ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ誘導性免疫刺激の調節
【課題】免疫応答を調節する方法の提供。
【解決手段】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が、その免疫刺激能力影響を与える。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’側の特定の位置への、荷電していないヌクレオシド間結合（uncharged internucleoside linkage）の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【効果】アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫治療用途においては免疫刺激効果の増大を、両方とも可能にする。
【解決手段】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が、その免疫刺激能力影響を与える。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’側の特定の位置への、荷電していないヌクレオシド間結合（uncharged internucleoside linkage）の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【効果】アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫治療用途においては免疫刺激効果の増大を、両方とも可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、2001年1月26日に提出された、出願番号第６０／１７８,５６２号の米国仮出願に対する優先権を主張しており、この結果、その全内容は参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの診断的プローブ法から遺伝子発現のアンチセンス的な阻害に至る、多様な技術に使用されており、近代的な分子生物学において必要不可欠な道具となった。オリゴヌクレオチドのこの広範な使用は、オリゴヌクレオチド合成のための迅速、安価かつ効率的な方法に対する要求を増大させるに至った。
【０００４】
アンチセンス用途および診断用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在、定法にしたがって達成することができる。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 1991); および Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); および Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)を参照。初期の合成アプローチは、ホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学を含む。Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)は、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学を開示している。Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これらの初期のアプローチは、合成のためのより効率的なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネートアプローチに、大きく道を譲った。Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)は、ポリヌクレオチドの合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示している。Agrawal and Zamecnik、米国特許第５,１４９,７９８号（１９９２）は、Ｈ−ホスホネートアプローチによる最適化されたオリゴヌクレオチドの合成を開示している。
【０００５】
これら両方の近代的アプローチは、多様な修飾されたヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するために使用された。Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホルアミデートの合成を開示している。Agrawal et al., Proc. Antl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)は、Ｈ−ホスホネート化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホルアミデートおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【０００６】
より最近になって、いくつかの研究者が、疾患の治療的処置に対するアンチセンスアプローチの有効性を証明した。Crooke, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viiiは、ヒトサイトメガロウイルス誘導性網膜炎の処置のためのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが販売承認を得たことを開示している。残念ながら、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は、当初予想していたより複雑になった。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより惹起されたある種の効果は、予想したアンチセンスメカニズムでは説明できなかった。例えば、McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)は、「センス」ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特異的な免疫刺激を起こすことを教示している。この副作用および他の副作用により、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの姿は複雑になった。
【０００７】
一方、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘導できるという観察は、この副作用を治療の道具として発展させることへの関心を創出した。これらの努力は、ジヌクレオチドＣｐＧを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに集中した。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含有するホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファおよびガンマの合成を誘導し、そして、ナチュラルキラー活性を増強できることを教示している。Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995)は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)は、このようなオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216-124 (1998)は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強することを教示している。McCluskie and Davis, The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を増強することを教示している。
【０００８】
これらの報告は、ＣｇＧ含有オリゴヌクレオチドによって惹起される免疫応答を調節できることに対する要求があることを明らかにしている。理想的には、このような調節は、アンチセンス用途において免疫刺激効果を減少させ、ならびに、免疫療法用途において免疫刺激効果を増大させることを含むべきである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えることを発見した。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’側の特定の位置への、荷電していないヌクレオシド間結合（uncharged internucleoside linkage）の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【００１１】
第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００１２】
第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む。
【００１３】
第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００１４】
第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入することを含む。
第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００１５】
第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含む。
第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００１６】
第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含む。
【００１７】
第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００１８】
第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００１９】
第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００２０】
第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２１】
第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００２２】
第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２３】
第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２４】
第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００２５】
第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】オリゴヌクレオチドなし（Ｃ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、または種々の無置換または２’もしくは３’置換オリゴヌクレオチドの存在下におけるマウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２】オリゴヌクレオチドを投与されていないか、または、種々の無置換または２’もしくは３’置換オリゴヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示した図である。
【図３】マウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果、および、オリゴヌクレオチドを投与していないか（Ｃ）、または、種々の無置換またはメチルホスホネート置換オリゴヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示した図である。下線を付したヌクレオシドは、３’位にメチルホスホネート結合を有する。
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的な使用に関する。本明細書中に引用した特許および出版物は、当該分野における知識レベルを反映しており、参照によりその全体をこの明細書に組込む。本明細書中に引用した任意の参照の任意の教示と本明細書との間に対立がある場合、本発明の目的のためには、後者が優先されるべきである。
【００２８】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２９】
当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えることを発見した。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの特定の５’または３’位への、荷電していないヌクレオシド間結合の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【００３０】
本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「相補的」という用語は、ゲノム領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物に、生理学的な条件下でハイブリダイズする能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖間の、好ましくはワトソン−クリック型またはフーグスティン型塩基対を形成する、塩基特異的水素結合の結果であるが、他の様式の水素結合、ならびに、塩基スタッキングもまた、ハイブリダイゼーションをもたらすことができる。実際的な問題として、このようなハイブリダイゼーションは、特異的な遺伝子発現の阻害の観察から推測することができる。
【００３１】
本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「アンチセンス活性」という用語は、オリゴヌクレオチドが、細胞または動物内に導入されたときに、それが相補的である遺伝子の発現の減少を惹起するものを意味する。
【００３２】
第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００３３】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入すること」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成することを意味する。３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの合成は、最近、Kumar and Takaku, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9: 2515-2520 (1999)に記載された。
【００３４】
第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む。
【００３５】
好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する。
【００３６】
第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００３７】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００３８】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起（mitogenesis）およびトロビン血餅形成の抑制（inhibition of thrombin clot formation）からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００３９】
第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００４０】
本発明の第４、第５および第６の側面に関しては、好ましい荷電していないヌクレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプチド結合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこれに限定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、および、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、それにより置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ（carbalkoxyl）基、またはアミノ基によって置換されていてもよい。
【００４１】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が荷電されていない結合を形成することを意味する。荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４２】
第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。
【００４３】
第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含む。
【００４４】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００４５】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００４６】
第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００４７】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が２’−５’結合を形成することを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４８】
第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する。
【００４９】
第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含む。
【００５０】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００５１】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００５２】
第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００５３】
本発明の第１０の側面に関しては、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、遺伝子または遺伝子転写物と正確に相補的であり、そして、それが正確に相補的な遺伝子または遺伝子転写物の発現を減少させることができるオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入すること」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成することを意味する。
【００５５】
第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００５６】
本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００５７】
第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００５８】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００５９】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。
【００６０】
このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
本発明のこの側面の方法は、免疫系のモデル研究に有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００６１】
第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６２】
本発明の第１３、第１４および第１５の側面に関しては、好ましい荷電していないヌクレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプチド結合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこれに限定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、および、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、それにより置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基によって置換されていてもよい。
【００６３】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌクレオシドの３’結合であることを意味する。荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００６４】
第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００６５】
本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。
本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００６６】
第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６７】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００６８】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
【００６９】
第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００７０】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、２’−５’ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌクレオシドの３’結合であることを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００７１】
第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００７２】
本発明の第１７の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００７３】
第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００７４】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００７５】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
【００７６】
本発明の全ての側面に関して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個または３個以上のデオキシリボヌクレオチドのポリマー、または、２’−ハロ−ヌクレオシド、２’または３’置換、２’または３’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せを含む、任意の修飾されたヌクレオシドを含む。このようなモノマーは、公知の任意の多様なヌクレオシド間結合により互いに結合されていてもよい。ある好ましい態様においては、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエートまたはホスホルアミデート結合、任意の前記のものの２’−５’結合、または、それらの組合せでもよい。オリゴヌクレオチドという用語はまた、化学的に修飾された塩基または糖を有し、および／または、親油基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含むがこれらに限定されない追加の置換基を有するこのようなポリマーを包含する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドという用語はまた、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび、五炭糖でない（例えば六炭糖の）主鎖または主鎖部分を含むオリゴヌクレオチドを包含する。本発明に関して、「３’−Ｏ−置換」という用語は、五炭糖部分の３’位の、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、または、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−下級アルキル基、または、２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または例えば、ハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシル基またはアミノ基によって置換されていてもよい）による置換を意味し、あるいは、このような３’置換は、水酸基（リボヌクレオシドを生成するための）、アミノ基またはハロゲノ基であってもよい。
【００７８】
本発明の全ての側面に関して、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」という用語は、ジヌクレオチド５’−シチジン−グアニジン−３’を意味し、ここでｐはヌクレオチド間結合であり、そして、ジヌクレオチドの糖主鎖は、リボース、デオキシリボース、または３’置換リボース、またはそれらの組合せであってもよい。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、立体特異性（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエートまたはアルキルホスホネート、および、上記のものの任意の２’−５’共有結合から選択される。ホスホジエステルでない、ホスホロチオエートでない態様は、免疫刺激効果をさらに低減するだろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホルジチオエートから選択される。
【００７９】
以下の例は本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００８０】
例１
部位特異的３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドを、自動化ＤＮＡ合成装置（Expedite 8909, PE Biosystems, MA）で固相（１μモルスケール）ホスホルアミダイト化学を用いて合成した。３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドホスホロチオエートのセグメントを、３’−Ｏ−メチル−２’−シアノエチルリボヌクレオシドホスホルアミダイト（ChemGenes, MA）を用いて、オリゴヌクレオチド内に組込んだ。オリゴヌクレオチドを、３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−ジオキシドを用いて硫化した。オリゴヌクレオチドを予備逆相ＨＰＬＣで精製し、ＣＧＥ（PE Nelson Turbochrom softwareを介してデータを処理）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Bruker Profelx III質量分析計）で特徴化した。
【００８１】
例２
in vitroでの免疫刺激効果の調節：３’置換
本研究においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するために、我々は、例１に記載のとおりに、マウス脾臓細胞増殖アッセイを用いた。表１に示したオリゴをこれらの研究に使用した。
【表１】
【００８２】
我々は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含むＰＳ−オリゴヌクレオチド（オリゴ１）、および、修飾されたヌクレオシドにより、１または２個のデオキシヌクレオシドの置換を特定部位で行なったオリゴ２〜５を使用した。
オリゴ２〜５における３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドによる置換は、同時に２’−５’ヌクレオシド間結合の組込みをもたらした。介在するヌクレオシドなしのＣｐＧの５’置換（オリゴ２）は、免疫刺激活性を減少させた。驚くべきことに、介在するヌクレオシドなしのＣｐＧの３’置換（オリゴ５）もまた、免疫刺激活性を減少させた。加えて、ＣｐＧの３’における３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド置換を伴うオリゴ３および４は、免疫刺激活性を増大させた（指数はそれぞれ４．６±０．４３および５．７±０．８７）。
【００８３】
例３
in vivoでの免疫刺激効果の調節：メチルホスホネート置換
in vitroの結果のin vivoモデルでの適用性を試験するために、選択したオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性のレベルの指標として脾腫の度合いを測定した。５ｍｇ／ｋｇの単一用量をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、４〜６週齢、Harlan Spraque Dawley Inc）に腹腔内投与した。マウスを投与の７２時間後に屠殺し、脾臓を採取し重量を測定した。陽性対照であるオリゴ１は、ＰＢＳのみを受けた陰性対照マウスに比べ、脾臓重量の７４％の増加をもたらした。
【００８４】
メチルホスホネートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを図３に示す。オリゴヌクレオチドを、ＣｐＧジヌクレオチドから５’側に３または４ヌクレオチド、またはＣｐＧジヌクレオチドから３’側に２または３ヌクレオチドにメチルホスホネート結合を有するように調製した。図３に示すとおり、全てのこれらのオリゴヌクレオチドは、マウス脾臓細胞増殖アッセイおよび脾臓肥大アッセイの両方で、オリゴ１よりもより免疫刺激的であった。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、2001年1月26日に提出された、出願番号第６０／１７８,５６２号の米国仮出願に対する優先権を主張しており、この結果、その全内容は参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの診断的プローブ法から遺伝子発現のアンチセンス的な阻害に至る、多様な技術に使用されており、近代的な分子生物学において必要不可欠な道具となった。オリゴヌクレオチドのこの広範な使用は、オリゴヌクレオチド合成のための迅速、安価かつ効率的な方法に対する要求を増大させるに至った。
【０００４】
アンチセンス用途および診断用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在、定法にしたがって達成することができる。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 1991); および Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); および Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)を参照。初期の合成アプローチは、ホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学を含む。Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)は、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学を開示している。Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これらの初期のアプローチは、合成のためのより効率的なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネートアプローチに、大きく道を譲った。Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)は、ポリヌクレオチドの合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示している。Agrawal and Zamecnik、米国特許第５,１４９,７９８号（１９９２）は、Ｈ−ホスホネートアプローチによる最適化されたオリゴヌクレオチドの合成を開示している。
【０００５】
これら両方の近代的アプローチは、多様な修飾されたヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するために使用された。Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホルアミデートの合成を開示している。Agrawal et al., Proc. Antl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)は、Ｈ−ホスホネート化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホルアミデートおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【０００６】
より最近になって、いくつかの研究者が、疾患の治療的処置に対するアンチセンスアプローチの有効性を証明した。Crooke, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viiiは、ヒトサイトメガロウイルス誘導性網膜炎の処置のためのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが販売承認を得たことを開示している。残念ながら、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は、当初予想していたより複雑になった。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより惹起されたある種の効果は、予想したアンチセンスメカニズムでは説明できなかった。例えば、McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)は、「センス」ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特異的な免疫刺激を起こすことを教示している。この副作用および他の副作用により、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの姿は複雑になった。
【０００７】
一方、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘導できるという観察は、この副作用を治療の道具として発展させることへの関心を創出した。これらの努力は、ジヌクレオチドＣｐＧを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに集中した。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含有するホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファおよびガンマの合成を誘導し、そして、ナチュラルキラー活性を増強できることを教示している。Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995)は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)は、このようなオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216-124 (1998)は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強することを教示している。McCluskie and Davis, The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を増強することを教示している。
【０００８】
これらの報告は、ＣｇＧ含有オリゴヌクレオチドによって惹起される免疫応答を調節できることに対する要求があることを明らかにしている。理想的には、このような調節は、アンチセンス用途において免疫刺激効果を減少させ、ならびに、免疫療法用途において免疫刺激効果を増大させることを含むべきである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えることを発見した。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’側の特定の位置への、荷電していないヌクレオシド間結合（uncharged internucleoside linkage）の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【００１１】
第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００１２】
第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む。
【００１３】
第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００１４】
第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入することを含む。
第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００１５】
第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含む。
第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００１６】
第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含む。
【００１７】
第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００１８】
第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００１９】
第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００２０】
第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２１】
第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００２２】
第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２３】
第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２４】
第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００２５】
第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】オリゴヌクレオチドなし（Ｃ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、または種々の無置換または２’もしくは３’置換オリゴヌクレオチドの存在下におけるマウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２】オリゴヌクレオチドを投与されていないか、または、種々の無置換または２’もしくは３’置換オリゴヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示した図である。
【図３】マウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果、および、オリゴヌクレオチドを投与していないか（Ｃ）、または、種々の無置換またはメチルホスホネート置換オリゴヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示した図である。下線を付したヌクレオシドは、３’位にメチルホスホネート結合を有する。
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的な使用に関する。本明細書中に引用した特許および出版物は、当該分野における知識レベルを反映しており、参照によりその全体をこの明細書に組込む。本明細書中に引用した任意の参照の任意の教示と本明細書との間に対立がある場合、本発明の目的のためには、後者が優先されるべきである。
【００２８】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２９】
当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えることを発見した。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの特定の５’または３’位への、荷電していないヌクレオシド間結合の導入が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは低減する。
【００３０】
本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「相補的」という用語は、ゲノム領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物に、生理学的な条件下でハイブリダイズする能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖間の、好ましくはワトソン−クリック型またはフーグスティン型塩基対を形成する、塩基特異的水素結合の結果であるが、他の様式の水素結合、ならびに、塩基スタッキングもまた、ハイブリダイゼーションをもたらすことができる。実際的な問題として、このようなハイブリダイゼーションは、特異的な遺伝子発現の阻害の観察から推測することができる。
【００３１】
本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「アンチセンス活性」という用語は、オリゴヌクレオチドが、細胞または動物内に導入されたときに、それが相補的である遺伝子の発現の減少を惹起するものを意味する。
【００３２】
第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００３３】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入すること」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成することを意味する。３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの合成は、最近、Kumar and Takaku, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9: 2515-2520 (1999)に記載された。
【００３４】
第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む。
【００３５】
好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する。
【００３６】
第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００３７】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００３８】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起（mitogenesis）およびトロビン血餅形成の抑制（inhibition of thrombin clot formation）からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００３９】
第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００４０】
本発明の第４、第５および第６の側面に関しては、好ましい荷電していないヌクレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプチド結合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこれに限定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、および、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、それにより置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ（carbalkoxyl）基、またはアミノ基によって置換されていてもよい。
【００４１】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が荷電されていない結合を形成することを意味する。荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４２】
第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。
【００４３】
第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含む。
【００４４】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００４５】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００４６】
第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。
【００４７】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が２’−５’結合を形成することを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４８】
第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する。
【００４９】
第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含む。
【００５０】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００５１】
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００５２】
第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含む。
【００５３】
本発明の第１０の側面に関しては、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、遺伝子または遺伝子転写物と正確に相補的であり、そして、それが正確に相補的な遺伝子または遺伝子転写物の発現を減少させることができるオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを導入すること」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成することを意味する。
【００５５】
第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００５６】
本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００５７】
第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００５８】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００５９】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。
【００６０】
このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
本発明のこの側面の方法は、免疫系のモデル研究に有用であり、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００６１】
第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６２】
本発明の第１３、第１４および第１５の側面に関しては、好ましい荷電していないヌクレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプチド結合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこれに限定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、および、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、それにより置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基によって置換されていてもよい。
【００６３】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌクレオシドの３’結合であることを意味する。荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００６４】
第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００６５】
本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。
本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００６６】
第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６７】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００６８】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
【００６９】
第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００７０】
本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルにおける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、２’−５’ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌクレオシドの３’結合であることを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００７１】
第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する。
【００７２】
本発明の第１７の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含んでもよい。
【００７３】
第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００７４】
本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状または代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効かも知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇから、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかもしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００７５】
ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはその両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。
【００７６】
本発明の全ての側面に関して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個または３個以上のデオキシリボヌクレオチドのポリマー、または、２’−ハロ−ヌクレオシド、２’または３’置換、２’または３’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せを含む、任意の修飾されたヌクレオシドを含む。このようなモノマーは、公知の任意の多様なヌクレオシド間結合により互いに結合されていてもよい。ある好ましい態様においては、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエートまたはホスホルアミデート結合、任意の前記のものの２’−５’結合、または、それらの組合せでもよい。オリゴヌクレオチドという用語はまた、化学的に修飾された塩基または糖を有し、および／または、親油基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含むがこれらに限定されない追加の置換基を有するこのようなポリマーを包含する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドという用語はまた、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび、五炭糖でない（例えば六炭糖の）主鎖または主鎖部分を含むオリゴヌクレオチドを包含する。本発明に関して、「３’−Ｏ−置換」という用語は、五炭糖部分の３’位の、ハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、または、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−下級アルキル基、または、２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、無置換であってもよく、または例えば、ハロゲノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシル基またはアミノ基によって置換されていてもよい）による置換を意味し、あるいは、このような３’置換は、水酸基（リボヌクレオシドを生成するための）、アミノ基またはハロゲノ基であってもよい。
【００７８】
本発明の全ての側面に関して、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」という用語は、ジヌクレオチド５’−シチジン−グアニジン−３’を意味し、ここでｐはヌクレオチド間結合であり、そして、ジヌクレオチドの糖主鎖は、リボース、デオキシリボース、または３’置換リボース、またはそれらの組合せであってもよい。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、立体特異性（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエートまたはアルキルホスホネート、および、上記のものの任意の２’−５’共有結合から選択される。ホスホジエステルでない、ホスホロチオエートでない態様は、免疫刺激効果をさらに低減するだろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホルジチオエートから選択される。
【００７９】
以下の例は本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００８０】
例１
部位特異的３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドを、自動化ＤＮＡ合成装置（Expedite 8909, PE Biosystems, MA）で固相（１μモルスケール）ホスホルアミダイト化学を用いて合成した。３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドホスホロチオエートのセグメントを、３’−Ｏ−メチル−２’−シアノエチルリボヌクレオシドホスホルアミダイト（ChemGenes, MA）を用いて、オリゴヌクレオチド内に組込んだ。オリゴヌクレオチドを、３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−ジオキシドを用いて硫化した。オリゴヌクレオチドを予備逆相ＨＰＬＣで精製し、ＣＧＥ（PE Nelson Turbochrom softwareを介してデータを処理）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Bruker Profelx III質量分析計）で特徴化した。
【００８１】
例２
in vitroでの免疫刺激効果の調節：３’置換
本研究においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するために、我々は、例１に記載のとおりに、マウス脾臓細胞増殖アッセイを用いた。表１に示したオリゴをこれらの研究に使用した。
【表１】
【００８２】
我々は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含むＰＳ−オリゴヌクレオチド（オリゴ１）、および、修飾されたヌクレオシドにより、１または２個のデオキシヌクレオシドの置換を特定部位で行なったオリゴ２〜５を使用した。
オリゴ２〜５における３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドによる置換は、同時に２’−５’ヌクレオシド間結合の組込みをもたらした。介在するヌクレオシドなしのＣｐＧの５’置換（オリゴ２）は、免疫刺激活性を減少させた。驚くべきことに、介在するヌクレオシドなしのＣｐＧの３’置換（オリゴ５）もまた、免疫刺激活性を減少させた。加えて、ＣｐＧの３’における３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド置換を伴うオリゴ３および４は、免疫刺激活性を増大させた（指数はそれぞれ４．６±０．４３および５．７±０．８７）。
【００８３】
例３
in vivoでの免疫刺激効果の調節：メチルホスホネート置換
in vitroの結果のin vivoモデルでの適用性を試験するために、選択したオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性のレベルの指標として脾腫の度合いを測定した。５ｍｇ／ｋｇの単一用量をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、４〜６週齢、Harlan Spraque Dawley Inc）に腹腔内投与した。マウスを投与の７２時間後に屠殺し、脾臓を採取し重量を測定した。陽性対照であるオリゴ１は、ＰＢＳのみを受けた陰性対照マウスに比べ、脾臓重量の７４％の増加をもたらした。
【００８４】
メチルホスホネートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを図３に示す。オリゴヌクレオチドを、ＣｐＧジヌクレオチドから５’側に３または４ヌクレオチド、またはＣｐＧジヌクレオチドから３’側に２または３ヌクレオチドにメチルホスホネート結合を有するように調製した。図３に示すとおり、全てのこれらのオリゴヌクレオチドは、マウス脾臓細胞増殖アッセイおよび脾臓肥大アッセイの両方で、オリゴ１よりもより免疫刺激的であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを作製するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドがオリゴヌクレオチド中に導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド中に１個のみの３’置換ヌクレオシドが導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に３’置換ヌクレオシドを含む、前記方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを導入することを含む、前記方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項２５】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項３９】
遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを作製するために使用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に導入されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド中に１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合が導入されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さである、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記方法。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチドが１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項５４】
２’−５’ヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項６０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項５９に記載の方法。
【請求項１】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを作製するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドがオリゴヌクレオチド中に導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド中に１個のみの３’置換ヌクレオシドが導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に３’置換ヌクレオシドを含む、前記方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを導入することを含む、前記方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項２５】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項３９】
遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを作製するために使用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に導入されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド中に１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合が導入されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さである、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記方法。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチドが１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させる方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記方法。
【請求項５４】
２’−５’ヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項６０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項５９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２９２８２９（Ｐ２００９−２９２８２９Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８０４０３（Ｐ２００９−１８０４０３）
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【分割の表示】特願２００１−５５４３９９（Ｐ２００１−５５４３９９）の分割
【原出願日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【分割の表示】特願２００１−５５４３９９（Ｐ２００１−５５４３９９）の分割
【原出願日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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