ヒト化抗グレリン抗体
ヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分を提供する。抗原結合部分はアシル化及び非アシル化ヒト化グレリンと結合する。当該抗体はグレリン活性の中和及びグレリン活性が有害な障害、肥満及び関連障害、並びにガンの治療に対して有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒトグレリンは、血中を循環し、配列ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（並列番号：１）を有する２８アミノ酸ペプチドホルモンである。アミノ酸位置３のセリン（Ｓｅｒ３）がｎ−オクタノイル基（「Ｃ８」又は「Ｃ８アシル化グレリン」）でアシル化されると、これは下垂体内の成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）と結合し、成長ホルモンが放出される。動物に食物が欠乏するとグレリンの血漿濃度は上昇し、食前に最大となり、摂食することで減少する。食欲を制御できずに重症の肥満を引き起こす遺伝子障害であるプラダー・ウィリー症候群の人々は、グレリンのレベルが極めて高い。こうした結果からグレリンが食事の動機づけに重要な役割を果たしていることが示された。
【背景技術】
【０００２】
摂食障害における役割に加えて、グレリンはＨｅｐＧ２細胞系及び前立腺ガン細胞系において増殖効果を有することも示した。グレリンにより成長を増強される他の細胞系としては、Ｈ９Ｃ２心筋細胞、膵臓腺ガン、副腎細胞、下垂体成長ホルモン分泌細胞、脂肪細胞、造骨細胞、乳ガン細胞系が挙げられる。
【０００３】
従って、グレリンの活性を調節する薬剤は、例えば、非インシュリン依存性糖尿病肥満及び肥満関連障害、並びに特定のガン等、哺乳類における種々の疾病又は障害の治療に可能性のあることを表しており、グレリン濃度又は活性の低下は望ましい治療効果に貢献する。
【０００４】
ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ２００６／０１９５７７（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）は、ヒトグレリンＣ末端に対する種々のマウスモノクローナル抗体のＦａｂ部位を開示し、Ｆａｂ３２８１、４７３１及び４２８１が命名されている（マウスＤ４ Ｆａｂ）。これらのＦａｂは、ヒトグレリンのアシル化及び非アシル化形態の両者と、このペプチドのアミノ酸１４−２７の範囲内に位置する抗原エピトープで結合する。全長（１−２８）Ｃ８アシル化ヒトグレリンに対するこれらのＦａｂのアフィニティ（ＫＤ）は、４．３６×１０−９から８．６２×１０−１１Ｍ（４３６０ｐＭから８６．２ｐＭ）の範囲である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肥満、肥満関連障害及び疾病、他の摂食障害、及びグレリン濃度上昇に関連する障害を治療するための、安全で効果的な手段への差し迫った需要がある。摂食を誘導する役割、及びある種の細胞系への増殖効果があることから、グレリンはこのような治療介入のための好適な目標である。本願明細書に開示のヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分には結合及び生物学的特性の範囲を示し、これは例えば、アシル化及び脱アシル化ヒトグレリンに対するＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ、安定的に形質転換しヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するハムスターＡＶ１２細胞の細胞内カルシウムにおけるアシル化ヒトグレリン媒介増加の阻害のＩＣ５０値等であり、国際出願ＰＣＴ第ＷＯ２００６／０１９５７７号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）に開示のマウスＤ４ Ｆａｂのものとは異なる。これらの特性により、本発明が想定する治療アプリケーションのための至適な抗体薬剤の選択が容易になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明の第１の態様は、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、これはアシル化及び脱アシル化ヒトグレリンのいずれにも選択的に結合し：
ａ）アシル化ヒトグレリンに対して約１７３０ｐＭから約１１ｐＭの範囲の平衡解離定数ＫＤを示し、
ｂ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から約４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲のｋｏｎ値を示し、
ｃ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．９８×１０−５（１／ｓ）から約２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲のｋｏｆｆ値を示し、
前記ＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ値は表面プラズモン共鳴により計測され；
ｄ）ヒト成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞において、細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を、インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイによる測定としてＩＣ５０が約１０ｎＭ以下で阻害する。
【０００７】
別の態様において、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域、又はヒトカッパ又はラムダから選ばれる軽鎖定常領域を含みうる。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４が好適である。
別の態様において、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域、又はヒトカッパ又はラムダから選ばれる軽鎖定常領域を含みうる。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４が好適である。
別の態様において、ヒト化抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片からなる群から選ばれる。
【０００８】
別の態様において、前述のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の任意の１つは以下のものでありうる：軽鎖可変領域は配列番号４で示される配列を有するペプチドを含み、重鎖可変領域は配列番号５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４６で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４７で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３５で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４８で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３６で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４９で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３７で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５０で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３８で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５１で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３９で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５２で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４０で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５３で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４１で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５４で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５６で示される配列を有するペプチドを含み；又は、軽鎖可変領域は配列番号４４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５７で示される配列を有するペプチドを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含んでなる医薬品組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、医薬品として用いるための、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳類、好適にはヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、又はガンからなる群から選ばれる疾病又は障害の治療のための、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、
ヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、又はガンを治療する方法を提供する。肥満の治療法は、治療的でも、又は例えば美容、美観等の非治療的でもありうる。
【００１０】
さらなる態様において。本発明は、前述のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、活性がアシル化グレリンか又は脱アシル化グレリン（又は両者）から生じるものであっても、ヒトにおけるグレリン活性を中和又は阻害する、あるいは活性グレリン濃度を低下させる方法を提供する、グレリン活性を中和又は阻害する方法は、治療的でも、又は例えば美容、美観等のための非治療的でもありうる。
本発明の適用性のさらなる態様は、以下の詳細な記載及び実施例により明らかであり、これらは非限定的な例示のためのみである。
本発明は、タンパク工学を用いてげっ歯類の抗体定常領域及び可変ドメインフレームワーク領域をヒト抗体に見出された配列で入れ替えることにより、異質タンパク配列を低減し、ヒトグレリンに対して治療的に用いるためのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本願明細書に開示のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアシル及び脱アシルグレリンに対してある範囲の解離定数（アフィニティ又はＫＤ）を示し、ヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞での、ヒトグレリン媒介による細胞内カルシウム増加の阻害において、ｋｏｎ及びｋｏｆｆのユニークな組み合わせ及び種々のＩＣ５０値を含んでなり、国際特許出願ＰＣＴ国際広報ＷＯ第２００６／０１９５７７号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）に開示のマウスＤ４ Ｆａｂのものとは異なっている。例えば、ＫＤ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＩＣ５０値等、本発明の抗体及び断片の結合及び生物学的特性は、その範囲及び組み合わせによって、本発明が想定する治療的応用に対する至適な抗体薬剤の選択が容易になる。
【００１２】
本発明の抗グレリンモノクローナル抗体は肥満、肥満関連障害、ＮＩＤＤＭ（ＩＩ型糖尿病）、プラダー・ウィリー症候群、摂食障害、過食症、障害性の満腹、不安、胃の運動性障害（例えば、過敏性腸症候群及び機能性消化不良を含む）、インスリン抵抗性シンドローム、メタボリックシンドローム、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アンドロゲン過多症、多嚢胞卵巣シンドローム、種々のガン及び心血管性障害の治療又は予防に有用でありうる。加えて、本発明の抗グレリンモノクローナル抗体は、グレリンのアシル化又は非アシル化形態のいずれか、あるいは両者の濃度低下又は活性低下が役立つ任意の疾病又は症状の治療又は予防に有用でありうる。
本発明のヒト化抗グレリンモノクローナル抗体（その抗原結合部分を含む）は、ヒトグレリンへの特異的結合が可能である。好適な抗グレリンモノクローナル抗体は、グレリンに付随する生物学的活性を調節することが可能であり、これにより肥満及び肥満関連疾病を含んでなる種々の疾病及び病理学的症状の治療又は予防に有用である。
【００１３】
用語「アシル化ヒトグレリン」は、配列番号：１に示す配列を有し、Ｓｅｒ３をオクタノイル化された２８アミノ酸ペプチド；オクタノイルグレリン（１−２７）；デカノイルグレリン（１−２８）；デカノイルグレリン（１−２７）；及びデセノイルグレリン（１−２８）を含んでなる。脱アシルグレリン（１−２８）及び脱アシル化グレリン（１−２７）は成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａには結合しない。これらのグレリンの分子形態は全てヒト血漿中、並びに胃の中に見出される。本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合部分は、アシル化ヒトグレリンの全長（１−２８）及び切断形態（１−２７）に特異的に結合し、これらにはＳｅｒ３ｎ−オクチル、ｎ−デカノイル、又はｎ−デカノイル基、又は他の脂肪酸、あるいは脱アシルグレリンを含んでなる。
【００１４】
用語「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」は、抗原と相互作用し、抗体上で抗原に対するその特異性及びアフィニティを与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の一部を指す。この抗体部分は、抗原結合残基の適切なコンホメーションを維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。本発明のモノクローナル抗体の抗原結合領域のＣＤＲは、マウス又は実質的にマウス期限のＣＤＲのヒト化バージョンである。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ジアボディ；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された複数特異的抗体を含んでなる。
【００１５】
本願明細書に用いる用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体又はその抗原結合部位が、その特異的結合パートナー、すなわち抗原エピトープを含むペプチド以外の分子に顕著な結合を示さない状況（すなわち、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１未満）を指す。当該用語は、例えば本発明の抗体の抗原結合領域が数多くの抗原に含まれる特定のエピトープに対して特異的である場合にも使用可能であり、この場合、抗原結合領域を担持する特定の抗体は、そのエピトープを含んでなる種々の抗原に結合しうる。本発明のモノクローナル抗体は、上述の配列番号：１及びその変異形を含んでなるグレリン分子に選択的に結合し、非グレリンタンパクには結合しない（又は結合が弱い）。
【００１６】
本発明の抗体を参照する際の用語「生物学的特性」「生物的特徴」「生物学的活性」又は「生物活性」は、交換可能に用いられ、アシル化又は脱アシル化グレリンの１以上の活性、グレリン濃度、又はグレリン活性を調節する、例えば少なくとも１つのタイプの哺乳類細胞において細胞内カルシウム濃度を変化させる当該抗体の能力；エピトープ／抗原におけるアフィニティ及び特異性（例えばグレリンに結合する抗グレリンモノクローナル抗体）；アシル化又は脱アシル化グレリンの活性とインビボ、インビトロ、又はインシチュにおいて拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）する能力；抗体のインビボ安定性；及び抗体の免疫特性を含んでなるが、これらに限定しない。上述の特性又は特徴は、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分析、インビトロ及びインビボ中和アッセイ、及びヒト、霊長類、又は必要により任意の他の生成源を含む異なる起源の組織切片を用いる免疫組織化学を含んでなる当業に公知の技法を用いて観察又は測定されうるが、これらに限定しない。
【００１７】
用語「阻害」又は「阻害する」は、生物学的活性又は特性、若しくは疾病又は症状を含んでなる、阻害されるものの進行又は重症度の中和、拮抗、抑制、妨害、制止、減速、崩壊、停止、又は逆転を意味するが、これらに限定しない。本発明の抗ヒトグレリン（又は抗グレリン）モノクローナル抗体を参照する用語「中和」又は「拮抗」、若しくは「グレリン活性に拮抗（中和）する抗体」又は「グレリンに拮抗（中和）する」という語句は、ヒトグレリンへの結合又は接触によりアシル化又は脱アシル化ヒトグレリンが誘起する生物学的活性の阻害が生じる抗体を指すことを意図する。ヒトグレリンの生物学的活性は、体重減少の誘発、摂食の変質、受容体結合の阻害（受容体結合アッセイの例示としてはＷＯ ０１／８７３３５を参照）、又はグレリン受容体結合アッセイにおける信号伝達を含んでなるが限定しない、ヒトグレリンの生物学的活性の、１以上のインビトロ又はインビボの指標を測定することにより評価しうる。グレリンの生物学的活性の指標は、当業に公知の１以上の種々のインビトロ又はインビボのアッセイにより評価しうる。例えば、グレリン活性に中和又は拮抗する抗グレリン抗体の能力は、本願明細書の実施例４に記載のＦＬＩＰＲアッセイを用いて評価する。
【００１８】
用語「個人」「被験者」「患者」はヒトを指す。
本発明は、アシル化ヒトグレリン及び脱アシル化ヒトグレリンの両者に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分の提供に関する。このような抗体は、アシル化ヒトグレリンでも脱アシルヒトグレリンでも、あるいは両者であっても、ヒトグレリン又はヒトグレリンの生物学的活性を中和する。阻害される活性は：（ｉ）受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａに対するアシル化ヒトグレリンの結合；（ｉｉ）ＧＨＳ−Ｒ１ａに結合するアシル化ヒトグレリンにより促進される情報伝達；（ｉｉｉ）特異的結合箇所を有する結合パートナーに対する脱アシル化ヒトグレリンの結合、又は（ｉｖ）特異的結合箇所を有する結合パートナーに結合する脱アシル化ヒトグレリンにより促進される情報伝達、でありうる。本発明のヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分の、アシル化及び脱アシル化の両形態のヒトグレリンに対する特異的結合により、当該分子は、グレリン付随疾病及び症状、すなわち被験者内に存在するグレリンの生物活性又は活性グレリン濃度の低下又は阻害が役立つ疾病又は症状の治療薬又は予防薬として用いうる。
【００１９】
好適な実施形態において、本発明は、アシル化及び脱アシルヒトグレリンの両者に結合する、単離されたヒト化抗ヒトグレリンモノクローナル抗体及びその抗原結合部分を提供する。当該抗体は、平衡解離定数ＫＤが約１７３０ｐＭ〜約１１ｐＭの範囲（固相ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分析により室温で計測）でアシル化グレリンに結合し、ヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞における細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介による増加が、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０値となるように、ヒトグレリンの活性に拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）する。
【００２０】
本発明の抗体の軽鎖可変領域に対する好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は以下の配列を含んでなり、これは例示を目的としてＦａｂ ３ａ（太字及び下線）のＣＤＲと共に本願明細書に開示する。
【００２１】
本発明の抗体の重鎖可変領域に対する好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は以下の配列を含んでなり、これは例示を目的としてＦａｂ ３ａ（太字及び下線）のＣＤＲと共に本願明細書に開示する。
【００２２】
ヒト定常領域配列は当業に公知であり、文献に報告されている。好適なヒト定常軽鎖配列はカッパ及びラムダ定常軽鎖配列を含んでなる。好適なヒト定常重鎖配列は、ヒトガンマ１、ヒトガンマ２、ヒトガンマ３、ヒトガンマ４、及び、例えばインビボ半減期の増強、Ｆｃ受容体結合の低減等、変質した効果又は機能を提供するこれらの変異体を含んでなる。ヒトガンマ１及びヒトガンマ４、並びにこれらの変異体は当業に公知であり、特に好適である。
【００２３】
いくつかの例において、ヒトグレリンのアミノ酸１４−２７に結合する抗体から、選択したヒトフレームワーク上に非ヒトＣＤＲを移植することにより生成したヒト化抗体は、ヒトグレリンに対して所望のアフィニティを有するヒト化抗体を提供する。しかしながら、抗原結合を増強するために、選択したヒトフレームワーク又は１以上のＣＤＲの特定の残基をさらに修飾することが必要であるか又は好ましい。好適には、結合部位の構造を維持するか又は影響を及ぼす親抗体のフレームワーク残基は保存される。このような残基は、親抗体又はＦａｂ断片のＸ線結晶学により同定可能であり、これにより抗原結合部位の３次元構造が同定される。
本発明は、さらに、アフィニティ又は特異性に悪影響を及ぼさない、ＣＤＲ内の１又は２の保守的なアミノ酸置換変異体を含んでなる、本願明細書に開示のヒト化抗体及び抗体断片に対して実質的に相同な変異体及び等価物を提供することに関する。
このような変異体又は等価物はＣＤＲの末端アミノ酸の欠失も含んでなる。
【００２４】
（診断利用）
本発明のヒト化抗体は、アシル化又は脱アシルのいずれかの形態においてヒトグレリンの発現に付随する疾病又は症状の診断に用いることが可能であり、あるいはグレリン関連症状に対して治療が行われる又は治療が考慮される被験者内のグレリン濃度をモニターすることが可能である。診断アッセイは、本発明の抗体及びヒト体液、細胞又は組織抽出物等の試料中のアシル化グレリン及び／又は脱アシルグレリンを検出するための標識を利用する方法を含んでなり、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳ等のプロトコルを含んでなる。
【００２５】
（治療利用）
本発明のモノクローナル抗体を含む医薬品組成物は、肥満症及び／又は肥満関連障害、例えば非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ；ＩＩ型糖尿病）、プラダー・ウィリー症候群、障害性の満腹、過食症、不安、胃の自動運動性障害（例えば、過敏性腸症候群及び機能性消化不良が挙げられる）、インスリン抵抗性症候群、メタボリック初稿群、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アンドロゲン過多症、多嚢胞の子房のシンドローム、心血管性の障害及び種々のガン、例えば肝ガン、前立腺ガン、心臓ガン、膵臓ガン、副腎ガン、下垂体ガン、骨ガン及び乳ガン等の障害の治療又は予防に用いてもよい。当該抗体は、食欲亢進、神経性食欲不振及び過食症を含む摂食障害の治療又は予防に用いてもよいが、これらに限定しない。
グレリン（アシル化又は脱アシル、若しくは両者）活性が有害である前述の障害の少なくとも１以上を治療又は予防するための医薬品としての本発明の抗ヒトグレリンモノクローナル抗体も、本願明細書の想定範囲にある。加えて、グレリン活性が有害である前述の障害の少なくとも１以上の治療用医薬品の製造において、本発明の抗グレリンモノクローナル抗体を使用することも、想定範囲にある。
本願明細書に用いるように、「治療」「治療する」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的作用を得ることを指す。用語「治療」は、疾病の阻害、すなわち疾病又は障害を退行させ、若しくは症候又はその合併症を軽減する目的のために、哺乳類、特にヒトに本発明の化合物の投与することを含んでなる。この効果は、疾病に対する部分的又は完全な治療法、及び／又は疾病に起因する影響の逆行の場合がある。治療は、摂食制限及びエクササイズ等、行動の改良と組み合わせてもよい。そのため、肥満治療には、摂食抑制、体重増加の抑制を含んでなり、及び／又は必要であれば被験者の体重減少を含んでなる。治療効果は予防的であってもよく、すなわち、疾病を被るかもしれないが、疾病を有するという診断をまだ受けていない被験者に、疾病又は症候が発生する前に完全に又は部分的に発生を防ぐことでもよい。
薬剤投与計画は、最適な所望の反応（例えば治療又は予防の反応）を提供するように調節してもよい。例えば、単一のボーラス投与を行ってもよく、いくつかの分割服用量を経時的に投与してもよく、又は服用量は治療状況の緊急性の度合いに応じて減少又は増加してもよい。
【００２６】
（医薬品組成物）
本発明のヒト化抗体及び抗原結合部分は、被験者への投与に適切な医薬品組成物に組み込まれうる。当該抗体化合物の投与は単独でもよく、単一又は複数の服用において薬理学的に許容できるキャリア、希釈液又は賦形剤と組み合わせてもよい。医薬品組成物は、本願明細書に開示の抗体の組み合わせを含みうる。このような医薬品組成物は、選択された投与モード又は経路に適切であるようｎ設計され、薬理学的に許容できる希釈剤、キャリア、及び／又は分散剤、バッファ、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張力剤、安定化剤等の賦形剤が適宜用いられる。このような組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年、に開示のように、通常の技法に従って設計しうる。医薬品組成物のための適切なキャリアは、本発明のモノクローナル抗体に組み合わされるときには、分子の活性を保持し、被験者の免疫系に反応性でない任意の材料を含んでなる。
本発明の抗ヒトグレリンモノクローナル抗体を含む医薬品組成物は、肥満又は関連障害、若しくは種々のガンに付随する病理の危険にある又は表している被験者に、本願明細書に記載のように、経口、非経口、吸引、又は局所（静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口内、舌下、座薬（経直腸又は経膣）を含む）投与を含んでなる通常の投与技法を用いて投与されうる。静脈内、腹腔内、又は皮下注射による周辺性の全身輸送が好適である。
このような医薬品組成物は、好適には本発明の１以上の抗体の「有効量」又は「治療上有効量」又は「予防的有効量」を含有する。「有効量」又は「治療上有効量」は、服用に対して及び必要期間の間に、所望の治療上の結果を成し遂げるのに効果的な量を指す。抗体の有効量又は治療上有効量は、疾病状態、年齢、性別及び個人の体重等の要因、及び所望の反応を個人に誘発する抗体又は抗体部分の能力に従って変化しうる。
有効量又は治療上有効量は、いかなる抗体の毒性又は有害な作用よりも治療上の有益な効果が上回るものである。「予防的有効量」は、服用に対して及び必要期間の間に、所望の予防上の結果を成し遂げるのに効果的な量を指す。典型的には、予防的投与量は、被験者が病気になる前に、又は病気の初期段階において用いるので、予防的有効量は、治療上有効量よりも少ないであろう。
有効量又は治療上有効量は、被験者に治療上の利点をもたらすのに必要な活性薬剤の、少なくとも最小量であるが有毒量未満である。換言すると、肥満症治療のためのこうした量は、例えばボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）の減少等により、哺乳類の肥満状態に改良を誘導、回復、さもなければ発生する量である。
医療技術において周知のように、任意の被験者に対する服用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、一般的健康状態、及び同時に投与される他の薬剤を含んでなる多くの要因に依存する。本発明の抗体又は抗原結合部分のための典型定期な服用量は、例えば、約０．００１から約１０００μｇの範囲でありうるが、しかしながら、特に前述の要因を考慮し、この例示を下回る又は上回る服用量も考えられる。１日あたりの非経口投与基準は全体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、好適には約０．３μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好適には約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、さらにより好適には１日あたり体重の約０．５から約１０ｍｇ／ｋｇである。患者の経過記録を周期的な評価によりモニタし、これによって投与量を調節しうる。
以下の実施例は、例示のためのみに提示し、いかなる点においても本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例】
【００２７】
＜実施例１＞
（マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１のヒト化）
ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ２００６／０１９５７７ （ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）号は、Ｆａｂ３２８１、４７３１、及び４２８１と名付けられた、ヒト化グレリンＣ末端への種々のマウスモノクローナル抗体を開示している。これらのＦａｂは、当該ペプチドのアミノ酸１４−２７内に位置する抗原エピトープでヒトグレリンのアシル化及び脱アシル化形態の両者に結合する。これらのＦａｂのＣ８アシル化ヒトグレリン全長（１−２８）に対するアフィニティ（ＫＤ）は、４．３６×１０−９から８．６２×１０−１１Ｍ（４３６０ｐＭから８６．２ｐＭ）の範囲にある。
マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を、ＣＤＲ領域を太字及び下線付きとして、以下に示す。
【００２８】
（マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１）
（軽鎖）
【００２９】
（重鎖）
マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１の軽鎖及び重鎖可変領域の両者のＣＤＲにアミノ酸の変化を導入することは、通常の分子生物学の技法を介してコード化ＤＮＡ内の適切なコドンを変更することにより実施される。表１に、本発明のヒト化Ｆａｂ内ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
表１。ヒト化Ｄ４ ＦａｂのＣＤＲアミノ酸配列
【表１】
＊ Ｄ４ ７．１ ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ ＣＤＲは、それぞれ適切なマウスＬＣＶＲ及びＨＣＶＲフレームワーク内のマウスに最適化した配列である。
表１の全体を通じて用いるように：
Ｘ１はＱ又はＤであり；
Ｘ２はＳ又はＨであり；
Ｘ３はＮ、Ｓ、Ｔ、又はＤであり；
Ｘ４はＮ、Ｆ、Ｙ、又はＨであり；
Ｘ５はＨ又はＳであり；
Ｘ６はＳ又はＤであり；
Ｘ７はＹ、Ｔ、又はＧであり；
Ｘ８はＮ又はＤであり；
Ｘ９はＥ、Ｙ、又はＦである。
軽鎖又は重鎖可変領域の全体は、適切なＣＤＲをヒト軽鎖及び重鎖フレームワークアミノ酸配列中に取り入れることにより生成される。
本発明の抗体の軽鎖可変領域のための好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は、次の配列を含んでなり、本願明細書に開示のＦａｂ ３ａ（太字及び下線）と共に図示を目的として当該配列を表す。
本発明の抗体の重鎖可変領域のための好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は、次の配列を含んでなり、本願明細書に開示のＦａｂ ３ａ（太字及び下線）と共に図示を目的として当該配列を表す。
表２に、本発明のＦａｂの軽鎖可変領域アライメントを示す。
【００３１】
表２．Ｆａｂ軽鎖可変領域アライメント
【表２】
表３に、本発明のＦａｂの重鎖可変領域アライメントを示す。
【００３２】
表３．Ｆａｂ重鎖可変領域アライメント
【表３】
マウスに最適化したＦａｂ Ｄ４ ７．１のＬＶＣＲ及びＨＣＶＲの配列は、ＣＤＲに太字及び下線を付し、以下に示す。
Ｆａｂ Ｄ４ ７．１ ＬＣＶＲ
Ｆａｂ Ｄ４ ７．１ ＨＣＶＲ
【００３３】
＜実施例２＞
（アシル化ヒトグレリンに対するヒト化Ｄ４ Ｆａｂのアフィニティ）
実施例１に開示の、Ｃ−８アシル化ヒトグレリン（１−２８）に対するヒト化／最適化抗グレリンＦａｂのアフィニティ（ＫＤ）は、ＣＭ５センサチップを装備するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置を用いて測定した。記載の場合を除き、全ての試薬及び材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ社（Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）から購入した。測定は約２５℃で実施した。ヒトグレリンを含む試料は、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）に溶解した。捕獲抗体は、Ｄ４及びＤ４ ７．１Ｆａｂに対してはヤギ抗マウスカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）であり、他の全てのＦａｂに対してはヤギ抗ヒトカッパ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であり、以後「捕獲抗体」と称するこれらのものを、アミン結合を用いるフローセル上に固定化した。フローセル（１−４）は、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物で７分間、流速１０μＬ／分にて活性化した。ヤギ抗マウスカッパ又はヤギ抗ヒトカッパ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中３０μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）は、流速１０μＬ／分にて４つのフローセルに手操作で注入した。表面密度をモニタし、必要ならば全てのフローセルの表面密度が４５００−５０００反応単位（ＲＵ）となるまで追加の捕獲抗体を個々の細胞に注入した。表面は、１Ｍエタノールアミン−塩酸、ｐＨ８．５（１０μＬ／分）を７分間注入してブロックした。共有結合的に結合しなかった全ての捕獲抗体が完全に除去されたことを確認するために、１０ｍＭグリシン１５μＬ、ｐＨ１．５を２回注入した。
動態試験用に用いたランニングバッファは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％ Ｐ２０を含んでなる。
【００３４】
動態結合データの収集は、大量輸送効果を最小にするために、最大流速（１００μＬ／分）かつ低表面密度で実施した。各分析サイクルは次からなる：（ｉ）異なるＦａｂに対して流速１０μＬ／分でフローセル２、３及び４に５μｇ／ｍＬ溶液１−１０μＬを注入することにより、Ｆａｂ（ＢｉｏＳｉｔｅ）３００−３５０ＲＵを捕獲する、（ｉｉ）フローセル１を参照フローセルとして全ての４つのフローセルにヒトグレリン（２回希釈増量して５０ｎＭから０．３９ｎＭの濃度範囲）２００μＬを注入（２分）、（ｉｉｉ）２０分間解離（バッファフロー）、（ｉｖ）１５秒間１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で捕獲抗体表面を再生成、（ｖ）３０秒間ランニングバッファのブランク注入、及び（ｖｉ）次のサイクル開始前、２分間の安定化時間。信号は、フローセル２からフローセル１を減算し、フローセル３からフローセル１を減算し、フローセル４からフローセル１を減算してモニタした。試料及びブランクバッファは、ランダムな順番で２重に注入した。データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１ソフトウェアを用いて処理し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１又はＣＬＡＭＰグローバルアナリシスソフトウェアのいずれかの１：１結合モデルにフィットさせた。
【００３５】
本願明細書に開示のヒト化Ｆａｂは、Ｃ−８アシル化ヒトグレリン全長に対し、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴による計測で１７３０ｐＭから２０ｐＭのアフィニティを示した。例えば、Ｆａｂ Ａ２のＫＤは４３ｐＭを示し、一方Ｆａｂ Ｔ３２ＹのＫＤは１０００ｐＭを示した。本発明のＦａｂに対するｋｏｎ値は５×１０６（１／Ｍｓ）から３．０５×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｆａｂ Ａ２のｋｏｎ値は６．３４×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｆａｂ Ｓ２８Ｄが示すｋｏｎ値は３×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＦａｂに対するｋｏｆｆ値は１．８８×１０−４（１／ｓ）から１．９０×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｆａｂ Ａ２のｋｏｆｆ値は２．７×１０−４（１／ｓ）を示し、一方Ｆａｂ Ｔ３２Ｙのｋｏｆｆ値は８．７５×１０−３（１／ｓ）を示した。最終的には、本発明のＦａｂのｔ１／２は分単位において０．６から６１を示した。例えば、Ｆａｂ Ｔ３２Ｙのｔ１／２は１分を示し、一方Ｆａｂ Ａ２のｔ１／２は４３分を示した。
【００３６】
＜実施例３＞
（ヒト化Ｄ４モノクローナル抗体の種々のグレリンに対するアフィニティ）
アシル化ヒトグレリンに対するヒト化Ｄ４モノクローナル抗体のアフィニティ（ＫＤ）は、ＣＭ５センサチップを装備するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置を用いて測定した。
このモノクローナル抗体は、ラット軽鎖カッパ定常ドメイン及びラットＩｇＧ１重鎖定常ドメインのそれぞれに融合した、Ｆａｂの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を含んでなる。
使用したラット軽鎖カッパ定常ドメインのアミノ酸配列は次の通りである。
【００３７】
（ラット軽鎖カッパ定常ドメイン）
使用したラット重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は次の通りである。
【００３８】
（ラット重鎖カッパ定常ドメイン）
記載の場合を除き、全ての試薬及び材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ社（Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）から購入した。全ての測定は約２５℃で実施した。ヒトグレリン（全長、Ｃ−８アシル化又は脱アシル）を含む全ての試料及び抗グレリンＭａｂは、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）で希釈した。全てのＭａｂに対し、後述のアミン結合を用いて抗体をＣＭ５チップに直接結合して、表面密度が８００−１０００反応単位（ＲＵ）となるようにした。フローセル（１−４）は、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物で７分間、流速１０μＬ／分にて活性化した。Ｍａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ４．５で１０μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／分にて４つのフローセルに手操作で注入した。表面密度をモニタし、必要ならば全てのフローセルの表面密度が８００−１０００ＲＵとなるまで追加の捕獲抗体を個々の細胞に注入した。表面は、１Ｍエタノールアミン−塩酸、ｐＨ８．５（１０μＬ／分）を７分間注入してブロックした。共有結合的に結合しなかった全ての捕獲抗体が完全に除去されたことを確認するために、１０ｍＭグリシン１５μＬ、ｐＨ１．５を２回注入した。動態試験用に用いたランニングバッファは、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）である。
【００３９】
動態結合データの収集は、大量輸送効果をを最小化するために、最大流速（１００μＬ／分）かつ低表面密度で実施した。各分析サイクルは次からなる：（ｉ）フローセル１を参照フローセルとして全ての４つのフローセルにグレリン（２回希釈増量して５０ｎＭから０．３９ｎＭの濃度範囲）２００μＬを注入（２分）、（ｉｉ）２０分間解離（バッファのみのフロー）、（ｉｉｉ）１５秒間１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で捕獲抗体表面を再生成、及び（ｉｖ）次のサイクル開始前に２分間の安定化時間。信号は、フローセル２からフローセル１を減算し、フローセル３からフローセル１を減算し、フローセル４からフローセル１を減算してモニタした。試料及びブランクバッファは、ランダムな順番で２重に注入した。データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１ソフトウェアを用いて処理し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１又はＣＬＡＭＰグローバルアナリシスソフトウェアのいずれかの１：１結合モデルにフィットさせた。
【００４０】
本願明細書に開示のヒト化／アフィニティ成熟した抗体は、Ｃ−８アシル化ヒトグレリンに対し、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴分析の計測で９３１ｐＭから１１ｐＭの範囲のアフィニティを示す。例えば、Ｍａｂ Ａ４のＫＤは７４ｐＭを示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４ＨのＫＤは４００ｐＭを示した。本発明のＭａｂに対するｋｏｎ値は４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ａ２のｋｏｎ値は４．４４×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｍａｂ Ｓ３４Ｈが示すｋｏｎ値は４．２４×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＭａｂに対するｋｏｆｆ値は４．９８×１０−５（１／ｓ）から２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｍａｂ Ａ５のｋｏｆｆ値は５．７４×１０−５（１／ｓ）を示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４Ｈのｋｏｆｆ値は１．６９×１０−２（１／ｓ）を示した。最終的には、本発明のＭａｂのｔ１／２は分単位において０から２３２を示した。例えば、Ｍａｂ Ｓ３４Ｈのｔ１／２は１分を示し、一方Ｍａｂ Ａ５のｔ１／２は２０１分を示した。ｔ１／２は次式から計算した。ｔ１／２（秒）＝（ｌｎ０．５）／（ｋｏｆｆ（１／秒））この値を６０で除して分に変換し、抗体：抗原複合体の理論的な半減値と考えた。これらの結合の動態は、上記改良されたＦａｂとＭａｂの間のアフィニティにおける類似性から示差されるように、定常領域（マウス又はラット）の付加によるものではない。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脱アシル化グレリンに対して、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴分析の計測で１３２０ｐＭから１４．１ｐＭの範囲のアフィニティを示す。例えば、Ｍａｂ Ｄ５２ＮのＫＤはヒト脱アシル化グレリンに対して１０５０ｐＭを示し、一方Ｍａｂ Ｄ２７ＱのＫＤは１７６ｐＭを示した。本発明のＭａｂにおけるヒト脱アシル化グレリンに対するｋｏｎ値は４．３２×１０６（１／Ｍｓ）から７３２１×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ａ４のｋｏｎ値は４．５６×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｍａｂ Ｄ５２Ｎが示すｋｏｎ値は３．２６×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＭａｂにおけるヒト脱アシル化グレリンに対するｋｏｆｆ値は２．５７×１０−５（１／ｓ）から９．５３×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｍａｂ Ａ５のｋｏｆｆ値は６．６７×１０−５（１／ｓ）を示し、一方Ｍａｂ Ｄ５２Ｎのｋｏｆｆ値は３．４３×１０−２（１／ｓ）を示した。
【００４２】
＜実施例４＞
（インビトロＦＬＩＰＲアッセイにおけるヒト化Ｄ４ Ｍａｂの活性）
インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）は、ＧＨＳ−Ｒ１ａ（ヒトグレるん受容体）を発現するために安定的に形質転換したハムスターＡＶ１２細胞と共に用いた。このアッセイは、グレリン／ＧＨＳ−Ｒ１ａ結合及び本発明のヒト化Ｍａｂの存在又は不在におけるシグナリングを検出する手段として、細胞内カルシウムの変化を評価する。
【００４３】
形質転換したＡＶ１２細胞は、成長培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）、５％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬハイグロマイシン、及び５０μｇ／ｍＬゼオシン）中、Ｔ−１５０フラスコあたり約５０−９０×１０６細胞まで成長させた。次いで細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＢｉｏｃｏａｔブラックポリＤ−リジンコートプレート（ウェルあたり１００μＬ成長培地内に６００００細胞）に分配した。５％ＣＯ２下、３７℃で約２０分間、細胞をインキュベートした。培地をプレートから除去し、１５０μＬ ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ １４０２５−０３７）を各ウェルに加えてから除去した。次いで、各ウェルに５０μＬのローディングバッファ（５μＭ Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））、ＦＬＩＰＲバッファ（カルシウム含有Ｈａｎｋｓ平衡塩（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ １４０２５−０９２））中０．０５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ及び０．７５％ ＢＳＡを加えることにより、細胞中に色素をローディングした。プレートをさらに５％ＣＯ２下、３７℃で１時間インキュベートした。次いでウェルをＨＢＳＳで２回洗浄し、次いでウェルあたり５０μＬ ＦＬＩＰＲバッファを添加した。
【００４４】
試料は、７．２μＬカルシウム濃縮液（ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ ３．７ｍｇ／ｍＬ水溶液をＨＢＳＳとの１：１混合し、フィルタ滅菌）、実施例３（種々の濃度）に開示のＭａｂ ３０μＬ、及び３．７５％ＢＳＡ／５０％ＨＢＳＳ中Ｃ−８アシル化１−２８ヒトグレリン（２．５μＬストック）１６．８μＬを組み合わせて調製した。試料溶液の最終濃度は０．７５％ＢＳＡ、及びＦＬＩＰＲバッファとほぼ同一濃度のカルシウムとなった。ＡＶ１２細胞を有するウェル中にて、試料溶液５０μＬに５０μＬＦＬＩＰＲバッファを添加した。ヒトグレリンの最終濃度は０．８３ｎＭである。細胞プレートは、ＦＬＩＰＲ装置中へのローディング前に約１５分間振とうした。試験試料又は対照試料を各ウェルに加え、蛍光イメージングプレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。
【００４５】
溶液中にＭａｂが無いか、又は関連しない抗体が存在するならば、アシル化された全長ヒトグレリンはＡＶ１２細胞上のＧＨＳ−Ｒ１ａ受容体に自由に結合し、情報伝達が発生して、アッセイ中に比較的高い値を生じる。溶液無いに全長ヒトグレリンと結合するＭａｂが存在するならば、ＧＨＳ−Ｒ１ａ受容体への全長ヒトグレリンの結合は阻害され、情報伝達が阻害され、アッセイ中に比較的低い値を生じる。用いたＭａｂ濃度は、１ｎＭヒトグレリン活性を約９５％阻害する濃度に滴定して計測した。
本願明細書に開示のＭａｂのＩＣ５０値は０．５５ｎＭから６．４９ｎＭの範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ｄ２７ＱのＩＣ５０値は１．１２ｎＭを示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４ＮのＩＣ５０値は２．５５ｎＭを示した。
【００４６】
＜実施例５＞
（食餌負荷肥満オスラットの体重におけるキメラのマウスＤ４グレリン抗体の効果）
本研究は、食餌負荷肥満（ＤＩＯ）ラットの体重減少におけるＤ４型抗体の投与効果を計測するために設計した。
離乳以来、高カロリー食餌負荷（ＴＤ９５２１７、Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ米ウィスコンシン州）に維持した食餌負荷肥満（ＤＩＯ）オスＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（Ｈａｒｌａｎ、米バージニア州）を用いた。ＤＩＯは、少なくとも７週間、４０％脂質、３９％炭水化物、及び２１％タンパクカロリー内容（ＴＤ９５２１７）を含んでなる餌を随意に給餌して確立した。動物は、１２時間の明暗サイクル（光照射２２００時間）を有する温度制御（２４℃）した施設内に固体別に収容し、自由に食餌（ＴＤ９５２１７）及び水にアクセスさせた。この施設に２週間順化した後、動物をランダム化し、体重ごとにグループ試験した。
【００４７】
処理開始の１日前及び処理終了時に、ＱＮＭＲにて身体組成を測定した。０、７、１４日目の毎週、対照同位体又はキメラなマウスＤ４抗グレリン抗体（１０又は３０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。２１日間、明暗期間の暗周期前の毎朝、動物の１日の摂食及び体重をモニタした。キメラのＤ４抗グレリン抗体は、上述の実施例３に開示のように、マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１軽鎖及び重鎖可変領域にそれぞれ配列番号２及び３を含んでなり、ラット軽鎖カッパ定常ドメイン及びラットＩｇＧ１重鎖定常ドメインに対してそれぞれ配列番号６０及び６１が融合する。
【００４８】
マウス／ラットのキメラマウスＤ４グレリン抗体の投与により、２１日処理後の食餌負荷肥満オスＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットにおいて、累積的な摂食、累積的な体重変化、及び脂質量の低下のそれぞれにおける減少という顕著な服用応答が生じた。これらの結果は、当該肥満ラットモデルにおいて、Ｄ４型の抗グレリン抗体が摂食及び肥満に関連する生理学的パラメータの減少に有効であることを示唆している。
【技術分野】
【０００１】
ヒトグレリンは、血中を循環し、配列ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（並列番号：１）を有する２８アミノ酸ペプチドホルモンである。アミノ酸位置３のセリン（Ｓｅｒ３）がｎ−オクタノイル基（「Ｃ８」又は「Ｃ８アシル化グレリン」）でアシル化されると、これは下垂体内の成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）と結合し、成長ホルモンが放出される。動物に食物が欠乏するとグレリンの血漿濃度は上昇し、食前に最大となり、摂食することで減少する。食欲を制御できずに重症の肥満を引き起こす遺伝子障害であるプラダー・ウィリー症候群の人々は、グレリンのレベルが極めて高い。こうした結果からグレリンが食事の動機づけに重要な役割を果たしていることが示された。
【背景技術】
【０００２】
摂食障害における役割に加えて、グレリンはＨｅｐＧ２細胞系及び前立腺ガン細胞系において増殖効果を有することも示した。グレリンにより成長を増強される他の細胞系としては、Ｈ９Ｃ２心筋細胞、膵臓腺ガン、副腎細胞、下垂体成長ホルモン分泌細胞、脂肪細胞、造骨細胞、乳ガン細胞系が挙げられる。
【０００３】
従って、グレリンの活性を調節する薬剤は、例えば、非インシュリン依存性糖尿病肥満及び肥満関連障害、並びに特定のガン等、哺乳類における種々の疾病又は障害の治療に可能性のあることを表しており、グレリン濃度又は活性の低下は望ましい治療効果に貢献する。
【０００４】
ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ２００６／０１９５７７（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）は、ヒトグレリンＣ末端に対する種々のマウスモノクローナル抗体のＦａｂ部位を開示し、Ｆａｂ３２８１、４７３１及び４２８１が命名されている（マウスＤ４ Ｆａｂ）。これらのＦａｂは、ヒトグレリンのアシル化及び非アシル化形態の両者と、このペプチドのアミノ酸１４−２７の範囲内に位置する抗原エピトープで結合する。全長（１−２８）Ｃ８アシル化ヒトグレリンに対するこれらのＦａｂのアフィニティ（ＫＤ）は、４．３６×１０−９から８．６２×１０−１１Ｍ（４３６０ｐＭから８６．２ｐＭ）の範囲である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肥満、肥満関連障害及び疾病、他の摂食障害、及びグレリン濃度上昇に関連する障害を治療するための、安全で効果的な手段への差し迫った需要がある。摂食を誘導する役割、及びある種の細胞系への増殖効果があることから、グレリンはこのような治療介入のための好適な目標である。本願明細書に開示のヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分には結合及び生物学的特性の範囲を示し、これは例えば、アシル化及び脱アシル化ヒトグレリンに対するＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ、安定的に形質転換しヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するハムスターＡＶ１２細胞の細胞内カルシウムにおけるアシル化ヒトグレリン媒介増加の阻害のＩＣ５０値等であり、国際出願ＰＣＴ第ＷＯ２００６／０１９５７７号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）に開示のマウスＤ４ Ｆａｂのものとは異なる。これらの特性により、本発明が想定する治療アプリケーションのための至適な抗体薬剤の選択が容易になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明の第１の態様は、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、これはアシル化及び脱アシル化ヒトグレリンのいずれにも選択的に結合し：
ａ）アシル化ヒトグレリンに対して約１７３０ｐＭから約１１ｐＭの範囲の平衡解離定数ＫＤを示し、
ｂ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から約４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲のｋｏｎ値を示し、
ｃ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．９８×１０−５（１／ｓ）から約２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲のｋｏｆｆ値を示し、
前記ＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ値は表面プラズモン共鳴により計測され；
ｄ）ヒト成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞において、細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を、インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイによる測定としてＩＣ５０が約１０ｎＭ以下で阻害する。
【０００７】
別の態様において、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域、又はヒトカッパ又はラムダから選ばれる軽鎖定常領域を含みうる。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４が好適である。
別の態様において、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域、又はヒトカッパ又はラムダから選ばれる軽鎖定常領域を含みうる。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４が好適である。
別の態様において、ヒト化抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片からなる群から選ばれる。
【０００８】
別の態様において、前述のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の任意の１つは以下のものでありうる：軽鎖可変領域は配列番号４で示される配列を有するペプチドを含み、重鎖可変領域は配列番号５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４６で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４７で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３５で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４８で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３６で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４９で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３７で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５０で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３８で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５１で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号３９で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５２で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４０で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５３で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４１で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５４で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５５で示される配列を有するペプチドを含み；軽鎖可変領域は配列番号４３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５６で示される配列を有するペプチドを含み；又は、軽鎖可変領域は配列番号４４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５７で示される配列を有するペプチドを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含んでなる医薬品組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、医薬品として用いるための、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳類、好適にはヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、又はガンからなる群から選ばれる疾病又は障害の治療のための、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、前述のいずれか１つのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、
ヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、又はガンを治療する方法を提供する。肥満の治療法は、治療的でも、又は例えば美容、美観等の非治療的でもありうる。
【００１０】
さらなる態様において。本発明は、前述のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、活性がアシル化グレリンか又は脱アシル化グレリン（又は両者）から生じるものであっても、ヒトにおけるグレリン活性を中和又は阻害する、あるいは活性グレリン濃度を低下させる方法を提供する、グレリン活性を中和又は阻害する方法は、治療的でも、又は例えば美容、美観等のための非治療的でもありうる。
本発明の適用性のさらなる態様は、以下の詳細な記載及び実施例により明らかであり、これらは非限定的な例示のためのみである。
本発明は、タンパク工学を用いてげっ歯類の抗体定常領域及び可変ドメインフレームワーク領域をヒト抗体に見出された配列で入れ替えることにより、異質タンパク配列を低減し、ヒトグレリンに対して治療的に用いるためのヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本願明細書に開示のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアシル及び脱アシルグレリンに対してある範囲の解離定数（アフィニティ又はＫＤ）を示し、ヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞での、ヒトグレリン媒介による細胞内カルシウム増加の阻害において、ｋｏｎ及びｋｏｆｆのユニークな組み合わせ及び種々のＩＣ５０値を含んでなり、国際特許出願ＰＣＴ国際広報ＷＯ第２００６／０１９５７７号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）に開示のマウスＤ４ Ｆａｂのものとは異なっている。例えば、ＫＤ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＩＣ５０値等、本発明の抗体及び断片の結合及び生物学的特性は、その範囲及び組み合わせによって、本発明が想定する治療的応用に対する至適な抗体薬剤の選択が容易になる。
【００１２】
本発明の抗グレリンモノクローナル抗体は肥満、肥満関連障害、ＮＩＤＤＭ（ＩＩ型糖尿病）、プラダー・ウィリー症候群、摂食障害、過食症、障害性の満腹、不安、胃の運動性障害（例えば、過敏性腸症候群及び機能性消化不良を含む）、インスリン抵抗性シンドローム、メタボリックシンドローム、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アンドロゲン過多症、多嚢胞卵巣シンドローム、種々のガン及び心血管性障害の治療又は予防に有用でありうる。加えて、本発明の抗グレリンモノクローナル抗体は、グレリンのアシル化又は非アシル化形態のいずれか、あるいは両者の濃度低下又は活性低下が役立つ任意の疾病又は症状の治療又は予防に有用でありうる。
本発明のヒト化抗グレリンモノクローナル抗体（その抗原結合部分を含む）は、ヒトグレリンへの特異的結合が可能である。好適な抗グレリンモノクローナル抗体は、グレリンに付随する生物学的活性を調節することが可能であり、これにより肥満及び肥満関連疾病を含んでなる種々の疾病及び病理学的症状の治療又は予防に有用である。
【００１３】
用語「アシル化ヒトグレリン」は、配列番号：１に示す配列を有し、Ｓｅｒ３をオクタノイル化された２８アミノ酸ペプチド；オクタノイルグレリン（１−２７）；デカノイルグレリン（１−２８）；デカノイルグレリン（１−２７）；及びデセノイルグレリン（１−２８）を含んでなる。脱アシルグレリン（１−２８）及び脱アシル化グレリン（１−２７）は成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａには結合しない。これらのグレリンの分子形態は全てヒト血漿中、並びに胃の中に見出される。本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合部分は、アシル化ヒトグレリンの全長（１−２８）及び切断形態（１−２７）に特異的に結合し、これらにはＳｅｒ３ｎ−オクチル、ｎ−デカノイル、又はｎ−デカノイル基、又は他の脂肪酸、あるいは脱アシルグレリンを含んでなる。
【００１４】
用語「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」は、抗原と相互作用し、抗体上で抗原に対するその特異性及びアフィニティを与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の一部を指す。この抗体部分は、抗原結合残基の適切なコンホメーションを維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。本発明のモノクローナル抗体の抗原結合領域のＣＤＲは、マウス又は実質的にマウス期限のＣＤＲのヒト化バージョンである。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ジアボディ；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された複数特異的抗体を含んでなる。
【００１５】
本願明細書に用いる用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体又はその抗原結合部位が、その特異的結合パートナー、すなわち抗原エピトープを含むペプチド以外の分子に顕著な結合を示さない状況（すなわち、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１未満）を指す。当該用語は、例えば本発明の抗体の抗原結合領域が数多くの抗原に含まれる特定のエピトープに対して特異的である場合にも使用可能であり、この場合、抗原結合領域を担持する特定の抗体は、そのエピトープを含んでなる種々の抗原に結合しうる。本発明のモノクローナル抗体は、上述の配列番号：１及びその変異形を含んでなるグレリン分子に選択的に結合し、非グレリンタンパクには結合しない（又は結合が弱い）。
【００１６】
本発明の抗体を参照する際の用語「生物学的特性」「生物的特徴」「生物学的活性」又は「生物活性」は、交換可能に用いられ、アシル化又は脱アシル化グレリンの１以上の活性、グレリン濃度、又はグレリン活性を調節する、例えば少なくとも１つのタイプの哺乳類細胞において細胞内カルシウム濃度を変化させる当該抗体の能力；エピトープ／抗原におけるアフィニティ及び特異性（例えばグレリンに結合する抗グレリンモノクローナル抗体）；アシル化又は脱アシル化グレリンの活性とインビボ、インビトロ、又はインシチュにおいて拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）する能力；抗体のインビボ安定性；及び抗体の免疫特性を含んでなるが、これらに限定しない。上述の特性又は特徴は、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分析、インビトロ及びインビボ中和アッセイ、及びヒト、霊長類、又は必要により任意の他の生成源を含む異なる起源の組織切片を用いる免疫組織化学を含んでなる当業に公知の技法を用いて観察又は測定されうるが、これらに限定しない。
【００１７】
用語「阻害」又は「阻害する」は、生物学的活性又は特性、若しくは疾病又は症状を含んでなる、阻害されるものの進行又は重症度の中和、拮抗、抑制、妨害、制止、減速、崩壊、停止、又は逆転を意味するが、これらに限定しない。本発明の抗ヒトグレリン（又は抗グレリン）モノクローナル抗体を参照する用語「中和」又は「拮抗」、若しくは「グレリン活性に拮抗（中和）する抗体」又は「グレリンに拮抗（中和）する」という語句は、ヒトグレリンへの結合又は接触によりアシル化又は脱アシル化ヒトグレリンが誘起する生物学的活性の阻害が生じる抗体を指すことを意図する。ヒトグレリンの生物学的活性は、体重減少の誘発、摂食の変質、受容体結合の阻害（受容体結合アッセイの例示としてはＷＯ ０１／８７３３５を参照）、又はグレリン受容体結合アッセイにおける信号伝達を含んでなるが限定しない、ヒトグレリンの生物学的活性の、１以上のインビトロ又はインビボの指標を測定することにより評価しうる。グレリンの生物学的活性の指標は、当業に公知の１以上の種々のインビトロ又はインビボのアッセイにより評価しうる。例えば、グレリン活性に中和又は拮抗する抗グレリン抗体の能力は、本願明細書の実施例４に記載のＦＬＩＰＲアッセイを用いて評価する。
【００１８】
用語「個人」「被験者」「患者」はヒトを指す。
本発明は、アシル化ヒトグレリン及び脱アシル化ヒトグレリンの両者に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分の提供に関する。このような抗体は、アシル化ヒトグレリンでも脱アシルヒトグレリンでも、あるいは両者であっても、ヒトグレリン又はヒトグレリンの生物学的活性を中和する。阻害される活性は：（ｉ）受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａに対するアシル化ヒトグレリンの結合；（ｉｉ）ＧＨＳ−Ｒ１ａに結合するアシル化ヒトグレリンにより促進される情報伝達；（ｉｉｉ）特異的結合箇所を有する結合パートナーに対する脱アシル化ヒトグレリンの結合、又は（ｉｖ）特異的結合箇所を有する結合パートナーに結合する脱アシル化ヒトグレリンにより促進される情報伝達、でありうる。本発明のヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分の、アシル化及び脱アシル化の両形態のヒトグレリンに対する特異的結合により、当該分子は、グレリン付随疾病及び症状、すなわち被験者内に存在するグレリンの生物活性又は活性グレリン濃度の低下又は阻害が役立つ疾病又は症状の治療薬又は予防薬として用いうる。
【００１９】
好適な実施形態において、本発明は、アシル化及び脱アシルヒトグレリンの両者に結合する、単離されたヒト化抗ヒトグレリンモノクローナル抗体及びその抗原結合部分を提供する。当該抗体は、平衡解離定数ＫＤが約１７３０ｐＭ〜約１１ｐＭの範囲（固相ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分析により室温で計測）でアシル化グレリンに結合し、ヒトグレリン受容体ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞における細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介による増加が、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０値となるように、ヒトグレリンの活性に拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）する。
【００２０】
本発明の抗体の軽鎖可変領域に対する好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は以下の配列を含んでなり、これは例示を目的としてＦａｂ ３ａ（太字及び下線）のＣＤＲと共に本願明細書に開示する。
【００２１】
本発明の抗体の重鎖可変領域に対する好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は以下の配列を含んでなり、これは例示を目的としてＦａｂ ３ａ（太字及び下線）のＣＤＲと共に本願明細書に開示する。
【００２２】
ヒト定常領域配列は当業に公知であり、文献に報告されている。好適なヒト定常軽鎖配列はカッパ及びラムダ定常軽鎖配列を含んでなる。好適なヒト定常重鎖配列は、ヒトガンマ１、ヒトガンマ２、ヒトガンマ３、ヒトガンマ４、及び、例えばインビボ半減期の増強、Ｆｃ受容体結合の低減等、変質した効果又は機能を提供するこれらの変異体を含んでなる。ヒトガンマ１及びヒトガンマ４、並びにこれらの変異体は当業に公知であり、特に好適である。
【００２３】
いくつかの例において、ヒトグレリンのアミノ酸１４−２７に結合する抗体から、選択したヒトフレームワーク上に非ヒトＣＤＲを移植することにより生成したヒト化抗体は、ヒトグレリンに対して所望のアフィニティを有するヒト化抗体を提供する。しかしながら、抗原結合を増強するために、選択したヒトフレームワーク又は１以上のＣＤＲの特定の残基をさらに修飾することが必要であるか又は好ましい。好適には、結合部位の構造を維持するか又は影響を及ぼす親抗体のフレームワーク残基は保存される。このような残基は、親抗体又はＦａｂ断片のＸ線結晶学により同定可能であり、これにより抗原結合部位の３次元構造が同定される。
本発明は、さらに、アフィニティ又は特異性に悪影響を及ぼさない、ＣＤＲ内の１又は２の保守的なアミノ酸置換変異体を含んでなる、本願明細書に開示のヒト化抗体及び抗体断片に対して実質的に相同な変異体及び等価物を提供することに関する。
このような変異体又は等価物はＣＤＲの末端アミノ酸の欠失も含んでなる。
【００２４】
（診断利用）
本発明のヒト化抗体は、アシル化又は脱アシルのいずれかの形態においてヒトグレリンの発現に付随する疾病又は症状の診断に用いることが可能であり、あるいはグレリン関連症状に対して治療が行われる又は治療が考慮される被験者内のグレリン濃度をモニターすることが可能である。診断アッセイは、本発明の抗体及びヒト体液、細胞又は組織抽出物等の試料中のアシル化グレリン及び／又は脱アシルグレリンを検出するための標識を利用する方法を含んでなり、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳ等のプロトコルを含んでなる。
【００２５】
（治療利用）
本発明のモノクローナル抗体を含む医薬品組成物は、肥満症及び／又は肥満関連障害、例えば非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ；ＩＩ型糖尿病）、プラダー・ウィリー症候群、障害性の満腹、過食症、不安、胃の自動運動性障害（例えば、過敏性腸症候群及び機能性消化不良が挙げられる）、インスリン抵抗性症候群、メタボリック初稿群、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アンドロゲン過多症、多嚢胞の子房のシンドローム、心血管性の障害及び種々のガン、例えば肝ガン、前立腺ガン、心臓ガン、膵臓ガン、副腎ガン、下垂体ガン、骨ガン及び乳ガン等の障害の治療又は予防に用いてもよい。当該抗体は、食欲亢進、神経性食欲不振及び過食症を含む摂食障害の治療又は予防に用いてもよいが、これらに限定しない。
グレリン（アシル化又は脱アシル、若しくは両者）活性が有害である前述の障害の少なくとも１以上を治療又は予防するための医薬品としての本発明の抗ヒトグレリンモノクローナル抗体も、本願明細書の想定範囲にある。加えて、グレリン活性が有害である前述の障害の少なくとも１以上の治療用医薬品の製造において、本発明の抗グレリンモノクローナル抗体を使用することも、想定範囲にある。
本願明細書に用いるように、「治療」「治療する」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的作用を得ることを指す。用語「治療」は、疾病の阻害、すなわち疾病又は障害を退行させ、若しくは症候又はその合併症を軽減する目的のために、哺乳類、特にヒトに本発明の化合物の投与することを含んでなる。この効果は、疾病に対する部分的又は完全な治療法、及び／又は疾病に起因する影響の逆行の場合がある。治療は、摂食制限及びエクササイズ等、行動の改良と組み合わせてもよい。そのため、肥満治療には、摂食抑制、体重増加の抑制を含んでなり、及び／又は必要であれば被験者の体重減少を含んでなる。治療効果は予防的であってもよく、すなわち、疾病を被るかもしれないが、疾病を有するという診断をまだ受けていない被験者に、疾病又は症候が発生する前に完全に又は部分的に発生を防ぐことでもよい。
薬剤投与計画は、最適な所望の反応（例えば治療又は予防の反応）を提供するように調節してもよい。例えば、単一のボーラス投与を行ってもよく、いくつかの分割服用量を経時的に投与してもよく、又は服用量は治療状況の緊急性の度合いに応じて減少又は増加してもよい。
【００２６】
（医薬品組成物）
本発明のヒト化抗体及び抗原結合部分は、被験者への投与に適切な医薬品組成物に組み込まれうる。当該抗体化合物の投与は単独でもよく、単一又は複数の服用において薬理学的に許容できるキャリア、希釈液又は賦形剤と組み合わせてもよい。医薬品組成物は、本願明細書に開示の抗体の組み合わせを含みうる。このような医薬品組成物は、選択された投与モード又は経路に適切であるようｎ設計され、薬理学的に許容できる希釈剤、キャリア、及び／又は分散剤、バッファ、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張力剤、安定化剤等の賦形剤が適宜用いられる。このような組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年、に開示のように、通常の技法に従って設計しうる。医薬品組成物のための適切なキャリアは、本発明のモノクローナル抗体に組み合わされるときには、分子の活性を保持し、被験者の免疫系に反応性でない任意の材料を含んでなる。
本発明の抗ヒトグレリンモノクローナル抗体を含む医薬品組成物は、肥満又は関連障害、若しくは種々のガンに付随する病理の危険にある又は表している被験者に、本願明細書に記載のように、経口、非経口、吸引、又は局所（静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口内、舌下、座薬（経直腸又は経膣）を含む）投与を含んでなる通常の投与技法を用いて投与されうる。静脈内、腹腔内、又は皮下注射による周辺性の全身輸送が好適である。
このような医薬品組成物は、好適には本発明の１以上の抗体の「有効量」又は「治療上有効量」又は「予防的有効量」を含有する。「有効量」又は「治療上有効量」は、服用に対して及び必要期間の間に、所望の治療上の結果を成し遂げるのに効果的な量を指す。抗体の有効量又は治療上有効量は、疾病状態、年齢、性別及び個人の体重等の要因、及び所望の反応を個人に誘発する抗体又は抗体部分の能力に従って変化しうる。
有効量又は治療上有効量は、いかなる抗体の毒性又は有害な作用よりも治療上の有益な効果が上回るものである。「予防的有効量」は、服用に対して及び必要期間の間に、所望の予防上の結果を成し遂げるのに効果的な量を指す。典型的には、予防的投与量は、被験者が病気になる前に、又は病気の初期段階において用いるので、予防的有効量は、治療上有効量よりも少ないであろう。
有効量又は治療上有効量は、被験者に治療上の利点をもたらすのに必要な活性薬剤の、少なくとも最小量であるが有毒量未満である。換言すると、肥満症治療のためのこうした量は、例えばボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）の減少等により、哺乳類の肥満状態に改良を誘導、回復、さもなければ発生する量である。
医療技術において周知のように、任意の被験者に対する服用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、一般的健康状態、及び同時に投与される他の薬剤を含んでなる多くの要因に依存する。本発明の抗体又は抗原結合部分のための典型定期な服用量は、例えば、約０．００１から約１０００μｇの範囲でありうるが、しかしながら、特に前述の要因を考慮し、この例示を下回る又は上回る服用量も考えられる。１日あたりの非経口投与基準は全体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、好適には約０．３μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好適には約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、さらにより好適には１日あたり体重の約０．５から約１０ｍｇ／ｋｇである。患者の経過記録を周期的な評価によりモニタし、これによって投与量を調節しうる。
以下の実施例は、例示のためのみに提示し、いかなる点においても本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例】
【００２７】
＜実施例１＞
（マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１のヒト化）
ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ２００６／０１９５７７ （ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９６８）号は、Ｆａｂ３２８１、４７３１、及び４２８１と名付けられた、ヒト化グレリンＣ末端への種々のマウスモノクローナル抗体を開示している。これらのＦａｂは、当該ペプチドのアミノ酸１４−２７内に位置する抗原エピトープでヒトグレリンのアシル化及び脱アシル化形態の両者に結合する。これらのＦａｂのＣ８アシル化ヒトグレリン全長（１−２８）に対するアフィニティ（ＫＤ）は、４．３６×１０−９から８．６２×１０−１１Ｍ（４３６０ｐＭから８６．２ｐＭ）の範囲にある。
マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を、ＣＤＲ領域を太字及び下線付きとして、以下に示す。
【００２８】
（マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１）
（軽鎖）
【００２９】
（重鎖）
マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１の軽鎖及び重鎖可変領域の両者のＣＤＲにアミノ酸の変化を導入することは、通常の分子生物学の技法を介してコード化ＤＮＡ内の適切なコドンを変更することにより実施される。表１に、本発明のヒト化Ｆａｂ内ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
表１。ヒト化Ｄ４ ＦａｂのＣＤＲアミノ酸配列
【表１】
＊ Ｄ４ ７．１ ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ ＣＤＲは、それぞれ適切なマウスＬＣＶＲ及びＨＣＶＲフレームワーク内のマウスに最適化した配列である。
表１の全体を通じて用いるように：
Ｘ１はＱ又はＤであり；
Ｘ２はＳ又はＨであり；
Ｘ３はＮ、Ｓ、Ｔ、又はＤであり；
Ｘ４はＮ、Ｆ、Ｙ、又はＨであり；
Ｘ５はＨ又はＳであり；
Ｘ６はＳ又はＤであり；
Ｘ７はＹ、Ｔ、又はＧであり；
Ｘ８はＮ又はＤであり；
Ｘ９はＥ、Ｙ、又はＦである。
軽鎖又は重鎖可変領域の全体は、適切なＣＤＲをヒト軽鎖及び重鎖フレームワークアミノ酸配列中に取り入れることにより生成される。
本発明の抗体の軽鎖可変領域のための好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は、次の配列を含んでなり、本願明細書に開示のＦａｂ ３ａ（太字及び下線）と共に図示を目的として当該配列を表す。
本発明の抗体の重鎖可変領域のための好適なヒトフレームワークアミノ酸配列は、次の配列を含んでなり、本願明細書に開示のＦａｂ ３ａ（太字及び下線）と共に図示を目的として当該配列を表す。
表２に、本発明のＦａｂの軽鎖可変領域アライメントを示す。
【００３１】
表２．Ｆａｂ軽鎖可変領域アライメント
【表２】
表３に、本発明のＦａｂの重鎖可変領域アライメントを示す。
【００３２】
表３．Ｆａｂ重鎖可変領域アライメント
【表３】
マウスに最適化したＦａｂ Ｄ４ ７．１のＬＶＣＲ及びＨＣＶＲの配列は、ＣＤＲに太字及び下線を付し、以下に示す。
Ｆａｂ Ｄ４ ７．１ ＬＣＶＲ
Ｆａｂ Ｄ４ ７．１ ＨＣＶＲ
【００３３】
＜実施例２＞
（アシル化ヒトグレリンに対するヒト化Ｄ４ Ｆａｂのアフィニティ）
実施例１に開示の、Ｃ−８アシル化ヒトグレリン（１−２８）に対するヒト化／最適化抗グレリンＦａｂのアフィニティ（ＫＤ）は、ＣＭ５センサチップを装備するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置を用いて測定した。記載の場合を除き、全ての試薬及び材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ社（Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）から購入した。測定は約２５℃で実施した。ヒトグレリンを含む試料は、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）に溶解した。捕獲抗体は、Ｄ４及びＤ４ ７．１Ｆａｂに対してはヤギ抗マウスカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）であり、他の全てのＦａｂに対してはヤギ抗ヒトカッパ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であり、以後「捕獲抗体」と称するこれらのものを、アミン結合を用いるフローセル上に固定化した。フローセル（１−４）は、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物で７分間、流速１０μＬ／分にて活性化した。ヤギ抗マウスカッパ又はヤギ抗ヒトカッパ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中３０μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）は、流速１０μＬ／分にて４つのフローセルに手操作で注入した。表面密度をモニタし、必要ならば全てのフローセルの表面密度が４５００−５０００反応単位（ＲＵ）となるまで追加の捕獲抗体を個々の細胞に注入した。表面は、１Ｍエタノールアミン−塩酸、ｐＨ８．５（１０μＬ／分）を７分間注入してブロックした。共有結合的に結合しなかった全ての捕獲抗体が完全に除去されたことを確認するために、１０ｍＭグリシン１５μＬ、ｐＨ１．５を２回注入した。
動態試験用に用いたランニングバッファは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％ Ｐ２０を含んでなる。
【００３４】
動態結合データの収集は、大量輸送効果を最小にするために、最大流速（１００μＬ／分）かつ低表面密度で実施した。各分析サイクルは次からなる：（ｉ）異なるＦａｂに対して流速１０μＬ／分でフローセル２、３及び４に５μｇ／ｍＬ溶液１−１０μＬを注入することにより、Ｆａｂ（ＢｉｏＳｉｔｅ）３００−３５０ＲＵを捕獲する、（ｉｉ）フローセル１を参照フローセルとして全ての４つのフローセルにヒトグレリン（２回希釈増量して５０ｎＭから０．３９ｎＭの濃度範囲）２００μＬを注入（２分）、（ｉｉｉ）２０分間解離（バッファフロー）、（ｉｖ）１５秒間１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で捕獲抗体表面を再生成、（ｖ）３０秒間ランニングバッファのブランク注入、及び（ｖｉ）次のサイクル開始前、２分間の安定化時間。信号は、フローセル２からフローセル１を減算し、フローセル３からフローセル１を減算し、フローセル４からフローセル１を減算してモニタした。試料及びブランクバッファは、ランダムな順番で２重に注入した。データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１ソフトウェアを用いて処理し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１又はＣＬＡＭＰグローバルアナリシスソフトウェアのいずれかの１：１結合モデルにフィットさせた。
【００３５】
本願明細書に開示のヒト化Ｆａｂは、Ｃ−８アシル化ヒトグレリン全長に対し、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴による計測で１７３０ｐＭから２０ｐＭのアフィニティを示した。例えば、Ｆａｂ Ａ２のＫＤは４３ｐＭを示し、一方Ｆａｂ Ｔ３２ＹのＫＤは１０００ｐＭを示した。本発明のＦａｂに対するｋｏｎ値は５×１０６（１／Ｍｓ）から３．０５×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｆａｂ Ａ２のｋｏｎ値は６．３４×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｆａｂ Ｓ２８Ｄが示すｋｏｎ値は３×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＦａｂに対するｋｏｆｆ値は１．８８×１０−４（１／ｓ）から１．９０×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｆａｂ Ａ２のｋｏｆｆ値は２．７×１０−４（１／ｓ）を示し、一方Ｆａｂ Ｔ３２Ｙのｋｏｆｆ値は８．７５×１０−３（１／ｓ）を示した。最終的には、本発明のＦａｂのｔ１／２は分単位において０．６から６１を示した。例えば、Ｆａｂ Ｔ３２Ｙのｔ１／２は１分を示し、一方Ｆａｂ Ａ２のｔ１／２は４３分を示した。
【００３６】
＜実施例３＞
（ヒト化Ｄ４モノクローナル抗体の種々のグレリンに対するアフィニティ）
アシル化ヒトグレリンに対するヒト化Ｄ４モノクローナル抗体のアフィニティ（ＫＤ）は、ＣＭ５センサチップを装備するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置を用いて測定した。
このモノクローナル抗体は、ラット軽鎖カッパ定常ドメイン及びラットＩｇＧ１重鎖定常ドメインのそれぞれに融合した、Ｆａｂの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を含んでなる。
使用したラット軽鎖カッパ定常ドメインのアミノ酸配列は次の通りである。
【００３７】
（ラット軽鎖カッパ定常ドメイン）
使用したラット重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は次の通りである。
【００３８】
（ラット重鎖カッパ定常ドメイン）
記載の場合を除き、全ての試薬及び材料はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ社（Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）から購入した。全ての測定は約２５℃で実施した。ヒトグレリン（全長、Ｃ−８アシル化又は脱アシル）を含む全ての試料及び抗グレリンＭａｂは、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）で希釈した。全てのＭａｂに対し、後述のアミン結合を用いて抗体をＣＭ５チップに直接結合して、表面密度が８００−１０００反応単位（ＲＵ）となるようにした。フローセル（１−４）は、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物で７分間、流速１０μＬ／分にて活性化した。Ｍａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ４．５で１０μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／分にて４つのフローセルに手操作で注入した。表面密度をモニタし、必要ならば全てのフローセルの表面密度が８００−１０００ＲＵとなるまで追加の捕獲抗体を個々の細胞に注入した。表面は、１Ｍエタノールアミン−塩酸、ｐＨ８．５（１０μＬ／分）を７分間注入してブロックした。共有結合的に結合しなかった全ての捕獲抗体が完全に除去されたことを確認するために、１０ｍＭグリシン１５μＬ、ｐＨ１．５を２回注入した。動態試験用に用いたランニングバッファは、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）である。
【００３９】
動態結合データの収集は、大量輸送効果をを最小化するために、最大流速（１００μＬ／分）かつ低表面密度で実施した。各分析サイクルは次からなる：（ｉ）フローセル１を参照フローセルとして全ての４つのフローセルにグレリン（２回希釈増量して５０ｎＭから０．３９ｎＭの濃度範囲）２００μＬを注入（２分）、（ｉｉ）２０分間解離（バッファのみのフロー）、（ｉｉｉ）１５秒間１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で捕獲抗体表面を再生成、及び（ｉｖ）次のサイクル開始前に２分間の安定化時間。信号は、フローセル２からフローセル１を減算し、フローセル３からフローセル１を減算し、フローセル４からフローセル１を減算してモニタした。試料及びブランクバッファは、ランダムな順番で２重に注入した。データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１ソフトウェアを用いて処理し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｖ３．１又はＣＬＡＭＰグローバルアナリシスソフトウェアのいずれかの１：１結合モデルにフィットさせた。
【００４０】
本願明細書に開示のヒト化／アフィニティ成熟した抗体は、Ｃ−８アシル化ヒトグレリンに対し、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴分析の計測で９３１ｐＭから１１ｐＭの範囲のアフィニティを示す。例えば、Ｍａｂ Ａ４のＫＤは７４ｐＭを示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４ＨのＫＤは４００ｐＭを示した。本発明のＭａｂに対するｋｏｎ値は４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ａ２のｋｏｎ値は４．４４×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｍａｂ Ｓ３４Ｈが示すｋｏｎ値は４．２４×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＭａｂに対するｋｏｆｆ値は４．９８×１０−５（１／ｓ）から２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｍａｂ Ａ５のｋｏｆｆ値は５．７４×１０−５（１／ｓ）を示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４Ｈのｋｏｆｆ値は１．６９×１０−２（１／ｓ）を示した。最終的には、本発明のＭａｂのｔ１／２は分単位において０から２３２を示した。例えば、Ｍａｂ Ｓ３４Ｈのｔ１／２は１分を示し、一方Ｍａｂ Ａ５のｔ１／２は２０１分を示した。ｔ１／２は次式から計算した。ｔ１／２（秒）＝（ｌｎ０．５）／（ｋｏｆｆ（１／秒））この値を６０で除して分に変換し、抗体：抗原複合体の理論的な半減値と考えた。これらの結合の動態は、上記改良されたＦａｂとＭａｂの間のアフィニティにおける類似性から示差されるように、定常領域（マウス又はラット）の付加によるものではない。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脱アシル化グレリンに対して、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴分析の計測で１３２０ｐＭから１４．１ｐＭの範囲のアフィニティを示す。例えば、Ｍａｂ Ｄ５２ＮのＫＤはヒト脱アシル化グレリンに対して１０５０ｐＭを示し、一方Ｍａｂ Ｄ２７ＱのＫＤは１７６ｐＭを示した。本発明のＭａｂにおけるヒト脱アシル化グレリンに対するｋｏｎ値は４．３２×１０６（１／Ｍｓ）から７３２１×１０７（１／Ｍｓ）の範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ａ４のｋｏｎ値は４．５６×１０６（１／Ｍｓ）であり、一方Ｍａｂ Ｄ５２Ｎが示すｋｏｎ値は３．２６×１０７（１／Ｍｓ）であった。本発明のＭａｂにおけるヒト脱アシル化グレリンに対するｋｏｆｆ値は２．５７×１０−５（１／ｓ）から９．５３×１０−２（１／ｓ）の範囲だった。例えば、Ｍａｂ Ａ５のｋｏｆｆ値は６．６７×１０−５（１／ｓ）を示し、一方Ｍａｂ Ｄ５２Ｎのｋｏｆｆ値は３．４３×１０−２（１／ｓ）を示した。
【００４２】
＜実施例４＞
（インビトロＦＬＩＰＲアッセイにおけるヒト化Ｄ４ Ｍａｂの活性）
インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）は、ＧＨＳ−Ｒ１ａ（ヒトグレるん受容体）を発現するために安定的に形質転換したハムスターＡＶ１２細胞と共に用いた。このアッセイは、グレリン／ＧＨＳ−Ｒ１ａ結合及び本発明のヒト化Ｍａｂの存在又は不在におけるシグナリングを検出する手段として、細胞内カルシウムの変化を評価する。
【００４３】
形質転換したＡＶ１２細胞は、成長培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）、５％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬハイグロマイシン、及び５０μｇ／ｍＬゼオシン）中、Ｔ−１５０フラスコあたり約５０−９０×１０６細胞まで成長させた。次いで細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＢｉｏｃｏａｔブラックポリＤ−リジンコートプレート（ウェルあたり１００μＬ成長培地内に６００００細胞）に分配した。５％ＣＯ２下、３７℃で約２０分間、細胞をインキュベートした。培地をプレートから除去し、１５０μＬ ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ １４０２５−０３７）を各ウェルに加えてから除去した。次いで、各ウェルに５０μＬのローディングバッファ（５μＭ Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））、ＦＬＩＰＲバッファ（カルシウム含有Ｈａｎｋｓ平衡塩（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ １４０２５−０９２））中０．０５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ及び０．７５％ ＢＳＡを加えることにより、細胞中に色素をローディングした。プレートをさらに５％ＣＯ２下、３７℃で１時間インキュベートした。次いでウェルをＨＢＳＳで２回洗浄し、次いでウェルあたり５０μＬ ＦＬＩＰＲバッファを添加した。
【００４４】
試料は、７．２μＬカルシウム濃縮液（ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ ３．７ｍｇ／ｍＬ水溶液をＨＢＳＳとの１：１混合し、フィルタ滅菌）、実施例３（種々の濃度）に開示のＭａｂ ３０μＬ、及び３．７５％ＢＳＡ／５０％ＨＢＳＳ中Ｃ−８アシル化１−２８ヒトグレリン（２．５μＬストック）１６．８μＬを組み合わせて調製した。試料溶液の最終濃度は０．７５％ＢＳＡ、及びＦＬＩＰＲバッファとほぼ同一濃度のカルシウムとなった。ＡＶ１２細胞を有するウェル中にて、試料溶液５０μＬに５０μＬＦＬＩＰＲバッファを添加した。ヒトグレリンの最終濃度は０．８３ｎＭである。細胞プレートは、ＦＬＩＰＲ装置中へのローディング前に約１５分間振とうした。試験試料又は対照試料を各ウェルに加え、蛍光イメージングプレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。
【００４５】
溶液中にＭａｂが無いか、又は関連しない抗体が存在するならば、アシル化された全長ヒトグレリンはＡＶ１２細胞上のＧＨＳ−Ｒ１ａ受容体に自由に結合し、情報伝達が発生して、アッセイ中に比較的高い値を生じる。溶液無いに全長ヒトグレリンと結合するＭａｂが存在するならば、ＧＨＳ−Ｒ１ａ受容体への全長ヒトグレリンの結合は阻害され、情報伝達が阻害され、アッセイ中に比較的低い値を生じる。用いたＭａｂ濃度は、１ｎＭヒトグレリン活性を約９５％阻害する濃度に滴定して計測した。
本願明細書に開示のＭａｂのＩＣ５０値は０．５５ｎＭから６．４９ｎＭの範囲を示した。例えば、Ｍａｂ Ｄ２７ＱのＩＣ５０値は１．１２ｎＭを示し、一方Ｍａｂ Ｓ３４ＮのＩＣ５０値は２．５５ｎＭを示した。
【００４６】
＜実施例５＞
（食餌負荷肥満オスラットの体重におけるキメラのマウスＤ４グレリン抗体の効果）
本研究は、食餌負荷肥満（ＤＩＯ）ラットの体重減少におけるＤ４型抗体の投与効果を計測するために設計した。
離乳以来、高カロリー食餌負荷（ＴＤ９５２１７、Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ米ウィスコンシン州）に維持した食餌負荷肥満（ＤＩＯ）オスＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（Ｈａｒｌａｎ、米バージニア州）を用いた。ＤＩＯは、少なくとも７週間、４０％脂質、３９％炭水化物、及び２１％タンパクカロリー内容（ＴＤ９５２１７）を含んでなる餌を随意に給餌して確立した。動物は、１２時間の明暗サイクル（光照射２２００時間）を有する温度制御（２４℃）した施設内に固体別に収容し、自由に食餌（ＴＤ９５２１７）及び水にアクセスさせた。この施設に２週間順化した後、動物をランダム化し、体重ごとにグループ試験した。
【００４７】
処理開始の１日前及び処理終了時に、ＱＮＭＲにて身体組成を測定した。０、７、１４日目の毎週、対照同位体又はキメラなマウスＤ４抗グレリン抗体（１０又は３０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。２１日間、明暗期間の暗周期前の毎朝、動物の１日の摂食及び体重をモニタした。キメラのＤ４抗グレリン抗体は、上述の実施例３に開示のように、マウスＤ４ Ｆａｂ３２８１軽鎖及び重鎖可変領域にそれぞれ配列番号２及び３を含んでなり、ラット軽鎖カッパ定常ドメイン及びラットＩｇＧ１重鎖定常ドメインに対してそれぞれ配列番号６０及び６１が融合する。
【００４８】
マウス／ラットのキメラマウスＤ４グレリン抗体の投与により、２１日処理後の食餌負荷肥満オスＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットにおいて、累積的な摂食、累積的な体重変化、及び脂質量の低下のそれぞれにおける減少という顕著な服用応答が生じた。これらの結果は、当該肥満ラットモデルにおいて、Ｄ４型の抗グレリン抗体が摂食及び肥満に関連する生理学的パラメータの減少に有効であることを示唆している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化及び脱アシル化ヒトグレリンのいずれにも特異的に結合し：
ａ）アシル化ヒトグレリンに対して約１７３０ｐＭから約１１ｐＭの範囲の平衡解離定数ＫＤを示し、
ｂ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から約４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲のｋｏｎ値を示し、
ｃ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．９８×１０−５（１／ｓ）から約２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲のｋｏｆｆ値を示し、
前記ＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ値は表面プラズモン共鳴により計測され；
ｄ）ヒト成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞において、細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を、インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイによる測定としてＩＣ５０が約１０ｎＭ以下で阻害する、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加をＩＣ５０が約５ｎＭ以下で阻害する請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加をＩＣ５０が約２．５ｎＭ以下で阻害する請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を阻害する、ＩＣ５０が約１ｎＭ以下の、請求項１から３のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ４からなる群から選ばれる重鎖定常領域を含んでなる、請求項１から４のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
カッパ及びラムダからなる群から選ばれる軽鎖定常領域を含んでなる、請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
前記抗原結合部分はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片からなる群から選ばれる、請求項１から６のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
軽鎖可変領域は配列番号４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４６で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４７で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３５で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４８で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３６で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４９で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３７で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５０で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３８で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５１で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３９で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５２で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４０で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５３で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４１で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５４で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５６で示される配列を有するペプチドを含み；又は、
軽鎖可変領域は配列番号４４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５７で示される配列を有するペプチドを含む；
請求項１から７のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含んでなる医薬品組成物。
【請求項１０】
医薬品として用いるための、請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
ヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、及びガンからなる群から選ばれる疾病又は障害の治療のための、請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の使用。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、ヒトの肥満を治療する非治療的方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおける、グレリン活性を中和又は阻害する、あるいは活性グレリン濃度を低下させる、非治療的方法。
【請求項１】
アシル化及び脱アシル化ヒトグレリンのいずれにも特異的に結合し：
ａ）アシル化ヒトグレリンに対して約１７３０ｐＭから約１１ｐＭの範囲の平衡解離定数ＫＤを示し、
ｂ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．４４×１０６（１／Ｍｓ）から約４．８９×１０７（１／Ｍｓ）の範囲のｋｏｎ値を示し、
ｃ）アシル化ヒトグレリンに対して約４．９８×１０−５（１／ｓ）から約２．５８×１０−２（１／ｓ）の範囲のｋｏｆｆ値を示し、
前記ＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ値は表面プラズモン共鳴により計測され；
ｄ）ヒト成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａを発現するよう安定的に形質転換されたハムスターＡＶ１２細胞において、細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を、インビトロＦＬＩＰＲカルシウムアッセイによる測定としてＩＣ５０が約１０ｎＭ以下で阻害する、ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加をＩＣ５０が約５ｎＭ以下で阻害する請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加をＩＣ５０が約２．５ｎＭ以下で阻害する請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
細胞内カルシウムのアシル化ヒトグレリン媒介増加を阻害する、ＩＣ５０が約１ｎＭ以下の、請求項１から３のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ４からなる群から選ばれる重鎖定常領域を含んでなる、請求項１から４のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
カッパ及びラムダからなる群から選ばれる軽鎖定常領域を含んでなる、請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
前記抗原結合部分はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片からなる群から選ばれる、請求項１から６のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
軽鎖可変領域は配列番号４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４６で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４７で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３５で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４８で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３６で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号４９で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３７で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５０で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３８で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５１で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号３９で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５２で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４０で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５３で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４１で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５４で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４２で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５５で示される配列を有するペプチドを含み；
軽鎖可変領域は配列番号４３で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５６で示される配列を有するペプチドを含み；又は、
軽鎖可変領域は配列番号４４で示される配列を有するペプチドを含み、かつ重鎖可変領域は配列番号５７で示される配列を有するペプチドを含む；
請求項１から７のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含んでなる医薬品組成物。
【請求項１０】
医薬品として用いるための、請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
ヒトにおける肥満、非インシュリン依存性糖尿病、プラダー・ウィリー症候群、過食症、障害性の満腹、及びガンからなる群から選ばれる疾病又は障害の治療のための、請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の使用。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、ヒトの肥満を治療する非治療的方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分の有効量を、これを必要とするヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおける、グレリン活性を中和又は阻害する、あるいは活性グレリン濃度を低下させる、非治療的方法。
【公表番号】特表２００９−５２９０００（Ｐ２００９−５２９０００Ａ）
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６５１９（Ｐ２００８−５５６５１９）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２４５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１０２１
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２４５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１０２１
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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