バクテロイデス用プライマー及び該プライマーを用いた検出方法
【課題】ヒト腸内において検出される各種の菌を属もしくは菌種レベルで特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブ、並びにこのプライマーを使用するバクテロイデスの検出方法であって、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程および（２）上記プライマーの1又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含む方法。
【解決手段】特定の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブ、並びにこのプライマーを使用するバクテロイデスの検出方法であって、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程および（２）上記プライマーの1又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー、プローブ及びこれを用いた腸内細菌の菌属、菌種特異的な検出・同定・解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物等の腸内には多様な細菌が生息し、腸内細菌叢を形成している。このような腸内細菌としてはビフィドバクテリウム属細菌やバクテロイデス属細菌等様々なものがあり、宿主である生体の生理状態等に影響を与えている。
【０００３】
例えば、ビフィドバクテリウム属細菌や乳酸菌等の腸内有用細菌数が増加すると、整腸効果、免疫賦活効果が高まることが知られており、また、腸内最優勢菌の１つであるバクテロイデスグループの細菌などは、菌体表面のＬＰＳ（lipopolysaccarido）にトキシン様の毒素活性があることも見出されているため、比較的悪玉菌として認識されている。
【０００４】
従ってヒトや動物等の腸内細菌叢を解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。現状ではその手段として、種々の選択培地を組み合せて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００５】
このため、菌種の同定、腸内細菌叢の解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑で、試験者の熟練を要するものであった。
【０００６】
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている（非特許文献１）。しかしながら、この同定法も長時間を要し、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。
【０００７】
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えばバクテロイデスグループ細菌（特許文献１）に特異的なプローブを、ビフィドバクテリウム属細菌菌種（特許文献２）に特異的なプライマーを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内にはこの他にも様々な細菌が存在しているため、上記の他の菌をもカバーできるプライマーやプローブのセットも要望されている。
【０００８】
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、種々の菌と反応してしまい、必要な菌に対する特異性が得られないものであることが多い。このため、腸内の菌の動向を把握するのに十分なプライマーが更に求められていた。
【特許文献１】特開平１１−２８０９０号
【特許文献２】特開平１１−１２３０９３号
【非特許文献１】Collins,M.D.,et al INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 39,105-108(1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、ヒト腸内において検出される各種の菌を属もしくは菌種レベルで特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
斯かる実状に鑑み本発明者は、多大な労力を投入し、種々の遺伝子のシークエンシング、アライメント等々の煩雑な作業を行った結果、各種腸内細菌に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見出し、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号２、５−１０、２６及び２９−３４から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブを提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、配列番号２と２６、５と２９、６と３０、７と３１、８と３２、９と３３及び１０と３４から選ばれる塩基配列の組み合せ又はこれらの塩基配列の組み合せに相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマーを提供するものである。
【００１３】
更に、本発明は、上記プライマーの１又は２以上を使用することを特徴とするバクテロイデスの検出方法を提供するものである。
【００１４】
更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及び（２）上記プライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むバクテロイデスの検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に腸内細菌の検出・同定を行うことができる。また他の菌に特異的なプライマー等と組み合せて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行い消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の抽出に特異的なプライマーを具体的に挙げれば、属特異的プライマーであるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属特異的プライマー、バクテロイデス（Bacteroides）グループ細菌のサブグループ特異的プライマーであるバクテロイデス（Bacteroides）クラスター特異的プライマー、プレボテラ（Prevotella）クラスター特異的プライマー、クロストリジウム（Clostridium）クラスターＸＩＶ特異的プライマー、及び菌種特異的プライマーであるバクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・セタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・エガーシィー（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・ブルゲイタス（Bacteroides vulgatus）、クロストリジウム・スフェノイデス（Clostridium sphenoides）、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、クロストリジウム・イノカム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridium paraputrificum）、クロストリジウム・バイファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・ディフィサイル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii) 、クロストリジウム・クロストリジフォーム（Clostridium clostridiiforme）、クロストリジウム・ネクサイル（Clostridium nexile）、クロストリジウム・コクレアータム（Clostridium cocleatum）を例示することができる。
【００１７】
バクテロイデスグループ（Bacteroidesceae）細菌は、グラム陰性の嫌気性菌であり、ヒトの腸管内における最優勢菌である。バクテロイデスグループには、近年新しい属が提唱され、そのサブグループは、バクテロイデス（Bacteroides）クラスター、プレボテラ（Prevotella）クラスター、ポルフィロモナス（Porphyromonas）クラスター、ニュー１（New1）、ニュー２（New2）の５つに大別される。
【００１８】
上記バクテロイデス属細菌は、全てバクテロイデスサブグループ内のバクテロイデスクラスター内に属する。クロストリジウム属細菌は、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・パラプトリフィカムがクラスター１に、クロストリジウム・ディフィサイル、クロストリジウム・バイファーメンタンス、クロストリジウム・ソルデリーがクラスター１１に、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・インドリス、クロストリジウム・クロストリジフォーム、クロストリジウム・ネクサイルがクラスター１４ａに、クロストリジウム・イノカムがクラスター１６に、クロストリジウム・ラモーサム、クロストリジウム・コクレアータムがクラスター１８にそれぞれ属する。
【００１９】
上記の腸内細菌に特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００２０】
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Genbank等）や本発明者が比較対象として新たにシークエンスを行って得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的には、クロストリジウム・パーフリンジェンスＪＣＭ１２９０T、クロストリジウム・ブチリカムＪＣＭ１３９１T、クロストリジウム・バイファーメンタンスＪＣＭ１３８６T、クロストリジウム・ディフィサイルＪＣＭ１２９６０T、クロストリジウム・ソルデリーＪＣＭ３８１４T、クロストリジウム・スフェノイデスＪＣＭ１４１５T、クロストリジウム・コクレアータムＪＣＭ１３９７T、クロストリジウム・インドリスＪＣＭ１３８０Tである。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。
【００２１】
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。その結果、ビフィドバクテリウム属に特異的なプライマーでは、大腸菌のナンバリングにおける１５３〜１６９領域と７２０〜６９９領域に属に特徴的な配列があり、以下バクテロイデスクラスターでは１４９〜１６９領域と６４６〜６２６領域に、プレボテラクラスターでは８０３〜８２７領域と１３３５〜１３１１領域に、クロストリジウムクラスターＸＩＶでは４７７〜４９６領域と９１６〜８９５領域に属に特徴的な配列があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１５〜２５ｂ．ｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００２２】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び２５記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム属に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行うためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライマー等と組み合せて用いることも可能であるが、その組み合せによっては種特異的な検出を行えないものもあるので、両者を組み合せることが望ましい。
【００２３】
また、配列番号２及び２６記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデスクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２４】
また、配列番号３及び２７記載の塩基配列を有するものは、プレボテラクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２５】
また、配列番号４及び２８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウムクラスターＸＩＶに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２６】
また、配列番号５及び２９記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・オバタス及びバクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２７】
また、配列番号６及び３０記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２８】
また、配列番号７及び３１記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・フラギリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２９】
また、配列番号８及び３２記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ユニフォルミスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３０】
また、配列番号９及び３３記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・エガーシィーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３１】
また、配列番号１０及び３４記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ブルゲイタスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３２】
また、配列番号１１及び３５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３３】
また、配列番号１２及び３６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ブチリカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３４】
また、配列番号１３及び３７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パラプトリフィカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３５】
また、配列番号１４及び３８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・バイファーメンタンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３６】
また、配列番号１５及び３９記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ディフィサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３７】
また、配列番号１６及び４０記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ソルデリーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３８】
また、配列番号１７及び４１記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・クロストリジフォームに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３９】
また、配列番号１８、１９及び４２記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ネクサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４０】
また、配列番号２０及び４３記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・スフェノイデスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４１】
また、配列番号２１及び４４記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・インドリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４２】
また、配列番号２２及び４５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・イノーカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４３】
また、配列番号２３及び４６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ラモーサムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４４】
また、配列番号２４及び４７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・コクレアータムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４５】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種（標準株及び基準株）のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。
【００４６】
一方で、今回新たにシークエンスを行ったことにより、配列番号１〜４７に示す配列番号にも種特異的な配列が見出されている。例えばバクテロイデス・オバタスでは、プライマー設計時には特異性を有すると考えられた配列がフォワードで３箇所、リバースで２箇所見出されたが、これらの中には同定の際、別の種に属する株と反応してしまうものがあった。また、クロストリジウム属ではパーフリンジェンス、ブチリカムで１組、パラブトリフィカム、バイファーメンタンス、ディフィサイル、スフェノイデスで２組、クロストリジフォーム、インドリスで４組、ネクサイルで１５組、ソルデリーで３１組のプライマーセットを作製したが、インドリスで２組、その他は１組だけが特異性を有しているに過ぎず、これ以外の配列では、他菌種と反応してしまったり、目的とする菌種と反応しないといった問題があり使用上好ましいものではなかった。
【００４７】
因みに、他菌種と反応してしまったものを例示すると、バクテロイデス・オバタス特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシーとの反応が、クロストリジウム・ネクサイル特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のフラギリス、エガーシー、ユニフォルミスとの反応が、クロストリジウム・ソルデリー特異的な配列のプライマーでは、クロストリジウム属のバイファーメンタンス、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシー、ユニフォルミス、オバタス、ブルゲイタスとの反応が見られた。
一方、本発明のプライマーとして選択したものの中でも、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと、クロストリジウム・ソルデリー特異的プライマーは、バクテロイデス属のオバタス及びブルゲイタスと反応してしまう。しかし、これらの菌種ではより特異性の高いプライマーを作製することは不可能と考えられ、また、非特異的な反応を起こす菌種に特異的なプライマーを併用すれば、菌種の同定、検出を簡便に行えるものと判断されるため、使用に支障をきたすことはないと考えられる。
【００４８】
本発明のプライマーは、このように各種腸内細菌への特異性を有するため、これらを用いて腸内細菌を迅速に検出・同定できる。また、各菌の選択培地（例えばバクテロイデス属細菌であれば、選択培地であるＮＢＧＴ培地（腸内菌の世界ｐ３２４；光岡知足、叢文社（１９８０））に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。
【００４９】
培養を行うことなく糞便等から目的とする菌属、菌種を特異的に検出するためには、例えば、まず、糞便１mLを遠心分離して得られるペレットからベンジルクロライド法（Zhu,H.,Qu,L.H.(1993)Isolation of genomicＤＮＡ from plants,fungi and bacteria usingbenzyl chloride.nucleic Acids Res.21,5279-5280)等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００５０】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法（Wang et al FEMS Microbiology letters 124(1994)229-238 ）等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を同定することができる。
【００５１】
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、定法であるMaraur法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記ベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。
【００５２】
このように、コロニーや糞便等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出することが可能であった。また、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量的検出も可能である。
【００５３】
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合せても用いることができる。
【００５４】
また、本発明のプライマーを上記腸内細菌菌種特異的プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合せて用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行い、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例１ プライマーの設計及び合成
（１）ビフィドバクテリウム属、バクテロイデスクラスター、プレボテラクラスター及びクロストリジウムクラスターXIV特異的プライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおける、ビフィドバクテリウム属はＶ２領域とＶ４周辺の領域に、バクテロイデスクラスターはＶ２領域とＶ４領域にプレボテラクラスターはＶ５周辺の領域とＶ８周辺の領域に、クロストリジウムクラスターXIVはＶ３領域とＶ５−Ｖ６間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表１）。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（２）バクテロイデス属に菌種特異的なプライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者が新たにシークエンシングした配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ３からＶ５領域の間に特異性が認められたので、この部分をターゲットして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表２）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
実施例２ プライマーの特異性確認
実施例１（１）のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（標準株及び基準株）とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表３に示す、１４菌属８７菌種の細菌をＧＡＭ培地（Nissui社製）にて嫌気的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ベンジルクロライド法（Zhu,H.et al(1993)Nucleic Acids Research 21,5279-5280）により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、ＧＡＭ培地を用いた一夜培養菌液１．５mLの遠心菌体にExtraction buffer（１００mM Ｔｒｉｓ，４０mM ＥＤＴＡ pH９．０）２５０μＬ、ベンジルクロライド１５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。３Ｍ酢酸ナトリウム１５０μＬを加えて氷中で１５分間静置した後、１５０００rpm、１０分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ７０％エタノールで洗浄した。沈殿を５０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（pH８．０）／１mM ＥＤＴＡ）に溶かして濃度を測定し、１０μｇ／mLの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００６０】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mL ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．８μＭプライマー、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、１０ng鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００６１】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Mupid-２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表３に示す通りであり、プライマーは特異的にバンドを形成した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例３ プライマーを用いた菌の同定
３５名の成人糞便サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。抽出法及びＰＣＲの条件は実施例１（１）と同じである。その結果、ビフィドバクテリウム属とクロストリジウムクラスターＸＩＶは３５名全てから、バクテロイデスは３４名からプレボテラは２２名から、それぞれ検出された。
【００６４】
実施例４ プライマーの特異性確認
実施例１（２）のバクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の基準株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表４、５に示す、６菌種のバクテロイデスクラスター細菌基準株、バクテロイデスサブグループに属する２１菌株、及びその他の腸内から分離される代表的な菌種２３株をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、培地上に出現したコロニーから菌体をかきとり、１００μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁する。この懸濁液を１００℃、５分間熱した後、氷中で急冷した。
【００６５】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００６６】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りである。バクテロイデス・オバタス以外のプライマーは特異的にバンドを形成したがオバタス特異的プライマーはフラギリスやセタイオタオミクロンともバンドを形成してしまった（表４、５）。
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
実施例５ バクテロイデス・オバタス特異的プライマーの再設計及び合成
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、実施例１と同様にプライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ２領域及びＶ３とＶ８の間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして再度設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表６）。
【００７０】
【表６】
【００７１】
実施例６ プライマーの特異性確認
実施例５のバクテロイデス・オバタス特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
前記表４、５に示す細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
【００７２】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００７３】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りであり、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと弱いバンドを形成したものの、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは特異的にバンドを形成した。
【００７４】
実施例７ プライマーの設計及び合成
表７、８に示すクロストリジウム属細菌菌種に特異的なプライマーを設計した。各種データベースより得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者がシークエンシングした配列を基に、特異性の認められた部分をターゲットとしてプライマーを設計した。こうして設計された塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（なお、特異性を有する配列は、上記のように表７、８以外にも多種認められたが、後に示す特異性確認試験で、問題が生じたものは記載していない）。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
実施例８ プライマーの特異性確認
実施例７のクロストリジウム属の菌種に特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表９（グループ１）、グループ２及びグループ３に示す、１１菌属４７菌種の細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
【００７８】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅに０．６μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．１２μＬのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ、タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ０．６μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で９４℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００７９】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。０．８％アガロース（Ｈ１４「ＴＡＫＡＲＡ」；タカラ社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（１．０mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表９に示す通りである。また、表９以外の菌に対しては、クロストリジウム・ソルデリー菌種特異的プライマー（ＣＩＳＯＲ−ＦＲ）が、クロストリジウム・ソルデリー以外に下記グループ３のバクテロイデス・オバタスＪＣＭ５８２４T 及びバクテロイデス・ブルガタスＪＣＭ５８２６T でバンドが認められた。その他のプライマーに関しては標的とした菌種以外にバンドは認められなかった。
【００８０】
【表９】
【００８１】
グループ２
１３菌体以外のClostridium９菌種（基準株）
C.barati ATCC 27639T
C.celatum ATCC 27791T
C.loptum ATCC 29065T
C.ghoni ATCC 25257T
C.aminovalericum ATCC13725T
C.coccoides ATCC 29236T
C.oroticum ATCC 13619T
C.symbiosum ATCC 14940T
C.spiroforme ATCC 29900T
グループ３
代表的ヒト腸内細菌２５菌種
Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum JCM 3718T
F.varium JCM 3722
F.necrophorum subsp. funduliforme JCM 3724T
Acinetobacter sp. ATCC 15308
Eschelihia coli MGG
Proteus vulgatus M52
Pseudomonas aeruginosa PA-15
Enterococcus faecalis ATCC 19433T
E.faecium ATCC 19434T
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356T
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius ATCC 11741T
Bifidobacterium adolescentis aE 1949
B.bifidum aE 319
B.breve aS-1
B.longum aE 1946
Eubacterium aerofaciens S 603
E.lentum VPI 0225 1
E.limosum ATCC 8486T
Bacterodies ovatus JCM 5824T
B.thetaiotaomicron JCM 5827T
B.fragilis DSM 2151T
B.eggerthii DSM 20697T
B.uniformis JCM 5828T
B.vulgatus JCM 5826T
B.distasonis JCM 5825T
【００８２】
実施例９ プライマーの特異性確認
バクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーを用い、ヒトふん便分離株をサンプルとして実施例４と同様の方法でサンプル中の菌種同定を行った。その結果、分離株２６株が同定された（表１０）。
なお、同一のサンプルの生物・生化学的性状を光岡らの方法（腸内菌の世界−嫌気性菌の分離と同定、光岡知足、叢文社）により確認したところ、本発明のプライマーによる同定（検出）結果と一致していた。
【００８３】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー、プローブ及びこれを用いた腸内細菌の菌属、菌種特異的な検出・同定・解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物等の腸内には多様な細菌が生息し、腸内細菌叢を形成している。このような腸内細菌としてはビフィドバクテリウム属細菌やバクテロイデス属細菌等様々なものがあり、宿主である生体の生理状態等に影響を与えている。
【０００３】
例えば、ビフィドバクテリウム属細菌や乳酸菌等の腸内有用細菌数が増加すると、整腸効果、免疫賦活効果が高まることが知られており、また、腸内最優勢菌の１つであるバクテロイデスグループの細菌などは、菌体表面のＬＰＳ（lipopolysaccarido）にトキシン様の毒素活性があることも見出されているため、比較的悪玉菌として認識されている。
【０００４】
従ってヒトや動物等の腸内細菌叢を解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。現状ではその手段として、種々の選択培地を組み合せて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００５】
このため、菌種の同定、腸内細菌叢の解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑で、試験者の熟練を要するものであった。
【０００６】
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている（非特許文献１）。しかしながら、この同定法も長時間を要し、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。
【０００７】
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えばバクテロイデスグループ細菌（特許文献１）に特異的なプローブを、ビフィドバクテリウム属細菌菌種（特許文献２）に特異的なプライマーを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内にはこの他にも様々な細菌が存在しているため、上記の他の菌をもカバーできるプライマーやプローブのセットも要望されている。
【０００８】
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、種々の菌と反応してしまい、必要な菌に対する特異性が得られないものであることが多い。このため、腸内の菌の動向を把握するのに十分なプライマーが更に求められていた。
【特許文献１】特開平１１−２８０９０号
【特許文献２】特開平１１−１２３０９３号
【非特許文献１】Collins,M.D.,et al INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 39,105-108(1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、ヒト腸内において検出される各種の菌を属もしくは菌種レベルで特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
斯かる実状に鑑み本発明者は、多大な労力を投入し、種々の遺伝子のシークエンシング、アライメント等々の煩雑な作業を行った結果、各種腸内細菌に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見出し、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号２、５−１０、２６及び２９−３４から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブを提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、配列番号２と２６、５と２９、６と３０、７と３１、８と３２、９と３３及び１０と３４から選ばれる塩基配列の組み合せ又はこれらの塩基配列の組み合せに相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマーを提供するものである。
【００１３】
更に、本発明は、上記プライマーの１又は２以上を使用することを特徴とするバクテロイデスの検出方法を提供するものである。
【００１４】
更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及び（２）上記プライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むバクテロイデスの検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に腸内細菌の検出・同定を行うことができる。また他の菌に特異的なプライマー等と組み合せて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行い消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の抽出に特異的なプライマーを具体的に挙げれば、属特異的プライマーであるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属特異的プライマー、バクテロイデス（Bacteroides）グループ細菌のサブグループ特異的プライマーであるバクテロイデス（Bacteroides）クラスター特異的プライマー、プレボテラ（Prevotella）クラスター特異的プライマー、クロストリジウム（Clostridium）クラスターＸＩＶ特異的プライマー、及び菌種特異的プライマーであるバクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・セタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・エガーシィー（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・ブルゲイタス（Bacteroides vulgatus）、クロストリジウム・スフェノイデス（Clostridium sphenoides）、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、クロストリジウム・イノカム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridium paraputrificum）、クロストリジウム・バイファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・ディフィサイル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii) 、クロストリジウム・クロストリジフォーム（Clostridium clostridiiforme）、クロストリジウム・ネクサイル（Clostridium nexile）、クロストリジウム・コクレアータム（Clostridium cocleatum）を例示することができる。
【００１７】
バクテロイデスグループ（Bacteroidesceae）細菌は、グラム陰性の嫌気性菌であり、ヒトの腸管内における最優勢菌である。バクテロイデスグループには、近年新しい属が提唱され、そのサブグループは、バクテロイデス（Bacteroides）クラスター、プレボテラ（Prevotella）クラスター、ポルフィロモナス（Porphyromonas）クラスター、ニュー１（New1）、ニュー２（New2）の５つに大別される。
【００１８】
上記バクテロイデス属細菌は、全てバクテロイデスサブグループ内のバクテロイデスクラスター内に属する。クロストリジウム属細菌は、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・パラプトリフィカムがクラスター１に、クロストリジウム・ディフィサイル、クロストリジウム・バイファーメンタンス、クロストリジウム・ソルデリーがクラスター１１に、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・インドリス、クロストリジウム・クロストリジフォーム、クロストリジウム・ネクサイルがクラスター１４ａに、クロストリジウム・イノカムがクラスター１６に、クロストリジウム・ラモーサム、クロストリジウム・コクレアータムがクラスター１８にそれぞれ属する。
【００１９】
上記の腸内細菌に特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００２０】
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Genbank等）や本発明者が比較対象として新たにシークエンスを行って得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的には、クロストリジウム・パーフリンジェンスＪＣＭ１２９０T、クロストリジウム・ブチリカムＪＣＭ１３９１T、クロストリジウム・バイファーメンタンスＪＣＭ１３８６T、クロストリジウム・ディフィサイルＪＣＭ１２９６０T、クロストリジウム・ソルデリーＪＣＭ３８１４T、クロストリジウム・スフェノイデスＪＣＭ１４１５T、クロストリジウム・コクレアータムＪＣＭ１３９７T、クロストリジウム・インドリスＪＣＭ１３８０Tである。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。
【００２１】
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。その結果、ビフィドバクテリウム属に特異的なプライマーでは、大腸菌のナンバリングにおける１５３〜１６９領域と７２０〜６９９領域に属に特徴的な配列があり、以下バクテロイデスクラスターでは１４９〜１６９領域と６４６〜６２６領域に、プレボテラクラスターでは８０３〜８２７領域と１３３５〜１３１１領域に、クロストリジウムクラスターＸＩＶでは４７７〜４９６領域と９１６〜８９５領域に属に特徴的な配列があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１５〜２５ｂ．ｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００２２】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び２５記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム属に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行うためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライマー等と組み合せて用いることも可能であるが、その組み合せによっては種特異的な検出を行えないものもあるので、両者を組み合せることが望ましい。
【００２３】
また、配列番号２及び２６記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデスクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２４】
また、配列番号３及び２７記載の塩基配列を有するものは、プレボテラクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２５】
また、配列番号４及び２８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウムクラスターＸＩＶに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２６】
また、配列番号５及び２９記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・オバタス及びバクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２７】
また、配列番号６及び３０記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２８】
また、配列番号７及び３１記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・フラギリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００２９】
また、配列番号８及び３２記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ユニフォルミスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３０】
また、配列番号９及び３３記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・エガーシィーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３１】
また、配列番号１０及び３４記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ブルゲイタスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３２】
また、配列番号１１及び３５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３３】
また、配列番号１２及び３６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ブチリカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３４】
また、配列番号１３及び３７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パラプトリフィカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３５】
また、配列番号１４及び３８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・バイファーメンタンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３６】
また、配列番号１５及び３９記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ディフィサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３７】
また、配列番号１６及び４０記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ソルデリーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３８】
また、配列番号１７及び４１記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・クロストリジフォームに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００３９】
また、配列番号１８、１９及び４２記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ネクサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４０】
また、配列番号２０及び４３記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・スフェノイデスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４１】
また、配列番号２１及び４４記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・インドリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４２】
また、配列番号２２及び４５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・イノーカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４３】
また、配列番号２３及び４６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ラモーサムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４４】
また、配列番号２４及び４７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・コクレアータムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。
【００４５】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種（標準株及び基準株）のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。
【００４６】
一方で、今回新たにシークエンスを行ったことにより、配列番号１〜４７に示す配列番号にも種特異的な配列が見出されている。例えばバクテロイデス・オバタスでは、プライマー設計時には特異性を有すると考えられた配列がフォワードで３箇所、リバースで２箇所見出されたが、これらの中には同定の際、別の種に属する株と反応してしまうものがあった。また、クロストリジウム属ではパーフリンジェンス、ブチリカムで１組、パラブトリフィカム、バイファーメンタンス、ディフィサイル、スフェノイデスで２組、クロストリジフォーム、インドリスで４組、ネクサイルで１５組、ソルデリーで３１組のプライマーセットを作製したが、インドリスで２組、その他は１組だけが特異性を有しているに過ぎず、これ以外の配列では、他菌種と反応してしまったり、目的とする菌種と反応しないといった問題があり使用上好ましいものではなかった。
【００４７】
因みに、他菌種と反応してしまったものを例示すると、バクテロイデス・オバタス特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシーとの反応が、クロストリジウム・ネクサイル特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のフラギリス、エガーシー、ユニフォルミスとの反応が、クロストリジウム・ソルデリー特異的な配列のプライマーでは、クロストリジウム属のバイファーメンタンス、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシー、ユニフォルミス、オバタス、ブルゲイタスとの反応が見られた。
一方、本発明のプライマーとして選択したものの中でも、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと、クロストリジウム・ソルデリー特異的プライマーは、バクテロイデス属のオバタス及びブルゲイタスと反応してしまう。しかし、これらの菌種ではより特異性の高いプライマーを作製することは不可能と考えられ、また、非特異的な反応を起こす菌種に特異的なプライマーを併用すれば、菌種の同定、検出を簡便に行えるものと判断されるため、使用に支障をきたすことはないと考えられる。
【００４８】
本発明のプライマーは、このように各種腸内細菌への特異性を有するため、これらを用いて腸内細菌を迅速に検出・同定できる。また、各菌の選択培地（例えばバクテロイデス属細菌であれば、選択培地であるＮＢＧＴ培地（腸内菌の世界ｐ３２４；光岡知足、叢文社（１９８０））に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。
【００４９】
培養を行うことなく糞便等から目的とする菌属、菌種を特異的に検出するためには、例えば、まず、糞便１mLを遠心分離して得られるペレットからベンジルクロライド法（Zhu,H.,Qu,L.H.(1993)Isolation of genomicＤＮＡ from plants,fungi and bacteria usingbenzyl chloride.nucleic Acids Res.21,5279-5280)等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００５０】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法（Wang et al FEMS Microbiology letters 124(1994)229-238 ）等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を同定することができる。
【００５１】
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、定法であるMaraur法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記ベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。
【００５２】
このように、コロニーや糞便等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出することが可能であった。また、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量的検出も可能である。
【００５３】
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合せても用いることができる。
【００５４】
また、本発明のプライマーを上記腸内細菌菌種特異的プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合せて用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行い、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例１ プライマーの設計及び合成
（１）ビフィドバクテリウム属、バクテロイデスクラスター、プレボテラクラスター及びクロストリジウムクラスターXIV特異的プライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおける、ビフィドバクテリウム属はＶ２領域とＶ４周辺の領域に、バクテロイデスクラスターはＶ２領域とＶ４領域にプレボテラクラスターはＶ５周辺の領域とＶ８周辺の領域に、クロストリジウムクラスターXIVはＶ３領域とＶ５−Ｖ６間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表１）。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（２）バクテロイデス属に菌種特異的なプライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者が新たにシークエンシングした配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ３からＶ５領域の間に特異性が認められたので、この部分をターゲットして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表２）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
実施例２ プライマーの特異性確認
実施例１（１）のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（標準株及び基準株）とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表３に示す、１４菌属８７菌種の細菌をＧＡＭ培地（Nissui社製）にて嫌気的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ベンジルクロライド法（Zhu,H.et al(1993)Nucleic Acids Research 21,5279-5280）により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、ＧＡＭ培地を用いた一夜培養菌液１．５mLの遠心菌体にExtraction buffer（１００mM Ｔｒｉｓ，４０mM ＥＤＴＡ pH９．０）２５０μＬ、ベンジルクロライド１５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。３Ｍ酢酸ナトリウム１５０μＬを加えて氷中で１５分間静置した後、１５０００rpm、１０分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ７０％エタノールで洗浄した。沈殿を５０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（pH８．０）／１mM ＥＤＴＡ）に溶かして濃度を測定し、１０μｇ／mLの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００６０】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mL ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．８μＭプライマー、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、１０ng鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００６１】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Mupid-２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表３に示す通りであり、プライマーは特異的にバンドを形成した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例３ プライマーを用いた菌の同定
３５名の成人糞便サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。抽出法及びＰＣＲの条件は実施例１（１）と同じである。その結果、ビフィドバクテリウム属とクロストリジウムクラスターＸＩＶは３５名全てから、バクテロイデスは３４名からプレボテラは２２名から、それぞれ検出された。
【００６４】
実施例４ プライマーの特異性確認
実施例１（２）のバクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の基準株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表４、５に示す、６菌種のバクテロイデスクラスター細菌基準株、バクテロイデスサブグループに属する２１菌株、及びその他の腸内から分離される代表的な菌種２３株をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、培地上に出現したコロニーから菌体をかきとり、１００μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁する。この懸濁液を１００℃、５分間熱した後、氷中で急冷した。
【００６５】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００６６】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りである。バクテロイデス・オバタス以外のプライマーは特異的にバンドを形成したがオバタス特異的プライマーはフラギリスやセタイオタオミクロンともバンドを形成してしまった（表４、５）。
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
実施例５ バクテロイデス・オバタス特異的プライマーの再設計及び合成
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、実施例１と同様にプライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ２領域及びＶ３とＶ８の間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして再度設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表６）。
【００７０】
【表６】
【００７１】
実施例６ プライマーの特異性確認
実施例５のバクテロイデス・オバタス特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
前記表４、５に示す細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
【００７２】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００７３】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りであり、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと弱いバンドを形成したものの、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは特異的にバンドを形成した。
【００７４】
実施例７ プライマーの設計及び合成
表７、８に示すクロストリジウム属細菌菌種に特異的なプライマーを設計した。各種データベースより得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者がシークエンシングした配列を基に、特異性の認められた部分をターゲットとしてプライマーを設計した。こうして設計された塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（なお、特異性を有する配列は、上記のように表７、８以外にも多種認められたが、後に示す特異性確認試験で、問題が生じたものは記載していない）。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
実施例８ プライマーの特異性確認
実施例７のクロストリジウム属の菌種に特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表９（グループ１）、グループ２及びグループ３に示す、１１菌属４７菌種の細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
【００７８】
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅに０．６μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．１２μＬのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ、タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ０．６μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で９４℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
【００７９】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。０．８％アガロース（Ｈ１４「ＴＡＫＡＲＡ」；タカラ社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（１．０mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表９に示す通りである。また、表９以外の菌に対しては、クロストリジウム・ソルデリー菌種特異的プライマー（ＣＩＳＯＲ−ＦＲ）が、クロストリジウム・ソルデリー以外に下記グループ３のバクテロイデス・オバタスＪＣＭ５８２４T 及びバクテロイデス・ブルガタスＪＣＭ５８２６T でバンドが認められた。その他のプライマーに関しては標的とした菌種以外にバンドは認められなかった。
【００８０】
【表９】
【００８１】
グループ２
１３菌体以外のClostridium９菌種（基準株）
C.barati ATCC 27639T
C.celatum ATCC 27791T
C.loptum ATCC 29065T
C.ghoni ATCC 25257T
C.aminovalericum ATCC13725T
C.coccoides ATCC 29236T
C.oroticum ATCC 13619T
C.symbiosum ATCC 14940T
C.spiroforme ATCC 29900T
グループ３
代表的ヒト腸内細菌２５菌種
Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum JCM 3718T
F.varium JCM 3722
F.necrophorum subsp. funduliforme JCM 3724T
Acinetobacter sp. ATCC 15308
Eschelihia coli MGG
Proteus vulgatus M52
Pseudomonas aeruginosa PA-15
Enterococcus faecalis ATCC 19433T
E.faecium ATCC 19434T
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356T
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius ATCC 11741T
Bifidobacterium adolescentis aE 1949
B.bifidum aE 319
B.breve aS-1
B.longum aE 1946
Eubacterium aerofaciens S 603
E.lentum VPI 0225 1
E.limosum ATCC 8486T
Bacterodies ovatus JCM 5824T
B.thetaiotaomicron JCM 5827T
B.fragilis DSM 2151T
B.eggerthii DSM 20697T
B.uniformis JCM 5828T
B.vulgatus JCM 5826T
B.distasonis JCM 5825T
【００８２】
実施例９ プライマーの特異性確認
バクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーを用い、ヒトふん便分離株をサンプルとして実施例４と同様の方法でサンプル中の菌種同定を行った。その結果、分離株２６株が同定された（表１０）。
なお、同一のサンプルの生物・生化学的性状を光岡らの方法（腸内菌の世界−嫌気性菌の分離と同定、光岡知足、叢文社）により確認したところ、本発明のプライマーによる同定（検出）結果と一致していた。
【００８３】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、５−１０、２６及び２９−３４から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブ。
【請求項２】
配列番号２と２６、５と２９、６と３０、７と３１、８と３２、９と３３及び１０と３４から選ばれる塩基配列の組み合せ又はこれらの塩基配列の組み合せに相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を使用することを特徴とするバクテロイデスの検出方法。
【請求項４】
（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及び（２）請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むバクテロイデスの検出方法。
【請求項１】
配列番号２、５−１０、２６及び２９−３４から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー又はプローブ。
【請求項２】
配列番号２と２６、５と２９、６と３０、７と３１、８と３２、９と３３及び１０と３４から選ばれる塩基配列の組み合せ又はこれらの塩基配列の組み合せに相補的な配列からなるバクテロイデス用プライマー。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を使用することを特徴とするバクテロイデスの検出方法。
【請求項４】
（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及び（２）請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むバクテロイデスの検出方法。
【公開番号】特開２００６−１４９４００（Ｐ２００６−１４９４００Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７６８５（Ｐ２００６−７６８５）
【出願日】平成１８年１月１６日（２００６．１．１６）
【分割の表示】特願平１１−２９６８１５の分割
【原出願日】平成１１年１０月１９日（１９９９．１０．１９）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【出願人】（５９７０９９８８５）財団法人ヤクルト・バイオサイエンス研究財団 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１６日（２００６．１．１６）
【分割の表示】特願平１１−２９６８１５の分割
【原出願日】平成１１年１０月１９日（１９９９．１０．１９）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【出願人】（５９７０９９８８５）財団法人ヤクルト・バイオサイエンス研究財団 (4)
【Ｆターム（参考）】
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