ヒト造血細胞の培養方法
【課題】移植の際に安全性が高いヒト造血幹細胞を簡単かつ適時に増幅することができるヒト造血幹細胞の増幅培養方法の提供
【解決手段】 臍帯血からヒト造血細胞を取得し、当該ヒト造血細胞を取得した臍帯血を用いてストローマ細胞を生成し、取得したヒト造血細胞を生成したストローマ細胞の共存下で培養する。これにより、移植が必要なときに臍帯血からプライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いて増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。
【解決手段】 臍帯血からヒト造血細胞を取得し、当該ヒト造血細胞を取得した臍帯血を用いてストローマ細胞を生成し、取得したヒト造血細胞を生成したストローマ細胞の共存下で培養する。これにより、移植が必要なときに臍帯血からプライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いて増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト造血細胞を培養する方法に関し、特にヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞を用いて、ヒト造血細胞を増幅培養するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の難治性血液疾患に対し、骨髄移植治療が施されている。骨髄移植治療では、一生涯にわたり各種血球細胞を産生する造血幹細胞を提供者（ドナー）から取得し、取得した造血幹細胞を受容者（レシピエント）の骨髄に定着させる。この骨髄移植治療では、大量の骨髄細胞をドナーから取得する必要があるため、ドナーの心身への負担が大きいという問題がある。また、骨髄移植治療においては、ドナー由来のＴ細胞の混入による急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症や、自己移植の際のがん細胞の混入による再発という問題もある。
【０００３】
このような状況の中、最近になって、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた。臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療では、骨髄や末梢血と比べて重症のＧＶＨＤの発生率が低いという利点がある。しかし、臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療には、臍帯から取得できる臍帯血の採取量が少ないという問題がある。このため、１個体に由来する臍帯血では体重４０ｋｇ程度までのレシピエントに移植可能とされている。
【０００４】
そこで、取得した臍帯血に含まれる造血幹細胞を効率的に増幅培養する試みが行われている。
【０００５】
このような造血幹細胞の増幅培養方法の一つに、胎盤組織および臍帯組織由来のストローマ細胞を、造血幹細胞を含むヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅培養に応用する造血幹細胞の培養方法（以下、組織由来増幅培養方法とする。）がある。組織由来増幅培養方法は、以下のように行われる。
【０００６】
１．ヒト胎盤からの造血ストローマ細胞の分離回収
臍帯血採取後の胎盤から臍帯と羊膜を除去した後、母体側からハサミで組織を採取し、血液を可及的に取り除く。このようにして１個の胎盤より２００ｇ〜３００ｇの胎盤の組織切片を採取する。そして、これら組織切片を、培養皿に張り付け、所定の条件で１０日〜１４日培養した後、回収する。
【０００７】
２．ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製
採取したヒト臍帯血から単核細胞を回収する。回収した臍帯血単核細胞からＣＤ３４陽性細胞を分画する。
【０００８】
３．臍帯血ＣＤ３４陽性細胞と胎盤由来造血ストローマ細胞との共培養
回収した組織切片と分画して得られた臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞とを、所定のサイトカインの存在下、所定条件で、１０日間、共培養する。なお、共培養の際に用いる組織切片は、ヒト胎盤由来の造血ストローマ細胞として機能する。
【０００９】
このような組織由来増幅培養方法により、ヒトＣＤ３４陽性幹細胞を簡便にしかも安全に増幅することが可能となる。よって、少量の臍帯血であっても、任意の成人患者に移植できる上に、数回にわたる継続投与が可能となる。
【００１０】
また、臍帯血を一度採取しておけば必要なときに必要な量だけ造血幹細胞を供給することが可能となる。
【００１１】
さらに、骨髄移植においても大量の骨髄細胞を必要としない。よって、骨髄の採取に伴うドナーの心身への負担を低減することができる。
【００１２】
さらに、出産に伴って世界中で廃棄されている臍帯血を有効に活用することができる。現在、廃棄されている臍帯血を保有することによって、幅の広い移植抗原を有する造血幹細胞を保有することが可能となり、結果的に、移植抗原の適合する移植が可能となる。よって、重症のＧＶＨＤが発症するリスクを低減することが可能となる。
【００１３】
さらに、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いれば、造血幹細胞の増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増幅した細胞を採取することができ、増幅させた細胞を、直接、輸注することができる。
【００１４】
【特許文献１】特開平２００４−２２２５０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述の組織由来増幅培養方法には、次のような問題点がある。組織由来増幅培養方法では、胎盤から組織切片を取得し、造血幹細胞に対するストローマ細胞として、造血幹細胞と共培養している。一方、造血幹細胞は、臍帯から取得している。つまり、造血幹細胞を取得する臍帯とは異なる組織である胎盤を必ず必要とする。このため、取得した胎盤を保存しなければならないという問題がある。
【００１６】
また、胎盤自体を保存せずに胎盤から取得したストローマ細胞を保存するとしても、当該ストローマ細胞をセル・ライン化（株化）しなければならないという問題がある。セルライン化に際しては新たに遺伝子を導入等する必要があることから、遺伝子の選択や導入する遺伝子が幹細胞の増幅能や造血能等に与える影響を考えなければならないという新たな問題が発生する。
【００１７】
さらに、胎盤若しくは当該胎盤から取得したストローマ細胞を保存せずに、臍帯血の造血幹細胞を増幅させる必要が生じた時、つまり造血幹細胞の移植が必用となった時に取得できた胎盤を用いる場合には、造血幹細胞に対して同種異系のストローマ細胞と共培養し、得られた造血幹細胞を移植することとなる。よって、ストローマ細胞の生成の際に取り除けなかった病原菌や知られていないアレルゲンをも移植してしまう可能性があるという安全性の問題がある。
【００１８】
さらに、造血幹細胞を同種異系のストローマ細胞と共培養する場合、共培養結果得られた造血幹細胞とストローマ細胞との混合細胞から、ストローマ細胞の取り除かなければならない。このため、臍帯血由来の造血幹細胞の増幅の際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いる方法が考えられるが、造血幹細胞の増幅の際、つまり、造血幹細胞の移植の際に、ＨＬＡが適合するストローマ細胞を生成できる胎盤を必ず得られるかという問題がある。
【００１９】
さらに、同種異系のストローマ細胞を生成する胎盤が得られない場合に、異種のストローマ細胞を生成する組織を用いるとなれば、前述の安全性の問題がさらにクローズ・アップされることになる。
【００２０】
そこで、本発明は、移植の際に安全性が高いヒト造血幹細胞を簡単かつ適時に増幅することができるヒト造血幹細胞の増幅培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は以下の内容から構成される。
【００２２】
（１）ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とするヒト造血細胞の培養方法。
【００２３】
（２）前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである前記（１）に記載のヒト造血幹細胞の培養方法。
【００２４】
（３）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る前記（２）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２５】
（４）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る前記（３）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２６】
（５）前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする前記（４）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２７】
（６）前記ヒト造血細胞は、前記ストローマ細胞のもととなった血液と同一の血液から抽出されたものである前記（１）〜前記（５）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００２８】
（７）前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する前記（６）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２９】
（８）前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である前記（１）〜前記（７）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３０】
（９）前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である前記（１）〜前記（８）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３１】
（１０）前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である前記（１）〜前記（９）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３２】
（１１）前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である前記（１）〜前記（９）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３３】
（１２）前記（１）〜前記（１１）に記載のいずれかの方法により得られる培養物。
【００３４】
（１３）前記（１）〜前記（１１）に記載のいずれかの方法により得られるヒト造血幹細胞培養物。
【００３５】
（１４）ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成するストローマ細胞の生成方法。
【００３６】
（１５）前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する（１４）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３７】
（１６）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る（１５）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３８】
（１７）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る（１６）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３９】
（１８）前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする（１７）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００４０】
（１９）前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である（１４）〜（１８）に記載のいずれかのストローマ細胞の生成方法。
【００４１】
（２０）（１４）〜（１９）に記載のいずれかの方法により得られるストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤。
【００４２】
本発明の詳細については、以下の「発明を実施するための最良の形態」において説明する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養する。これにより、血液からストローマ細胞を取得するので、プライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いてヒト造血細胞を増幅することができるので、増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、血液は容易に保存することができるので、ストローマ細胞のセル・ライン化（株化）といった問題が生じないことから、安全性が高いヒト造血細胞の移植が可能となる。
【００４４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである。よって、有核細胞は血液から容易に得ることができるので、容易にストローマ細胞を得ることができる。
【００４５】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る。よって、有核細胞からストローマ細胞を培養するので、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間を短縮することができる。一般的に、血液のどの分画(有核・単核・ＣＤ３４＋単核）からストローマ細胞を培養するにしても、ストローマ細胞の培養に細胞株でないプライマリ細胞を使う限り、培養開始から培養終了、さらに培養したストローマ細胞が壊死する若しくは使用できなくなるまでの期間は、約１ヶ月と推定されている。このため、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間が短ければ、それだけストローマ細胞とヒト造血細胞との共培養の期間を長く確保することができる。
【００４６】
例えば、単核球やＣＤ３４＋単核球を使うと、ストローマ細胞の培養に約３週間の時間を必用とし、結果的に約１週間ぐらいしか共培養の期間を確保できない。このため、共培養による十分な造血幹細胞の増幅が見込めない。一方、有核細胞を使うと諸条件により約２週間でのストローマ細胞の培養が可能であり、結果的に、共培養の期間も２週間確保することが可能となる。
【００４７】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る。これにより、ヒト造血細胞の培養に際して、ヒト臍帯静脈内皮細胞と同様の機能を有すると考えられるストローマ細胞を用いることができる。よって、ヒト造血細胞とストローマ細胞と共培養する際に、ヒト造血細胞を臍帯内と類似する微環境におくことができる。結果として、ヒト造血細胞の自己増幅力及び多分化能力を含む造血能力を向上させることができる。
【００４８】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記有核細胞を１０日〜１４日間培養する。これにより、セミ・コンフルエントな状態に培養された有核細胞を容易に得ることができる。
【００４９】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞を、前記ストローマ細胞の由来元の血液と同一の血液から抽出する。よって、ヒト造血細胞を増幅に際して、血液以外の組織を必要としない。血液の保存は容易に行えることから、結果的に、必要なときに保存された血液を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００５０】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する。これにより、ストローマ細胞を得るために有核細胞を培養している間、ヒト造血細胞の分化を止めることができる。よって、培養に時間を必要とするストローマ細胞との共培養を容易に行うことができる。
【００５１】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である。これにより、ヒト造血細胞マーカーであるＣＤ３４及びＣＤ１３３を用いて、容易にヒト造血細胞を得ることができる。
【００５２】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である。これにより、例えば臍帯血からヒト造血細胞及びストローマ細胞を取得することとすれば、臍帯血以外の組織を必要としない。臍帯血の保存は、現在、既に臍帯血バンクとして行われていることから、結果的に、必要なときに保存された臍帯血を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００５３】
さらに、臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。よって、臍帯血バンクにおけるコレクションの数が多くなるので、 移植を必要とするレシピエントとＨＬＡが適合する臍帯血が見つかる可能性を高めることができ、移植の成功率を向上させることができる。
【００５４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である。これにより、容易にヒト造血幹細胞を増幅培養することができる。
【００５５】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である。これにより、容易にヒト造血前駆細胞を培養することができる。
【００５６】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞では、ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成する。これにより、プライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いたヒト造血細胞の増幅が可能となるので、増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、血液は容易に保存することができるので、ストローマ細胞のセル・ライン化（株化）といった問題が生じないことから、当該ストローマ細胞を用いたて増幅したヒト造血細胞を用いれば、安全性が高いヒト造血細胞の移植が可能となる。
【００５７】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞では、前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する。よって、有核細胞は血液から容易に得ることができるので、容易にストローマ細胞を得ることができる。
【００５８】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養するよって得る。よって、有核細胞からストローマ細胞を培養するので、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間を短縮することができる。一般的に、血液のどの分画(有核・単核・ＣＤ３４＋単核）からストローマ細胞を培養するにしても、ストローマ細胞の培養に細胞株でないプライマリ細胞を使う限り、培養開始から培養終了、さらに培養したストローマ細胞が壊死する若しくは使用できなくなるまでの期間は、約１ヶ月と推定されている。このため、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間が短ければ、それだけストローマ細胞とヒト造血細胞との共培養の期間を長く確保することができる。
【００５９】
例えば、単核球やＣＤ３４＋単核球を使うと、ストローマ細胞の培養に約３週間の時間を必用とし、結果的に約１週間ぐらいしか共培養の期間を確保できない。このため、共培養による十分な造血幹細胞の増幅が見込めない。一方、有核細胞を使うと諸条件により約２週間でのストローマ細胞の培養が可能であり、結果的に、共培養の期間も２週間確保することが可能となる。
【００６０】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る。これにより、ヒト造血細胞の培養に際して、ヒト臍帯静脈内皮細胞と同様の機能を有すると考えられるストローマ細胞を用いることができる。よって、ヒト造血細胞とストローマ細胞と共培養する際に、ヒト造血細胞を臍帯内と類似する微環境におくことができる。結果として、ヒト造血細胞の自己増幅力及び多分化能力を含む造血能力を向上させることができる。
【００６１】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする。これにより、セミ・コンフルエントな状態に培養された有核細胞を容易に得ることができる。
【００６２】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である。これにより、例えば臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、臍帯血からヒト造血細胞を取得することができるので、ヒト造血細胞の培養に際して、臍帯血以外の組織を必要としない。臍帯血の保存は、現在、既に臍帯血バンクとして行われていることから、結果的に、必要なときに保存された臍帯血を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００６３】
さらに、臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。よって、臍帯血バンクにおけるコレクションの数が多くなるので、 移植を必要とするレシピエントとＨＬＡが適合する臍帯血が見つかる可能性を高めることができ、移植の成功率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明の発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系由来のストローマ細胞の共存下で培養することにより、移植の際に安全性が高いヒト造血幹細胞を簡単かつ適時に増幅することができることをみいだし、本発明を完成するに至った。
【００６５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００６６】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法は、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする方法である。
【００６７】
「ヒト造血細胞」とは、あらゆる種類若しくは系統の血液成分に分化しうる能力を有する未分化なヒトの血液細胞をいう。ヒト造血細胞には、ヒト造血幹細胞、ヒト造血前駆細胞が含まれる。一方、分化した血液細胞、例えば、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）など、または、分化した血液細胞由来産物である赤血球、血小板などは、「ヒト造血細胞」の概念に含まれない。
【００６８】
「分化」とは、細胞の表面に現れる表面抗原分子が変化して、次の成熟段階の細胞になることをいう。前記分化には、例えば、ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋）からリンパ系幹細胞または骨髄系幹細胞または赤芽球になること、リンパ系幹細胞からＴ前駆細胞またはＢ前駆細胞になること、骨髄系幹細胞からマスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、巨核球、単球、好中球等になること、赤芽球から赤血球になること、Ｔ前駆細胞からＴ細胞になること、Ｂ前駆細胞からＢ細胞になること等が含まれる。
【００６９】
「ヒト造血幹細胞」とは、あらゆる種類若しくは系統の血液成分に分化する多分化能力を有するとともに自己を複製する自己複製能力を有する細胞をいう。ヒト造血幹細胞は、例えば、ヒト骨髄、ヒト臍帯血、ヒト末梢血に存在する。
【００７０】
「ヒト造血前駆細胞」とは、限定的な一又は複数種類若しくは系統のヒトの血液成分に分化する分化能力を有するヒトの細胞をいう。ヒト造血前駆細胞は、２〜３種類若しくは系統の血球に分化できる寡能性造血前駆細胞、１種類若しくは系統の血球に分化が限定される単能性造血前駆細胞に分類することができる。
【００７１】
ヒト前駆細胞は、特定の細胞マーカーを判別する公知の方法により分類することができる。例えば、骨髄系細胞のマーカーとしてＣＤ１３、単球及びマクロファージ系のマーカーとしてＣＤ１４、巨核球系マーカーとしてＣＤ４１、赤血球系マーカーとしてグリコホリン、Ｂ細胞系マーカーとしてＣＤ１９、Ｔ細胞系マーカーとしてＣＤ３が知られている。
【００７２】
ヒト造血前駆細胞を判別する公知の方法としては、例えば、コロニーアッセイ法（in vitro コロニー法）がある。
【００７３】
ヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞は、特定の抗原表現型を発現している細胞である。よって、臍帯血、または臍帯血から抽出した有核細胞から、特定の抗原表現型を発現している細胞を抽出することによって、結果的にヒト造血幹細胞、ヒト造血前駆細胞を得ることができる。
【００７４】
特定の抗原表現型としては、例えば、ＣＤ３４がある。したがって、ヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞といえる。
【００７５】
ＣＤ３４＋細胞は、例えば、臍帯血から分離抽出することによって得ることができる。具体的には、（１） 臍帯血から有核細胞を分離抽出する工程、（２） 抽出した有核細胞からマイクロビーズをコンジュゲート（conjugate）した抗ＣＤ３４抗体を用いて ＣＤ３４＋細胞を分離抽出する工程からなる。マイクロビーズをコンジュゲート（conjugate）した抗ＣＤ３４抗体としてＣＤ３４ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ベルギッシュ・グラッドバッハ、ドイツ）を用い、マイクロビーズを用いてＣＤ３４＋幹細胞を採取する装置として自動ＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いる。
【００７６】
なお、特定の抗原表現型としては、ＣＤ３４の他に、他の造血細胞マーカーを使用することも、若しくはＣＤ３４に加えて複数併用することも可能である。他の造血細胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ３８、ＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３があり、好ましくはＣＤ１３３である。
【００７７】
ヒト造血細胞が、いずれの幹細胞マーカーを発現しているかは、ＦＡＣＳを用いる方法等、公知の方法により測定することができる。
【００７８】
「有核細胞」とは、核を有する細胞をいう。臍帯血から抽出できる有核細胞には、例えば、総ての系列に分化しうるヒト造血幹細胞、リンパ系幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系幹細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、巨核球、単球、好中球、または赤芽球などが含まれる。
【００７９】
臍帯血からの有核細胞の抽出は、例えば、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を用いることによって実現できる。
【００８０】
ストローマ細胞とは、基質細胞または間質細胞をいう。ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤は、例えば、ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液から生成することが可能である。
【００８１】
ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液とは、ヒト造血細胞の由来元の個体と同一の個体から取得する血液をいい、好ましくは、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液、若しくはヒト末梢血であり、さらに好ましくはヒト臍帯血である。
【００８２】
ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤の生成は、例えば（１） 臍帯血から、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を用いて有核細胞を分離抽出する工程、（２） 有核細胞を平皿で培養し、付着細胞を選択的に増殖させセミ・コンフルエントな状態まで育成させる工程、により行われる。
【００８３】
なお、ストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤とは、ヒト造血細胞を造血するために用いられる材料であって、ストローマ細胞を含むものであればよい。
【００８４】
有核細胞のセミ・コンフルエントな状態での培養とは、所定の領域において、有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群の全部若しくは一部が、所定の領域内で固定され、かつ、固定された有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群が、平皿で増殖期の細胞分裂頻度を保ちながら増殖している状態をさす。具体的には、有核細胞を２４ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１０日〜１２日間培養することによって、２４ウェル細胞培養プレートにおいてセミ・コンフルエントな状態となったストローマ細胞を得ることができる。
【００８５】
「ヒト造血幹細胞をストローマ細胞の共存下で培養する」とは、ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶ状況で培養することをいう。
【００８６】
ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶとは、ヒト造血幹細胞の造血能力をストローマ細胞がサポートする状況という。例えば、臍帯血由来のヒト造血幹細胞やストローマ細胞、若しくはサイトカインやケモカイン等に存在する共通の接着分子が、ヒト造血幹細胞の自己再生能力をサポートし、増幅の仲立ちをし得る状況や、臍帯血由来のストローマ細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｎｕｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）類似の性質を示し、臍帯血中のヒト造血細胞が臍帯中に存在するときの微環境をｅｘ ｖｉｖｏにおいても模倣し得る状況がある。
【００８７】
「凍結保存」とは、ヒト造血幹細胞の性質を変化させるものでなければ、いかなる方法も用いることができる。凍結保存の方法としては、例えば、保存しようとする細胞を培地と共に保存容器に納め、必要に応じて、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの凍結防御剤を加えて、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存する方法を用いることができる。なお、培地（培養液）には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含めてもよい。
【００８８】
「ヒト臍帯血」とは、ヒトの臍帯から取得できる血液のことをいう。ヒト臍帯血は、例えば、兵庫臍帯血バンク等の臍帯血バンクから取得することができる。
【００８９】
「ヒト骨髄由来血液」とは、ヒトの骨髄中に存在する髄液に含まれる血液をいう。ヒトの骨髄は、一般的な、骨髄バンクから取得することができる。
【００９０】
「培養」とは、常法に従って、例えば、以下のように実施することができる。培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有したα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの培地中に、あるいは、Ｘ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５などの培地中に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、 ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＥＰＯ、ＴＰＯなどのサイトカイン の存在下、ストローマ細胞及びＣＤ３４＋細胞を加えて、３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養する。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、おおよそ１年間にわたって行うような長期間のものまでを挙げることができる。長期間の場合は、定期的な培地交換を行い、温度、湿度、二酸化炭素濃度等をモニタリングして培養維持することにより、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞を増幅可能である。なお、培養は、開放条件下で行うことも可能であるし、閉鎖（密閉）条件下で行うことも可能である。
【００９１】
培地（培養液）については、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる培地を用いてもよい。培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４＋細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる環境条件を選択してもよい。なお、物理的条件における温度については、具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。
【００９２】
サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増幅・分化の調節作用などを示す物質をいう。サイトカインには、具体的には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７， ＩＬ−１８インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（Ｆｌｔ‐３／４リガンド）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）等が含まれる。ヒト造血細胞を増幅する際に用いられるサイトカインとしては、例えば、ｈｕ−ＳＣＦ、ｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド、ｈｕ−ＴＰＯ等がある。
【００９３】
細胞培養に用いる培養容器には、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材・形状のものを用いることができる。例えば、支持台の素材としては、ガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属等がある。また、培養容器は、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることができる。例えば、培養容器の素材としては、ガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂、または金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
【００９４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法は、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする方法である。
【００９５】
「培養物」とは、所定の細胞を培養した結果、得られるものであればよい。例えば、ＣＤ３４＋細胞を所定のストローマ細胞の存在下において培養する方法であれば、培養物に当該ストローマ細胞が含まれていてもよい。また、サイトカイン存在下において培養する方法の場合も同様に、培養物に当該サイトカインが含まれていてもよい。
【実施例１】
【００９６】
以下に、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明を実施例に限定するものではない。
【００９７】
１．臍帯血の取得
研究使用目的に対するインフォームド・コンセントが得られた臍帯血を、兵庫臍帯血バンクから取得した。なお、ヒト材料を用いる全ての実験手続については、実験を行う前に、財団法人先端医療振興財団の倫理委員会による審査及び承認を得た。
【００９８】
２．臍帯血からのストローマ細胞の生成
（１） ５０ｍｌ〜１００ｍｌの臍帯血から、有核細胞を分離抽出する。有核細胞の分離抽出に際しては、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を使用した。ＨＥＳ４０を臍帯血と、容量にして５対１の割合で混合した。混合の後、約１時間放置し赤血球を沈殿させた。有核細胞は上精中に存在しているので、有核細胞を含むＨＥＳ４０混合液（以下、ＨＥＳ４０ソリューションとする。）を上清液として回収した。
【００９９】
（２） 分離抽出の結果得られたＨＥＳ４０ソリューションから、５００μｌのＨＥＳ４０ソリューションを、７分間、４００Ｇ、１０℃で遠心分離器にかけた。遠心分離の結果、上清のＨＥＳ４０を取り除き、有核細胞を得た。ウシ血清を１０％容量添加した５００μｌの培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）を有核細胞に加えて再懸濁する。
【０１００】
（３） その後、有核細胞を、２４ウェル細胞培養プレートに播種する。有核細胞を５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１２日間培養し、セミ・コンフルエントなストローマ細胞を生成する。
【０１０１】
３．臍帯血由来有核細胞からのＣＤ３４＋細胞の抽出
（１） 上記２．（２）で得た有核細胞を７分間、４００Ｇ，１０℃で遠心しＨＥＳ４０ソリューションを除き、サリンへス液（杏林製薬社製 ＃８７３３１９）に１×１０９個/ｍｌとなるように再懸濁した。
【０１０２】
（２） １×１０９個／ｍｌに調整した有核細胞に対して１ｍｌ当たり、１００μｌのＦｃＢｌｏｃｋ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＃２７７６０３）、２００mｌの牛血清、１００μｌのＣＤ３４マイクロビーズ(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃２７７６０３）を添加し、ローテータを用いて、１０℃、３０分間で攪拌させた。
【０１０３】
（３） 有核細胞からＣＤ３４＋細胞の抽出については、自動ＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いて行った。
【０１０４】
（４） 分離したＣＤ３４＋細胞の純度を、ＦＡＣＳキャリブバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、サン・ホセ、ＵＳ）を用いて測定し、純度９５％以上であることを確認した。
【０１０５】
（５）抽出したＣＤ３４＋細胞を、再びセルバンカー液（日本全薬工業社製 ＃ＢＣＬ−１）に１．５×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁させ、―８０℃、−１５０℃の冷凍庫または液体窒素下で冷凍保存した。
【０１０６】
４．臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞とストローマ細胞との共培養
（１） 冷凍保存したＣＤ３４＋細胞を、３７℃のウオーターバスに漬け解凍した。
【０１０７】
（２） 解凍したＣＤ３４＋細胞を５×１０３個／５００μｌのＣＤ３４＋細胞となるように調整した。このときの培養溶液は、Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地（ＣＡＭＢＲＥＸ社製、＃０４−３８０Ｑ、ボルチモア、ＵＳ）である。
【０１０８】
（３） セミ・コンフルエントなストローマ細胞を有する２４ウェル細胞培養プレートを、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製 ＃１４１９０）で３回洗浄し、２４ウェル細胞培養プレートに付着したストローマ細胞のみ得た。
【０１０９】
（４）５００μｌに調整したＣＤ３４＋細胞を、上記（３）で得たストローマ細胞が付着した２４ウェル細胞培養プレートに加えて共培養する。さらに５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、ロンドン、ＵＫ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（以下、サイトカイン混合液とする。）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２濃度雰囲気下で培養した。
【０１１０】
（５） 培地及びサイトカイン混合液を、共培養の間、３日に一度追加しながら、１４日間、共培養した。
【実施例２】
【０１１１】
間葉系細胞由来の臍帯血細胞にヒトＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって得られるＨ−ｔｅｒｔセルラインＵＣＢＴＥＲＴ−２１を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ、大阪）から取得する。取得したＵＣＢＴＥＲＴ−２１に対して、実施例１における１〜４の処理を実行し、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１との共存下で培養した。
【実施例３】
【０１１２】
前記実施例１によって得られた培養物（以下、培養物１とする。）及び前記実施例２によって得られた培養物（以下、培養物２とする。）を用いて、ＣＤ３４、ＣＤ１３３の発現を確認するためのフロー・サイトメトリック解析（ＦＡＣＳ解析）を行った。フロー・サイトメトリック解析にあたっては、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
【０１１３】
比較例１として、実施例１と同様に、実施例１の３で抽出した５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を、ストローマ細胞を用いずに、ミニマム・サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍのｈｕ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド）の存在下で、１４日間、液体培養を行った。また、比較例２として、実施例１と同様に、５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を、ストローマ細胞を用いず、フル・サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍのｈｕ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ｓｏｌＩＬ−６レセプター（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の存在下で、１４日間、液体培養を行った。比較例１によって得られた培養物（以下、培養物３とする。）、及び、比較例４によって得られた培養物（以下、培養物４とする。）用いて、同様にＦＡＣＳ解析を行った。
【０１１４】
ＦＡＣＳ解析の結果を図１ａ〜図１ｅに示す。図１ａは培養物１について、図１ｂは培養物２について、図１ｃは培養物３について、図１ｄは培養物４について、図１Ｅは培養前について、それぞれのＦＡＣＳ解析の結果を示している。さらに、図１ａ〜図１ｄの解析結果のまとめを表１に示す。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
表１に示すように、ＣＤ３４及びＣＤ１３３が共に発現している細胞の培養物の総細胞数に対する割合は、培養物１、培養物２で、それぞれ約１４％であった。一方、培養物３で、約９．４％であった。また、培養物４で、約６．６％であった。
【０１１７】
これらの結果から、臍帯血由来のストローマ細胞上でＣＤ３４＋細胞を培養することによって、ＣＤ３４＋細胞の自己複製能力が、サイトカイン存在下における液体培養に比べて、上昇すること、つまり、ヒト造血幹細胞の自己複製能力が上昇することが確認された。
【実施例４】
【０１１８】
実施例３と同じ培養物１〜培養物４を用いて、培養物中における総細胞数、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を、それぞれ計数した。なお、培養にあたっては、当初５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を培養しているため、培養０日目の総細胞数、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数は、５×１０３個である。
【０１１９】
総細胞数の計数には、多項目自動血液計数装置（シスメック社製 ＫＸ−２１）を用いた。
【０１２０】
培養物１〜培養物４中における、総細胞数を計数した結果を図２ａに、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数を計数した結果を図２ｂに、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を計数した結果を図２ｃに、それぞれ示す。なお、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数については、総細胞数にＦＡＣＳ解析の結果得られた発現比の割合（表１参照）を乗じて計算した。
【０１２１】
図２ａ、図２ｂ、及び図２ｃから明らかなように、ヒト造血細胞を臍帯血由来のストローマ細胞と共培養することによって、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数が増加している。つまり、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数という観点では、ヒト造血細胞を臍帯血由来のストローマ細胞と共培養する方法は、ストローマ細胞を用いなでサイトカインを用いてヒト造血細胞を培養する方法に対して、顕著な優位性を示すことは明らかである。
【実施例５】
【０１２２】
実施例３と同じ培養物１〜培養物４を用いて、培養物の増幅能力を評価するためにメチルセルロース・アッセイを行った。メチルセルロース・アッセイは以下の方法により行った。
【０１２３】
（１）各培養物におけるＣＤ３４＋細胞の絶対数を計数する。
【０１２４】
（２）各培養物から３×１０２個のＣＤ３４＋細胞を取得する。
【０１２５】
（３）取得したＣＤ３４＋細胞を、１．２ｍｌのＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（Ｈ４３３０、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製、バンクーバ、カナダ）培地に播種する。なお、ＭＥＴＨＯＣＵＬＴは、３ｕｎｉｔ／ｍｌのＥＰＯ、３０％のＦＣＳ、１％のＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｇ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＧＭ−ＳＣＦを含む。
【０１２６】
（４）ＭＥＴＨＯＣＵＬＴ培地に播種した培養物を１４日間、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で、培養（二次培養）する。
【０１２７】
（５）培養の後、培地中に形成された各系統のコロニー数をカウントする。
【０１２８】
図３ａにメチルセルロース・アッセイを用いて計数した各系統のコロニー数を示す。
【０１２９】
なお、培養後のコントロールとして実施例１の３で抽出したＣＤ３４＋細胞から１００個の細胞を取得し、培養せずにメチルセルロースに播種した時の各コロニーの性状を顕微鏡下の目視によって調べておいた。未培養のＣＤ３４＋細胞からは、７０個弱のコロニーが当アッセイで得られた。このことから、未培養の細胞集団では、約７割弱の細胞が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍなどのコロニーを形成する造血幹細胞・前駆細胞であったと考えられる。この１００個の未培養のＣＤ３４＋細胞の構成を図３Ａの右端「ｄａｙ０」に示す。
【０１３０】
図３ａには、培養物１〜培養物４のそれぞれから採取した３×１０２個の細胞をメチルセルロース・アッセイを用いて１４日間二次培養して得られたそれぞれのコロニー数を示している。ここで留意すべきことは、メチルセルロース・アッセイを行う時に用いた３×１０２個の細胞の母集団（培養物１〜培養物４）の総細胞数は、同じではないということである。これは、各培養物を得るまでの培養条件が異なることに起因する。そこで、培養物１〜培養物４で得られた全ての細胞をメチルセルロースに播種したと想定した時に得られる総コロニー数を、図３ｂに記す。なお、総コロニー数は、図２ａの培養１４日目での細胞数を３×１０２で除して得られた商に、図３ａの各コロニー数を乗ずることによって得た。
【０１３１】
図３ｂから明らかなように、ＣＤ３４＋細胞を同種同系臍帯血有核細胞由来のストローマ細胞と共培養することによって、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーとして計数された多分化能を有するヒト造血幹細胞の数が、未培養ＣＤ３４＋細胞と比べて約６倍に拡大している。このことより、ＣＤ３４＋細胞を当該ＣＤ３４＋細胞を抽出した臍帯血由来のストローマ細胞と共培養する方法は、ＣＤ３４＋細胞の増幅能力を高めること、つまり、ヒト造血幹細胞の自己複製能力が上昇することが確認された。
【０１３２】
［産業上の利用可能性］
本発明では、未分化のヒト造血細胞を簡単かつ安全に増幅培養できるため、増幅培養したヒト造血細胞を再生医療、細胞移植へ応用することができる。また、本発明では、例えば、臍帯血さえあればヒト造血細胞の増幅培養が可能であり、培養したヒト造血細胞を移植する際に病原菌や未知のアレルゲンを同時に移植してしまうことがないので、増幅培養したヒト造血細胞を安全に再生医療、細胞移植へ応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１ａ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物１（プライマリ・ストローマ細胞と供培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｂ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物２（セルラインＵＣＢＴＥＲＴ−２１と供培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｃ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物３（ミニマム・サイトカイン存在下で液体培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｄ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物４（フル・サイトカインで液体培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｅ】培養前のＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図２ａ】培養物１〜培養物４中の総細胞数を培養前と培養１４日目で計数した結果を示した図である。
【図２ｂ】培養物１〜培養物４中のＣＤ３４＋細胞の絶対総数を培養前と培養14日目で計数した結果を示した図である。
【図２ｃ】培養物１〜培養物４中のＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を培養前と培養14日目で計数した結果を示した図である。
【図３ａ】メチルセルロース・アッセイを用いて計数した各系統のコロニー数を示した図である。一番右は未培養で細胞を１００個播いたときのコロニー数を、それ以外は培養１４日目で細胞を３００個播いたときのコロニー数を示す。
【図３ｂ】それぞれの方法で１４日間培養した時の細胞総てを、メチルセルロースに播種したと想定した時の総コロニー数を示した図である。一番右は未培養のコントロール。多分化能を持つＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの数をもって、培養系中の造血幹細胞数を推定している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト造血細胞を培養する方法に関し、特にヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞を用いて、ヒト造血細胞を増幅培養するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の難治性血液疾患に対し、骨髄移植治療が施されている。骨髄移植治療では、一生涯にわたり各種血球細胞を産生する造血幹細胞を提供者（ドナー）から取得し、取得した造血幹細胞を受容者（レシピエント）の骨髄に定着させる。この骨髄移植治療では、大量の骨髄細胞をドナーから取得する必要があるため、ドナーの心身への負担が大きいという問題がある。また、骨髄移植治療においては、ドナー由来のＴ細胞の混入による急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症や、自己移植の際のがん細胞の混入による再発という問題もある。
【０００３】
このような状況の中、最近になって、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた。臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療では、骨髄や末梢血と比べて重症のＧＶＨＤの発生率が低いという利点がある。しかし、臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療には、臍帯から取得できる臍帯血の採取量が少ないという問題がある。このため、１個体に由来する臍帯血では体重４０ｋｇ程度までのレシピエントに移植可能とされている。
【０００４】
そこで、取得した臍帯血に含まれる造血幹細胞を効率的に増幅培養する試みが行われている。
【０００５】
このような造血幹細胞の増幅培養方法の一つに、胎盤組織および臍帯組織由来のストローマ細胞を、造血幹細胞を含むヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅培養に応用する造血幹細胞の培養方法（以下、組織由来増幅培養方法とする。）がある。組織由来増幅培養方法は、以下のように行われる。
【０００６】
１．ヒト胎盤からの造血ストローマ細胞の分離回収
臍帯血採取後の胎盤から臍帯と羊膜を除去した後、母体側からハサミで組織を採取し、血液を可及的に取り除く。このようにして１個の胎盤より２００ｇ〜３００ｇの胎盤の組織切片を採取する。そして、これら組織切片を、培養皿に張り付け、所定の条件で１０日〜１４日培養した後、回収する。
【０００７】
２．ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製
採取したヒト臍帯血から単核細胞を回収する。回収した臍帯血単核細胞からＣＤ３４陽性細胞を分画する。
【０００８】
３．臍帯血ＣＤ３４陽性細胞と胎盤由来造血ストローマ細胞との共培養
回収した組織切片と分画して得られた臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞とを、所定のサイトカインの存在下、所定条件で、１０日間、共培養する。なお、共培養の際に用いる組織切片は、ヒト胎盤由来の造血ストローマ細胞として機能する。
【０００９】
このような組織由来増幅培養方法により、ヒトＣＤ３４陽性幹細胞を簡便にしかも安全に増幅することが可能となる。よって、少量の臍帯血であっても、任意の成人患者に移植できる上に、数回にわたる継続投与が可能となる。
【００１０】
また、臍帯血を一度採取しておけば必要なときに必要な量だけ造血幹細胞を供給することが可能となる。
【００１１】
さらに、骨髄移植においても大量の骨髄細胞を必要としない。よって、骨髄の採取に伴うドナーの心身への負担を低減することができる。
【００１２】
さらに、出産に伴って世界中で廃棄されている臍帯血を有効に活用することができる。現在、廃棄されている臍帯血を保有することによって、幅の広い移植抗原を有する造血幹細胞を保有することが可能となり、結果的に、移植抗原の適合する移植が可能となる。よって、重症のＧＶＨＤが発症するリスクを低減することが可能となる。
【００１３】
さらに、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いれば、造血幹細胞の増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増幅した細胞を採取することができ、増幅させた細胞を、直接、輸注することができる。
【００１４】
【特許文献１】特開平２００４−２２２５０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述の組織由来増幅培養方法には、次のような問題点がある。組織由来増幅培養方法では、胎盤から組織切片を取得し、造血幹細胞に対するストローマ細胞として、造血幹細胞と共培養している。一方、造血幹細胞は、臍帯から取得している。つまり、造血幹細胞を取得する臍帯とは異なる組織である胎盤を必ず必要とする。このため、取得した胎盤を保存しなければならないという問題がある。
【００１６】
また、胎盤自体を保存せずに胎盤から取得したストローマ細胞を保存するとしても、当該ストローマ細胞をセル・ライン化（株化）しなければならないという問題がある。セルライン化に際しては新たに遺伝子を導入等する必要があることから、遺伝子の選択や導入する遺伝子が幹細胞の増幅能や造血能等に与える影響を考えなければならないという新たな問題が発生する。
【００１７】
さらに、胎盤若しくは当該胎盤から取得したストローマ細胞を保存せずに、臍帯血の造血幹細胞を増幅させる必要が生じた時、つまり造血幹細胞の移植が必用となった時に取得できた胎盤を用いる場合には、造血幹細胞に対して同種異系のストローマ細胞と共培養し、得られた造血幹細胞を移植することとなる。よって、ストローマ細胞の生成の際に取り除けなかった病原菌や知られていないアレルゲンをも移植してしまう可能性があるという安全性の問題がある。
【００１８】
さらに、造血幹細胞を同種異系のストローマ細胞と共培養する場合、共培養結果得られた造血幹細胞とストローマ細胞との混合細胞から、ストローマ細胞の取り除かなければならない。このため、臍帯血由来の造血幹細胞の増幅の際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いる方法が考えられるが、造血幹細胞の増幅の際、つまり、造血幹細胞の移植の際に、ＨＬＡが適合するストローマ細胞を生成できる胎盤を必ず得られるかという問題がある。
【００１９】
さらに、同種異系のストローマ細胞を生成する胎盤が得られない場合に、異種のストローマ細胞を生成する組織を用いるとなれば、前述の安全性の問題がさらにクローズ・アップされることになる。
【００２０】
そこで、本発明は、移植の際に安全性が高いヒト造血幹細胞を簡単かつ適時に増幅することができるヒト造血幹細胞の増幅培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は以下の内容から構成される。
【００２２】
（１）ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とするヒト造血細胞の培養方法。
【００２３】
（２）前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである前記（１）に記載のヒト造血幹細胞の培養方法。
【００２４】
（３）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る前記（２）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２５】
（４）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る前記（３）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２６】
（５）前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする前記（４）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２７】
（６）前記ヒト造血細胞は、前記ストローマ細胞のもととなった血液と同一の血液から抽出されたものである前記（１）〜前記（５）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００２８】
（７）前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する前記（６）に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【００２９】
（８）前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である前記（１）〜前記（７）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３０】
（９）前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である前記（１）〜前記（８）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３１】
（１０）前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である前記（１）〜前記（９）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３２】
（１１）前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である前記（１）〜前記（９）に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【００３３】
（１２）前記（１）〜前記（１１）に記載のいずれかの方法により得られる培養物。
【００３４】
（１３）前記（１）〜前記（１１）に記載のいずれかの方法により得られるヒト造血幹細胞培養物。
【００３５】
（１４）ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成するストローマ細胞の生成方法。
【００３６】
（１５）前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する（１４）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３７】
（１６）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る（１５）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３８】
（１７）前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る（１６）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００３９】
（１８）前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする（１７）に記載のストローマ細胞の生成方法。
【００４０】
（１９）前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である（１４）〜（１８）に記載のいずれかのストローマ細胞の生成方法。
【００４１】
（２０）（１４）〜（１９）に記載のいずれかの方法により得られるストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤。
【００４２】
本発明の詳細については、以下の「発明を実施するための最良の形態」において説明する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養する。これにより、血液からストローマ細胞を取得するので、プライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いてヒト造血細胞を増幅することができるので、増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、血液は容易に保存することができるので、ストローマ細胞のセル・ライン化（株化）といった問題が生じないことから、安全性が高いヒト造血細胞の移植が可能となる。
【００４４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである。よって、有核細胞は血液から容易に得ることができるので、容易にストローマ細胞を得ることができる。
【００４５】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る。よって、有核細胞からストローマ細胞を培養するので、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間を短縮することができる。一般的に、血液のどの分画(有核・単核・ＣＤ３４＋単核）からストローマ細胞を培養するにしても、ストローマ細胞の培養に細胞株でないプライマリ細胞を使う限り、培養開始から培養終了、さらに培養したストローマ細胞が壊死する若しくは使用できなくなるまでの期間は、約１ヶ月と推定されている。このため、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間が短ければ、それだけストローマ細胞とヒト造血細胞との共培養の期間を長く確保することができる。
【００４６】
例えば、単核球やＣＤ３４＋単核球を使うと、ストローマ細胞の培養に約３週間の時間を必用とし、結果的に約１週間ぐらいしか共培養の期間を確保できない。このため、共培養による十分な造血幹細胞の増幅が見込めない。一方、有核細胞を使うと諸条件により約２週間でのストローマ細胞の培養が可能であり、結果的に、共培養の期間も２週間確保することが可能となる。
【００４７】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る。これにより、ヒト造血細胞の培養に際して、ヒト臍帯静脈内皮細胞と同様の機能を有すると考えられるストローマ細胞を用いることができる。よって、ヒト造血細胞とストローマ細胞と共培養する際に、ヒト造血細胞を臍帯内と類似する微環境におくことができる。結果として、ヒト造血細胞の自己増幅力及び多分化能力を含む造血能力を向上させることができる。
【００４８】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記有核細胞を１０日〜１４日間培養する。これにより、セミ・コンフルエントな状態に培養された有核細胞を容易に得ることができる。
【００４９】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞を、前記ストローマ細胞の由来元の血液と同一の血液から抽出する。よって、ヒト造血細胞を増幅に際して、血液以外の組織を必要としない。血液の保存は容易に行えることから、結果的に、必要なときに保存された血液を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００５０】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する。これにより、ストローマ細胞を得るために有核細胞を培養している間、ヒト造血細胞の分化を止めることができる。よって、培養に時間を必要とするストローマ細胞との共培養を容易に行うことができる。
【００５１】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である。これにより、ヒト造血細胞マーカーであるＣＤ３４及びＣＤ１３３を用いて、容易にヒト造血細胞を得ることができる。
【００５２】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である。これにより、例えば臍帯血からヒト造血細胞及びストローマ細胞を取得することとすれば、臍帯血以外の組織を必要としない。臍帯血の保存は、現在、既に臍帯血バンクとして行われていることから、結果的に、必要なときに保存された臍帯血を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００５３】
さらに、臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。よって、臍帯血バンクにおけるコレクションの数が多くなるので、 移植を必要とするレシピエントとＨＬＡが適合する臍帯血が見つかる可能性を高めることができ、移植の成功率を向上させることができる。
【００５４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である。これにより、容易にヒト造血幹細胞を増幅培養することができる。
【００５５】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法、培養物及びヒト造血細胞では、前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である。これにより、容易にヒト造血前駆細胞を培養することができる。
【００５６】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞では、ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成する。これにより、プライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いたヒト造血細胞の増幅が可能となるので、増幅したヒト造血細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、血液は容易に保存することができるので、ストローマ細胞のセル・ライン化（株化）といった問題が生じないことから、当該ストローマ細胞を用いたて増幅したヒト造血細胞を用いれば、安全性が高いヒト造血細胞の移植が可能となる。
【００５７】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞では、前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する。よって、有核細胞は血液から容易に得ることができるので、容易にストローマ細胞を得ることができる。
【００５８】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養するよって得る。よって、有核細胞からストローマ細胞を培養するので、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間を短縮することができる。一般的に、血液のどの分画(有核・単核・ＣＤ３４＋単核）からストローマ細胞を培養するにしても、ストローマ細胞の培養に細胞株でないプライマリ細胞を使う限り、培養開始から培養終了、さらに培養したストローマ細胞が壊死する若しくは使用できなくなるまでの期間は、約１ヶ月と推定されている。このため、ストローマ細胞を樹立するまでの培養期間が短ければ、それだけストローマ細胞とヒト造血細胞との共培養の期間を長く確保することができる。
【００５９】
例えば、単核球やＣＤ３４＋単核球を使うと、ストローマ細胞の培養に約３週間の時間を必用とし、結果的に約１週間ぐらいしか共培養の期間を確保できない。このため、共培養による十分な造血幹細胞の増幅が見込めない。一方、有核細胞を使うと諸条件により約２週間でのストローマ細胞の培養が可能であり、結果的に、共培養の期間も２週間確保することが可能となる。
【００６０】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る。これにより、ヒト造血細胞の培養に際して、ヒト臍帯静脈内皮細胞と同様の機能を有すると考えられるストローマ細胞を用いることができる。よって、ヒト造血細胞とストローマ細胞と共培養する際に、ヒト造血細胞を臍帯内と類似する微環境におくことができる。結果として、ヒト造血細胞の自己増幅力及び多分化能力を含む造血能力を向上させることができる。
【００６１】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする。これにより、セミ・コンフルエントな状態に培養された有核細胞を容易に得ることができる。
【００６２】
本発明にかかるストローマ細胞の培養方法及びストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤では、前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である。これにより、例えば臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、臍帯血からヒト造血細胞を取得することができるので、ヒト造血細胞の培養に際して、臍帯血以外の組織を必要としない。臍帯血の保存は、現在、既に臍帯血バンクとして行われていることから、結果的に、必要なときに保存された臍帯血を用いてヒト造血細胞を増幅することができる。
【００６３】
さらに、臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、現在、移植に必要とされるヒト造血細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。よって、臍帯血バンクにおけるコレクションの数が多くなるので、 移植を必要とするレシピエントとＨＬＡが適合する臍帯血が見つかる可能性を高めることができ、移植の成功率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明の発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系由来のストローマ細胞の共存下で培養することにより、移植の際に安全性が高いヒト造血幹細胞を簡単かつ適時に増幅することができることをみいだし、本発明を完成するに至った。
【００６５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００６６】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法は、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする方法である。
【００６７】
「ヒト造血細胞」とは、あらゆる種類若しくは系統の血液成分に分化しうる能力を有する未分化なヒトの血液細胞をいう。ヒト造血細胞には、ヒト造血幹細胞、ヒト造血前駆細胞が含まれる。一方、分化した血液細胞、例えば、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）など、または、分化した血液細胞由来産物である赤血球、血小板などは、「ヒト造血細胞」の概念に含まれない。
【００６８】
「分化」とは、細胞の表面に現れる表面抗原分子が変化して、次の成熟段階の細胞になることをいう。前記分化には、例えば、ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋）からリンパ系幹細胞または骨髄系幹細胞または赤芽球になること、リンパ系幹細胞からＴ前駆細胞またはＢ前駆細胞になること、骨髄系幹細胞からマスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、巨核球、単球、好中球等になること、赤芽球から赤血球になること、Ｔ前駆細胞からＴ細胞になること、Ｂ前駆細胞からＢ細胞になること等が含まれる。
【００６９】
「ヒト造血幹細胞」とは、あらゆる種類若しくは系統の血液成分に分化する多分化能力を有するとともに自己を複製する自己複製能力を有する細胞をいう。ヒト造血幹細胞は、例えば、ヒト骨髄、ヒト臍帯血、ヒト末梢血に存在する。
【００７０】
「ヒト造血前駆細胞」とは、限定的な一又は複数種類若しくは系統のヒトの血液成分に分化する分化能力を有するヒトの細胞をいう。ヒト造血前駆細胞は、２〜３種類若しくは系統の血球に分化できる寡能性造血前駆細胞、１種類若しくは系統の血球に分化が限定される単能性造血前駆細胞に分類することができる。
【００７１】
ヒト前駆細胞は、特定の細胞マーカーを判別する公知の方法により分類することができる。例えば、骨髄系細胞のマーカーとしてＣＤ１３、単球及びマクロファージ系のマーカーとしてＣＤ１４、巨核球系マーカーとしてＣＤ４１、赤血球系マーカーとしてグリコホリン、Ｂ細胞系マーカーとしてＣＤ１９、Ｔ細胞系マーカーとしてＣＤ３が知られている。
【００７２】
ヒト造血前駆細胞を判別する公知の方法としては、例えば、コロニーアッセイ法（in vitro コロニー法）がある。
【００７３】
ヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞は、特定の抗原表現型を発現している細胞である。よって、臍帯血、または臍帯血から抽出した有核細胞から、特定の抗原表現型を発現している細胞を抽出することによって、結果的にヒト造血幹細胞、ヒト造血前駆細胞を得ることができる。
【００７４】
特定の抗原表現型としては、例えば、ＣＤ３４がある。したがって、ヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞といえる。
【００７５】
ＣＤ３４＋細胞は、例えば、臍帯血から分離抽出することによって得ることができる。具体的には、（１） 臍帯血から有核細胞を分離抽出する工程、（２） 抽出した有核細胞からマイクロビーズをコンジュゲート（conjugate）した抗ＣＤ３４抗体を用いて ＣＤ３４＋細胞を分離抽出する工程からなる。マイクロビーズをコンジュゲート（conjugate）した抗ＣＤ３４抗体としてＣＤ３４ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ベルギッシュ・グラッドバッハ、ドイツ）を用い、マイクロビーズを用いてＣＤ３４＋幹細胞を採取する装置として自動ＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いる。
【００７６】
なお、特定の抗原表現型としては、ＣＤ３４の他に、他の造血細胞マーカーを使用することも、若しくはＣＤ３４に加えて複数併用することも可能である。他の造血細胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ３８、ＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３があり、好ましくはＣＤ１３３である。
【００７７】
ヒト造血細胞が、いずれの幹細胞マーカーを発現しているかは、ＦＡＣＳを用いる方法等、公知の方法により測定することができる。
【００７８】
「有核細胞」とは、核を有する細胞をいう。臍帯血から抽出できる有核細胞には、例えば、総ての系列に分化しうるヒト造血幹細胞、リンパ系幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系幹細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、巨核球、単球、好中球、または赤芽球などが含まれる。
【００７９】
臍帯血からの有核細胞の抽出は、例えば、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を用いることによって実現できる。
【００８０】
ストローマ細胞とは、基質細胞または間質細胞をいう。ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤は、例えば、ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液から生成することが可能である。
【００８１】
ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液とは、ヒト造血細胞の由来元の個体と同一の個体から取得する血液をいい、好ましくは、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液、若しくはヒト末梢血であり、さらに好ましくはヒト臍帯血である。
【００８２】
ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤の生成は、例えば（１） 臍帯血から、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を用いて有核細胞を分離抽出する工程、（２） 有核細胞を平皿で培養し、付着細胞を選択的に増殖させセミ・コンフルエントな状態まで育成させる工程、により行われる。
【００８３】
なお、ストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤とは、ヒト造血細胞を造血するために用いられる材料であって、ストローマ細胞を含むものであればよい。
【００８４】
有核細胞のセミ・コンフルエントな状態での培養とは、所定の領域において、有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群の全部若しくは一部が、所定の領域内で固定され、かつ、固定された有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群が、平皿で増殖期の細胞分裂頻度を保ちながら増殖している状態をさす。具体的には、有核細胞を２４ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１０日〜１２日間培養することによって、２４ウェル細胞培養プレートにおいてセミ・コンフルエントな状態となったストローマ細胞を得ることができる。
【００８５】
「ヒト造血幹細胞をストローマ細胞の共存下で培養する」とは、ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶ状況で培養することをいう。
【００８６】
ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶとは、ヒト造血幹細胞の造血能力をストローマ細胞がサポートする状況という。例えば、臍帯血由来のヒト造血幹細胞やストローマ細胞、若しくはサイトカインやケモカイン等に存在する共通の接着分子が、ヒト造血幹細胞の自己再生能力をサポートし、増幅の仲立ちをし得る状況や、臍帯血由来のストローマ細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｎｕｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）類似の性質を示し、臍帯血中のヒト造血細胞が臍帯中に存在するときの微環境をｅｘ ｖｉｖｏにおいても模倣し得る状況がある。
【００８７】
「凍結保存」とは、ヒト造血幹細胞の性質を変化させるものでなければ、いかなる方法も用いることができる。凍結保存の方法としては、例えば、保存しようとする細胞を培地と共に保存容器に納め、必要に応じて、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの凍結防御剤を加えて、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存する方法を用いることができる。なお、培地（培養液）には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含めてもよい。
【００８８】
「ヒト臍帯血」とは、ヒトの臍帯から取得できる血液のことをいう。ヒト臍帯血は、例えば、兵庫臍帯血バンク等の臍帯血バンクから取得することができる。
【００８９】
「ヒト骨髄由来血液」とは、ヒトの骨髄中に存在する髄液に含まれる血液をいう。ヒトの骨髄は、一般的な、骨髄バンクから取得することができる。
【００９０】
「培養」とは、常法に従って、例えば、以下のように実施することができる。培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有したα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの培地中に、あるいは、Ｘ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５などの培地中に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、 ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＥＰＯ、ＴＰＯなどのサイトカイン の存在下、ストローマ細胞及びＣＤ３４＋細胞を加えて、３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養する。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、おおよそ１年間にわたって行うような長期間のものまでを挙げることができる。長期間の場合は、定期的な培地交換を行い、温度、湿度、二酸化炭素濃度等をモニタリングして培養維持することにより、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞を増幅可能である。なお、培養は、開放条件下で行うことも可能であるし、閉鎖（密閉）条件下で行うことも可能である。
【００９１】
培地（培養液）については、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる培地を用いてもよい。培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４＋細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる環境条件を選択してもよい。なお、物理的条件における温度については、具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。
【００９２】
サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増幅・分化の調節作用などを示す物質をいう。サイトカインには、具体的には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７， ＩＬ−１８インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（Ｆｌｔ‐３／４リガンド）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）等が含まれる。ヒト造血細胞を増幅する際に用いられるサイトカインとしては、例えば、ｈｕ−ＳＣＦ、ｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド、ｈｕ−ＴＰＯ等がある。
【００９３】
細胞培養に用いる培養容器には、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材・形状のものを用いることができる。例えば、支持台の素材としては、ガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属等がある。また、培養容器は、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４＋細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることができる。例えば、培養容器の素材としては、ガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂、または金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
【００９４】
本発明にかかるヒト造血細胞の培養方法は、ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする方法である。
【００９５】
「培養物」とは、所定の細胞を培養した結果、得られるものであればよい。例えば、ＣＤ３４＋細胞を所定のストローマ細胞の存在下において培養する方法であれば、培養物に当該ストローマ細胞が含まれていてもよい。また、サイトカイン存在下において培養する方法の場合も同様に、培養物に当該サイトカインが含まれていてもよい。
【実施例１】
【００９６】
以下に、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明を実施例に限定するものではない。
【００９７】
１．臍帯血の取得
研究使用目的に対するインフォームド・コンセントが得られた臍帯血を、兵庫臍帯血バンクから取得した。なお、ヒト材料を用いる全ての実験手続については、実験を行う前に、財団法人先端医療振興財団の倫理委員会による審査及び承認を得た。
【００９８】
２．臍帯血からのストローマ細胞の生成
（１） ５０ｍｌ〜１００ｍｌの臍帯血から、有核細胞を分離抽出する。有核細胞の分離抽出に際しては、ＨＥＳ４０（ニプロ社製 ＃８９−１２０−５）を使用した。ＨＥＳ４０を臍帯血と、容量にして５対１の割合で混合した。混合の後、約１時間放置し赤血球を沈殿させた。有核細胞は上精中に存在しているので、有核細胞を含むＨＥＳ４０混合液（以下、ＨＥＳ４０ソリューションとする。）を上清液として回収した。
【００９９】
（２） 分離抽出の結果得られたＨＥＳ４０ソリューションから、５００μｌのＨＥＳ４０ソリューションを、７分間、４００Ｇ、１０℃で遠心分離器にかけた。遠心分離の結果、上清のＨＥＳ４０を取り除き、有核細胞を得た。ウシ血清を１０％容量添加した５００μｌの培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）を有核細胞に加えて再懸濁する。
【０１００】
（３） その後、有核細胞を、２４ウェル細胞培養プレートに播種する。有核細胞を５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１２日間培養し、セミ・コンフルエントなストローマ細胞を生成する。
【０１０１】
３．臍帯血由来有核細胞からのＣＤ３４＋細胞の抽出
（１） 上記２．（２）で得た有核細胞を７分間、４００Ｇ，１０℃で遠心しＨＥＳ４０ソリューションを除き、サリンへス液（杏林製薬社製 ＃８７３３１９）に１×１０９個/ｍｌとなるように再懸濁した。
【０１０２】
（２） １×１０９個／ｍｌに調整した有核細胞に対して１ｍｌ当たり、１００μｌのＦｃＢｌｏｃｋ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＃２７７６０３）、２００mｌの牛血清、１００μｌのＣＤ３４マイクロビーズ(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃２７７６０３）を添加し、ローテータを用いて、１０℃、３０分間で攪拌させた。
【０１０３】
（３） 有核細胞からＣＤ３４＋細胞の抽出については、自動ＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いて行った。
【０１０４】
（４） 分離したＣＤ３４＋細胞の純度を、ＦＡＣＳキャリブバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、サン・ホセ、ＵＳ）を用いて測定し、純度９５％以上であることを確認した。
【０１０５】
（５）抽出したＣＤ３４＋細胞を、再びセルバンカー液（日本全薬工業社製 ＃ＢＣＬ−１）に１．５×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁させ、―８０℃、−１５０℃の冷凍庫または液体窒素下で冷凍保存した。
【０１０６】
４．臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞とストローマ細胞との共培養
（１） 冷凍保存したＣＤ３４＋細胞を、３７℃のウオーターバスに漬け解凍した。
【０１０７】
（２） 解凍したＣＤ３４＋細胞を５×１０３個／５００μｌのＣＤ３４＋細胞となるように調整した。このときの培養溶液は、Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地（ＣＡＭＢＲＥＸ社製、＃０４−３８０Ｑ、ボルチモア、ＵＳ）である。
【０１０８】
（３） セミ・コンフルエントなストローマ細胞を有する２４ウェル細胞培養プレートを、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製 ＃１４１９０）で３回洗浄し、２４ウェル細胞培養プレートに付着したストローマ細胞のみ得た。
【０１０９】
（４）５００μｌに調整したＣＤ３４＋細胞を、上記（３）で得たストローマ細胞が付着した２４ウェル細胞培養プレートに加えて共培養する。さらに５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、ロンドン、ＵＫ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（以下、サイトカイン混合液とする。）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２濃度雰囲気下で培養した。
【０１１０】
（５） 培地及びサイトカイン混合液を、共培養の間、３日に一度追加しながら、１４日間、共培養した。
【実施例２】
【０１１１】
間葉系細胞由来の臍帯血細胞にヒトＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって得られるＨ−ｔｅｒｔセルラインＵＣＢＴＥＲＴ−２１を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ、大阪）から取得する。取得したＵＣＢＴＥＲＴ−２１に対して、実施例１における１〜４の処理を実行し、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１との共存下で培養した。
【実施例３】
【０１１２】
前記実施例１によって得られた培養物（以下、培養物１とする。）及び前記実施例２によって得られた培養物（以下、培養物２とする。）を用いて、ＣＤ３４、ＣＤ１３３の発現を確認するためのフロー・サイトメトリック解析（ＦＡＣＳ解析）を行った。フロー・サイトメトリック解析にあたっては、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
【０１１３】
比較例１として、実施例１と同様に、実施例１の３で抽出した５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を、ストローマ細胞を用いずに、ミニマム・サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍのｈｕ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド）の存在下で、１４日間、液体培養を行った。また、比較例２として、実施例１と同様に、５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を、ストローマ細胞を用いず、フル・サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍのｈｕ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ｓｏｌＩＬ−６レセプター（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の存在下で、１４日間、液体培養を行った。比較例１によって得られた培養物（以下、培養物３とする。）、及び、比較例４によって得られた培養物（以下、培養物４とする。）用いて、同様にＦＡＣＳ解析を行った。
【０１１４】
ＦＡＣＳ解析の結果を図１ａ〜図１ｅに示す。図１ａは培養物１について、図１ｂは培養物２について、図１ｃは培養物３について、図１ｄは培養物４について、図１Ｅは培養前について、それぞれのＦＡＣＳ解析の結果を示している。さらに、図１ａ〜図１ｄの解析結果のまとめを表１に示す。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
表１に示すように、ＣＤ３４及びＣＤ１３３が共に発現している細胞の培養物の総細胞数に対する割合は、培養物１、培養物２で、それぞれ約１４％であった。一方、培養物３で、約９．４％であった。また、培養物４で、約６．６％であった。
【０１１７】
これらの結果から、臍帯血由来のストローマ細胞上でＣＤ３４＋細胞を培養することによって、ＣＤ３４＋細胞の自己複製能力が、サイトカイン存在下における液体培養に比べて、上昇すること、つまり、ヒト造血幹細胞の自己複製能力が上昇することが確認された。
【実施例４】
【０１１８】
実施例３と同じ培養物１〜培養物４を用いて、培養物中における総細胞数、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を、それぞれ計数した。なお、培養にあたっては、当初５×１０３個のＣＤ３４＋細胞を培養しているため、培養０日目の総細胞数、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数は、５×１０３個である。
【０１１９】
総細胞数の計数には、多項目自動血液計数装置（シスメック社製 ＫＸ−２１）を用いた。
【０１２０】
培養物１〜培養物４中における、総細胞数を計数した結果を図２ａに、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数を計数した結果を図２ｂに、及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を計数した結果を図２ｃに、それぞれ示す。なお、ＣＤ３４＋細胞の絶対総数及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数については、総細胞数にＦＡＣＳ解析の結果得られた発現比の割合（表１参照）を乗じて計算した。
【０１２１】
図２ａ、図２ｂ、及び図２ｃから明らかなように、ヒト造血細胞を臍帯血由来のストローマ細胞と共培養することによって、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数が増加している。つまり、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数という観点では、ヒト造血細胞を臍帯血由来のストローマ細胞と共培養する方法は、ストローマ細胞を用いなでサイトカインを用いてヒト造血細胞を培養する方法に対して、顕著な優位性を示すことは明らかである。
【実施例５】
【０１２２】
実施例３と同じ培養物１〜培養物４を用いて、培養物の増幅能力を評価するためにメチルセルロース・アッセイを行った。メチルセルロース・アッセイは以下の方法により行った。
【０１２３】
（１）各培養物におけるＣＤ３４＋細胞の絶対数を計数する。
【０１２４】
（２）各培養物から３×１０２個のＣＤ３４＋細胞を取得する。
【０１２５】
（３）取得したＣＤ３４＋細胞を、１．２ｍｌのＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（Ｈ４３３０、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製、バンクーバ、カナダ）培地に播種する。なお、ＭＥＴＨＯＣＵＬＴは、３ｕｎｉｔ／ｍｌのＥＰＯ、３０％のＦＣＳ、１％のＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｇ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＧＭ−ＳＣＦを含む。
【０１２６】
（４）ＭＥＴＨＯＣＵＬＴ培地に播種した培養物を１４日間、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で、培養（二次培養）する。
【０１２７】
（５）培養の後、培地中に形成された各系統のコロニー数をカウントする。
【０１２８】
図３ａにメチルセルロース・アッセイを用いて計数した各系統のコロニー数を示す。
【０１２９】
なお、培養後のコントロールとして実施例１の３で抽出したＣＤ３４＋細胞から１００個の細胞を取得し、培養せずにメチルセルロースに播種した時の各コロニーの性状を顕微鏡下の目視によって調べておいた。未培養のＣＤ３４＋細胞からは、７０個弱のコロニーが当アッセイで得られた。このことから、未培養の細胞集団では、約７割弱の細胞が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍなどのコロニーを形成する造血幹細胞・前駆細胞であったと考えられる。この１００個の未培養のＣＤ３４＋細胞の構成を図３Ａの右端「ｄａｙ０」に示す。
【０１３０】
図３ａには、培養物１〜培養物４のそれぞれから採取した３×１０２個の細胞をメチルセルロース・アッセイを用いて１４日間二次培養して得られたそれぞれのコロニー数を示している。ここで留意すべきことは、メチルセルロース・アッセイを行う時に用いた３×１０２個の細胞の母集団（培養物１〜培養物４）の総細胞数は、同じではないということである。これは、各培養物を得るまでの培養条件が異なることに起因する。そこで、培養物１〜培養物４で得られた全ての細胞をメチルセルロースに播種したと想定した時に得られる総コロニー数を、図３ｂに記す。なお、総コロニー数は、図２ａの培養１４日目での細胞数を３×１０２で除して得られた商に、図３ａの各コロニー数を乗ずることによって得た。
【０１３１】
図３ｂから明らかなように、ＣＤ３４＋細胞を同種同系臍帯血有核細胞由来のストローマ細胞と共培養することによって、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーとして計数された多分化能を有するヒト造血幹細胞の数が、未培養ＣＤ３４＋細胞と比べて約６倍に拡大している。このことより、ＣＤ３４＋細胞を当該ＣＤ３４＋細胞を抽出した臍帯血由来のストローマ細胞と共培養する方法は、ＣＤ３４＋細胞の増幅能力を高めること、つまり、ヒト造血幹細胞の自己複製能力が上昇することが確認された。
【０１３２】
［産業上の利用可能性］
本発明では、未分化のヒト造血細胞を簡単かつ安全に増幅培養できるため、増幅培養したヒト造血細胞を再生医療、細胞移植へ応用することができる。また、本発明では、例えば、臍帯血さえあればヒト造血細胞の増幅培養が可能であり、培養したヒト造血細胞を移植する際に病原菌や未知のアレルゲンを同時に移植してしまうことがないので、増幅培養したヒト造血細胞を安全に再生医療、細胞移植へ応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１ａ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物１（プライマリ・ストローマ細胞と供培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｂ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物２（セルラインＵＣＢＴＥＲＴ−２１と供培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｃ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物３（ミニマム・サイトカイン存在下で液体培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｄ】ヒト造血細胞の培養方法によって得られた培養物４（フル・サイトカインで液体培養）に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図１ｅ】培養前のＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。
【図２ａ】培養物１〜培養物４中の総細胞数を培養前と培養１４日目で計数した結果を示した図である。
【図２ｂ】培養物１〜培養物４中のＣＤ３４＋細胞の絶対総数を培養前と培養14日目で計数した結果を示した図である。
【図２ｃ】培養物１〜培養物４中のＤ３４／ＣＤ１３３が共に発現している細胞の絶対総数を培養前と培養14日目で計数した結果を示した図である。
【図３ａ】メチルセルロース・アッセイを用いて計数した各系統のコロニー数を示した図である。一番右は未培養で細胞を１００個播いたときのコロニー数を、それ以外は培養１４日目で細胞を３００個播いたときのコロニー数を示す。
【図３ｂ】それぞれの方法で１４日間培養した時の細胞総てを、メチルセルロースに播種したと想定した時の総コロニー数を示した図である。一番右は未培養のコントロール。多分化能を持つＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの数をもって、培養系中の造血幹細胞数を推定している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養するヒト造血細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである請求項１に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項３】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る請求項２に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項４】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る請求項３に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項５】
前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする請求項４に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項６】
前記ヒト造血細胞を、前記ストローマ細胞の由来元である血液と同一の血液から抽出する請求項１〜請求項５に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項７】
前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する請求項６に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項８】
前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である請求項１〜請求項７に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項９】
前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である請求項１〜請求項８に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である請求項１〜請求項９に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１１】
前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である請求項１〜請求項９に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１に記載のいずれかの方法により得られる培養物。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１１に記載のいずれかの方法により得られるヒト造血幹細胞培養物。
【請求項１４】
ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成するストローマ細胞の生成方法。
【請求項１５】
前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する請求項１４に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１６】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る請求項１５に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１７】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る請求項１６に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１８】
前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする請求項１７に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１９】
前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である請求項１４〜請求項１８に記載のいずれかのストローマ細胞の生成方法。
【請求項２０】
請求項１４〜請求項１９に記載のいずれかの方法により得られるストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤。
【請求項１】
ヒト造血細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養するヒト造血細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ストローマ細胞は、前記血液から抽出した有核細胞由来のものである請求項１に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項３】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る請求項２に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項４】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る請求項３に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項５】
前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする請求項４に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項６】
前記ヒト造血細胞を、前記ストローマ細胞の由来元である血液と同一の血液から抽出する請求項１〜請求項５に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項７】
前記ヒト造血細胞を、前記血液から抽出されてから前記ストローマ細胞の共存下での培養が開始されるまでの間、凍結保存する請求項６に記載のヒト造血細胞の培養方法。
【請求項８】
前記ヒト造血細胞は、少なくともＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋である請求項１〜請求項７に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項９】
前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である請求項１〜請求項８に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記ヒト造血細胞がヒト造血幹細胞である請求項１〜請求項９に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１１】
前記ヒト造血細胞がヒト造血前駆細胞である請求項１〜請求項９に記載のいずれかのヒト造血細胞の培養方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１に記載のいずれかの方法により得られる培養物。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１１に記載のいずれかの方法により得られるヒト造血幹細胞培養物。
【請求項１４】
ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液からストローマ細胞を生成するストローマ細胞の生成方法。
【請求項１５】
前記ストローマ細胞を、前記血液から抽出した有核細胞から生成する請求項１４に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１６】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞を培養することによって得る請求項１５に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１７】
前記ストローマ細胞を、前記有核細胞をセミ・コンフルエントな状態に培養することによって得る請求項１６に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１８】
前記有核細胞を１０日〜１４日間培養してセミ・コンフルエントな状態とする請求項１７に記載のストローマ細胞の生成方法。
【請求項１９】
前記ヒト造血細胞と同種同形由来の血液は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液又はヒト末梢血である請求項１４〜請求項１８に記載のいずれかのストローマ細胞の生成方法。
【請求項２０】
請求項１４〜請求項１９に記載のいずれかの方法により得られるストローマ細胞を含む造血細胞造血用の補助剤。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【公開番号】特開２００８−２３７１３６（Ｐ２００８−２３７１３６Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８３９５３（Ｐ２００７−８３９５３）
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
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