ヒト胚性幹細胞由来血管芽細胞からナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する方法
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法を提供する。本方法は、ヒト血管芽細胞を中間細胞として使用して、ＮＫ細胞およびＤＣを生成する。種々の実施形態では、本方法は、間質フィーダー層の使用を必要としない。種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化させることができる。他の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管芽細胞からナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）を生成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ各々明確に示されている場合と同程度にて、参照により本明細書に組み込まれる。以下の記述は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。それは、本明細書で提供されるいずれの情報についても、それが請求される本発明の先行技術であるかもしくはそれに関連するものであること、および明確にもしくは暗に参照されるいずれの刊行物についても、それが先行技術であること、を承認するものではない。
【０００３】
ヒトおよびマウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）を用いた研究は、血管芽細胞と呼ばれる、血管細胞系列（内皮および平滑筋細胞）および造血細胞系列の両方の共通前駆体を、培養中でＥＳＣ由来胚様体から産生することができることを示している。本発明者らのグループは、無血清および無間質条件下で、血管芽細胞を複数のｈＥＳＣ系統から効率的に再現性よく生成するための簡便な戦略を開発した。これは、再生医学において血管芽細胞の生産用途に重要である。以前の研究は、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞が赤血球および骨髄系列へと効果的に分化することができることを示しているが、免疫療法能力を有するものを含むリンパ系列細胞を産生するそれらの能力は、比較的わかっていない。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、リンパ系列から生じ、先天性免疫系の一部であり、あるタイプの腫瘍細胞を検出および死滅させることが見出されているため、抗癌療法で使用することができる。樹状細胞（ＤＣ）は、多くの場合骨髄系列から（単球から）生じ、適応免疫系の一部であり、抗原を提示するそれらの能力により抗原特異的免疫応答を増強し、未感作Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を刺激するため（例えば、ＤＣに基づくワクチン療法）に使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫療法能力を考慮すると、当該技術分野では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下の実施形態およびその態様は、例示および説明のためであることが意図される組成物および方法と合わせて記載および説明され、範囲を限定するものではない。
【０００７】
本発明の種々の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、メチルセルロース並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養すること；培養した細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成することを含む方法を提供する。
【０００８】
種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４２３６メチルセルロースであってもよい。他の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースであってもよい。
【０００９】
種々の実施形態では、ＩＬ２の濃度は、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ７は約５〜２０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ１５は約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＳＣＦは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００１０】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約６〜８日間であってもよい。種々の実施形態では、回収した細胞の培養は、約１４〜２１日間であってもよい。種々の実施形態では、本方法は、培地を週１回変更して、第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含んでいてもよい。
【００１１】
種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化させることができる。他の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化させることができる。
【００１２】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、未熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であってもよい。他の実施形態では、ＮＫ細胞は、成熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋であってもよい。
【００１３】
本発明の種々の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること；培養した細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫを生成することを含む方法を提供する。
【００１４】
種々の実施形態では、ＩＬ２の濃度は、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ７は約５〜２０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ１５は約５〜1０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＳＣＦは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００１５】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約６〜８日間であってもよい。種々の実施形態では、回収した細胞の培養は、約１４〜２１日間であってもよい。
【００１６】
種々の実施形態では、本方法は、培地を週１回変更して、第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含んでいてもよい。
【００１７】
種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化させることができる。他の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化させることができる。
【００１８】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、未熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であってもよい。他の実施形態では、ＮＫ細胞は、成熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋であってもよい。
【００１９】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００２０】
本発明の種々の実施形態は、樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養すること；液体培地にＩＬ４を添加すること；および血管芽細胞を更に培養してＤＣを生成することを含む方法を提供する。
【００２１】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約７〜１１日間であってもよい。種々の実施形態では、ＩＬ４を添加した後の血管芽細胞の培養は、約８〜１０日間であってもよい。
【００２２】
種々の実施形態では、本方法は、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、ＤＣの成熟化を誘導することを更に含んでいてもよい。種々の実施形態では、サイトカイン混合物は、約４８時間添加してもよい。種々の実施形態では、サイトカイン混合物は、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含んでいてもよい。
【００２３】
種々の実施形態では、本方法は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／またはＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含んでいてもよい。
【００２４】
種々の実施形態では、ＳＣＦの濃度は、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約５〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＧＭ−ＣＳＦは約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ４は約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。種々の実施形態では、ＩＬ１ｂの濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＴＮＦγは約１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。種々の実施形態では、ＰＧＥ２の濃度は、約１μｇ／ｍｌであってもよく、ＩＦＮα２ｂは約３０００単位／ｍｌであってもよく、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは約２０μｇ／ｍｌであってもよく、ＩＦＮγは約２０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００２５】
種々の実施形態では、ＤＣは、成熟ＤＣであってもよく、ＣＤ８３を発現してもよい。他の実施形態では、ＤＣは、成熟ＤＣであってもよく、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現は増加される。
【００２６】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成された樹状細胞（ＤＣ）細胞を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたＤＣをある量含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００２７】
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の実施形態の種々の特徴を例として説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２８】
代表的な実施形態を、参照図面で示す。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定のためではなく、説明のためのものとして見なされるべきであることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】血管芽細胞が、本発明の種々の実施形態により造血系列（Ａ〜Ｃ）および血管（Ｄ〜Ｆ）系列の両方を生じさせることができる二分化能前駆細胞であることを示す図である。
【図２】樹状細胞等の免疫療法能力を有する細胞を、本発明の種々の実施形態により血管芽細胞から分化させることができることを示す図である。Ａ．分化の２８日目の樹状細胞表面マーカー発現。Ｂ．成熟化サイトカインと４８時間接触させることにより、ＤＣ表面マーカー発現を増加させることができることを示す棒グラフ。Ｃ．ＤＣが３０分間のアッセイでＤＱ−オボアルブミン抗原を取り込み、プロセシングすることができることを示すヒストグラム。Ｄ．ＤＣのライト−ギムザ染色、２０×。E．ＤＣのライト−ギムザ染色、１００×。
【図３】リンパ誘導性サイトカインとの接触に際して、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞が、本発明の種々の実施形態により、無フィーダー培養系でＣＤ５６ｌｏｗ／ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を生じさせることができることを示す図である。Ａ．メチルセルロース培養中に、血管芽細胞のサブセットは、共通の白血球抗原、ＣＤ４５を獲得する。Ｂ．血管芽細胞を液体培養（ヒト血清およびサイトカイン混合物を含有する）に移すことにより、ＮＫ細胞マーカー、ＣＤ５６の獲得が可能になる。Ｃ．合計２８〜４０日間分化させた後のＣＤ５６ｌｏｗ／ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の出現。
【図４】古典的な５１Ｃｒ放出アッセイと同様に、細胞内フローサイトメトリーを使用して、本発明の種々の実施形態により、ＮＫ媒介性細胞傷害活性を評価することができることを示す図である。
【図５】血管芽細胞由来ＮＫエフェクター細胞が、本発明の実施形態により、標準的な４時間の共培養後にＫ５６２赤白血病標的細胞のアポトーシスを誘導することができることを示す図である。
【図６】本発明の実施形態によりＮＫ細胞を生成するプロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全内容が完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。それ以外の定義がなされない限りにおいて、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２００１）は、本出願に用いられる用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供するものである。
【００３１】
当業者であれば、本発明の実践に用いることが可能である本明細書で述べるものと類似または同等である多くの方法および物質を識別する。実際、本発明は、記載される方法および物質に限定されるものではまったくない。本発明の目的のために、以下の用語を次のように定義する。
【００３２】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して用いる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、複数の言及を含む。また、本明細書で用いる場合、「中で（ｉｎ）」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、「中で（ｉｎ）」および「上で（ｏｎ）」を含む。
【００３３】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）の用語は、当該技術分野で用いられるように本明細書において用いられる。この用語は、細胞系統として段階的に継代培養されたものを含む、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から得られる細胞を含む。ＥＳ細胞は、卵細胞と精子との受精から、さらにはＤＮＡ、核移植、単為生殖を用いて、またはＨＬＡ領域においてホモ接合性を有するＥＳ細胞を生成させる手段によって得られるものであってよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、雄性生殖、またはクロマチンの再プログラム化およびそれに続く細胞作製のための再プログラム化されたクロマチンの細胞膜への組み込みによって発生した接合体、卵割球、もしくは胚盤胞期哺乳類の胚から得られる細胞でもある。胚性幹細胞は、その作製源またはそれを作製するために用いられる特定の方法に関わらず、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞へ分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫不全動物へ移植された場合にテラトーマを発生させる能力、に基づいて識別することができる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「多能性幹細胞」の用語は、多能性幹細胞が得られる方法に関わらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および誘導多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、機能的に：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された場合にテラトーマを誘発する能力を有する；（ｂ）３つすべての胚葉の細胞型へ分化する能力を有する（例：外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞型に分化することができる）；ならびに（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例：Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐３表面抗原、ＳＳＥＡ‐４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ‐１‐６０、ＴＲＡ‐１‐８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）、幹細胞として定義される。代表的な多能性幹細胞は、例えば当該技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。代表的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚のＩＣＭから得られる胚性幹細胞、さらには卵割期または桑実胚期胚の１つ以上の卵割球から得られる胚性幹細胞（所望に応じて、胚の残り部分を破壊することなく行ってよい）が挙げられる。そのような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄性生殖を含む無性生殖的手段によって作製される胚性物質から生成してよい。さらなる代表的な多能性幹細胞としては、因子の組み合わせ（以降本明細書にて再プログラム化因子と称する）を発現することによる体細胞の再プログラム化によって生成される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、胎児（仔）、出生後、新生児（仔）、若齢、または成体の体細胞を用いて生成してよい。特定の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称される場合もある）、Ｓｏｘ２、ｃ‐Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせが挙げられる。他の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせが挙げられる。他の実施形態では、体細胞は、少なくとも２つの再プログラム化因子、少なくとも３つの再プログラム化因子、または４つの再プログラム化因子の発現により再プログラムされる。誘導多能性幹細胞は、ある組み合わせの再プログラム化因子を体細胞で発現させることより産生することができる。特定の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。誘導多能性幹細胞は、再プログラム化因子を体細胞にタンパク質形質導入することにより産生することができる。ある実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラムを成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。
【００３５】
他の実施形態では、さらなる再プログラム化因子が特定され、体細胞を多能性幹細胞に再プログラム化するために、単独でまたは１つ以上の既知の再プログラム化因子と組み合わせて使用される。誘導多能性幹細胞は、機能的に定義され、様々な方法（組込みベクター、非組込みベクター、化学的手段等）のいずれかを使用して再プログラム化されている細胞が含まれる。
【００３６】
多能性幹細胞は、いかなる種からのものであってもよい。胚性幹細胞は、例えば、マウス、非ヒト霊長類の複数の種、およびヒトで得ることに成功しており、胚性幹様細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ）は、数多くのさらなる種から生成されている。従って、当業者であれば、胚性幹細胞および胚由来幹細胞を、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３７】
同様に、ｉＰＳ細胞もいかなる種からのものであってもよい。これらのｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒト細胞を用いての生成に成功している。ｉＰＳ細胞は、胚、胎児（胎仔）、新生児（仔）、および成体組織を用いての生成に成功している。従って、ｉＰＳ細胞は、いかなる種からのドナー細胞を用いても容易に生成することができる。従って、ｉＰＳ細胞は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３８】
誘導多能性幹細胞は、出発点として、実質的にいかなる細胞発生段階のいかなる体細胞を用いて生成してもよい。例えば、細胞は、胚、胎児（仔）、新生児（仔）、若齢、または成体ドナーからのものであってよい。用いてよい代表的な体細胞としては、皮膚サンプルもしくは生検によって得られる皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞、または肺線維芽細胞が挙げられる。皮膚および頬は、容易に利用可能であり、簡単に入手可能である適切な細胞源を提供するが、実質的にいかなる細胞を用いてもよい。特定の実施形態では、体細胞は線維芽細胞ではない。
【００３９】
「血管芽細胞」および「血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ）」の用語は、本出願全体を通して交換可能に用いられる。これらの細胞は、数多くの構造的および機能的特徴を有する。これらの細胞の特徴の中で、宿主へ投与された場合に骨髄へ生着する能力がある。これらの細胞は、これらに限定されないが、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）、または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）がないこと、を含む数多くの構造的および機能的特性に基づいて説明することができる。血管コロニー形成細胞は、分化して、少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を発生させる能力を有する。好ましくは、血管コロニー形成細胞は、二分化能であり、分化して、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を発生させる能力を有する。従って、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単分化能であり、好ましくは二分化能である。しかし、加えて、血管コロニー形成細胞は、より高い度合いの発生能を有していてよく、特定の実施形態では、分化して、その他の系列の細胞型を発生させてよい。特定の実施形態では、血管コロニー形成細胞は、分化して、心臓細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞などのその他の中胚葉誘導体を発生させる能力を有する。
【００４０】
「非生着血管芽細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ）」または「非生着血管細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏ ｃｅｌｌｓ）」の用語は、本出願全体を通して、血管コロニー形成細胞の特徴の一部を共有する細胞の集団を意味するために用いられる。しかし、非生着血管細胞は、免疫不全宿主に投与された場合に骨髄へ生着しないという点で、区別することができる。この違いにも関わらず、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴および特性の１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有し得る。例えば、特定の実施形態では、非生着血管細胞は、互いに緩やかに接着している。他の実施形態では、非生着血管細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、の１つまたは２つ以上（２、３、４）を発現しない。理論に束縛されるものではないが、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞よりもある程度特殊化された独特の幹細胞集団を提供し得るが、それでも、一定範囲の造血細胞型を生成する能力を有する。
【００４１】
本発明者らは、ヒトＥＳＣから免疫療法能力を有する細胞を産生するための生体外培養系を開発した。この戦略は、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞を中間細胞供給源として使用することを伴うという点で従来技術と異なる。本発明者らは、無フィーダー培養条件を使用して、血管芽細胞の分化をナチュラルキラー（ＮＫ）および樹状細胞（ＤＣ）の両方に向けることができた。ＮＫ細胞は、リンパ系列から生じ、先天性免疫系の一部であり、あるタイプの腫瘍細胞を検出および死滅させることが見出されているため、抗癌療法で使用することができる。ＤＣは、多くの場合骨髄系列から（単球から）生じ、適応免疫系の一部であり、抗原を提示するそれらの能力により抗原特異的免疫応答を増強し、未感作Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を刺激するため（例えば、ＤＣに基づくワクチン療法）に使用することができる。
【００４２】
種々の活性化シグナルおよび阻害シグナル間の相互作用が、ＮＫ細胞の３つの主な機能を制御する。３つの主な機能とは、サイトカイン放出、ナチュラル細胞毒性、および抗体依存性細胞傷害性である。Ｈ７およびＨｕＥＳ−３ ｈＥＳＣ系統の両方から生成された血管芽細胞を使用して、本発明者らは、成熟ＣＤ５６ｌｏｗ／−、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を産生することができ、それらの産生は、間質フィーダー層の使用を必要としないことを見出した。この分化手順は、最初に４日間培養して胚様体を生成し、その後、血管芽細胞集団を産生および増殖させるための一組のサイトカインおよび成長因子で補完されたメチルセルロースで１０〜１４日間培養することを伴う。フローサイトメトリーで評価すると、ヒト血清およびサイトカイン混合物を加えた液体培養中でのさらなる１４〜２１日間は、ＮＫ細胞の分化を可能にする。５１Ｃｒ放出アッセイに類似した非放射能性細胞傷害性アッセイは、これら血管芽細胞由来ＮＫ細胞が、標準的な４時間の共培養後に、標的Ｋ５６２赤芽球性白血病細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができるため、ナチュラル細胞傷害性機能を内包することを示す。血管芽細胞を中間細胞供給源として使用することは、ｈＥＳＣが生体外で分化する能力および／または効率を増強し、重要なことには、免疫療法能力を有する細胞を産生するための無フィーダー系の開発を可能にすることができる。
【００４３】
本発明の実施形態は、リンパ系列細胞を生成する方法を提供する。種々の実施形態では、本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法を提供する。
【００４４】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞を生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、メチルセルロース並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬ上に播種し、培養すること；細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む液体培地に再播種／培養することを含む。
【００４５】
種々の実施形態では、液体培地は、週１回変更される。種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４２３６メチルセルロースである。他の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースである。種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、細胞の回収は、細胞を６〜８日間培養した後で行われる。種々の実施形態では、細胞は、再播種された後、更に１４〜２１日間培養される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００４６】
別の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびヒト血清を含む液体培地中で培養すること；細胞を回収すること；および回収した細胞を、ヒト血清、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む液体培地中で培養することを含む。
【００４７】
種々の実施形態では、液体培地は、週１回変更される。先述と同様に、種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、細胞の回収は、細胞を６〜８日間培養した後で行われる。種々の実施形態では、細胞は、再播種された後、更に１４〜２１日間培養される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００４８】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法により生成されたナチュラルキラー細胞を提供する。種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、本発明の方法により生成されたＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物に提供される。
【００４９】
本発明の他の実施形態は、樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法を提供する。１つの実施形態では、ＤＣを生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地に播種し培養すること；ＩＬ４を液体培地に添加すること；および細胞を更に培養することを含む。
【００５０】
他の実施形態では、本方法は、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、ＤＣの成熟化を誘導することを更に含む。さらなる実施形態では、サイトカイン混合物は、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む。他の実施形態では、本方法は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／またはＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含む。
【００５１】
種々の実施形態では、液体培地は、６〜７日毎に変更される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。種々の実施形態では、細胞は、７〜１１日間培養される。種々の実施形態では、細胞を７〜１１日間培養した後で、ＩＬ４を添加する。種々の実施形態では、細胞は、ＩＬ４を添加した後、更に８〜１０日間培養される。
【００５２】
種々の実施形態では、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦの濃度は、ヒト血清（１０〜２０％）、ＳＣＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭ−ＣＳＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）である。別の実施形態では、ＩＬ４の濃度は、５０〜１００ｎｇ／ｍｌである。種々の実施形態では、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６の濃度は、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ６（１５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、ｐｏｌｙ Ｉ；Ｃ、およびＩＦＮγの濃度は、ＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮα２ｂ（３０００単位／ｍｌ）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）である。
【００５３】
血管芽細胞から樹状細胞を産生する効率は比較的良好であるため、ＤＣを用いた将来的な研究は、新しい機能アッセイのための条件を最適化することおよび種々の新しい機能アッセイを開発することを含み得る。例えば、ＤＣ成熟化混合物を構成する成分の変更は、ＩＬ１２ｐ７０分泌アッセイを向上させる可能性がある。本発明者らは、現在６つの異なるサイトカインの混合物を成熟化に使用しているが、芽球由来ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生を刺激するためには、ＬＰＳおよび／またはＩＦＮγの添加が必要な場合がある。同様に、合成化合物、Ｓ−２８４６３は、ＩＬ１２ｐ７０産生およびＨＬＡ−ＤＲ発現の両方の増加を支援することができる。
【００５４】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法により生成された樹状細胞を提供する。種々の実施形態では、ＤＣは、本発明の方法により生成されたＤＣをある量含む薬学的に許容される組成物に提供される。
【００５５】
本発明の種々の実施形態では、血管芽細胞は、以下を含む方法により取得することができる：ｈＥＳＣを提供すること；サイトカインを含む培地中でｈＥＳＣを培養して、胚様体（ＥＢ）を生成すること；ＥＢを脱凝集すること；個々の細胞をろ過すること；個々の細胞を、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＦＬ、およびｂＦＧＦを含むメチルセルロースに接種すること；およびメチルセルロースから芽球様細胞を回収すること。
【００５６】
種々の実施形態では、ｈＥＳＣは、ＥＢを脱凝集する前に、まず４日間培養される。種々の実施形態では、胚様体を生成するためのサイトカインは、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４を含む。種々の実施形態では、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４は、ＥＢ形成の全体にわたって使用される。別の実施形態では、胚様体を生成するためのサイトカインは、ｂＦＧＦを更に含む。１つの実施形態では、ｂＦＧＦは、ｈＥＳＣ培養の最初の２日間の後に添加される。種々の実施形態では、ＥＢの脱凝集は、トリプシンを用いてＥＢを脱凝集し、その後、血清含有培地でトリプシンを不活化することを含む。１つの実施形態では、トリプシンは、０．０５％である。種々の実施形態では、個々の細胞のろ過は、４０μＭ細胞ストレーナーで個々の細胞をろ過することを含む。種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４４３６またはＨ４５３６メチルセルロースである。種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＴＰＯ（５０μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＬ（５０μｇ／ｍｌ）、およびｂＦＧＦ（２０〜５０μｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、芽球様細胞は、６日目〜１０日目にメチルセルロースから回収される。
【００５７】
ＮＫ細胞の生成に使用するための血管芽細胞の調製等の、特定の実施形態では、メチルセルロースは、さらなるサイトカインを含んでいてもよい。これらさらなるサイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。種々の実施形態では、これらサイトカインの濃度は、ＩＬ２（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（１〜２０μｇ／ｍｌ）、およびＩＬ１５（１〜１０μｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、メチルセルロース培養物は、５０，０００〜１５０，０００細胞／ｍｌの濃度で播種される。
【００５８】
特定の実施形態では、血管芽細胞は、無エリトロポイエチンメチルセルロース中で生成される。１つの実施形態では、無エリトロポイエチンメチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースである。
【００５９】
代替的な実施形態では、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞を含む）が、ｈＥＳＣの代りに使用される。他の実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００６０】
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０５０号および同ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０４３号は、双方ともに、２００９年５月６日に出願され、その全内容が完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、血管芽細胞および非生着血管芽細胞を生成する際の追加的な手引きを提供する。
【００６１】
種々の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明のナチュラルキル細胞または樹状細胞と共に薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に、安全であり、無毒であり、望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用並びにヒト医薬品使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合にはガス状であってもよい。
【００６２】
種々の実施形態では、本発明による医薬組成物は、任意の投与経路で送達するために製剤化することができる。「投与経路」は、当該技術分野で公知の任意の投与経路を指すことができ、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、または非経口が含まれるが、それらに限定されない。
【００６３】
「非経口」は、一般的に注射に関連する投与経路を指し、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管が含まれる。非経口経路では、組成物は、注入用または注射用の溶液または懸濁液の形態であってもよく、または凍結乾燥粉末としてでもよい。
【００６４】
また、本発明による医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体を含有することができる。「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、目的の化合物を、体内のある組織、器官、または部分から、体内の別の組織、器官、または部分に運搬または輸送することに関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、担体は、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料、またはそれらの組み合わせであってもよい。担体の各成分は、製剤の他の成分と適合しなければならないという点において、「薬学的に許容」されなければならない。また、担体の各成分は、それが接触する可能性がある任意の組織または器官と接触しての使用に好適でなければならず、その治療的有益性を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクをもたらしてはならないことを意味する。
【実施例】
【００６５】
以下の例は、特許請求されている発明をよりよく説明するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。特定の物質が言及される場合、それは例示目的に過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。当業者であれば、発明的な能力を行使せず、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発することができる。
【００６６】
実施例１
初期分化
両細胞タイプの初期分化手順は同じであり、胚様体（ＥＢ）を生成するために、サイトカインを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ社製）中でｈＥＳＣを４日間培養することを伴う。サイトカイン、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４を、ＥＢ培養の全体にわたって使用し、ｂＦＧＦを、最初の２日間の後に添加する。合計で４日後に、その結果生じたＥＢを、０．０５％トリプシンで脱凝集し、その後トリプシンを血清含有培地で不活化する。その後、個々の細胞を４０μＭ細胞ストレーナーでろ過し、計数し、ＴＰＯ（５０μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＬ（５０μｇ／ｍｌ）、およびｂＦＧＦ（２０〜５０μｇ／ｍｌ）等のさらなるサイトカインを含有するＨ４４３６またはＨ４５３６メチルセルロース（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に播種する。ＮＫ分化の場合、サイトカインＩＬ２（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（１〜２０μｇ／ｍｌ）、および／またはＩＬ１５（１〜１０μｇ／ｍｌ）を、この段階で添加することもできる。血管芽細胞集団を産生および増殖させるために、１ｍｌ当たり５０，０００〜１５０，０００細胞の濃度で、メチルセルロース培養物を播種する。芽球様細胞を、６〜１０日目にメチルセルロースから回収し、下記の手順のうちの１つにより更に分化させる。
【００６７】
実施例２
ＮＫ分化
芽球細胞は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を加えたＨ４２３６メチルセルロースに再播種してもよく、または同じサイトカインおよび１０〜２０％ヒト血清を含有する液体培養に再播種してもよい。６〜８日間の培養後、細胞を回収し、１０〜２０％ヒト血清並びにサイトカインＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた液体培地（αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２）に、更に１４〜２１日間再播種する。週１回の培地変更を使用して、サイトカイン混合物を新しくする。
【００６８】
フローサイトメトリーを分化手順の全体にわたって断続的に使用して、細胞の免疫表現型およびＮＫ細胞表面マーカーの獲得を評価する。細胞表面マーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、およびＣＤ４５ＲＡが含まれる。血管芽細胞由来ＮＫ細胞の機能を検査する試験には、以下が含まれる：（１）Ｋ５６２赤白血病標的細胞を使用したナチュラル細胞傷害アッセイ、（２）ＩＬ１２／ＩＬ１８またはフォルボールミリステートアセテート処理に応答したＩＦＮγ産生、（３）パーフォリンおよびグランザイムＢ酵素の存在に関する細胞内フローサイトメトリー、および（４）Ｒａｊｉ細胞および抗ＣＤ２０抗体を使用した抗体依存性細胞傷害アッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｔｙ ａｓｓａｙ）。
【００６９】
これまでのところ、本発明者らは、Ｈ７およびＨｕＥＳ３ ｈＥＳＣの両方からＮＫ細胞を生成することができた。５１Ｃｒ放出アッセイに類似する非放射能性細胞傷害性アッセイは、本発明者らの血管芽細胞由来ＮＫ細胞が、標準的な４時間の共培養後に、標的Ｋ５６２赤芽球性白血病細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができるため、ナチュラル細胞傷害性機能を内包することを示す。
【００７０】
実施例３
ＤＣ分化
芽球細胞を、１０〜２０％ヒト血清並びにサイトカイン、ＳＣＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭ−ＣＳＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた液体培地（αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２）に播種する。７〜１１日間の培養後、ＩＬ４（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）も培養物に添加し、細胞を更に８〜１０日間増殖させる。培地変更は、６〜７日毎に実施する。ＤＣの成熟化を誘導するために、さらなるサイトカイン混合物（１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１ｂ、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦγ、１５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ６）を、４８時間培養物に添加することができる。
【００７１】
フローサイトメトリーを分化手順の全体にわたって断続的に使用して、細胞の免疫表現型およびＤＣ表面マーカーの獲得を評価する。細胞表面マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＨＬＡ ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ１ａ、およびＣＤ１４が含まれる。成熟化は、Ｔ細胞共刺激受容体（ＣＤ８３）の獲得により評価するが、成熟化に際して、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、およびＣＤ１１ｃの発現も増加する場合がある。あるアッセイでは、１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２、３０００単位／ｍｌ ＩＦＮα２ｂ、２０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、またはＩＦＮγ ２０ｎｇ／ｍｌ等のさらなるサイトカインを、成熟化混合物に添加して、ＤＣ機能応答を増強することができる。血管芽細胞由来ＤＣの機能性に取り組むアッセイには、以下が含まれる：（１）ＤＱ−オボアルブミン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）処理による抗原取り込み、（２）化学誘引物質、ＭＩＰ−３ｂに応答したトランスウエル遊走、（３）ＨＬＡ不適合Ｔ細胞の増殖を増加させるＤＣの能力を決定するための同種異系混合リンパ球反応アッセイ、（４）ＤＣ刺激時のＩＬ１２−ｐ７０分泌、および（５）抗原負荷ＤＣが、以前に抗原で初回刺激を受けた末梢血単核細胞でＩＦＮγ産生を誘導することができるか否かを決定するための抗原提示アッセイ。
【００７２】
本発明者らは、ＨｕＥＳ３およびＭＡ０１ ｈＥＳＣの両方からＤＣ細胞を生成することができた。４８時間の成熟化サイトカイン混合物に応答して、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ２０９の上方制御が観察された。これらＤＣは、３０分間のアッセイで、ＤＱ−オボアルブミンを取り込み、タンパク質分解することができることが見出される。
【００７３】
実施例４
血管芽細胞増殖条件の変更
Ｈ４４３６メチルセルロースで増殖させた血管芽細胞を使用して、上記のＮＫおよびＤＣ分化手順を実施した。しかしながら、Ｈ４５３６、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の無エリトロポイエチンメチルセルロースを使用して、血管芽細胞を効率的に生成することもできる。これら「ｅｐｏマイナス」血管芽細胞は、元々の「ｅｐｏプラス」芽球と非常に類似しており、それらは、様々な造血細胞タイプおよび血管細胞タイプへと分化することが可能である。予備的な結果は、ＮＫ細胞およびＤＣを含む種々の造血系列へと血管芽細胞を分化させるためには、Ｈ４５３６の使用が、Ｈ４４３６メチルセルロースよりも著しい利点を提供することができることを示唆する。芽球増殖培地中にｅｐｏが存在しないことにより、赤血球マーカーＣＤ２３５ａを発現する細胞の割合を低減させ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ４１ａを発現する細胞の割合を増加させることが見出された。細胞表面マーカー発現におけるこの違いのため、「ｅｐｏ−マイナス」増殖条件は、骨髄系列および／またはリンパ系列への分化を増強することができる。
【００７４】
実施例５
ｉＰＳ細胞からのＭＫの生成
ＯＰ９共培養系を使用して、本発明者らは、ｉＰＳ細胞からＭＫを生成することができることを示す。数千個のＣＤ４１ａ＋ＭＫを、数十万個のｉＰＳ細胞から生成した。
【００７５】
実施例６
ヒトＥＳＣからのＮＫ細胞分化
分化手順を以下のように実施した：
Ｈ７ ＥＳＣを、胚様体（ＥＢ）へと４日間分化させた。ＥＢを回収し、血管芽細胞を産生および増殖させるために、サイトカイン豊富なメチルセルロースに１０〜１５日間移した。血管芽細胞を回収し、１０〜２０％ヒトＡＢ血清を加えた無フィーダー液体培地に一群のサイトカインと共に更に１４〜１７日間配置し、３〜４日毎に培地を半分変更した。
免疫表現型検査（フローサイトメトリーを使用）：
未熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１６ｌｏ、ＫＩＲｌｏ、ＣＤ１１７＋、ＣＤ９４−、ＮＫＧ２Ｄ＋だった。上記の手順の変法を使用することにより、３２日間の分化後の生細胞の２０〜３０％が、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−だった。成熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６ｈｉ、ＫＩＲｈｉ、ＣＤ１１７ｌｏ／−、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋だった。上記の手順を使用することにより、３１日間の分化後の生細胞の２０％が、ＣＤ５６−ＣＤ１６＋であり、それらの５％が、ＣＤ５６ｌｏＣＤ１６＋だった。
【００７６】
機能アッセイ：
ナチュラル細胞傷害性：成熟ＮＫ細胞は、ヒトＫ５６２赤白血病細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｕ８７細胞、ＰＣ３細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞等の標的細胞のアポトーシスを誘発することができる。「３ＦＣ」アッセイを使用して、細胞傷害性の効率を評価する。このアッセイは、５１Ｃｒ放出アッセイと類似しているが、放射能を必要としない。Ｄｅｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ７８： ３５−３９ （２００１）を参照されたい。上述の成熟ＮＫ細胞の異種性集団（アイテムＢ２−ａ）が、標準的な４時間の実験で６５〜７０％のＫ５６２細胞にアポトーシスを誘発することが見出された。
【００７７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）：ＮＫ細胞表面のＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、標的細胞に結合された抗ＣＤ２０抗体のｆｃ領域に結合し、ＡＤＣＣを誘導する。Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）に由来する）を抗ＣＤ２０抗体と共にプレインキュベートし、ＡＤＣＣアッセイでの標的として使用する。（Ｔｓｉｒｉｇｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏ １０８： ２６７−２７１ （２００８））。
【００７８】
ＩＦＮγサイトカイン産生：未熟ＮＫ細胞は、イオノマイシンまたはＩＬ１２を加え、ＩＬ１８を加えたＰＭＡ（フォルボールミリステートアセテート）による一晩の処理に応答して、大量のＩＦＮγを産生する。ＩＦＮγ分泌をブレフェルジンａで阻止し、細胞内フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーおよびＩＦＮγについて細胞を染色する。Ｗｏｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５： ５０９５−５１０３ （２００５）を参照されたい。
【００７９】
異種移植マウスモデルを使用したＮＫ細胞の生体内免疫療法能力：生物発光（ルシフェラーゼ含有）Ｋ５６２細胞を、腫瘍生着用のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射し、その後ＮＫ細胞のボーラス並びにＩＬ２およびＩＬ１５の１日１回のＩＰ注射を行う。生物発光画像診断を使用して、生体内ＮＫ免疫療法能力を経時的にモニターする。Ｗｏｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １１３ （２４）： ６０９４−６１０１ （２００９）を参照されたい。
【００８０】
実施例７
血管芽細胞を骨髄再増殖細胞として使用することにより、またはそれらを樹状突起細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、および／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）へと分化させることにより、本発明者らは、癌、ＨＩＶ、および／または自己免疫疾患（ａｕｔｏｍｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）と闘うための大規模で効果的な細胞に基づく療法を生み出すことができる。本発明者らは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の両方からの樹状細胞（ＤＣ）の分化を、４０〜５５％の効率で達成することができた。２つの新しい機能アッセイに加えて、ヒト骨髄に由来するＤＣと対照比較することにより、今や、ｈＥＳＣ由来ＤＣが、多くの同様な特徴をヒトＢＭ由来ＤＣと共有していることが確認され、さらなる最適化を必要とする分野も特定された。ナチュラルキラー細胞分化の場合、ヒト骨髄由来ＮＫ細胞と対照比較することにより、骨髄細胞供給源を使用した場合さえ、生体外ＮＫ細胞分化が、あまり効率的ではないことが確認された。本発明者らは、芽球由来ＮＫ細胞が、ナチュラル細胞傷害性能力を示すことを見出した。抗体依存性細胞傷害アッセイを実施する。Ｔ細胞分化の場合、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激するためにヒトデルタリガンド発現ＯＰ９間質細胞系統の生成することに成功し、血管芽細胞のＴ細胞分化を刺激するために、この間質細胞系統を使用している。
【００８１】
血管芽細胞由来樹状細胞（４０〜５５％効率）
細胞表面マーカー：ＣＤ１１ｃ、４５、２０９は、芽球由来ＤＣおよびヒト骨髄由来ＤＣでは同様の発現を示すが、ＨＬＡ−ＤＲは、芽球ＤＣでは、ヒトＢＭ ＤＣよりもはるかに低いレベルで発現される。
【００８２】
機能アッセイ（抗原取り込みおよび遊走アッセイについて以前に報告されている）。 ＩＬ１２−ｐ７０分泌：ＩＬ１２ｐ７０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｈ１指向性応答を誘発するために、成熟ＤＣにより分泌される。ヒトＢＭ由来ＤＣは、５００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＬ１２ｐ７０を産生することができるが、芽球由来ＤＣは、成熟化時に検出可能なＩＬ１２ｐ７０を産生しなかった。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ：ＭＬＲアッセイは、同種異系Ｔ細胞の増殖を刺激するＤＣの能力を決定する。臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ、これはＴ細胞を含む）を応答物として使用し、蛍光標識し、それらの増殖を、未熟または成熟芽球由来ＤＣと共に４〜５日間共培養した後で測定した。予備的な結果は、レスポンダー細胞が、成熟（ｍ）ＤＣに応答して増殖することを示す。
【００８３】
血管芽細胞由来ナチュラルキラー細胞：細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ９４、ＣＤ５６、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄを、芽球由来およびヒト骨髄由来ＮＫ細胞で評価した。
【００８４】
ＮＫ分化効率：組換えヒトＳｏｘ７タンパク質を、ＮＫ分化の前駆体から始めて、ＣＤ３４＋の貯留を増加させるその能力について調査されていた。結果は、ｒｈＳｏｘ７が、ＣＤ３４＋細胞の％に劇的な影響を及ぼさないことを示唆する。重要な細胞間接触およびＮＫ細胞分化の分泌因子を提供することができる間質フィーダー層として、マウスＡＦＴ０２４を調査した。細胞表面マーカー発現により示されたように、ＡＦＴ０２４間質共培養は、ヒトＢＭまたは芽球のＮＫ分化をいずれも増強しなかった。
【００８５】
血管芽細胞由来Ｔ細胞：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｔ細胞分化にとって重要である。そのため、ヒトデルタ様リガンド１（ｈＤＬＬ１）のｃＤＮＡを、ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰに基づくレトロウイルスベクターにクローニングし、その結果生じたウイルス上清を使用して、ＯＰ９間質細胞を感染させた。ウイルスが組み込まれると、ＯＰ９細胞は、それらの細胞表面にｈＤＬＬ１を発現し、ｇｆｐ陽性になるだろう。ＦＡＣＳに基づく選別を使用して、感染ＯＰ９細胞の異種性貯留から最も高いｇｆｐ陽性の細胞を精製した。これらＯＰ９−ｈＤＬ１Ｓ（選別では「Ｓ」）を増殖させ、特徴付けした。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光法、およびフローサイトメトリーは全て、これら細胞でのｈＤＬＬ１タンパク質の発現を確認する。
【００８６】
実施例８
臍帯血および末梢血単核細胞は両方とも、レスポンダーとして使用される。本発明者らは、陽性対照エフェクターとしてヒト骨髄由来ＤＣを使用する。
【００８７】
Ｅ４ＢＰ４は、ＮＫ系列発生にとって重要であることが示されており（Ｇａｓｃｏｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０（１０）： １１１８−１１２５， ２００９を参照）、生体外でのより高い効率に必要な転写プログラムを提供することができる。
【００８８】
ＮＫ細胞分化。本発明者らは、Ｅ４ＢＰ４ ｃＤＮＡを、血管芽細胞でそれを過剰発現するためにレトロウイルスベクターにクローニングし、ＮＫ分化を増加させるその能力を評価する。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＮＫ細胞機能に重要である種々のＫＩＲ受容体アイソフォーム、並びに酵素、パーフォリンおよびグランザイムＢの発現をモニターする。機能アッセイの場合、本発明者らは、芽球由来ＮＫ細胞が、ナチュラル細胞傷害性を示すことを示した。従って、芽球由来ＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）能力を評価する。ＡＤＣＣアッセイに必要な試薬には、バーキットリンパ腫由来Ｒａｊｉ細胞および抗ＣＤ２０抗体が含まれる。ＣＤ２０表示Ｒａｊｉ細胞とＮＫ細胞との共培養は、特異的ＡＤＣＣ応答を誘発するはずであり、それは、フローサイトメトリー手段でモニターされるだろう。
【００８９】
ＮＫ参考文献：
１． Ｗｏｌｌ， Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １７５： ５０９５−５１０３ （２００５）．
２． Ｗｏｌｌ， Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ１１３（２４）： ６０９４−１０１ （２００９）．
３． Ｂｏｒｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９： １５０８−１５１６ （２００４）．
４． Ｔａｂａｔｏａｂａｅｉ−Ｚａｖａｒｅｈ ｅｔ ａｌ． ＰＬＯＳ Ｏｎｅ Ｉｓｓｕｅ ２， ｅ２３２ （２００７）．
５． ＭｃＣｕｌｌａｒ， Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３６（５）： ５９８−６０８ （２００８）．
６． Ｆｒｅｕｄ， ＡＧ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：２９５−３０４ （２００５）．
７． Ｙｕ， Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９２ （１０）： ３６４７−３６５７ （１９９８）．
【００９０】
ＤＣ文献：
１． Ｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（１９）： ６２０７−６２１７ （２００８）．
２． Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（４）： ５１３−５２６ （２００９）．
３． Ｂａｎｄｉ ｅｔ ａｌ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１ （２００８）． （ｏｐｅｎ−ａｃｃｅｓｓ）
４． Ｓｌｕｋｖｉｎ， ＩＩ ｅｔ ａｌ． Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６： ２９２４−２９３２ （２００６）．
【００９１】
本発明の種々の実施形態が、発明を実施するための形態に記述されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接記述するが、当業者であれば、本明細書に表示および記述されている特定の実施形態の改変および／または変異を想起することができることが理解される。本説明の範囲以内にあるあらゆるそのような改変または変異も同様に本説明の範囲に含まれることが意図される。特別な注記がない限り、本明細書および特許請求の範囲にある単語および語句には、該当する技術分野（複数可）の当業者にとって通常の習慣的な意味が与えられることが、本発明者らの意図である。
【００９２】
本出願の出願時に出願者に知られている本発明の種々の実施形態の先述の説明が示されており、それは、例示および説明のためであることが意図されている。本説明は、網羅的であることも、開示された詳細な形態に本発明を限定することも意図されておらず、上記の教示に照らして多数の改変および変異が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理およびその実用的応用を説明し、他の当業者が、企図した特定の使用に好適なように種々の改変を施して、本発明を種々の実施形態で使用することを可能にする役目を果たす。従って、本発明は、本発明を実施するための開示された特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【００９３】
本発明の特定の実施形態が表示および記述されているが、当業者であれば、本明細書の教示に基づき、本発明およびそのより広範な態様から逸脱せずに変更および改変を為すことができることは明らかであり、従って添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨および範囲内にあるそのような変更および改変を全て、それらの範囲に包含することになる。本明細書で使用されている用語は、一般的に「非限定的」な用語であると意図されていることが、当業者により一般的に理解されるだろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「〜を少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきである等）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管芽細胞からナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）を生成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ各々明確に示されている場合と同程度にて、参照により本明細書に組み込まれる。以下の記述は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。それは、本明細書で提供されるいずれの情報についても、それが請求される本発明の先行技術であるかもしくはそれに関連するものであること、および明確にもしくは暗に参照されるいずれの刊行物についても、それが先行技術であること、を承認するものではない。
【０００３】
ヒトおよびマウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）を用いた研究は、血管芽細胞と呼ばれる、血管細胞系列（内皮および平滑筋細胞）および造血細胞系列の両方の共通前駆体を、培養中でＥＳＣ由来胚様体から産生することができることを示している。本発明者らのグループは、無血清および無間質条件下で、血管芽細胞を複数のｈＥＳＣ系統から効率的に再現性よく生成するための簡便な戦略を開発した。これは、再生医学において血管芽細胞の生産用途に重要である。以前の研究は、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞が赤血球および骨髄系列へと効果的に分化することができることを示しているが、免疫療法能力を有するものを含むリンパ系列細胞を産生するそれらの能力は、比較的わかっていない。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、リンパ系列から生じ、先天性免疫系の一部であり、あるタイプの腫瘍細胞を検出および死滅させることが見出されているため、抗癌療法で使用することができる。樹状細胞（ＤＣ）は、多くの場合骨髄系列から（単球から）生じ、適応免疫系の一部であり、抗原を提示するそれらの能力により抗原特異的免疫応答を増強し、未感作Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を刺激するため（例えば、ＤＣに基づくワクチン療法）に使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫療法能力を考慮すると、当該技術分野では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下の実施形態およびその態様は、例示および説明のためであることが意図される組成物および方法と合わせて記載および説明され、範囲を限定するものではない。
【０００７】
本発明の種々の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、メチルセルロース並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養すること；培養した細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成することを含む方法を提供する。
【０００８】
種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４２３６メチルセルロースであってもよい。他の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースであってもよい。
【０００９】
種々の実施形態では、ＩＬ２の濃度は、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ７は約５〜２０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ１５は約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＳＣＦは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００１０】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約６〜８日間であってもよい。種々の実施形態では、回収した細胞の培養は、約１４〜２１日間であってもよい。種々の実施形態では、本方法は、培地を週１回変更して、第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含んでいてもよい。
【００１１】
種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化させることができる。他の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化させることができる。
【００１２】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、未熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であってもよい。他の実施形態では、ＮＫ細胞は、成熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋であってもよい。
【００１３】
本発明の種々の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること；培養した細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫを生成することを含む方法を提供する。
【００１４】
種々の実施形態では、ＩＬ２の濃度は、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ７は約５〜２０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ１５は約５〜1０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＳＣＦは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００１５】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約６〜８日間であってもよい。種々の実施形態では、回収した細胞の培養は、約１４〜２１日間であってもよい。
【００１６】
種々の実施形態では、本方法は、培地を週１回変更して、第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含んでいてもよい。
【００１７】
種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化させることができる。他の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化させることができる。
【００１８】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、未熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であってもよい。他の実施形態では、ＮＫ細胞は、成熟ＮＫ細胞であってもよく、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋であってもよい。
【００１９】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００２０】
本発明の種々の実施形態は、樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養すること；液体培地にＩＬ４を添加すること；および血管芽細胞を更に培養してＤＣを生成することを含む方法を提供する。
【００２１】
種々の実施形態では、血管芽細胞の培養は、約７〜１１日間であってもよい。種々の実施形態では、ＩＬ４を添加した後の血管芽細胞の培養は、約８〜１０日間であってもよい。
【００２２】
種々の実施形態では、本方法は、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、ＤＣの成熟化を誘導することを更に含んでいてもよい。種々の実施形態では、サイトカイン混合物は、約４８時間添加してもよい。種々の実施形態では、サイトカイン混合物は、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含んでいてもよい。
【００２３】
種々の実施形態では、本方法は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／またはＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含んでいてもよい。
【００２４】
種々の実施形態では、ＳＣＦの濃度は、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ３は約５〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＧＭ−ＣＳＦは約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ４は約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。種々の実施形態では、ＩＬ１ｂの濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＴＮＦγは約１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、ＩＬ６は約１５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。種々の実施形態では、ＰＧＥ２の濃度は、約１μｇ／ｍｌであってもよく、ＩＦＮα２ｂは約３０００単位／ｍｌであってもよく、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは約２０μｇ／ｍｌであってもよく、ＩＦＮγは約２０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００２５】
種々の実施形態では、ＤＣは、成熟ＤＣであってもよく、ＣＤ８３を発現してもよい。他の実施形態では、ＤＣは、成熟ＤＣであってもよく、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現は増加される。
【００２６】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成された樹状細胞（ＤＣ）細胞を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたＤＣをある量含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００２７】
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の実施形態の種々の特徴を例として説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２８】
代表的な実施形態を、参照図面で示す。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定のためではなく、説明のためのものとして見なされるべきであることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】血管芽細胞が、本発明の種々の実施形態により造血系列（Ａ〜Ｃ）および血管（Ｄ〜Ｆ）系列の両方を生じさせることができる二分化能前駆細胞であることを示す図である。
【図２】樹状細胞等の免疫療法能力を有する細胞を、本発明の種々の実施形態により血管芽細胞から分化させることができることを示す図である。Ａ．分化の２８日目の樹状細胞表面マーカー発現。Ｂ．成熟化サイトカインと４８時間接触させることにより、ＤＣ表面マーカー発現を増加させることができることを示す棒グラフ。Ｃ．ＤＣが３０分間のアッセイでＤＱ−オボアルブミン抗原を取り込み、プロセシングすることができることを示すヒストグラム。Ｄ．ＤＣのライト−ギムザ染色、２０×。E．ＤＣのライト−ギムザ染色、１００×。
【図３】リンパ誘導性サイトカインとの接触に際して、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞が、本発明の種々の実施形態により、無フィーダー培養系でＣＤ５６ｌｏｗ／ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を生じさせることができることを示す図である。Ａ．メチルセルロース培養中に、血管芽細胞のサブセットは、共通の白血球抗原、ＣＤ４５を獲得する。Ｂ．血管芽細胞を液体培養（ヒト血清およびサイトカイン混合物を含有する）に移すことにより、ＮＫ細胞マーカー、ＣＤ５６の獲得が可能になる。Ｃ．合計２８〜４０日間分化させた後のＣＤ５６ｌｏｗ／ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の出現。
【図４】古典的な５１Ｃｒ放出アッセイと同様に、細胞内フローサイトメトリーを使用して、本発明の種々の実施形態により、ＮＫ媒介性細胞傷害活性を評価することができることを示す図である。
【図５】血管芽細胞由来ＮＫエフェクター細胞が、本発明の実施形態により、標準的な４時間の共培養後にＫ５６２赤白血病標的細胞のアポトーシスを誘導することができることを示す図である。
【図６】本発明の実施形態によりＮＫ細胞を生成するプロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全内容が完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。それ以外の定義がなされない限りにおいて、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２００１）は、本出願に用いられる用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供するものである。
【００３１】
当業者であれば、本発明の実践に用いることが可能である本明細書で述べるものと類似または同等である多くの方法および物質を識別する。実際、本発明は、記載される方法および物質に限定されるものではまったくない。本発明の目的のために、以下の用語を次のように定義する。
【００３２】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して用いる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、複数の言及を含む。また、本明細書で用いる場合、「中で（ｉｎ）」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、「中で（ｉｎ）」および「上で（ｏｎ）」を含む。
【００３３】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）の用語は、当該技術分野で用いられるように本明細書において用いられる。この用語は、細胞系統として段階的に継代培養されたものを含む、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から得られる細胞を含む。ＥＳ細胞は、卵細胞と精子との受精から、さらにはＤＮＡ、核移植、単為生殖を用いて、またはＨＬＡ領域においてホモ接合性を有するＥＳ細胞を生成させる手段によって得られるものであってよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、雄性生殖、またはクロマチンの再プログラム化およびそれに続く細胞作製のための再プログラム化されたクロマチンの細胞膜への組み込みによって発生した接合体、卵割球、もしくは胚盤胞期哺乳類の胚から得られる細胞でもある。胚性幹細胞は、その作製源またはそれを作製するために用いられる特定の方法に関わらず、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞へ分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫不全動物へ移植された場合にテラトーマを発生させる能力、に基づいて識別することができる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「多能性幹細胞」の用語は、多能性幹細胞が得られる方法に関わらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および誘導多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、機能的に：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された場合にテラトーマを誘発する能力を有する；（ｂ）３つすべての胚葉の細胞型へ分化する能力を有する（例：外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞型に分化することができる）；ならびに（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例：Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐３表面抗原、ＳＳＥＡ‐４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ‐１‐６０、ＴＲＡ‐１‐８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）、幹細胞として定義される。代表的な多能性幹細胞は、例えば当該技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。代表的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚のＩＣＭから得られる胚性幹細胞、さらには卵割期または桑実胚期胚の１つ以上の卵割球から得られる胚性幹細胞（所望に応じて、胚の残り部分を破壊することなく行ってよい）が挙げられる。そのような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄性生殖を含む無性生殖的手段によって作製される胚性物質から生成してよい。さらなる代表的な多能性幹細胞としては、因子の組み合わせ（以降本明細書にて再プログラム化因子と称する）を発現することによる体細胞の再プログラム化によって生成される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、胎児（仔）、出生後、新生児（仔）、若齢、または成体の体細胞を用いて生成してよい。特定の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称される場合もある）、Ｓｏｘ２、ｃ‐Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせが挙げられる。他の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせが挙げられる。他の実施形態では、体細胞は、少なくとも２つの再プログラム化因子、少なくとも３つの再プログラム化因子、または４つの再プログラム化因子の発現により再プログラムされる。誘導多能性幹細胞は、ある組み合わせの再プログラム化因子を体細胞で発現させることより産生することができる。特定の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。誘導多能性幹細胞は、再プログラム化因子を体細胞にタンパク質形質導入することにより産生することができる。ある実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラムを成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化タンパク質が、体細胞に形質導入される。
【００３５】
他の実施形態では、さらなる再プログラム化因子が特定され、体細胞を多能性幹細胞に再プログラム化するために、単独でまたは１つ以上の既知の再プログラム化因子と組み合わせて使用される。誘導多能性幹細胞は、機能的に定義され、様々な方法（組込みベクター、非組込みベクター、化学的手段等）のいずれかを使用して再プログラム化されている細胞が含まれる。
【００３６】
多能性幹細胞は、いかなる種からのものであってもよい。胚性幹細胞は、例えば、マウス、非ヒト霊長類の複数の種、およびヒトで得ることに成功しており、胚性幹様細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ）は、数多くのさらなる種から生成されている。従って、当業者であれば、胚性幹細胞および胚由来幹細胞を、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３７】
同様に、ｉＰＳ細胞もいかなる種からのものであってもよい。これらのｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒト細胞を用いての生成に成功している。ｉＰＳ細胞は、胚、胎児（胎仔）、新生児（仔）、および成体組織を用いての生成に成功している。従って、ｉＰＳ細胞は、いかなる種からのドナー細胞を用いても容易に生成することができる。従って、ｉＰＳ細胞は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３８】
誘導多能性幹細胞は、出発点として、実質的にいかなる細胞発生段階のいかなる体細胞を用いて生成してもよい。例えば、細胞は、胚、胎児（仔）、新生児（仔）、若齢、または成体ドナーからのものであってよい。用いてよい代表的な体細胞としては、皮膚サンプルもしくは生検によって得られる皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞、または肺線維芽細胞が挙げられる。皮膚および頬は、容易に利用可能であり、簡単に入手可能である適切な細胞源を提供するが、実質的にいかなる細胞を用いてもよい。特定の実施形態では、体細胞は線維芽細胞ではない。
【００３９】
「血管芽細胞」および「血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ）」の用語は、本出願全体を通して交換可能に用いられる。これらの細胞は、数多くの構造的および機能的特徴を有する。これらの細胞の特徴の中で、宿主へ投与された場合に骨髄へ生着する能力がある。これらの細胞は、これらに限定されないが、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）、または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）がないこと、を含む数多くの構造的および機能的特性に基づいて説明することができる。血管コロニー形成細胞は、分化して、少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を発生させる能力を有する。好ましくは、血管コロニー形成細胞は、二分化能であり、分化して、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を発生させる能力を有する。従って、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単分化能であり、好ましくは二分化能である。しかし、加えて、血管コロニー形成細胞は、より高い度合いの発生能を有していてよく、特定の実施形態では、分化して、その他の系列の細胞型を発生させてよい。特定の実施形態では、血管コロニー形成細胞は、分化して、心臓細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞などのその他の中胚葉誘導体を発生させる能力を有する。
【００４０】
「非生着血管芽細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ）」または「非生着血管細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏ ｃｅｌｌｓ）」の用語は、本出願全体を通して、血管コロニー形成細胞の特徴の一部を共有する細胞の集団を意味するために用いられる。しかし、非生着血管細胞は、免疫不全宿主に投与された場合に骨髄へ生着しないという点で、区別することができる。この違いにも関わらず、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴および特性の１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有し得る。例えば、特定の実施形態では、非生着血管細胞は、互いに緩やかに接着している。他の実施形態では、非生着血管細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、の１つまたは２つ以上（２、３、４）を発現しない。理論に束縛されるものではないが、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞よりもある程度特殊化された独特の幹細胞集団を提供し得るが、それでも、一定範囲の造血細胞型を生成する能力を有する。
【００４１】
本発明者らは、ヒトＥＳＣから免疫療法能力を有する細胞を産生するための生体外培養系を開発した。この戦略は、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞を中間細胞供給源として使用することを伴うという点で従来技術と異なる。本発明者らは、無フィーダー培養条件を使用して、血管芽細胞の分化をナチュラルキラー（ＮＫ）および樹状細胞（ＤＣ）の両方に向けることができた。ＮＫ細胞は、リンパ系列から生じ、先天性免疫系の一部であり、あるタイプの腫瘍細胞を検出および死滅させることが見出されているため、抗癌療法で使用することができる。ＤＣは、多くの場合骨髄系列から（単球から）生じ、適応免疫系の一部であり、抗原を提示するそれらの能力により抗原特異的免疫応答を増強し、未感作Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を刺激するため（例えば、ＤＣに基づくワクチン療法）に使用することができる。
【００４２】
種々の活性化シグナルおよび阻害シグナル間の相互作用が、ＮＫ細胞の３つの主な機能を制御する。３つの主な機能とは、サイトカイン放出、ナチュラル細胞毒性、および抗体依存性細胞傷害性である。Ｈ７およびＨｕＥＳ−３ ｈＥＳＣ系統の両方から生成された血管芽細胞を使用して、本発明者らは、成熟ＣＤ５６ｌｏｗ／−、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を産生することができ、それらの産生は、間質フィーダー層の使用を必要としないことを見出した。この分化手順は、最初に４日間培養して胚様体を生成し、その後、血管芽細胞集団を産生および増殖させるための一組のサイトカインおよび成長因子で補完されたメチルセルロースで１０〜１４日間培養することを伴う。フローサイトメトリーで評価すると、ヒト血清およびサイトカイン混合物を加えた液体培養中でのさらなる１４〜２１日間は、ＮＫ細胞の分化を可能にする。５１Ｃｒ放出アッセイに類似した非放射能性細胞傷害性アッセイは、これら血管芽細胞由来ＮＫ細胞が、標準的な４時間の共培養後に、標的Ｋ５６２赤芽球性白血病細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができるため、ナチュラル細胞傷害性機能を内包することを示す。血管芽細胞を中間細胞供給源として使用することは、ｈＥＳＣが生体外で分化する能力および／または効率を増強し、重要なことには、免疫療法能力を有する細胞を産生するための無フィーダー系の開発を可能にすることができる。
【００４３】
本発明の実施形態は、リンパ系列細胞を生成する方法を提供する。種々の実施形態では、本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法を提供する。
【００４４】
種々の実施形態では、ＮＫ細胞を生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、メチルセルロース並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬ上に播種し、培養すること；細胞を回収すること；並びに回収した細胞を、ヒト血清、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む液体培地に再播種／培養することを含む。
【００４５】
種々の実施形態では、液体培地は、週１回変更される。種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４２３６メチルセルロースである。他の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースである。種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、細胞の回収は、細胞を６〜８日間培養した後で行われる。種々の実施形態では、細胞は、再播種された後、更に１４〜２１日間培養される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００４６】
別の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびヒト血清を含む液体培地中で培養すること；細胞を回収すること；および回収した細胞を、ヒト血清、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む液体培地中で培養することを含む。
【００４７】
種々の実施形態では、液体培地は、週１回変更される。先述と同様に、種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、細胞の回収は、細胞を６〜８日間培養した後で行われる。種々の実施形態では、細胞は、再播種された後、更に１４〜２１日間培養される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００４８】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法により生成されたナチュラルキラー細胞を提供する。種々の実施形態では、ＮＫ細胞は、本発明の方法により生成されたＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物に提供される。
【００４９】
本発明の他の実施形態は、樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法を提供する。１つの実施形態では、ＤＣを生成する方法は、血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地に播種し培養すること；ＩＬ４を液体培地に添加すること；および細胞を更に培養することを含む。
【００５０】
他の実施形態では、本方法は、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、ＤＣの成熟化を誘導することを更に含む。さらなる実施形態では、サイトカイン混合物は、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む。他の実施形態では、本方法は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／またはＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含む。
【００５１】
種々の実施形態では、液体培地は、６〜７日毎に変更される。種々の実施形態では、液体培地は、αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２である。種々の実施形態では、細胞は、７〜１１日間培養される。種々の実施形態では、細胞を７〜１１日間培養した後で、ＩＬ４を添加する。種々の実施形態では、細胞は、ＩＬ４を添加した後、更に８〜１０日間培養される。
【００５２】
種々の実施形態では、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦの濃度は、ヒト血清（１０〜２０％）、ＳＣＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭ−ＣＳＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）である。別の実施形態では、ＩＬ４の濃度は、５０〜１００ｎｇ／ｍｌである。種々の実施形態では、ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６の濃度は、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ６（１５０ｎｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、ｐｏｌｙ Ｉ；Ｃ、およびＩＦＮγの濃度は、ＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮα２ｂ（３０００単位／ｍｌ）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）である。
【００５３】
血管芽細胞から樹状細胞を産生する効率は比較的良好であるため、ＤＣを用いた将来的な研究は、新しい機能アッセイのための条件を最適化することおよび種々の新しい機能アッセイを開発することを含み得る。例えば、ＤＣ成熟化混合物を構成する成分の変更は、ＩＬ１２ｐ７０分泌アッセイを向上させる可能性がある。本発明者らは、現在６つの異なるサイトカインの混合物を成熟化に使用しているが、芽球由来ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生を刺激するためには、ＬＰＳおよび／またはＩＦＮγの添加が必要な場合がある。同様に、合成化合物、Ｓ−２８４６３は、ＩＬ１２ｐ７０産生およびＨＬＡ−ＤＲ発現の両方の増加を支援することができる。
【００５４】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法により生成された樹状細胞を提供する。種々の実施形態では、ＤＣは、本発明の方法により生成されたＤＣをある量含む薬学的に許容される組成物に提供される。
【００５５】
本発明の種々の実施形態では、血管芽細胞は、以下を含む方法により取得することができる：ｈＥＳＣを提供すること；サイトカインを含む培地中でｈＥＳＣを培養して、胚様体（ＥＢ）を生成すること；ＥＢを脱凝集すること；個々の細胞をろ過すること；個々の細胞を、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＦＬ、およびｂＦＧＦを含むメチルセルロースに接種すること；およびメチルセルロースから芽球様細胞を回収すること。
【００５６】
種々の実施形態では、ｈＥＳＣは、ＥＢを脱凝集する前に、まず４日間培養される。種々の実施形態では、胚様体を生成するためのサイトカインは、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４を含む。種々の実施形態では、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４は、ＥＢ形成の全体にわたって使用される。別の実施形態では、胚様体を生成するためのサイトカインは、ｂＦＧＦを更に含む。１つの実施形態では、ｂＦＧＦは、ｈＥＳＣ培養の最初の２日間の後に添加される。種々の実施形態では、ＥＢの脱凝集は、トリプシンを用いてＥＢを脱凝集し、その後、血清含有培地でトリプシンを不活化することを含む。１つの実施形態では、トリプシンは、０．０５％である。種々の実施形態では、個々の細胞のろ過は、４０μＭ細胞ストレーナーで個々の細胞をろ過することを含む。種々の実施形態では、メチルセルロースは、Ｈ４４３６またはＨ４５３６メチルセルロースである。種々の実施形態では、サイトカインの濃度は、ＴＰＯ（５０μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＬ（５０μｇ／ｍｌ）、およびｂＦＧＦ（２０〜５０μｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、芽球様細胞は、６日目〜１０日目にメチルセルロースから回収される。
【００５７】
ＮＫ細胞の生成に使用するための血管芽細胞の調製等の、特定の実施形態では、メチルセルロースは、さらなるサイトカインを含んでいてもよい。これらさらなるサイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。種々の実施形態では、これらサイトカインの濃度は、ＩＬ２（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（１〜２０μｇ／ｍｌ）、およびＩＬ１５（１〜１０μｇ／ｍｌ）である。種々の実施形態では、メチルセルロース培養物は、５０，０００〜１５０，０００細胞／ｍｌの濃度で播種される。
【００５８】
特定の実施形態では、血管芽細胞は、無エリトロポイエチンメチルセルロース中で生成される。１つの実施形態では、無エリトロポイエチンメチルセルロースは、Ｈ４５３６メチルセルロースである。
【００５９】
代替的な実施形態では、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞を含む）が、ｈＥＳＣの代りに使用される。他の実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００６０】
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０５０号および同ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０４３号は、双方ともに、２００９年５月６日に出願され、その全内容が完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、血管芽細胞および非生着血管芽細胞を生成する際の追加的な手引きを提供する。
【００６１】
種々の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明のナチュラルキル細胞または樹状細胞と共に薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に、安全であり、無毒であり、望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用並びにヒト医薬品使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合にはガス状であってもよい。
【００６２】
種々の実施形態では、本発明による医薬組成物は、任意の投与経路で送達するために製剤化することができる。「投与経路」は、当該技術分野で公知の任意の投与経路を指すことができ、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、または非経口が含まれるが、それらに限定されない。
【００６３】
「非経口」は、一般的に注射に関連する投与経路を指し、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管が含まれる。非経口経路では、組成物は、注入用または注射用の溶液または懸濁液の形態であってもよく、または凍結乾燥粉末としてでもよい。
【００６４】
また、本発明による医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体を含有することができる。「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、目的の化合物を、体内のある組織、器官、または部分から、体内の別の組織、器官、または部分に運搬または輸送することに関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、担体は、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料、またはそれらの組み合わせであってもよい。担体の各成分は、製剤の他の成分と適合しなければならないという点において、「薬学的に許容」されなければならない。また、担体の各成分は、それが接触する可能性がある任意の組織または器官と接触しての使用に好適でなければならず、その治療的有益性を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクをもたらしてはならないことを意味する。
【実施例】
【００６５】
以下の例は、特許請求されている発明をよりよく説明するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。特定の物質が言及される場合、それは例示目的に過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。当業者であれば、発明的な能力を行使せず、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発することができる。
【００６６】
実施例１
初期分化
両細胞タイプの初期分化手順は同じであり、胚様体（ＥＢ）を生成するために、サイトカインを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ社製）中でｈＥＳＣを４日間培養することを伴う。サイトカイン、ＶＥＧＦおよびＢＭＰ４を、ＥＢ培養の全体にわたって使用し、ｂＦＧＦを、最初の２日間の後に添加する。合計で４日後に、その結果生じたＥＢを、０．０５％トリプシンで脱凝集し、その後トリプシンを血清含有培地で不活化する。その後、個々の細胞を４０μＭ細胞ストレーナーでろ過し、計数し、ＴＰＯ（５０μｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＬ（５０μｇ／ｍｌ）、およびｂＦＧＦ（２０〜５０μｇ／ｍｌ）等のさらなるサイトカインを含有するＨ４４３６またはＨ４５３６メチルセルロース（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に播種する。ＮＫ分化の場合、サイトカインＩＬ２（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（１〜２０μｇ／ｍｌ）、および／またはＩＬ１５（１〜１０μｇ／ｍｌ）を、この段階で添加することもできる。血管芽細胞集団を産生および増殖させるために、１ｍｌ当たり５０，０００〜１５０，０００細胞の濃度で、メチルセルロース培養物を播種する。芽球様細胞を、６〜１０日目にメチルセルロースから回収し、下記の手順のうちの１つにより更に分化させる。
【００６７】
実施例２
ＮＫ分化
芽球細胞は、ＩＬ２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を加えたＨ４２３６メチルセルロースに再播種してもよく、または同じサイトカインおよび１０〜２０％ヒト血清を含有する液体培養に再播種してもよい。６〜８日間の培養後、細胞を回収し、１０〜２０％ヒト血清並びにサイトカインＩＬ７（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた液体培地（αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２）に、更に１４〜２１日間再播種する。週１回の培地変更を使用して、サイトカイン混合物を新しくする。
【００６８】
フローサイトメトリーを分化手順の全体にわたって断続的に使用して、細胞の免疫表現型およびＮＫ細胞表面マーカーの獲得を評価する。細胞表面マーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、およびＣＤ４５ＲＡが含まれる。血管芽細胞由来ＮＫ細胞の機能を検査する試験には、以下が含まれる：（１）Ｋ５６２赤白血病標的細胞を使用したナチュラル細胞傷害アッセイ、（２）ＩＬ１２／ＩＬ１８またはフォルボールミリステートアセテート処理に応答したＩＦＮγ産生、（３）パーフォリンおよびグランザイムＢ酵素の存在に関する細胞内フローサイトメトリー、および（４）Ｒａｊｉ細胞および抗ＣＤ２０抗体を使用した抗体依存性細胞傷害アッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｔｙ ａｓｓａｙ）。
【００６９】
これまでのところ、本発明者らは、Ｈ７およびＨｕＥＳ３ ｈＥＳＣの両方からＮＫ細胞を生成することができた。５１Ｃｒ放出アッセイに類似する非放射能性細胞傷害性アッセイは、本発明者らの血管芽細胞由来ＮＫ細胞が、標準的な４時間の共培養後に、標的Ｋ５６２赤芽球性白血病細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができるため、ナチュラル細胞傷害性機能を内包することを示す。
【００７０】
実施例３
ＤＣ分化
芽球細胞を、１０〜２０％ヒト血清並びにサイトカイン、ＳＣＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭ−ＣＳＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた液体培地（αＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２）に播種する。７〜１１日間の培養後、ＩＬ４（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）も培養物に添加し、細胞を更に８〜１０日間増殖させる。培地変更は、６〜７日毎に実施する。ＤＣの成熟化を誘導するために、さらなるサイトカイン混合物（１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１ｂ、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦγ、１５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ６）を、４８時間培養物に添加することができる。
【００７１】
フローサイトメトリーを分化手順の全体にわたって断続的に使用して、細胞の免疫表現型およびＤＣ表面マーカーの獲得を評価する。細胞表面マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＨＬＡ ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ１ａ、およびＣＤ１４が含まれる。成熟化は、Ｔ細胞共刺激受容体（ＣＤ８３）の獲得により評価するが、成熟化に際して、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、およびＣＤ１１ｃの発現も増加する場合がある。あるアッセイでは、１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２、３０００単位／ｍｌ ＩＦＮα２ｂ、２０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、またはＩＦＮγ ２０ｎｇ／ｍｌ等のさらなるサイトカインを、成熟化混合物に添加して、ＤＣ機能応答を増強することができる。血管芽細胞由来ＤＣの機能性に取り組むアッセイには、以下が含まれる：（１）ＤＱ−オボアルブミン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）処理による抗原取り込み、（２）化学誘引物質、ＭＩＰ−３ｂに応答したトランスウエル遊走、（３）ＨＬＡ不適合Ｔ細胞の増殖を増加させるＤＣの能力を決定するための同種異系混合リンパ球反応アッセイ、（４）ＤＣ刺激時のＩＬ１２−ｐ７０分泌、および（５）抗原負荷ＤＣが、以前に抗原で初回刺激を受けた末梢血単核細胞でＩＦＮγ産生を誘導することができるか否かを決定するための抗原提示アッセイ。
【００７２】
本発明者らは、ＨｕＥＳ３およびＭＡ０１ ｈＥＳＣの両方からＤＣ細胞を生成することができた。４８時間の成熟化サイトカイン混合物に応答して、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ２０９の上方制御が観察された。これらＤＣは、３０分間のアッセイで、ＤＱ−オボアルブミンを取り込み、タンパク質分解することができることが見出される。
【００７３】
実施例４
血管芽細胞増殖条件の変更
Ｈ４４３６メチルセルロースで増殖させた血管芽細胞を使用して、上記のＮＫおよびＤＣ分化手順を実施した。しかしながら、Ｈ４５３６、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の無エリトロポイエチンメチルセルロースを使用して、血管芽細胞を効率的に生成することもできる。これら「ｅｐｏマイナス」血管芽細胞は、元々の「ｅｐｏプラス」芽球と非常に類似しており、それらは、様々な造血細胞タイプおよび血管細胞タイプへと分化することが可能である。予備的な結果は、ＮＫ細胞およびＤＣを含む種々の造血系列へと血管芽細胞を分化させるためには、Ｈ４５３６の使用が、Ｈ４４３６メチルセルロースよりも著しい利点を提供することができることを示唆する。芽球増殖培地中にｅｐｏが存在しないことにより、赤血球マーカーＣＤ２３５ａを発現する細胞の割合を低減させ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ４１ａを発現する細胞の割合を増加させることが見出された。細胞表面マーカー発現におけるこの違いのため、「ｅｐｏ−マイナス」増殖条件は、骨髄系列および／またはリンパ系列への分化を増強することができる。
【００７４】
実施例５
ｉＰＳ細胞からのＭＫの生成
ＯＰ９共培養系を使用して、本発明者らは、ｉＰＳ細胞からＭＫを生成することができることを示す。数千個のＣＤ４１ａ＋ＭＫを、数十万個のｉＰＳ細胞から生成した。
【００７５】
実施例６
ヒトＥＳＣからのＮＫ細胞分化
分化手順を以下のように実施した：
Ｈ７ ＥＳＣを、胚様体（ＥＢ）へと４日間分化させた。ＥＢを回収し、血管芽細胞を産生および増殖させるために、サイトカイン豊富なメチルセルロースに１０〜１５日間移した。血管芽細胞を回収し、１０〜２０％ヒトＡＢ血清を加えた無フィーダー液体培地に一群のサイトカインと共に更に１４〜１７日間配置し、３〜４日毎に培地を半分変更した。
免疫表現型検査（フローサイトメトリーを使用）：
未熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１６ｌｏ、ＫＩＲｌｏ、ＣＤ１１７＋、ＣＤ９４−、ＮＫＧ２Ｄ＋だった。上記の手順の変法を使用することにより、３２日間の分化後の生細胞の２０〜３０％が、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−だった。成熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６ｈｉ、ＫＩＲｈｉ、ＣＤ１１７ｌｏ／−、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋だった。上記の手順を使用することにより、３１日間の分化後の生細胞の２０％が、ＣＤ５６−ＣＤ１６＋であり、それらの５％が、ＣＤ５６ｌｏＣＤ１６＋だった。
【００７６】
機能アッセイ：
ナチュラル細胞傷害性：成熟ＮＫ細胞は、ヒトＫ５６２赤白血病細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｕ８７細胞、ＰＣ３細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞等の標的細胞のアポトーシスを誘発することができる。「３ＦＣ」アッセイを使用して、細胞傷害性の効率を評価する。このアッセイは、５１Ｃｒ放出アッセイと類似しているが、放射能を必要としない。Ｄｅｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ７８： ３５−３９ （２００１）を参照されたい。上述の成熟ＮＫ細胞の異種性集団（アイテムＢ２−ａ）が、標準的な４時間の実験で６５〜７０％のＫ５６２細胞にアポトーシスを誘発することが見出された。
【００７７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）：ＮＫ細胞表面のＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、標的細胞に結合された抗ＣＤ２０抗体のｆｃ領域に結合し、ＡＤＣＣを誘導する。Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）に由来する）を抗ＣＤ２０抗体と共にプレインキュベートし、ＡＤＣＣアッセイでの標的として使用する。（Ｔｓｉｒｉｇｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏ １０８： ２６７−２７１ （２００８））。
【００７８】
ＩＦＮγサイトカイン産生：未熟ＮＫ細胞は、イオノマイシンまたはＩＬ１２を加え、ＩＬ１８を加えたＰＭＡ（フォルボールミリステートアセテート）による一晩の処理に応答して、大量のＩＦＮγを産生する。ＩＦＮγ分泌をブレフェルジンａで阻止し、細胞内フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーおよびＩＦＮγについて細胞を染色する。Ｗｏｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５： ５０９５−５１０３ （２００５）を参照されたい。
【００７９】
異種移植マウスモデルを使用したＮＫ細胞の生体内免疫療法能力：生物発光（ルシフェラーゼ含有）Ｋ５６２細胞を、腫瘍生着用のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射し、その後ＮＫ細胞のボーラス並びにＩＬ２およびＩＬ１５の１日１回のＩＰ注射を行う。生物発光画像診断を使用して、生体内ＮＫ免疫療法能力を経時的にモニターする。Ｗｏｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １１３ （２４）： ６０９４−６１０１ （２００９）を参照されたい。
【００８０】
実施例７
血管芽細胞を骨髄再増殖細胞として使用することにより、またはそれらを樹状突起細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、および／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）へと分化させることにより、本発明者らは、癌、ＨＩＶ、および／または自己免疫疾患（ａｕｔｏｍｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）と闘うための大規模で効果的な細胞に基づく療法を生み出すことができる。本発明者らは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の両方からの樹状細胞（ＤＣ）の分化を、４０〜５５％の効率で達成することができた。２つの新しい機能アッセイに加えて、ヒト骨髄に由来するＤＣと対照比較することにより、今や、ｈＥＳＣ由来ＤＣが、多くの同様な特徴をヒトＢＭ由来ＤＣと共有していることが確認され、さらなる最適化を必要とする分野も特定された。ナチュラルキラー細胞分化の場合、ヒト骨髄由来ＮＫ細胞と対照比較することにより、骨髄細胞供給源を使用した場合さえ、生体外ＮＫ細胞分化が、あまり効率的ではないことが確認された。本発明者らは、芽球由来ＮＫ細胞が、ナチュラル細胞傷害性能力を示すことを見出した。抗体依存性細胞傷害アッセイを実施する。Ｔ細胞分化の場合、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激するためにヒトデルタリガンド発現ＯＰ９間質細胞系統の生成することに成功し、血管芽細胞のＴ細胞分化を刺激するために、この間質細胞系統を使用している。
【００８１】
血管芽細胞由来樹状細胞（４０〜５５％効率）
細胞表面マーカー：ＣＤ１１ｃ、４５、２０９は、芽球由来ＤＣおよびヒト骨髄由来ＤＣでは同様の発現を示すが、ＨＬＡ−ＤＲは、芽球ＤＣでは、ヒトＢＭ ＤＣよりもはるかに低いレベルで発現される。
【００８２】
機能アッセイ（抗原取り込みおよび遊走アッセイについて以前に報告されている）。 ＩＬ１２−ｐ７０分泌：ＩＬ１２ｐ７０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｈ１指向性応答を誘発するために、成熟ＤＣにより分泌される。ヒトＢＭ由来ＤＣは、５００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＬ１２ｐ７０を産生することができるが、芽球由来ＤＣは、成熟化時に検出可能なＩＬ１２ｐ７０を産生しなかった。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ：ＭＬＲアッセイは、同種異系Ｔ細胞の増殖を刺激するＤＣの能力を決定する。臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ、これはＴ細胞を含む）を応答物として使用し、蛍光標識し、それらの増殖を、未熟または成熟芽球由来ＤＣと共に４〜５日間共培養した後で測定した。予備的な結果は、レスポンダー細胞が、成熟（ｍ）ＤＣに応答して増殖することを示す。
【００８３】
血管芽細胞由来ナチュラルキラー細胞：細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ９４、ＣＤ５６、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄを、芽球由来およびヒト骨髄由来ＮＫ細胞で評価した。
【００８４】
ＮＫ分化効率：組換えヒトＳｏｘ７タンパク質を、ＮＫ分化の前駆体から始めて、ＣＤ３４＋の貯留を増加させるその能力について調査されていた。結果は、ｒｈＳｏｘ７が、ＣＤ３４＋細胞の％に劇的な影響を及ぼさないことを示唆する。重要な細胞間接触およびＮＫ細胞分化の分泌因子を提供することができる間質フィーダー層として、マウスＡＦＴ０２４を調査した。細胞表面マーカー発現により示されたように、ＡＦＴ０２４間質共培養は、ヒトＢＭまたは芽球のＮＫ分化をいずれも増強しなかった。
【００８５】
血管芽細胞由来Ｔ細胞：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｔ細胞分化にとって重要である。そのため、ヒトデルタ様リガンド１（ｈＤＬＬ１）のｃＤＮＡを、ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰに基づくレトロウイルスベクターにクローニングし、その結果生じたウイルス上清を使用して、ＯＰ９間質細胞を感染させた。ウイルスが組み込まれると、ＯＰ９細胞は、それらの細胞表面にｈＤＬＬ１を発現し、ｇｆｐ陽性になるだろう。ＦＡＣＳに基づく選別を使用して、感染ＯＰ９細胞の異種性貯留から最も高いｇｆｐ陽性の細胞を精製した。これらＯＰ９−ｈＤＬ１Ｓ（選別では「Ｓ」）を増殖させ、特徴付けした。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光法、およびフローサイトメトリーは全て、これら細胞でのｈＤＬＬ１タンパク質の発現を確認する。
【００８６】
実施例８
臍帯血および末梢血単核細胞は両方とも、レスポンダーとして使用される。本発明者らは、陽性対照エフェクターとしてヒト骨髄由来ＤＣを使用する。
【００８７】
Ｅ４ＢＰ４は、ＮＫ系列発生にとって重要であることが示されており（Ｇａｓｃｏｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０（１０）： １１１８−１１２５， ２００９を参照）、生体外でのより高い効率に必要な転写プログラムを提供することができる。
【００８８】
ＮＫ細胞分化。本発明者らは、Ｅ４ＢＰ４ ｃＤＮＡを、血管芽細胞でそれを過剰発現するためにレトロウイルスベクターにクローニングし、ＮＫ分化を増加させるその能力を評価する。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＮＫ細胞機能に重要である種々のＫＩＲ受容体アイソフォーム、並びに酵素、パーフォリンおよびグランザイムＢの発現をモニターする。機能アッセイの場合、本発明者らは、芽球由来ＮＫ細胞が、ナチュラル細胞傷害性を示すことを示した。従って、芽球由来ＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）能力を評価する。ＡＤＣＣアッセイに必要な試薬には、バーキットリンパ腫由来Ｒａｊｉ細胞および抗ＣＤ２０抗体が含まれる。ＣＤ２０表示Ｒａｊｉ細胞とＮＫ細胞との共培養は、特異的ＡＤＣＣ応答を誘発するはずであり、それは、フローサイトメトリー手段でモニターされるだろう。
【００８９】
ＮＫ参考文献：
１． Ｗｏｌｌ， Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １７５： ５０９５−５１０３ （２００５）．
２． Ｗｏｌｌ， Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ１１３（２４）： ６０９４−１０１ （２００９）．
３． Ｂｏｒｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９： １５０８−１５１６ （２００４）．
４． Ｔａｂａｔｏａｂａｅｉ−Ｚａｖａｒｅｈ ｅｔ ａｌ． ＰＬＯＳ Ｏｎｅ Ｉｓｓｕｅ ２， ｅ２３２ （２００７）．
５． ＭｃＣｕｌｌａｒ， Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３６（５）： ５９８−６０８ （２００８）．
６． Ｆｒｅｕｄ， ＡＧ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：２９５−３０４ （２００５）．
７． Ｙｕ， Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９２ （１０）： ３６４７−３６５７ （１９９８）．
【００９０】
ＤＣ文献：
１． Ｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（１９）： ６２０７−６２１７ （２００８）．
２． Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（４）： ５１３−５２６ （２００９）．
３． Ｂａｎｄｉ ｅｔ ａｌ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１ （２００８）． （ｏｐｅｎ−ａｃｃｅｓｓ）
４． Ｓｌｕｋｖｉｎ， ＩＩ ｅｔ ａｌ． Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６： ２９２４−２９３２ （２００６）．
【００９１】
本発明の種々の実施形態が、発明を実施するための形態に記述されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接記述するが、当業者であれば、本明細書に表示および記述されている特定の実施形態の改変および／または変異を想起することができることが理解される。本説明の範囲以内にあるあらゆるそのような改変または変異も同様に本説明の範囲に含まれることが意図される。特別な注記がない限り、本明細書および特許請求の範囲にある単語および語句には、該当する技術分野（複数可）の当業者にとって通常の習慣的な意味が与えられることが、本発明者らの意図である。
【００９２】
本出願の出願時に出願者に知られている本発明の種々の実施形態の先述の説明が示されており、それは、例示および説明のためであることが意図されている。本説明は、網羅的であることも、開示された詳細な形態に本発明を限定することも意図されておらず、上記の教示に照らして多数の改変および変異が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理およびその実用的応用を説明し、他の当業者が、企図した特定の使用に好適なように種々の改変を施して、本発明を種々の実施形態で使用することを可能にする役目を果たす。従って、本発明は、本発明を実施するための開示された特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【００９３】
本発明の特定の実施形態が表示および記述されているが、当業者であれば、本明細書の教示に基づき、本発明およびそのより広範な態様から逸脱せずに変更および改変を為すことができることは明らかであり、従って添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨および範囲内にあるそのような変更および改変を全て、それらの範囲に包含することになる。本明細書で使用されている用語は、一般的に「非限定的」な用語であると意図されていることが、当業者により一般的に理解されるだろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「〜を少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきである等）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成することを含む方法。
【請求項２】
前記メチルセルロースが、Ｈ４２３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチルセルロースが、Ｈ４５３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養して前記ＮＫを生成することを含む方法。
【請求項１５】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間ある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２４】
請求項２４に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項２５】
樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養すること、
前記液体培地にＩＬ４を添加すること、および
前記血管芽細胞を更に培養して、前記ＤＣを生成することを含む方法。
【請求項２６】
前記血管芽細胞の培養が、約７〜１１日間ある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ４添加の後の前記血管芽細胞の培養が、約８〜１０日間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、前記ＤＣの成熟化を誘導することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記サイトカイン混合物が、約４８時間添加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカイン混合物が、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、前記ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／または前記ＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＣＦの濃度が、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦが約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ４が約５０〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＬ１ｂの濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＮＦγが、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＧＥ２の濃度が、約１μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮα２ｂが約３０００単位／ｍｌであり、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃが約２０μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγが約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ８３を発現する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現が増加される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法により生成される樹状細胞（ＤＣ）細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載のＤＣ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成することを含む方法。
【請求項２】
前記メチルセルロースが、Ｈ４２３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチルセルロースが、Ｈ４５３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養して前記ＮＫを生成することを含む方法。
【請求項１５】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間ある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２４】
請求項２４に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項２５】
樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養すること、
前記液体培地にＩＬ４を添加すること、および
前記血管芽細胞を更に培養して、前記ＤＣを生成することを含む方法。
【請求項２６】
前記血管芽細胞の培養が、約７〜１１日間ある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ４添加の後の前記血管芽細胞の培養が、約８〜１０日間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、前記ＤＣの成熟化を誘導することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記サイトカイン混合物が、約４８時間添加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカイン混合物が、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、前記ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／または前記ＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＣＦの濃度が、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦが約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ４が約５０〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＬ１ｂの濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＮＦγが、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＧＥ２の濃度が、約１μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮα２ｂが約３０００単位／ｍｌであり、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃが約２０μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγが約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ８３を発現する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ２０９、ＨＬＡ ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現が増加される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法により生成される樹状細胞（ＤＣ）細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載のＤＣ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１２６７３（Ｐ２０１３−５１２６７３Ａ）
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２１６３（Ｐ２０１２−５４２１６３）
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８５９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６８８９６
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５１２１４４８７４）ステム セル アンド リジェネレイティブ メディスン インターナショナル， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８５９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６８８９６
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５１２１４４８７４）ステム セル アンド リジェネレイティブ メディスン インターナショナル， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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