ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体
【課題】ＭＣＰ−１の領域を変異させることで、単球吸引活性の阻害を可能にする。
【解決手段】単球吸引活性の阻害は、次の方法の一つ以上でＭＣＰ−１が修飾されるときに成功することが見出された。すなわち、ａ）２８位チロジンをアスパルテートで置換する、ｂ）２４位アルギニンをフェニルアラニンで置換する、ｃ）３位アスパルテートをアラニンで置換する、及び／又はｄ）２〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、である。請求項記載のＭＣＰ−１誘導体は、ＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害する必要のある患者に投与することができる。例えば、冠動脈形成手術を受けた患者に普通に生ずる再狭窄を防止するためにこの誘導体を使用することができる。本発明はさらに、この誘導体を用いるＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害する組成物及び方法に関する。
【解決手段】単球吸引活性の阻害は、次の方法の一つ以上でＭＣＰ−１が修飾されるときに成功することが見出された。すなわち、ａ）２８位チロジンをアスパルテートで置換する、ｂ）２４位アルギニンをフェニルアラニンで置換する、ｃ）３位アスパルテートをアラニンで置換する、及び／又はｄ）２〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、である。請求項記載のＭＣＰ−１誘導体は、ＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害する必要のある患者に投与することができる。例えば、冠動脈形成手術を受けた患者に普通に生ずる再狭窄を防止するためにこの誘導体を使用することができる。本発明はさらに、この誘導体を用いるＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害する組成物及び方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性ＭＣＰ−１、好ましくはヒトＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害するように変異させたＭＣＰ−１誘導体、並びにそれらの医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン（chemokines)は、特殊なタイプの白血球の化学吸引物質(chemoattractants)及び活性化因子である前炎症性（proinflammatory)サイトカインである。このファミリーに属するものは、共通の構造上のモチーフ、特に４個のシステインの位置並びに高度に保存されたその他の一次構造を共有している。それらの類似性にもかかわらず、多くのケモカインは標的細胞特異性において重複していない。ケモカインは、構造上及び遺伝上の基準に基づき、ケモカイン−αおよびケモカイン−βタンパク質という二つの下位のファミリーに分類することができる。
【０００３】
単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、前炎症性サイトカインのケモカイン−βファミリーの１員である。ヒトＭＣＰ−１のアミノ酸配列は、非特許文献１に開示されている。ＭＣＰ−１は、ナノモル濃度以下で好中球を除く単球を吸引しそして活性化する。ＭＣＰ−１は、好中球特異的な化学−吸引物質でありケモカイン−αファミリーの１員であるインターロイキン−８（ＩＬ−８）に構造的及び遺伝的に関係している。
【０００４】
単球は、冠動脈血管形成によって生じた損傷などの損傷した冠動脈に吸引され、そして再狭窄を引き起こすのに関与する。
【非特許文献１】ロリン（Rollins), モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー，９巻，１１号，４６８７−４６９５頁，１１月，１９８９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein)−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity)を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は、
[１] 内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体であって、該修飾が、ＭＣＰ−１のＮ−末端領域における置換、欠失または挿入であり、該Ｎ−末端領域が、ＭＣＰ−１の第１のシステイン間ループ前のアミノ酸残基からなる、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[２] 該修飾が２〜８位アミノ酸残基の欠失である、前記[１]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体、
[３] 該修飾がＮ−末端グルタミン残基の後におけるアミノ酸の挿入である、前記[１]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体、
[４] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２４位アルギニンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[５] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が３位アスパルテートでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[６] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２８位チロシンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、内因性ヒトＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒトＭＣＰ−１誘導体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、内因性ＭＣＰ−１、好ましくはヒトＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害するように変異させたＭＣＰ−１誘導体、並びにそれらの医薬組成物を提供する。好ましい態様においては、このＭＣＰ−１誘導体は２８位チロシン、２４位アルギニン、３位アスパルテート及び／又は約２位〜約８位の間のアミノ酸において修飾される。一つの態様においては、変異は２８位のチロシンにおいてではない。好ましくは、ＭＣＰ−１誘導体は２８位チロシンをロイシンで置換せず、及び／又は３０位アルギニンをバリンで置換しない。吸引活性の阻害はＭＣＰ−１が次の方法の一つ以上で修飾されると成功することが見出された、すなわち、ａ）２８位チロシンがアスパルテートで置換される、ｂ）２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換される、ｃ）３位アスパルテートがアラニンで置換される、及び／又はｄ）２位〜８位のアミノ酸配列が欠失される、である。
【０００９】
請求項に記載のＭＣＰ−１誘導体は、ＭＣＰ−１単球吸引活性を阻害する必要のある患者に投与することができる。この誘導体は、冠動脈形成を受けた多くの患者に典型的に起こるような再狭窄を防止するために使用することができる点で有利である。
【００１０】
本発明の上記の及びその他の特徴は、請求の範囲においてより具体的に記述されそして指摘されるであろう。本発明を構成する特定の誘導体は例示の仕方で示され、従って本発明を限定するものではない。本発明の原理及び特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく変わった無数の態様で実施することができる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＣＰ−１の領域を変異させて、内因性ＭＣＰ−１単球化学吸引活性を阻害することができるという発見に基づく。所望の阻害活性を持つＭＣＰ−１変異体が開発された。この活性の阻害は、例えば、ヒトＭＣＰ−１が次の方法の一つ以上で修飾されるときに成功することが分かる。すなわち、ａ）２８位チロシンをアスパルテートで置換する、ｂ）２４位アルギニンをフェニルアラニンで置換する、ｃ）３位アスパルテートをアラニンで置換する、及び／又はｄ）２位〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、である。上記のうちの唯１個の修飾のみを行って得られた具体的変異体は、Ｙ２８Ｄ、Ｒ２４Ｆ、Ｄ３Ａ、及び７ＮＤとそれぞれ命名された。
【００１２】
上記の点変異以外のヒトＭＣＰ−１の変異も本発明の範囲内に包含される。さらに、単球化学吸引性タンパク質を有する他の哺乳動物由来のＭＣＰ−１変異体であって、内因性ＭＣＰ−１を阻害するものを開発することが可能である。変異体タンパク質の開発及び開発された変異体のスクリーニング用に本発明で記述される技法を用いて、他の均等な変異体タンパク質を同定し、単離することが可能である。
【００１３】
本明細書で用いられるとき「誘導体」という語は、全タンパク質、それらのすべての活性部分、又は親タンパク質のすべての付加産物を包含するものと定義される。
【００１４】
請求項記載の本発明の誘導体は、ポリメラーゼ連鎖反応などの現技術水準で知られている方法により作成することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はヒトＭＣＰ−１のｃＤＮＡに点変異を創るために利用することができる。R. Higuchi,“Recombinant PCR”, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M. A.編; Gelfand, D. H.; Sninsky, J. J.;およびWhite, T. J., AcademicPress, NY 1990は参照により本明細書に含められる。ｃＤＮＡは、変異タンパク質を作成するために適当な発現系に一時的にトランスフェクトすることができる。使用することができる適当な発現系としては、原核動物及び真核動物が挙げられる。細菌に誘導されるタンパク質の適切なホールディングを誘導するという問題を避けるために、該タンパク質をＣＯＳ細胞中で発現させることが好ましい。
【００１５】
例として、エピトープで標識したＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１変異の構築をポリメラーゼ連鎖反応を用いて行うことができる。適当なクローニング・ベクター中のＭＣＰ−１のｃＤＮＡの適当な資源を鋳型として使用することができる。使用することができるクローニング・ベクターとしては、ｐＧＥＭ−ｈＪＥ３４（ｐＧＥＭ−７中のヒトＭＣＰ−１・ｃＤＮＡ（プロメガ、ウイスコンシン））が好ましい。一つの態様においては、組換え体ＰＣＲを用いて、ＦＬＡＧエピトープ（プリケット（Prickett) , バイオテクニークス, 7, pp 580-589,(1989))をコードする３０ヌクレオチドを２個のグリシンからなるスペーサーと共に終止コドン（３６６位）の５’側直前に挿入した。
【００１６】
こうして得られたｃＤＮＡを適当な発現ベクターであるｐｍｔ２１（ジェネティックス・インスティチュート）中にクローニングしてｐＦＸ２と名付けたプラスミドを得た。
【００１７】
同様な技法を用いて、プロセス後のＭＣＰ−１のアスパルテート−３に対するコドン（ヌクレオチド１４６位）の３’側直後にＦＬＡＧエピトープ及びスペーサーを挿入した。この発現プラスミドは、ｐＦＸ３と命名された。ｐＦＸ２を鋳型として用いて、組換えＰＣＲにより、所望のように終止コドン又は単一アミノ酸の変化を挿入した。
【００１８】
このようにして得られたｃＤＮＡをｐｍｔ２１（ジエネティックス・インスティチュート）のような適当な発現ベクターにクローニングして適当なプラスミドを得た。
【００１９】
ＭＣＰ−１及びその誘導体の発現は、既知の技法により達成することができる。広範囲の発現ビーイクルを使用することができる。一つの好ましい発現ビーイクルはＣＯＳ細胞株である。このタンパク質の発現は、例えばイミュノブロッティングやレーザーデンシトメトリーのような現行技術の定型的方法により測定し定量することができる。
【００２０】
上に述べたように、ＭＣＰ−１は単球を吸引しそして活性化する。単球は冠動脈形成により生じた損傷のような、損傷を受けた冠動脈に吸引され、そして再狭窄の惹起に関与する。単球の漸増に対する阻害剤の投与は、再狭窄の防止、リウマチ性関節炎、慢性肺炎症（chronic pulmonary inflammation) 及びその他の単球の漸増に関連する諸状態に有用であろう。
【００２１】
請求項に記載の本発明の誘導体は、単独で又は適当な医薬組成物の形で投与することができる。投与の方法は、非経口投与のような、現行技術で知られているものである。
【００２２】
適当な医薬用担体としては、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又は澱粉のような炭水化物、マグネシウムステアレート、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。医薬調製物は殺菌することができ、所望により潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩類、緩衝液、色素、及び／又は芳香性物質などの活性化合物と反応して悪影響を与えない補助剤と混合することができる。これらは、望ましいときは、例えば酵素阻害剤のような他の活性物質と混合して代謝による分解を抑制することもできる。
【００２３】
非経口的投与には、注射可能な滅菌溶液、好ましくは油状又は水性の溶液が、懸濁液、乳濁液、又は坐剤などの埋没物（implants) と同様に特に適当である。アンプルは単位投与に便利である。
【００２４】
具体的場合におけるＭＣＰ−１誘導体の実際の投与量は、例えば、使用される具体的化合物、処方される具体的組成、投与方法、及び患者の年齢、体重及び状態により変動するであろう。具体的な患者に対する投与量は、この分野における通常の熟練者が通常の考慮（例えば、適当な通常の薬学的プロトコールに従うことにより）により決定することができる。
【００２５】
本発明は、以下の実施例によりさらに具体的に例示される。
【実施例】
【００２６】
エピトープ標識ＭＣＰ−１及び野生型ＭＣＰ−１の構築と発現
鋳型としてｐＧＥＭ−ｈＪＥ３４（ｐＧＥＭ−７中のヒトＭＣＰ−１のｃＤＮＡ（プロメガ、ウイスコンシン））を用いて開始し、組換えＰＣＲはＦＬＡＧエピトープ（プリケット，（１９８９））をコードする３０ヌクレオチドを２個のグリシンからなるスペーサーと共に終止コドン（３６６位）の５’側直前に挿入した。得られたｃＤＮＡの配列分析により、他の塩基の変更はないことが明らかになった、そしてこのｃＤＮＡ全体を発現ベクターｐｍｔ２１（ジェネティックス・インスティチュート）にクローニングして、ｐＦＸ２と命名したプラスミドを得た。
【００２７】
ＣＯＳ細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。４×１０６細胞（０．８ｍｌ）を０．４ｃｍギャップのエレクトロポレーション・キュベットに入れ、１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え、そして細胞に対し０．２８ｋＶ、９６０μＦ（１０−１３ミリ秒の時定数で発生）でエレクトロポレーションを行った。細胞を室温で１０分間キュベット中で回復させ、ついで２枚の１００ｍｍディッシュ中の１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ中に入れた。２４時間後に、培地を無血清ＤＭＥＭに変えた。さらに２４時間後にこの培地を集め、細胞と破砕物を遠心分離により除き、ついでこの条件付きの培地（上清）を−７０℃で貯蔵した。
【００２８】
野生型のＭＣＰ−１も、ＣＯＳ細胞トランスフェクションによって上と同様に作成した。
【００２９】
ＭＣＰ−１変異の構築と発現
上述のヒグチ（Higuchi)によって記載されたと同様の技法を用いてＦＬＡＧエピトープ及びスペーサーをプロセス後のＭＣＰ−１のアスパルテート−３（ヌクレオチド１４６位）に対するコドンの３’側直後に挿入した。この発現プラスミドをｐＦＸ３と名付けた。他のケモカイン（特にＩＬ−８）からの構造／活性データ並びにモデルの検討に基づき、三つの領域におけるＭＣＰ−１変異を構築した。すなわち、Ｎ−末端、第１のシステイン間ループ、及びα−ヘリックスから予想されるＣ−末端である（図２）。ｐＦＸ２を鋳型として、組換えＰＣＲを用いて終止コドン又は単一アミノ酸変化を挿入した。すべての変異はＤＮＡ鎖の両方の配列分析により確認した。
【００３０】
イミュノブロッティング
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞から得た条件付きの培地を試料緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ中１５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に付した。培地をまずセントリコン−１０装置（アミコン、デンバー，ＭＡ）を用いて濃縮した例もある。
【００３１】
タンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移転し、そして抗−ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローナル抗体（インターナショナル・バイオテクノロジース，インク，ニューヘブン，ＣＴ）又はウサギ抗ＭＣＰ−１抗血清のいずれかをプローブとして検出した。
【００３２】
ブロットを適当なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体及び基質溶液を用いて発色させた（ベクトルラボラトリース，バーリンガム，ＣＡ）。
【００３３】
ＭＣＰ−１及びその誘導体の定量
ＭＣＰ−１を大腸菌中、ＦＬＡＧバイオシステムを用いてＦＬＡＧ融合タンパク質として発現させ、そして抗−ＦＬＡＧ親和性カラム（インターナショナル・バイオテクノロジース，インク，ニューヘブン，ＣＴ）を用いて精製した。既知量の精製ＦＬＡＧ−ＭＣＰ−１融合タンパク質をＣＯＳ細胞によって産生されたＭＣＰ−１の各イミュノブロット中に含ませた。次いで、イミュノブロットをレーザー・デンシトメトリー（ファルマシア，ピスカタウエイ，ＮＪ）で分析し、そしてＣＯＳ細胞の産生したタンパク質のそれぞれの量をＦＬＡＧ−ＭＣＰ−１融合体の標準品と対比して測定した。ＣＯＳ細胞の上清を、レーザー・デンシトメーターの直線応答領域内の量で、イミュノブロットシグナルを示した各ウエルに入れた。可能なときは、試料を抗−ＦＬＡＧ抗体及び抗−ＭＣＰ−１抗体の両方を使用して定量した。エピトープの一方が存在しなかった場合を除き、この二つの抗体を用いるタンパク質の量の間には不一致は存在しなかった。
【００３４】
単球走化性試験
ヒト末梢血の単核細胞は記載（ロリンス（Rollins, Blood, 78, pp 1112-1116(1989))されたようにボランティアから調製した。走化性試験は、記載されたように５μの孔を有するポリカーボネートフィルターを備えた多孔室を用いて行った。ＣＯＳ細胞の上清のそれぞれを広範囲の希釈にわたって試験した、そして各上清中の単球化学吸引活性（ＭＣＡ）の濃度を、最大走化性応答の１／２を与える希釈の逆数として定義した。
【００３５】
野生型ＭＣＰ−１及びＦＸ２は同様な用量応答特性を示した、図１。イミュノブロッティングからの定量データを用いて用量応答曲線の分析を行うと、ＦＸ２の比活性は４０８，０００Ｕ／ｍｌであり、一方野生型ＭＣＰ−１のそれは４４２，０００Ｕ／ｍｌであることが示された。両者の値を精製真核細胞産生組換えＭＣＰ−１について測定された比活性と比較すると、エピトープ標識はイン・ビボで単球を吸引するＭＣＰ−１の能力を邪魔しないことが示唆される。
【００３６】
図２に例示された構築された変異のそれぞれは、同様の方法で単球走化性について試験した。上で述べたように、変異は三つの領域、すなわちＮ−末端、第１システイン内ループ、及びＣ−末端で構築された。Ｎ−末端では、Ｎ−末端グルタミンの直後にＦＬＡＧエピトープを挿入すると、このタンパク質の単球化学吸引活性（ＦＸ３）が破壊された。この発見と一致して、アミノ酸２〜８の欠失もまた不活性タンパク質を生ずるという事実があった。より詳細なマッピングを作成しようと試みて、この領域の二つの荷電アミノ酸（アスパルテート−３及びアスパラギン−６）をアラニンに変えた。アスパルテート−３を変えるとこのタンパク質の活性を著しく減少させたが、アスパラギン−６を変えても野生型ＭＣＰ−１の活性の５２．９％を保持したタンパク質が生じた。
【００３７】
次に、第１のシステイン間ループ中に４種の点変異を構築した。アルギニン−２４をフェニルアラニンに、チロシン２８をアスパルテートに、そしてアルギニン−３０をロイシンに変異させたが、すべて野生型の何分の１かの活性を持つにすぎないタンパク質を生産した。しかしながら、同じ領域の別の極性アミノ酸、すなわちセリン−２７を変異させると、野生型の活性の６０％を持つタンパク質を生産した。
【００３８】
最後に、Ｃ−末端のα−ヘリックスを操作すると、なお信号を発することができるが、野生型に比べて能力の劣るタンパク質を生産した。α−ヘリックスの半分（Ｄ２）又はすべて（Ｄ１）を欠失させると、それぞれ野生型の活性の１７％及び１１．３％を有するタンパク質を生じた。ＭＣＰ−１ダイマーの予想されるモデル構造では、アスパルテート−６８は２個のα−ヘリックスの間の予想される受容体結合クレフト中に突き出している。このアミノ酸のロイシンへの変異はヘリックス全体の欠失と同じ効果を持っていた。
【００３９】
生物学的効果の競合
変異したＭＣＰ−１誘導体について、非変異ＭＣＰ−１に対する応答として生ずるイン・ビトロにおける単球走化性に対するそれらの阻害能を調べた。ＦＸ２の固定濃度に対し、変異体タンパク質を発現するＣＯＳ細胞によって条件付けられた培地をその量を増加させながら添加した。Ｙ２８Ｄ、Ｒ２４Ｆ、７NＤ、及びＤ３Ａのみが野生型ＭＣＰ−１を阻害する能力を示した。図３は、Ｙ２８Ｄ及び７ＮＤがＦＸ２による単球走化性を、試験した最高比の場合に約５０％阻害することができたことを示す。（この上限は条件付き培地における変異タンパク質の濃度によって決定される。）Ｙ２８Ｄは、１０ｎｇ／ｍｌの野生型ＭＣＰ−１の存在下にモルべースで約３００ｎｇ／ｍｌに相当するＩＤ５０を持つ７ＮＤよりも僅かにより効果的であった。Ｒ２４Ｆは、１対１のモル比で対照の６９％にまでＭＣＰ−１の化学吸引効果を低下させた。２４Ｆそれ自体は野生型の僅か５％の単球化学吸引活性を有するにすぎないが、野生型に対し１対１のモル比を超えてＲ２４Ｆを添加すると化学吸引活性の増大を招いた。Ｄ３Ａは、モル比１０対１において対照の８０％にＭＣＰ−１の活性を低下させた。しかし、それは化学吸引活性も持つので、より高いモル比では阻害の喪失を示した。変異体はホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）に応答しての単球走化性を阻害しなかったから、阻害活性はＭＣＰ−１に特異的であった。
【００４０】
均等物
当該技術分野における熟練せる者は、定型的実験にすぎないものを用いて、本明細書において具体的に記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の範囲に包含されるべきものである。
【００４１】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[１] 内因性単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein) −１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity) を阻害することができるＭＣＰ−１誘導体であって、２８位チロシンがロイシンによって置換されておらず及び／又は３０位アルギニンがバリンによって置換されていないＭＣＰ−１誘導体。
[２] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該ヒトＭＣＰ−１が、
ａ） ２８位チロシンがアスパルテートで置換される、
ｂ） ２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換される、
ｃ） ３位アスパルテートがアラニンで置換される、及び／又は
ｄ） ２〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、
方法の１以上で修飾されているヒトＭＣＰ−１誘導体、及びそれらの均等物。
[３] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２８位チロシンがアスパルテートで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[４] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２〜８位のアミノ酸配列が欠失している、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[５] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[６] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の３位アスパルテートがアラニンで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[７] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[８] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[９] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１０] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１１] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１２] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１３] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１４] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１５] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１６] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１７] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１８] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１９] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２０] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２１] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２２] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２３] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２４] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２５] 変異が２８位チロシンでないことを条件に、ヒトＭＣＰ−１の１個以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害することができるヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２６] ２４位アルギニンが置換されている、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２７] ３位アスパルテートが置換されている、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２８] 約２位と約８位の間のアミノ酸が欠失している、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２９] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、２４位アルギニン、３位アスパルテート及び２位〜８位のアミノ酸配列の１以上が欠失し又は１以上のアミノ酸で置換されており、内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害することができるＭＣＰ−１誘導体。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、野生型ＭＣＰ−１及びＦＬＡＧエピトープを標識したＭＣＰ−１タンパク質の応答曲線を示す図である。
【図２】図２は、調製された変異のチャートおよび変異体の特異的走化性活性を示す図である。
【図３】図３は、請求項に記載の４種の態様のＭＣＰ−１阻害に対する用量反応曲線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性ＭＣＰ−１、好ましくはヒトＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害するように変異させたＭＣＰ−１誘導体、並びにそれらの医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン（chemokines)は、特殊なタイプの白血球の化学吸引物質(chemoattractants)及び活性化因子である前炎症性（proinflammatory)サイトカインである。このファミリーに属するものは、共通の構造上のモチーフ、特に４個のシステインの位置並びに高度に保存されたその他の一次構造を共有している。それらの類似性にもかかわらず、多くのケモカインは標的細胞特異性において重複していない。ケモカインは、構造上及び遺伝上の基準に基づき、ケモカイン−αおよびケモカイン−βタンパク質という二つの下位のファミリーに分類することができる。
【０００３】
単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、前炎症性サイトカインのケモカイン−βファミリーの１員である。ヒトＭＣＰ−１のアミノ酸配列は、非特許文献１に開示されている。ＭＣＰ−１は、ナノモル濃度以下で好中球を除く単球を吸引しそして活性化する。ＭＣＰ−１は、好中球特異的な化学−吸引物質でありケモカイン−αファミリーの１員であるインターロイキン−８（ＩＬ−８）に構造的及び遺伝的に関係している。
【０００４】
単球は、冠動脈血管形成によって生じた損傷などの損傷した冠動脈に吸引され、そして再狭窄を引き起こすのに関与する。
【非特許文献１】ロリン（Rollins), モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー，９巻，１１号，４６８７−４６９５頁，１１月，１９８９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein)−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity)を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は、
[１] 内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体であって、該修飾が、ＭＣＰ−１のＮ−末端領域における置換、欠失または挿入であり、該Ｎ−末端領域が、ＭＣＰ−１の第１のシステイン間ループ前のアミノ酸残基からなる、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[２] 該修飾が２〜８位アミノ酸残基の欠失である、前記[１]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体、
[３] 該修飾がＮ−末端グルタミン残基の後におけるアミノ酸の挿入である、前記[１]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体、
[４] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２４位アルギニンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[５] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が３位アスパルテートでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
[６] 内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２８位チロシンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、内因性ヒトＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒトＭＣＰ−１誘導体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、内因性ＭＣＰ−１、好ましくはヒトＭＣＰ−１の単球吸引活性を阻害するように変異させたＭＣＰ−１誘導体、並びにそれらの医薬組成物を提供する。好ましい態様においては、このＭＣＰ−１誘導体は２８位チロシン、２４位アルギニン、３位アスパルテート及び／又は約２位〜約８位の間のアミノ酸において修飾される。一つの態様においては、変異は２８位のチロシンにおいてではない。好ましくは、ＭＣＰ−１誘導体は２８位チロシンをロイシンで置換せず、及び／又は３０位アルギニンをバリンで置換しない。吸引活性の阻害はＭＣＰ−１が次の方法の一つ以上で修飾されると成功することが見出された、すなわち、ａ）２８位チロシンがアスパルテートで置換される、ｂ）２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換される、ｃ）３位アスパルテートがアラニンで置換される、及び／又はｄ）２位〜８位のアミノ酸配列が欠失される、である。
【０００９】
請求項に記載のＭＣＰ−１誘導体は、ＭＣＰ−１単球吸引活性を阻害する必要のある患者に投与することができる。この誘導体は、冠動脈形成を受けた多くの患者に典型的に起こるような再狭窄を防止するために使用することができる点で有利である。
【００１０】
本発明の上記の及びその他の特徴は、請求の範囲においてより具体的に記述されそして指摘されるであろう。本発明を構成する特定の誘導体は例示の仕方で示され、従って本発明を限定するものではない。本発明の原理及び特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく変わった無数の態様で実施することができる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＣＰ−１の領域を変異させて、内因性ＭＣＰ−１単球化学吸引活性を阻害することができるという発見に基づく。所望の阻害活性を持つＭＣＰ−１変異体が開発された。この活性の阻害は、例えば、ヒトＭＣＰ−１が次の方法の一つ以上で修飾されるときに成功することが分かる。すなわち、ａ）２８位チロシンをアスパルテートで置換する、ｂ）２４位アルギニンをフェニルアラニンで置換する、ｃ）３位アスパルテートをアラニンで置換する、及び／又はｄ）２位〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、である。上記のうちの唯１個の修飾のみを行って得られた具体的変異体は、Ｙ２８Ｄ、Ｒ２４Ｆ、Ｄ３Ａ、及び７ＮＤとそれぞれ命名された。
【００１２】
上記の点変異以外のヒトＭＣＰ−１の変異も本発明の範囲内に包含される。さらに、単球化学吸引性タンパク質を有する他の哺乳動物由来のＭＣＰ−１変異体であって、内因性ＭＣＰ−１を阻害するものを開発することが可能である。変異体タンパク質の開発及び開発された変異体のスクリーニング用に本発明で記述される技法を用いて、他の均等な変異体タンパク質を同定し、単離することが可能である。
【００１３】
本明細書で用いられるとき「誘導体」という語は、全タンパク質、それらのすべての活性部分、又は親タンパク質のすべての付加産物を包含するものと定義される。
【００１４】
請求項記載の本発明の誘導体は、ポリメラーゼ連鎖反応などの現技術水準で知られている方法により作成することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はヒトＭＣＰ−１のｃＤＮＡに点変異を創るために利用することができる。R. Higuchi,“Recombinant PCR”, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M. A.編; Gelfand, D. H.; Sninsky, J. J.;およびWhite, T. J., AcademicPress, NY 1990は参照により本明細書に含められる。ｃＤＮＡは、変異タンパク質を作成するために適当な発現系に一時的にトランスフェクトすることができる。使用することができる適当な発現系としては、原核動物及び真核動物が挙げられる。細菌に誘導されるタンパク質の適切なホールディングを誘導するという問題を避けるために、該タンパク質をＣＯＳ細胞中で発現させることが好ましい。
【００１５】
例として、エピトープで標識したＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１変異の構築をポリメラーゼ連鎖反応を用いて行うことができる。適当なクローニング・ベクター中のＭＣＰ−１のｃＤＮＡの適当な資源を鋳型として使用することができる。使用することができるクローニング・ベクターとしては、ｐＧＥＭ−ｈＪＥ３４（ｐＧＥＭ−７中のヒトＭＣＰ−１・ｃＤＮＡ（プロメガ、ウイスコンシン））が好ましい。一つの態様においては、組換え体ＰＣＲを用いて、ＦＬＡＧエピトープ（プリケット（Prickett) , バイオテクニークス, 7, pp 580-589,(1989))をコードする３０ヌクレオチドを２個のグリシンからなるスペーサーと共に終止コドン（３６６位）の５’側直前に挿入した。
【００１６】
こうして得られたｃＤＮＡを適当な発現ベクターであるｐｍｔ２１（ジェネティックス・インスティチュート）中にクローニングしてｐＦＸ２と名付けたプラスミドを得た。
【００１７】
同様な技法を用いて、プロセス後のＭＣＰ−１のアスパルテート−３に対するコドン（ヌクレオチド１４６位）の３’側直後にＦＬＡＧエピトープ及びスペーサーを挿入した。この発現プラスミドは、ｐＦＸ３と命名された。ｐＦＸ２を鋳型として用いて、組換えＰＣＲにより、所望のように終止コドン又は単一アミノ酸の変化を挿入した。
【００１８】
このようにして得られたｃＤＮＡをｐｍｔ２１（ジエネティックス・インスティチュート）のような適当な発現ベクターにクローニングして適当なプラスミドを得た。
【００１９】
ＭＣＰ−１及びその誘導体の発現は、既知の技法により達成することができる。広範囲の発現ビーイクルを使用することができる。一つの好ましい発現ビーイクルはＣＯＳ細胞株である。このタンパク質の発現は、例えばイミュノブロッティングやレーザーデンシトメトリーのような現行技術の定型的方法により測定し定量することができる。
【００２０】
上に述べたように、ＭＣＰ−１は単球を吸引しそして活性化する。単球は冠動脈形成により生じた損傷のような、損傷を受けた冠動脈に吸引され、そして再狭窄の惹起に関与する。単球の漸増に対する阻害剤の投与は、再狭窄の防止、リウマチ性関節炎、慢性肺炎症（chronic pulmonary inflammation) 及びその他の単球の漸増に関連する諸状態に有用であろう。
【００２１】
請求項に記載の本発明の誘導体は、単独で又は適当な医薬組成物の形で投与することができる。投与の方法は、非経口投与のような、現行技術で知られているものである。
【００２２】
適当な医薬用担体としては、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又は澱粉のような炭水化物、マグネシウムステアレート、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。医薬調製物は殺菌することができ、所望により潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩類、緩衝液、色素、及び／又は芳香性物質などの活性化合物と反応して悪影響を与えない補助剤と混合することができる。これらは、望ましいときは、例えば酵素阻害剤のような他の活性物質と混合して代謝による分解を抑制することもできる。
【００２３】
非経口的投与には、注射可能な滅菌溶液、好ましくは油状又は水性の溶液が、懸濁液、乳濁液、又は坐剤などの埋没物（implants) と同様に特に適当である。アンプルは単位投与に便利である。
【００２４】
具体的場合におけるＭＣＰ−１誘導体の実際の投与量は、例えば、使用される具体的化合物、処方される具体的組成、投与方法、及び患者の年齢、体重及び状態により変動するであろう。具体的な患者に対する投与量は、この分野における通常の熟練者が通常の考慮（例えば、適当な通常の薬学的プロトコールに従うことにより）により決定することができる。
【００２５】
本発明は、以下の実施例によりさらに具体的に例示される。
【実施例】
【００２６】
エピトープ標識ＭＣＰ−１及び野生型ＭＣＰ−１の構築と発現
鋳型としてｐＧＥＭ−ｈＪＥ３４（ｐＧＥＭ−７中のヒトＭＣＰ−１のｃＤＮＡ（プロメガ、ウイスコンシン））を用いて開始し、組換えＰＣＲはＦＬＡＧエピトープ（プリケット，（１９８９））をコードする３０ヌクレオチドを２個のグリシンからなるスペーサーと共に終止コドン（３６６位）の５’側直前に挿入した。得られたｃＤＮＡの配列分析により、他の塩基の変更はないことが明らかになった、そしてこのｃＤＮＡ全体を発現ベクターｐｍｔ２１（ジェネティックス・インスティチュート）にクローニングして、ｐＦＸ２と命名したプラスミドを得た。
【００２７】
ＣＯＳ細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。４×１０６細胞（０．８ｍｌ）を０．４ｃｍギャップのエレクトロポレーション・キュベットに入れ、１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え、そして細胞に対し０．２８ｋＶ、９６０μＦ（１０−１３ミリ秒の時定数で発生）でエレクトロポレーションを行った。細胞を室温で１０分間キュベット中で回復させ、ついで２枚の１００ｍｍディッシュ中の１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ中に入れた。２４時間後に、培地を無血清ＤＭＥＭに変えた。さらに２４時間後にこの培地を集め、細胞と破砕物を遠心分離により除き、ついでこの条件付きの培地（上清）を−７０℃で貯蔵した。
【００２８】
野生型のＭＣＰ−１も、ＣＯＳ細胞トランスフェクションによって上と同様に作成した。
【００２９】
ＭＣＰ−１変異の構築と発現
上述のヒグチ（Higuchi)によって記載されたと同様の技法を用いてＦＬＡＧエピトープ及びスペーサーをプロセス後のＭＣＰ−１のアスパルテート−３（ヌクレオチド１４６位）に対するコドンの３’側直後に挿入した。この発現プラスミドをｐＦＸ３と名付けた。他のケモカイン（特にＩＬ−８）からの構造／活性データ並びにモデルの検討に基づき、三つの領域におけるＭＣＰ−１変異を構築した。すなわち、Ｎ−末端、第１のシステイン間ループ、及びα−ヘリックスから予想されるＣ−末端である（図２）。ｐＦＸ２を鋳型として、組換えＰＣＲを用いて終止コドン又は単一アミノ酸変化を挿入した。すべての変異はＤＮＡ鎖の両方の配列分析により確認した。
【００３０】
イミュノブロッティング
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞から得た条件付きの培地を試料緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ中１５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に付した。培地をまずセントリコン−１０装置（アミコン、デンバー，ＭＡ）を用いて濃縮した例もある。
【００３１】
タンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移転し、そして抗−ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローナル抗体（インターナショナル・バイオテクノロジース，インク，ニューヘブン，ＣＴ）又はウサギ抗ＭＣＰ−１抗血清のいずれかをプローブとして検出した。
【００３２】
ブロットを適当なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体及び基質溶液を用いて発色させた（ベクトルラボラトリース，バーリンガム，ＣＡ）。
【００３３】
ＭＣＰ−１及びその誘導体の定量
ＭＣＰ−１を大腸菌中、ＦＬＡＧバイオシステムを用いてＦＬＡＧ融合タンパク質として発現させ、そして抗−ＦＬＡＧ親和性カラム（インターナショナル・バイオテクノロジース，インク，ニューヘブン，ＣＴ）を用いて精製した。既知量の精製ＦＬＡＧ−ＭＣＰ−１融合タンパク質をＣＯＳ細胞によって産生されたＭＣＰ−１の各イミュノブロット中に含ませた。次いで、イミュノブロットをレーザー・デンシトメトリー（ファルマシア，ピスカタウエイ，ＮＪ）で分析し、そしてＣＯＳ細胞の産生したタンパク質のそれぞれの量をＦＬＡＧ−ＭＣＰ−１融合体の標準品と対比して測定した。ＣＯＳ細胞の上清を、レーザー・デンシトメーターの直線応答領域内の量で、イミュノブロットシグナルを示した各ウエルに入れた。可能なときは、試料を抗−ＦＬＡＧ抗体及び抗−ＭＣＰ−１抗体の両方を使用して定量した。エピトープの一方が存在しなかった場合を除き、この二つの抗体を用いるタンパク質の量の間には不一致は存在しなかった。
【００３４】
単球走化性試験
ヒト末梢血の単核細胞は記載（ロリンス（Rollins, Blood, 78, pp 1112-1116(1989))されたようにボランティアから調製した。走化性試験は、記載されたように５μの孔を有するポリカーボネートフィルターを備えた多孔室を用いて行った。ＣＯＳ細胞の上清のそれぞれを広範囲の希釈にわたって試験した、そして各上清中の単球化学吸引活性（ＭＣＡ）の濃度を、最大走化性応答の１／２を与える希釈の逆数として定義した。
【００３５】
野生型ＭＣＰ−１及びＦＸ２は同様な用量応答特性を示した、図１。イミュノブロッティングからの定量データを用いて用量応答曲線の分析を行うと、ＦＸ２の比活性は４０８，０００Ｕ／ｍｌであり、一方野生型ＭＣＰ−１のそれは４４２，０００Ｕ／ｍｌであることが示された。両者の値を精製真核細胞産生組換えＭＣＰ−１について測定された比活性と比較すると、エピトープ標識はイン・ビボで単球を吸引するＭＣＰ−１の能力を邪魔しないことが示唆される。
【００３６】
図２に例示された構築された変異のそれぞれは、同様の方法で単球走化性について試験した。上で述べたように、変異は三つの領域、すなわちＮ−末端、第１システイン内ループ、及びＣ−末端で構築された。Ｎ−末端では、Ｎ−末端グルタミンの直後にＦＬＡＧエピトープを挿入すると、このタンパク質の単球化学吸引活性（ＦＸ３）が破壊された。この発見と一致して、アミノ酸２〜８の欠失もまた不活性タンパク質を生ずるという事実があった。より詳細なマッピングを作成しようと試みて、この領域の二つの荷電アミノ酸（アスパルテート−３及びアスパラギン−６）をアラニンに変えた。アスパルテート−３を変えるとこのタンパク質の活性を著しく減少させたが、アスパラギン−６を変えても野生型ＭＣＰ−１の活性の５２．９％を保持したタンパク質が生じた。
【００３７】
次に、第１のシステイン間ループ中に４種の点変異を構築した。アルギニン−２４をフェニルアラニンに、チロシン２８をアスパルテートに、そしてアルギニン−３０をロイシンに変異させたが、すべて野生型の何分の１かの活性を持つにすぎないタンパク質を生産した。しかしながら、同じ領域の別の極性アミノ酸、すなわちセリン−２７を変異させると、野生型の活性の６０％を持つタンパク質を生産した。
【００３８】
最後に、Ｃ−末端のα−ヘリックスを操作すると、なお信号を発することができるが、野生型に比べて能力の劣るタンパク質を生産した。α−ヘリックスの半分（Ｄ２）又はすべて（Ｄ１）を欠失させると、それぞれ野生型の活性の１７％及び１１．３％を有するタンパク質を生じた。ＭＣＰ−１ダイマーの予想されるモデル構造では、アスパルテート−６８は２個のα−ヘリックスの間の予想される受容体結合クレフト中に突き出している。このアミノ酸のロイシンへの変異はヘリックス全体の欠失と同じ効果を持っていた。
【００３９】
生物学的効果の競合
変異したＭＣＰ−１誘導体について、非変異ＭＣＰ−１に対する応答として生ずるイン・ビトロにおける単球走化性に対するそれらの阻害能を調べた。ＦＸ２の固定濃度に対し、変異体タンパク質を発現するＣＯＳ細胞によって条件付けられた培地をその量を増加させながら添加した。Ｙ２８Ｄ、Ｒ２４Ｆ、７NＤ、及びＤ３Ａのみが野生型ＭＣＰ−１を阻害する能力を示した。図３は、Ｙ２８Ｄ及び７ＮＤがＦＸ２による単球走化性を、試験した最高比の場合に約５０％阻害することができたことを示す。（この上限は条件付き培地における変異タンパク質の濃度によって決定される。）Ｙ２８Ｄは、１０ｎｇ／ｍｌの野生型ＭＣＰ−１の存在下にモルべースで約３００ｎｇ／ｍｌに相当するＩＤ５０を持つ７ＮＤよりも僅かにより効果的であった。Ｒ２４Ｆは、１対１のモル比で対照の６９％にまでＭＣＰ−１の化学吸引効果を低下させた。２４Ｆそれ自体は野生型の僅か５％の単球化学吸引活性を有するにすぎないが、野生型に対し１対１のモル比を超えてＲ２４Ｆを添加すると化学吸引活性の増大を招いた。Ｄ３Ａは、モル比１０対１において対照の８０％にＭＣＰ−１の活性を低下させた。しかし、それは化学吸引活性も持つので、より高いモル比では阻害の喪失を示した。変異体はホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）に応答しての単球走化性を阻害しなかったから、阻害活性はＭＣＰ−１に特異的であった。
【００４０】
均等物
当該技術分野における熟練せる者は、定型的実験にすぎないものを用いて、本明細書において具体的に記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の範囲に包含されるべきものである。
【００４１】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[１] 内因性単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein) −１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity) を阻害することができるＭＣＰ−１誘導体であって、２８位チロシンがロイシンによって置換されておらず及び／又は３０位アルギニンがバリンによって置換されていないＭＣＰ−１誘導体。
[２] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該ヒトＭＣＰ−１が、
ａ） ２８位チロシンがアスパルテートで置換される、
ｂ） ２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換される、
ｃ） ３位アスパルテートがアラニンで置換される、及び／又は
ｄ） ２〜８位のアミノ酸配列を欠失させる、
方法の１以上で修飾されているヒトＭＣＰ−１誘導体、及びそれらの均等物。
[３] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２８位チロシンがアスパルテートで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[４] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２〜８位のアミノ酸配列が欠失している、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[５] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の２４位アルギニンがフェニルアラニンで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[６] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の３位アスパルテートがアラニンで置換されている、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
[７] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[８] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[９] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１０] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１１] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１２] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
[１３] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１４] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１５] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１６] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１７] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１８] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、それを必要としている患者に投与することにより再狭窄を治療する方法。
[１９] 前記[１]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２０] 前記[２]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２１] 前記[３]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２２] 前記[４]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２３] 前記[５]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２４] 前記[６]記載のＭＣＰ−１誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与することにより、単球の化学吸引活性を阻害する方法。
[２５] 変異が２８位チロシンでないことを条件に、ヒトＭＣＰ−１の１個以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害することができるヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２６] ２４位アルギニンが置換されている、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２７] ３位アスパルテートが置換されている、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２８] 約２位と約８位の間のアミノ酸が欠失している、前記[２５]記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
[２９] ヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、２４位アルギニン、３位アスパルテート及び２位〜８位のアミノ酸配列の１以上が欠失し又は１以上のアミノ酸で置換されており、内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害することができるＭＣＰ−１誘導体。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、野生型ＭＣＰ−１及びＦＬＡＧエピトープを標識したＭＣＰ−１タンパク質の応答曲線を示す図である。
【図２】図２は、調製された変異のチャートおよび変異体の特異的走化性活性を示す図である。
【図３】図３は、請求項に記載の４種の態様のＭＣＰ−１阻害に対する用量反応曲線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein)−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity)を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体であって、該修飾が、ＭＣＰ−１のＮ−末端領域における置換、欠失または挿入であり、該Ｎ−末端領域が、ＭＣＰ−１の第１のシステイン間ループ前のアミノ酸残基からなる、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項２】
該修飾が２位〜８位アミノ酸残基の欠失である、請求項１記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項３】
該修飾がＮ−末端グルタミン残基の後におけるアミノ酸の挿入である、請求項１記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項４】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２４位アルギニンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項５】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が３位アスパルテートでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項６】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２８位チロシンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項１】
内因性ヒト単球化学吸引性タンパク質（monocyte chemoattractant protein)−１（ＭＣＰ−１）の単球化学吸引活性(monocyte chemoattractant activity)を阻害し、および内因性ヒトＭＣＰ−１に対して少なくとも１つの修飾を含むヒトＭＣＰ−１誘導体であって、該修飾が、ＭＣＰ−１のＮ−末端領域における置換、欠失または挿入であり、該Ｎ−末端領域が、ＭＣＰ−１の第１のシステイン間ループ前のアミノ酸残基からなる、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項２】
該修飾が２位〜８位アミノ酸残基の欠失である、請求項１記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項３】
該修飾がＮ−末端グルタミン残基の後におけるアミノ酸の挿入である、請求項１記載のヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項４】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２４位アルギニンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項５】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が３位アスパルテートでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【請求項６】
内因性ＭＣＰ−１の単球化学吸引活性を阻害するヒト単球化学吸引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）誘導体であって、該誘導体が野生型ＭＣＰ−１に対してただ１つの修飾を有し、該修飾が２８位チロシンでのアミノ酸置換である、ヒトＭＣＰ−１誘導体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２２５４０２（Ｐ２００６−２２５４０２Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３６９８３（Ｐ２００６−１３６９８３）
【出願日】平成１８年５月１６日（２００６．５．１６）
【分割の表示】特願平７−５１３９５５の分割
【原出願日】平成６年１１月７日（１９９４．１１．７）
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１６日（２００６．５．１６）
【分割の表示】特願平７−５１３９５５の分割
【原出願日】平成６年１１月７日（１９９４．１１．７）
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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