ヒト臍帯血由来の非制限体幹細胞（ＵＳＳＣ）
【課題】血管疾患、心臓もしくは平滑筋の疾患、肝臓疾患、タイプ１の糖尿病、神経疾患、パーキンソン病疾患、または血液疾患を治療するために有用であり、間葉細胞、神経細胞、血液細胞、または内皮細胞のような、異なる前駆細胞へ分化し得る幹細胞の提供。
【解決手段】間葉細胞、神経細胞、血液細胞、または内皮細胞のような、異なる前駆細胞へ分化し得る幹細胞として、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する非制限体幹細胞。（ｉ）ＣＤ４５およびＣＤ１４表面抗原に対して陰性であり；（ｉｉ）ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅ抗原に対して陽性であり；（ｉｉｉ）ＹＢ１、ＡＭＬ−１、ＲＵＮＸ−１、およびフィブリン−２を発現し；および（ｉｖ）ヒアルロナンシンターゼ、フィブロモジュリン、およびＩＮＦＬＳを発現しない。該非制限体幹細胞として、ヒト臍帯血および胎盤血から単離されたものが特に好ましい。
【解決手段】間葉細胞、神経細胞、血液細胞、または内皮細胞のような、異なる前駆細胞へ分化し得る幹細胞として、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する非制限体幹細胞。（ｉ）ＣＤ４５およびＣＤ１４表面抗原に対して陰性であり；（ｉｉ）ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅ抗原に対して陽性であり；（ｉｉｉ）ＹＢ１、ＡＭＬ−１、ＲＵＮＸ−１、およびフィブリン−２を発現し；および（ｉｖ）ヒアルロナンシンターゼ、フィブロモジュリン、およびＩＮＦＬＳを発現しない。該非制限体幹細胞として、ヒト臍帯血および胎盤血から単離されたものが特に好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体幹細胞(somatic stem cell)、複数の幹細胞、本発明の幹細胞を含む薬剤、ならびに、本発明の幹細胞の精製、単離、および珍しい分化の可能性(unique differentiation-potential)のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、永続的に自己置換する(self-replacing)が、それらは、一般にゆっくり繰り返している。一般に、これら細胞は、分化される細胞の数を増加させるための限定された自己再生能力を有する、一時的な増幅細胞群を生じさせると考えられている。これまで、大人のヒトにおける幹細胞の位置を突き止めるための挑戦があり、そのため、多数の代理マーカー（例えば、造血系統(hematopoietic lineage)のためのコロニー形成試験）を使用する文献があった。
【０００３】
多数の米国特許、例えば、US 5,486,359; 5,591,625; 5,736,396; 5,811,094; 5,827,740; 5,837,539; 5,908,782; 5,908,784; 5,942,225; 5,965,436; 6,010,696; 6,022,540; 6,087,113; 5,858,390; 5,804,446; 5,846,796; 5,654,186; 6,054,121; 5,827,735; 5,906,934は、数種の前駆細胞、例えば、筋肉前駆細胞、結合組織細胞前駆体、または卵細胞、へ分化し得る間葉幹細胞（ＭＳＣ）を扱っている。筋肉前駆細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、ならびに平滑筋細胞へ更に分化しているのに対し、結合組織細胞前駆体は、骨、軟骨、ならびに脂肪へ分化し得る。卵細胞は、肝臓または膵臓の細胞へ分化し得る(グロンペ(Grompe)ら、2001)。
【０００４】
へその緒の臍帯血内の非造血性幹細胞の存在が、依然として議論されている(マヤニ(Mayani)ら、2000、マレシ(Mareschi)ら、2001)。ドイツ特許出願DE 198 03 267 A1は、骨芽細胞前駆体およびヒト臍帯血からの骨形成を記載した最初のものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来技術のこれら間葉前駆細胞の使用は、器官または組織を生み出すために有用なツールになるためには、それらの開発は不十分なので(they are too far developed)、しばしば制限される。換言すれば、それらは、機能再生器官または組織を得るために、既にかなり拘束され(committed)、かつ特殊化されているようである。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、間葉細胞、神経細胞、血液細胞、または内皮細胞のような、異なる前駆細胞へ分化し得る幹細胞を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、胚(embryonic)幹細胞の欠点を有さない幹細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
新たに同定された幹細胞が、上記目的を解決し得ることがわかった。本発明の体幹細胞は、ヒトのへその緒の臍帯血、胎盤血、および／または、生まれたばかりの子供の血液から得られ、前記体幹細胞は、間葉幹もしくは前駆細胞、造血系統幹もしくは前駆細胞、神経幹もしくは前駆細胞または内皮幹もしくは肝臓前駆細胞とは異なっているが、それらへ分化することができる。これら細胞は、造血系統、間葉幹細胞ならびに神経幹細胞の前駆体を提示する。この珍しい多機能(multifunctional capacity)、および、体幹細胞または異なる分化プロトコルの下で拘束された細胞のいずれかのようなこれらの臍帯血（ＣＢ）由来の非制限体幹細胞(cord blood (CB) derived unrestricted somatic stem cells)（ＵＳＳＣ）を増やすための技術により、再生医療において幹細胞治療を生み出して実施するための、明確な特徴付け、標準化および利用が可能になる。
【０００９】
図１は、低密度で平板培養された初期ＵＳＳＣ培養細胞の顕微鏡写真を示す。
【００１０】
図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００１１】
図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１２】
図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１３】
図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１４】
図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性(kinetic)を示す。
【００１５】
図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。
【００１６】
図８は、本発明のUSSC類が、抗ネスチン免疫染色を行う神経幹細胞マーカーネスチンを発現することを示す。
【００１７】
図９は、ニューロン系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【００１８】
図１０は、神経膠系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【００１９】
図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。
【００２０】
図１２は、ＵＳＳＣ由来のペレット培養物のアルシアンブルー(Alcian Blue)染色を示す。
【００２１】
図１３は、軟骨形成(chondrogenic)分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）を示す。
【００２２】
図１４は、オイルレッド染色によって示されるＵＳＳＣ培養物の脂肪形成(adipogenic)分化を示す。
【００２３】
図１５は、筋形成分化前後のＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００２４】
図１６は、アザシチジン処理後のゆっくり作用する(low-acting)ミオシンに関する免疫細胞化学を示す。
【００２５】
図１７は、ＵＳＳＣ誘導体の卵細胞表現型を示す。
【００２６】
図１８は、SCIDマウスの肝臓柔組織への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合(integration)を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の体幹細胞は、実施例１に記載するように、濃度勾配単離、粘着細胞の培養、および成長因子を適用する継代培養を含む数種の方法によって単離および精製され得る。融合性細胞層が設けられた後、本発明の細胞を得るための単離工程が、形態(線維芽球様細胞(fibroblastoid)の形態)、ならびに、ＣＤ１３（陽性）、ＣＤ１４（陰性）、ＣＤ４５（陰性）、およびＣＤ２９（陽性；実施例２参照）表面抗原に対する抗体を使用する表現型分析によって普通に制御される。
【００２８】
本発明の体幹細胞は、ＣＤ４５のような造血系統に対して特異的なマーカーと陰性に反応しており、そのため、胎盤の臍帯血からも単離され得る造血幹細胞とは異なっている。ＣＤ１４は、ＵＳＳＣ類において検出され得ない別の表面抗原である。更に、本発明の幹細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅのような、細胞表面に存在する一連の抗原を特徴とする。ＵＳＳＣ調製物は、表皮成長因子レセプター (EGF-R)、小板(platelet)由来成長因子レセプターアルファ(PDGF-RA)、およびインシュリン成長因子レセプター(IGF-R)のような、所定のレセプター分子に対するｍＲＮＡ転写物の存在を、更に特徴とする。これらの細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、YB1(Ｙ−ボックス転移因子１)、Runx1(小動物(runt)関連転移因子１)およびAML1C(急性骨髄性白血病1転移因子)のような転移因子を典型的に発現している。しかし、ＵＳＳＣ調製物は、軟骨形成転移因子Ｃａｒｔ−１に対する転写物ならびに神経フィラメント、シナプトフィジン(synaptophysin)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)および神経膠繊維性酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)のような神経マーカーに対して、典型的には陰性である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
ＵＳＳＣ調製物のＲＮＡ発現物および骨髄由来ＭＳＣ類(カプラン(Caplan)、1991)は、定量的アフィメトリックスジーンチップ（商標）マイクロアレイ(quantitative Affymetrix GeneChipTM microarrays)を用いることによって直接比較された。フィブリン(Fibulin)−２遺伝子（遺伝子バンク番号Ｘ８２４９４）の転写物は、高発現レベルでＵＳＳＣ類において検出されたが、ＭＳＣ類では検出されなかった。フィブリン−２生成は、線維母細胞において以前は行われていた（パン(Pan)ら、１９９３）。様々なヒト組織からのｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、心臓、胎盤、および卵巣組織中には４．５−ｋｂ転写物が豊富であることが明らかになる(ツァン(Zhang)ら、1994)。ポリクローナル抗体を使用して、妊娠４−１０週のヒト胎児において、光学顕微鏡レベルで蛋白質が局在化された。フィブリン−２は、ニューロピテリウム(neuropithelium)、脊髄神経節(spinal ganglia)、および末梢神経内で主に検出された(ミオスゲ(Miosge)ら、1996)。
【００３１】
ラット動物モデルでは、ラットの肝臓筋線維母細胞(myofibroblast)（ｒＭＦ）は、フィブリン−２内に一緒に局在化している(colocalized)。これらの細胞は、門脈場(portal field)、中心静脈の壁に、そして、ほんの時たま柔組織に位置していた。線維症の初期段階では、ｒＭＦは、進行中の(developing)傷内で検出された。線維症の進行した段階では、ｒＭＦは、傷内に位置する細胞の大部分を占めていた(ニッテル(Knittel)ら、1999)。別の動物モデルでは、マウスのフィブリン−２蛋白質は、胚(embryonic)心臓発達中の心内膜床マトリックスにおける上皮−間葉形質転換中に発現される。フィブリン−２はまた、神経堤細胞および心外膜細胞にそれぞれ由来する、発達中の大動脈弓型血管（arch vessels）の平滑筋前駆細胞および冠状動脈内皮細胞によって合成される(ツダ(Tsuda)ら、2001)。
【００３２】
ヒアルロナンシンターゼ遺伝子（Ｄ８４４２４）、フィブロモジュリン(Fibromodulin)遺伝子(U05291)の転写物、および転写物１ＮＦＬＳ（Ｗ０３８４６）は、ＵＳＳＣ類では検出されなかったが、ＭＳＣ類では高レベルで検出された。ノーザンブロット分析は、ヒアルロナンシンターゼが、ヒト組織において偏在的に発現されることを示した(イタノ(Itano)およびキマタ(Kimata)、1996)。この酵素、ヒアルロナンの生成物は、空間の充填 (space filling)、関節の潤滑、および、それを通って細胞が移動し得るマトリックスの提供、を含む、様々な機能を果たす(ホール(Hall)ら、１９９５)。フィブロモジュリンは、小細胞間プロテオグリカンの群のメンバーである。蛋白質は、広範な組織分布を示し、関節の軟骨、腱、および靭帯において最も多量に観察される(スツトロビクス(Sztrolovics)ら、1994)。転写物１ＮＦＬＳは、ヒト胎児の肝臓からクローニングされた。
【００３３】
ＣＤ２４遺伝子（Ｌ３３３９３０）は、ＭＳＣ類中での発現レベルと比べて非常に低レベルで、ＵＳＳＣ類において発現される。ＣＤ２４は、多くのＢ−系統細胞中で、および、成熟顆粒球において、発現される(ファン・デル・スコート(Van der Schoot)ら、1989)。
【００３４】
ＭＳＣ類と比べた場合、本発明の体細胞は、それらがそこから単離される組織供給源に基づいて、はっきり識別され得る。更に、ＵＳＳＣ類は、ヒトの白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ−クラスＩ）の発現がないことを特徴とする。本発明の体幹細胞とは対照的に、骨髄および筋組織から単離された、先に記載されたＭＳＣ類は、きわめて高レベルのＨＬＡ−クラスＩ抗原を、それらの細胞表面において発現する。本発明の細胞は、段階に特異的な初期抗原４(stage specific early antigen 4)（ＳＳＥＡ４）も発現する（図４参照）。
【００３５】
典型的には、本発明の体幹細胞は、線維芽球様細胞形状を示し、かつ、粘着状態で増殖する。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、本発明の体幹細胞（ＵＳＳＣ）は、他の体幹細胞、例えば、好ましくは、ＡＣ１３３およびＣＤ３４を発現する造血系統、の前駆体、間葉前駆体幹細胞、ニューロン前駆体幹細胞、またはそれらの組み合わせ、を提示する、複数または混合物中に存在する。この態様は、他の異なる体幹細胞へ分化する能力、または、本発明の好ましい態様のような、そのような体幹細胞の存在に基づいて、高い再生の可能性を含むため、有利である。好ましくは、間葉前駆体幹細胞またはニューロン前駆体幹細胞は、本発明の幹細胞からの分化によって生成される。
【００３７】
本発明によれば、本発明の体幹細胞ならびに本発明による体幹細胞の複数または混合物を含む薬剤（再生治療用）が提供される。その薬剤は、医学的および薬理的に許容され得るキャリアー物質または補助物質を更に含み得る。本発明はまた、遺伝子治療、器官置換、製剤の試験、血管のインビトロ成長、血管、骨、肝臓、膵臓、および神経の疾患の治療において、ＵＳＳＣまたは本発明の幹細胞の複数もしくは混合物を使用する方法に関する。
【００３８】
例えば、本発明のＵＳＳＣ類は、必要な部位に、例えば、バイオマテリアルとともに、またはバイオマテリアルなしで、局所的に適用され得る。
【００３９】
疾患の種類によって、ＵＳＳＣ類の局所および／または全身投与が適している。ＵＳＳＣ類は、直接適用され得るか、または薬学的に許容され得るキャリアーもしくはアジュバントと共に適用され得る。疾患の治療を促進する更なる物質を添加することが有利であり得る。例えば、整形外科的適用では、骨生成を向上させる物質が、ＵＳＳＣ類と共に適用され得る。
【００４０】
基本的に、ＵＳＳＣ類を適用する場合は、ＭＳＣ類の適用のために知られている方法が、同様に(in analogous manner)適用され得る。更に、幹細胞の適用は、例えば、B. E.ストラウアー(Strauer)ら、M.“Intrakoronare, humane autologe Stammzelltransplantation zur Myokardregeneration nach Herzinfarkt”、Dtsch med Wochenschr 2001; 126:932-938; クアルト(Quarto) R.ら、“自己由来骨髄基質細胞の使用による大きな骨損傷の修復(Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells)”、N Engl J Med 2001; 344:385-386; バカンティ(Vacanti) C. A.、“簡単な報告：組織工学的な骨による剥離した節骨の置換(Brief Report:Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone)” N Engl J Med 2001; 344:1511-1514、５月１７日、2001; ヘンツ(Hentz) V. R.、“親指の再構築のための組織工学(Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb)”、N Engl J Med 2001; 344:1547-1548; ブリットバーグ(Brittberg) M.、“自己由来軟骨細胞移植によるひざの重症軟骨損傷の治療(Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation)”、N Engl J Med 1994; 331:889-895, １０月６日、1994; フリード(Freed) C. R.、“重症パーキンソン病のための胚ドーパミンニューロンの移植(Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease)”,N Engl J Med 2001; 344:710-719; シン’オカ(Shin'oka) T.、“組織工学的肺動脈の移植(Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery)”、N Engl J Med 2001; 344:532-533. シャピロ(Shapiro) A.M. J.、グルココルチコイドを含まない免疫抑制投薬計画を使用するタイプ１の糖尿病を有する７人の患者における島の移植(Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen) N Engl J Med 2000; 343:230-238、に記載されている。これらの参考文献は、開示として援用される。
【００４１】
本発明の幹細胞を、更に、より詳細に説明する。
本発明の幹細胞は、トリプシンＥＤＴＡ−処理および適当な培養条件下（実施例１）での再播種後に得られる、線維芽球様細胞形状および２つまたは３つの核小体（図１参照）を有する粘着細胞であり、長く伸びた形態の融合体(confluence)に迅速に広がる（図２）。図１は、初期ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。低密度で平板培養された細胞は、ＵＳＳＣ類の線維芽球様細胞形態を示す。これらの細胞は、１４培養継代より長期にわたって容易に成長させることができる。図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。ほとんどの融合性細胞ＵＳＳＣ層は、細胞の平行配置を示す。
【００４２】
その後の継代において、初期粘着細胞層の表面マーカー表現型ならびにそのすべての誘導体は、ＣＤ４５マーカーに対して陰性のままである。図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。ＣＤ４５、造血細胞に特徴的なマーカー抗原、は、以後の継代からのＵＳＳＣ類では、ほとんど検出することができない（図３、４８、５４、８２日）。
【００４３】
方法Ａを使用するインビトロ培養後(実施例１)、ＵＳＳＣ調製物は、段階に特異的な初期抗原４（ＳＳＥＡ４）に対して陽性になり、この胚マーカーの均質発現を示す。図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。方法Ａ（実施例１）によって増加された細胞は、段階に特異的な初期抗原４（ＳＳＥＡ４）の発現を強く示す。同時に、ＵＳＳＣ培養物は、ＨＬＡ−クラスＩ表面抗原発現に対して陰性である。（図５Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲ抗原発現（図５Ｂ）ならびにＣＤ１４陰性（図５Ｃ）。図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。インビトロでの発現後の本発明のＵＳＳＣ培養物は、ＨＬＡ−クラスＩ抗原に対して陰性である（パネルＡ）。これらの細胞は、抗原提示細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）および単球（ＣＤ１４）に特徴的な、ＨＬＡ−ＤＲ（パネルＢ）およびＣＤ１４（パネルＣ）表面抗原に対しても陰性である。
【００４４】
図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性を示す。ＵＳＳＣ類は、１０継代にわたってＨ５１００／ＰＥＩにおいて成長した。この培養期間中、ＣＤ３４抗原発現の顕著な増加が観察された。造血幹細胞マーカーＣＤ３４に関して、図６により、継代３において、５４日目まで、ＣＤ３４陽性細胞が何ら検出され得ないことが明らかになる。それに対して、第７継代において、８２日目に、新規ＣＤ３４陽性小集団が現れている。一方、そのようなＣＤ３４または／およびＦＩＫ１陽性前駆体が、造血分化に特異的な、サイトカインで調整された(cytokine conditioned)培地によって培養された場合、赤血球前駆体および白血球前駆体のための、典型的な混合または造血コロニー（ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ）が、ＣＤ４５+造血前駆細胞に匹敵するほど発達した（実施例９）。
【００４５】
一方、ＣＤ１４のために使い果たされた(depleted)臍帯血単核細胞を、高グルコース含有培地において培養すると、それらは、神経幹細胞の典型的な特徴を示す。図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。高グルコースのダルベッコ改質イーグル培地（Dulbecco's modified eagle medium）（ＤＭＥＭ）中で培養された本発明のＵＳＳＣ類は、星状膠状形態を示す。図７は、培養の１３日後に得られた、神経膠形態を示す、そのような培養細胞の例を示す（実施例６）。ＰＥＩによって増加された後、ＵＳＳＣ類は、神経幹細胞マーカーネスチンを発現する。最初の観察により、ネスチン染色が、レチノイド酸（ＲＡ）、塩基性線維母細胞成長因子ｂＦＧＦ、および神経成長因子β（ＮＧＦ−β）のような神経誘発剤(neural inducing agents)によって刺激された後はあまり現されない(less pronounced)ことが示される(マッカイ(McKay)、１９９７)。
【００４６】
詳細には、図８は、神経幹細胞マーカーネスチンを発現する、本発明のＵＳＳＣ類を示す。（Ａ）ＵＳＳＣ類は、Ｈ５１００／ＰＥＩ培地中で７日間インキュベートされ、そして、標準抗ネスチン免疫組織化学に付された。（Ｂ）細胞は、Ｈ５１００／ＰＥＩ中で７日間インキュベートされた後、ＲＡ、ｂＦＧＦ、およびＮＧＦによって、Ｈ５１００中で９日間誘発された。但し、（Ａ）の条件下で成長した細胞と比べて、ネスチン染色は低減される。
【００４７】
これらの細胞の更なる分析により、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ、図９Ｂ）、チロシンヒドロキシラーゼ（図９Ｂ）、シナプトフィジン（図９Ｄ）、神経フィラメント（図９Ｆ）のような神経細胞、または、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ、図１０Ｂ）のような典型的な神経膠抗原に特徴的な蛋白質、および神経膠酸性蛋白質（ＧＦＡＰ、図１０Ｄ）の発現も明らかになる。図９は、ニューロン系統の細胞を生み出す、本発明のＵＳＳＣ類を示す。本発明のＵＳＳＣ類を、Ｈ５１００／ＰＥＩ中で７日間成長させ、そして、ＲＡ、ｂＦＧＦ、およびＮＧＦを含むＨ５１００上に２７日間保持させた。標準固定プロトコル後、ニューロン特異的抗体を適用した。（Ａ、Ｃ、Ｄ）段階を対比する(Phase-contrast)写真、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｄと同じ調製物の蛍光写真。ＤＮＡ染色剤ＤＡＰＩ（青）は、細胞の核を染色するために使用される。（Ｂ）抗ＧＡＢＡ（赤）および抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、緑）を使用する二重免疫蛍光写真。（Ｄ）抗シナプトフィジン染色（緑）。（Ｆ）ニューロン特異的抗神経フィラメント染色を示す（赤）。神経フィラメントの異なるサブタイプに対する抗体のカクテルを使用した。図１０は、神経膠系統の細胞を生み出す、本発明のＵＳＳＣ類を示す。細胞を、図９に示したものと同じ細胞培養条件に付した。ＤＡＰＩは青である。（Ａ、Ｃ）段階を対比する写真の提示。（Ｂ）抗ＧａｌＣ免疫染色（赤）に付された、（Ａ）で見られるものと同じ細胞。（Ｄ）抗神経膠微小細胞酸性蛋白質(anti-glial fibrillary acid protein)（ＧＦＡＰ、赤）によって染色された（Ｃ）と同じ細胞。
【００４８】
しかし、仮に、上記の一般的な幹細胞が、いずれかの発現継代から採取されてＤＡＧ（デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールホスフェート）含有培養条件またはフィブロネクチン含有培地において誘発されるならば、骨形成系統における(along the osteogenic lineage)分化が誘発される（実施例３）。表２に示すように、骨に特異的なマーカー遺伝子（アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、コラーゲンタイプＩ）は、容易に誘発されてＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る。
【００４９】
【表２】
【００５０】
骨形成分化の３つのマーカー遺伝子すべてが、ＤＡＧ誘発の７日目で、ｍＲＮＡ発現の増加を示す。β−アクチンは、ポジティブコントロールとして役立つ。
【００５１】
図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。ほぼ融合性のＵＳＳＣ層の骨形成分化が、培養培地Ｈ５１００へのデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールホスフェートの添加によって誘発された。刺激の１０日目に、特徴的な骨小節が現れる（１１Ａ）。これらの小節の鉱物沈殿が、アリザリンレッド染色によって示され得る（１１Ｂ）。これらの骨形成誘発条件下で、本発明の細胞では、アリザリンレッドによって染色され得る（図１１Ｂ）、異なる小節中の鉱化された骨の蓄積によって示されるような（図１１Ａ）、完全な骨形成分化が起こる。または、細胞培養物中のヒドロキシアパタイトの蓄積が、フォン・コッサ(von Kossa)染色によって６日後に検出され得る。
【００５２】
これらの結果から、臍帯血が、これまで検出されなかった、多量に増加され得る非常に初期の幹細胞を含むことは明らかである。また、図１１Ａに既に示したように、この細胞は、誘発されてＭＳＣ類へ分化し、そしてそこから骨芽細胞へ分化し得る。ＤＡＧによる完全な誘発後、アリザリンレッド染色による、図１１Ｂに示すような、鉱化骨小節への更なる分化が得られ得る。
【００５３】
本発明の細胞の多様性(versatily)は、デキサメタゾン、プロリン、ピルビン酸ナトリウム、ＩＴＳ＋プレミックス(Premix)、およびＴＧＦ−β１を含む、高グルコースのＤＭＥＭ中での培養後、軟骨形成分化によって示されるように、更に重要である(ジョーンストーン(Johnstone)ら、1998)。これらの分化実験の０日目および１４日目に、細胞を採取し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（表３、実施例４）。
【００５４】
【表３】
【００５５】
軟骨形成刺激の１４日目に、軟骨形成中の(on going chondrogenesis)３つの特徴的なマーカー遺伝子が発現される。
【００５６】
これらの研究の結果は、軟骨形成刺激の１４日後に、Ｃａｒｔ−１、特異的軟骨形成転移因子の上方制御(upregulation)を明らかに示す。更に、２つの典型的な軟骨細胞外蛋白質（コラーゲンタイプＩＩおよびコンドロアドヘリン）に対するｍＲＮＡ転写物も、上方制御された。更に、本発明の細胞は、アルシアンブルー染色によって示されるように、軟骨細胞(chondrocytic)分化に典型的な細胞外プロテオグリカン分子を明らかに生成した。図１２は、ＵＳＳＣ由来ペレット培養物のアルシアンブルー染色を示す。ＵＳＳＣ類を、沈降培養(sedimentation culture)下で、軟骨形成分化培地中で成長させた。誘発培地中で６日後、軟骨形成分化の特徴的なマーカーとしての多量のプロテオグリカン（ＰＧ）を、アルシアンブルー染色によって検出することはできない（パネルＡ）。それに対して、ＰＧ類は、青色／緑色によって示されるように、容易に検出され得る（パネルＢ）。
【００５７】
更に、軟骨特異的コラーゲンタイプＩＩの存在を、蛋白質レベルで示すことができた。図１３：軟骨形成分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）。
【００５８】
ＵＳＳＣ類を、軟骨形成分化培地中で培養した。１４日目の細胞外マトリックス蛋白質コラーゲンタイプＩＩの発現を、抗コラーゲンタイプＩＩ第一抗体およびＦＩＴＣ抗マウス第二抗体を使用して、蛍光顕微鏡によって示した（図１３Ｂ）。
【００５９】
ここで、非制限幹細胞の更なる多様性を、ＰＥＩプロトコルの下での、より高濃度のデキサメタゾンによる、そのような先に増加させた培養物の脂肪細胞への分化によって示す(実施例５)。
【００６０】
図１４は、オイルレッド（シグマ(Sigma)）によって特異的に染色され得る脂肪細胞を示す。脂肪細胞は、多量の細胞内小嚢およびオイルレッドによる特異的赤色染色を特徴とする。
【００６１】
更に、１０μＭの５’−アザシチジンおよび次に１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＨ５１００中で２４時間培養した場合、ＵＳＳＣ類は、筋肉分化の確固たる証拠を示す。細胞の形態の変化は、ゆっくり作用するミオシンの発現と同時に起こる(図１５および１６)。
【００６２】
また、典型的な卵細胞の出現および増殖は、ＰＥＩによって誘発されたＵＳＳＣ類が、図６に示された（実施例８）、ＣＤ３４+小集団からサブクローニングされる場合、後の継代において定期的に観察される（図１７）。これらの細胞は、酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶを様々な程度で(to variable degrees)発現し、このことは、そのような卵細胞が、肝臓の細胞へ更に分化し得ることを意味する。
【００６３】
インビトロで増加したＵＳＳＣは、５０％の部分的な肝切除を伴うＳＣＩＤマウスの再生肝臓内ならびに肝切除されていない肝臓内への注入後に生存し、そして存続するのに対し、臍帯血由来の単核細胞は、２５倍多い数の細胞が移植されるとしても検出され得ない。図１８は、ＳＣＩＤマウスの肝臓柔組織内への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合を示す。図１８Ａ：移植７日後の赤色蛍光は、本発明のヒトＰＫＨ２６−ラベルＵＳＳＣ類の生存およびマウス肝臓組織への統合を示す（肝切除なし）。それに対し、臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣ類）の移植後、ヒトＭＮＣ類の統合を示す赤色蛍光は検出され得なかった。図１８Ｂ：Ａに対応するマウス肝臓組織の凍結切除：統合されたヒトＵＳＳＣ類を含むマウス肝臓組織の透過光顕微鏡写真。
【００６４】
肝臓および膵臓β島細胞のための前駆体は同じであるので、そのようなＣＢ由来卵細胞も、それらを、糖尿病の患者または肝不全の患者における細胞治療のための有用なツールにする、インシュリン生成β−島細胞へ分化され得る。
【００６５】
これらの明らかな臨床的適用の他に、いずれかの良好に特徴付けされ、そして標準化条件下で増やされた幹細胞成分およびそれらの子孫(progeny)を、新たに開発された薬剤の作用ならびに分子および細胞効果を観察して規定することにより、所定の動物に基づく実験の代わりにもするために使用することができる。
【００６６】
従って、ここで記載した、これらの良好に特徴付けされた幹細胞およびヒトの臍帯血培養物から得られた分化された細胞は、薬学およびバイオマテリアル産業のための価値あるテスト試薬として使用される。
適当な培養条件下において、ＵＳＳＣ調製物は、異なる造血系統の多数のコロニーを形成し、これらの細胞が、造血を生じさせ得るという証拠を示した。
【００６７】
所定の濃度のＶＥＧＦ、Ｆｌｔ ３Ｌ、ＳＣＧＦ（幹細胞成長因子）を含む、適当に調整された培養培地の下で、および、メチルセルロース中で、そのような細胞は、ＦＬＫ１＋およびＡＣ１３３＋、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２マーカーに対しても陽性の細胞を含む混合コロニーを形成する。更なる分化において、ＡＣ１３３ネガティブ、ＣＤ３１+、ＣＤ５４+、ＶＷＦ+、ＶＥ−カテリン(Ｃａｔｈｅｒｉｎ)+を含む、内皮細胞に特徴的なマーカープロファイルが発達した。
【００６８】
血管疾患の治療のための自己由来および同種異系血管のインビトロ成長のための、そのような内皮細胞の明らかな有用性を、ここに記載する。
【００６９】
同時に、これらのインビトロ生成され、そして均質に増やされた前駆体およびそれれらの分化された細胞のすべては−クローンレベルで−細胞生物学および細胞または分子によって媒介される治療に基づくその後のすべての医学的適用における、特異的遺伝子およびそれらの生成物の役割の規定のためのきわめて重要なツールとして役立つ。
【００７０】
医学的に適用され得る再生細胞型の生成のために、多数の粘着して成長する(adherently growing)本発明のＵＳＳＣ類およびより多くの分化された間葉幹細胞を生み出すためには、この珍しい細胞型は、少数だけで十分である。
【００７１】
この知識の１つのまったく新しい見解は、そのような前駆体が、２つ以上のはっきりと分化している細胞型へ、非対照的に進化し得る点である。これにより、インビトロでも生じる、機能的に方向付けられた(functionally oriented)細胞再生における、共存成分制御の新たな生物学的原則が明らかになる。
【００７２】
本発明の結論は、幹細胞に基づく治療法は、この原則に従って設計されなければならず、そして、１つのクローン細胞型のみからなるものではいけないということである。本発明を、以下の非限定的な実施例において更に説明する。
【実施例１】
【００７３】
臍帯血の回収（ＣＢ）
母親にインフォームドコンセントを行って、産科において臍帯血の回収を行った。まだ子宮中での胎盤による赤ん坊の輸送後に、へその緒を、二重に締めて、へそから７−１０ｃｍ離れたところで横に切開した(transsected)。へその緒の消毒後、臍静脈に穴を開けて、抗凝血剤として、サイトレートホスフェートデキストロース（ＣＰＤ）を含む回収バッグ内へ、ＣＢを回収した。
【００７４】
臍帯血からの単核細胞の単離
へその緒の臍帯血を、フィコール(Ficoll)溶液上へ注意深く載せた（密度１．０７７ｇ／ｃｍ3）。濃度勾配遠心分離を行った（４５０ｇ、室温、２５分）。中間期の単核細胞（ＭＮＣ）を回収し、ｐＨ７，３のリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。
【００７５】
線維芽球様細胞形態の粘着層の生成
単核細胞を、Ｔ２５培養フラスコ（ヌンクロン(Nunclon)）中で、約５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で平板培養した[Ａ．）、Ｂ．）、Ｃ．）]。４つの異なる培養法を使用して、粘着幹細胞の成長を開始させた：
Ａ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含むミエロコルト(Myelocult)H5100培地(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー／カナダ)中で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｂ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含むメセンコルト(Mesencult)(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー／カナダ)中で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｃ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含む３０％のＦＣＳを含む低グルコースのＤＭＥＭ(バイオ−ホワイタッカー(Bio-Whittaker))中で、Ｂ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｄ．）デキサメタゾンなしで、５０ｍｌの培養フラスコ（ヌンクロン(Nunclon)）内の１０ｍｌのミエロコルト(Myelocult)Ｈ５１００培地(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー、カナダ)中で、５×１０6／ｍｌの密度で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を平板培養した。
【００７６】
すべての培養物を、完全な湿潤雰囲気中で、５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートし、非粘着細胞を含む完全培地を除去して１０ｍｌの新鮮な培地を添加することにより、週に１回供給した。いくつかの時点の後に、粘着性の紡錘状細胞を、０．０５％のトリプシンおよび０．５３ｍＭのＥＤＴＡによる２分間の処理によって除去し、５０％の血清含有培地によってすすぎ洗いし、遠心分離によって７８０ｇ回収し、そして、フローサイトメトリーまたはＲＴ−ＰＣＲによって分析した。２〜３週後、線維芽球様細胞形態の粘着細胞が、全細胞培養物の約３０％に現れる。
【００７７】
本発明のＵＳＳＣ類の増加のための培養条件
本発明のＵＳＳＣ類を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ Ｉ（インシュリン状成長因子−Ｉ）、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（小板由来の成長因子−ＢＢ）、および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ヒトＥＧＦ（組み換え型ヒト表皮成長因子）を含むＨ５１００培地（ＰＥＩ培地）中で、１×１０4〜１×１０5細胞／ｍｌの密度で増加させることができる（増加方法Ａ）。代わりに、ＵＳＳＣ調製物を、初期成長培地Ａ、Ｂ、およびＣ中で増加させることができる。
【実施例２】
【００７８】
細胞蛍光計(cytofluorometry)による細胞の免疫表現型のタイピング(immonophenotyping)
ＵＳＳＣ類の免疫表現型を決定するために、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、ＰＥ結合抗ＣＤ１４（ファーミンゲン(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、ヤギＦ（ａｂ｀）2抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣによってラベルされた抗ＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０）（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ１０−ＰＥ（ＣＡＬＬＡ、ファーミンゲン(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ)）、ヤギＦ（ａｂ｀）2抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ （Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣによってラベルされた抗ＨＬＡ−クラスＩ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ１３−ＰＥ（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）；抗ＣＤ２９（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ４４（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ４９ｅ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ９０（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＨＬＡ−クラスＩＩ−ＦＩＴＣ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）によって、細胞を染色した。ＥＰＩＣＳ ＸＬ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）またはＦＡＣＳ分析器（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)を用いて、細胞を分析した。
【実施例３】
【００７９】
ＵＳＳＣ類の骨形成分化の可能性の立証
実施例１に記載したように得られたＵＳＳＣ類を、それらが７０％の融合度(confluency)に達するまで、標準培地中で培養した。１０-7Ｍのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを添加することによって、これらの細胞の骨形成分化を誘発した(ブルーダー(Bruder)ら、1994、ジャイスワル(Jaiswal)ら、1997)。刺激の１０日目に、細胞は、カルシウムホスフェート沈殿を示し、それにより、骨小節が得られた。鉱化した骨小節を、アリザリンレッドによる染色によって、以下のように検出した：培養物中の粘着細胞を、ｐＨ７．３のＰＢＳによって２回洗浄し、室温で１時間、５ｍｌの０．１％アリザリンレッド溶液によって、次いで、０．１％の酢酸および無水得エタノールならびにＰＢＳによって染色した。
【００８０】
カルシウムのアリザリンレッドおよびフォン・コッサ染色は、これらの細胞の鉱化の可能性を示す（スタンフォード(Stanford)ら、1995、ルングバイ(Rungby)ら、1993）。骨に特異的な分化マーカーオステオカルシン(OC)、オステオポンチン(osteopontin)(OP)、骨に特異的なアルカリホスファターゼ(AP)、骨シアロ蛋白質 (BSP)、小板由来成長因子レセプターアルファ(PDGF-Ra)、表皮成長因子レセプター(EGFR)、およびコラーゲンタイプＩを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによっても、骨形成分化が示された。
【実施例４】
【００８１】
ＵＳＳＣ類の軟骨形成分化の可能性の立証
軟骨形成分化のために、２×１０5個の粘着幹細胞を、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中の沈降培養物中に置いた。デキサメタゾン、プロリン、ピルビン酸ナトリウム、ITS+プレミックス、およびＴＧＦ−β１を含む高グルコースのＤＭＥＭを、細胞培養培地として使用した（ジョーンストーン(Johnstone)ら、1998、ヨー(Yoo)ら、1998）。７、１４、および２１日目に、Ｃａｒｔ−１、コラーゲンタイプＩＩおよびコンドロアドヘリンをコードする軟骨に特異的な遺伝子産物について、ＲＴ−ＰＣＲによって細胞画分を分析した。また、ＵＳＳＣ類を、沈降培養物中で使用した。２週間後に、デワックス(Dewax)セクションを、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドによって固定し、エタノール中で洗浄した。セクションを、１％アルシアンブルー／３％酢酸、ｐＨ２，５によって５分間染色し、蒸留水中で洗浄した。それらは、アルシアンブルー染色によって示されるように、特異的なプロテオグリカンの陽性染色を明らかに示す（チャオ(Chao)ら、1993）。１４日の軟骨形成誘発期の後に、細胞を、標準プロトコルに従って固定し、蛍光顕微鏡によって分析したところ(ロゼンバウム(Rosenbaum)ら、1998)、コラーゲンタイプＩＩに特異的な細胞外マトリックスの存在が示された（図１３Ｂ）。
【実施例５】
【００８２】
ＵＳＳＣ類の脂肪形成分化の可能性の立証
１０-6Ｍのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを含むＨ５１００中で、ＵＳＳＣを培養したところ、オイルレッド染色によって示されるように、脂肪細胞へのＵＳＳＣ類の部分的な分化が得られた(ラミレズ−ザカリアス(Ramirez-Zacarias)ら、1992)。
【実施例６】
【００８３】
ＵＳＳＣ類の神経形成(neurogenic)分化の可能性の立証
神経膠細胞のための細胞単離および培養条件
製造者(ミルテニイ・バイオテク(Miltenyi Biotec)、バーギシュ・グラドバッハ(Bergisch Gladbach))の指示に従って、ＶＳ＋分離カラムを使用して、ＣＤ１４／磁気活性化細胞選別(magnetic Activated Cell Sorting)（ＭＡＣＳ）によって、ＣＤ１４＋細胞のために、記載したように得られた単核臍帯血細胞を使い果たした。ＣＤ１４に使い果たされた単核細胞を、Ｔ２５培養フラスコ(ヌンクロン(Nunclon))内の１０ｍｌの高グルコース培地(４５００Ｇ／Ｌのグルコースを含むダルベッコ(Dulbecco´s)MEM)中で、２×１０6／ｍｌの密度で培養し、完全湿潤雰囲気中で、５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。１０−１５日後に、培養物中で、神経膠状細胞が検出された。
【００８４】
神経細胞への分化
Ａ）Ｈ５１００のみの中で、または４０ｐｇ／ｍｌのＰＤＧＦＢ、１０ｐｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｐｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉの存在下のいずれかで、細胞を７日間増やした。細胞をトリプシン化し、ポリＤ−リジン（ＰＤＬ）およびラミニン(laminin)(PDL/lam)によって被覆されたカバースリップ上の２４ウェル培養皿において、約３，５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で平板培養した。次いで、オールトランスレチノイド酸（１０-5Ｍ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＮＧＦ−β（５０ｎｇ／ｍｌ）のような誘発剤を変化することにより、ニューロン分化を開始した。
【００８５】
蛍光顕微鏡
誘発期間（２７日）後、細胞を、標準プロトコルに従って固定して、神経特異的抗原に対する抗体によって染色した。蛍光および透過光顕微鏡を用いて、標本を分析した。
【実施例７】
【００８６】
ミオサイト(myocytic)系統における分化の可能性の立証
１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦＢＢ、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦを補充したＨ５１００培地（ステムセル・テクノロジー(StemCell Technology)）において、３７℃、５％ＣＯ2で、１×１０4個のＵＳＳＣ類を、それらの融合度が７０％に達するまで培養した。その後、細胞を、１０μＭの５’−アザシチジン（シグマ(Sigma)）と共に２４時間インキュベートし、ＰＢＳによって２回洗浄し、そして、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（シグマ(Sigma)）を補充したＨ５１００培地中で培養した。分化培地において１週間後、細胞の形態が変化した（図１５）。１０日後、細胞を、トリプシン化し、免疫染色のために、フィブロネクチンによって被覆したガラスチャンバースライドへ移した。
【００８７】
免疫組織化学
細胞を、５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳによって１５分間固定し、ｐＨ７．３のＰＢＳ中で２回洗浄した。標準プロトコルを使用して、抗骨格(anti-skeletal)ミオシン(遅い)特異的第一抗体(クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ、１：４００）(緑で示す)と共に、そして、抗ＣＤ１３第一抗体（赤で示す）またはモノクローナル抗骨格ミオシン第一抗体（クローンＭＹ−３２、１：４０００）と共に、細胞をインキュベートした。上記培養条件下で培養されたＵＳＳＣ類について、染色は陽性であった（図１６）。
【実施例８】
【００８８】
ヒトのＵＳＳＣ細胞ならびに臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣ）を、PKH26 レッド・フルオレセント・セル・リンカー・キット(RED Fluorescent Cell Linker Kit)(シグマ(Sigma)、PKH26-GL)によってラベルした。２×１０5個のＵＳＳＣ類および５×１０6個のＭＮＣ類を、５０％の肝切除あり、およびなしのＳＣＩＤマウスの肝臓柔組織内へ注入した。移植の７日後、肝切除された動物について、完全な肝臓再生が達成された。赤色ラベルされたヒト細胞の存在について、肝臓組織の凍結断片を、蛍光顕微鏡によって分析した（図１８）。
【実施例９】
【００８９】
ＵＳＳＣの造血系統への分化の可能性の立証
長期間（継代５〜８）、適当な増加培地(expansion medium)中で成長する３つの異なるＵＳＳＣ類の調製物(３０％のＦＣＳを含むＤＭＥ培地中のUSSCKCB55、デキサメタゾンを含むＨ５１００培地中のUSSCKCB12、デキサメタゾンを含むメセンカルト(MesenCult)培地中のUSSCKCB13、およびＰＥＩを含むＨ５１００培地中のUSSCGK12)を、造血特異培養培地（メトカルト（Methocult）4434）中で２４ウェルプレートにおいて、２５０μｌ（２×１０4−２×１０5細胞）の細胞懸濁液中へ３回(in triplicate)接種した。５０個を超える細胞のコロニーを数えて、確立された規準に従って、顆粒細胞／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、初期赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞または多能性(CFU-GEMM)前駆細胞由来のように分類した。分化条件下で、異なる培養物中のコロニー形成が、観察の１週間から始まり、３週間まで続くことが明らかになった。ＵＳＳＣ調製物が、異なる系統の多数のコロニーに進化し、これにより、これらの細胞が、造血を引き起こし得ることが証明された。
【実施例１０】
【００９０】
非制限体幹細胞およびそれらの連続分化産物の分析のための分子的方法
オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロ蛋白質、アルカリホスファターゼ、ＰＤＧＦＲαおよびＥＧＦレセプターからの特異的ｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプライマーを、それらを、それらのそれぞれ生み出されるＤＮＡフラグメントの大きさで区別し得るために、異なる各エクソンから選択した。
【００９１】
ｐＣＲＬ１ベクター（インビトロゲン(Invitrogen)／米国）へのクローニングおよび大腸菌株TOP １０Fへの連続した形質転換により、各特異的ｃDNAクローンを得て、自動シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）におけるサイクルシーケンシングによって特徴付けした。
【００９２】
２段階の工程で、RT-PCR反応を行った。１時間、５０℃で、２０μｌ容量の１０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ(Promega)、マンハイム(Mannheim)）、１．５ｐｍｏｌの３’−遺伝子特異的プライマー、１ｍＭのｄＮＴＰ類、および補充されたバッファー（プロメガ(Promega)、マンハイム(Mannheim)）によって、細胞の全ＲＮＡ２００ｎｇを最初に逆転写した。１ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、バッファーおよびＱ−溶液（キアゲン(Qiagen)、ヒルデン（Hilden））、１．５ｍMのｄＮＴＰ類、ならびに２０ｐｍｏｌの３’−および５’−遺伝子特異的プライマーを含む２μｌのｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行った。９５℃での１５分間の開始段階、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分の３７サイクル、および６８℃での５分間の最終重合段階によって、ＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
【表４】
【００９４】
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【００９５】
略語
ＤＡＧ デキサメタゾン、アスコルビン酸、およびβ−グリセロホスフェートを含む骨形成分化培地
ＨＬＡ ヒト白血球抗原
ＭＳＣ 間葉幹細胞
ＰＥＩ ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦおよびＩＧＦを含む培地
ＳＳＥＡ４ 段階に特異的な初期抗原４
ＵＳＳＣ 非制限体幹細胞
ＰＧ プロテオグリカン
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、低密度で平板培養された初期ＵＳＳＣ培養細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図４】図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図５】図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図６】図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性(kinetic)を示す。
【図７】図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、本発明のUSSC類が、抗ネスチン免疫染色を行う神経幹細胞マーカーネスチンを発現することを示す。
【図９】図９は、ニューロン系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【図１０】図１０は、神経膠系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【図１１】図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。
【図１２】図１２は、ＵＳＳＣ由来のペレット培養物のアルシアンブルー染色を示す。
【図１３】図１３は、軟骨形成分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）を示す。
【図１４】図１４は、オイルレッド染色によって示されるＵＳＳＣ培養物の脂肪形成分化を示す。
【図１５】図１５は、筋形成分化前後のＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１６】図１６は、アザシチジン処理後のゆっくり作用するミオシンに関する免疫細胞化学を示す。
【図１７】図１７は、ＵＳＳＣ誘導体の卵細胞表現型を示す。
【図１８】図１８は、SCIDマウスの肝臓柔組織への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体幹細胞(somatic stem cell)、複数の幹細胞、本発明の幹細胞を含む薬剤、ならびに、本発明の幹細胞の精製、単離、および珍しい分化の可能性(unique differentiation-potential)のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、永続的に自己置換する(self-replacing)が、それらは、一般にゆっくり繰り返している。一般に、これら細胞は、分化される細胞の数を増加させるための限定された自己再生能力を有する、一時的な増幅細胞群を生じさせると考えられている。これまで、大人のヒトにおける幹細胞の位置を突き止めるための挑戦があり、そのため、多数の代理マーカー（例えば、造血系統(hematopoietic lineage)のためのコロニー形成試験）を使用する文献があった。
【０００３】
多数の米国特許、例えば、US 5,486,359; 5,591,625; 5,736,396; 5,811,094; 5,827,740; 5,837,539; 5,908,782; 5,908,784; 5,942,225; 5,965,436; 6,010,696; 6,022,540; 6,087,113; 5,858,390; 5,804,446; 5,846,796; 5,654,186; 6,054,121; 5,827,735; 5,906,934は、数種の前駆細胞、例えば、筋肉前駆細胞、結合組織細胞前駆体、または卵細胞、へ分化し得る間葉幹細胞（ＭＳＣ）を扱っている。筋肉前駆細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、ならびに平滑筋細胞へ更に分化しているのに対し、結合組織細胞前駆体は、骨、軟骨、ならびに脂肪へ分化し得る。卵細胞は、肝臓または膵臓の細胞へ分化し得る(グロンペ(Grompe)ら、2001)。
【０００４】
へその緒の臍帯血内の非造血性幹細胞の存在が、依然として議論されている(マヤニ(Mayani)ら、2000、マレシ(Mareschi)ら、2001)。ドイツ特許出願DE 198 03 267 A1は、骨芽細胞前駆体およびヒト臍帯血からの骨形成を記載した最初のものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来技術のこれら間葉前駆細胞の使用は、器官または組織を生み出すために有用なツールになるためには、それらの開発は不十分なので(they are too far developed)、しばしば制限される。換言すれば、それらは、機能再生器官または組織を得るために、既にかなり拘束され(committed)、かつ特殊化されているようである。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、間葉細胞、神経細胞、血液細胞、または内皮細胞のような、異なる前駆細胞へ分化し得る幹細胞を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、胚(embryonic)幹細胞の欠点を有さない幹細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
新たに同定された幹細胞が、上記目的を解決し得ることがわかった。本発明の体幹細胞は、ヒトのへその緒の臍帯血、胎盤血、および／または、生まれたばかりの子供の血液から得られ、前記体幹細胞は、間葉幹もしくは前駆細胞、造血系統幹もしくは前駆細胞、神経幹もしくは前駆細胞または内皮幹もしくは肝臓前駆細胞とは異なっているが、それらへ分化することができる。これら細胞は、造血系統、間葉幹細胞ならびに神経幹細胞の前駆体を提示する。この珍しい多機能(multifunctional capacity)、および、体幹細胞または異なる分化プロトコルの下で拘束された細胞のいずれかのようなこれらの臍帯血（ＣＢ）由来の非制限体幹細胞(cord blood (CB) derived unrestricted somatic stem cells)（ＵＳＳＣ）を増やすための技術により、再生医療において幹細胞治療を生み出して実施するための、明確な特徴付け、標準化および利用が可能になる。
【０００９】
図１は、低密度で平板培養された初期ＵＳＳＣ培養細胞の顕微鏡写真を示す。
【００１０】
図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００１１】
図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１２】
図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１３】
図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【００１４】
図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性(kinetic)を示す。
【００１５】
図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。
【００１６】
図８は、本発明のUSSC類が、抗ネスチン免疫染色を行う神経幹細胞マーカーネスチンを発現することを示す。
【００１７】
図９は、ニューロン系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【００１８】
図１０は、神経膠系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【００１９】
図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。
【００２０】
図１２は、ＵＳＳＣ由来のペレット培養物のアルシアンブルー(Alcian Blue)染色を示す。
【００２１】
図１３は、軟骨形成(chondrogenic)分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）を示す。
【００２２】
図１４は、オイルレッド染色によって示されるＵＳＳＣ培養物の脂肪形成(adipogenic)分化を示す。
【００２３】
図１５は、筋形成分化前後のＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００２４】
図１６は、アザシチジン処理後のゆっくり作用する(low-acting)ミオシンに関する免疫細胞化学を示す。
【００２５】
図１７は、ＵＳＳＣ誘導体の卵細胞表現型を示す。
【００２６】
図１８は、SCIDマウスの肝臓柔組織への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合(integration)を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の体幹細胞は、実施例１に記載するように、濃度勾配単離、粘着細胞の培養、および成長因子を適用する継代培養を含む数種の方法によって単離および精製され得る。融合性細胞層が設けられた後、本発明の細胞を得るための単離工程が、形態(線維芽球様細胞(fibroblastoid)の形態)、ならびに、ＣＤ１３（陽性）、ＣＤ１４（陰性）、ＣＤ４５（陰性）、およびＣＤ２９（陽性；実施例２参照）表面抗原に対する抗体を使用する表現型分析によって普通に制御される。
【００２８】
本発明の体幹細胞は、ＣＤ４５のような造血系統に対して特異的なマーカーと陰性に反応しており、そのため、胎盤の臍帯血からも単離され得る造血幹細胞とは異なっている。ＣＤ１４は、ＵＳＳＣ類において検出され得ない別の表面抗原である。更に、本発明の幹細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅのような、細胞表面に存在する一連の抗原を特徴とする。ＵＳＳＣ調製物は、表皮成長因子レセプター (EGF-R)、小板(platelet)由来成長因子レセプターアルファ(PDGF-RA)、およびインシュリン成長因子レセプター(IGF-R)のような、所定のレセプター分子に対するｍＲＮＡ転写物の存在を、更に特徴とする。これらの細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、YB1(Ｙ−ボックス転移因子１)、Runx1(小動物(runt)関連転移因子１)およびAML1C(急性骨髄性白血病1転移因子)のような転移因子を典型的に発現している。しかし、ＵＳＳＣ調製物は、軟骨形成転移因子Ｃａｒｔ−１に対する転写物ならびに神経フィラメント、シナプトフィジン(synaptophysin)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)および神経膠繊維性酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)のような神経マーカーに対して、典型的には陰性である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
ＵＳＳＣ調製物のＲＮＡ発現物および骨髄由来ＭＳＣ類(カプラン(Caplan)、1991)は、定量的アフィメトリックスジーンチップ（商標）マイクロアレイ(quantitative Affymetrix GeneChipTM microarrays)を用いることによって直接比較された。フィブリン(Fibulin)−２遺伝子（遺伝子バンク番号Ｘ８２４９４）の転写物は、高発現レベルでＵＳＳＣ類において検出されたが、ＭＳＣ類では検出されなかった。フィブリン−２生成は、線維母細胞において以前は行われていた（パン(Pan)ら、１９９３）。様々なヒト組織からのｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、心臓、胎盤、および卵巣組織中には４．５−ｋｂ転写物が豊富であることが明らかになる(ツァン(Zhang)ら、1994)。ポリクローナル抗体を使用して、妊娠４−１０週のヒト胎児において、光学顕微鏡レベルで蛋白質が局在化された。フィブリン−２は、ニューロピテリウム(neuropithelium)、脊髄神経節(spinal ganglia)、および末梢神経内で主に検出された(ミオスゲ(Miosge)ら、1996)。
【００３１】
ラット動物モデルでは、ラットの肝臓筋線維母細胞(myofibroblast)（ｒＭＦ）は、フィブリン−２内に一緒に局在化している(colocalized)。これらの細胞は、門脈場(portal field)、中心静脈の壁に、そして、ほんの時たま柔組織に位置していた。線維症の初期段階では、ｒＭＦは、進行中の(developing)傷内で検出された。線維症の進行した段階では、ｒＭＦは、傷内に位置する細胞の大部分を占めていた(ニッテル(Knittel)ら、1999)。別の動物モデルでは、マウスのフィブリン−２蛋白質は、胚(embryonic)心臓発達中の心内膜床マトリックスにおける上皮−間葉形質転換中に発現される。フィブリン−２はまた、神経堤細胞および心外膜細胞にそれぞれ由来する、発達中の大動脈弓型血管（arch vessels）の平滑筋前駆細胞および冠状動脈内皮細胞によって合成される(ツダ(Tsuda)ら、2001)。
【００３２】
ヒアルロナンシンターゼ遺伝子（Ｄ８４４２４）、フィブロモジュリン(Fibromodulin)遺伝子(U05291)の転写物、および転写物１ＮＦＬＳ（Ｗ０３８４６）は、ＵＳＳＣ類では検出されなかったが、ＭＳＣ類では高レベルで検出された。ノーザンブロット分析は、ヒアルロナンシンターゼが、ヒト組織において偏在的に発現されることを示した(イタノ(Itano)およびキマタ(Kimata)、1996)。この酵素、ヒアルロナンの生成物は、空間の充填 (space filling)、関節の潤滑、および、それを通って細胞が移動し得るマトリックスの提供、を含む、様々な機能を果たす(ホール(Hall)ら、１９９５)。フィブロモジュリンは、小細胞間プロテオグリカンの群のメンバーである。蛋白質は、広範な組織分布を示し、関節の軟骨、腱、および靭帯において最も多量に観察される(スツトロビクス(Sztrolovics)ら、1994)。転写物１ＮＦＬＳは、ヒト胎児の肝臓からクローニングされた。
【００３３】
ＣＤ２４遺伝子（Ｌ３３３９３０）は、ＭＳＣ類中での発現レベルと比べて非常に低レベルで、ＵＳＳＣ類において発現される。ＣＤ２４は、多くのＢ−系統細胞中で、および、成熟顆粒球において、発現される(ファン・デル・スコート(Van der Schoot)ら、1989)。
【００３４】
ＭＳＣ類と比べた場合、本発明の体細胞は、それらがそこから単離される組織供給源に基づいて、はっきり識別され得る。更に、ＵＳＳＣ類は、ヒトの白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ−クラスＩ）の発現がないことを特徴とする。本発明の体幹細胞とは対照的に、骨髄および筋組織から単離された、先に記載されたＭＳＣ類は、きわめて高レベルのＨＬＡ−クラスＩ抗原を、それらの細胞表面において発現する。本発明の細胞は、段階に特異的な初期抗原４(stage specific early antigen 4)（ＳＳＥＡ４）も発現する（図４参照）。
【００３５】
典型的には、本発明の体幹細胞は、線維芽球様細胞形状を示し、かつ、粘着状態で増殖する。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、本発明の体幹細胞（ＵＳＳＣ）は、他の体幹細胞、例えば、好ましくは、ＡＣ１３３およびＣＤ３４を発現する造血系統、の前駆体、間葉前駆体幹細胞、ニューロン前駆体幹細胞、またはそれらの組み合わせ、を提示する、複数または混合物中に存在する。この態様は、他の異なる体幹細胞へ分化する能力、または、本発明の好ましい態様のような、そのような体幹細胞の存在に基づいて、高い再生の可能性を含むため、有利である。好ましくは、間葉前駆体幹細胞またはニューロン前駆体幹細胞は、本発明の幹細胞からの分化によって生成される。
【００３７】
本発明によれば、本発明の体幹細胞ならびに本発明による体幹細胞の複数または混合物を含む薬剤（再生治療用）が提供される。その薬剤は、医学的および薬理的に許容され得るキャリアー物質または補助物質を更に含み得る。本発明はまた、遺伝子治療、器官置換、製剤の試験、血管のインビトロ成長、血管、骨、肝臓、膵臓、および神経の疾患の治療において、ＵＳＳＣまたは本発明の幹細胞の複数もしくは混合物を使用する方法に関する。
【００３８】
例えば、本発明のＵＳＳＣ類は、必要な部位に、例えば、バイオマテリアルとともに、またはバイオマテリアルなしで、局所的に適用され得る。
【００３９】
疾患の種類によって、ＵＳＳＣ類の局所および／または全身投与が適している。ＵＳＳＣ類は、直接適用され得るか、または薬学的に許容され得るキャリアーもしくはアジュバントと共に適用され得る。疾患の治療を促進する更なる物質を添加することが有利であり得る。例えば、整形外科的適用では、骨生成を向上させる物質が、ＵＳＳＣ類と共に適用され得る。
【００４０】
基本的に、ＵＳＳＣ類を適用する場合は、ＭＳＣ類の適用のために知られている方法が、同様に(in analogous manner)適用され得る。更に、幹細胞の適用は、例えば、B. E.ストラウアー(Strauer)ら、M.“Intrakoronare, humane autologe Stammzelltransplantation zur Myokardregeneration nach Herzinfarkt”、Dtsch med Wochenschr 2001; 126:932-938; クアルト(Quarto) R.ら、“自己由来骨髄基質細胞の使用による大きな骨損傷の修復(Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells)”、N Engl J Med 2001; 344:385-386; バカンティ(Vacanti) C. A.、“簡単な報告：組織工学的な骨による剥離した節骨の置換(Brief Report:Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone)” N Engl J Med 2001; 344:1511-1514、５月１７日、2001; ヘンツ(Hentz) V. R.、“親指の再構築のための組織工学(Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb)”、N Engl J Med 2001; 344:1547-1548; ブリットバーグ(Brittberg) M.、“自己由来軟骨細胞移植によるひざの重症軟骨損傷の治療(Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation)”、N Engl J Med 1994; 331:889-895, １０月６日、1994; フリード(Freed) C. R.、“重症パーキンソン病のための胚ドーパミンニューロンの移植(Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease)”,N Engl J Med 2001; 344:710-719; シン’オカ(Shin'oka) T.、“組織工学的肺動脈の移植(Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery)”、N Engl J Med 2001; 344:532-533. シャピロ(Shapiro) A.M. J.、グルココルチコイドを含まない免疫抑制投薬計画を使用するタイプ１の糖尿病を有する７人の患者における島の移植(Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen) N Engl J Med 2000; 343:230-238、に記載されている。これらの参考文献は、開示として援用される。
【００４１】
本発明の幹細胞を、更に、より詳細に説明する。
本発明の幹細胞は、トリプシンＥＤＴＡ−処理および適当な培養条件下（実施例１）での再播種後に得られる、線維芽球様細胞形状および２つまたは３つの核小体（図１参照）を有する粘着細胞であり、長く伸びた形態の融合体(confluence)に迅速に広がる（図２）。図１は、初期ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。低密度で平板培養された細胞は、ＵＳＳＣ類の線維芽球様細胞形態を示す。これらの細胞は、１４培養継代より長期にわたって容易に成長させることができる。図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。ほとんどの融合性細胞ＵＳＳＣ層は、細胞の平行配置を示す。
【００４２】
その後の継代において、初期粘着細胞層の表面マーカー表現型ならびにそのすべての誘導体は、ＣＤ４５マーカーに対して陰性のままである。図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。ＣＤ４５、造血細胞に特徴的なマーカー抗原、は、以後の継代からのＵＳＳＣ類では、ほとんど検出することができない（図３、４８、５４、８２日）。
【００４３】
方法Ａを使用するインビトロ培養後(実施例１)、ＵＳＳＣ調製物は、段階に特異的な初期抗原４（ＳＳＥＡ４）に対して陽性になり、この胚マーカーの均質発現を示す。図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。方法Ａ（実施例１）によって増加された細胞は、段階に特異的な初期抗原４（ＳＳＥＡ４）の発現を強く示す。同時に、ＵＳＳＣ培養物は、ＨＬＡ−クラスＩ表面抗原発現に対して陰性である。（図５Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲ抗原発現（図５Ｂ）ならびにＣＤ１４陰性（図５Ｃ）。図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。インビトロでの発現後の本発明のＵＳＳＣ培養物は、ＨＬＡ−クラスＩ抗原に対して陰性である（パネルＡ）。これらの細胞は、抗原提示細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）および単球（ＣＤ１４）に特徴的な、ＨＬＡ−ＤＲ（パネルＢ）およびＣＤ１４（パネルＣ）表面抗原に対しても陰性である。
【００４４】
図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性を示す。ＵＳＳＣ類は、１０継代にわたってＨ５１００／ＰＥＩにおいて成長した。この培養期間中、ＣＤ３４抗原発現の顕著な増加が観察された。造血幹細胞マーカーＣＤ３４に関して、図６により、継代３において、５４日目まで、ＣＤ３４陽性細胞が何ら検出され得ないことが明らかになる。それに対して、第７継代において、８２日目に、新規ＣＤ３４陽性小集団が現れている。一方、そのようなＣＤ３４または／およびＦＩＫ１陽性前駆体が、造血分化に特異的な、サイトカインで調整された(cytokine conditioned)培地によって培養された場合、赤血球前駆体および白血球前駆体のための、典型的な混合または造血コロニー（ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ）が、ＣＤ４５+造血前駆細胞に匹敵するほど発達した（実施例９）。
【００４５】
一方、ＣＤ１４のために使い果たされた(depleted)臍帯血単核細胞を、高グルコース含有培地において培養すると、それらは、神経幹細胞の典型的な特徴を示す。図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。高グルコースのダルベッコ改質イーグル培地（Dulbecco's modified eagle medium）（ＤＭＥＭ）中で培養された本発明のＵＳＳＣ類は、星状膠状形態を示す。図７は、培養の１３日後に得られた、神経膠形態を示す、そのような培養細胞の例を示す（実施例６）。ＰＥＩによって増加された後、ＵＳＳＣ類は、神経幹細胞マーカーネスチンを発現する。最初の観察により、ネスチン染色が、レチノイド酸（ＲＡ）、塩基性線維母細胞成長因子ｂＦＧＦ、および神経成長因子β（ＮＧＦ−β）のような神経誘発剤(neural inducing agents)によって刺激された後はあまり現されない(less pronounced)ことが示される(マッカイ(McKay)、１９９７)。
【００４６】
詳細には、図８は、神経幹細胞マーカーネスチンを発現する、本発明のＵＳＳＣ類を示す。（Ａ）ＵＳＳＣ類は、Ｈ５１００／ＰＥＩ培地中で７日間インキュベートされ、そして、標準抗ネスチン免疫組織化学に付された。（Ｂ）細胞は、Ｈ５１００／ＰＥＩ中で７日間インキュベートされた後、ＲＡ、ｂＦＧＦ、およびＮＧＦによって、Ｈ５１００中で９日間誘発された。但し、（Ａ）の条件下で成長した細胞と比べて、ネスチン染色は低減される。
【００４７】
これらの細胞の更なる分析により、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ、図９Ｂ）、チロシンヒドロキシラーゼ（図９Ｂ）、シナプトフィジン（図９Ｄ）、神経フィラメント（図９Ｆ）のような神経細胞、または、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ、図１０Ｂ）のような典型的な神経膠抗原に特徴的な蛋白質、および神経膠酸性蛋白質（ＧＦＡＰ、図１０Ｄ）の発現も明らかになる。図９は、ニューロン系統の細胞を生み出す、本発明のＵＳＳＣ類を示す。本発明のＵＳＳＣ類を、Ｈ５１００／ＰＥＩ中で７日間成長させ、そして、ＲＡ、ｂＦＧＦ、およびＮＧＦを含むＨ５１００上に２７日間保持させた。標準固定プロトコル後、ニューロン特異的抗体を適用した。（Ａ、Ｃ、Ｄ）段階を対比する(Phase-contrast)写真、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｄと同じ調製物の蛍光写真。ＤＮＡ染色剤ＤＡＰＩ（青）は、細胞の核を染色するために使用される。（Ｂ）抗ＧＡＢＡ（赤）および抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、緑）を使用する二重免疫蛍光写真。（Ｄ）抗シナプトフィジン染色（緑）。（Ｆ）ニューロン特異的抗神経フィラメント染色を示す（赤）。神経フィラメントの異なるサブタイプに対する抗体のカクテルを使用した。図１０は、神経膠系統の細胞を生み出す、本発明のＵＳＳＣ類を示す。細胞を、図９に示したものと同じ細胞培養条件に付した。ＤＡＰＩは青である。（Ａ、Ｃ）段階を対比する写真の提示。（Ｂ）抗ＧａｌＣ免疫染色（赤）に付された、（Ａ）で見られるものと同じ細胞。（Ｄ）抗神経膠微小細胞酸性蛋白質(anti-glial fibrillary acid protein)（ＧＦＡＰ、赤）によって染色された（Ｃ）と同じ細胞。
【００４８】
しかし、仮に、上記の一般的な幹細胞が、いずれかの発現継代から採取されてＤＡＧ（デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールホスフェート）含有培養条件またはフィブロネクチン含有培地において誘発されるならば、骨形成系統における(along the osteogenic lineage)分化が誘発される（実施例３）。表２に示すように、骨に特異的なマーカー遺伝子（アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、コラーゲンタイプＩ）は、容易に誘発されてＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る。
【００４９】
【表２】
【００５０】
骨形成分化の３つのマーカー遺伝子すべてが、ＤＡＧ誘発の７日目で、ｍＲＮＡ発現の増加を示す。β−アクチンは、ポジティブコントロールとして役立つ。
【００５１】
図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。ほぼ融合性のＵＳＳＣ層の骨形成分化が、培養培地Ｈ５１００へのデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールホスフェートの添加によって誘発された。刺激の１０日目に、特徴的な骨小節が現れる（１１Ａ）。これらの小節の鉱物沈殿が、アリザリンレッド染色によって示され得る（１１Ｂ）。これらの骨形成誘発条件下で、本発明の細胞では、アリザリンレッドによって染色され得る（図１１Ｂ）、異なる小節中の鉱化された骨の蓄積によって示されるような（図１１Ａ）、完全な骨形成分化が起こる。または、細胞培養物中のヒドロキシアパタイトの蓄積が、フォン・コッサ(von Kossa)染色によって６日後に検出され得る。
【００５２】
これらの結果から、臍帯血が、これまで検出されなかった、多量に増加され得る非常に初期の幹細胞を含むことは明らかである。また、図１１Ａに既に示したように、この細胞は、誘発されてＭＳＣ類へ分化し、そしてそこから骨芽細胞へ分化し得る。ＤＡＧによる完全な誘発後、アリザリンレッド染色による、図１１Ｂに示すような、鉱化骨小節への更なる分化が得られ得る。
【００５３】
本発明の細胞の多様性(versatily)は、デキサメタゾン、プロリン、ピルビン酸ナトリウム、ＩＴＳ＋プレミックス(Premix)、およびＴＧＦ−β１を含む、高グルコースのＤＭＥＭ中での培養後、軟骨形成分化によって示されるように、更に重要である(ジョーンストーン(Johnstone)ら、1998)。これらの分化実験の０日目および１４日目に、細胞を採取し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（表３、実施例４）。
【００５４】
【表３】
【００５５】
軟骨形成刺激の１４日目に、軟骨形成中の(on going chondrogenesis)３つの特徴的なマーカー遺伝子が発現される。
【００５６】
これらの研究の結果は、軟骨形成刺激の１４日後に、Ｃａｒｔ−１、特異的軟骨形成転移因子の上方制御(upregulation)を明らかに示す。更に、２つの典型的な軟骨細胞外蛋白質（コラーゲンタイプＩＩおよびコンドロアドヘリン）に対するｍＲＮＡ転写物も、上方制御された。更に、本発明の細胞は、アルシアンブルー染色によって示されるように、軟骨細胞(chondrocytic)分化に典型的な細胞外プロテオグリカン分子を明らかに生成した。図１２は、ＵＳＳＣ由来ペレット培養物のアルシアンブルー染色を示す。ＵＳＳＣ類を、沈降培養(sedimentation culture)下で、軟骨形成分化培地中で成長させた。誘発培地中で６日後、軟骨形成分化の特徴的なマーカーとしての多量のプロテオグリカン（ＰＧ）を、アルシアンブルー染色によって検出することはできない（パネルＡ）。それに対して、ＰＧ類は、青色／緑色によって示されるように、容易に検出され得る（パネルＢ）。
【００５７】
更に、軟骨特異的コラーゲンタイプＩＩの存在を、蛋白質レベルで示すことができた。図１３：軟骨形成分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）。
【００５８】
ＵＳＳＣ類を、軟骨形成分化培地中で培養した。１４日目の細胞外マトリックス蛋白質コラーゲンタイプＩＩの発現を、抗コラーゲンタイプＩＩ第一抗体およびＦＩＴＣ抗マウス第二抗体を使用して、蛍光顕微鏡によって示した（図１３Ｂ）。
【００５９】
ここで、非制限幹細胞の更なる多様性を、ＰＥＩプロトコルの下での、より高濃度のデキサメタゾンによる、そのような先に増加させた培養物の脂肪細胞への分化によって示す(実施例５)。
【００６０】
図１４は、オイルレッド（シグマ(Sigma)）によって特異的に染色され得る脂肪細胞を示す。脂肪細胞は、多量の細胞内小嚢およびオイルレッドによる特異的赤色染色を特徴とする。
【００６１】
更に、１０μＭの５’−アザシチジンおよび次に１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＨ５１００中で２４時間培養した場合、ＵＳＳＣ類は、筋肉分化の確固たる証拠を示す。細胞の形態の変化は、ゆっくり作用するミオシンの発現と同時に起こる(図１５および１６)。
【００６２】
また、典型的な卵細胞の出現および増殖は、ＰＥＩによって誘発されたＵＳＳＣ類が、図６に示された（実施例８）、ＣＤ３４+小集団からサブクローニングされる場合、後の継代において定期的に観察される（図１７）。これらの細胞は、酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶを様々な程度で(to variable degrees)発現し、このことは、そのような卵細胞が、肝臓の細胞へ更に分化し得ることを意味する。
【００６３】
インビトロで増加したＵＳＳＣは、５０％の部分的な肝切除を伴うＳＣＩＤマウスの再生肝臓内ならびに肝切除されていない肝臓内への注入後に生存し、そして存続するのに対し、臍帯血由来の単核細胞は、２５倍多い数の細胞が移植されるとしても検出され得ない。図１８は、ＳＣＩＤマウスの肝臓柔組織内への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合を示す。図１８Ａ：移植７日後の赤色蛍光は、本発明のヒトＰＫＨ２６−ラベルＵＳＳＣ類の生存およびマウス肝臓組織への統合を示す（肝切除なし）。それに対し、臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣ類）の移植後、ヒトＭＮＣ類の統合を示す赤色蛍光は検出され得なかった。図１８Ｂ：Ａに対応するマウス肝臓組織の凍結切除：統合されたヒトＵＳＳＣ類を含むマウス肝臓組織の透過光顕微鏡写真。
【００６４】
肝臓および膵臓β島細胞のための前駆体は同じであるので、そのようなＣＢ由来卵細胞も、それらを、糖尿病の患者または肝不全の患者における細胞治療のための有用なツールにする、インシュリン生成β−島細胞へ分化され得る。
【００６５】
これらの明らかな臨床的適用の他に、いずれかの良好に特徴付けされ、そして標準化条件下で増やされた幹細胞成分およびそれらの子孫(progeny)を、新たに開発された薬剤の作用ならびに分子および細胞効果を観察して規定することにより、所定の動物に基づく実験の代わりにもするために使用することができる。
【００６６】
従って、ここで記載した、これらの良好に特徴付けされた幹細胞およびヒトの臍帯血培養物から得られた分化された細胞は、薬学およびバイオマテリアル産業のための価値あるテスト試薬として使用される。
適当な培養条件下において、ＵＳＳＣ調製物は、異なる造血系統の多数のコロニーを形成し、これらの細胞が、造血を生じさせ得るという証拠を示した。
【００６７】
所定の濃度のＶＥＧＦ、Ｆｌｔ ３Ｌ、ＳＣＧＦ（幹細胞成長因子）を含む、適当に調整された培養培地の下で、および、メチルセルロース中で、そのような細胞は、ＦＬＫ１＋およびＡＣ１３３＋、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２マーカーに対しても陽性の細胞を含む混合コロニーを形成する。更なる分化において、ＡＣ１３３ネガティブ、ＣＤ３１+、ＣＤ５４+、ＶＷＦ+、ＶＥ−カテリン(Ｃａｔｈｅｒｉｎ)+を含む、内皮細胞に特徴的なマーカープロファイルが発達した。
【００６８】
血管疾患の治療のための自己由来および同種異系血管のインビトロ成長のための、そのような内皮細胞の明らかな有用性を、ここに記載する。
【００６９】
同時に、これらのインビトロ生成され、そして均質に増やされた前駆体およびそれれらの分化された細胞のすべては−クローンレベルで−細胞生物学および細胞または分子によって媒介される治療に基づくその後のすべての医学的適用における、特異的遺伝子およびそれらの生成物の役割の規定のためのきわめて重要なツールとして役立つ。
【００７０】
医学的に適用され得る再生細胞型の生成のために、多数の粘着して成長する(adherently growing)本発明のＵＳＳＣ類およびより多くの分化された間葉幹細胞を生み出すためには、この珍しい細胞型は、少数だけで十分である。
【００７１】
この知識の１つのまったく新しい見解は、そのような前駆体が、２つ以上のはっきりと分化している細胞型へ、非対照的に進化し得る点である。これにより、インビトロでも生じる、機能的に方向付けられた(functionally oriented)細胞再生における、共存成分制御の新たな生物学的原則が明らかになる。
【００７２】
本発明の結論は、幹細胞に基づく治療法は、この原則に従って設計されなければならず、そして、１つのクローン細胞型のみからなるものではいけないということである。本発明を、以下の非限定的な実施例において更に説明する。
【実施例１】
【００７３】
臍帯血の回収（ＣＢ）
母親にインフォームドコンセントを行って、産科において臍帯血の回収を行った。まだ子宮中での胎盤による赤ん坊の輸送後に、へその緒を、二重に締めて、へそから７−１０ｃｍ離れたところで横に切開した(transsected)。へその緒の消毒後、臍静脈に穴を開けて、抗凝血剤として、サイトレートホスフェートデキストロース（ＣＰＤ）を含む回収バッグ内へ、ＣＢを回収した。
【００７４】
臍帯血からの単核細胞の単離
へその緒の臍帯血を、フィコール(Ficoll)溶液上へ注意深く載せた（密度１．０７７ｇ／ｃｍ3）。濃度勾配遠心分離を行った（４５０ｇ、室温、２５分）。中間期の単核細胞（ＭＮＣ）を回収し、ｐＨ７，３のリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。
【００７５】
線維芽球様細胞形態の粘着層の生成
単核細胞を、Ｔ２５培養フラスコ（ヌンクロン(Nunclon)）中で、約５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で平板培養した[Ａ．）、Ｂ．）、Ｃ．）]。４つの異なる培養法を使用して、粘着幹細胞の成長を開始させた：
Ａ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含むミエロコルト(Myelocult)H5100培地(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー／カナダ)中で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｂ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含むメセンコルト(Mesencult)(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー／カナダ)中で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｃ．）１０-7Ｍのデキサメタゾンを含む３０％のＦＣＳを含む低グルコースのＤＭＥＭ(バイオ−ホワイタッカー(Bio-Whittaker))中で、Ｂ由来のＭＮＣ類を最初に培養した。
Ｄ．）デキサメタゾンなしで、５０ｍｌの培養フラスコ（ヌンクロン(Nunclon)）内の１０ｍｌのミエロコルト(Myelocult)Ｈ５１００培地(ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)、バンクーバー、カナダ)中で、５×１０6／ｍｌの密度で、ＣＢ由来のＭＮＣ類を平板培養した。
【００７６】
すべての培養物を、完全な湿潤雰囲気中で、５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートし、非粘着細胞を含む完全培地を除去して１０ｍｌの新鮮な培地を添加することにより、週に１回供給した。いくつかの時点の後に、粘着性の紡錘状細胞を、０．０５％のトリプシンおよび０．５３ｍＭのＥＤＴＡによる２分間の処理によって除去し、５０％の血清含有培地によってすすぎ洗いし、遠心分離によって７８０ｇ回収し、そして、フローサイトメトリーまたはＲＴ−ＰＣＲによって分析した。２〜３週後、線維芽球様細胞形態の粘着細胞が、全細胞培養物の約３０％に現れる。
【００７７】
本発明のＵＳＳＣ類の増加のための培養条件
本発明のＵＳＳＣ類を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ Ｉ（インシュリン状成長因子−Ｉ）、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（小板由来の成長因子−ＢＢ）、および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ヒトＥＧＦ（組み換え型ヒト表皮成長因子）を含むＨ５１００培地（ＰＥＩ培地）中で、１×１０4〜１×１０5細胞／ｍｌの密度で増加させることができる（増加方法Ａ）。代わりに、ＵＳＳＣ調製物を、初期成長培地Ａ、Ｂ、およびＣ中で増加させることができる。
【実施例２】
【００７８】
細胞蛍光計(cytofluorometry)による細胞の免疫表現型のタイピング(immonophenotyping)
ＵＳＳＣ類の免疫表現型を決定するために、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、ＰＥ結合抗ＣＤ１４（ファーミンゲン(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、ヤギＦ（ａｂ｀）2抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣによってラベルされた抗ＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０）（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ１０−ＰＥ（ＣＡＬＬＡ、ファーミンゲン(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ)）、ヤギＦ（ａｂ｀）2抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ （Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣによってラベルされた抗ＨＬＡ−クラスＩ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ１３−ＰＥ（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)、コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）；抗ＣＤ２９（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ４４（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ４９ｅ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＣＤ９０（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）、抗ＨＬＡ−クラスＩＩ−ＦＩＴＣ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）によって、細胞を染色した。ＥＰＩＣＳ ＸＬ（コールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)）またはＦＡＣＳ分析器（ベクトン・ディケンソン(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)を用いて、細胞を分析した。
【実施例３】
【００７９】
ＵＳＳＣ類の骨形成分化の可能性の立証
実施例１に記載したように得られたＵＳＳＣ類を、それらが７０％の融合度(confluency)に達するまで、標準培地中で培養した。１０-7Ｍのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを添加することによって、これらの細胞の骨形成分化を誘発した(ブルーダー(Bruder)ら、1994、ジャイスワル(Jaiswal)ら、1997)。刺激の１０日目に、細胞は、カルシウムホスフェート沈殿を示し、それにより、骨小節が得られた。鉱化した骨小節を、アリザリンレッドによる染色によって、以下のように検出した：培養物中の粘着細胞を、ｐＨ７．３のＰＢＳによって２回洗浄し、室温で１時間、５ｍｌの０．１％アリザリンレッド溶液によって、次いで、０．１％の酢酸および無水得エタノールならびにＰＢＳによって染色した。
【００８０】
カルシウムのアリザリンレッドおよびフォン・コッサ染色は、これらの細胞の鉱化の可能性を示す（スタンフォード(Stanford)ら、1995、ルングバイ(Rungby)ら、1993）。骨に特異的な分化マーカーオステオカルシン(OC)、オステオポンチン(osteopontin)(OP)、骨に特異的なアルカリホスファターゼ(AP)、骨シアロ蛋白質 (BSP)、小板由来成長因子レセプターアルファ(PDGF-Ra)、表皮成長因子レセプター(EGFR)、およびコラーゲンタイプＩを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによっても、骨形成分化が示された。
【実施例４】
【００８１】
ＵＳＳＣ類の軟骨形成分化の可能性の立証
軟骨形成分化のために、２×１０5個の粘着幹細胞を、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中の沈降培養物中に置いた。デキサメタゾン、プロリン、ピルビン酸ナトリウム、ITS+プレミックス、およびＴＧＦ−β１を含む高グルコースのＤＭＥＭを、細胞培養培地として使用した（ジョーンストーン(Johnstone)ら、1998、ヨー(Yoo)ら、1998）。７、１４、および２１日目に、Ｃａｒｔ−１、コラーゲンタイプＩＩおよびコンドロアドヘリンをコードする軟骨に特異的な遺伝子産物について、ＲＴ−ＰＣＲによって細胞画分を分析した。また、ＵＳＳＣ類を、沈降培養物中で使用した。２週間後に、デワックス(Dewax)セクションを、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドによって固定し、エタノール中で洗浄した。セクションを、１％アルシアンブルー／３％酢酸、ｐＨ２，５によって５分間染色し、蒸留水中で洗浄した。それらは、アルシアンブルー染色によって示されるように、特異的なプロテオグリカンの陽性染色を明らかに示す（チャオ(Chao)ら、1993）。１４日の軟骨形成誘発期の後に、細胞を、標準プロトコルに従って固定し、蛍光顕微鏡によって分析したところ(ロゼンバウム(Rosenbaum)ら、1998)、コラーゲンタイプＩＩに特異的な細胞外マトリックスの存在が示された（図１３Ｂ）。
【実施例５】
【００８２】
ＵＳＳＣ類の脂肪形成分化の可能性の立証
１０-6Ｍのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを含むＨ５１００中で、ＵＳＳＣを培養したところ、オイルレッド染色によって示されるように、脂肪細胞へのＵＳＳＣ類の部分的な分化が得られた(ラミレズ−ザカリアス(Ramirez-Zacarias)ら、1992)。
【実施例６】
【００８３】
ＵＳＳＣ類の神経形成(neurogenic)分化の可能性の立証
神経膠細胞のための細胞単離および培養条件
製造者(ミルテニイ・バイオテク(Miltenyi Biotec)、バーギシュ・グラドバッハ(Bergisch Gladbach))の指示に従って、ＶＳ＋分離カラムを使用して、ＣＤ１４／磁気活性化細胞選別(magnetic Activated Cell Sorting)（ＭＡＣＳ）によって、ＣＤ１４＋細胞のために、記載したように得られた単核臍帯血細胞を使い果たした。ＣＤ１４に使い果たされた単核細胞を、Ｔ２５培養フラスコ(ヌンクロン(Nunclon))内の１０ｍｌの高グルコース培地(４５００Ｇ／Ｌのグルコースを含むダルベッコ(Dulbecco´s)MEM)中で、２×１０6／ｍｌの密度で培養し、完全湿潤雰囲気中で、５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。１０−１５日後に、培養物中で、神経膠状細胞が検出された。
【００８４】
神経細胞への分化
Ａ）Ｈ５１００のみの中で、または４０ｐｇ／ｍｌのＰＤＧＦＢ、１０ｐｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｐｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉの存在下のいずれかで、細胞を７日間増やした。細胞をトリプシン化し、ポリＤ−リジン（ＰＤＬ）およびラミニン(laminin)(PDL/lam)によって被覆されたカバースリップ上の２４ウェル培養皿において、約３，５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で平板培養した。次いで、オールトランスレチノイド酸（１０-5Ｍ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＮＧＦ−β（５０ｎｇ／ｍｌ）のような誘発剤を変化することにより、ニューロン分化を開始した。
【００８５】
蛍光顕微鏡
誘発期間（２７日）後、細胞を、標準プロトコルに従って固定して、神経特異的抗原に対する抗体によって染色した。蛍光および透過光顕微鏡を用いて、標本を分析した。
【実施例７】
【００８６】
ミオサイト(myocytic)系統における分化の可能性の立証
１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦＢＢ、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦを補充したＨ５１００培地（ステムセル・テクノロジー(StemCell Technology)）において、３７℃、５％ＣＯ2で、１×１０4個のＵＳＳＣ類を、それらの融合度が７０％に達するまで培養した。その後、細胞を、１０μＭの５’−アザシチジン（シグマ(Sigma)）と共に２４時間インキュベートし、ＰＢＳによって２回洗浄し、そして、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（シグマ(Sigma)）を補充したＨ５１００培地中で培養した。分化培地において１週間後、細胞の形態が変化した（図１５）。１０日後、細胞を、トリプシン化し、免疫染色のために、フィブロネクチンによって被覆したガラスチャンバースライドへ移した。
【００８７】
免疫組織化学
細胞を、５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳによって１５分間固定し、ｐＨ７．３のＰＢＳ中で２回洗浄した。標準プロトコルを使用して、抗骨格(anti-skeletal)ミオシン(遅い)特異的第一抗体(クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ、１：４００）(緑で示す)と共に、そして、抗ＣＤ１３第一抗体（赤で示す）またはモノクローナル抗骨格ミオシン第一抗体（クローンＭＹ−３２、１：４０００）と共に、細胞をインキュベートした。上記培養条件下で培養されたＵＳＳＣ類について、染色は陽性であった（図１６）。
【実施例８】
【００８８】
ヒトのＵＳＳＣ細胞ならびに臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣ）を、PKH26 レッド・フルオレセント・セル・リンカー・キット(RED Fluorescent Cell Linker Kit)(シグマ(Sigma)、PKH26-GL)によってラベルした。２×１０5個のＵＳＳＣ類および５×１０6個のＭＮＣ類を、５０％の肝切除あり、およびなしのＳＣＩＤマウスの肝臓柔組織内へ注入した。移植の７日後、肝切除された動物について、完全な肝臓再生が達成された。赤色ラベルされたヒト細胞の存在について、肝臓組織の凍結断片を、蛍光顕微鏡によって分析した（図１８）。
【実施例９】
【００８９】
ＵＳＳＣの造血系統への分化の可能性の立証
長期間（継代５〜８）、適当な増加培地(expansion medium)中で成長する３つの異なるＵＳＳＣ類の調製物(３０％のＦＣＳを含むＤＭＥ培地中のUSSCKCB55、デキサメタゾンを含むＨ５１００培地中のUSSCKCB12、デキサメタゾンを含むメセンカルト(MesenCult)培地中のUSSCKCB13、およびＰＥＩを含むＨ５１００培地中のUSSCGK12)を、造血特異培養培地（メトカルト（Methocult）4434）中で２４ウェルプレートにおいて、２５０μｌ（２×１０4−２×１０5細胞）の細胞懸濁液中へ３回(in triplicate)接種した。５０個を超える細胞のコロニーを数えて、確立された規準に従って、顆粒細胞／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、初期赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞または多能性(CFU-GEMM)前駆細胞由来のように分類した。分化条件下で、異なる培養物中のコロニー形成が、観察の１週間から始まり、３週間まで続くことが明らかになった。ＵＳＳＣ調製物が、異なる系統の多数のコロニーに進化し、これにより、これらの細胞が、造血を引き起こし得ることが証明された。
【実施例１０】
【００９０】
非制限体幹細胞およびそれらの連続分化産物の分析のための分子的方法
オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロ蛋白質、アルカリホスファターゼ、ＰＤＧＦＲαおよびＥＧＦレセプターからの特異的ｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプライマーを、それらを、それらのそれぞれ生み出されるＤＮＡフラグメントの大きさで区別し得るために、異なる各エクソンから選択した。
【００９１】
ｐＣＲＬ１ベクター（インビトロゲン(Invitrogen)／米国）へのクローニングおよび大腸菌株TOP １０Fへの連続した形質転換により、各特異的ｃDNAクローンを得て、自動シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）におけるサイクルシーケンシングによって特徴付けした。
【００９２】
２段階の工程で、RT-PCR反応を行った。１時間、５０℃で、２０μｌ容量の１０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ(Promega)、マンハイム(Mannheim)）、１．５ｐｍｏｌの３’−遺伝子特異的プライマー、１ｍＭのｄＮＴＰ類、および補充されたバッファー（プロメガ(Promega)、マンハイム(Mannheim)）によって、細胞の全ＲＮＡ２００ｎｇを最初に逆転写した。１ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、バッファーおよびＱ−溶液（キアゲン(Qiagen)、ヒルデン（Hilden））、１．５ｍMのｄＮＴＰ類、ならびに２０ｐｍｏｌの３’−および５’−遺伝子特異的プライマーを含む２μｌのｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行った。９５℃での１５分間の開始段階、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分の３７サイクル、および６８℃での５分間の最終重合段階によって、ＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
【表４】
【００９４】
参考文献
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【００９５】
略語
ＤＡＧ デキサメタゾン、アスコルビン酸、およびβ−グリセロホスフェートを含む骨形成分化培地
ＨＬＡ ヒト白血球抗原
ＭＳＣ 間葉幹細胞
ＰＥＩ ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦおよびＩＧＦを含む培地
ＳＳＥＡ４ 段階に特異的な初期抗原４
ＵＳＳＣ 非制限体幹細胞
ＰＧ プロテオグリカン
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、低密度で平板培養された初期ＵＳＳＣ培養細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、融合性ＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、インビトロ培養の間のＣＤ４５抗原に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図４】図４は、ＳＳＥＡ４胚マーカーに関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図５】図５は、ＨＬＡ−クラスＩ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＨＬＡ ＤＲおよびＣＤ１４に関するＦＡＣＳ分析を示す。
【図６】図６は、ＣＤ３４表面マーカーに関するＦＡＣＳ運動性(kinetic)を示す。
【図７】図７は、ニューロン誘発後のＵＳＳＣ細胞の顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、本発明のUSSC類が、抗ネスチン免疫染色を行う神経幹細胞マーカーネスチンを発現することを示す。
【図９】図９は、ニューロン系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【図１０】図１０は、神経膠系統の細胞を生み出すＵＳＳＣ類を示す。
【図１１】図１１は、骨形成誘発後およびアリザリンレッドによる染色後（Ｂ）の鉱化された小節形成を示す。
【図１２】図１２は、ＵＳＳＣ由来のペレット培養物のアルシアンブルー染色を示す。
【図１３】図１３は、軟骨形成分化後のＵＳＳＣ培養物のコラーゲンタイプＩＩ染色（緑）を示す。
【図１４】図１４は、オイルレッド染色によって示されるＵＳＳＣ培養物の脂肪形成分化を示す。
【図１５】図１５は、筋形成分化前後のＵＳＳＣ培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１６】図１６は、アザシチジン処理後のゆっくり作用するミオシンに関する免疫細胞化学を示す。
【図１７】図１７は、ＵＳＳＣ誘導体の卵細胞表現型を示す。
【図１８】図１８は、SCIDマウスの肝臓柔組織への注入後のＵＳＳＣ培養物の生存および統合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管疾患、心臓もしくは平滑筋の疾患、肝臓疾患、タイプ１の糖尿病、神経疾患、パーキンソン病疾患、または血液疾患を治療するための薬剤の製造における、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する非制限体幹細胞（ＵＳＳＣｓ）の使用方法。
（ｉ）ＣＤ４５およびＣＤ１４表面抗原に対して陰性であり；
（ｉｉ）ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅ抗原に対して陽性であり；
（ｉｉｉ）ＹＢ１、ＡＭＬ−１、ＲＵＮＸ−１、およびフィブリン−２を発現し；および
（ｉｖ）ヒアルロナンシンターゼ、フィブロモジュリン、およびＩＮＦＬＳを発現しない。
【請求項２】
前記薬剤が前記非制限体幹細胞をインビトロで分化せしめた子孫をさらに含む請求項１の使用方法。
【請求項３】
前記薬剤が血管疾患の治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記薬剤が心臓疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項５】
前記薬剤が平滑筋疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項６】
前記薬剤が肝臓疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項７】
前記薬剤がタイプ１の糖尿病を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項８】
前記薬剤が神経疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項９】
前記薬剤がパーキンソン病疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記薬剤が血液疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項１１】
非制限体幹細胞が、へその緒の臍帯血または胎盤血から単離されたものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１】
血管疾患、心臓もしくは平滑筋の疾患、肝臓疾患、タイプ１の糖尿病、神経疾患、パーキンソン病疾患、または血液疾患を治療するための薬剤の製造における、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する非制限体幹細胞（ＵＳＳＣｓ）の使用方法。
（ｉ）ＣＤ４５およびＣＤ１４表面抗原に対して陰性であり；
（ｉｉ）ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｅ抗原に対して陽性であり；
（ｉｉｉ）ＹＢ１、ＡＭＬ−１、ＲＵＮＸ−１、およびフィブリン−２を発現し；および
（ｉｖ）ヒアルロナンシンターゼ、フィブロモジュリン、およびＩＮＦＬＳを発現しない。
【請求項２】
前記薬剤が前記非制限体幹細胞をインビトロで分化せしめた子孫をさらに含む請求項１の使用方法。
【請求項３】
前記薬剤が血管疾患の治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記薬剤が心臓疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項５】
前記薬剤が平滑筋疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項６】
前記薬剤が肝臓疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項７】
前記薬剤がタイプ１の糖尿病を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項８】
前記薬剤が神経疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項９】
前記薬剤がパーキンソン病疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記薬剤が血液疾患を治療における使用のためのものである請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項１１】
非制限体幹細胞が、へその緒の臍帯血または胎盤血から単離されたものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−１７９６４２（Ｐ２００８−１７９６４２Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６８５９（Ｐ２００８−１６８５９）
【出願日】平成２０年１月２８日（２００８．１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５３９４９７（Ｐ２００２−５３９４９７）の分割
【原出願日】平成１３年１１月３日（２００１．１１．３）
【出願人】（５０３１６３３６５）クーリオン テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２８日（２００８．１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５３９４９７（Ｐ２００２−５３９４９７）の分割
【原出願日】平成１３年１１月３日（２００１．１１．３）
【出願人】（５０３１６３３６５）クーリオン テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
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