬを添加し、続いて室温以上で４５分間培養した。トランスフェクトされた小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、次いで遠心分離しそして上清を除去した。１０００μＬのＮＰＢ−９９を２ｍＬ微小遠心管に加え、穏やかに攪拌し続いて５００ｍＬを、セフォタキシム含有のＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマ社 Ｆ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）３ｍLを含む３５ｍｍのペトリ皿中にピペットでとった。
【００７４】
植物から直接採取した同様に滅菌した穂からの４個又は５個の子房を小胞子を含む各々の皿に加えた。皿をパラフィルムで封止し、そして１５０ｍｍペトリ皿中の滅菌蒸留水を含む蓋のない５０ｍｍペトリ皿のまわりにおいた。次いで１５０ｍｍ皿もパラフィルムで封止し、そして暗所中、２８℃で２０乃至３０日間培養した。小胞子培養、胚培養及び植物培養の間、一切抽出を使用しなかった。
【００７５】
再生植物を３種のトランス遺伝子の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。ＲＮＡは、興味ある３種の遺伝子に関してＰＣＲで陽性であった植物から抽出した。ｃＤＮＡは、この選択された植物から成長し、そしてＰＣＲは３種のトランス遺伝子の発現の確認のために実施した。結果は表４に示した。
【表４】
【００７６】
実施例１０．ライ小麦小胞子におけるＤＮＡ−たんぱく質の共輸送
小胞子単離のためのライ小麦腋芽を、それら根元を蒸留水中にいれ及びそれら頭頂部をアルミホイルでつつみ、３週間冷蔵庫（４℃）で保存した。３週±３日の後、単一核小胞子期の半ばから後半を、以前に採取したアセトカルミン染色剤を使用したメジアンフローレットから検証した。ＮＰＢ９９培地の１ｍＬあたり２．５×１０5の細胞となるように
調製された精製小胞子けん濁液を得るためにユード及びアムンセン（２００５）に刊行されたライ小麦へ、単離した小胞子を運んだ。
【００７７】
プラスミド（ｐＡｃｔ−１ ＧＵＳ、〜７．２ｋｂ）をＰｓｔｌ制限酵素を用いて線形化し、そしてＤＮＡをＰＣＲ生成物精製キット（キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、米国）によって精製した。ＧＵＳ ＤＮＡを下記７つの異なる処理（Ｔ）に従い得た。これら実験を５回繰り返した。
Ｔ１）対照：対照処理は滅菌水２００μＬである。
Ｔ２）ＧＵＳ ＤＮＡのみ：２００μＬの滅菌水で希釈したＧＵＳ ＤＮＡ（シグマアルドリッチ）１μｇ。
Ｔ３）ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡ：滅菌水１００μＬに希釈したＤＮＡ１μｇを、１００μＬに希釈したＲｅｃＡ４μｇへ添加し、そして穏やかに攪拌し、混合物中１：４の割合のたんぱく質とＤＮＡを得た。
Ｔ４）ＤＮＡ−Ｔａｔ２：滅菌水１００μＬに希釈したＤＮＡ１μｇを１００μＬに希
釈したＴａｔ２ ４μｇに加え、そして穏やかに攪拌し、結果として、混合物中１：４の割合のＤＮＡと細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をもたらした。
Ｔ５）ＤＮＡ−チャリオットキット：チャリオットたんぱく質形質導入キットを用いたＧＵＳ ＤＮＡを操作手順（アクティブ モチーフ社、米国）により形質転換した。ＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水１００μＬ中に希釈し、そしてチャリオットの６μＬを滅菌水１００μＬに希釈した。ＧＵＳ ＤＮＡ溶液を２ｍＬの微小遠心管中のチャリオット溶液に加え、最終容量を２００μＬにした。
Ｔ６）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオットキット：ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡ溶液をチャリオットたんぱく質形質導入キットを使用して小胞子中に送達し、操作手順は以下に従った。ＲｅｃＡ４μｇを滅菌水５０μＬに希釈し、及びＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水５０μＬに希釈した。ＲｅｃＡ溶液をＤＮＡ溶液に加え、そして１５分間培養した。チャリオット６μＬを滅菌水１００μＬに希釈した。チャリオット溶液を、２ｍＬ微小遠心管中に最終体積が２００μＬになるようにＤＮＡ−ＲｅｃＡ容器にピペットで加えた。
Ｔ７）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２：ＧＵＳ ＤＮＡ−ＲｅｃＡをＴａｔ２によって小胞子中に送達した。ＲｅｃＡ４μｇを滅菌水５０μＬに希釈し、そしてＧＵＳ ＤＮＡ１μｇを滅菌水５０μＬ中に希釈した。ＲｅｃＡ溶液をＤＮＡ溶液に加え、そして１５分間培養した。Ｔａｔ２ ４μｇを滅菌水１００μＬに希釈した。そしてＴａｔ２溶液をＤＮＡ−ＲｅｃＡ溶液中へ加え、２ｍＬ微小遠心管中、最終体積を２００μＬとした。
【００７８】
複合体を１５分間室温で培養し、続いてリポフェクタミン５μLを添加し５分間室温で
培養した。混合物を２ｍLの微小遠心管中の上清を除いて小胞子のみへ添加した。小胞子
をキャリア−カーゴ複合体と１５分間培養し、ＮＰＢ−９９ １００μＬを添加し、さらに４５分以上室温で培養した。トランスフェクトされた小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、遠心分離し、そして上清を除去した。ＮＰＢ−９９ １０００μＬを２ｍＬ微小遠心管に加え、穏やかに混合した。５００ｍＬを、セフォタキシム含有のＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマ社 Ｆ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）３ｍLを含む３５ｍｍのペ
トリ皿中にピペットでとった。
【００７９】
植物から直接採取した同様に滅菌した穂からの４個又は５個の子房を、小胞子を含む各々の皿に加えた。皿をパラフィルムで封止し、そして１５０ｍｍペトリ皿中の滅菌蒸留水を含む蓋のない５０ｍｍペトリ皿のまわりにおいた。次いで１５０ｍｍ皿もパラフィルムで封止し、そして暗所中、２８℃で２０乃至３０日間培養した。
【００８０】
０．５ｍｍより大きい胚をペトリ皿から取り除き、そしてＧＥＭ培地（１０ｃｍのペトリ皿に２０ｍＬ：ユードら、２００３）上で培養した。ペトリ皿をパラフィルムで封止し、１６℃の室温で８０μMｍ-2ｓ-1を送達しているシルバニアグロ−ラックス（Ｓｙｌｖ
ａｎｉａ Ｇｒｏ−ｌｕｘ）広帯域電球（４０ワット）（１６時間で点灯終了）の３０ｃｍ下に設置した。胚が緑色に変化した時点で、同じ条件で、マジェンダ容器中の根付け培地５０ｍＬ上に無菌で移した。植物が２乃至３枚葉段階に達し、及び根が充分な根が生長した時点で、植物を４×８スペンサー−ルーメル育苗箱（スペンサー−ルーメル インダストリー リミテッド、エドモントン）に移し、母植物のように同じ条件で育成棚に置いた。開花後２週間に、倍数性を結実の状態を調べることによって推定した。
【００８１】
４〜５週間で、胚をＧＵＳ組織化学分析を行った。分析は２００ｍＬのＧＵＳ組織化学的緩衝液（５００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ マンニトール、２ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃ、ｐＨ７．０）を小胞子に添加し、続いて３７℃、暗所、一晩で培養することによって実施された。染色剤溶液は除去され、そして胚はＰＢＳによって除去した。青色を示す小胞子はＣＰＰによってＧＵＳ酵素を外生的な取り込みの活性を示唆する。各々の処理における青染色胚の割合は立体顕微鏡を使用して算定した。
【００８２】
胚におけるＴａｔ２及びチャリオットの明らかな転座はトランスフェクションの２ヵ月後に観察された（表５）。ＧＵＳは陰性対照、未処理の小胞子中には観察されなかった。Ｔａｔ２及びチャリオットでの処理でＧＵＳを示した最も高い数の胚は各々２５．８及び２６．４％であった（表５）。２番目の頻度の青染色胚はＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２を用いた処理で観察された。リポフェクタミンを用いた、ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ処理は低頻度で小胞子へのトランスフェクト可能である。これらの研究は、異なるＤＮＡとたんぱく質との複合体がライ小麦小胞子中に内在化されたことを示している。
【００８３】
表５．トランスフェクション後２ヶ月の遺伝子形質転換のための７種の異なる処理により作り出された胚を発現したＧＵＳの総数。
Ｔ１）対照、未処理の胚；Ｔ２）ＤＮＡ；３）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ；Ｔ４）ＤＮＡ−ＴＡｔ２；Ｔ５）ＤＮＡ−チャリオット；Ｔ６）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット；Ｔ７）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２
【表５】
【００８４】
実施例１１：ＤＮアーゼＩ保護アッセイ及び遅延度アッセイ
ＣＰＰ−ＧＵＳ ＤＮＡ複合体を、ライ小麦小胞子ＤＮＡ（Ｔ２）及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ（Ｔ３）中のＤＮＡ及びＣＰＰ複合体の実施例１０における送達のために記述される通りに調製した。リポフェタミンなしであるが、ＤＮアーゼＩ保護アッセイは、ライ小麦小胞子中にＤＮＡとＣＰＰの複合体のＤＮＡ（Ｔ２）及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ（Ｔ３）送達のために記述される通りに機能した。２０分間のペプチド−ＤＮＡの培養後直ちに、ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ−フリーＤＮアーゼセット、キアゲン、米国）４μＬを混合物容積（２００μＬ）へ添加し、そして室温で１５分間培養し、続いて氷上で５分間培養した。ペプチド−プラスミド解離及びプラスミド精製はＤＮＡ精製キット（クイアクイック ＰＣＲ精製キット）を使用して行った。
【００８５】
DNAに対応するバンド（７．２ｋｂ）は明らかに可視化されたので、リポフェクタミン
を伴う、ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲｅｃＡ、ＤＮＡ−Ｔａｔ２、ＤＮＡ−チャリオット、ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット、及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２は感知できるほど保護されており、一方、リポフェクタミンを伴わないＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲｅｃＡ複合体はヌクレアーゼで処理されたＤＮＡの分解のもたらしたことを、ＤＮアーゼＩ保護アッセイは示した（図１１Ａ）。
【００８６】
ＲｅｃＡ−ＧＵＳ ＤＮＡ複合体はライ小麦小胞体中へＤＮＡ及びＣＰＰ複合体の送達のために記述されたとおりに調製された。ＧＵＳ ＤＮＡ １μＬを１：０、１：４、１：８、１：１２、１：１６、１：２０及び１：２４の比率になるように異なる濃度のＲｅ
ｃＡたんぱく質に混合した。リポフェクタミンなしに２０分間培養した後、複合体２０μＬを１％アガロースゲルに塗布した。
【００８７】
ＤＮＡ−ＲｅｃＡ複合体のためのゲル遅延度アッセイは、スメアーな蛍光発色が１：８及びその高い割合並びにＧＵＳ ＤＮＡで観察されることを示し、線形プラスミドＤＮＡの減少した移動度に関してＲｅｃＡの高濃度の影響を示唆する（図１１Ｂ）。ＲｅｄＡ１：８及び高い比率でｄｓＤＮＡに結合した。
【００８８】
図１１ＡはＣＰＰ−ＤＮＡ複合体構造を示す。（Ａ）ＣＰＰ及びＤＮＡの組み合わせの異なる処理はＤＮアーゼ保護アッセイのために試験された。Ｔ１）対照、Ｔ２）ＤＮＡ、及びＴ３）リポフェクタミンなしのＤＮＡ−ＲｅｃＡ；Ｔ４）ＤＮＡ、Ｔ５）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ、Ｔ６）ＤＮＡ−Ｔａｔ２、Ｔ７）ＤＮＡ−チャリオット、Ｔ８）ＤＮＡ−ＲｅｃＡ−チャリオット、及びＴ９）リポフェクタミンとＤＮＡ−ＲｅｃＡ−Ｔａｔ２。図１１ＢはＤＮＡ及びＲｅｃＡの種々の濃度の効果を示す。
【００８９】
実施例１２．小麦小胞子ヘトランスフェクトされたアピンループ遺伝子構造
ＴａＡＯＳ遺伝子（ＡＹ１９６００４）はヘアピンループ技術を使用した小麦中のサイレンシングジャスモン酸（ＪＡ）経路として考えられる。２７ｍｅｒシークエンスｇｇｃｃａｔｃｃｇｃｇａｃｃｇｃｃｔｃｇａｃｔｔｃｔａはセンス鎖として選択された。アクチンプロモータ及びＮＯＳターミネータ間の複製された完全遺伝子シークエンスはＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＣＴであった。
【００９０】
滅菌水１００μＬに希釈された総ＤＮＡ１μｇを１００μＬに希釈したＴａｔ２ ４μｇに添加し、そして穏やかに混合し、混合物中、１：４の割合のＤＮＡ及び細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を結果として得た。３０分間室温で複合体培養に続いて、リポフェクタミン５μＬを湿塩で５分間かけて加えた。混合物は２ｍＬの微小遠心管に上清を除いて小胞子にだけ加えた。
【００９１】
小麦栽培品種（フィールダ社）からの小胞子は前の実施例を示されたように集められ、１５分間キャリア−カーゴ複合体とともに培養された。１００μＬのＮＰＢ−９９を添加し、そして混合物を４５分間以上室温で培養した。トランスフェクト化した小胞子をＮＰＢ−９９で洗浄し、遠心分離し、そして上清を除去した。１０００μＬのＮＰＢ−９９を２ｍＬ微小遠心管に加え、そして穏やかに攪拌した。５００μＬをセフォタキシムを含む３ｍＬのＮＰＢ−９９＋１０％フィコール（シグマＦ４３７５）（ＮＰＢ−９９−１０Ｆ）を含む３５ｍｍペトリ皿へピペットで取った。小胞子及び胚は上記実施例の記載通りに培養した。
【００９２】
全９０の小植物を小胞子の２つの抽出からの培養から生産した。土壌に適用させた初日の間に、５５の植物が死んだ。一度、土壌と中空の不純物に露出された小植物死亡の非常に高い割合は、ＪＡサイレンシングの発現に関連している。再生植物（３５）をトランス遺伝子の存在のためにＰＣＲによって検査した。これら植物の３つがトランス遺伝子に対してＰＣＲ陽性であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１２１３２５号明細書
【特許文献２】国際公開２００５１１７９９２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２６０７５６号明細書
【非特許文献】
【００９４】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ レターズ、２００４年、５６６号、ｐ３０７
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カーゴ部分を植物組織、植物器官、又は植物細胞へ送達するための方法であって、前記方法は植物細胞をキャリア部分と結合している少なくとも１つのカーゴ部分を含む複合体に露出させることを含む方法。
【請求項２】
前記植物細胞が配偶体植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャリア部分が細胞透過性及び核酸結合性を有しているポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キャリア部分中に細胞小器官局在化シグナルを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア部分中に核局在化シグナルを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１ペプチド及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キャリア部分はｔａｔのたんぱく形質導入領域（ＰＴＤ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４９乃至５７を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カーゴ部分は核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸は、ｍＲＡＮ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記カーゴ部分がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが細胞代謝を変えるたんぱく質をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記たんぱく質が胚形成関連たんぱく質又はその活性領域である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記たんぱく質が相同たんぱく質又はその活性領域と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記カーゴ部分がまた、追加のポリペプチド及び／又は核酸の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法
【請求項１８】
体細胞性植物細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）が細胞透過化剤で前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記透過化剤がトルエンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに前記細胞をリポフェクタミンに露出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
植物細胞中への活性物質の輸送を仲介するための複合体であって、該複合体は植物細胞へ複合体を導入することが可能なキャリア部分と結合したカーゴ部分を含む複合体。
【請求項２２】
前記カーゴ部分が核酸である、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記キャリア部分が核局在化シグナルを含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２４】
カーゴ部分及びキャリア部分からなる融合たんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２５】
マーカーたんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２６】
部位特異的組込みと関連するたんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２７】
胚形成たんぱく質又はその活性領域を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２８】
請求項２２乃至請求項２７において定義された複合体又は一連の複合体を用いて植物細胞をトランスフェクションすること及びトランスフェクションされた植物細胞から植物を生成することを含む、遺伝子組み換え植物の生産方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法に従って生産された遺伝子組み換え植物。
【請求項３０】
請求項２１で定義された複合体で形質転換された遺伝子組み換え種子。
【請求項３１】
請求項２１で定義された複合体で形質転換された全能植物細胞。
【請求項１】
カーゴ部分を植物組織、植物器官、又は植物細胞へ送達するための方法であって、前記方法は植物細胞をキャリア部分と結合している少なくとも１つのカーゴ部分を含む複合体に露出させることを含む方法。
【請求項２】
前記植物細胞が配偶体植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャリア部分が細胞透過性及び核酸結合性を有しているポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キャリア部分中に細胞小器官局在化シグナルを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア部分中に核局在化シグナルを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔ、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、Ｐｅｐ−１ペプチド及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キャリア部分はｔａｔのたんぱく形質導入領域（ＰＴＤ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キャリア部分はＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４９乃至５７を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カーゴ部分は核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸は、ｍＲＡＮ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド；プラスミド、人工染色体、遺伝子治療構築体、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、制限断片、リボザイム、アンチセンス構築体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記カーゴ部分がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが細胞代謝を変えるたんぱく質をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記たんぱく質が胚形成関連たんぱく質又はその活性領域である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記たんぱく質が相同たんぱく質又はその活性領域と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記カーゴ部分がまた、追加のポリペプチド及び／又は核酸の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法
【請求項１８】
体細胞性植物細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）が細胞透過化剤で前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記透過化剤がトルエンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに前記細胞をリポフェクタミンに露出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
植物細胞中への活性物質の輸送を仲介するための複合体であって、該複合体は植物細胞へ複合体を導入することが可能なキャリア部分と結合したカーゴ部分を含む複合体。
【請求項２２】
前記カーゴ部分が核酸である、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記キャリア部分が核局在化シグナルを含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２４】
カーゴ部分及びキャリア部分からなる融合たんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２５】
マーカーたんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２６】
部位特異的組込みと関連するたんぱく質を含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２７】
胚形成たんぱく質又はその活性領域を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２８】
請求項２２乃至請求項２７において定義された複合体又は一連の複合体を用いて植物細胞をトランスフェクションすること及びトランスフェクションされた植物細胞から植物を生成することを含む、遺伝子組み換え植物の生産方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法に従って生産された遺伝子組み換え植物。
【請求項３０】
請求項２１で定義された複合体で形質転換された遺伝子組み換え種子。
【請求項３１】
請求項２１で定義された複合体で形質転換された全能植物細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３２１５９（Ｐ２０１０−５３２１５９Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０６２９（Ｐ２０１０−５１０６２９）
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１１１２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４８２２３
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０９３３６９８９）
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＲＩ−ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＡＧＲＩ−ＦＯＯＤ ＣＡＮＡＤＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１１１２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４８２２３
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０９３３６９８９）
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＲＩ−ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＡＧＲＩ−ＦＯＯＤ ＣＡＮＡＤＡ
【Ｆターム（参考）】
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