ヒト癌を処置するのに有用なキメライムノレセプター
【課題】キメラ膜貫通イムノレセプターであって、細胞表面に細胞外ドメインを接着することができる支持体領域に連結した可溶性レセプターリガンドを含む細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞内シグナリングドメインを含んで成るキメラ膜貫通イムノレセプター、ゼータカインを提供する。
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に連結したＩＬ−１３Ｒα２特異的ＩＬ−１３突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の細胞外標的指向ドメイン、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン、およびヒトＣＤ３ゼータ鎖を含む神経膠腫特異的イムノレセプター。
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に連結したＩＬ−１３Ｒα２特異的ＩＬ−１３突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の細胞外標的指向ドメイン、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン、およびヒトＣＤ３ゼータ鎖を含む神経膠腫特異的イムノレセプター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
［０００１］本発明は、癌治療、およびヒト脳腫瘍および他の癌の処置における、キメライムノレセプターを発現する遺伝子修飾されたＴリンパ球の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０００２］原発性脳腫瘍は、若年成人の癌関連死亡率の第三の主因であり、小児では第二の主因であり、しかも小児科学的および老年医学的双方の集団において発病率が増加していると考えられる１〜４。神経膠腫は、原発性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、米国では毎年、２０，０００例が診断され、１４，０００例の神経膠腫関連死がある５〜８。神経膠腫は、それらの悪性作用に関して不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）であるが、それらの最も一般的且つ攻撃的な形において、未分化星細胞腫（ＡＡ−III度）およ
び多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ−IV度）は、速やかに進行し且つほぼ一様に致死的である９〜１０。現在利用可能な治療様式は、これら高度腫瘍に最小限の治癒的可能性しかなく、しばしば、中枢神経系中のそれらの場所に課される既に重症の病的状態を悪化させる。したがって、悪性神経膠腫の患者は、しばしば、生涯の最も生産的な時期に襲われ、頻繁に起こる知的諸能力の低下および高い疾患致命率が、これら腫瘍の特有の個人的および社会的影響の原因となっている。
【０００３】
［０００３］悪性神経膠腫の腫瘍学的処置の基礎は、切除術および放射線治療である１１〜１６。最新の外科的および放射線治療的技法で、平均生存期間は、多形性神経膠芽細胞腫について８２週間および未分化星細胞腫について２７５週間まで増加したが、５年生存率は、多形性神経膠芽細胞腫について３〜６％および未分化星細胞腫について１２．１％増加しているにすぎない６〜８。長期生存の主な予後指標は、より若い年齢（＜４０歳）および行動状態（ＫＰＳスコア ＞７０）である１７。大きい腫瘍の９０％を超える切除術は、通常は、生活機能解剖学が許されるという条件付きで試みられる。術後放射線治療と共に用いられる場合、切除術の程度の生存期間への影響はあまり明らかではない１８；１９。切除術および放射線への化学療法の追加は、未分化星細胞腫または多形性神経膠芽細胞腫の患者に、最低限生存しうる利点を与えるにすぎない２０〜２３。ニトロソ尿素は、単独でまたはプロカルバジンおよびビンクリスチンとの組合せで、公共に用いられる慣用的な薬物であり、全体の半数生存に影響することなく、１年および２年生存率を１５％改善すると考えられる。白金基剤薬物およびトポイソメラーゼ阻害剤を併用する更に攻撃的な治療方式は、研究中である２６。幹細胞救出での高用量化学療法の役割は、これまでのところ立証されていない２７〜２９。
【０００４】
［０００４］約８０％の再発性腫瘍は、元の不完全に切除された腫瘍の残部をＸ線撮影によって増強することに由来する１０；３０；３１。再発が単一病巣であり、それらの場所で攻撃的再切除術を行いやすいという条件ならば、このアプローチは、特に、未分化星細胞腫の患者およびＫＰＳ＞７０の多形性神経膠芽細胞腫患者について生存期間を延長することができる１０。再切除術で処置された再発性多形性神経膠芽細胞腫患者の半数生存は、３６週間である１０；３０；３１。近接照射療法かまたは定位放射線手術の形での放射線治療は、再切除術された再発性多形性神経膠芽細胞腫患者の生存期間を１０〜１２週間だけ延長することができる。再発性疾患の設定での化学療法の使用は、この患者集団でのその効力が立証されていないので、利用可能な臨床試験の状況にあるはずである。
【０００５】
［０００５］悪性神経膠腫の引き続き悲惨な予後は、遺伝子治療（ＴＫ自殺、腫瘍増殖
因子レセプターのアンチセンス阻害、条件致死ウイルスベクター）、免疫療法（抗体、腫瘍細胞ワクチン、イムノトキシン、活性リンパ球の養子移入）、および抗血管新生アプローチが含まれるがこれに制限されるわけではない新規な治療的実体の臨床的研究を促している３３〜４０。悪性神経膠腫に有効なアジュバント療法の開発に向けられた挑戦の多様性には、正常な脳実質中への腫瘍細胞の広範な浸潤性成長、免疫応答の発生を減衰させるこれら腫瘍から作られる可溶性因子の能力、および中枢神経系（ＣＮＳ）中に治療薬を投与する場合の臨床的に意味のある治療的比率を決定する難しさが含まれる。新規な治療薬の早期臨床評価は、この患者集団において明らかに必要とされている。
【０００６】
［０００６］最近、トランスフェリンのレセプターおよび増殖因子は、デリバリーシステムとしての毒素またはラジオヌクレオチドに抱合されたこれらレセプターのリガンドを利用した実験的神経膠腫治療薬の論題となっている４１。このアプローチの特異性は、正常な脳と比較される、神経膠腫細胞上の標的レセプターの独特の発現または過剰発現に頼っている。興味深いことに、免疫系によって利用されるインターロイキンの若干のレセプター複合体は、神経膠腫、特に、高親和性ＩＬ−１３レセプターによって発現される４２〜４８。免疫系によって利用されるＩＬ−１３レセプター三分子複合体は、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒβおよびγｃから成るが、これとは異なり、神経膠腫細胞は、ＩＬ−４Ｒβまたはγｃについての必要条件とは無関係にＩＬ−１３を結合することができる特有のＩＬ−１３Ｒα２鎖を過剰発現する４４；４９；５０。そのホモログＩＬ−４と同様に、ＩＬ−１３は、ＣＮＳの外に多面的（pleotrophic）免疫調節活性を有する。どちらの
サイトカインも、Ｂリンパ球によるＩｇＥ生産を刺激し且つマクロファージによる前炎症性サイトカイン生産を抑制する。ＣＮＳ内のＩＬ−１３の免疫生物学は、ほとんど知られていない。
【０００７】
［０００７］放射性標識ＩＬ−１３でのオートラジオグラフィーを用いた Debinski et
al. による詳細な研究は、研究されたほとんど全ての悪性神経膠腫組織上に豊富なＩＬ
−１３結合を示している４２；４５；４６；４８。更に、その結合は、腫瘍切片内でおよび単細胞分析により、きわめて均一である４６；４８。ヒト神経膠腫細胞系へのＩＬ−１３結合のスキャッチャード分析は、平均して１７，０００〜２８，０００の結合部位／細胞を示している４５。ＩＬ−１３Ｒα２ ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いた分子分析では、全てのＣＮＳ解剖学的位置において正常な脳エレメントによる神経膠腫特異的レセプターの発現を示すことができない４２；４３。更に、放射性標識ＩＬ−１３でのオートラジオグラフィーでは、ＣＮＳにおける検出可能な特異的ＩＬ−１３結合を示すことができなかったことから、共有されるＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターは、ＣＮＳにおいて検出可能なレベルで発現されることもないということが示唆された４６。これら知見は、別個に、非病理学的脳切片についてＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−４βに特異的な抗体での免疫組織化学的技法を用いて証明された５４。したがって、ＩＬ−１３Ｒα２は、これまでに記載された神経膠腫についての最も特異的で且つ遍在的に発現される細胞表面標的としてある。
【０００８】
［０００８］ＣＮＳにおけるＩＬ−１３Ｒα２の神経膠腫特異的発現を利用する戦略として、ＩＬ−１３サイトカインの分子コンストラクトであって、種々の細胞毒素（シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素およびジフテリア（Diptheria）毒素）がそのカルボキシル末端に融合しているものが記載されてきている５５〜５８。ＩＬ−１３レセプターへの結合でのこれら毒素のインターナリゼーションは、これら融合タンパク質の選択的毒性の根拠である。これら毒素は、in vitro の神経膠腫細胞に対してピコモル濃度で強力な
細胞傷害性を示す５５。免疫欠損マウスにおけるヒト頭蓋内神経膠腫異種移植片は、毒性が認められることなく、ＩＬ−１３−毒素融合タンパク質の腫瘍内注射によって排除されうる５５。これら研究は、ＩＬ−１３に支配されたイムノトキシンを悪性神経膠腫に局所的に利用する臨床研究の開始を支持する。
【０００９】
［０００９］しかしながら、広く発現されるＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプター複合体へのＩＬ−１３に基づく細胞毒素の結合は、ＣＮＳ外の正常組織に不都合な毒性を媒介する可能性があり、したがって、これら薬剤の全身投与を制限する。ＩＬ−１３は、分子レベルで充分に調べられていて、個々のレセプターサブユニットと連結するのに重要であるこのサイトカインの構造ドメインは、地図に示されている５５；５８。結果として、ＩＬ−１３中の選択されたアミノ酸置換は、このサイトカインとそのレセプターサブユニットとの連結に予想可能な作用をする。ＩＬ−１３のαヘリックスＡ、具体的にはアミノ酸１３におけるアミノ酸置換は、ＩＬ−４βと連結するその能力を破壊し、それによって、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターへのＩＬ−１３の親和性を選択的に５倍だけ減少させる５５；５７；５８。驚くべきことに、ＩＬ−１３Ｒα２への突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の結合は、保存されただけでなく、野生型ＩＬ−１３に相対して５０倍増加した。したがって、最小限に変更されたＩＬ−１３類似体は、神経膠腫細胞へのＩＬ−１３の特異性および親和性をＩＬ−１３Ｒα２への選択的結合によって同時に、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターを有する正常組織に相対して増加させることができる。
【００１０】
［００１０］悪性神経膠腫は、（１）大部分の患者が、切除術および放射線治療で最低限の疾患重症度状態に達する、および（２）ＣＮＳの境界内のこれら腫瘍の解剖学的位置が、エフェクター細胞の直接的局所投与を可能にさせることから、免疫療法介入にとってきわめて魅力のある臨床的実体である。少なくとも二つの病理学的研究は、悪性神経膠腫における血管周囲リンパ球性浸潤の程度が、改善された予後と相関するということを示している５９〜６１。動物モデルシステムが確立されており、そこで、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞ではないが神経膠腫特異的Ｔ細胞は、大脳内に植え込まれた神経膠腫の後退を媒介することができる６２〜７１。Ｔ細胞は、ＬＡＫ細胞とは異なり、脳実質中に浸潤する能力を有するので、原発性腫瘍から遠く離れていることがありうる浸潤性腫瘍細胞を標的にすることができる。これら知見にもかかわらず、神経膠腫が、主に、免疫抑制性サイトカイン（ＴＧＦ−β２）およびプロスタグランジンの精巧さによって、免疫破壊を積極的に覆すという実質的な証拠があり、これが、神経膠腫反応性Ｔ細胞応答の誘導／増幅を阻害する７２〜７４。これら知見は、in vivo 応答を生じることについての腫瘍に媒介される制限を克服する戦略としての養子療法のための ex vivo で増大した抗神
経膠腫エフェクター細胞の評価を促している。
【００１１】
［００１１］悪性神経膠腫切除術腔への ex vivo 活性化リンパ球の投与を伴う少なく
とも１０種類の試験研究が、これまでに報告されている７５〜８５。エフェクター細胞タイプ（ＬＡＫ、ＴＩＬ、アロ反応性（alloreactive）ＣＴＬ）の種類、それらの不均一組成／患者間の組成の変動、および神経膠腫標的に対するこれらエフェクター細胞のしばしば穏当な in vitro 反応性にもかかわらず、これら研究は、事例の長期生存者を含む再発性／難治性疾患の患者において、総計して約５０％の応答率を報告している。これら研究は、神経膠腫への細胞性免疫療法の優れた臨床的作用が、均一できわめて強力なエフェクター細胞で予想されうるという前提を支持する。
【００１２】
［００１２］これら試験研究は、悪性神経膠腫の患者の切除術腔中への、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）および ex vivo 活性化リンパ球の直接的投
与の安全性および許容性についても報告している７５；７６；７８；８２；８６〜９２。広範囲の個々の細胞用量（＞１０９個細胞／用量）、更には、高い累積細胞用量（＞２７ｘ１０９個細胞）でさえも、毒性は穏当であり、典型的には、II度またはそれ未満の一時的頭痛、悪心、嘔吐および発熱から成る。上記のように、これら研究は、ｒｈＩＬ−２の同時投与も用いて、転移したリンパ球の in vivo 生存を支持した。リンパ球と同時にか
またはリンパ球投与後に逐次的に与えられる多重用量は、４８時間毎に供給されるＩＬ−
２の１２用量コースについて、１．２ｘ１０６ＩＵ／用量と同程度に高い用量で許容された。
【００１３】
［００１３］上に概説された知見に基づいて、神経膠腫免疫療法で用いられるリンパ球エフェクター細胞の抗腫瘍力価を改善する戦略は開発中である。一つのアプローチは、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）結合性ドメインを利用する神経膠腫標的と一緒に、抗ＣＤ３ドメインによってＴリンパ球を同時限局化し且つ活性化することができる二重特異性抗体を利用している９３〜９６。自己リンパ球と組み合わせたこの二重特異性抗体での予備臨床実験は、Ｔ細胞が、切除術腔中において現場で活性化されるということを示唆している。しかしながら、脳実質内の浸潤性腫瘍細胞に標的指向することは、このアプローチの潜在的に有意の限界である。Ｔ細胞は、神経膠腫によって発現される標的抗原に特異的である場合、有意に増加した抗神経膠腫活性を有すると考えられる。Ｔリンパ球が反応性である腫瘍抗原をコードしている、ＳＡＲＴ−１遺伝子を含めた増加する多数のヒト遺伝子がクローン化されているが、これは、ほぼ７５％の高度神経膠腫によって発現されると考えられる９７。樹状細胞に基づく in vitro 細胞培養技術、更には、テトラマーに基づくＴ細胞選択技術は両方とも、養子両方のための抗原特異的Ｔ細胞の単離を実行可能にしている。ＳＡＲＴ−１のような抗原は、制限性ＨＬＡ対立遺伝子の場合にＴ細胞によって認識されるので、抗原特異的アプローチは、一般的な神経膠腫患者集団に広く応用可能であるようにこれら抗原を提示することができる抗原および制限性ＨＬＡ対立遺伝子の数の実質的な増大を必要とするであろう。
【００１４】
［００１４］Ｔ細胞抗原レセプター複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合した細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）から成るように遺伝子操作されたキメラ抗原レセプター（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）は、Ｔ細胞中で発現された場合、モノクローナル抗体の特異性に基づく抗原認識を再支配する能力を有する９８。腫瘍細胞表面エピトープについて標的特異性を有するｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターの設計は、それが既存の抗腫瘍免疫に頼っていないので、養子療法のための抗腫瘍免疫エフェクター細胞を生じる概念上魅力のある戦略である。これらレセプターは、それらがＭＨＣ非依存様式で抗原を結合するという点で「普遍的」であり、したがって、一つのレセプターコンストラクトを用いて、抗原陽性腫瘍を有する患者集団を処置することができる。ヒト腫瘍に標的指向するためのいくつかのコンストラクトは、参考文献に記載されており、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＥＲＲＢ−２、ＣＤ４４ｖ６、および腎細胞癌上で選択的に発現されるエピトープに特異性を有するレセプターが含まれる９８〜１０４。これらエピトープは全て、キメラＴ細胞レセプターによってｓｃＦｖ結合に接近可能な細胞表面部分であるという共通の特性を共有している。in vitro 研究は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞エフェクター機能が、こ
れらレセプターによって引き起こされうるということを示している。更に、動物モデルは、養子移入されたｓｃＦｖＦｃ：ζを発現するＴ細胞の、樹立された腫瘍を撲滅する能力を示している１０５。腫瘍特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターを発現する初代ヒトＴ細胞の機能は、in vitro で評価されており、これら細胞は、特異的に、腫瘍標的を溶解し、
そしてＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含めた一連の前炎症性サイトカインを分泌する１０４。Ｉ期試験養子療法研究は、ＨＩＶ感染個体のＨＩＶｇｐ１２０に特異的な自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞、および乳腺癌および結腸直腸腺癌を含めたいろいろな腺癌で発現されるＴＡＧ−７２に特異性を有する自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞を利用して進行中である。
【００１５】
［００１５］City of Hope の研究者らは、ＣＤ２０＋Ｂ細胞悪性腫瘍に標的指向する
目的のためのＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターコンストラクト、および神経芽細胞腫に標的指向するためのＬ１−ＣＡＭ特異的キメライムノレセプターを遺伝子操作している１０６。前臨床実験室研究は、再配列されていない染色体に組み込まれたベクターＤＮＡの単コピーを含有し且つＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターを発現するＣ
Ｄ８＋ＣＴＬクローンを、健康個体およびリンパ腫患者から単離し且つ増大させる実行可能性を示している１０７。これを達成するために、ＣＭＶ即時／初期プロモーターの転写制御下にあるキメラレセプター配列およびＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下にあるＮｅｏＲ遺伝子を含有する精製直鎖状プラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションと称される手順である、短時間電流への細胞およびＤＮＡの暴露によって、活性化されたヒト末梢血単核細胞中に導入した。Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington におけるＦＤＡ認可臨床試験で現在用いられている選択法、クローニング法および増大法を利用して、ＣＤ２０特異的細胞溶解活性を有する遺伝子修飾されたＣＤ８＋ＣＴＬクローンを、６人の健康な志願者各々から、１５回の別個のエレクトロポレーション手順で生じている。これらクローンは、ヒトＣＤ２０＋リンパ腫細胞系の一団と一緒に共培養された場合、増殖し、特異的に標的細胞を溶解し、そして刺激されてサイトカインを生産する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の要旨
［００１６］本発明は、「ゼータカイン」と称されるキメラ膜貫通イムノレセプターであって、細胞表面に細胞外ドメインを接着すること（tethering）ができる支持体領域に
連結した可溶性レセプターリガンドを含む細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞内シグナリングドメインを含んで成るものに関する。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現された場合、可溶性レセプターリガンドが特異的であるレセプターを発現するそれら細胞へのＴ細胞活性を支配する。ゼータカインキメライムノレセプターは、Ｔ細胞の抗原特異性を再支配するための抗体に基づくイムノレセプターの新規伸長であり、いろいろな癌の処置に、具体的には、ヒト悪性腫瘍によって利用されるオートクリン／パラクリンサイトカインシステムによって応用される。
【００１７】
［００１７］悪性神経膠腫および腎細胞癌によるＩＬ−１３Ｒα２の腫瘍限定発現を細胞免疫療法の標的として利用した一つの好ましい態様において、ＩＬ−１３Ｒα２に選択的高親和性結合を有するＩＬ−１３サイトカインの突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）は、ＩＬ−１３Ｒα２発現性腫瘍細胞へのＴ細胞抗原特異性を再支配することができるＩ型膜貫通キメライムノレセプターに変換されている。ゼータカインのこの態様は、ヒトＩｇＧ４Ｆｃに融合した細胞外ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）、膜貫通ＣＤ４および細胞内Ｔ細胞抗原レセプターＣＤ３複合体ゼータ鎖から成る。細胞表面上でレセプターを選択的に発現するいろいろなガン細胞タイプのいずれかに特異的であり、その選択的リガンドが知られているまたは遺伝子操作されうる類似のイムノレセプターを生じることができる。
【００１８】
［００１８］このようなイムノレセプターを発現するように安定して形質転換されたヒトＴ細胞のバルク系統（bulk lines）およびクローンは、それらが特異的であるガン細胞タイプの再支配された細胞溶解を示すが、非標的細胞に対しては無視しうる毒性を示す。このような遺伝子操作されたＴ細胞は、神経膠腫のような処置するのが難しい癌を含めた悪性腫瘍のための強力且つ選択的な療法である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
詳細な説明
［００２８］遺伝子操作され再支配されたＴ細胞での腫瘍標的指向に理想的な細胞表面エピトープは、単に腫瘍細胞上において均一様式でおよび同じ診断の患者集団内の全ての腫瘍上において発現されると考えられる。腫瘍細胞膜からの標的分子のモジュレーションおよび／または流出（shedding）は、再支配されたＴ細胞認識のための特定の標的エピトープの有用性に影響を与えることもありうる。これまでのところ、「理想的な」腫瘍特異的エピトープは僅かしか定義されていないが、二次エピトープは、臨界的正常組織での発
現不足かまたは腫瘍での相対的過剰発現に基づいて標的とされてきている。悪性神経膠腫の場合、この癌の処置のためのＴ細胞の腔内投与は、ＣＭＳ外の他の組織による発現においてより小さいストリンジェンシーで、正常ＣＮＳではないが腫瘍細胞上で発現されるものへの標的エピトープの増大を可能にする。ＣＭＳ外の組織の交差反応性による毒性に関する問題は、（ａ）腔内投与経路に基づくＣＮＳにおける細胞の隔絶（sequestration）
、および（ｂ）典型的に全身投与される細胞用量と比較して低い投与細胞数によって軽減される。
【００２０】
［００２９］ＩＬ−１３Ｒα２レセプターは、悪性神経膠腫について最も遍在的且つ特異的な細胞表面標的として突出している４７。感受性のオートラジオグラフィーおよび免疫組織化学的研究では、ＣＮＳにおいてＩＬ−１３レセプターを検出することができない４６；４８。更に、神経膠腫に限定されたＩＬ−１３Ｒα２レセプターを選択的に結合するＩＬ−１３サイトカインの突然変異は、ＣＮＳ外のＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β＋正常組織に対するＩＬ−１３に向けられた治療薬の不都合な反応性に対する更にもう一つの防護手段である５５；５７。神経膠腫ＩＬ−１３Ｒα２に標的指向することの潜在的有用性、順に、ＣＤ４ＴＭおよびＣＤ３ゼータの細胞質テイルに融合するヒトＩｇＧ４Ｆｃによって原形質膜に接着した細胞外ＩＬ−１３突然変異体サイトカイン（Ｅ１３Ｙ）から成る、Ｔ細胞の特異性を再支配するための新規な遺伝子操作されたキメライムノレセプターの設計および試験。このキメライムノレセプターは、「ＩＬ−１３ゼータカイン」という呼称を与えられている。ＩＬ−１３Ｒα２レセプター／ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）レセプター−リガンド対は、概して、ゼータカインで用いるためのレセプター−リガンド対の適合性を理解し且つ評価するための優れた指針である。理想的なゼータカインは、ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の性状（独特の癌細胞表面レセプターへの特異性、それが天然に存在する可溶性細胞シグナル分子に由来することによる in vivo 安定性、同じ理由での低免疫原性
）を有する細胞外可溶性レセプターリガンドを含む。可溶性レセプターリガンドは、細胞外環境においてより安定であると考えられ、非抗原性であり、そしてより選択的であるという点で、抗体フラグメント（ｓｃＦｖＦｃイムノレセプターなど）または細胞接着分子の先行技術使用にまさる明確な利点としての可溶性レセプターリガンドの使用。
【００２１】
［００３０］本発明によるキメライムノレセプターは、順に、細胞内レセプターシグナリングドメインに連結した膜貫通ドメインによって、細胞表面に可溶性レセプターリガンドを接着している細胞外支持体領域に連結したこのリガンドを含んで成る細胞外ドメインを含む。適当な可溶性レセプターリガンドの例には、オートクリンおよびパラクリン増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモン、および必要な特異性を示す遺伝子操作された人工低分子リガンドが含まれる。天然のリガンド配列は、特定の標的細胞へのそれらの特異性を増加させるように遺伝子操作することもできる。特定のゼータカインで用いるための可溶性レセプターリガンドの選択は、標的細胞の性質、および神経膠腫に対する使用に好ましいリガンドであるＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）分子に関して上に論及された品質によって左右される。適当な支持体領域の例には、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域、ヒトＣＤ８∝、および標的細胞上に結合しているレセプターへの向上した接近のために標的指向部分を細胞表面から離れて移動させるのに役立つ人工リンカーが含まれる。好ましい支持体領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ４など）のＦｃ領域である。適当な膜貫通ドメインの例には、白血球ＣＤマーカーの膜貫通ドメイン、好ましくは、ＣＤ８の膜貫通ドメインが含まれる。細胞内レセプターシグナリングドメインの例は、Ｔ細胞抗原レセプター複合体のもの、好ましくは、ＣＤ３のゼータ鎖、更には、ＦｃγＲIII共刺激シグナリングドメイン、
ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ２単独またはＣＤ３ゼータを含む系列である。
【００２２】
［００３１］ＩＬ−１３ゼータカイン態様において、Ｅ１３Ｙアミノ酸置換を有するヒトＩＬ−１３ｃＤＮＡは、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によって合成した。完全長さＩＬ−１３ゼータカインコンストラクトは、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長に
よって組み立てたが、これは、ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターα鎖リーダーペプチド、ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、ヒトＣＤ４ＴＭ、およびヒト細胞質ゼータ鎖から成る。このｃＤＮＡコンストラクトを、ヒト Elongation Factor−１αプロモーター（Invivogen, San Diego）の転写制御下において修飾ｐＭＧプラスミドの多重クローニング部位中に連結した。この発現ベクターは、ＣＭＶ即時／初期プロモーターから、トランスフェクタントの in vitro 選択のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性とガンシクロビルでの細胞の in vivo 除去（ablation）の
ためのＨＳＶチミジンキナーゼ活性とを一つの分子内に一緒にしている融合タンパク質ＨｙＴＫをエンコードしているＨｙＴＫｃＤＮＡを同時発現する。グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンと一緒にプレインキュベートされた全細胞 Jurkat 溶解産物の、抗ゼータ抗体プローブでのウェスタンブロットは、予想される無傷の５６−ｋＤａキメラレセプタータンパク質が発現されるということを示した。このレセプターは、本来のＩＬ−１３サイトカインの翻訳後修飾と一致して強くグリコシル化される１０８。抗ヒトＩＬ−１３および抗ヒトＦｃ特異的抗体を含むＩＬ−１３ゼータカイン＋ Jurkat 細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｉ型膜貫通タンパク質としてのＩＬ−１３ゼータカインの細胞表面発現を確証した。
【００２３】
［００３２］City of Hope で開発され確立されたヒトＴ細胞遺伝子修飾法を用いて１
０７、ＩＬ−１３ゼータカインキメライムノレセプターを発現する初代ヒトＴ細胞クローンを、前臨床機能特性決定のために生じている。ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、ex vivo 増大培養において強い増殖活性を示す。増大したクローンは、４時間クロム放出検定において、ヒトＩＬ−１３Ｒα２＋神経膠芽細胞腫細胞系に対する再支配された細胞溶解活性を示す。この細胞溶解活性レベルは、Ｔ細胞上でのゼータカイン発現レベルおよび神経膠腫標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２レセプター密度レベルと相関する。死滅の他に、ＩＬ−１３ゼータカイン＋クローンは、サイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ）について活性化される。活性化は、神経膠腫細胞上のＩＬ−１３Ｒα２レセプターとＩＬ−１３ゼータカインの相互作用によって特異的に媒介されたが、不適切なキメライムノレセプターを発現するＣＴＬクローンは、神経膠腫細胞に応答しないからであるし、しかも活性化は、Ｔ細胞トランスフェクタント上のＩＬ−１３および神経膠腫標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２に対する遮断抗体または可溶性ＩＬ−１３の培養物への添加によって、用量依存方式で阻害されうるからである。最後に、ＩＬ−１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、培養物中の神経膠腫細胞によって刺激された場合に増殖する。強力な抗神経膠腫エフェクター活性を有するＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、正常ＣＮＳへの限られた側副損傷を含む悪性神経膠腫に対して有意の臨床的活性を有するであろう。
【００２４】
［００３３］本発明によるイムノレセプターは、当該技術分野において知られているいずれの手段によっても生じることができるが、好ましくは、それは、組換えＤＮＡ技術を用いて生じる。キメラレセプターのいくつかの領域をエンコードしている核酸配列は、分子クローニングの標準的な技法（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助連結、位置指定突然変異誘発等）によって製造し且つ完全なコーディング配列に組み立てることができる。得られたコーディング領域を、好ましくは、発現ベクター中に挿入し且つ用いて、適当な発現宿主細胞系、好ましくは、Ｔリンパ球細胞系、最も好ましくは、自己Ｔリンパ球細胞系を形質転換する。イムノレセプターの発現のための第三者は、Ｔ細胞系／クローン、形質転換された体液または外因性の（xerogenic）免疫学的エフェ
クター細胞系を得た。ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、ＬＡＫ細胞、ＬＩＫ細胞、およびこれら細胞に分化する幹細胞を用いることもできる。好ましい態様において、リンパ球は、白血球搬出法によって患者から得られ、そして自己Ｔ細胞を、ゼータカインを発現するように形質導入し且つ臨床的に許容しうる手段によって患者に投与し戻して、抗癌治療を達成する。
【００２５】
［００３４］治療的作用に適当な用量は、好ましくは、一連の投薬サイクルで約１０６〜約１０９個細胞／用量であると考えられる。好ましい投薬計画は、用量を段階的に増加させる、０日目に約１０７個細胞で始め、５日目までに約１０８個細胞の標的用量まで漸増増加させる４回の１週間投薬サイクルから成る。適当な投与方式には、静脈内、皮下、腔内（例えば、レザバー接近装置（reservoir-access device）による）、腹腔内、およ
び腫瘍塊中への直接注射が含まれる。
【００２６】
［００３５］次の実施例は、本発明の一つの態様を単に詳しく説明するためにある。
【実施例１】
【００２７】
実施例１：イムノレセプターコーディング配列の構築
［００３６］本発明によるイムノレセプターのコーディング配列を、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）コーディング配列の de novo 合成により、次のプライマーを用いて構築した（イム
ノレセプターのコーディング配列および発現ベクターの構築を示すフローチャートについては、図８を参照されたい）。
【００２８】
【化１】
［００３７］最終配列（４１７ｂｐ）を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで末端消化し、そしてプラスミドｐＳＫ（stratagene, LaJolla, CA）中に連結してライゲーション（ligation）３１２＃３とした。ライゲーション３１２＃３を、突然変異誘発させて（stratagene キット、製造者の取扱説明書による）、欠失したヌクレオチドを、プライマー５’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ５−３
【００２９】
【化２】
および３’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ３−５
【００３０】
【化３】
、および鋳型としてのライゲーション３１２＃３を用いて固定して、ライゲーション３４８＃１（ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ）を形成した。
【００３１】
［００３８］コーディング Human ＧＭ−ＣＳＦＲα鎖 Signal Peptide（ｈｓｐ）コーディング配列を、標準的なＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によってＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）の５’末端に融合した。このｈｓｐ配列（１０１ｂｐ）は、鋳型ライゲーション３０１＃１０（ｈｓｐ／ｐＳＫ）（ヒトＴ細胞ｃＤＮＡからのヒトＧＣＳＦレセプターα鎖リーダー配列）から、プライマー５’：１９ｈｓｐ５’
【００３２】
【化４】
（ＸｂａＩ部位を太字で強調）および３’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＲ
【００３３】
【化５】
を用いて得た。ＩＬ−１３配列（３７１ｂｐ）は、プライマー５’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＦ
【００３４】
【化６】
および３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲ
【００３５】
【化７】
、および鋳型としてのライゲーション３１２＃３を用いて得た。融合は、このようにして得られた１０１ｂｐ ｈｓｐ配列および３７１ｂｐ ＩＬ１３配列、およびプライマー５’：１９ｈｓｐ５’および３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲを用いて行って、４３８ｂｐ融合ｈｓｐ−ＩＬ１３配列を生じた。
【００３６】
［００３９］ＩｇＧ４Ｆｃ領域ＩｇＧ４ｍ：ゼータをコードしている配列を、このｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列の３’末端に同じ方法を用いて融合した。ＩｇＧ４ｍ：ゼータ配列（１１１９ｂｐ）は、プライマー５’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＦ
【００３７】
【化８】
および３’：ＺｅｔａＮ３’
【００３８】
【化９】
（ＮｏｔＩ部位を太字で強調）を用い、鋳型として配列Ｒ９．１０（ＩｇＧ４ｍＺｅｔａ／ｐＳＫ）を用いて得た。この１１１９ｂｐ ＩｇＧ４ｍ：ゼータ配列を、ｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列に、鋳型としてのそれぞれの配列、およびプライマー５’：１９ｈｓｐ５’および３’：ＺｅｔａＮ３’を用いて融合して、１５２２ｂｐ ｈｓｐ−ＩＬ１３−ＩｇＧ４ｍ：ゼータ融合配列を生じた。その両末端を、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、ライゲーション３５１＃７としてｐＳＫ中に連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ（４４６４ｂｐ）を生じた。
【実施例２】
【００３９】
実施例２：発現ベクターの構築
［００４０］ＩＬ１３ゼータカインコーディング配列を含有する発現ベクターは、実施例１で得られたＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫを、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、クレノウ（Klenow）を含むブラント末端を生じ、そして得られたフラグメントをプラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃ（Invirogen）（ＳｇｒＡＩで開き、クレノウでブラントにし、ＳＡＰでの脱
リン酸化によって最初に製造される）中に連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧを生じることによって生成した。図８を参照されたい。ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧのハイグロマイシン耐性領域を、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩでの消化によって除去し、そしてプラスミドＣＥ７Ｒ／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ（Jensen, City of Hope）からＮｏｔＩ−ＮｈｅＩでの消化によって得られる選択／自殺融合ＨｙＴＫによって置き換えて、発現ベクターＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ（６７８５ｂｐ）を生じた。このプラスミドは、Human Elongation Factor−１αプロモーター（ｈＥＦ１ｐ）を６〜５４９塩基に、
ＩＬ１３ゼータカインコーディング配列を６９２〜２１８５塩基に、シミアンウイルス４０後期（Simian Virus 40 Late）ポリアデニル化シグナル（ＬａｔｅＳＶ４０ｐＡＮ）を２２３２〜２５００塩基に、最小の大腸菌（Ｅ．coli）複製起点（Ｏｒｉ ＣｏｌＥ１）を２５０１〜３２４７塩基に、合成ポリＡおよび Pause 部位（ＳｐＡＮ）を３２４８〜
３４３４塩基に、極初期（Immeate-early）ＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ｈＣＭ
Ｖ−１Ａｐｒｏｍ）を３４５５〜４０７７塩基に、ハイグロマイシン耐性チミジンキナーゼコーディング領域融合（ＨｙＴＫ）を４２５９〜６３３４塩基に、そしてウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび転写ポーズ（ＢＧｈ ｐＡｎ）を６３３５〜６６３３塩基に含む。このプラスミドは、ＰａｃＩ線状化部位を３２３５〜３２４２塩基に有する。ｈＥＦ１ｐおよびＩＬ１３ゼータカインエレメントは、ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧから得、残りのエレメントは、ＣＥ７Ｒ／ＨｙＴＫ−ｐＭＧから（ＨｙＴＫエレメントを除いて、最終的には親プラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃから）得た。要するに、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧは、ｈＥＦ１プロモーターからＩＬ１３ゼータカイン遺伝子、およびＣＭＶ−１ＡプロモーターからＨｙＴＫ融合を発現する修飾ｐＭＧ主鎖である。プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの地図は、図９で明らかである。
【実施例３】
【００４０】
実施例３：イムノレセプターの発現
［００４１］発現されたコンストラクトの統合性の評価を、グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンの存在下または不存在下で培養された Jurkat Ｔ細胞安定トランスフェクタント１０７に由来する全細胞溶解産物の抗ゼータ抗体でプローブされたウェスタンブ
ロットによって最初に表した。図１。Jurkat Ｔ細胞安定トランスフェクタント（Jurkat
−ＩＬ１３−ｐＭＧバルク系統（bulk line））は、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−
ｐＭＧ発現ベクターを Jurkat Ｔ細胞にエレクトロポレーション後、陽性トランスフェクタントの選択および増大を行うことによって得た。Jurkat−ＩＬ１３−ｐＭＧバルク系統から２ｘ１０６個／ウェルの細胞を、２４ウェルプレート中に５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのツニカマイシンと一緒にまたは不含でプレーティングした。そのプレートを３７℃で２２時間インキュベートした。細胞を各々のウェルから採取し、各試料をＰＢＳで洗浄し、そして１錠／１０ｍｌ Complete Protease Inhibitor Cocktail（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含有する５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ，１％ＮＰ４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁させた。試料を氷上で３０分間インキュベート後、２１ゲージ針のシリンジでの吸引によって破壊し、次に、氷上で更に３０分間インキュベート後、４℃において１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離された溶解産物上澄み試料を採取し、減圧条件下において等容量の試料用緩衝液中で沸騰させた後、１２％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ニトロセルロースへの転移後、膜を４℃でＯ／Ｎ乾燥させた。翌朝、膜を、Ｔ−ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０２％トゥイーン２０）中に０．０４ｇｍ／ｍｌの脱脂粉乳を含有する Blotto 溶液中で１時間ブロックした。次に、膜を、１μｇ／ｍｌ濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA）と一緒に２時間インキュベートし、洗浄後、１：３０
００希釈（Blotto 溶液中）のヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ抱合二次抗
体（Bio-Rad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）と一緒に１時間インキュベートした。展開前に、膜をＴ−ＴＢＳ中で更に４回洗浄後、３ｍｌのホスファターゼ基質溶液（Biorad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）と一緒に室温で５分間インキュベートした。次に、膜を
プラスチックで覆い、ｘ線フィルムに露出させた。野生型ヒトＩＬ−１３の既知のグリコシル化パターンと一致して、発現されたＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの電気泳動移動度は、ツニカマイシンの存在下で発現された場合に約５４ｋＤａのアミノ酸主鎖まで減少する、強くグリコシル化されたタンパク質を示している。
【００４１】
［００４２］ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインは、フィコエリトリン（ＰＥ）抱合抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合マウス抗ヒトＦｃ（ガンマ）フラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体でのトランスフェクタントのフローサイトメトリー分析によって証明されるように、ホモダイマーＩ型膜貫通タンパク質として細胞表面に移行する。図２。Jurkat ＩＬ１３ゼータカイン−ｐ
ＭＧトランスフェクタントを、細胞表面キメラレセプター発現の分析のために、抗ヒトＦｃ（ＦＩＴＣ）抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、リコンビナントヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、次に、Ｆ
ＩＴＣ抱合抗ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Sigma, St.Louis, MO）および抗ＩＬ１
３（ＰＥ）抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康ドナーの初代細胞も、ＦＩＴＣに抱合された抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲおよびイソタイプ対照モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各々の染色には、１０６個の細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ３および５μｌの抗体原液を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、そして二次抗体で染色するかまたは、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳCaliber サイトメーターで分析した。
【実施例４】
【００４２】
実施例４：ＩＬ１３Ｒα２レセプターへのＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの結合
［００４３］ヒトＩｇＧ４Ｆｃによって細胞膜に接着したＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）（すなわち、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン）は、可溶性ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ融合タン
パク質を用いたフローサイトメトリー分析によって評価されるように、その標的ＩＬ１３Ｒα２レセプターに結合することができる。図３。クローン化されたヒトＰＢＭＣ ＩＬ１３ゼータカイン−ｐＭＧトランスフェクタントは、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ発現ベクターをＰＢＭＣにエレクトロポレーション後、陽性トランスフェクタント１０７の選択および増大を行うことによって得た。ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローン細胞を、細胞表面キメラレセプター発現の分析のために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合マウス抗ヒトＦｃ（ガンマ）フラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、リコンビナントヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、次に、ＦＩＴＣ抱合抗ヒトＩ
ｇＧ１モノクローナル抗体（Sigma, St.Louis, MO）およびフィコエリトリン（ＰＥ）抱
合抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康ドナーの初代細胞も、ＦＩＴＣに抱合された抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲおよびイソタイプ対照モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各々の染色には、１０６個の細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ３および５μｌの抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、そして二次抗体で染色するかまたは、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳCaliber サイトメーターで分析した。
【００４３】
［００４４］次に、初代ヒトＴ細胞の代理抗原レセプターとしてのＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの免疫生物学を評価した。初代ヒトＴ細胞に、プラスミド発現ベクターをエレクトロポレーションした。陽性形質転換細胞を、ハイグロマイシンで選択し、制限希釈でクローン化後、ＯＫＴ３、ＩＬ−２および照射支持細胞での循環刺激サイクルによって増大させた。次に、ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳによってＩＬ−１３ゼータカイン発現を示したクローンを、４時間クロム放出検定において、種々のＩＬ−１３Ｒα２＋／ＣＤ２０−神経膠腫細胞系（Ｕ２５１，ＳＮ−Ｂ１９，Ｕ１３８）およびＩＬ１３α−／ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ球系（Daudi）に対する機能性評価を行った。これら試験は
、ＩＬ１３ゼータカインが、神経膠腫細胞に特異的であった細胞溶解活性を与えたということ（図４ａ）、およびこの特異的細胞溶解活性が、神経膠腫細胞についてクラスとして存在しているということ（図４ｂ）を示した。ＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧクローンの細胞溶解活性は、５１Ｃｒで標識されたＳＮ−Ｂ１９、Ｕ２５１およびＵ１３８神経膠腫細胞系（ＩＬ１３α２＋／ＣＤ２０−）および Daudi（ＣＤ２０＋／ＩＬ１３α２−）を標的として用いることによって検定した。ＭＪ−ＩＬ１３エフェクターを、刺激後８〜１２日目に検定した。エフェクターを採取し、洗浄し、検定用培地中に再懸濁させた。２．５ｘ１０５個、１．２５ｘ１０５個、２．５ｘ１０４個および５ｘ１０３個のエフェクターを、９６ウェルＶ底微量滴定プレート中において５ｘ１０３個の標的細胞と一緒に三重に、３７℃で４時間培養した。インキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μｌアリコートを採取し、その上澄み中の５１Ｃｒをγカウンターで検定した。特異的細胞溶解％は、次のように計算した。
【００４４】
【数１】
対照ウェルは、標的細胞単独の存在下でインキュベートされた標的細胞を含有した。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳの存在下において標識された標的細胞によって放出された５１Ｃｒを測定することによって決定した。約４０％のＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＴＣＲα／β＋リンパ球から成る安定してトランスフェクションされたヒトＴ細胞のバルク系統は、４時間クロム放出検定において、１３Ｒα２＋神経膠腫標的に特異的な再
支配された細胞溶解を示したが（２５：１のＥ：Ｔ比で＞５０％の特異的溶解）、ＩＬ−１３Ｒα２−標的に対しては無視しうる活性を示した（２５：１のＥ：Ｔ比で＜８％の特異的溶解）。抗ＩＬ−１３抗体への高レベル結合に基づいて選択されたＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＴＣＲα／β＋ＴＣＬクローンも、再支配されたＩＬ１３Ｒα２特異的神経膠腫細胞死滅を示す。図４ｂ。
【００４５】
［００４５］ＩＬ１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＴＣＬクローンは、培養物中の神経膠腫細胞によって刺激された場合に活性化し、増殖する。図５〜７。ＩＬ１３ゼータカインを発現するＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧ Ｃ１．Ｆ２反応細胞を、in vitro のＩＦＮγ、
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦα生産のレセプターに媒介される誘発（triggering）について評価した。２ｘ１０６個の反応細胞を、２４ウェル組織培養プレート中において２ｘ１０５個の照射刺激細胞（Daudi, Fibroblasts, Neuroblastoma １０ＨＴＢ、および神経膠芽細胞腫Ｕ２５１）と一緒に２ｍｌの全量で共培養した。遮断用ラット抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA）、リコンビナントヒトＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）およびＩＬ１３Ｒα２特異的ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）を、Ｕ２５１刺激細胞のアリコート（２ｘ１０５個／ｍｌ）に、１ｎ
ｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で加え、３０分後、反応細胞を加えた。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、その後、培養物上澄みを採取し、小分けし、−７０℃で貯蔵した。ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαについてのＥＬＩＳＡ検定は、Ｒ＆Ｄ Systems（Minneapolis, MN）キットを製造者の
取扱説明書によって用いて行った。試料は、未希釈の、または１：５または１：１０に希釈された二重ウェルで調べた。展開されたＥＬＩＳＡプレートを、マイクロプレートリーダーで評価し、サイトカイン濃度は、標準曲線からの外挿によって決定した。結果は、ピコグラム／ｍｌとして報告され、神経膠腫刺激細胞によるサイトカイン生産について強い活性化を示している。図５、図６。
【００４６】
［００４６］最後に、ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＴＣＬのＩＬ−２非依存増殖を、神経膠腫刺激細胞との共培養で認めたが（図７ａ）、ＩＬ１３Ｒα２刺激細胞では認められなかった。増殖は、ｒｈＩＬ−１３抗体の添加によって阻害され（図７ｂ）、認められた増殖が、ＩＬ１３Ｒα２神経膠腫細胞特異的レセプターへのゼータカインの結合に依存したということが示された。
【実施例５】
【００４７】
実施例５：治療的使用に適したＩＬ１３ゼータカイン＋Ｔ細胞の製造
［００４７］単核細胞を、ヘパリン化全血から、臨床等級 Ficoll（Pharmacia, Uppsula, Sweden）上での遠心分離によって分離する。ＰＢＭＣを滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
（Irvine Scientific）中で２回洗浄し、そしてＲＰＭＩ１６４０ＨＥＰＥＳ、１０％熱
失活ＦＣＳおよび４ｍＭ Ｌ−グルタミンから成る培地中に懸濁させる。患者ＰＢＭＣ中に存在するＴ細胞を、Orthoclone ＯＫＴ３の培養物（３０ｎｇ／ｍｌ）への添加によっ
てポリクローナル活性化する。次に、細胞培養物を、研究対象指定インキュベーター中において脱気されたＴ７５組織培養フラスコ中でインキュベートする。培養の開始後２４時間に、ｒｈＩＬ−２を２５Ｕ／ｍｌで加える。
【００４８】
［００４８］培養の開始後３日目に、ＰＢＭＣを採取し、遠心分離し、低張性エレクトロポレーション用緩衝液（Eppendorf）中に２０ｘ１０６個細胞／ｍｌで再懸濁させる。
実施例３による２５μｇのプラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧを、４００μｌの細胞懸濁液と一緒に、滅菌０．２ｃｍエレクトロポレーション用キュベットに加える。各々のキュベットに、２５０Ｖ／４０μｓの単一電気パルスを施し、再度ＲＴで１０分間インキュベートする。生存している細胞をキュベットから採取し、プールし、２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する培地中に再懸濁させる。フラスコを患者指定組織培養
インキュベーター中に入れる。エレクトロポレーション後３日目に、ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加える。エレクトロポレーションされたＰＢＭＣを、４８時間毎に培地およびＩＬ−２の補足を行いながら全１４日間培養する。
【００４９】
［００４９］エレクトロポレーションされたＯＫＴ３活性化患者ＰＢＭＣからのハイグロマイシン耐性ＣＤ８＋ＣＴＬのクローニングは、培養１４日目に開始する。簡単にいうと、生存しうる患者ＰＢＭＣを、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する２００ｍｌ容量の培地中の１００ｘ１０６個の低温保存された（cyropreserved）照射支持ＰＢＭＣおよび２０ｘ１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬの混合物に加える
。このマスターミックスを、各ウェルに０．２ｍｌが入る１０個の９６ウェルクローニング用プレート中にプレーティングする。プレートを、蒸発損失を減少させるようにアルミニウム箔で包み、患者指定組織培養インキュベーター中に入れる。培養１９日目、各ウェルに、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のためのハイグロマイシンを入れる。ウェルを、３０日目に細胞成長について倒立顕微鏡での可視化によって調べ、陽性ウェルに再刺激のための印を付ける。
【００５０】
［００５０］細胞成長のある各々のクローニングウェルの内容物を、個別に、２５ｍｌの組織培養培地中に５０ｘ１０６個の照射ＰＢＭＣ、１０ｘ１０６個の照射ＬＣＬおよび３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を含有するＴ２５フラスコに移す。再刺激後１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目および１３日目に、フラスコに５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２および１５ｍｌの新鮮培地を入れる。刺激サイクルの５日目に、フラスコに０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンも補足する。播種後１４日目に、細胞を採取し、計数し、そして５０ｍｌの組織培養培地中に１５０ｘ１０６個の照射ＰＢＭＣ、３０ｘ１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬおよび３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を含有するＴ７５フラスコ中で再刺激する。フラスコに、上に概説されるｒｈＩＬ−２およびハイグロマイシンの培養物への添加物を入れる。
【００５１】
［００５１］療法で可能性のある使用のための増大に選択されるＣＴＬを、ＣＲＢ−３００６に収容されるＦＡＣＳＣalibur での免疫蛍光法によって、ＦＩＴＣ抱合モノクロ
ーナル抗体ＷＴ／３１（ａβＴＣＲ）、Ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８）およびＯＫＴ４（ＣＤ４）を用いて分析して、必要なクローン表現型（αβＴＣＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋およびＩＬ１３＋）を確認する。臨床的使用のためのクローンの選択の判定基準には、イソタイプ対照ＦＩＴＣ／ＰＥ抱合抗体と比較される均一なＴＣＲαβ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋およびＩＬ１３＋が含まれる。プラスミドベクター染色体組込みの単一部位は、サザンブロット分析によって確認する。遺伝子修飾されたＴ細胞クローンからのＤＮＡは、プラスミドベクターに特異的なＤＮＡプローブでスクリーニングされるであろう。プラスミドベクター中のＨｙＴＫに特異的なプローブＤＮＡは、フルオレセイン抱合ｄＵＴＰでのランダムプライミングにより、製造者の取扱説明書（Amersham, Arlington Hts, IL）によって合
成する。Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを、標準的な技法によって単離する。Ｔ細胞クローンからの１０マイクログラムのゲノムＤＮＡを、３７℃で一晩消化後、０．８５％アガロースゲル上で電気泳動によって分離する。次に、ＤＮＡを、アルカリ性キャピラリー転移法を用いてナイロンフィルター（BioRad, Hercules, CA）に移す。フィルターとプローブとを、１０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Sigma）を含有する０．５Ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．
２、７％ＳＤＳ中において６５℃で一晩ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを、４０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ中において６５℃で４回洗浄後、化学発光ＡＰ抱合抗フルオレセイン抗体（Amersham, Arlington Hts, IL）を用いて可視化す
る。クローン選択の判定基準は、ベクターバンドに特有の単一バンドである。
【００５２】
［００５２］ＩＬ−１３ゼータカインの発現は、キメラレセプタータンパク質を抗ゼータ抗体で検出するウェスタンブロット法によって確認する。トランスフェクションされた
Ｔ細胞クローンの全細胞溶解産物は、１錠／１０ｍｌ Complete Protease Inhibitor Cocktail（Boehringer Mannheim）を含有する１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ，１％ＮＰ４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）中での２ｘ１０７個の洗浄された細胞の溶解によって生じる。氷上で８０分間インキュベーション後、遠心分離された全細胞溶解産物上澄みのアリコートを採取し、減圧条件下において等容量のローディング緩衝液中で沸騰させた後、成形済み１２％アクリルアミドゲル（BioRad）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。ニトロセルロースへの転移後、膜を、０．０７ｇｍ／ｍｌの脱脂粉乳を含有するブロット（blotto）溶液中で２時間ブロックする。膜を、Ｔ−ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０５％トゥイーン２０）中で洗浄後、１μｇ／ｍｌ濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体８Ｄ３（Pharmingen, San Diego, CA）と一緒に２時間インキュベートする。Ｔ−ＴＢＳ中で更に４回洗浄後、膜を、
１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ抱合二次抗体と一緒に１時間インキュベートする。展開前に、膜をＴ−ＴＢＳ中ですすぎ洗浄後、３０ｍｌの「ＡＫＰ」溶液（Promega, Madison, WI）で製造者の取扱説明書によって展開させる。クローン選択の判定基準は、キメラゼータバンドの存在である。
【００５３】
［００５３］ＩＬ−１３ゼータカインキメライムノレセプターを発現するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡに制限されない様式でキメラレセプターと細胞表面標的エピトープとの相互作用後、ヒト神経膠芽細胞腫標的細胞を認識し且つ溶解する。標的ＩＬ−１３Ｒα２エピトープ発現およびクラスＩ ＭＨＣ非依存認識のための必要条件は、各々のａβＴＣＲ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４−、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンを、ＩＬ−１３Ｒα２＋ Daudi 細胞トランスフェクタントおよびＩＬ−１３Ｒα２− Daudi 細胞に対して検定することによって確認されるであろう。Ｔ細胞エフェクターを、ＯＫＴ３で刺激後１２〜１４日目に検定する。エフェクターを採取し、洗浄し、検定用培地中に再懸濁させる。ＩＬ−１３Ｒα２を発現する Daudi 細胞トランスフェクタント。２．
５ｘ１０５個、１．２５ｘ１０５個、０．２５ｘ１０５個および０．０５ｘ１０５個のエフェクターを、Ｖ底微量滴定プレート（Costar, Cambridge, MA）中において５ｘ１０３
個の標的細胞と一緒に三重に３７℃で４時間プレーティングする。遠心分離およびインキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μＬアリコートを採取し、計数する。特異的細胞溶解％は、次のように計算する。
【００５４】
【数２】
対照ウェルは、検定用培地中でインキュベートされた標的細胞を含有する。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳで溶解された標的細胞の５１Ｃｒ含有量を測定することによって決定する。クローン選択の判定基準は、５：１のＥ：Ｔ比におけるＩＬ−１３Ｒα２＋ Daudi
トランスフェクタントの＞２５％の特異的溶解、および同じＥ：Ｔ比における親 Daudi の＜１０％の溶解である。
【００５５】
実施例６：ＩＬ−１３ゼータカイン発現性Ｔ細胞を用いたヒト神経膠腫の処置。
［００５４］ＩＬ−１３ＲゼータカインキメライムノレセプターおよびＨｙＴＫを発現するように実施例５によって遺伝子修飾されたＴ細胞クローンを、次について選択する。
【００５６】
ａ．フローサイトメトリーによって決定される細胞表面表現型ＴＣＲα／β＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＩＬ−１３＋。
ｂ．サザンブロットによって示される、染色体に組み込まれたプラスミドベクターＤＮＡの単コピーの存在。
【００５７】
ｃ．ウェスタンブロットによって検出されるＩＬ−１３ゼータカインタンパク質の発現。
ｄ．４時間クロム放出検定におけるヒトＩＬ−１３Ｒα２＋標的の特異的溶解。
【００５８】
ｅ．in vitro 成長についての外因性ＩＬ−２への依存。
ｆ．マイコプラズマ、真菌、細菌の無菌状態および＜５ＥＵ／ｍｌの内毒素レベル。
ｇ．ガンシクロビルへのクローンの in vitro 感受性。
【００５９】
［００５５］末梢血単核細胞は、患者から白血球搬出法によって、好ましくは、最初の切除手術から回復後およびステロイドの漸減および／またはそれらの最も最近の全身化学療法から少なくとも３週間の時点に得る。標的白血球搬出単核細胞収量は、５ｘ１０９個であり、ハイグロマイシン耐性細胞溶解性Ｔ細胞クローンの標的数は、ex vivo 増大のための全ての品質管理パラメーターを満たす少なくとも５個のクローンが識別されることを期待して２５である。クローンを低温保存し、そしてＸ線連続撮影および臨床検査によって患者を監視する。疾患進行の再発が示される場合、患者に、腫瘍切除腔にＴ細胞を供給するためのレザバー接近装置（Omaya レザバー）の配置および／または再切除を行う。外科手術からの回復およびステロイドの漸減後、適用可能ならば、その患者でＴ細胞療法を開始する。
【００６０】
［００５６］その患者に、少なくとも４回の１週間サイクルの療法を与える。最初のサイクル中、細胞用量上昇は、０日目に１０７個の初期細胞用量から、次に３日目の５ｘ１０７個、５日目の１０８個の標的用量まで続く。サイクル２は、サイクル１の開始から１週間程度の早期に開始する。ＭＲＩにおいて残存する疾患で腫瘍退行を示している患者には、サイクル３および４の後、１週間の残余／再実行の反復から成る７週目以降に開始する療法の追加のコースが与えられてよいが、但し、これら処置は、疾患進行またはＣＲが、Ｘ線撮影評価に基づいて得られるような時点まで充分に許容される（＜３度の最大毒性）という条件付きである。
【００６１】
［００５７］細胞用量は、類似した患者集団７５〜８５に供給される腔内ＬＡＫ細胞（１０９個までの個々の細胞用量および２．７５ｘ１０１０個程度に高い累積細胞数が安全に投与されている）、ex vivo 増大ＴＩＬ（最小毒性について報告される１０９個細胞／用量まで）およびアロ反応性リンパ球（累積細胞用量について１０８個の細胞用量で始めて５１．５ｘ１０８個まで）を用いた研究で与えられる用量未満の少なくとも対数である。このプロトコールで考えられるようなより低い細胞用量の根本的理由は、以前に利用されたエフェクター細胞集団の穏当な反応性プロフィールと比較して増加したＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンの in vitro 反応性／抗腫瘍力価に基づいている。低用量反復投薬は、単回多量細胞数点滴で生じるかもしれない潜在的に危険な炎症性応答を免れるのに好ましい。各々の注入は、単一Ｔ細胞クローンから成るであろう。同じクローンを、患者の処置コースの間中投与するであろう。Ｔ細胞投与の当日に、増大したクローンを、無菌的に、５０ｃｃのＰＢＳ中で２回洗浄することによって処理後、医薬用保存剤不含規定生理食塩水中に、患者供給用の細胞用量を２ｍｌで生じる容量で再懸濁させる。Ｔ細胞を５〜１０分間にわたって点滴する。２ｍｌのＰＦＮＳフラッシュは、Ｔ細胞後５分間にわたって投与するであろう。療法への応答は、脳ＭＲＩ＋／−ガンドリニウムにより、分光法で評価する。
【００６２】
［００５８］神経膠腫切除腔中へのＴ細胞投与について予想される副作用は、典型的には、自己限定性悪心および嘔吐、発熱、および既存の神経学的欠損の一時的悪化から成る。これら毒性は、分泌されたサイトカインの作用との組合せでＴ細胞によって媒介される腫瘍床中の局所炎症／水腫双方によることがありうる。これら副作用は、典型的には、一
時的であり且つII度未満の重症度である。たとえ患者が一層重症の毒性を経験するとしても、デカドロンは単独でまたはガンシクロビルとの組合せで、炎症過程を減衰させ且つ注入された細胞を除去するであろうと考えられる。細菌または真菌で汚染されている細胞製品の不注意による注入は、重篤なまたは生命を危うくする毒性を媒介する可能性がある。細胞製品の充分な注入前培養は、汚染された組織培養フラスコを識別し且つこの可能性を最小限にするために行う。再注入当日に、培養液のグラム染色、更には、内毒素レベルを実施する。
【００６３】
［００５９］ＩＬ−１３Ｒα２の発現についての充分な分子分析は、この分子が、ＣＮＳの場合４４；４６；４８；５４に腫瘍特異的であるということを示している。更に、実証可能なＩＬ−１３Ｒα２発現を含む唯一のヒト組織は、精巣であると考えられる４２。この発現の腫瘍精巣制限パターンは、種々のヒト癌、特に、黒色腫および腎細胞癌１０９〜１１１によって発現される腫瘍抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）の増加する数を連想させる。ワクチンおよび養子Ｔ細胞療法での臨床経験は、このクラスの抗原が、精巣の同時自己免疫攻撃を伴うことなく、全身腫瘍免疫療法に利用されうるということを示している１１２〜１１４。おそらくは、これは、無傷の血液精巣関門の作用および精巣内の免疫学的に特権的な環境を選択的に反映している。突然変異体ＩＬ−１３標的指向部分の申し分のない特異性にもかかわらず、毒性は、理論的には、細胞が全身循環中に充分な数で出て行き且つＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４βレセプターを発現する組織を認識する場合に可能性がある。この間接的な危険、更には、点滴されたＴ細胞が、ある患者では腫瘍床中の過剰すぎる炎症応答を媒介することがありうるという可能性を考慮して、ガンシクロビルでの in vivo 除去に感受性のＴ細胞を与えるＨｙＴＫ遺伝子をクローン
に装備する１１５〜１１８。ガンシクロビル自殺は、患者内Ｔ細胞用量上昇戦略との組合せで、可能性のある危険を最小限にして、関与するものを探求するのに役立つ。
【００６４】
［００６０］療法に関連した副作用（頭痛、発熱、悪寒、悪心等）には、その状態に適当な確立された処置を用いて対処する。処置している医師の意見で、患者をかなり医学的に危険にさせるいずれか新しい３度またはいずれか４度の処置関連毒性が認められる場合、その患者にガンシクロビルを与える。非経口投与されるガンシクロビルは、分割される１０ｍｇ／ｋｇ／日で１２時間毎に投与する。１４日間コースが処方されるであろうが、その時間間隔で症状の消散が得られないならば、延長してよい。ガンシクロビルでの処置は、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＨｙＴＫ＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの除去をもたらす。患者は、最初の７２時間のガンシクロビル療法のために監視する目的で入院すべきである。症状が４８時間以内にガンシクロビルに応答しない場合、コルチコステロイドおよびシクロスポリンが含まれるがこれに制限されるわけではない追加の免疫抑制薬を、処置している医師の判断で加えてよい。毒性が重症である場合、処置している医師の判断で、ガンシクロビルと一緒にデカドロンおよび／または他の免疫抑制薬を、より早期に用いる。
【００６５】
参考文献
【００６６】
【化１０】
【００６７】
【化１１】
【００６８】
【化１２】
【００６９】
【化１３】
【００７０】
【化１４】
【００７１】
【化１５】
【００７２】
【化１６】
【００７３】
【化１７】
【００７４】
【化１８】
【００７５】
【化１９】
【００７６】
【化２０】
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】［００１９］図１：ＩＬ１３ゼータカインキメライムノレセプターは、Jurkat Ｔ細胞中で無傷のグリコシル化タンパク質として発現されるということを示しているウェスタンブロットの結果。
【図２】［００２０］図２：発現されたＩＬ１３ゼータカインキメライムノレセプターは、Ｉ型膜貫通タンパク質として細胞表面に移行するということを示しているフローサイトメトリー分析の結果。
【図３】［００２１］図３：代表的な一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンの細胞表面表現型を示しているフローサイトメトリー分析の結果。
【図４Ａ】［００２２］図４：（ａ）ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンが、神経膠腫特異的な再支配された細胞溶解活性を獲得したことを示しているクロム放出検定の結果。
【図４Ｂ】図４：（ｂ）一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンによる抗神経膠腫細胞溶解活性のプロフィールは、神経膠腫細胞で一般的に認められたことを示しているクロム放出検定の結果。
【図５】［００２３］図５：ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、神経膠腫刺激性細胞によってサイトカイン生産について活性化されるということを示している、サイトカイン生産の in vitro 刺激の結果。
【図６】［００２４］図６：抗ＩＬ１３Ｒ ＭａｂおよびｒｈＩＬ１３によるサイトカイン生産についてのＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬ活性化の特異的阻害を示している、サイトカイン生産の in vitro 刺激の結果。
【図７Ａ】［００２５］図７：（ａ）ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞は、神経膠腫刺激物質との共培養で増殖するということを示している増殖研究の結果。
【図７Ｂ】図７：（ｂ）神経膠腫に刺激されたＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞増殖のｒｈＩＬ−１３による阻害を示している増殖研究の結果。
【図８Ａ】［００２６］図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図８Ｂ】図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図８Ｃ】図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図９】［００２７］図９：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧのプラスミド地図。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
［０００１］本発明は、癌治療、およびヒト脳腫瘍および他の癌の処置における、キメライムノレセプターを発現する遺伝子修飾されたＴリンパ球の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０００２］原発性脳腫瘍は、若年成人の癌関連死亡率の第三の主因であり、小児では第二の主因であり、しかも小児科学的および老年医学的双方の集団において発病率が増加していると考えられる１〜４。神経膠腫は、原発性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、米国では毎年、２０，０００例が診断され、１４，０００例の神経膠腫関連死がある５〜８。神経膠腫は、それらの悪性作用に関して不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）であるが、それらの最も一般的且つ攻撃的な形において、未分化星細胞腫（ＡＡ−III度）およ
び多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ−IV度）は、速やかに進行し且つほぼ一様に致死的である９〜１０。現在利用可能な治療様式は、これら高度腫瘍に最小限の治癒的可能性しかなく、しばしば、中枢神経系中のそれらの場所に課される既に重症の病的状態を悪化させる。したがって、悪性神経膠腫の患者は、しばしば、生涯の最も生産的な時期に襲われ、頻繁に起こる知的諸能力の低下および高い疾患致命率が、これら腫瘍の特有の個人的および社会的影響の原因となっている。
【０００３】
［０００３］悪性神経膠腫の腫瘍学的処置の基礎は、切除術および放射線治療である１１〜１６。最新の外科的および放射線治療的技法で、平均生存期間は、多形性神経膠芽細胞腫について８２週間および未分化星細胞腫について２７５週間まで増加したが、５年生存率は、多形性神経膠芽細胞腫について３〜６％および未分化星細胞腫について１２．１％増加しているにすぎない６〜８。長期生存の主な予後指標は、より若い年齢（＜４０歳）および行動状態（ＫＰＳスコア ＞７０）である１７。大きい腫瘍の９０％を超える切除術は、通常は、生活機能解剖学が許されるという条件付きで試みられる。術後放射線治療と共に用いられる場合、切除術の程度の生存期間への影響はあまり明らかではない１８；１９。切除術および放射線への化学療法の追加は、未分化星細胞腫または多形性神経膠芽細胞腫の患者に、最低限生存しうる利点を与えるにすぎない２０〜２３。ニトロソ尿素は、単独でまたはプロカルバジンおよびビンクリスチンとの組合せで、公共に用いられる慣用的な薬物であり、全体の半数生存に影響することなく、１年および２年生存率を１５％改善すると考えられる。白金基剤薬物およびトポイソメラーゼ阻害剤を併用する更に攻撃的な治療方式は、研究中である２６。幹細胞救出での高用量化学療法の役割は、これまでのところ立証されていない２７〜２９。
【０００４】
［０００４］約８０％の再発性腫瘍は、元の不完全に切除された腫瘍の残部をＸ線撮影によって増強することに由来する１０；３０；３１。再発が単一病巣であり、それらの場所で攻撃的再切除術を行いやすいという条件ならば、このアプローチは、特に、未分化星細胞腫の患者およびＫＰＳ＞７０の多形性神経膠芽細胞腫患者について生存期間を延長することができる１０。再切除術で処置された再発性多形性神経膠芽細胞腫患者の半数生存は、３６週間である１０；３０；３１。近接照射療法かまたは定位放射線手術の形での放射線治療は、再切除術された再発性多形性神経膠芽細胞腫患者の生存期間を１０〜１２週間だけ延長することができる。再発性疾患の設定での化学療法の使用は、この患者集団でのその効力が立証されていないので、利用可能な臨床試験の状況にあるはずである。
【０００５】
［０００５］悪性神経膠腫の引き続き悲惨な予後は、遺伝子治療（ＴＫ自殺、腫瘍増殖
因子レセプターのアンチセンス阻害、条件致死ウイルスベクター）、免疫療法（抗体、腫瘍細胞ワクチン、イムノトキシン、活性リンパ球の養子移入）、および抗血管新生アプローチが含まれるがこれに制限されるわけではない新規な治療的実体の臨床的研究を促している３３〜４０。悪性神経膠腫に有効なアジュバント療法の開発に向けられた挑戦の多様性には、正常な脳実質中への腫瘍細胞の広範な浸潤性成長、免疫応答の発生を減衰させるこれら腫瘍から作られる可溶性因子の能力、および中枢神経系（ＣＮＳ）中に治療薬を投与する場合の臨床的に意味のある治療的比率を決定する難しさが含まれる。新規な治療薬の早期臨床評価は、この患者集団において明らかに必要とされている。
【０００６】
［０００６］最近、トランスフェリンのレセプターおよび増殖因子は、デリバリーシステムとしての毒素またはラジオヌクレオチドに抱合されたこれらレセプターのリガンドを利用した実験的神経膠腫治療薬の論題となっている４１。このアプローチの特異性は、正常な脳と比較される、神経膠腫細胞上の標的レセプターの独特の発現または過剰発現に頼っている。興味深いことに、免疫系によって利用されるインターロイキンの若干のレセプター複合体は、神経膠腫、特に、高親和性ＩＬ−１３レセプターによって発現される４２〜４８。免疫系によって利用されるＩＬ−１３レセプター三分子複合体は、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒβおよびγｃから成るが、これとは異なり、神経膠腫細胞は、ＩＬ−４Ｒβまたはγｃについての必要条件とは無関係にＩＬ−１３を結合することができる特有のＩＬ−１３Ｒα２鎖を過剰発現する４４；４９；５０。そのホモログＩＬ−４と同様に、ＩＬ−１３は、ＣＮＳの外に多面的（pleotrophic）免疫調節活性を有する。どちらの
サイトカインも、Ｂリンパ球によるＩｇＥ生産を刺激し且つマクロファージによる前炎症性サイトカイン生産を抑制する。ＣＮＳ内のＩＬ−１３の免疫生物学は、ほとんど知られていない。
【０００７】
［０００７］放射性標識ＩＬ−１３でのオートラジオグラフィーを用いた Debinski et
al. による詳細な研究は、研究されたほとんど全ての悪性神経膠腫組織上に豊富なＩＬ
−１３結合を示している４２；４５；４６；４８。更に、その結合は、腫瘍切片内でおよび単細胞分析により、きわめて均一である４６；４８。ヒト神経膠腫細胞系へのＩＬ−１３結合のスキャッチャード分析は、平均して１７，０００〜２８，０００の結合部位／細胞を示している４５。ＩＬ−１３Ｒα２ ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いた分子分析では、全てのＣＮＳ解剖学的位置において正常な脳エレメントによる神経膠腫特異的レセプターの発現を示すことができない４２；４３。更に、放射性標識ＩＬ−１３でのオートラジオグラフィーでは、ＣＮＳにおける検出可能な特異的ＩＬ−１３結合を示すことができなかったことから、共有されるＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターは、ＣＮＳにおいて検出可能なレベルで発現されることもないということが示唆された４６。これら知見は、別個に、非病理学的脳切片についてＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−４βに特異的な抗体での免疫組織化学的技法を用いて証明された５４。したがって、ＩＬ−１３Ｒα２は、これまでに記載された神経膠腫についての最も特異的で且つ遍在的に発現される細胞表面標的としてある。
【０００８】
［０００８］ＣＮＳにおけるＩＬ−１３Ｒα２の神経膠腫特異的発現を利用する戦略として、ＩＬ−１３サイトカインの分子コンストラクトであって、種々の細胞毒素（シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素およびジフテリア（Diptheria）毒素）がそのカルボキシル末端に融合しているものが記載されてきている５５〜５８。ＩＬ−１３レセプターへの結合でのこれら毒素のインターナリゼーションは、これら融合タンパク質の選択的毒性の根拠である。これら毒素は、in vitro の神経膠腫細胞に対してピコモル濃度で強力な
細胞傷害性を示す５５。免疫欠損マウスにおけるヒト頭蓋内神経膠腫異種移植片は、毒性が認められることなく、ＩＬ−１３−毒素融合タンパク質の腫瘍内注射によって排除されうる５５。これら研究は、ＩＬ−１３に支配されたイムノトキシンを悪性神経膠腫に局所的に利用する臨床研究の開始を支持する。
【０００９】
［０００９］しかしながら、広く発現されるＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプター複合体へのＩＬ−１３に基づく細胞毒素の結合は、ＣＮＳ外の正常組織に不都合な毒性を媒介する可能性があり、したがって、これら薬剤の全身投与を制限する。ＩＬ−１３は、分子レベルで充分に調べられていて、個々のレセプターサブユニットと連結するのに重要であるこのサイトカインの構造ドメインは、地図に示されている５５；５８。結果として、ＩＬ−１３中の選択されたアミノ酸置換は、このサイトカインとそのレセプターサブユニットとの連結に予想可能な作用をする。ＩＬ−１３のαヘリックスＡ、具体的にはアミノ酸１３におけるアミノ酸置換は、ＩＬ−４βと連結するその能力を破壊し、それによって、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターへのＩＬ−１３の親和性を選択的に５倍だけ減少させる５５；５７；５８。驚くべきことに、ＩＬ−１３Ｒα２への突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の結合は、保存されただけでなく、野生型ＩＬ−１３に相対して５０倍増加した。したがって、最小限に変更されたＩＬ−１３類似体は、神経膠腫細胞へのＩＬ−１３の特異性および親和性をＩＬ−１３Ｒα２への選択的結合によって同時に、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃレセプターを有する正常組織に相対して増加させることができる。
【００１０】
［００１０］悪性神経膠腫は、（１）大部分の患者が、切除術および放射線治療で最低限の疾患重症度状態に達する、および（２）ＣＮＳの境界内のこれら腫瘍の解剖学的位置が、エフェクター細胞の直接的局所投与を可能にさせることから、免疫療法介入にとってきわめて魅力のある臨床的実体である。少なくとも二つの病理学的研究は、悪性神経膠腫における血管周囲リンパ球性浸潤の程度が、改善された予後と相関するということを示している５９〜６１。動物モデルシステムが確立されており、そこで、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞ではないが神経膠腫特異的Ｔ細胞は、大脳内に植え込まれた神経膠腫の後退を媒介することができる６２〜７１。Ｔ細胞は、ＬＡＫ細胞とは異なり、脳実質中に浸潤する能力を有するので、原発性腫瘍から遠く離れていることがありうる浸潤性腫瘍細胞を標的にすることができる。これら知見にもかかわらず、神経膠腫が、主に、免疫抑制性サイトカイン（ＴＧＦ−β２）およびプロスタグランジンの精巧さによって、免疫破壊を積極的に覆すという実質的な証拠があり、これが、神経膠腫反応性Ｔ細胞応答の誘導／増幅を阻害する７２〜７４。これら知見は、in vivo 応答を生じることについての腫瘍に媒介される制限を克服する戦略としての養子療法のための ex vivo で増大した抗神
経膠腫エフェクター細胞の評価を促している。
【００１１】
［００１１］悪性神経膠腫切除術腔への ex vivo 活性化リンパ球の投与を伴う少なく
とも１０種類の試験研究が、これまでに報告されている７５〜８５。エフェクター細胞タイプ（ＬＡＫ、ＴＩＬ、アロ反応性（alloreactive）ＣＴＬ）の種類、それらの不均一組成／患者間の組成の変動、および神経膠腫標的に対するこれらエフェクター細胞のしばしば穏当な in vitro 反応性にもかかわらず、これら研究は、事例の長期生存者を含む再発性／難治性疾患の患者において、総計して約５０％の応答率を報告している。これら研究は、神経膠腫への細胞性免疫療法の優れた臨床的作用が、均一できわめて強力なエフェクター細胞で予想されうるという前提を支持する。
【００１２】
［００１２］これら試験研究は、悪性神経膠腫の患者の切除術腔中への、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）および ex vivo 活性化リンパ球の直接的投
与の安全性および許容性についても報告している７５；７６；７８；８２；８６〜９２。広範囲の個々の細胞用量（＞１０９個細胞／用量）、更には、高い累積細胞用量（＞２７ｘ１０９個細胞）でさえも、毒性は穏当であり、典型的には、II度またはそれ未満の一時的頭痛、悪心、嘔吐および発熱から成る。上記のように、これら研究は、ｒｈＩＬ−２の同時投与も用いて、転移したリンパ球の in vivo 生存を支持した。リンパ球と同時にか
またはリンパ球投与後に逐次的に与えられる多重用量は、４８時間毎に供給されるＩＬ−
２の１２用量コースについて、１．２ｘ１０６ＩＵ／用量と同程度に高い用量で許容された。
【００１３】
［００１３］上に概説された知見に基づいて、神経膠腫免疫療法で用いられるリンパ球エフェクター細胞の抗腫瘍力価を改善する戦略は開発中である。一つのアプローチは、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）結合性ドメインを利用する神経膠腫標的と一緒に、抗ＣＤ３ドメインによってＴリンパ球を同時限局化し且つ活性化することができる二重特異性抗体を利用している９３〜９６。自己リンパ球と組み合わせたこの二重特異性抗体での予備臨床実験は、Ｔ細胞が、切除術腔中において現場で活性化されるということを示唆している。しかしながら、脳実質内の浸潤性腫瘍細胞に標的指向することは、このアプローチの潜在的に有意の限界である。Ｔ細胞は、神経膠腫によって発現される標的抗原に特異的である場合、有意に増加した抗神経膠腫活性を有すると考えられる。Ｔリンパ球が反応性である腫瘍抗原をコードしている、ＳＡＲＴ−１遺伝子を含めた増加する多数のヒト遺伝子がクローン化されているが、これは、ほぼ７５％の高度神経膠腫によって発現されると考えられる９７。樹状細胞に基づく in vitro 細胞培養技術、更には、テトラマーに基づくＴ細胞選択技術は両方とも、養子両方のための抗原特異的Ｔ細胞の単離を実行可能にしている。ＳＡＲＴ−１のような抗原は、制限性ＨＬＡ対立遺伝子の場合にＴ細胞によって認識されるので、抗原特異的アプローチは、一般的な神経膠腫患者集団に広く応用可能であるようにこれら抗原を提示することができる抗原および制限性ＨＬＡ対立遺伝子の数の実質的な増大を必要とするであろう。
【００１４】
［００１４］Ｔ細胞抗原レセプター複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合した細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）から成るように遺伝子操作されたキメラ抗原レセプター（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）は、Ｔ細胞中で発現された場合、モノクローナル抗体の特異性に基づく抗原認識を再支配する能力を有する９８。腫瘍細胞表面エピトープについて標的特異性を有するｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターの設計は、それが既存の抗腫瘍免疫に頼っていないので、養子療法のための抗腫瘍免疫エフェクター細胞を生じる概念上魅力のある戦略である。これらレセプターは、それらがＭＨＣ非依存様式で抗原を結合するという点で「普遍的」であり、したがって、一つのレセプターコンストラクトを用いて、抗原陽性腫瘍を有する患者集団を処置することができる。ヒト腫瘍に標的指向するためのいくつかのコンストラクトは、参考文献に記載されており、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＥＲＲＢ−２、ＣＤ４４ｖ６、および腎細胞癌上で選択的に発現されるエピトープに特異性を有するレセプターが含まれる９８〜１０４。これらエピトープは全て、キメラＴ細胞レセプターによってｓｃＦｖ結合に接近可能な細胞表面部分であるという共通の特性を共有している。in vitro 研究は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞エフェクター機能が、こ
れらレセプターによって引き起こされうるということを示している。更に、動物モデルは、養子移入されたｓｃＦｖＦｃ：ζを発現するＴ細胞の、樹立された腫瘍を撲滅する能力を示している１０５。腫瘍特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターを発現する初代ヒトＴ細胞の機能は、in vitro で評価されており、これら細胞は、特異的に、腫瘍標的を溶解し、
そしてＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含めた一連の前炎症性サイトカインを分泌する１０４。Ｉ期試験養子療法研究は、ＨＩＶ感染個体のＨＩＶｇｐ１２０に特異的な自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞、および乳腺癌および結腸直腸腺癌を含めたいろいろな腺癌で発現されるＴＡＧ−７２に特異性を有する自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞を利用して進行中である。
【００１５】
［００１５］City of Hope の研究者らは、ＣＤ２０＋Ｂ細胞悪性腫瘍に標的指向する
目的のためのＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターコンストラクト、および神経芽細胞腫に標的指向するためのＬ１−ＣＡＭ特異的キメライムノレセプターを遺伝子操作している１０６。前臨床実験室研究は、再配列されていない染色体に組み込まれたベクターＤＮＡの単コピーを含有し且つＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζレセプターを発現するＣ
Ｄ８＋ＣＴＬクローンを、健康個体およびリンパ腫患者から単離し且つ増大させる実行可能性を示している１０７。これを達成するために、ＣＭＶ即時／初期プロモーターの転写制御下にあるキメラレセプター配列およびＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下にあるＮｅｏＲ遺伝子を含有する精製直鎖状プラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションと称される手順である、短時間電流への細胞およびＤＮＡの暴露によって、活性化されたヒト末梢血単核細胞中に導入した。Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington におけるＦＤＡ認可臨床試験で現在用いられている選択法、クローニング法および増大法を利用して、ＣＤ２０特異的細胞溶解活性を有する遺伝子修飾されたＣＤ８＋ＣＴＬクローンを、６人の健康な志願者各々から、１５回の別個のエレクトロポレーション手順で生じている。これらクローンは、ヒトＣＤ２０＋リンパ腫細胞系の一団と一緒に共培養された場合、増殖し、特異的に標的細胞を溶解し、そして刺激されてサイトカインを生産する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の要旨
［００１６］本発明は、「ゼータカイン」と称されるキメラ膜貫通イムノレセプターであって、細胞表面に細胞外ドメインを接着すること（tethering）ができる支持体領域に
連結した可溶性レセプターリガンドを含む細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞内シグナリングドメインを含んで成るものに関する。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現された場合、可溶性レセプターリガンドが特異的であるレセプターを発現するそれら細胞へのＴ細胞活性を支配する。ゼータカインキメライムノレセプターは、Ｔ細胞の抗原特異性を再支配するための抗体に基づくイムノレセプターの新規伸長であり、いろいろな癌の処置に、具体的には、ヒト悪性腫瘍によって利用されるオートクリン／パラクリンサイトカインシステムによって応用される。
【００１７】
［００１７］悪性神経膠腫および腎細胞癌によるＩＬ−１３Ｒα２の腫瘍限定発現を細胞免疫療法の標的として利用した一つの好ましい態様において、ＩＬ−１３Ｒα２に選択的高親和性結合を有するＩＬ−１３サイトカインの突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）は、ＩＬ−１３Ｒα２発現性腫瘍細胞へのＴ細胞抗原特異性を再支配することができるＩ型膜貫通キメライムノレセプターに変換されている。ゼータカインのこの態様は、ヒトＩｇＧ４Ｆｃに融合した細胞外ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）、膜貫通ＣＤ４および細胞内Ｔ細胞抗原レセプターＣＤ３複合体ゼータ鎖から成る。細胞表面上でレセプターを選択的に発現するいろいろなガン細胞タイプのいずれかに特異的であり、その選択的リガンドが知られているまたは遺伝子操作されうる類似のイムノレセプターを生じることができる。
【００１８】
［００１８］このようなイムノレセプターを発現するように安定して形質転換されたヒトＴ細胞のバルク系統（bulk lines）およびクローンは、それらが特異的であるガン細胞タイプの再支配された細胞溶解を示すが、非標的細胞に対しては無視しうる毒性を示す。このような遺伝子操作されたＴ細胞は、神経膠腫のような処置するのが難しい癌を含めた悪性腫瘍のための強力且つ選択的な療法である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
詳細な説明
［００２８］遺伝子操作され再支配されたＴ細胞での腫瘍標的指向に理想的な細胞表面エピトープは、単に腫瘍細胞上において均一様式でおよび同じ診断の患者集団内の全ての腫瘍上において発現されると考えられる。腫瘍細胞膜からの標的分子のモジュレーションおよび／または流出（shedding）は、再支配されたＴ細胞認識のための特定の標的エピトープの有用性に影響を与えることもありうる。これまでのところ、「理想的な」腫瘍特異的エピトープは僅かしか定義されていないが、二次エピトープは、臨界的正常組織での発
現不足かまたは腫瘍での相対的過剰発現に基づいて標的とされてきている。悪性神経膠腫の場合、この癌の処置のためのＴ細胞の腔内投与は、ＣＭＳ外の他の組織による発現においてより小さいストリンジェンシーで、正常ＣＮＳではないが腫瘍細胞上で発現されるものへの標的エピトープの増大を可能にする。ＣＭＳ外の組織の交差反応性による毒性に関する問題は、（ａ）腔内投与経路に基づくＣＮＳにおける細胞の隔絶（sequestration）
、および（ｂ）典型的に全身投与される細胞用量と比較して低い投与細胞数によって軽減される。
【００２０】
［００２９］ＩＬ−１３Ｒα２レセプターは、悪性神経膠腫について最も遍在的且つ特異的な細胞表面標的として突出している４７。感受性のオートラジオグラフィーおよび免疫組織化学的研究では、ＣＮＳにおいてＩＬ−１３レセプターを検出することができない４６；４８。更に、神経膠腫に限定されたＩＬ−１３Ｒα２レセプターを選択的に結合するＩＬ−１３サイトカインの突然変異は、ＣＮＳ外のＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β＋正常組織に対するＩＬ−１３に向けられた治療薬の不都合な反応性に対する更にもう一つの防護手段である５５；５７。神経膠腫ＩＬ−１３Ｒα２に標的指向することの潜在的有用性、順に、ＣＤ４ＴＭおよびＣＤ３ゼータの細胞質テイルに融合するヒトＩｇＧ４Ｆｃによって原形質膜に接着した細胞外ＩＬ−１３突然変異体サイトカイン（Ｅ１３Ｙ）から成る、Ｔ細胞の特異性を再支配するための新規な遺伝子操作されたキメライムノレセプターの設計および試験。このキメライムノレセプターは、「ＩＬ−１３ゼータカイン」という呼称を与えられている。ＩＬ−１３Ｒα２レセプター／ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）レセプター−リガンド対は、概して、ゼータカインで用いるためのレセプター−リガンド対の適合性を理解し且つ評価するための優れた指針である。理想的なゼータカインは、ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の性状（独特の癌細胞表面レセプターへの特異性、それが天然に存在する可溶性細胞シグナル分子に由来することによる in vivo 安定性、同じ理由での低免疫原性
）を有する細胞外可溶性レセプターリガンドを含む。可溶性レセプターリガンドは、細胞外環境においてより安定であると考えられ、非抗原性であり、そしてより選択的であるという点で、抗体フラグメント（ｓｃＦｖＦｃイムノレセプターなど）または細胞接着分子の先行技術使用にまさる明確な利点としての可溶性レセプターリガンドの使用。
【００２１】
［００３０］本発明によるキメライムノレセプターは、順に、細胞内レセプターシグナリングドメインに連結した膜貫通ドメインによって、細胞表面に可溶性レセプターリガンドを接着している細胞外支持体領域に連結したこのリガンドを含んで成る細胞外ドメインを含む。適当な可溶性レセプターリガンドの例には、オートクリンおよびパラクリン増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモン、および必要な特異性を示す遺伝子操作された人工低分子リガンドが含まれる。天然のリガンド配列は、特定の標的細胞へのそれらの特異性を増加させるように遺伝子操作することもできる。特定のゼータカインで用いるための可溶性レセプターリガンドの選択は、標的細胞の性質、および神経膠腫に対する使用に好ましいリガンドであるＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）分子に関して上に論及された品質によって左右される。適当な支持体領域の例には、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域、ヒトＣＤ８∝、および標的細胞上に結合しているレセプターへの向上した接近のために標的指向部分を細胞表面から離れて移動させるのに役立つ人工リンカーが含まれる。好ましい支持体領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ４など）のＦｃ領域である。適当な膜貫通ドメインの例には、白血球ＣＤマーカーの膜貫通ドメイン、好ましくは、ＣＤ８の膜貫通ドメインが含まれる。細胞内レセプターシグナリングドメインの例は、Ｔ細胞抗原レセプター複合体のもの、好ましくは、ＣＤ３のゼータ鎖、更には、ＦｃγＲIII共刺激シグナリングドメイン、
ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ２単独またはＣＤ３ゼータを含む系列である。
【００２２】
［００３１］ＩＬ−１３ゼータカイン態様において、Ｅ１３Ｙアミノ酸置換を有するヒトＩＬ−１３ｃＤＮＡは、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によって合成した。完全長さＩＬ−１３ゼータカインコンストラクトは、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長に
よって組み立てたが、これは、ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターα鎖リーダーペプチド、ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、ヒトＣＤ４ＴＭ、およびヒト細胞質ゼータ鎖から成る。このｃＤＮＡコンストラクトを、ヒト Elongation Factor−１αプロモーター（Invivogen, San Diego）の転写制御下において修飾ｐＭＧプラスミドの多重クローニング部位中に連結した。この発現ベクターは、ＣＭＶ即時／初期プロモーターから、トランスフェクタントの in vitro 選択のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性とガンシクロビルでの細胞の in vivo 除去（ablation）の
ためのＨＳＶチミジンキナーゼ活性とを一つの分子内に一緒にしている融合タンパク質ＨｙＴＫをエンコードしているＨｙＴＫｃＤＮＡを同時発現する。グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンと一緒にプレインキュベートされた全細胞 Jurkat 溶解産物の、抗ゼータ抗体プローブでのウェスタンブロットは、予想される無傷の５６−ｋＤａキメラレセプタータンパク質が発現されるということを示した。このレセプターは、本来のＩＬ−１３サイトカインの翻訳後修飾と一致して強くグリコシル化される１０８。抗ヒトＩＬ−１３および抗ヒトＦｃ特異的抗体を含むＩＬ−１３ゼータカイン＋ Jurkat 細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｉ型膜貫通タンパク質としてのＩＬ−１３ゼータカインの細胞表面発現を確証した。
【００２３】
［００３２］City of Hope で開発され確立されたヒトＴ細胞遺伝子修飾法を用いて１
０７、ＩＬ−１３ゼータカインキメライムノレセプターを発現する初代ヒトＴ細胞クローンを、前臨床機能特性決定のために生じている。ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、ex vivo 増大培養において強い増殖活性を示す。増大したクローンは、４時間クロム放出検定において、ヒトＩＬ−１３Ｒα２＋神経膠芽細胞腫細胞系に対する再支配された細胞溶解活性を示す。この細胞溶解活性レベルは、Ｔ細胞上でのゼータカイン発現レベルおよび神経膠腫標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２レセプター密度レベルと相関する。死滅の他に、ＩＬ−１３ゼータカイン＋クローンは、サイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ）について活性化される。活性化は、神経膠腫細胞上のＩＬ−１３Ｒα２レセプターとＩＬ−１３ゼータカインの相互作用によって特異的に媒介されたが、不適切なキメライムノレセプターを発現するＣＴＬクローンは、神経膠腫細胞に応答しないからであるし、しかも活性化は、Ｔ細胞トランスフェクタント上のＩＬ−１３および神経膠腫標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２に対する遮断抗体または可溶性ＩＬ−１３の培養物への添加によって、用量依存方式で阻害されうるからである。最後に、ＩＬ−１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、培養物中の神経膠腫細胞によって刺激された場合に増殖する。強力な抗神経膠腫エフェクター活性を有するＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、正常ＣＮＳへの限られた側副損傷を含む悪性神経膠腫に対して有意の臨床的活性を有するであろう。
【００２４】
［００３３］本発明によるイムノレセプターは、当該技術分野において知られているいずれの手段によっても生じることができるが、好ましくは、それは、組換えＤＮＡ技術を用いて生じる。キメラレセプターのいくつかの領域をエンコードしている核酸配列は、分子クローニングの標準的な技法（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助連結、位置指定突然変異誘発等）によって製造し且つ完全なコーディング配列に組み立てることができる。得られたコーディング領域を、好ましくは、発現ベクター中に挿入し且つ用いて、適当な発現宿主細胞系、好ましくは、Ｔリンパ球細胞系、最も好ましくは、自己Ｔリンパ球細胞系を形質転換する。イムノレセプターの発現のための第三者は、Ｔ細胞系／クローン、形質転換された体液または外因性の（xerogenic）免疫学的エフェ
クター細胞系を得た。ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、ＬＡＫ細胞、ＬＩＫ細胞、およびこれら細胞に分化する幹細胞を用いることもできる。好ましい態様において、リンパ球は、白血球搬出法によって患者から得られ、そして自己Ｔ細胞を、ゼータカインを発現するように形質導入し且つ臨床的に許容しうる手段によって患者に投与し戻して、抗癌治療を達成する。
【００２５】
［００３４］治療的作用に適当な用量は、好ましくは、一連の投薬サイクルで約１０６〜約１０９個細胞／用量であると考えられる。好ましい投薬計画は、用量を段階的に増加させる、０日目に約１０７個細胞で始め、５日目までに約１０８個細胞の標的用量まで漸増増加させる４回の１週間投薬サイクルから成る。適当な投与方式には、静脈内、皮下、腔内（例えば、レザバー接近装置（reservoir-access device）による）、腹腔内、およ
び腫瘍塊中への直接注射が含まれる。
【００２６】
［００３５］次の実施例は、本発明の一つの態様を単に詳しく説明するためにある。
【実施例１】
【００２７】
実施例１：イムノレセプターコーディング配列の構築
［００３６］本発明によるイムノレセプターのコーディング配列を、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）コーディング配列の de novo 合成により、次のプライマーを用いて構築した（イム
ノレセプターのコーディング配列および発現ベクターの構築を示すフローチャートについては、図８を参照されたい）。
【００２８】
【化１】
［００３７］最終配列（４１７ｂｐ）を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで末端消化し、そしてプラスミドｐＳＫ（stratagene, LaJolla, CA）中に連結してライゲーション（ligation）３１２＃３とした。ライゲーション３１２＃３を、突然変異誘発させて（stratagene キット、製造者の取扱説明書による）、欠失したヌクレオチドを、プライマー５’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ５−３
【００２９】
【化２】
および３’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ３−５
【００３０】
【化３】
、および鋳型としてのライゲーション３１２＃３を用いて固定して、ライゲーション３４８＃１（ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ）を形成した。
【００３１】
［００３８］コーディング Human ＧＭ−ＣＳＦＲα鎖 Signal Peptide（ｈｓｐ）コーディング配列を、標準的なＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によってＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）の５’末端に融合した。このｈｓｐ配列（１０１ｂｐ）は、鋳型ライゲーション３０１＃１０（ｈｓｐ／ｐＳＫ）（ヒトＴ細胞ｃＤＮＡからのヒトＧＣＳＦレセプターα鎖リーダー配列）から、プライマー５’：１９ｈｓｐ５’
【００３２】
【化４】
（ＸｂａＩ部位を太字で強調）および３’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＲ
【００３３】
【化５】
を用いて得た。ＩＬ−１３配列（３７１ｂｐ）は、プライマー５’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＦ
【００３４】
【化６】
および３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲ
【００３５】
【化７】
、および鋳型としてのライゲーション３１２＃３を用いて得た。融合は、このようにして得られた１０１ｂｐ ｈｓｐ配列および３７１ｂｐ ＩＬ１３配列、およびプライマー５’：１９ｈｓｐ５’および３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲを用いて行って、４３８ｂｐ融合ｈｓｐ−ＩＬ１３配列を生じた。
【００３６】
［００３９］ＩｇＧ４Ｆｃ領域ＩｇＧ４ｍ：ゼータをコードしている配列を、このｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列の３’末端に同じ方法を用いて融合した。ＩｇＧ４ｍ：ゼータ配列（１１１９ｂｐ）は、プライマー５’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＦ
【００３７】
【化８】
および３’：ＺｅｔａＮ３’
【００３８】
【化９】
（ＮｏｔＩ部位を太字で強調）を用い、鋳型として配列Ｒ９．１０（ＩｇＧ４ｍＺｅｔａ／ｐＳＫ）を用いて得た。この１１１９ｂｐ ＩｇＧ４ｍ：ゼータ配列を、ｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列に、鋳型としてのそれぞれの配列、およびプライマー５’：１９ｈｓｐ５’および３’：ＺｅｔａＮ３’を用いて融合して、１５２２ｂｐ ｈｓｐ−ＩＬ１３−ＩｇＧ４ｍ：ゼータ融合配列を生じた。その両末端を、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、ライゲーション３５１＃７としてｐＳＫ中に連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ（４４６４ｂｐ）を生じた。
【実施例２】
【００３９】
実施例２：発現ベクターの構築
［００４０］ＩＬ１３ゼータカインコーディング配列を含有する発現ベクターは、実施例１で得られたＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫを、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、クレノウ（Klenow）を含むブラント末端を生じ、そして得られたフラグメントをプラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃ（Invirogen）（ＳｇｒＡＩで開き、クレノウでブラントにし、ＳＡＰでの脱
リン酸化によって最初に製造される）中に連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧを生じることによって生成した。図８を参照されたい。ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧのハイグロマイシン耐性領域を、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩでの消化によって除去し、そしてプラスミドＣＥ７Ｒ／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ（Jensen, City of Hope）からＮｏｔＩ−ＮｈｅＩでの消化によって得られる選択／自殺融合ＨｙＴＫによって置き換えて、発現ベクターＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ（６７８５ｂｐ）を生じた。このプラスミドは、Human Elongation Factor−１αプロモーター（ｈＥＦ１ｐ）を６〜５４９塩基に、
ＩＬ１３ゼータカインコーディング配列を６９２〜２１８５塩基に、シミアンウイルス４０後期（Simian Virus 40 Late）ポリアデニル化シグナル（ＬａｔｅＳＶ４０ｐＡＮ）を２２３２〜２５００塩基に、最小の大腸菌（Ｅ．coli）複製起点（Ｏｒｉ ＣｏｌＥ１）を２５０１〜３２４７塩基に、合成ポリＡおよび Pause 部位（ＳｐＡＮ）を３２４８〜
３４３４塩基に、極初期（Immeate-early）ＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ｈＣＭ
Ｖ−１Ａｐｒｏｍ）を３４５５〜４０７７塩基に、ハイグロマイシン耐性チミジンキナーゼコーディング領域融合（ＨｙＴＫ）を４２５９〜６３３４塩基に、そしてウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび転写ポーズ（ＢＧｈ ｐＡｎ）を６３３５〜６６３３塩基に含む。このプラスミドは、ＰａｃＩ線状化部位を３２３５〜３２４２塩基に有する。ｈＥＦ１ｐおよびＩＬ１３ゼータカインエレメントは、ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧから得、残りのエレメントは、ＣＥ７Ｒ／ＨｙＴＫ−ｐＭＧから（ＨｙＴＫエレメントを除いて、最終的には親プラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃから）得た。要するに、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧは、ｈＥＦ１プロモーターからＩＬ１３ゼータカイン遺伝子、およびＣＭＶ−１ＡプロモーターからＨｙＴＫ融合を発現する修飾ｐＭＧ主鎖である。プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの地図は、図９で明らかである。
【実施例３】
【００４０】
実施例３：イムノレセプターの発現
［００４１］発現されたコンストラクトの統合性の評価を、グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンの存在下または不存在下で培養された Jurkat Ｔ細胞安定トランスフェクタント１０７に由来する全細胞溶解産物の抗ゼータ抗体でプローブされたウェスタンブ
ロットによって最初に表した。図１。Jurkat Ｔ細胞安定トランスフェクタント（Jurkat
−ＩＬ１３−ｐＭＧバルク系統（bulk line））は、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−
ｐＭＧ発現ベクターを Jurkat Ｔ細胞にエレクトロポレーション後、陽性トランスフェクタントの選択および増大を行うことによって得た。Jurkat−ＩＬ１３−ｐＭＧバルク系統から２ｘ１０６個／ウェルの細胞を、２４ウェルプレート中に５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのツニカマイシンと一緒にまたは不含でプレーティングした。そのプレートを３７℃で２２時間インキュベートした。細胞を各々のウェルから採取し、各試料をＰＢＳで洗浄し、そして１錠／１０ｍｌ Complete Protease Inhibitor Cocktail（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含有する５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ，１％ＮＰ４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁させた。試料を氷上で３０分間インキュベート後、２１ゲージ針のシリンジでの吸引によって破壊し、次に、氷上で更に３０分間インキュベート後、４℃において１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離された溶解産物上澄み試料を採取し、減圧条件下において等容量の試料用緩衝液中で沸騰させた後、１２％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ニトロセルロースへの転移後、膜を４℃でＯ／Ｎ乾燥させた。翌朝、膜を、Ｔ−ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０２％トゥイーン２０）中に０．０４ｇｍ／ｍｌの脱脂粉乳を含有する Blotto 溶液中で１時間ブロックした。次に、膜を、１μｇ／ｍｌ濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA）と一緒に２時間インキュベートし、洗浄後、１：３０
００希釈（Blotto 溶液中）のヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ抱合二次抗
体（Bio-Rad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）と一緒に１時間インキュベートした。展開前に、膜をＴ−ＴＢＳ中で更に４回洗浄後、３ｍｌのホスファターゼ基質溶液（Biorad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）と一緒に室温で５分間インキュベートした。次に、膜を
プラスチックで覆い、ｘ線フィルムに露出させた。野生型ヒトＩＬ−１３の既知のグリコシル化パターンと一致して、発現されたＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの電気泳動移動度は、ツニカマイシンの存在下で発現された場合に約５４ｋＤａのアミノ酸主鎖まで減少する、強くグリコシル化されたタンパク質を示している。
【００４１】
［００４２］ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインは、フィコエリトリン（ＰＥ）抱合抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合マウス抗ヒトＦｃ（ガンマ）フラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体でのトランスフェクタントのフローサイトメトリー分析によって証明されるように、ホモダイマーＩ型膜貫通タンパク質として細胞表面に移行する。図２。Jurkat ＩＬ１３ゼータカイン−ｐ
ＭＧトランスフェクタントを、細胞表面キメラレセプター発現の分析のために、抗ヒトＦｃ（ＦＩＴＣ）抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、リコンビナントヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、次に、Ｆ
ＩＴＣ抱合抗ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Sigma, St.Louis, MO）および抗ＩＬ１
３（ＰＥ）抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康ドナーの初代細胞も、ＦＩＴＣに抱合された抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲおよびイソタイプ対照モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各々の染色には、１０６個の細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ３および５μｌの抗体原液を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、そして二次抗体で染色するかまたは、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳCaliber サイトメーターで分析した。
【実施例４】
【００４２】
実施例４：ＩＬ１３Ｒα２レセプターへのＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの結合
［００４３］ヒトＩｇＧ４Ｆｃによって細胞膜に接着したＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）（すなわち、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン）は、可溶性ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ融合タン
パク質を用いたフローサイトメトリー分析によって評価されるように、その標的ＩＬ１３Ｒα２レセプターに結合することができる。図３。クローン化されたヒトＰＢＭＣ ＩＬ１３ゼータカイン−ｐＭＧトランスフェクタントは、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ発現ベクターをＰＢＭＣにエレクトロポレーション後、陽性トランスフェクタント１０７の選択および増大を行うことによって得た。ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローン細胞を、細胞表面キメラレセプター発現の分析のために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合マウス抗ヒトＦｃ（ガンマ）フラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、リコンビナントヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、次に、ＦＩＴＣ抱合抗ヒトＩ
ｇＧ１モノクローナル抗体（Sigma, St.Louis, MO）およびフィコエリトリン（ＰＥ）抱
合抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康ドナーの初代細胞も、ＦＩＴＣに抱合された抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲおよびイソタイプ対照モノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各々の染色には、１０６個の細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ３および５μｌの抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、そして二次抗体で染色するかまたは、１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳCaliber サイトメーターで分析した。
【００４３】
［００４４］次に、初代ヒトＴ細胞の代理抗原レセプターとしてのＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの免疫生物学を評価した。初代ヒトＴ細胞に、プラスミド発現ベクターをエレクトロポレーションした。陽性形質転換細胞を、ハイグロマイシンで選択し、制限希釈でクローン化後、ＯＫＴ３、ＩＬ−２および照射支持細胞での循環刺激サイクルによって増大させた。次に、ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳによってＩＬ−１３ゼータカイン発現を示したクローンを、４時間クロム放出検定において、種々のＩＬ−１３Ｒα２＋／ＣＤ２０−神経膠腫細胞系（Ｕ２５１，ＳＮ−Ｂ１９，Ｕ１３８）およびＩＬ１３α−／ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ球系（Daudi）に対する機能性評価を行った。これら試験は
、ＩＬ１３ゼータカインが、神経膠腫細胞に特異的であった細胞溶解活性を与えたということ（図４ａ）、およびこの特異的細胞溶解活性が、神経膠腫細胞についてクラスとして存在しているということ（図４ｂ）を示した。ＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧクローンの細胞溶解活性は、５１Ｃｒで標識されたＳＮ−Ｂ１９、Ｕ２５１およびＵ１３８神経膠腫細胞系（ＩＬ１３α２＋／ＣＤ２０−）および Daudi（ＣＤ２０＋／ＩＬ１３α２−）を標的として用いることによって検定した。ＭＪ−ＩＬ１３エフェクターを、刺激後８〜１２日目に検定した。エフェクターを採取し、洗浄し、検定用培地中に再懸濁させた。２．５ｘ１０５個、１．２５ｘ１０５個、２．５ｘ１０４個および５ｘ１０３個のエフェクターを、９６ウェルＶ底微量滴定プレート中において５ｘ１０３個の標的細胞と一緒に三重に、３７℃で４時間培養した。インキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μｌアリコートを採取し、その上澄み中の５１Ｃｒをγカウンターで検定した。特異的細胞溶解％は、次のように計算した。
【００４４】
【数１】
対照ウェルは、標的細胞単独の存在下でインキュベートされた標的細胞を含有した。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳの存在下において標識された標的細胞によって放出された５１Ｃｒを測定することによって決定した。約４０％のＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＴＣＲα／β＋リンパ球から成る安定してトランスフェクションされたヒトＴ細胞のバルク系統は、４時間クロム放出検定において、１３Ｒα２＋神経膠腫標的に特異的な再
支配された細胞溶解を示したが（２５：１のＥ：Ｔ比で＞５０％の特異的溶解）、ＩＬ−１３Ｒα２−標的に対しては無視しうる活性を示した（２５：１のＥ：Ｔ比で＜８％の特異的溶解）。抗ＩＬ−１３抗体への高レベル結合に基づいて選択されたＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＴＣＲα／β＋ＴＣＬクローンも、再支配されたＩＬ１３Ｒα２特異的神経膠腫細胞死滅を示す。図４ｂ。
【００４５】
［００４５］ＩＬ１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＴＣＬクローンは、培養物中の神経膠腫細胞によって刺激された場合に活性化し、増殖する。図５〜７。ＩＬ１３ゼータカインを発現するＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧ Ｃ１．Ｆ２反応細胞を、in vitro のＩＦＮγ、
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦα生産のレセプターに媒介される誘発（triggering）について評価した。２ｘ１０６個の反応細胞を、２４ウェル組織培養プレート中において２ｘ１０５個の照射刺激細胞（Daudi, Fibroblasts, Neuroblastoma １０ＨＴＢ、および神経膠芽細胞腫Ｕ２５１）と一緒に２ｍｌの全量で共培養した。遮断用ラット抗ヒトＩＬ１３モノクローナル抗体（Pharmingen, San Diego, CA）、リコンビナントヒトＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）およびＩＬ１３Ｒα２特異的ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）を、Ｕ２５１刺激細胞のアリコート（２ｘ１０５個／ｍｌ）に、１ｎ
ｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で加え、３０分後、反応細胞を加えた。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、その後、培養物上澄みを採取し、小分けし、−７０℃で貯蔵した。ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαについてのＥＬＩＳＡ検定は、Ｒ＆Ｄ Systems（Minneapolis, MN）キットを製造者の
取扱説明書によって用いて行った。試料は、未希釈の、または１：５または１：１０に希釈された二重ウェルで調べた。展開されたＥＬＩＳＡプレートを、マイクロプレートリーダーで評価し、サイトカイン濃度は、標準曲線からの外挿によって決定した。結果は、ピコグラム／ｍｌとして報告され、神経膠腫刺激細胞によるサイトカイン生産について強い活性化を示している。図５、図６。
【００４６】
［００４６］最後に、ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＴＣＬのＩＬ−２非依存増殖を、神経膠腫刺激細胞との共培養で認めたが（図７ａ）、ＩＬ１３Ｒα２刺激細胞では認められなかった。増殖は、ｒｈＩＬ−１３抗体の添加によって阻害され（図７ｂ）、認められた増殖が、ＩＬ１３Ｒα２神経膠腫細胞特異的レセプターへのゼータカインの結合に依存したということが示された。
【実施例５】
【００４７】
実施例５：治療的使用に適したＩＬ１３ゼータカイン＋Ｔ細胞の製造
［００４７］単核細胞を、ヘパリン化全血から、臨床等級 Ficoll（Pharmacia, Uppsula, Sweden）上での遠心分離によって分離する。ＰＢＭＣを滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
（Irvine Scientific）中で２回洗浄し、そしてＲＰＭＩ１６４０ＨＥＰＥＳ、１０％熱
失活ＦＣＳおよび４ｍＭ Ｌ−グルタミンから成る培地中に懸濁させる。患者ＰＢＭＣ中に存在するＴ細胞を、Orthoclone ＯＫＴ３の培養物（３０ｎｇ／ｍｌ）への添加によっ
てポリクローナル活性化する。次に、細胞培養物を、研究対象指定インキュベーター中において脱気されたＴ７５組織培養フラスコ中でインキュベートする。培養の開始後２４時間に、ｒｈＩＬ−２を２５Ｕ／ｍｌで加える。
【００４８】
［００４８］培養の開始後３日目に、ＰＢＭＣを採取し、遠心分離し、低張性エレクトロポレーション用緩衝液（Eppendorf）中に２０ｘ１０６個細胞／ｍｌで再懸濁させる。
実施例３による２５μｇのプラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧを、４００μｌの細胞懸濁液と一緒に、滅菌０．２ｃｍエレクトロポレーション用キュベットに加える。各々のキュベットに、２５０Ｖ／４０μｓの単一電気パルスを施し、再度ＲＴで１０分間インキュベートする。生存している細胞をキュベットから採取し、プールし、２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する培地中に再懸濁させる。フラスコを患者指定組織培養
インキュベーター中に入れる。エレクトロポレーション後３日目に、ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加える。エレクトロポレーションされたＰＢＭＣを、４８時間毎に培地およびＩＬ−２の補足を行いながら全１４日間培養する。
【００４９】
［００４９］エレクトロポレーションされたＯＫＴ３活性化患者ＰＢＭＣからのハイグロマイシン耐性ＣＤ８＋ＣＴＬのクローニングは、培養１４日目に開始する。簡単にいうと、生存しうる患者ＰＢＭＣを、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する２００ｍｌ容量の培地中の１００ｘ１０６個の低温保存された（cyropreserved）照射支持ＰＢＭＣおよび２０ｘ１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬの混合物に加える
。このマスターミックスを、各ウェルに０．２ｍｌが入る１０個の９６ウェルクローニング用プレート中にプレーティングする。プレートを、蒸発損失を減少させるようにアルミニウム箔で包み、患者指定組織培養インキュベーター中に入れる。培養１９日目、各ウェルに、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のためのハイグロマイシンを入れる。ウェルを、３０日目に細胞成長について倒立顕微鏡での可視化によって調べ、陽性ウェルに再刺激のための印を付ける。
【００５０】
［００５０］細胞成長のある各々のクローニングウェルの内容物を、個別に、２５ｍｌの組織培養培地中に５０ｘ１０６個の照射ＰＢＭＣ、１０ｘ１０６個の照射ＬＣＬおよび３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を含有するＴ２５フラスコに移す。再刺激後１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目および１３日目に、フラスコに５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２および１５ｍｌの新鮮培地を入れる。刺激サイクルの５日目に、フラスコに０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンも補足する。播種後１４日目に、細胞を採取し、計数し、そして５０ｍｌの組織培養培地中に１５０ｘ１０６個の照射ＰＢＭＣ、３０ｘ１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬおよび３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を含有するＴ７５フラスコ中で再刺激する。フラスコに、上に概説されるｒｈＩＬ−２およびハイグロマイシンの培養物への添加物を入れる。
【００５１】
［００５１］療法で可能性のある使用のための増大に選択されるＣＴＬを、ＣＲＢ−３００６に収容されるＦＡＣＳＣalibur での免疫蛍光法によって、ＦＩＴＣ抱合モノクロ
ーナル抗体ＷＴ／３１（ａβＴＣＲ）、Ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８）およびＯＫＴ４（ＣＤ４）を用いて分析して、必要なクローン表現型（αβＴＣＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋およびＩＬ１３＋）を確認する。臨床的使用のためのクローンの選択の判定基準には、イソタイプ対照ＦＩＴＣ／ＰＥ抱合抗体と比較される均一なＴＣＲαβ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋およびＩＬ１３＋が含まれる。プラスミドベクター染色体組込みの単一部位は、サザンブロット分析によって確認する。遺伝子修飾されたＴ細胞クローンからのＤＮＡは、プラスミドベクターに特異的なＤＮＡプローブでスクリーニングされるであろう。プラスミドベクター中のＨｙＴＫに特異的なプローブＤＮＡは、フルオレセイン抱合ｄＵＴＰでのランダムプライミングにより、製造者の取扱説明書（Amersham, Arlington Hts, IL）によって合
成する。Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを、標準的な技法によって単離する。Ｔ細胞クローンからの１０マイクログラムのゲノムＤＮＡを、３７℃で一晩消化後、０．８５％アガロースゲル上で電気泳動によって分離する。次に、ＤＮＡを、アルカリ性キャピラリー転移法を用いてナイロンフィルター（BioRad, Hercules, CA）に移す。フィルターとプローブとを、１０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Sigma）を含有する０．５Ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．
２、７％ＳＤＳ中において６５℃で一晩ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを、４０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ中において６５℃で４回洗浄後、化学発光ＡＰ抱合抗フルオレセイン抗体（Amersham, Arlington Hts, IL）を用いて可視化す
る。クローン選択の判定基準は、ベクターバンドに特有の単一バンドである。
【００５２】
［００５２］ＩＬ−１３ゼータカインの発現は、キメラレセプタータンパク質を抗ゼータ抗体で検出するウェスタンブロット法によって確認する。トランスフェクションされた
Ｔ細胞クローンの全細胞溶解産物は、１錠／１０ｍｌ Complete Protease Inhibitor Cocktail（Boehringer Mannheim）を含有する１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ，１％ＮＰ４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）中での２ｘ１０７個の洗浄された細胞の溶解によって生じる。氷上で８０分間インキュベーション後、遠心分離された全細胞溶解産物上澄みのアリコートを採取し、減圧条件下において等容量のローディング緩衝液中で沸騰させた後、成形済み１２％アクリルアミドゲル（BioRad）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。ニトロセルロースへの転移後、膜を、０．０７ｇｍ／ｍｌの脱脂粉乳を含有するブロット（blotto）溶液中で２時間ブロックする。膜を、Ｔ−ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０５％トゥイーン２０）中で洗浄後、１μｇ／ｍｌ濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体８Ｄ３（Pharmingen, San Diego, CA）と一緒に２時間インキュベートする。Ｔ−ＴＢＳ中で更に４回洗浄後、膜を、
１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ抱合二次抗体と一緒に１時間インキュベートする。展開前に、膜をＴ−ＴＢＳ中ですすぎ洗浄後、３０ｍｌの「ＡＫＰ」溶液（Promega, Madison, WI）で製造者の取扱説明書によって展開させる。クローン選択の判定基準は、キメラゼータバンドの存在である。
【００５３】
［００５３］ＩＬ−１３ゼータカインキメライムノレセプターを発現するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡに制限されない様式でキメラレセプターと細胞表面標的エピトープとの相互作用後、ヒト神経膠芽細胞腫標的細胞を認識し且つ溶解する。標的ＩＬ−１３Ｒα２エピトープ発現およびクラスＩ ＭＨＣ非依存認識のための必要条件は、各々のａβＴＣＲ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４−、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンを、ＩＬ−１３Ｒα２＋ Daudi 細胞トランスフェクタントおよびＩＬ−１３Ｒα２− Daudi 細胞に対して検定することによって確認されるであろう。Ｔ細胞エフェクターを、ＯＫＴ３で刺激後１２〜１４日目に検定する。エフェクターを採取し、洗浄し、検定用培地中に再懸濁させる。ＩＬ−１３Ｒα２を発現する Daudi 細胞トランスフェクタント。２．
５ｘ１０５個、１．２５ｘ１０５個、０．２５ｘ１０５個および０．０５ｘ１０５個のエフェクターを、Ｖ底微量滴定プレート（Costar, Cambridge, MA）中において５ｘ１０３
個の標的細胞と一緒に三重に３７℃で４時間プレーティングする。遠心分離およびインキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μＬアリコートを採取し、計数する。特異的細胞溶解％は、次のように計算する。
【００５４】
【数２】
対照ウェルは、検定用培地中でインキュベートされた標的細胞を含有する。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳで溶解された標的細胞の５１Ｃｒ含有量を測定することによって決定する。クローン選択の判定基準は、５：１のＥ：Ｔ比におけるＩＬ−１３Ｒα２＋ Daudi
トランスフェクタントの＞２５％の特異的溶解、および同じＥ：Ｔ比における親 Daudi の＜１０％の溶解である。
【００５５】
実施例６：ＩＬ−１３ゼータカイン発現性Ｔ細胞を用いたヒト神経膠腫の処置。
［００５４］ＩＬ−１３ＲゼータカインキメライムノレセプターおよびＨｙＴＫを発現するように実施例５によって遺伝子修飾されたＴ細胞クローンを、次について選択する。
【００５６】
ａ．フローサイトメトリーによって決定される細胞表面表現型ＴＣＲα／β＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＩＬ−１３＋。
ｂ．サザンブロットによって示される、染色体に組み込まれたプラスミドベクターＤＮＡの単コピーの存在。
【００５７】
ｃ．ウェスタンブロットによって検出されるＩＬ−１３ゼータカインタンパク質の発現。
ｄ．４時間クロム放出検定におけるヒトＩＬ−１３Ｒα２＋標的の特異的溶解。
【００５８】
ｅ．in vitro 成長についての外因性ＩＬ−２への依存。
ｆ．マイコプラズマ、真菌、細菌の無菌状態および＜５ＥＵ／ｍｌの内毒素レベル。
ｇ．ガンシクロビルへのクローンの in vitro 感受性。
【００５９】
［００５５］末梢血単核細胞は、患者から白血球搬出法によって、好ましくは、最初の切除手術から回復後およびステロイドの漸減および／またはそれらの最も最近の全身化学療法から少なくとも３週間の時点に得る。標的白血球搬出単核細胞収量は、５ｘ１０９個であり、ハイグロマイシン耐性細胞溶解性Ｔ細胞クローンの標的数は、ex vivo 増大のための全ての品質管理パラメーターを満たす少なくとも５個のクローンが識別されることを期待して２５である。クローンを低温保存し、そしてＸ線連続撮影および臨床検査によって患者を監視する。疾患進行の再発が示される場合、患者に、腫瘍切除腔にＴ細胞を供給するためのレザバー接近装置（Omaya レザバー）の配置および／または再切除を行う。外科手術からの回復およびステロイドの漸減後、適用可能ならば、その患者でＴ細胞療法を開始する。
【００６０】
［００５６］その患者に、少なくとも４回の１週間サイクルの療法を与える。最初のサイクル中、細胞用量上昇は、０日目に１０７個の初期細胞用量から、次に３日目の５ｘ１０７個、５日目の１０８個の標的用量まで続く。サイクル２は、サイクル１の開始から１週間程度の早期に開始する。ＭＲＩにおいて残存する疾患で腫瘍退行を示している患者には、サイクル３および４の後、１週間の残余／再実行の反復から成る７週目以降に開始する療法の追加のコースが与えられてよいが、但し、これら処置は、疾患進行またはＣＲが、Ｘ線撮影評価に基づいて得られるような時点まで充分に許容される（＜３度の最大毒性）という条件付きである。
【００６１】
［００５７］細胞用量は、類似した患者集団７５〜８５に供給される腔内ＬＡＫ細胞（１０９個までの個々の細胞用量および２．７５ｘ１０１０個程度に高い累積細胞数が安全に投与されている）、ex vivo 増大ＴＩＬ（最小毒性について報告される１０９個細胞／用量まで）およびアロ反応性リンパ球（累積細胞用量について１０８個の細胞用量で始めて５１．５ｘ１０８個まで）を用いた研究で与えられる用量未満の少なくとも対数である。このプロトコールで考えられるようなより低い細胞用量の根本的理由は、以前に利用されたエフェクター細胞集団の穏当な反応性プロフィールと比較して増加したＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンの in vitro 反応性／抗腫瘍力価に基づいている。低用量反復投薬は、単回多量細胞数点滴で生じるかもしれない潜在的に危険な炎症性応答を免れるのに好ましい。各々の注入は、単一Ｔ細胞クローンから成るであろう。同じクローンを、患者の処置コースの間中投与するであろう。Ｔ細胞投与の当日に、増大したクローンを、無菌的に、５０ｃｃのＰＢＳ中で２回洗浄することによって処理後、医薬用保存剤不含規定生理食塩水中に、患者供給用の細胞用量を２ｍｌで生じる容量で再懸濁させる。Ｔ細胞を５〜１０分間にわたって点滴する。２ｍｌのＰＦＮＳフラッシュは、Ｔ細胞後５分間にわたって投与するであろう。療法への応答は、脳ＭＲＩ＋／−ガンドリニウムにより、分光法で評価する。
【００６２】
［００５８］神経膠腫切除腔中へのＴ細胞投与について予想される副作用は、典型的には、自己限定性悪心および嘔吐、発熱、および既存の神経学的欠損の一時的悪化から成る。これら毒性は、分泌されたサイトカインの作用との組合せでＴ細胞によって媒介される腫瘍床中の局所炎症／水腫双方によることがありうる。これら副作用は、典型的には、一
時的であり且つII度未満の重症度である。たとえ患者が一層重症の毒性を経験するとしても、デカドロンは単独でまたはガンシクロビルとの組合せで、炎症過程を減衰させ且つ注入された細胞を除去するであろうと考えられる。細菌または真菌で汚染されている細胞製品の不注意による注入は、重篤なまたは生命を危うくする毒性を媒介する可能性がある。細胞製品の充分な注入前培養は、汚染された組織培養フラスコを識別し且つこの可能性を最小限にするために行う。再注入当日に、培養液のグラム染色、更には、内毒素レベルを実施する。
【００６３】
［００５９］ＩＬ−１３Ｒα２の発現についての充分な分子分析は、この分子が、ＣＮＳの場合４４；４６；４８；５４に腫瘍特異的であるということを示している。更に、実証可能なＩＬ−１３Ｒα２発現を含む唯一のヒト組織は、精巣であると考えられる４２。この発現の腫瘍精巣制限パターンは、種々のヒト癌、特に、黒色腫および腎細胞癌１０９〜１１１によって発現される腫瘍抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）の増加する数を連想させる。ワクチンおよび養子Ｔ細胞療法での臨床経験は、このクラスの抗原が、精巣の同時自己免疫攻撃を伴うことなく、全身腫瘍免疫療法に利用されうるということを示している１１２〜１１４。おそらくは、これは、無傷の血液精巣関門の作用および精巣内の免疫学的に特権的な環境を選択的に反映している。突然変異体ＩＬ−１３標的指向部分の申し分のない特異性にもかかわらず、毒性は、理論的には、細胞が全身循環中に充分な数で出て行き且つＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４βレセプターを発現する組織を認識する場合に可能性がある。この間接的な危険、更には、点滴されたＴ細胞が、ある患者では腫瘍床中の過剰すぎる炎症応答を媒介することがありうるという可能性を考慮して、ガンシクロビルでの in vivo 除去に感受性のＴ細胞を与えるＨｙＴＫ遺伝子をクローン
に装備する１１５〜１１８。ガンシクロビル自殺は、患者内Ｔ細胞用量上昇戦略との組合せで、可能性のある危険を最小限にして、関与するものを探求するのに役立つ。
【００６４】
［００６０］療法に関連した副作用（頭痛、発熱、悪寒、悪心等）には、その状態に適当な確立された処置を用いて対処する。処置している医師の意見で、患者をかなり医学的に危険にさせるいずれか新しい３度またはいずれか４度の処置関連毒性が認められる場合、その患者にガンシクロビルを与える。非経口投与されるガンシクロビルは、分割される１０ｍｇ／ｋｇ／日で１２時間毎に投与する。１４日間コースが処方されるであろうが、その時間間隔で症状の消散が得られないならば、延長してよい。ガンシクロビルでの処置は、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＨｙＴＫ＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの除去をもたらす。患者は、最初の７２時間のガンシクロビル療法のために監視する目的で入院すべきである。症状が４８時間以内にガンシクロビルに応答しない場合、コルチコステロイドおよびシクロスポリンが含まれるがこれに制限されるわけではない追加の免疫抑制薬を、処置している医師の判断で加えてよい。毒性が重症である場合、処置している医師の判断で、ガンシクロビルと一緒にデカドロンおよび／または他の免疫抑制薬を、より早期に用いる。
【００６５】
参考文献
【００６６】
【化１０】
【００６７】
【化１１】
【００６８】
【化１２】
【００６９】
【化１３】
【００７０】
【化１４】
【００７１】
【化１５】
【００７２】
【化１６】
【００７３】
【化１７】
【００７４】
【化１８】
【００７５】
【化１９】
【００７６】
【化２０】
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】［００１９］図１：ＩＬ１３ゼータカインキメライムノレセプターは、Jurkat Ｔ細胞中で無傷のグリコシル化タンパク質として発現されるということを示しているウェスタンブロットの結果。
【図２】［００２０］図２：発現されたＩＬ１３ゼータカインキメライムノレセプターは、Ｉ型膜貫通タンパク質として細胞表面に移行するということを示しているフローサイトメトリー分析の結果。
【図３】［００２１］図３：代表的な一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンの細胞表面表現型を示しているフローサイトメトリー分析の結果。
【図４Ａ】［００２２］図４：（ａ）ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンが、神経膠腫特異的な再支配された細胞溶解活性を獲得したことを示しているクロム放出検定の結果。
【図４Ｂ】図４：（ｂ）一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンによる抗神経膠腫細胞溶解活性のプロフィールは、神経膠腫細胞で一般的に認められたことを示しているクロム放出検定の結果。
【図５】［００２３］図５：ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、神経膠腫刺激性細胞によってサイトカイン生産について活性化されるということを示している、サイトカイン生産の in vitro 刺激の結果。
【図６】［００２４］図６：抗ＩＬ１３Ｒ ＭａｂおよびｒｈＩＬ１３によるサイトカイン生産についてのＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬ活性化の特異的阻害を示している、サイトカイン生産の in vitro 刺激の結果。
【図７Ａ】［００２５］図７：（ａ）ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞は、神経膠腫刺激物質との共培養で増殖するということを示している増殖研究の結果。
【図７Ｂ】図７：（ｂ）神経膠腫に刺激されたＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞増殖のｒｈＩＬ−１３による阻害を示している増殖研究の結果。
【図８Ａ】［００２６］図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図８Ｂ】図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図８Ｃ】図８：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧの構築のフローチャート。
【図９】［００２７］図９：ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧのプラスミド地図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメライムノレセプターであって、規定の順に配置された次の連結エレメント、
（ａ）可溶性レセプターリガンドを含む細胞外ドメイン、
（ｂ）該細胞外ドメインを細胞表面に接着することができる支持体領域、
（ｃ）膜貫通領域、および
（ｄ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメライムノレセプター。
【請求項２】
細胞外ドメインが、オートクリン増殖因子、パラクリン増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモンおよび遺伝子操作された人工低分子リガンドから成る群より選択される可溶性リガンドを含む、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項３】
支持体領域が、免疫グロブリンの定常領域、ＣＤ８および人工リンカーから成る群より選択される、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項４】
膜貫通領域が、白血球ＣＤマーカーの膜貫通ドメインである、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項５】
細胞内シグナリングドメインが、Ｔ細胞抗原複合体の細胞内レセプターシグナリングドメイン、ＦｃγＲIII共刺激ドメイン、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０およびＣＤ２から成る群よ
り選択される、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項６】
次の連結エレメント、
（ａ）ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、
（ｂ）ＩｇＧ４定常領域、
（ｃ）ＣＤ４膜貫通ドメイン、および
（ｄ）細胞内Ｔ細胞抗原レセプターＣＤ３複合体ゼータ鎖
を規定の順に含む、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項７】
イムノレセプターが、該イムノレセプターをコードしているＤＮＡ配列で形質転換されたＴリンパ球細胞系によって発現されている、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項８】
ヒト癌を処置する方法であって、癌に罹患しているヒトに、請求項１〜７のいずれかに記載のイムノレセプターを発現する複数の細胞を投与することを含み、ここにおいて、該イムノレセプターの可溶性レセプターリガンドが、癌特異的細胞表面レセプターに特異的である方法。
【請求項９】
癌特異的細胞表面レセプターがサイトカインレセプターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性レセプターリガンドがＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
キメライムノレセプターであって、規定の順に配置された次の連結エレメント、
（ａ）可溶性レセプターリガンドを含む細胞外ドメイン、
（ｂ）該細胞外ドメインを細胞表面に接着することができる支持体領域、
（ｃ）膜貫通領域、および
（ｄ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメライムノレセプター。
【請求項２】
細胞外ドメインが、オートクリン増殖因子、パラクリン増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモンおよび遺伝子操作された人工低分子リガンドから成る群より選択される可溶性リガンドを含む、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項３】
支持体領域が、免疫グロブリンの定常領域、ＣＤ８および人工リンカーから成る群より選択される、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項４】
膜貫通領域が、白血球ＣＤマーカーの膜貫通ドメインである、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項５】
細胞内シグナリングドメインが、Ｔ細胞抗原複合体の細胞内レセプターシグナリングドメイン、ＦｃγＲIII共刺激ドメイン、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０およびＣＤ２から成る群よ
り選択される、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項６】
次の連結エレメント、
（ａ）ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、
（ｂ）ＩｇＧ４定常領域、
（ｃ）ＣＤ４膜貫通ドメイン、および
（ｄ）細胞内Ｔ細胞抗原レセプターＣＤ３複合体ゼータ鎖
を規定の順に含む、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項７】
イムノレセプターが、該イムノレセプターをコードしているＤＮＡ配列で形質転換されたＴリンパ球細胞系によって発現されている、請求項１に記載のキメライムノレセプター。
【請求項８】
ヒト癌を処置する方法であって、癌に罹患しているヒトに、請求項１〜７のいずれかに記載のイムノレセプターを発現する複数の細胞を投与することを含み、ここにおいて、該イムノレセプターの可溶性レセプターリガンドが、癌特異的細胞表面レセプターに特異的である方法。
【請求項９】
癌特異的細胞表面レセプターがサイトカインレセプターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性レセプターリガンドがＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）である、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−４７５９１（Ｐ２０１０−４７５９１Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８３５８（Ｐ２００９−２３８３５８）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００２−５８５６１５（Ｐ２００２−５８５６１５）の分割
【原出願日】平成１４年４月３０日（２００２．４．３０）
【出願人】（５９８００４４２４）シティ・オブ・ホープ (15)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０−０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００２−５８５６１５（Ｐ２００２−５８５６１５）の分割
【原出願日】平成１４年４月３０日（２００２．４．３０）
【出願人】（５９８００４４２４）シティ・オブ・ホープ (15)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０−０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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