ヒトＡｐｏＡ−Ｖ蛋白質に対する抗体、及び、当該抗体を用いたヒトＡｐｏＡ−Ｖ蛋白質定量測定系
【課題】臨床的にも有望視されているヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出手段を提供し、さらに、当該検出手段を用いた脂質代謝異常の検出を行うこと。
【解決手段】ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質に対する抗体を作出し、当該抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【解決手段】ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質に対する抗体を作出し、当該抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清アポリポ蛋白質に対する抗体と、これを用いた脂質代謝異常の検出に用いることが可能な当該蛋白質の定量法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフスタイルの欧米化や年齢の高齢化に伴い脳血管障害や虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患が急速に増加し、社会的に大きな問題となっている。多くの疫学的研究により、血中の低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の上昇、及び高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）の減少は冠動脈疾患の危険因子であり、加えて血中の中性脂肪（ＴＧ）は、近年、冠動脈疾患の独立した危険因子であることが報告されている(Austin MA,et al.,Am J,81:7B-12B,1998:Haim M,et al.,Circulation,100:475-482,1990)。さらに、高脂血症、高血圧、インスリン抵抗性が合併する動脈硬化疾患の易発症状である、いわゆるメタボリックシンドロームにおいては、血中コレステロールの上昇より、むしろ中性脂肪の上昇が危険因子となっている。したがって、血中ＴＧ濃度に影響を及ぼす調節因子について解析を行うことは高ＴＧ血症の成因、及びその治療法を確立する上で重要であり、ひいては動脈硬化症を予防し、冠動脈疾患の発症を軽減することになる。
【０００３】
アポリポ蛋白質は、血中において難溶性である脂質の運搬を担うリポ蛋白質の主要な構造蛋白質であり、かつ細胞内へ運搬においては機能的に作用している。アポリポ蛋白質ファミリーのなかで、アポリポ蛋白質Ａ−Ｖ（Ａｐｏ Ａ−Ｖ）は、近年、ヒト―マウス間の遺伝子配列比較解析により発見され、アポリポ蛋白質ファミリーの一員であることが同定された。Ａｐｏ Ａ−Ｖは肝臓で合成され、血中に分泌され、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）やＨＤＬに結合して存在する。Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子ノックアウトマウスにおいては、血中ＴＧ濃度、ＶＬＤＬ蛋白質量がコントロールマウスと比較して上昇しており、逆に、Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスにおいては血中ＴＧ濃度、及びＶＬＤＬ蛋白質量がコントロールマウスと比較して大きく低値であることから、Ａｐｏ Ａ−Ｖが血中ＴＧの代謝に密接に関連していることが示されている(Pennacchio LA,et al., Science,294:169-173,2001)。また、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子のコードする領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析から、当該遺伝子のＳＮＰｓ１〜３は血中ＴＧ濃度、及びＶＬＤＬ蛋白質量との強い相関が認められている(Baum L,et al.,Clin Genet,63:377-379,2003; Eichenbaum-Voline S,et al.,Arteroscler Thromb Vasc Biol,24:167-174,2004;Endo K, et al.,Hum Genet,111:570-572,2002;Pennacchio LA,Hum Mol Genet,11:3031-3038, 2002;Talmud PJ,et al.,Hum Mol Genet,11:3039-3046,2004)。特に、ヒトにおける解析では、血中ＴＧ濃度の高値である個人において、ＳＮＰ３のヘテロ型が多く存在することが報告されており、Ａｐｏ Ａ−Ｖと血中ＴＧ濃度の関連性について注目されている。さらに、血中中性脂肪を低下させる薬剤であるＰＰＡＲ−α活性化薬は、Ａｐｏ Ａ−ＶのｍＲＮＡを増加させることが知られている(Prieur X,et al.,J Biol Chem,2003;278:25468-25480)。よって、これらＰＰＡＲ−α活性薬の薬効判定に対し、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度の測定は有用である。
【非特許文献１】Pennacchio LA,et al.,Science,2001;294:169-173
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決すべき課題は、臨床的にも有望視されているヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出手段を提供し、さらに、当該検出手段を用いた脂質代謝異常の検出を行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、この課題の解決のために、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体を作出し、当該抗体を用いたヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法を提供し、当該検出方法により脂質代謝異常を検出可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
第１に、本発明は、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体（以下、本抗体ともいう）を提供する発明である。本抗体は、モノクローナル抗体（以下、本モノクローナル抗体ともいう）とポリクローナル抗体（以下、本ポリクローナル抗体ともいう）のいずれかであり得る。
【０００７】
第２に、本発明は、本抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖとを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。本検出方法により得られた被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの定量値と、当該蛋白質の定量値の標準とを比較して、当該定量値が当該標準と異なる場合に、これを脂質代謝異常として評価することが可能である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出手段の重要な要素として用いることができるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体が提供され、実際に、当該抗体を用いたヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法が提供される。当該検出方法により、検体提供者の脂質代謝異常を検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ａ．本抗体
本抗体は、上述のように、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体、すなわち、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対するモノクローナル抗体、または、ポリクローナル抗体である。
【００１０】
このような本抗体を製造するための前提条件として、免疫抗原として用いるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが必要である。
【００１１】
Ａｐｏ Ａ−Ｖは、上述したように、ヒト―マウス間の遺伝子配列比較解析により発見され、アポリポ蛋白質ファミリーの一員であることが同定された(配列番号１、２：Pennacchio LA,et al.,Science,2001;294:169-173, Gene Bank Accession Number:NM_052968(cDNA))。
【００１２】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖは、天然物として、ヒト血漿から分離して調製することができる。すなわち、ヒト血漿より、常法、例えば、超遠心法や塩析等により得られる、含Ａｐｏ Ａ−Ｖ粗画分に、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常公知の精製法を施して、精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを製造することができる(例えば、Choi et al.,J Immu Methods. 131, 1990, 159-163)。特に、本抗体を既に得ている場合には、このヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの天然物のヒト血漿からの分離は容易となる。
【００１３】
このようにして得た精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。
【００１４】
また、遺伝子工学的な手法を用いて、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの組み換え蛋白質を得て、これを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。この方法は、未だ本抗体を得ていない状態において、これを製造する場合に有利な方法である。
【００１５】
当該組み換え蛋白質は、既知のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の塩基配列(例えば、Gene Bank Accession Number:NM_052968(cDNA))を参考にして、遺伝子増幅用プライマーを調製し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子を遺伝子増幅産物として得て、これをクローニングすることにより得たクローンより産生されるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの組み換え蛋白質を、上述した通常公知の精製法により精製することにより、本抗体を製造するための免疫抗原として用いることが可能なヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ組み換え蛋白質とすることができる。また、上記のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の塩基配列を一部改変した、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ一部改変遺伝子がコードする改変組み換え蛋白質も、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する免疫抗原としての性質を失わない限り可能である。
【００１６】
なお、ここで使用される免疫抗原としてのヒトＡｐｏ Ａ−Ｖは、必ずしもヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの全部である必要はなく、その一部の断片ペプチドであってもよい。
【００１７】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの一部の断片ペプチドは、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の一部断片がコードするヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ断片や、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖのプロテアーゼ処理物、ホスファイト−トリエステル法(Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)) 等を用いた固相法や液相法による化学合成ペプチド等として免疫抗原として用いることができる。
【００１８】
このようにして得られる上記のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖにおいて、特に、免疫抗原として用いるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが小分子の一部ペプチドである場合には、本抗体の免疫反応性を向上させるために、ハプテンを結合させることができる。
【００１９】
このハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００２０】
上記のペプチドとハプテンを結合させるために、架橋剤を用いることができる。かかる架橋剤は、選択するハプテンの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ハプテンとして、傘貝ヘモシアニンを選択する場合には、ｍ−マレイニミドベンジル−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等を用いることができる。なお、選択する架橋剤の種類に応じて、必要な処理を、上記のペプチドに施すことができる。例えば、上記のＭＢＳを架橋剤として用いる場合には、結合反応に必要なスルフィド結合を有するシステイン残基を、上記ペプチドの両末端のいずれかに付加することが必要である。また、選択したペプチドにおけるシステイン残基は、これを他のアミノ酸に置換するか、保護基を結合させることによって保護することが好ましい。
【００２１】
本抗体を製造するために、上述のようにして得られる免疫抗原で免疫される動物も、特に限定されるものではなく、マウス、ラット等を広く用いることが可能であり、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００２２】
本抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるにかかわらず、免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
【００２３】
より、具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度毎に、上記手法により数回投与することにより免疫を行う。
【００２４】
本ポリクローナル抗体は、このように、上記免疫抗原により免疫を行った動物の抗血清として得ることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体は、当該免疫動物の、例えば、脾臓細胞を免疫細胞として用い、この免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により得られる、本抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマにより得ることができる。
【００２６】
上記の骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えば、
SP2/0-Ag14,P3-NS1-1-Ag4-1,MPC11-45,6.TG1.7（以上、マウス由来）；210.RCY.Ag1.2.3（ラット由来）；SKO-007,GM15006TG-A12（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００２７】
上記免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法(Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495(1975))等に準じて行うことができる。
【００２８】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００２９】
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００３０】
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
【００３１】
このようにして得られるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを認識するモノクローナル抗体である本抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
【００３２】
このハイブリドーマからの本モノクローナル抗体の採取は、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、用いるハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００３３】
なお、インビトロで免疫細胞をヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることで、本モノクローナル抗体を得ることもできる(Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53,261(1982);Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,1149(1983))。
【００３４】
さらに、動物細胞発現ベクターに対してヒトＡｐｏ Ａ−Ｖをコードする遺伝子を導入した、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ発現ベクターを直接動物に投与することによっても、当該動物においてヒトＡｐｏ Ａ−Ｖにより免疫を行うことができる。この手法は、上述したヒトＡｐｏ Ａ−Ｖによる直接免疫に代えて行うことも、両手法を組み合わせて行うことも可能である。なお、ここで用いられる動物発現ベクターとしては、例えば、pcDNA3.1(+)（インビトロシジェン社製）、pRc/CMV（インビトロシジェン社製）等のサイトメガロウイルスプロモーターを用いた発現ベクター等を挙げることができる。
【００３５】
また、上記のようにして得られる本抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。本抗体は、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに特異反応性を有する抗体である。なお、この「ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに特異反応性を有する」とは、本抗体は、少なくとも、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対しては交差反応性を示すという意味である。
【００３６】
このような性質の本抗体は、後述するように、臨床において用い得ることは勿論のこと、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ自体の分離・精製のための試薬としても極めて有用である。
【００３７】
本抗体についてのさらに具体的な内容は、実施例において後述する。このようにして得られる本抗体を、必要に応じて標識物質で標識して、後述する本発明に係わる測定方法等において用いることができる。
【００３８】
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００３９】
これらの標識物質による、本抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
【００４０】
また、本抗体（標識されたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化抗体として、後述する本発明に係わる測定方法等に用いることもできる。
【００４１】
さらに、本抗体は、必要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができる。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
【００４２】
これらの不溶性担体における、本抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４３】
Ｂ．本検出方法
本検出方法は、上述したように、本抗体を用いて、検体中のＡｐｏ Ａ−Ｖを定量検出することが可能な検出方法である。すなわち、本検出方法は、本抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法であり、本検出方法により、被験者の脂質代謝異常を検出することが可能である。
【００４４】
このような本検出方法の様態としては、例えばエンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フルオロメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができるが、一般的には、エンザイムイムノアッセイ法による解析による方法を選択することが望ましい。 エンザイムイムノアッセイ法は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする“heterogeneous enzyme immunoassay”と、このＢ／Ｆ分離を必要としない“homogeneous enzyme immunoassay”とに大別される。本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前者の“heterogeneous enzyme immunoassay”を選択することが好ましく、イムノソルベントを用いる、“enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)”を選択することがさらに好ましい。
【００４５】
より具体的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。かかるサンドイッチ法は、特に、操作上の簡便性、経済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考慮すると、特に好ましい検出態様の一つである。
【００４６】
このサンドイッチ法を行うに際しては、本抗体が、９６穴マイクロプレートに代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された固定化抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチンにより標識された本抗体を用いることが好ましい。
【００４７】
サンドイッチ法は、少なくとも、下記（ａ） 及び（ｂ） の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
【００４８】
（ａ） 不溶性担体に本抗体を固定化した固定化抗体に、血液検体等の検体を反応させる工程。
【００４９】
この工程（ａ） においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化抗体から除去される。
【００５０】
（ｂ） 固定化抗体と、試料中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等により標識された本抗体を反応させる工程。
【００５１】
この工程（ｂ） においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識された本抗体は、固定化抗体から除去される。
【００５２】
また、この工程（ｂ） においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。例えば、標識物質としてビオチンを選択した場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。また、例えば、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その基質を必要に応じて発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化することができる。
【００５３】
このようにして、顕在化した発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出を行うことができる。
【００５４】
なお、本検出方法において用いられる検体は、本来、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが存在する検体であれば特に限定されないが、本検出方法が、血清脂質異常に関連する事項について判定する方法であることや、本発明の臨床検査としての適応等を考慮すると、血漿等の血液検体であることが好ましい。
【００５５】
本検出方法の検出対象である、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量は、動脈硬化等の原因となり得る脂質代謝異常の有力な指標となる。すなわち、本検出方法により検出された検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの異常により、検体提供者の脂質代謝異常を判定することができる。
【００５６】
本検出方法においては、脂質代謝が正常であれば、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が正常値（１８２ｎｇ／ｍｌ程度）であるが、脂質代謝異常である場合には、量的に低い値か高い値を示すことによって、脂質代謝異常の判定がなされる。
【００５７】
すなわち、本検出方法により、血液検体等の検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が、正常値よりも多ければ、血中ＴＧ濃度とＶＬＤＬ蛋白質量が標準よりも少ないことが予測される。逆に、血液検体等の検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が、正常値よりも少なければ、血中ＴＧ濃度とＶＬＤＬ蛋白質量が標準よりも多いことが予測され、これは動脈硬化の原因となり得る可能性の強い脂質代謝異常である。よって、特に、本検出方法で検出されるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が標準よりも少ない場合に、検体提供者における注意が必要になる。
【００５８】
本検出方法で、「脂質代謝異常」と判定された検体提供者に対して、具体的な症状、例えば、動脈硬化に伴って起こることが多い、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等が現れる前に、適切な処置を行うことが可能であり、予防医学上、極めて有用な方法である。
【００５９】
本発明においては、本抗体を、本検出方法において用いるための、本抗体を含む脂質代謝異常判定用キットも提供される（以下、本キットともいう）。
【００６０】
本キットにおいては、本抗体を、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出のために供する要素、例えば、前記の標識された本抗体や固定化された本抗体等が含まれ得る。
【００６１】
本キットは、本検出方法に対応して、サンドイッチ法やフルオロメトリーによる判定や検出を容易に行い得る構成のキットであることが好ましい。
【実施例】
【００６２】
下記に本発明の実施例を記載するが、これにより本願発明の範囲が限定されるものではない。
【００６３】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡの作製
ＨｅｐＧ２細胞よりｍＲＮＡを精製し、プライマー１、プライマー２、及びプライマー３、プライマー４を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１、及びＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を増幅した。
プライマー１（配列番号３）：5’-gacggatccaaaggcttctgggactacttcagcc-3’(forward)
プライマー２（配列番号４）：5’-gacgtcgactcaggggtcccccagatggctgtgg-3’(reverse)
プライマー３（配列番号５）：5’-gacgaattcagcagataatggcaagcatggctgc-3’(forward)
プライマー４（配列番号６）：5’-gacgaattctcagtgatggtgatggtgatgggggtcccccagatggctgtggccc-3’(reverse)
【００６４】
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１はヒトＡｐｏ Ａ−Ｖアミノ酸配列の２２から３６３番目に対応する領域である。Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２はヒトＡｐｏ Ａ−Ｖアミノ酸配列の１から３６３番目に対応し、さらにＣ末端にヒスチジン６個（ヒスチジンタグ）が融合するように設定されている。得られたＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１、及びＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２はプラスミドpBluescriptIISK- (STRATAGENE)に組み込み、シーケンシングを行い、ヒトＡｐｏ Ａ−ＶｃＤＮＡ(Gene Bank Accession Number:NM_052968)の塩基配列と相違ないことを確認した。
【００６５】
大腸菌を宿主としたリコンビナントヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ Ｅ．ｃｏｌｉ）の作成
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１を大腸菌発現ベクターpQE-30(Qiagen)に挿入し、ベクターpQE-30／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。このベクターを大腸菌株ＪＭ１０９（東洋紡）に導入し、大腸菌ＪＭ１０９／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。この組替え大腸菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地にて培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧによりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを発現誘導した。発現誘導後、培養液を遠心(5000rpm,5min,4℃)し、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ発現大腸菌体を得た。沈殿した菌体は０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁した後、氷上にてソニケーションにより破砕した。さらに、遠心(15000rpm,30min,4℃)によりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを含む沈殿を回収した。沈殿は７Ｍ Ｕｒｅａ、１０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、氷上にてソニケーション処理し、遠心(15000rpm,30min,4℃)によりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖを含む上清を回収した。上清は予め７Ｍ Ｕｒｅａ， １０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化したNi-NTA agarose(Qiagen)に結合し、７Ｍ Ｕｒｅａ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸緩衝液(pH4.5)にて溶出し、溶出画分を精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉとした。ＢＣＡ法によりＢＳＡを用いた検量線から蛋白濃度を測定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製の純度を確認した（図１）。
【００６６】
ＣＨＯ−Ｋ１、細胞を宿主としたリコンビナントヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ ＣＨＯ）の製造
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を動物細胞発現ベクターpEF321(Kim DG et al,Gene,91:217-223,1990)に挿入し、ベクターpEF321／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。FuGENE6 Transfection reagent（ラフマンラロッシュ社製）を用いてpEF321／Ａｐｏ Ａ−ＶとpSV2neo (CLONTECH)を同時にＣＨＯ細胞に導入し、ネオマイシンの一種であるゲネチシン耐性を指標に導入した遺伝子が安定に組み込まれた細胞を選別し、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ発現ＣＨＯ細胞株（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＣＨＯ）を得た。ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖの発現は培養上清をWestern Blottingにより、Tetra・His Antibody（キアゲン社製）を用いてｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯのＣ末端に融合させたヒスチジンタグを検出することにより確認した。ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＣＨＯ細胞をCHO-S-SFMII培地(Gibco)で培養し、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖを含む培養上清を得た。培養上清はＰＢＳにて予め平衡化したTALON(R) Metal Affinity Resins（クロンテック社製）に結合（培養上清100ml対しResin 1ml)させ、２５０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液(pH8.0)にて溶出(Resin 1mlに対し溶出液2ml)し、溶出画分を粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯとした（図２）。
【００６７】
抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ モノクローナル抗体の製造
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を動物細胞発現ベクターpcDNA3.1(+)（インビトロシジェン社製）に挿入し、ベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。さらに、QIAfilter Plasmid Maxi Kit（キアゲン社製）を用いてｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖを精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解した。このプラスミドベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖ溶液５０μＬをＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢、日本ＳＬＣ社製）の皮下に投与し、さらに２週間ごとに同様のプラスミドベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖ溶液５０μＬをマウス皮下に合計７回ないし８回投与した。ＤＮＡ溶液の最終投与から２週間後に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ ５０μＬをlmmunEasyTM Mouse Adjuvant（キアゲン社製）を用いてマウス皮下に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ ２５０μＬをフロイント不完全アジュバントを用いてマウス腹腔内に投与した。粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ投与から３日後にマウス脾細胞を摘出し、ポリエチレングリコール１５００溶液を用いてマウス骨髄腫細胞(SP2/0-Ag14)と融合させた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は１０％ハイブリドーマクローニングファクターを添加したＨＡＴ培地で選択した。抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体の産生は、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって選別した。すなわち、各ウェル当たりにＰＢＳにて１０倍希釈した粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ １００μＬを固相化（４℃、一晩）し、洗浄後、各ウェルを５％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキングした。各ウェルを洗浄後、１００μＬの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、４，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、洗浄液にてウェルを５回洗浄し、１００μＬの発色溶液(0.012%過酸化水素、0.4mg/mL OPD(o-phenulenediamine dihydrochloride、シグマアルドリッチ社製）含有クエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を添加後、室温課で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸を添加し、反応を停止した。反応停止後、波長４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。１．０以上の吸光度を示すハイブリドーマ培養上清を陽性とし、選別した。抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体産生ハイブリドーマはさらに限界希釈法によりクローニングした。また、陽性のハイブリドーマ培養上清はウエスタンブロット法にて粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯに対する反応性を確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを最終的に選別した。これらのクローンのうち２クローンを、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センターに寄託した［mouse hybridoma E8E(FERM AP-20357) 、mouse hybridoma B10E(FERM AP-20358)］。
【００６８】
ウェスタンブロット法は、１レーンあたり１０μＬの粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを１２．５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、洗浄液にて１０倍から１００倍に希釈した各モノクローナル抗体を含む培養上清を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、０．０５μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【００６９】
最終的に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相化したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法、及び粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、またはヒト血漿に対するウェスタンブロット法により選別し、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対して反応するモノクローナル抗体産生クローンを５クローン得た。
【００７０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの抗体製造及び精製
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌）に一匹あたりハイブリドーマ細胞１０６〜１０７個／０．５ｍＬを腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し、腹水を採取した。得られた腹水は、遠心にて細胞成分を取り除き、上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。次いで、１０，０００ｘｇで１０分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン溶液、pH8.9）に溶解し、蛋白質Ａセファロースと混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させた蛋白質Ａセファロースをカラムに充填し、６倍量の結合溶液にて洗浄後、溶出溶液（０．１Ｍクエン酸溶液、pH4.0）で１ｍＬずつ溶出した。溶出された画分は、０．１ｍＬの２Ｍトリス溶液（pH10.0）で中和した。各溶出画分の吸光度(280nm)を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収した。回収したモノクローナル画分はＰＢＳにて透析（４℃、一晩）し、精製モノクローナル抗体を得た。
【００７１】
得られたモノクロナール抗体のアイソタイプは、マウスモノクロナール抗体アイソタイプ決定用キット（べーリンガー社製）を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対するモノクローナル抗体産生は、ＩｇＧ１（３クローン）、及びＩｇＧ２ａ（２クローン）であった。これらのうち、上記mouse hybridoma E8Eとmouse hybridoma B10E由来のモノクローナル抗体［抗体Ｅ８Ｅ（ＩｇＧ１）と抗体Ｂ１０Ｅ（ＩｇＧ２ａ）］について、下記のように抗体の特異性を確認した。
【００７２】
抗体の特異性は、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、及びヒト血漿に対するウェスタンブロット法にて（図３）、及び抗原（粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ）を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法による希釈抗体による反応曲線により確認した（図４）
ビオチン標識モノクローナル抗体の作製
上述のようにして得た、精製抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体（Ｅ８Ｅ）１ｍｇを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）にて４℃、１６時間透析を行った。６０μｇのＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を、ＤＭＳＯに溶解したものを加え、撹絆しながら室温にて４時間反応させた。反応後、５ＬのＰＢＳにて透析（４℃、一晩）を行い、ビオチン化モノクローナル抗体を得た。
【００７３】
ヒト血漿中Ａｐｏ Ａ−Ｖ 蛋白質定量測定系の構築
９６穴マイクロプレートに、ＰＢＳにて希釈した各固相化抗体（Ｂ１０Ｅ抗体）溶液(5μg/mL)を、各ウェルに１００μＬずつ加え、４℃、一晩静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、ぺーパータオルなどでウェル壁面の液を完全に取り除いた。ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）をＰＢＳに溶解したブロッキング溶液を、各ウェルに２００μＬずつ加えて、室温下、２時間静置した。各ウェルを洗浄液（0.1% Tween20含有PBS)３００μＬで２回洗浄した。予めサンプル希釈液(0.5% CHAPS、及び0.3% BSA含有PBS)にて希釈した測定試料（精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ，ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、もしくはヒト血漿）を１００μＬずつ加えて、室温下、２時間静置した。洗浄液で各ウェルを５回洗浄し、抗体希釈液(0.1% Tween20、及び0.3%BSA含有PBS)で希釈したビオチン標識抗体溶液(0.5μg/mL)を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温下、２時間静置した。洗浄液で各ウェルを５回洗浄後、抗体希釈液で希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン溶液(0.05μg/mL)１００μＬを加えて、室温下、１時間反応させた。次いで、洗浄液で５回洗浄後、使用直前に調整した発色溶液(0.012% 過酸化水素、及び0.4mg/mL OPD(o-phenilendiamine dihydrochloride)含有クエン酸・リン酸緩衝液、pH5.0)を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温下、３０分問反応させた。反応後、５０μＬの反応停止液 ２Ｎ硫酸溶液）を各ウェルに加え、反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて吸光度(波長492nm)を測定した。
【００７４】
精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを用いた検量線を図５に示した。また、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、 ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、及びヒト血漿に対するそれぞれの反応性を図６に示した。これらの結果より、本サンドイッチＥＬＩＳＡにおける反応性は、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、及びヒト血漿において同等であることが示された。
【００７５】
Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子多型の解析
Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子多型T1131Cの解析は、インベーダーアッセイにより行った。すなわち、被検者血液よりＤＮＡ抽出キット（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。３８４ウェルプレートにゲノムＤＮＡ(20ng/μl)、及び陰性、陽性コントロール用合成オリゴヌクレオチド(150ng/3.0μl/ウェル）を加える。
【００７６】
インベーダーオリゴ（配列番号７）：5‘-GTGGAGTTCAGCTTTTCCTCATGGGGCAAATCTA-3’
プローブオリゴ１（１１３１Ｔ）（配列番号８）：5‘-ACGGACGCGGAGCACTTTCGCTCCAGTTV-3’(RED)
プローブオリゴ２（１１３１Ｃ）（配列番号９）：5‘-CGCGCCGAGGTACTTTCGCTCCAGTTCV-3’(FAM)
【００７７】
さらに各ウェルにミネラルオイルを６．０μｌ／ウェルで加え、プレートを９５℃、１０分聞インキュベートする。インキュベート後、３μｌのプローブ／クリーべ一ス／塩化マグネシウム溶液（ＰＰＩミックス１．２μｌ＋フレットバッファー１．４μｌ＋クリーべース／塩化マグネシウム溶液０．４μｌ）を各ウェルに加え、サーマルサイクラーＰＴＣ−１００（エムジェイジャパン株式会社製）で６３℃、４時間反応させる。反応後、各ウェルの蛍光強度をサイトフロー４０００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＦＡＭ(Excitation 485nm/Emission 530nm)、及びＲＥＤ(Excitation 560nm/Emission 620nm)の蛍光強度を測定する。得られたＦＡＭ、及びＲＥＤの蛍光強度を下記の公式を用いてアレル比を求め、変異の有無を決定する。
【００７８】
【数１】
【００７９】
上記式にて得られた被検サンプルの遺伝子型は以下のように求められる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
ヒト血漿Ａｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質量と脂質代謝異常症との関連
健常者２０８名（平均年齢34.8±8.1歳(mean±SD)）におけるＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質量は182.0±77.0ng/mLであった。血中脂質パラメーター（総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＡｐｏＡ−Ｉ，ＡｐｏＡ−II，ＡｐｏＢ，ＡｐｏＣ−II，ＡｐｏＣ−III、及びＡｐｏＥ）との関連において、ＨＤＬコレステロール（r=0.227、P<0.001)、ＡｐｏＡ−Ｉ(r=0.183、P<0.001)、ＡｐｏＥ(r=0.244、P<0.0005)とは、正相関が認められたが、その他の脂質パラメーターとは相関が認められなかった。
【００８２】
Ａｐｏ Ａ−ＶのＳＮＰ３(T1131C)において、ＴＴ型が１０８名、ＴＣ型が３４名、ＣＣ型が１７名であった。各Ｔ１１３１Ｃ多型におけるＡｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、ＴＴ型が194.4±80.8ng/mL、ＴＣ型が173.8±69.6ng/mL、ＣＣ型が144.9±75.1ng/mLと、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、ＣＣ型＜ＴＣ型＜ＴＴ型であり、ＴＴ型は、ＣＣ型(P<0.005)とＴＣ型(P<0.05)と比較して有意に低値であった。
【００８３】
さらに、高脂血症患者７３例（血中中性脂肪濃度142.2±93.2mg/dL）、及び糖尿病患者８７例（血中中性脂肪濃度172.1±128.0mg/dL）において、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、それぞれ77.2±85.7ng/mL、70.8±46.6ng/mLと、健常者（Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度 182.0±77.0mg/dL、血中中性脂肪濃度 95.9mg/dL)と比較し有意に低値であった(P<0.01)。
【００８４】
すなわち、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖは、中性脂肪を加水分解する酵素であるリポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）を活性化する作用を有していることから、中性脂肪代謝に密接に関与し、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、血中中性脂肪代謝を知る一因子であることが示された。さらに、ＡｐｏＣ−IIIはＬＰＬ活性に対して阻害作用を、ＡｐｏＣ−IIは促進作用を示すことが知られている（Fruchart-Najib J,et al,Biochem Biophys Res Commun,319:397-404,2004;Schaap FG,et al,J Biol Chem,279:27941-27947,2004) 。血中中性脂肪濃度（ＴＧ）とｌｏｇＴＧに対して、Ａｐｏ Ａ−Ｖ／ＡｐｏＣ−III比は負の相関（TG:r=-0.319、P<0.0001;logTG:r=-0.449、P<0.0001)を示し、ApoC-II/ApoC-III比は正の相関(TG:r=0.425、P<0.0001;logTG:r=0.484、P<0.0001)を示すことから、LPL活性に関わる因子の濃度に依存してLPL活性を調節し、中性脂肪代謝に関与していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した図面である。
【図２】粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した図、及び抗Ａｐｏ Ａ−Ｖ抗体にてＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を検出したウェスタンブロット図を表す図面である。
【図３】精製抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体Ｅ８Ｅ、及びＢ１０ＥのｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ， ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、及びヒト血漿に対する特異性を検討したウェスタンブロット図を表す図面である。
【図４】粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相化プレートにて抗体の反応性を検討した結果を示す図面である。
【図５】Ａｐｏ Ａ−ＶサンドイッチＥＬＩＳＡの検量線を示す図面である。
【図６】サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｏｏｌｉ、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、及びヒト血漿に対する反応性を検討した結果を示す図面である。
【図７】血中中性脂肪濃度と脂質パラメーターＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＡｐｏＣ−III比との関係を示した図面である。
【図８】血中中性脂肪濃度と脂質パラメーターＡｐｏＣ−II／ＡｐｏＣ−III比との関係を示した図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清アポリポ蛋白質に対する抗体と、これを用いた脂質代謝異常の検出に用いることが可能な当該蛋白質の定量法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフスタイルの欧米化や年齢の高齢化に伴い脳血管障害や虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患が急速に増加し、社会的に大きな問題となっている。多くの疫学的研究により、血中の低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の上昇、及び高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）の減少は冠動脈疾患の危険因子であり、加えて血中の中性脂肪（ＴＧ）は、近年、冠動脈疾患の独立した危険因子であることが報告されている(Austin MA,et al.,Am J,81:7B-12B,1998:Haim M,et al.,Circulation,100:475-482,1990)。さらに、高脂血症、高血圧、インスリン抵抗性が合併する動脈硬化疾患の易発症状である、いわゆるメタボリックシンドロームにおいては、血中コレステロールの上昇より、むしろ中性脂肪の上昇が危険因子となっている。したがって、血中ＴＧ濃度に影響を及ぼす調節因子について解析を行うことは高ＴＧ血症の成因、及びその治療法を確立する上で重要であり、ひいては動脈硬化症を予防し、冠動脈疾患の発症を軽減することになる。
【０００３】
アポリポ蛋白質は、血中において難溶性である脂質の運搬を担うリポ蛋白質の主要な構造蛋白質であり、かつ細胞内へ運搬においては機能的に作用している。アポリポ蛋白質ファミリーのなかで、アポリポ蛋白質Ａ−Ｖ（Ａｐｏ Ａ−Ｖ）は、近年、ヒト―マウス間の遺伝子配列比較解析により発見され、アポリポ蛋白質ファミリーの一員であることが同定された。Ａｐｏ Ａ−Ｖは肝臓で合成され、血中に分泌され、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）やＨＤＬに結合して存在する。Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子ノックアウトマウスにおいては、血中ＴＧ濃度、ＶＬＤＬ蛋白質量がコントロールマウスと比較して上昇しており、逆に、Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスにおいては血中ＴＧ濃度、及びＶＬＤＬ蛋白質量がコントロールマウスと比較して大きく低値であることから、Ａｐｏ Ａ−Ｖが血中ＴＧの代謝に密接に関連していることが示されている(Pennacchio LA,et al., Science,294:169-173,2001)。また、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子のコードする領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析から、当該遺伝子のＳＮＰｓ１〜３は血中ＴＧ濃度、及びＶＬＤＬ蛋白質量との強い相関が認められている(Baum L,et al.,Clin Genet,63:377-379,2003; Eichenbaum-Voline S,et al.,Arteroscler Thromb Vasc Biol,24:167-174,2004;Endo K, et al.,Hum Genet,111:570-572,2002;Pennacchio LA,Hum Mol Genet,11:3031-3038, 2002;Talmud PJ,et al.,Hum Mol Genet,11:3039-3046,2004)。特に、ヒトにおける解析では、血中ＴＧ濃度の高値である個人において、ＳＮＰ３のヘテロ型が多く存在することが報告されており、Ａｐｏ Ａ−Ｖと血中ＴＧ濃度の関連性について注目されている。さらに、血中中性脂肪を低下させる薬剤であるＰＰＡＲ−α活性化薬は、Ａｐｏ Ａ−ＶのｍＲＮＡを増加させることが知られている(Prieur X,et al.,J Biol Chem,2003;278:25468-25480)。よって、これらＰＰＡＲ−α活性薬の薬効判定に対し、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度の測定は有用である。
【非特許文献１】Pennacchio LA,et al.,Science,2001;294:169-173
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決すべき課題は、臨床的にも有望視されているヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出手段を提供し、さらに、当該検出手段を用いた脂質代謝異常の検出を行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、この課題の解決のために、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体を作出し、当該抗体を用いたヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法を提供し、当該検出方法により脂質代謝異常を検出可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
第１に、本発明は、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体（以下、本抗体ともいう）を提供する発明である。本抗体は、モノクローナル抗体（以下、本モノクローナル抗体ともいう）とポリクローナル抗体（以下、本ポリクローナル抗体ともいう）のいずれかであり得る。
【０００７】
第２に、本発明は、本抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖとを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。本検出方法により得られた被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの定量値と、当該蛋白質の定量値の標準とを比較して、当該定量値が当該標準と異なる場合に、これを脂質代謝異常として評価することが可能である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出手段の重要な要素として用いることができるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体が提供され、実際に、当該抗体を用いたヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出方法が提供される。当該検出方法により、検体提供者の脂質代謝異常を検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ａ．本抗体
本抗体は、上述のように、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する抗体、すなわち、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対するモノクローナル抗体、または、ポリクローナル抗体である。
【００１０】
このような本抗体を製造するための前提条件として、免疫抗原として用いるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが必要である。
【００１１】
Ａｐｏ Ａ−Ｖは、上述したように、ヒト―マウス間の遺伝子配列比較解析により発見され、アポリポ蛋白質ファミリーの一員であることが同定された(配列番号１、２：Pennacchio LA,et al.,Science,2001;294:169-173, Gene Bank Accession Number:NM_052968(cDNA))。
【００１２】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖは、天然物として、ヒト血漿から分離して調製することができる。すなわち、ヒト血漿より、常法、例えば、超遠心法や塩析等により得られる、含Ａｐｏ Ａ−Ｖ粗画分に、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常公知の精製法を施して、精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを製造することができる(例えば、Choi et al.,J Immu Methods. 131, 1990, 159-163)。特に、本抗体を既に得ている場合には、このヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの天然物のヒト血漿からの分離は容易となる。
【００１３】
このようにして得た精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。
【００１４】
また、遺伝子工学的な手法を用いて、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの組み換え蛋白質を得て、これを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。この方法は、未だ本抗体を得ていない状態において、これを製造する場合に有利な方法である。
【００１５】
当該組み換え蛋白質は、既知のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の塩基配列(例えば、Gene Bank Accession Number:NM_052968(cDNA))を参考にして、遺伝子増幅用プライマーを調製し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子を遺伝子増幅産物として得て、これをクローニングすることにより得たクローンより産生されるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの組み換え蛋白質を、上述した通常公知の精製法により精製することにより、本抗体を製造するための免疫抗原として用いることが可能なヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ組み換え蛋白質とすることができる。また、上記のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の塩基配列を一部改変した、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ一部改変遺伝子がコードする改変組み換え蛋白質も、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対する免疫抗原としての性質を失わない限り可能である。
【００１６】
なお、ここで使用される免疫抗原としてのヒトＡｐｏ Ａ−Ｖは、必ずしもヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの全部である必要はなく、その一部の断片ペプチドであってもよい。
【００１７】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの一部の断片ペプチドは、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子の一部断片がコードするヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ断片や、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖのプロテアーゼ処理物、ホスファイト−トリエステル法(Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)) 等を用いた固相法や液相法による化学合成ペプチド等として免疫抗原として用いることができる。
【００１８】
このようにして得られる上記のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖにおいて、特に、免疫抗原として用いるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが小分子の一部ペプチドである場合には、本抗体の免疫反応性を向上させるために、ハプテンを結合させることができる。
【００１９】
このハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００２０】
上記のペプチドとハプテンを結合させるために、架橋剤を用いることができる。かかる架橋剤は、選択するハプテンの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ハプテンとして、傘貝ヘモシアニンを選択する場合には、ｍ−マレイニミドベンジル−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等を用いることができる。なお、選択する架橋剤の種類に応じて、必要な処理を、上記のペプチドに施すことができる。例えば、上記のＭＢＳを架橋剤として用いる場合には、結合反応に必要なスルフィド結合を有するシステイン残基を、上記ペプチドの両末端のいずれかに付加することが必要である。また、選択したペプチドにおけるシステイン残基は、これを他のアミノ酸に置換するか、保護基を結合させることによって保護することが好ましい。
【００２１】
本抗体を製造するために、上述のようにして得られる免疫抗原で免疫される動物も、特に限定されるものではなく、マウス、ラット等を広く用いることが可能であり、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００２２】
本抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるにかかわらず、免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
【００２３】
より、具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度毎に、上記手法により数回投与することにより免疫を行う。
【００２４】
本ポリクローナル抗体は、このように、上記免疫抗原により免疫を行った動物の抗血清として得ることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体は、当該免疫動物の、例えば、脾臓細胞を免疫細胞として用い、この免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により得られる、本抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマにより得ることができる。
【００２６】
上記の骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えば、
SP2/0-Ag14,P3-NS1-1-Ag4-1,MPC11-45,6.TG1.7（以上、マウス由来）；210.RCY.Ag1.2.3（ラット由来）；SKO-007,GM15006TG-A12（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００２７】
上記免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法(Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495(1975))等に準じて行うことができる。
【００２８】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００２９】
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００３０】
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
【００３１】
このようにして得られるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖを認識するモノクローナル抗体である本抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
【００３２】
このハイブリドーマからの本モノクローナル抗体の採取は、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、用いるハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００３３】
なお、インビトロで免疫細胞をヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることで、本モノクローナル抗体を得ることもできる(Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53,261(1982);Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,1149(1983))。
【００３４】
さらに、動物細胞発現ベクターに対してヒトＡｐｏ Ａ−Ｖをコードする遺伝子を導入した、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ発現ベクターを直接動物に投与することによっても、当該動物においてヒトＡｐｏ Ａ−Ｖにより免疫を行うことができる。この手法は、上述したヒトＡｐｏ Ａ−Ｖによる直接免疫に代えて行うことも、両手法を組み合わせて行うことも可能である。なお、ここで用いられる動物発現ベクターとしては、例えば、pcDNA3.1(+)（インビトロシジェン社製）、pRc/CMV（インビトロシジェン社製）等のサイトメガロウイルスプロモーターを用いた発現ベクター等を挙げることができる。
【００３５】
また、上記のようにして得られる本抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。本抗体は、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに特異反応性を有する抗体である。なお、この「ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに特異反応性を有する」とは、本抗体は、少なくとも、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対しては交差反応性を示すという意味である。
【００３６】
このような性質の本抗体は、後述するように、臨床において用い得ることは勿論のこと、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ自体の分離・精製のための試薬としても極めて有用である。
【００３７】
本抗体についてのさらに具体的な内容は、実施例において後述する。このようにして得られる本抗体を、必要に応じて標識物質で標識して、後述する本発明に係わる測定方法等において用いることができる。
【００３８】
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００３９】
これらの標識物質による、本抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
【００４０】
また、本抗体（標識されたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化抗体として、後述する本発明に係わる測定方法等に用いることもできる。
【００４１】
さらに、本抗体は、必要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができる。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
【００４２】
これらの不溶性担体における、本抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４３】
Ｂ．本検出方法
本検出方法は、上述したように、本抗体を用いて、検体中のＡｐｏ Ａ−Ｖを定量検出することが可能な検出方法である。すなわち、本検出方法は、本抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法であり、本検出方法により、被験者の脂質代謝異常を検出することが可能である。
【００４４】
このような本検出方法の様態としては、例えばエンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フルオロメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができるが、一般的には、エンザイムイムノアッセイ法による解析による方法を選択することが望ましい。 エンザイムイムノアッセイ法は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする“heterogeneous enzyme immunoassay”と、このＢ／Ｆ分離を必要としない“homogeneous enzyme immunoassay”とに大別される。本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前者の“heterogeneous enzyme immunoassay”を選択することが好ましく、イムノソルベントを用いる、“enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)”を選択することがさらに好ましい。
【００４５】
より具体的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。かかるサンドイッチ法は、特に、操作上の簡便性、経済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考慮すると、特に好ましい検出態様の一つである。
【００４６】
このサンドイッチ法を行うに際しては、本抗体が、９６穴マイクロプレートに代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された固定化抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチンにより標識された本抗体を用いることが好ましい。
【００４７】
サンドイッチ法は、少なくとも、下記（ａ） 及び（ｂ） の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
【００４８】
（ａ） 不溶性担体に本抗体を固定化した固定化抗体に、血液検体等の検体を反応させる工程。
【００４９】
この工程（ａ） においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化抗体から除去される。
【００５０】
（ｂ） 固定化抗体と、試料中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等により標識された本抗体を反応させる工程。
【００５１】
この工程（ｂ） においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識された本抗体は、固定化抗体から除去される。
【００５２】
また、この工程（ｂ） においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。例えば、標識物質としてビオチンを選択した場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。また、例えば、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その基質を必要に応じて発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化することができる。
【００５３】
このようにして、顕在化した発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出を行うことができる。
【００５４】
なお、本検出方法において用いられる検体は、本来、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖが存在する検体であれば特に限定されないが、本検出方法が、血清脂質異常に関連する事項について判定する方法であることや、本発明の臨床検査としての適応等を考慮すると、血漿等の血液検体であることが好ましい。
【００５５】
本検出方法の検出対象である、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量は、動脈硬化等の原因となり得る脂質代謝異常の有力な指標となる。すなわち、本検出方法により検出された検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの異常により、検体提供者の脂質代謝異常を判定することができる。
【００５６】
本検出方法においては、脂質代謝が正常であれば、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が正常値（１８２ｎｇ／ｍｌ程度）であるが、脂質代謝異常である場合には、量的に低い値か高い値を示すことによって、脂質代謝異常の判定がなされる。
【００５７】
すなわち、本検出方法により、血液検体等の検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が、正常値よりも多ければ、血中ＴＧ濃度とＶＬＤＬ蛋白質量が標準よりも少ないことが予測される。逆に、血液検体等の検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が、正常値よりも少なければ、血中ＴＧ濃度とＶＬＤＬ蛋白質量が標準よりも多いことが予測され、これは動脈硬化の原因となり得る可能性の強い脂質代謝異常である。よって、特に、本検出方法で検出されるヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ量が標準よりも少ない場合に、検体提供者における注意が必要になる。
【００５８】
本検出方法で、「脂質代謝異常」と判定された検体提供者に対して、具体的な症状、例えば、動脈硬化に伴って起こることが多い、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等が現れる前に、適切な処置を行うことが可能であり、予防医学上、極めて有用な方法である。
【００５９】
本発明においては、本抗体を、本検出方法において用いるための、本抗体を含む脂質代謝異常判定用キットも提供される（以下、本キットともいう）。
【００６０】
本キットにおいては、本抗体を、検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖの検出のために供する要素、例えば、前記の標識された本抗体や固定化された本抗体等が含まれ得る。
【００６１】
本キットは、本検出方法に対応して、サンドイッチ法やフルオロメトリーによる判定や検出を容易に行い得る構成のキットであることが好ましい。
【実施例】
【００６２】
下記に本発明の実施例を記載するが、これにより本願発明の範囲が限定されるものではない。
【００６３】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡの作製
ＨｅｐＧ２細胞よりｍＲＮＡを精製し、プライマー１、プライマー２、及びプライマー３、プライマー４を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１、及びＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を増幅した。
プライマー１（配列番号３）：5’-gacggatccaaaggcttctgggactacttcagcc-3’(forward)
プライマー２（配列番号４）：5’-gacgtcgactcaggggtcccccagatggctgtgg-3’(reverse)
プライマー３（配列番号５）：5’-gacgaattcagcagataatggcaagcatggctgc-3’(forward)
プライマー４（配列番号６）：5’-gacgaattctcagtgatggtgatggtgatgggggtcccccagatggctgtggccc-3’(reverse)
【００６４】
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１はヒトＡｐｏ Ａ−Ｖアミノ酸配列の２２から３６３番目に対応する領域である。Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２はヒトＡｐｏ Ａ−Ｖアミノ酸配列の１から３６３番目に対応し、さらにＣ末端にヒスチジン６個（ヒスチジンタグ）が融合するように設定されている。得られたＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１、及びＡｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２はプラスミドpBluescriptIISK- (STRATAGENE)に組み込み、シーケンシングを行い、ヒトＡｐｏ Ａ−ＶｃＤＮＡ(Gene Bank Accession Number:NM_052968)の塩基配列と相違ないことを確認した。
【００６５】
大腸菌を宿主としたリコンビナントヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ Ｅ．ｃｏｌｉ）の作成
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−１を大腸菌発現ベクターpQE-30(Qiagen)に挿入し、ベクターpQE-30／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。このベクターを大腸菌株ＪＭ１０９（東洋紡）に導入し、大腸菌ＪＭ１０９／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。この組替え大腸菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地にて培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧによりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを発現誘導した。発現誘導後、培養液を遠心(5000rpm,5min,4℃)し、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ発現大腸菌体を得た。沈殿した菌体は０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁した後、氷上にてソニケーションにより破砕した。さらに、遠心(15000rpm,30min,4℃)によりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを含む沈殿を回収した。沈殿は７Ｍ Ｕｒｅａ、１０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、氷上にてソニケーション処理し、遠心(15000rpm,30min,4℃)によりｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖを含む上清を回収した。上清は予め７Ｍ Ｕｒｅａ， １０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化したNi-NTA agarose(Qiagen)に結合し、７Ｍ Ｕｒｅａ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸緩衝液(pH4.5)にて溶出し、溶出画分を精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉとした。ＢＣＡ法によりＢＳＡを用いた検量線から蛋白濃度を測定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製の純度を確認した（図１）。
【００６６】
ＣＨＯ−Ｋ１、細胞を宿主としたリコンビナントヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ ＣＨＯ）の製造
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を動物細胞発現ベクターpEF321(Kim DG et al,Gene,91:217-223,1990)に挿入し、ベクターpEF321／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。FuGENE6 Transfection reagent（ラフマンラロッシュ社製）を用いてpEF321／Ａｐｏ Ａ−ＶとpSV2neo (CLONTECH)を同時にＣＨＯ細胞に導入し、ネオマイシンの一種であるゲネチシン耐性を指標に導入した遺伝子が安定に組み込まれた細胞を選別し、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ発現ＣＨＯ細胞株（ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＣＨＯ）を得た。ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖの発現は培養上清をWestern Blottingにより、Tetra・His Antibody（キアゲン社製）を用いてｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯのＣ末端に融合させたヒスチジンタグを検出することにより確認した。ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＣＨＯ細胞をCHO-S-SFMII培地(Gibco)で培養し、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖを含む培養上清を得た。培養上清はＰＢＳにて予め平衡化したTALON(R) Metal Affinity Resins（クロンテック社製）に結合（培養上清100ml対しResin 1ml)させ、２５０ｍＭ Imidazole、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液(pH8.0)にて溶出(Resin 1mlに対し溶出液2ml)し、溶出画分を粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯとした（図２）。
【００６７】
抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ モノクローナル抗体の製造
Ａｐｏ Ａ−Ｖ ｃＤＮＡ−２を動物細胞発現ベクターpcDNA3.1(+)（インビトロシジェン社製）に挿入し、ベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖを得た。さらに、QIAfilter Plasmid Maxi Kit（キアゲン社製）を用いてｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖを精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解した。このプラスミドベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖ溶液５０μＬをＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢、日本ＳＬＣ社製）の皮下に投与し、さらに２週間ごとに同様のプラスミドベクターｐｃＤＮＡ／Ａｐｏ Ａ−Ｖ溶液５０μＬをマウス皮下に合計７回ないし８回投与した。ＤＮＡ溶液の最終投与から２週間後に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ ５０μＬをlmmunEasyTM Mouse Adjuvant（キアゲン社製）を用いてマウス皮下に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ ２５０μＬをフロイント不完全アジュバントを用いてマウス腹腔内に投与した。粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ投与から３日後にマウス脾細胞を摘出し、ポリエチレングリコール１５００溶液を用いてマウス骨髄腫細胞(SP2/0-Ag14)と融合させた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は１０％ハイブリドーマクローニングファクターを添加したＨＡＴ培地で選択した。抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体の産生は、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって選別した。すなわち、各ウェル当たりにＰＢＳにて１０倍希釈した粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ １００μＬを固相化（４℃、一晩）し、洗浄後、各ウェルを５％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキングした。各ウェルを洗浄後、１００μＬの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、４，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、洗浄液にてウェルを５回洗浄し、１００μＬの発色溶液(0.012%過酸化水素、0.4mg/mL OPD(o-phenulenediamine dihydrochloride、シグマアルドリッチ社製）含有クエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を添加後、室温課で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸を添加し、反応を停止した。反応停止後、波長４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。１．０以上の吸光度を示すハイブリドーマ培養上清を陽性とし、選別した。抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体産生ハイブリドーマはさらに限界希釈法によりクローニングした。また、陽性のハイブリドーマ培養上清はウエスタンブロット法にて粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯに対する反応性を確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを最終的に選別した。これらのクローンのうち２クローンを、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センターに寄託した［mouse hybridoma E8E(FERM AP-20357) 、mouse hybridoma B10E(FERM AP-20358)］。
【００６８】
ウェスタンブロット法は、１レーンあたり１０μＬの粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを１２．５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、洗浄液にて１０倍から１００倍に希釈した各モノクローナル抗体を含む培養上清を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、０．０５μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【００６９】
最終的に、粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相化したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法、及び粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、またはヒト血漿に対するウェスタンブロット法により選別し、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対して反応するモノクローナル抗体産生クローンを５クローン得た。
【００７０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの抗体製造及び精製
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌）に一匹あたりハイブリドーマ細胞１０６〜１０７個／０．５ｍＬを腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し、腹水を採取した。得られた腹水は、遠心にて細胞成分を取り除き、上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。次いで、１０，０００ｘｇで１０分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン溶液、pH8.9）に溶解し、蛋白質Ａセファロースと混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させた蛋白質Ａセファロースをカラムに充填し、６倍量の結合溶液にて洗浄後、溶出溶液（０．１Ｍクエン酸溶液、pH4.0）で１ｍＬずつ溶出した。溶出された画分は、０．１ｍＬの２Ｍトリス溶液（pH10.0）で中和した。各溶出画分の吸光度(280nm)を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収した。回収したモノクローナル画分はＰＢＳにて透析（４℃、一晩）し、精製モノクローナル抗体を得た。
【００７１】
得られたモノクロナール抗体のアイソタイプは、マウスモノクロナール抗体アイソタイプ決定用キット（べーリンガー社製）を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。精製ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖに対するモノクローナル抗体産生は、ＩｇＧ１（３クローン）、及びＩｇＧ２ａ（２クローン）であった。これらのうち、上記mouse hybridoma E8Eとmouse hybridoma B10E由来のモノクローナル抗体［抗体Ｅ８Ｅ（ＩｇＧ１）と抗体Ｂ１０Ｅ（ＩｇＧ２ａ）］について、下記のように抗体の特異性を確認した。
【００７２】
抗体の特異性は、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、及びヒト血漿に対するウェスタンブロット法にて（図３）、及び抗原（粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ）を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法による希釈抗体による反応曲線により確認した（図４）
ビオチン標識モノクローナル抗体の作製
上述のようにして得た、精製抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体（Ｅ８Ｅ）１ｍｇを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）にて４℃、１６時間透析を行った。６０μｇのＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を、ＤＭＳＯに溶解したものを加え、撹絆しながら室温にて４時間反応させた。反応後、５ＬのＰＢＳにて透析（４℃、一晩）を行い、ビオチン化モノクローナル抗体を得た。
【００７３】
ヒト血漿中Ａｐｏ Ａ−Ｖ 蛋白質定量測定系の構築
９６穴マイクロプレートに、ＰＢＳにて希釈した各固相化抗体（Ｂ１０Ｅ抗体）溶液(5μg/mL)を、各ウェルに１００μＬずつ加え、４℃、一晩静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、ぺーパータオルなどでウェル壁面の液を完全に取り除いた。ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）をＰＢＳに溶解したブロッキング溶液を、各ウェルに２００μＬずつ加えて、室温下、２時間静置した。各ウェルを洗浄液（0.1% Tween20含有PBS)３００μＬで２回洗浄した。予めサンプル希釈液(0.5% CHAPS、及び0.3% BSA含有PBS)にて希釈した測定試料（精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ，ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、もしくはヒト血漿）を１００μＬずつ加えて、室温下、２時間静置した。洗浄液で各ウェルを５回洗浄し、抗体希釈液(0.1% Tween20、及び0.3%BSA含有PBS)で希釈したビオチン標識抗体溶液(0.5μg/mL)を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温下、２時間静置した。洗浄液で各ウェルを５回洗浄後、抗体希釈液で希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン溶液(0.05μg/mL)１００μＬを加えて、室温下、１時間反応させた。次いで、洗浄液で５回洗浄後、使用直前に調整した発色溶液(0.012% 過酸化水素、及び0.4mg/mL OPD(o-phenilendiamine dihydrochloride)含有クエン酸・リン酸緩衝液、pH5.0)を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温下、３０分問反応させた。反応後、５０μＬの反応停止液 ２Ｎ硫酸溶液）を各ウェルに加え、反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて吸光度(波長492nm)を測定した。
【００７４】
精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉを用いた検量線を図５に示した。また、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、 ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ培養上清、及びヒト血漿に対するそれぞれの反応性を図６に示した。これらの結果より、本サンドイッチＥＬＩＳＡにおける反応性は、精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ、及びヒト血漿において同等であることが示された。
【００７５】
Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子多型の解析
Ａｐｏ Ａ−Ｖ遺伝子多型T1131Cの解析は、インベーダーアッセイにより行った。すなわち、被検者血液よりＤＮＡ抽出キット（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。３８４ウェルプレートにゲノムＤＮＡ(20ng/μl)、及び陰性、陽性コントロール用合成オリゴヌクレオチド(150ng/3.0μl/ウェル）を加える。
【００７６】
インベーダーオリゴ（配列番号７）：5‘-GTGGAGTTCAGCTTTTCCTCATGGGGCAAATCTA-3’
プローブオリゴ１（１１３１Ｔ）（配列番号８）：5‘-ACGGACGCGGAGCACTTTCGCTCCAGTTV-3’(RED)
プローブオリゴ２（１１３１Ｃ）（配列番号９）：5‘-CGCGCCGAGGTACTTTCGCTCCAGTTCV-3’(FAM)
【００７７】
さらに各ウェルにミネラルオイルを６．０μｌ／ウェルで加え、プレートを９５℃、１０分聞インキュベートする。インキュベート後、３μｌのプローブ／クリーべ一ス／塩化マグネシウム溶液（ＰＰＩミックス１．２μｌ＋フレットバッファー１．４μｌ＋クリーべース／塩化マグネシウム溶液０．４μｌ）を各ウェルに加え、サーマルサイクラーＰＴＣ−１００（エムジェイジャパン株式会社製）で６３℃、４時間反応させる。反応後、各ウェルの蛍光強度をサイトフロー４０００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＦＡＭ(Excitation 485nm/Emission 530nm)、及びＲＥＤ(Excitation 560nm/Emission 620nm)の蛍光強度を測定する。得られたＦＡＭ、及びＲＥＤの蛍光強度を下記の公式を用いてアレル比を求め、変異の有無を決定する。
【００７８】
【数１】
【００７９】
上記式にて得られた被検サンプルの遺伝子型は以下のように求められる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
ヒト血漿Ａｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質量と脂質代謝異常症との関連
健常者２０８名（平均年齢34.8±8.1歳(mean±SD)）におけるＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質量は182.0±77.0ng/mLであった。血中脂質パラメーター（総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＡｐｏＡ−Ｉ，ＡｐｏＡ−II，ＡｐｏＢ，ＡｐｏＣ−II，ＡｐｏＣ−III、及びＡｐｏＥ）との関連において、ＨＤＬコレステロール（r=0.227、P<0.001)、ＡｐｏＡ−Ｉ(r=0.183、P<0.001)、ＡｐｏＥ(r=0.244、P<0.0005)とは、正相関が認められたが、その他の脂質パラメーターとは相関が認められなかった。
【００８２】
Ａｐｏ Ａ−ＶのＳＮＰ３(T1131C)において、ＴＴ型が１０８名、ＴＣ型が３４名、ＣＣ型が１７名であった。各Ｔ１１３１Ｃ多型におけるＡｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、ＴＴ型が194.4±80.8ng/mL、ＴＣ型が173.8±69.6ng/mL、ＣＣ型が144.9±75.1ng/mLと、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、ＣＣ型＜ＴＣ型＜ＴＴ型であり、ＴＴ型は、ＣＣ型(P<0.005)とＴＣ型(P<0.05)と比較して有意に低値であった。
【００８３】
さらに、高脂血症患者７３例（血中中性脂肪濃度142.2±93.2mg/dL）、及び糖尿病患者８７例（血中中性脂肪濃度172.1±128.0mg/dL）において、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、それぞれ77.2±85.7ng/mL、70.8±46.6ng/mLと、健常者（Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度 182.0±77.0mg/dL、血中中性脂肪濃度 95.9mg/dL)と比較し有意に低値であった(P<0.01)。
【００８４】
すなわち、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖは、中性脂肪を加水分解する酵素であるリポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）を活性化する作用を有していることから、中性脂肪代謝に密接に関与し、血中Ａｐｏ Ａ−Ｖ濃度は、血中中性脂肪代謝を知る一因子であることが示された。さらに、ＡｐｏＣ−IIIはＬＰＬ活性に対して阻害作用を、ＡｐｏＣ−IIは促進作用を示すことが知られている（Fruchart-Najib J,et al,Biochem Biophys Res Commun,319:397-404,2004;Schaap FG,et al,J Biol Chem,279:27941-27947,2004) 。血中中性脂肪濃度（ＴＧ）とｌｏｇＴＧに対して、Ａｐｏ Ａ−Ｖ／ＡｐｏＣ−III比は負の相関（TG:r=-0.319、P<0.0001;logTG:r=-0.449、P<0.0001)を示し、ApoC-II/ApoC-III比は正の相関(TG:r=0.425、P<0.0001;logTG:r=0.484、P<0.0001)を示すことから、LPL活性に関わる因子の濃度に依存してLPL活性を調節し、中性脂肪代謝に関与していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した図面である。
【図２】粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した図、及び抗Ａｐｏ Ａ−Ｖ抗体にてＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を検出したウェスタンブロット図を表す図面である。
【図３】精製抗ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖモノクローナル抗体Ｅ８Ｅ、及びＢ１０ＥのｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｃｏｌｉ， ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、及びヒト血漿に対する特異性を検討したウェスタンブロット図を表す図面である。
【図４】粗精製ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯを固相化プレートにて抗体の反応性を検討した結果を示す図面である。
【図５】Ａｐｏ Ａ−ＶサンドイッチＥＬＩＳＡの検量線を示す図面である。
【図６】サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿Ｅ．ｏｏｌｉ、ｒｈＡｐｏ Ａ−Ｖ＿ＣＨＯ、及びヒト血漿に対する反応性を検討した結果を示す図面である。
【図７】血中中性脂肪濃度と脂質パラメーターＡｐｏ Ａ−Ｖ／ＡｐｏＣ−III比との関係を示した図面である。
【図８】血中中性脂肪濃度と脂質パラメーターＡｐｏＣ−II／ＡｐｏＣ−III比との関係を示した図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質に対する抗体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項４】
前記検出方法により得られた被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の定量値と、当該蛋白質の定量値の標準とを比較して、当該定量値が当該標準と異なる場合に、これを脂質代謝異常として評価することを特徴とする、請求項３記載のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項５】
前記被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の定量値が、標準よりも小さいことを特徴とする、請求項４記載のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項６】
前記抗体を構成要素として含むことを特徴とする、請求項５又は６に記載の検出方法を行うための、脂質代謝異常判定用キット。
【請求項１】
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質に対する抗体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗体と既知の量のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質とを接触させて決定された当該蛋白質の検量値と、当該抗体と検体とを接触させて得られた当該蛋白質の検量値を比較することによって、当該検体中のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質を定量することを特徴とする、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項４】
前記検出方法により得られた被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の定量値と、当該蛋白質の定量値の標準とを比較して、当該定量値が当該標準と異なる場合に、これを脂質代謝異常として評価することを特徴とする、請求項３記載のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項５】
前記被験者のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の定量値が、標準よりも小さいことを特徴とする、請求項４記載のヒトＡｐｏ Ａ−Ｖ蛋白質の検出方法。
【請求項６】
前記抗体を構成要素として含むことを特徴とする、請求項５又は６に記載の検出方法を行うための、脂質代謝異常判定用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２１４７６５（Ｐ２００６−２１４７６５Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５４７８（Ｐ２００５−２５４７８）
【出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（５９１０８３３３６）株式会社ビー・エム・エル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（５９１０８３３３６）株式会社ビー・エム・エル (31)
【Ｆターム（参考）】
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