ヒトＨＭＧ−１に特異的に結合する抗体及びその製造方法
【課題】ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体、並びにＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、かつ測定の操作が簡便で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法を提供する。
【解決手段】ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体；並びに該抗体を製造する方法。
【解決手段】ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体；並びに該抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に特異的に結合する抗体、並びにこの抗体を使用するヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００３】
ハイモビリティーグループプロテイン（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（以下「ＨＭＧ」と略すことがある。）は、クロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧはＤＮＡと結合する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
【０００４】
ＨＭＧには、いくつかの種類が存在する。例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧ−１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧ−２）、ハイモビリティーグループプロテイン−３（ＨＭＧ−３）、ハイモビリティーグループプロテイン−８（ＨＭＧ−８）、ハイモビリティーグループプロテイン−１７（ＨＭＧ−１７）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｙ（ＨＭＧ−Ｙ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン Ｉ−Ｃ（ＨＭＧ Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
【０００５】
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ウシのＨＭＧ−１の相同性は９８．６％であり、ブタのＨＭＧ−１の相同性は９９．１％であった。また、同様に、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ヒトのＨＭＧ−２の相同性は８１．２％であり、ウシのＨＭＧ−２の相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧ−２の相同性は７９．４％であった。
【０００６】
ワングらは１９９９年に、ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧ−１の定量測定を行った。その結果、ワングらは、ＨＭＧ−１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧ−１を測定することによって可能であることを示した。即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧ−１の存在を確認するだけではなく、精密に定量することの有用性が明らかにされた（Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行）。
【０００７】
なお、先に、ＨＭＧ−１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧ−１に結合する抗体については、パーキネンらや、レップらによって調製可能なことが示されていた（Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行；Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行）。この抗体を用いてレップらはＨＭＧ−１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。（なお、この固相酵素免疫測定法は、精製したＨＭＧ−１をマイクロプレート（マイクロタイタープレート）のウェルに固相化し、これに酵素標識したＨＭＧ−１に結合する抗体を接触させ、作用させて、ＨＭＧ−１に結合する抗体が精製したＨＭＧ−１に結合することを確かめたものである。）
しかしながら、これらの抗体は、ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体であるので、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１と相同性の高い(８１．２％)、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【０００８】
即ち、レップら又はワングらが示したＨＭＧ−１の測定方法は、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２をも測り込んでしまう測定方法であった。
【０００９】
また、ルーヒアイネンらは２０００年に、遺伝子工学によって組換えＤＮＡより調製したラットのＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体と、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を各々使用して、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法により、ヒト血液中のＨＭＧ−１を測定した（Ａ．Ｒｏｕｈｉａｉｎｅｎら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，８４巻，１０８７〜１０９４頁，２０００年発行）。
【００１０】
しかしながら、ここで使用されたラットのＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体は、前記した理由により、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【００１１】
また、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体は、免疫原とした前記のペプチドのアミノ酸配列が、ＨＭＧ−２のアミノ酸配列の一部を含むこと、及びポリクローナル抗体であることより、やはりＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【００１２】
よって、ルーヒアイネンらが開示した測定方法は、これも、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２をも測り込んでしまう測定方法であった。
【００１３】
従って、今までは、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体は、知られておらず存在しなかった。
【００１４】
それゆえ、前記のワングらのウエスタンブロット法での測定方法以外に、ＨＭＧ−２を測り込むことなしにＨＭＧ−１のみを測ることができる測定方法は存在しなかった。（なお、このウエスタンブロット法は、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２等を電気泳動し、この担体又はこれを転写した担体に、抗体を接触させ、結合させて、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２と抗体との結合を確かめるものである。よって、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２の泳動位置（分子量の違いによる易動度）は異なるので、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２を分別することができる。）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述したように、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体は、知られておらず存在しなかった。このため、前記のワングらのウエスタンブロット法での方法を除くと、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるＨＭＧ−１だけを測ることができ、ＨＭＧ−２を測り込むことのない免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬は存在しなかった。即ち、ウエスタンブロット法以外の免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬では、試料中のＨＭＧ−１を測定しようとしても、試料中に含まれるＨＭＧ−２をも測り込んでしまい、そのため正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値が得られてしまう。このＨＭＧ−２をも測り込んでしまい、正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値は、敗血症等の疾患の診断を誤らせる可能性のあるものであった。
【００１６】
なお、ウエスタンブロット法は、操作が繁雑であり、手技に熟練を要する測定方法であるので、実施することができる測定者、測定施設は限られたものである。そして、ウエスタンブロット法は、その測定の自動化が困難なものである。
【００１７】
従って、ＨＭＧ−２を測り込むことなく、ＨＭＧ−１のみを正確に測定することができる測定方法、測定試薬であって、かつ、操作が簡便であり、又は自動化が可能な測定方法、測定試薬が求められていた。
【００１８】
これに対して、本発明の第一の課題は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を提供することである。
【００１９】
また、本発明の第二の課題は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、かつ測定の操作が簡便で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬を提供することである。
【００２０】
そして、本発明の第三の課題は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、かつ操作が簡便で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体。
（２）次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（３）下記の[1]及び[2]の特徴：
[1]次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなる、
[2]当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体を得ることができる、
を有するペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（４）下記の[1]及び[2]の特徴：
[1]次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなる、
[2]前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製された抗体と結合することができる、
を有するペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（５）モノクローナル抗体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を使用することを特徴とする免疫学的測定方法。
（７）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測定試薬において、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗体は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−１と非常に相同性の高いヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体である。
【００２３】
また、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭＧ−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡便で自動化することも可能な測定試薬である。これにより、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【００２４】
そして、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭＧ−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡便で自動化することも可能な測定方法である。これにより、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体
（１）総論
本発明の、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１（ヒトＨＭＧ−１）には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２（ヒトＨＭＧ−２）には結合しない抗体（以下「本発明の抗体」ということがある。）は、ヒトＨＭＧ−１に結合し、かつヒトＨＭＧ−２に結合しない抗体であれば、いかなるものでもよい。
【００２６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体よりなる抗血清又はモノクローナル抗体のいずれのタイプのものをも含み、また、これらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’等）をも含むものである。
なお、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であることが、その調製操作において吸収操作などを省略できること等から好ましい。
【００２７】
本発明の抗体を取得する方法は、特に限定されないものの、下記の方法等が挙げられる。
[1]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２のアミノ酸配列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択する。次に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。そして、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体であることを確認するか、又はそのような抗体を選択して、本発明の抗体を取得する。
【００２８】
なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００２９】
[2]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。固相に固定化したＨＭＧ−２と前記産生された抗体を含む溶液を接触させ、ＨＭＧ−２に結合する抗体を、固定化されたＨＭＧ−２を介して固相に結合させる。次に、前記担体と前記溶液を分離することにより、溶液中からＨＭＧ−２に結合する抗体を除去して、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を取得する。
【００３０】
[3]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２のアミノ酸配列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択する。次に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。固相に固定化したＨＭＧ−２と前記産生された抗体を含む溶液を接触させ、ＨＭＧ−２に結合する抗体を、固定化されたＨＭＧ−２を介して固相に結合させる。次に、前記担体と前記溶液を分離することにより、溶液中からＨＭＧ−２に結合する抗体を除去して、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を取得する。
【００３１】
なお、この場合も、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００３２】
前記[1]の方法は、モノクローナル抗体の取得において適した方法であり、前記[2]及び[3]の方法はポリクローナル抗体又は抗血清の取得において適した方法である。そして、前記[1]の方法に比べて前記[2]の方法の方が操作がより繁雑であり、また、前記[2]の方法に比べて前記[3]の方法の方が操作がより繁雑であるので、操作の面からは前記[1]の方法がより好ましい。
【００３３】
（２）免疫原
本発明の抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
前記した通り、本発明の抗体を産生させるための免疫原として、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質、あるいはＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等を用いることができる。
【００３４】
なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００３５】
このアミノ酸配列の各アミノ酸残基の親水性の高さの推定は、ホップらの方法（Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻，３８２４〜３８２８頁，１９８１年発行）又はパーカーらの方法（Ｐａｒｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５巻，５４２５〜５４３２頁，１９８６年発行）等により行うことができる。
【００３６】
本発明者らは、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列（Ｌ．Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行）の全てについて、前記のホップらの方法により、各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を行った。この結果を図１に示した。
【００３７】
この図において、横軸はヒトＨＭＧ−１の各アミノ酸残基のＮ末端からの順番を示している。また、縦軸は値がプラス側に大きい程、疎水性が高いことを示し、逆に値がマイナス側に大きい程、親水性が高いことを示す。
【００３８】
次に、本発明者らは、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列のうち親水性の高い配列をヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１９９２年発行）と比較した。
そして、この親水性の高いアミノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択した。
【００３９】
この本発明者らが選択したアミノ酸配列は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミノ酸残基（グリシン）より１１番目のアミノ酸残基（リシン）までの、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」である。
【００４０】
後述するように、このアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」よりなるペプチドを免疫原として調製された抗体は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（本発明の抗体）である。
【００４１】
この「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製することにより、本発明の抗体を取得することができるのであるが、本発明の抗体を産生させるための免疫原としては、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００４２】
なお、ヒトＨＭＧ−１の前記アミノ酸配列に相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列は「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」であり、これはＮ末端から６番目のアミノ酸残基が「Lys」（ＨＭＧ−１）から「Asn」（ＨＭＧ−２）に入れ替わっただけのものであり、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の前記アミノ酸配列における違いはこの箇所だけであるので、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（本発明の抗体）の免疫原のうち、前記アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」に由来する免疫原のアミノ酸配列としては、このヒトＨＭＧ−１のＮ末端から６番目のアミノ酸残基「Lys」を含むことが必須であると考える。
【００４３】
そして、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）があるので、本発明の抗体の免疫原のうち、前記アミノ酸配列に由来する免疫原の最小単位としては、「Pro Lys Lys」、「Asp Pro Lys」又は「Lys Lys Pro」を規定（考える）することができる。そして更に、これらのトリペプチドに他のアミノ酸、又はペプチドが付加したものを、本発明の抗体の免疫原として考えることができる。
【００４４】
なお、前記の本発明の抗体を産生させるための免疫原としての、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチドは、以下のいずれかの条件を満たすものである。
（Ａ）当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を得ることができるペプチド、又は、
（Ｂ）「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製された抗体と結合することができるペプチド。
【００４５】
なお、前記（１）の[2]の方法に従う場合、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原とすることもできる。
【００４６】
前記の免疫原としての、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチド、又はＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質は、ヒト又は他の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製し、取得することができる。
【００４７】
なお、ＨＭＧ−１又はＨＭＧ−２のヒト胸腺、ブタ胸腺、ウシ胸腺、ヒト胎盤、好中球、ＨＬ−６０細胞株等からの取得の方法は、以下の文献等に記載されている（Ｈ．Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，４０５巻，２８０〜２９１頁，１９７５年発行；Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５巻，１１７〜１２４頁，１９８０年発行；Ｙ．Ａｄａｃｈｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，５３０巻，３９〜４６巻，１９９２年発行）。
【００４８】
そして、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の混合物が、和光純薬工業社より販売されているので、これよりウシＨＭＧ−１のみを精製し取得することもできる。
【００４９】
また、前記の各々の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学IV」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００５０】
更に、前記の各々の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学講座１ 遺伝子研究法II」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法III」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００５１】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００５２】
なお、抗体を産生させる際に担体を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００５３】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００５４】
（３）抗体の取得方法
[1]ポリクローナル抗体、抗血清
本発明の抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により取得することができる。
【００５５】
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を哺乳動物(マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ等)又は鳥類(ニワトリ等)等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウス一匹当り一回につき０．１μｇ〜数ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。また、ウサギの場合はウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
【００５６】
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
【００５７】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００５８】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本発明の抗体を含む抗血清を得る。
【００５９】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
【００６０】
ここで得られたポリクローナル抗体は、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体と、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体の両方よりなるものであるので、更に、これをＨＭＧ−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させる。ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧ−２）を介して固相に結合し、捕集される。これに対して、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧ−２）に結合することなく、このカラムを素通りするので、素通りした画分を得ることにより、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体を取得することができる。
【００６１】
なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【００６２】
[2]モノクローナル抗体
本発明の抗体において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【００６３】
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００６４】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
【００６５】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００６６】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００６７】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
【００６８】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
【００６９】
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００７０】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又はヒトＨＭＧ−１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧ−１等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００７１】
また、前記のハイブリドーマの培養上清を、ヒトＨＭＧ−２等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧ−２等には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００７２】
この２種類のハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明の抗体（モノクローナル抗体）、即ちヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００７３】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
【００７４】
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることもできる。
【００７５】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。
【００７６】
２．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法
（１）総論
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法（以下「本発明の免疫学的測定方法」又は「本発明の測定方法」ということがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴とするものである。
【００７７】
即ち、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴とする測定方法である。これにより、本発明の測定方法では、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができるのである。
【００７８】
この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、このような性質を有するものであれば特に制限なく使用することができ、前記の効果を得ることができる。
【００７９】
なお、ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として２つの抗体を使用する免疫学的測定法においては、その２つの抗体のうち少なくとも１つが、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよい。そして、他方は「ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体」であれば如何なるものでもよい。また、両方の抗体とも、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であってもよい。
【００８０】
例えば、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれか一方又は両方が、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよい。
【００８１】
この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
なお、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」の詳細については、前記の「１．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」の項に記載したとおりである。
【００８２】
（２）免疫学的測定方法
本発明の測定方法は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用するものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００８３】
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００８４】
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方法を適用することができる。
また、本発明の測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００８５】
（３）測定試料
本発明の測定方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織もしくは細胞などの抽出液等、ＨＭＧ−１が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００８６】
（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、固相化抗体及び標識抗体のいずれか一方の抗体が「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよく、また固相化抗体及び標識抗体の両方が「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であってもよい。
【００８７】
前記測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００８８】
固相化抗体は、本発明の抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００８９】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００９０】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００９１】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００９２】
本発明の抗体等の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００９３】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００９４】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１＝標識抗体」の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたＨＭＧ−１の量（濃度）のみを測定することができる。
【００９５】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００９６】
（５）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明の測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００９７】
本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
【００９８】
本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００９９】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【０１００】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１０１】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ＨＭＧ−１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０１０２】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のＨＭＧ−１の濃度、本発明の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０１０３】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された「本発明の抗体」と試料中に含まれていた「ＨＭＧ−１」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【０１０４】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０１０５】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０１０６】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１０７】
３．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬
（１）総論
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬（以下「本発明の免疫学的測定試薬」又は「本発明の測定試薬」ということがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測定試薬において、前述した本発明の抗体を使用することを特徴とするものであり、前述した本発明の測定方法に使用することができるものである。従って、本発明の測定試薬に使用する抗体、測定原理等については、前述した本発明の測定方法と同様である。
【０１０８】
（２）その他の試薬成分
本発明の測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１０９】
また、本発明の測定試薬には、前記の本発明の抗体などの抗体を固相化した固相担体、前記の本発明の抗体などの抗体を感作した固相担体、及び／又は前記の本発明の抗体などの抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１１０】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油もしくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１１】
（３）測定試薬の構成
本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のＨＭＧ−１の測定に使用することができる。そして、そのもの単独にて、販売することができる。また、本発明の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のＨＭＧ−１の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕（ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列における、親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いアミノ酸配列の選択）
親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いアミノ酸配列を、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列より選択した。
【０１１３】
（１） ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列は、前記のウエンらのデータの通りである。〔Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行〕
【０１１４】
（２） このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を、前記のホップらの方法〔Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻，３８２４〜３８２８頁，１９８１年発行〕により行った。この結果は、前記の図１の通りである。
【０１１５】
（３） 次に、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列のうち親水性の高い配列を、ヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列〔Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１９９２年発行〕と比較した。そして、この親水性の高いアミノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択した。
【０１１６】
（４） ここで本発明者らが選択したアミノ酸配列の第１番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミノ酸残基（グリシン）より１１番目のアミノ酸残基（リシン）までの、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」である。なお、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」は、これに相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」と、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基が異なっている。〔ヒトＨＭＧ−１では「Lys」であり、これに対してヒトＨＭＧ−２では「Asn」である。〕
【０１１７】
（５） 次に、本発明者らが選択したアミノ酸配列の第２番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端から８７番目のアミノ酸残基（リシン）より１００番目のアミノ酸残基（アラニン）までの、「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」である。なお、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」は、これに相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」と、Ｎ末端から８８番目のアミノ酸残基が異なっている。〔ヒトＨＭＧ−１では「Phe」であり、これに対してヒトＨＭＧ−２では「Lys」である。〕
【０１１８】
〔実施例２〕（ペプチドの合成）
実施例１で選択した２種類のアミノ酸配列の各々のＮ末端に、担体に結合させるためにシステインを結合させたアミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」及び「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」のペプチドをそれぞれ合成した。
【０１１９】
まず、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル４３０Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法でアミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」のペプチドの合成を行った。
【０１２０】
副反応を抑制するためにスカベンジャーとして、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾール、ｍ−クレゾール及びアニソールの存在下でフッ化水素法により樹脂から合成したペプチドの脱離を行った。
その後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行った。
【０１２１】
陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−Ｘ２（ＤＯＷＥＸ １−Ｘ２）により陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行った。
【０１２２】
そして、エバポレーターにより凍結乾燥をして濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取した。なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速７．０ｍＬ／分で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
【０１２３】
ここで精製分取した合成ペプチドをエバポレーターで凍結乾燥して濃縮した。
得られた合成ペプチドの純度をＨＰＬＣで分析した。装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｒ−ＯＤＳ−５（４．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速１．０ｍＬ／分、２５分間で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。これより得られた合成ペプチドの純度がほぼ１００％であることが分かった。
【０１２４】
また、前記と同様にして、アミノ酸配列「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」のペプチドの合成を行った。そして、得られた合成ペプチドの純度を前記と同様にＨＰＬＣで分析したところ、これも純度はほぼ１００％であることが分かった。
【０１２５】
〔実施例３〕（免疫原の調製）
担体であるスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）〔カルビオケム社製〕又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔生化学工業社製〕の１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解している２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社製〕溶液１５０μＬを加え室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
【０１２６】
これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたゲル濾過カラムであるセファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）カラム〔ファルマシア−エルケービー社製〕にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結合成分を分取した。
【０１２７】
このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例２で合成したペプチド「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を添加混合して１５０分間反応させた。
【０１２８】
反応後、水に対して３回透析した後、凍結乾燥を行って前記ペプチドと結合した担体よりなる免疫原を得た。
また、実施例２で合成したペプチド「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」についても、前記の通り操作を行って、前記ペプチドと結合した担体よりなる免疫原を得た。
【０１２９】
〔実施例４〕（モノクローナル抗体の調製）
実施例３で調製した免疫原を用いてモノクローナル抗体の調製を下記のようにして行った。
〔１〕 動物への免疫
（１） 実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）を１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。
【０１３０】
（２） 初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を５０μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【０１３１】
（３） 免疫動物であるこのマウスの血清中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。
[1] 実施例３で得た「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドに担体としてＢＳＡを結合させた免疫原を５μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置してこの免疫原の固相化を行った。
[2] このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
[3] このマイクロプレートのウェルに、抗体の産生を検査すべき前記マウスの血清を試料として１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
[4] また対照として、前記[2]のマイクロプレートのウェルに、ＨＡＴ培地を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、その後洗浄液で洗浄した。
[5] パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で２，０００倍に希釈した後、[3]及び[4]のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
[6] これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
[7] これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１３２】
（４） 初回免疫から１８週間目以降、抗体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で８００μｇ／ｍＬとした実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）の０．５ｍＬを注射した。その後３日目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【０１３３】
以上の（１）〜（４）の操作を、もう一方の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）についても同様に行い、免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【０１３４】
〔２〕 骨髄腫細胞の増殖
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（バイオセル社製）で増殖を行った。
【０１３５】
これは、この骨髄腫細胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び血球計で計数を行った。
【０１３６】
〔３〕 細胞融合
（１） 前記〔１〕で免疫動物のマウスより取得した脾臓を、ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分にほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離を行い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。
【０１３７】
（２） この脾臓細胞と前記の増殖させたＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した後、遠心分離を行った。混合した細胞を、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ・ダイアグノスティック社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液にゆっくりと懸濁した。そして、最終的にポリエチレングリコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈した。
【０１３８】
（３） これより細胞を遠心分離で分離し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オリゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平底の９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）のウェルに、１ウェル当り１０６個／１００μＬの細胞数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養した。
【０１３９】
（４） 細胞融合後１日目に、各ウェルに１００μＬのＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテリンとなるようにそれぞれを補充したもの、いずれも東京化成社製）を加えた。その後３日間は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後は、２〜３日ごとに同様の交換を行った。
【０１４０】
（５） 細胞は、顕微鏡で観察を行った。ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以降より出現し、１４日以降に「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で示されるアミノ酸配列を認識する抗体の産生を検査するため、ウェルの上澄み液をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
【０１４１】
（６） 前記（５）のスクリーニングにおいて、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を認識する抗体を産生していることが判明したウェルのハイブリドーマを、２４穴のウェルがあるプレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養した。
【０１４２】
（７） そして、ハイブリドーマはＨＴ培地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングファクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。
【０１４３】
（８） アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を認識する抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により前記（５）と同様にして調べたところ、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを３個確認した。
【０１４４】
以上の（１）〜（８）の操作を、もう一方の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）を免疫して得た前記のマウス脾臓についても同様に行い、アミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」を含む「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを６個確認した。
【０１４５】
〔４〕 ハイブリドーマサブクローニング
（Ａ） 免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合
（１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する前記ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にてサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行った。
そして、これらのハイブリドーマを、１００μＬのＨＴ培地当り、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロプレートの１ウェル当り１００μＬずつ分注した。これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増殖させた。
【０１４６】
（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルのコロニー数を調べ、そして、「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマについて前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べた。１ウェル中に１コロニーが存在し、そしてこのような抗体を産生するハイブリドーマ（ウェル）を２個得ることができた。
【０１４７】
（３） これを、２４穴のプレートに移し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。
【０１４８】
（４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替えることと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この結果、前記のハイブリドーマのうち、１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体を産生する細胞株であることが判明した。
【０１４９】
（５） このハイブリドーマを、再度、前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そして、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを１個得た。
【０１５０】
（６） このハイブリドーマのクローンが産生する抗体の前記ヒトＨＭＧ−１との反応性を、再度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。この検討の結果、このハイブリドーマのクローンが産生する抗体（モノクローナル抗体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが確かめられた。
【０１５１】
（７） 次に、このハイブリドーマが産生する抗体の、参考例３で調製したウシＨＭＧ−１、ウシＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例３で調製したウシＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替えることと、試料をこのハイブリドーマ（このウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
【０１５２】
この検討の結果、このハイブリドーマが産生する抗体は、ウシＨＭＧ−１には結合するが、ウシＨＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。
なお、免疫原のペプチドのアミノ酸配列として採用したＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」、及びこの配列に対応するＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列である。
【０１５３】
従って、以上のことより、このハイブリドーマが産生する抗体（モノクローナル抗体）が、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）であることが明らかになった。
【０１５４】
このハイブリドーマは、ＭＤ７７と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−１８４０４として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。
【０１５５】
（Ｂ） 免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合
（１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する前記ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にてサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行った。
【０１５６】
そして、これらのハイブリドーマを、１００μＬのＨＴ培地当り、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロプレートの１ウェル当り１００μＬずつ分注した。これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増殖させた。
【０１５７】
（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルのコロニー数を調べ、そして、「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマについて前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べた。１ウェル中に１コロニーが存在し、そしてこのような抗体を産生するハイブリドーマ（ウェル）を４個得ることができた。
【０１５８】
（３） これを、２４穴のプレートに移し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。
【０１５９】
（４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替えることと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この結果、前記のハイブリドーマのうち、１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体を産生する細胞株であることが判明した。
【０１６０】
（５） このハイブリドーマを、再度、前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そして、アミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」を含む「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを２個得た。
【０１６１】
（６） これらの２個のハイブリドーマのクローンが産生する各々の抗体の前記ヒトＨＭＧ−１との反応性を、再度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。この検討の結果、これらの２個のハイブリドーマのクローンが産生する各々の抗体（モノクローナル抗体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが確かめられた。
【０１６２】
（７） 次に、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体の、参考例３で調製したウシＨＭＧ−１、ウシＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例３で調製したウシＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替えることと、試料をこれらのハイブリドーマ（このウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この検討の結果、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体は、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の両方に結合することが確かめられた。
【０１６３】
なお、免疫原のペプチドのアミノ酸配列として採用したＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」、及びこの配列に対応するＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列である。
【０１６４】
従って、以上のことより、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体（モノクローナル抗体）が、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが明らかになった。
【０１６５】
これらのハイブリドーマは、ＭＤ７８と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８４０５として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。
【０１６６】
〔５〕 モノクローナル抗体の産生
（１） 前記〔４〕で得た各々のモノクローナル抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）を、それぞれ中型ボトル（ヌンク社製）の中に１つずつ入れ、底面の約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地中で培養を行った。
（２） その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。次に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁した。
（３） 前もって、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射した。注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかった場合には、再度これを繰り返し行った。
（４） このマウスの腹部の膨張が認められた時に腹水を採取した。これを２００ｇ、５分間の遠心分離にかけ、ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体を含む上澄み液を、ハイブリドーマから分離して取得した。
【０１６７】
〔６〕 モノクローナル抗体の精製
（１） 前記〔５〕で得た、ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体を含む上澄み液の各々の１０ｍＬに、２２℃で硫酸ナトリウム１．８ｇを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に１時間撹拌を続けて塩析を行った。
（２） これを２２℃で遠心分離（７０００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。
（３） 次に、これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のものを除去した。
（４） これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１０ｃｍ〕に流速０．４ｍＬ／分で通して、溶出液を２ｍＬずつ集めた。
（５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。
（６） 更に、これをプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製を行い、精製したモノクローナル抗体を得た。
【０１６８】
なお、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の得られた量は、タンパク質量として０．５ｍｇであった。
【０１６９】
また、免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）の得られた量は、タンパク質量として０．４ｍｇであった。
【０１７０】
〔実施例５〕（パーオキシダーゼ標識抗体の調製）
実施例４で得たヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを標識化して、パーオキシダーゼ標識抗体を調製した。
（１）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入
パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加して、３０℃で６０分間反応させた。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。以上の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド基を導入した。
【０１７１】
（２）抗体へのチオール基の導入
実施例４で得た、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加して、室温で３０分間反応させた。
【０１７２】
その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で５分間放置した。
【０１７３】
次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。
以上の操作により、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）に、チオール基を導入した。
【０１７４】
（３）標識抗体の調製
前記（１）で調製したマレイミド基を導入したパーオキシダーゼ及び前記（２）で調製したチオール基を導入した抗体を一対一で混合し、３０℃で２０時間反応させて、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を行った。その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４のカラムに通し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このゲル濾過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。このパーオキシダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、パーオキシダーゼが結合した抗体、即ちパーオキシダーゼ標識抗体を得た。そして、このパーオキシダーゼ標識抗体を含む溶液のタンパク質濃度を測定した。
【０１７５】
〔実施例６〕（マイクロプレート固相化抗体）
実施例４で得たヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートに固相化して、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
（１） 実施例４で得た、免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍＬとした後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固相化した。
（２） この抗体が固相化されたマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１７６】
以上の操作により、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１７７】
〔実施例７〕（ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を使用するヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法）
実施例５で調製したパーオキシダーゼ標識抗体及び実施例６で調製したマイクロプレート固相化抗体を免疫学的測定試薬として使用し、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１及び参考例３で調製したウシＨＭＧ−１の酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定を行った。そして、この免疫学的測定方法における検量線を作成した。
【０１７８】
１．測定試薬
[1] パーオキシダーゼ標識抗体
実施例５で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを結合させたパーオキシダーゼ標識抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用した。
[2] マイクロプレート固相化抗体
実施例６で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートの各ウェルに固相化したマイクロプレート固相化抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用した。
[3] 洗浄液
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とした。
[4] パーオキシダーゼ基質液
３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したものを調製して、標識としたパーオキシダーゼの基質、即ちパーオキシダーゼ基質液とした。
[5] 反応停止液
６Ｎ硫酸水溶液を調製して、反応停止液とした。
【０１７９】
２．試料
[1] ヒトＨＭＧ−１を含む試料
参考例２において調製したヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後の前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。そして、この前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、前記ヒトＨＭＧ−１濃度が、３６０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ又は１，０８０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
[2] ウシＨＭＧ−１を含む試料
参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。そして、このウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
[3] ０ｎｇ／ｍＬの試料
前記の０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を、ヒトＨＭＧ−１濃度及びウシＨＭＧ−１濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
【０１８０】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
[1] 前記２で調製した、３種類の前記ヒトＨＭＧ−１を含む試料、４種類の前記ウシＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ、生理食塩水で２倍に希釈した。
[2] 前記[1]で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
[3] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[4] 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。次にこれを、前記[3]の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
[5] その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[6] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
[7] 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の反応停止液を、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
[8] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により測定した。
[9] 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値、即ち検量線を図に示した。前記のヒトＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線を、図２に示した。また、前記のウシＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線を、図３に示した。
【０１８１】
なお、これらの図において、横軸は試料中に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１又は前記ウシＨＭＧ−１の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０１８２】
４．まとめ
図２より、前記ヒトＨＭＧ−１を含む試料においては、含まれる前記ヒトＨＭＧ−１濃度に比例して得られる吸光度が増加しており、試料に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１濃度に比例した測定値を得ることができることが分かった。
よって、本発明の測定試薬及び測定方法により、試料中に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１を正確に測定することができることが確かめられた。
【０１８３】
図３より、前記ウシＨＭＧ−１を含む試料においては、含まれる前記ウシＨＭＧ−１濃度に比例して得られる吸光度が増加しており、試料に含まれる前記ウシＨＭＧ−１濃度に比例した測定値を得ることができることが分かった。
【０１８４】
〔実施例８〕（本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法による血清試料の測定）
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法について、血清試料に含まれるＨＭＧ−１を測定して、血清試料の測定時の正確性を確かめた。
【０１８５】
１．測定試薬
実施例７の「１．測定試薬」の「[1] パーオキシダーゼ標識抗体」、「[2] マイクロプレート固相化抗体」、「[3] 洗浄液」、「[4] パーオキシダーゼ基質液」及び「[5] 反応停止液」をそれぞれ使用した。
【０１８６】
２．試料
[1] 参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。
【０１８７】
そして、このウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃度が、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ又は４００ｎｇ／ｍＬの溶液をそれぞれ調製した。
【０１８８】
[2] 前記[1]で調製した３種類の溶液をそれぞれ生理食塩水で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ−１濃度が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬの血清を含まない試料をそれぞれ調製した。
[3] また、前記[1]で調製した３種類の溶液をそれぞれヒト血清で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ−１濃度が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬの血清試料をそれぞれ調製した。
【０１８９】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
[1] 前記２で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
[2] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[3] 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。次にこれを、前記[2]の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
[4] その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[5] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
[6] 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の反応停止液を前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
[7] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により測定した。
[8] 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値を表に示した。なお、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０１９０】
【表１】
【０１９１】
４．まとめ
前記の表より、各々のウシＨＭＧ−１濃度において、生理食塩水で希釈した血清を含まない試料の測定値（吸光度）と、ヒト血清で希釈した血清試料の測定値（吸光度）は、ほとんど同じであることが分かる。
【０１９２】
血清は種々の成分を含み複雑な組成のものであるが、本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、このような血清又は血清を含む試料においても、ＨＭＧ−１の濃度を正確に測定することができるものであることが確かめられた。
【０１９３】
なお、先に述べたように、前記測定を行った本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に使用した抗体はいずれも、ヒトとウシとで全くアミノ酸配列が同一な箇所を免疫原に使用して作成したものであり、そして、実施例７において本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、前記ヒトＨＭＧ−１も前記ウシＨＭＧ−１も正確に測定できることが確かめられているので、例え、試料としてウシＨＭＧ−１の代わりにヒトＨＭＧ−１を血清で希釈したものを用いたとしても、同じ結果が得られることは明白である。
【０１９４】
〔実施例９〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性の確認）
実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）、及び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）のそれぞれについて、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各々との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０１９５】
１．ウエスタンブロット法
（１）ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）
[1] ヒト血清を、タイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、これに前記のヒト血清の２μＬを接触させた。
[2] そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。
[3] 前記[2]の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
【０１９６】
まず、前記[2]において電気泳動を行ったアガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。
[4] この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
[5] 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[6] 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解し、この溶液に前記[5]の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[7] 前記[6]の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
[8] 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、これに前記[7]のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[9] このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記[9]のニトロセルロース膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
【０１９７】
以上の操作により、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０１９８】
（２）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）
前記（１）の[6]における「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）」を、「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）」に変えること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０１９９】
（３）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクローナル抗体）
前記（１）の[6]における「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）」を、「参考例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）」に変えること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、参考例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０２００】
２．実験結果
（１）ウエスタンブロット法の結果
前記１の（１）、（２）及び（３）におけるウエスタンブロット法の結果を図４に示した。
なお、この図において、「ＭＡ１」はヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）における結果であり、「ＭＡ２」はヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）における結果であり、「ＰＡ」はヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクローナル抗体）における結果である。
【０２０１】
そして、この図において、「１」のバンドはヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−１によるバンドであり、「２」のバンドはヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−２によるバンドである。
〔これは、別途、ヒト血清の替わりに、精製して得たウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２をそれぞれ電気泳動して、ウエスタンブロット法を行い、得られたバンドの位置より確かめておいた。（ヒトＨＭＧ−１とウシＨＭＧ−１、そしてヒトＨＭＧ−２とウシＨＭＧ−２のアミノ酸配列の相同性は、それぞれ非常に高いので、電気泳動においてほぼ同じ位置に泳動される。）〕
【０２０２】
（２）対照（コントロール）
前記１の（１）、（２）及び（３）における（１）の[5]の操作までを行ったもう一枚の各ニトロセルロース膜について、前記（１）の[6]の操作は行わず、しかし前記（１）の[7]以下の操作は同様に行って、これを対照（コントロール）とした。
【０２０３】
この、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体も、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をも作用させていない対照（コントロール）においては、ヒトＨＭＧ−１のバンドが現れる位置及びヒトＨＭＧ−２のバンドが現れる位置のいずれにおいても何ら発色は認められなかった。
このことより、前記の各ウエスタンブロット法においては、非特異的な発色が起きていないことが確かめられた。
【０２０４】
３．まとめ
図４より、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）、及び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）では、ヒトＨＭＧ−１が泳動される位置とヒトＨＭＧ−２が泳動される位置の両方において発色が見られることが分かる。
このことより、ヒト血清中には、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方が存在することが確かめられた。
【０２０５】
そして、前記のヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）とヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）は、確かにヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の両方に結合することが、このウエスタンブロット法の結果より確認できた。
【０２０６】
また、図４より、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）では、ヒトＨＭＧ−１が泳動される位置には発色が見られるものの、ヒトＨＭＧ−２が泳動される位置には発色が見られないことが分かる。
【０２０７】
このことより、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体は、確かにヒトＨＭＧ−１には結合するものの、ヒトＨＭＧ−２には結合しないことが、このウエスタンブロット法の結果より確認できた。
【０２０８】
〔参考例１〕（ヒトＨＭＧ−１遺伝子の調製）
ヒトＨＭＧ−１をヒト脳ｃＤＮＡからＤＮＡ増幅を行いクローン化した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで修飾し、シークエンス・ベクターのｐＣＡＬ−ｎベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化し、ＤＮＡ配列の確認を行った。
【０２０９】
〔参考例２〕（ＤＮＡ組換え法によるヒトＨＭＧ−１の調製）
このＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIで修飾されたＰＣＲ産物をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させるために、ｐＥＸ発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化した。
【０２１０】
次に、このリコンビナントプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１に、トランスフォームした。
トランスフォームされた細胞を１Ｌ程で培養を行った後、ＩＰＴＧの誘導をかけ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１で発現させた。
【０２１１】
この発現させたＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１を集菌後、３０ｍＬ程度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム及び５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）〕に分散させた。
【０２１２】
そして、これを超音波処理により破砕し、遠心分離後、上澄み液を回収した。
この上澄み液中に含まれるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質をグルタチオン・カラム（ファルマシア社）により精製した。
【０２１３】
次に、この精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質から、第Ｘａ因子を作用させて、ヒトＨＭＧ−１を切り出した。
以上のＤＮＡ組換え操作により、ヒトＨＭＧ−１を取得、調製した。
【０２１４】
〔参考例３〕（ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の調製）
ウシの胸腺より、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２をサンダースらの方法〔Ｃ．Ｓａｎｄｅｒｓら，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，７８巻，１０３４〜１０４２頁，１９７７年発行〕に従って調製した。
[1] まず、ウシの胸腺５００ｇを、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む６００ｍＬの緩衝液中で破砕を行った。
[2] 次に、この破砕物を遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。
[3] これに、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液を加えて撹拌した後、遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。この洗浄操作を２回繰り返して行った。
[4] 次に、得られた沈殿物に、０．７５Ｍの過塩素酸の３００ｍＬを加えた。そして、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。残った沈殿物に０．７５Ｍの過塩素酸の４００ｍＬを加えた。これについても、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。この上澄み液と先に分取した上澄み液とを合わせた。なお、沈殿物は廃棄した。
[5] 前記の合わせた上澄み液に０．７５Ｍの過塩素酸を加えて、全体の容量を１，０００ｍＬとした。次に、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液をグラスフィルター（グレード４）で濾過した。
[6] 前記の濾過の濾液に、３，５００ｍＬのアセトンと２１ｍＬの濃塩酸の混合液を加えた。濁りが生じてくるので、遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分取した。この上澄み液に、アセトン２，５００ｍＬを加えた。そして、再度、濁りが生じてくるので、これを遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分離し、残った沈殿物を集めた。
[7] この集めた沈殿物を室温で自然乾燥させた。
【０２１５】
以上の操作により、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を含むタンパク質画分が、およそ２００ｍｇ得られた。
[8] 前記のＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を含むタンパク質画分を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍＬに溶解した後、この２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で充分に透析を行った。
[9] この透析の後、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに添加した。
【０２１６】
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
この溶出パターンを図５に示した。なお、この図において、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は溶出画分の番号を示す。
【０２１７】
[10] そして、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、その易動度より、図５において「Ａ」で示した溶出画分及び「Ｂ」で示した溶出画分はウシＨＭＧ−１を含む画分であり、更に「Ｃ」で示した溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分はウシＨＭＧ−２を含む画分であることが確かめられた。
【０２１８】
よって、図５において「Ａ」で示した溶出画分及び「Ｂ」で示した溶出画分を混合して集め、更に「Ｃ」で示した溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分を混合して集めた。
【０２１９】
〔参考例４〕（ポリクローナル抗体の調製）
参考例３で調製したウシＨＭＧ−１を用いてポリクローナル抗体の調製を下記のようにして行った。
〔１〕 動物への免疫
（１） 前記の参考例３で得たウシＨＭＧ−１を４００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、ウサギ（北山ラベス社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。
【０２２０】
（２） 初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を３００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【０２２１】
（３） 免疫動物であるこのウサギの血清中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。
[1] 参考例３で得たウシＨＭＧ−１を５μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置してこのウシＨＭＧ−１の固相化を行った。
[2] このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
[3] 抗体の産生を検査すべき前記ウサギの血清を、生理食塩水で１，０００倍、１０，０００倍、そして１００，０００倍と希釈し、これらをマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
[4] また対照として、前記[2]のマイクロプレートのウェルに、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、その後洗浄液で洗浄した。
[5] パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、[3]及び[4]のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
[6] これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
[7] これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０２２２】
（４） 初回免疫から１２週間目以降、抗体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物であるウサギの全採血を行った。そして、このウサギの血液より抗血清を得た。
（５） 前記（４）で得た抗血清について、２２〜２５℃において、この抗血清１ｍＬに対して０．１８ｇの比率で硫酸ナトリウムを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に３０分間撹拌を続けて塩析を行った。
（６） これを２２〜２５℃で、遠心分離（７０００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿をリン酸緩衝生理食塩水の１ｍＬに溶解した。
（７） 次に、これをリン酸緩衝生理食塩水に対して充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のものを除去した。
（８） これをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×２．５ｃｍ〕に通して、溶出液を集めた。
（９） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて濃縮した。
【０２２３】
（１０） 次に、これを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１を固定化したカラムに通して、アフィニティークロマトグラフィーを行った。この操作を以下に示した。
[1] 参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１の２ｍｇに対して１ｇのＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシアバイオテック社製）をその取扱説明書に従って反応させ、前記のＨＭＧ−１を固定化したアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを調製した。
[2] このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておき、その後、前記（９）にて濃縮した成分（ポリクローナル抗体）を通した。
[3] これにリン酸緩衝生理食塩水を充分に通して洗浄した後、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通した。
[4] これにより溶出した画分を集め、リン酸緩衝生理食塩水で透析を行い、その後、濃縮を行った。
【０２２４】
以上のアフィニティークロマトグラフィーの操作により、ヒトＨＭＧ−１に結合するポリクローナル抗体を分取した。
【０２２５】
（１１） 以上の操作により得られたウサギのポリクローナル抗体は、ヒトＨＭＧ−１に結合することができるものである。また、ヒトＨＭＧ−１と相同性の高いヒトＨＭＧ−２とも結合することができるものである。
【０２２６】
〔実施例１０〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性の確認）
実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）について、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各々との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０２２７】
なお、前記実施例９においては、ヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と各抗体との反応性を確かめたが、本実施例においては、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と前記抗体との反応性の確認を行った。
【０２２８】
１．ウエスタンブロット法
（１）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
[1] 後述する参考例５においてヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２をタイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、これに前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を各々０．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）の２μＬを接触させた。
[2] そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。
[3] 前記[2]の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
【０２２９】
まず、前記[2]において電気泳動を行ったアガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。
【０２３０】
[4] この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
[5] 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[6] 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解し、この溶液に前記[5]の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[7] 前記[6]の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
[8] 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、これに前記[7]のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[9] このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記[9]のニトロセルロース膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
【０２３１】
以上の操作により、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性に関するウエスタンブロット法の結果を得た。
【０２３２】
（２）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
参考として、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）に替えて、市販のヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）〔品名：Ａｎｔｉ ＨＭＧ−２（Ｃ−１９），Human、品番：SC-8758、メーカー：サンタクルズ社（米国）、販売：コスモ・バイオ社〕を前記（１）の[6]において用いること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、バンドを得て、本ウエスタンブロット法におけるヒトＨＭＧ−２のバンドの位置の確認に用いた。
【０２３３】
（３）ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
参考として、前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に替えて、参考例３においてウシ胸腺より調製したウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の等量混合液を用いること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、バンドを得て、本ウエスタンブロット法におけるウシＨＭＧ−１のバンドの位置の確認に用いた。
【０２３４】
２．実験結果
（１）ウエスタンブロット法の結果
前記１におけるウエスタンブロット法の結果を図６に示した。
なお、この図において、「Ｈ[1]」のレーンは前記１の（１）のウエスタンブロット法のレーンであり、「Ｈ[2]」のレーンは前記１の（２）のウエスタンブロット法のレーンであり、そして、「Ｂ[1]」のレーンは前記１の（３）のウエスタンブロット法のレーンである。
【０２３５】
この図６より、以下のことが分かる。
・ 「Ｈ[1]」のレーンにおいては、ただ一本のバンドだけが認められる。
・ 「Ｈ[1]」のレーンにおいては、「Ｈ[2]」のレーンにおけるバンドの位置にはバンドが認められない。
・ 「Ｈ[1]」のレーンと「Ｂ[1]」のレーンは、同じ位置にバンドが認められる。
【０２３６】
すなわち、
[1] ヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を反応させた「Ｈ[2]」のレーンのバンドの位置に、「Ｈ[1]」のレーンではバンドが認められないことが分かる。
[2] ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を泳動させた「Ｈ[1]」のレーンにおいて、ただ一本のバンドだけが認められ、そのバンドの位置が、ヒトＨＭＧ−１と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−２を泳動させた「Ｂ[1]」のレーンの唯一のバンドの位置と同じであることが分かる。
【０２３７】
以上のことより、実施例４で調製された抗体（モノクローナル抗体）は、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１に結合し、かつ、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。
【０２３８】
（２）対照（コントロール）
前記１の（１）の[5]の操作までを行ったもう一枚のニトロセルロース膜について、前記[6]の操作は行わず、しかし前記[7]以下の操作は同様に行って、これを対照（コントロール）とした。
前記１の（２）及び（３）においても、同様に対照（コントロール）を作成した。
【０２３９】
これらのいずれの抗体も作用させていない対照（コントロール）においては、何ら発色は認められなかった。
このことより、前記の各ウエスタンブロット法においては、非特異的な発色が起きていないことが確かめられた。
【０２４０】
〔参考例５〕（ヒト細胞よりのヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の調製）
ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を調製した。
[1] まず、ＲＰＭＩ１６４０にて培養したヒト細胞（ＨＬ６０細胞）の培養液の上清の３Ｌを、約２５０ｍＬに濃縮した。
[2] 次に、終濃度が２００ｍＭとなるように、塩化ナトリウムを添加した。
[3] これを遠心分離機で遠心分離を行い（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）、その上清を分取して、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過を行った。
[4] この濾液を、ハイトラップ・ヘパリン・カラム（アマシャムファルマシア社製）に通した。
[5] このカラムに、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を流して洗った。
[6] 次に、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）において、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭから２，０００ｍＭまでのグラジエントをかけて前記カラムより溶出させた。
[7] 前記の各溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を同定した。この画分は、塩化ナトリウム濃度が５００ｍＭから１，０００ｍＭにあるときに溶出した画分であった。
[8] 前記[7]のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに通した。
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
[9] ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１を含む画分、及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を各々同定した。
以上の操作により、ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１を調製し、また、ヒトＨＭＧ−２をも調製した
【配列表フリーテキスト】
【０２４１】
配列番号１：ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド
配列番号２：ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全てについて、ホップらの方法により、各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を行った結果を示した図である。
【図２】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定方法により、ヒトＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成した検量線を示した図である。
【図３】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定方法により、ウシＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成した検量線を示した図である。
【図４】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果を示した図である。
【図５】ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の調製における陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示した図である。
【図６】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に特異的に結合する抗体、並びにこの抗体を使用するヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００３】
ハイモビリティーグループプロテイン（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（以下「ＨＭＧ」と略すことがある。）は、クロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧはＤＮＡと結合する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
【０００４】
ＨＭＧには、いくつかの種類が存在する。例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧ−１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧ−２）、ハイモビリティーグループプロテイン−３（ＨＭＧ−３）、ハイモビリティーグループプロテイン−８（ＨＭＧ−８）、ハイモビリティーグループプロテイン−１７（ＨＭＧ−１７）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｙ（ＨＭＧ−Ｙ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン Ｉ−Ｃ（ＨＭＧ Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
【０００５】
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ウシのＨＭＧ−１の相同性は９８．６％であり、ブタのＨＭＧ−１の相同性は９９．１％であった。また、同様に、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ヒトのＨＭＧ−２の相同性は８１．２％であり、ウシのＨＭＧ−２の相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧ−２の相同性は７９．４％であった。
【０００６】
ワングらは１９９９年に、ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧ−１の定量測定を行った。その結果、ワングらは、ＨＭＧ−１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧ−１を測定することによって可能であることを示した。即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧ−１の存在を確認するだけではなく、精密に定量することの有用性が明らかにされた（Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行）。
【０００７】
なお、先に、ＨＭＧ−１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧ−１に結合する抗体については、パーキネンらや、レップらによって調製可能なことが示されていた（Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行；Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行）。この抗体を用いてレップらはＨＭＧ−１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。（なお、この固相酵素免疫測定法は、精製したＨＭＧ−１をマイクロプレート（マイクロタイタープレート）のウェルに固相化し、これに酵素標識したＨＭＧ−１に結合する抗体を接触させ、作用させて、ＨＭＧ−１に結合する抗体が精製したＨＭＧ−１に結合することを確かめたものである。）
しかしながら、これらの抗体は、ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体であるので、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１と相同性の高い(８１．２％)、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【０００８】
即ち、レップら又はワングらが示したＨＭＧ−１の測定方法は、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２をも測り込んでしまう測定方法であった。
【０００９】
また、ルーヒアイネンらは２０００年に、遺伝子工学によって組換えＤＮＡより調製したラットのＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体と、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を各々使用して、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法により、ヒト血液中のＨＭＧ−１を測定した（Ａ．Ｒｏｕｈｉａｉｎｅｎら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，８４巻，１０８７〜１０９４頁，２０００年発行）。
【００１０】
しかしながら、ここで使用されたラットのＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体は、前記した理由により、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【００１１】
また、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体は、免疫原とした前記のペプチドのアミノ酸配列が、ＨＭＧ−２のアミノ酸配列の一部を含むこと、及びポリクローナル抗体であることより、やはりＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。
【００１２】
よって、ルーヒアイネンらが開示した測定方法は、これも、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２をも測り込んでしまう測定方法であった。
【００１３】
従って、今までは、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体は、知られておらず存在しなかった。
【００１４】
それゆえ、前記のワングらのウエスタンブロット法での測定方法以外に、ＨＭＧ−２を測り込むことなしにＨＭＧ−１のみを測ることができる測定方法は存在しなかった。（なお、このウエスタンブロット法は、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２等を電気泳動し、この担体又はこれを転写した担体に、抗体を接触させ、結合させて、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２と抗体との結合を確かめるものである。よって、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２の泳動位置（分子量の違いによる易動度）は異なるので、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２を分別することができる。）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述したように、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体は、知られておらず存在しなかった。このため、前記のワングらのウエスタンブロット法での方法を除くと、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるＨＭＧ−１だけを測ることができ、ＨＭＧ−２を測り込むことのない免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬は存在しなかった。即ち、ウエスタンブロット法以外の免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬では、試料中のＨＭＧ−１を測定しようとしても、試料中に含まれるＨＭＧ−２をも測り込んでしまい、そのため正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値が得られてしまう。このＨＭＧ−２をも測り込んでしまい、正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値は、敗血症等の疾患の診断を誤らせる可能性のあるものであった。
【００１６】
なお、ウエスタンブロット法は、操作が繁雑であり、手技に熟練を要する測定方法であるので、実施することができる測定者、測定施設は限られたものである。そして、ウエスタンブロット法は、その測定の自動化が困難なものである。
【００１７】
従って、ＨＭＧ−２を測り込むことなく、ＨＭＧ−１のみを正確に測定することができる測定方法、測定試薬であって、かつ、操作が簡便であり、又は自動化が可能な測定方法、測定試薬が求められていた。
【００１８】
これに対して、本発明の第一の課題は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を提供することである。
【００１９】
また、本発明の第二の課題は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、かつ測定の操作が簡便で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬を提供することである。
【００２０】
そして、本発明の第三の課題は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、かつ操作が簡便で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体。
（２）次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（３）下記の[1]及び[2]の特徴：
[1]次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなる、
[2]当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体を得ることができる、
を有するペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（４）下記の[1]及び[2]の特徴：
[1]次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなる、
[2]前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製された抗体と結合することができる、
を有するペプチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗体。
（５）モノクローナル抗体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を使用することを特徴とする免疫学的測定方法。
（７）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測定試薬において、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗体は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−１と非常に相同性の高いヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体である。
【００２３】
また、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭＧ−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡便で自動化することも可能な測定試薬である。これにより、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【００２４】
そして、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭＧ−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡便で自動化することも可能な測定方法である。これにより、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体
（１）総論
本発明の、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１（ヒトＨＭＧ−１）には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２（ヒトＨＭＧ−２）には結合しない抗体（以下「本発明の抗体」ということがある。）は、ヒトＨＭＧ−１に結合し、かつヒトＨＭＧ−２に結合しない抗体であれば、いかなるものでもよい。
【００２６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体よりなる抗血清又はモノクローナル抗体のいずれのタイプのものをも含み、また、これらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’等）をも含むものである。
なお、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であることが、その調製操作において吸収操作などを省略できること等から好ましい。
【００２７】
本発明の抗体を取得する方法は、特に限定されないものの、下記の方法等が挙げられる。
[1]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２のアミノ酸配列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択する。次に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。そして、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体であることを確認するか、又はそのような抗体を選択して、本発明の抗体を取得する。
【００２８】
なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００２９】
[2]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。固相に固定化したＨＭＧ−２と前記産生された抗体を含む溶液を接触させ、ＨＭＧ−２に結合する抗体を、固定化されたＨＭＧ−２を介して固相に結合させる。次に、前記担体と前記溶液を分離することにより、溶液中からＨＭＧ−２に結合する抗体を除去して、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を取得する。
【００３０】
[3]ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２のアミノ酸配列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択する。次に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得する。固相に固定化したＨＭＧ−２と前記産生された抗体を含む溶液を接触させ、ＨＭＧ−２に結合する抗体を、固定化されたＨＭＧ−２を介して固相に結合させる。次に、前記担体と前記溶液を分離することにより、溶液中からＨＭＧ−２に結合する抗体を除去して、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を取得する。
【００３１】
なお、この場合も、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００３２】
前記[1]の方法は、モノクローナル抗体の取得において適した方法であり、前記[2]及び[3]の方法はポリクローナル抗体又は抗血清の取得において適した方法である。そして、前記[1]の方法に比べて前記[2]の方法の方が操作がより繁雑であり、また、前記[2]の方法に比べて前記[3]の方法の方が操作がより繁雑であるので、操作の面からは前記[1]の方法がより好ましい。
【００３３】
（２）免疫原
本発明の抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
前記した通り、本発明の抗体を産生させるための免疫原として、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質、あるいはＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等を用いることができる。
【００３４】
なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原として産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからである。
【００３５】
このアミノ酸配列の各アミノ酸残基の親水性の高さの推定は、ホップらの方法（Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻，３８２４〜３８２８頁，１９８１年発行）又はパーカーらの方法（Ｐａｒｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５巻，５４２５〜５４３２頁，１９８６年発行）等により行うことができる。
【００３６】
本発明者らは、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列（Ｌ．Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行）の全てについて、前記のホップらの方法により、各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を行った。この結果を図１に示した。
【００３７】
この図において、横軸はヒトＨＭＧ−１の各アミノ酸残基のＮ末端からの順番を示している。また、縦軸は値がプラス側に大きい程、疎水性が高いことを示し、逆に値がマイナス側に大きい程、親水性が高いことを示す。
【００３８】
次に、本発明者らは、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列のうち親水性の高い配列をヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１９９２年発行）と比較した。
そして、この親水性の高いアミノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択した。
【００３９】
この本発明者らが選択したアミノ酸配列は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミノ酸残基（グリシン）より１１番目のアミノ酸残基（リシン）までの、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」である。
【００４０】
後述するように、このアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」よりなるペプチドを免疫原として調製された抗体は、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（本発明の抗体）である。
【００４１】
この「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製することにより、本発明の抗体を取得することができるのであるが、本発明の抗体を産生させるための免疫原としては、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００４２】
なお、ヒトＨＭＧ−１の前記アミノ酸配列に相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列は「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」であり、これはＮ末端から６番目のアミノ酸残基が「Lys」（ＨＭＧ−１）から「Asn」（ＨＭＧ−２）に入れ替わっただけのものであり、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の前記アミノ酸配列における違いはこの箇所だけであるので、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（本発明の抗体）の免疫原のうち、前記アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」に由来する免疫原のアミノ酸配列としては、このヒトＨＭＧ−１のＮ末端から６番目のアミノ酸残基「Lys」を含むことが必須であると考える。
【００４３】
そして、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）があるので、本発明の抗体の免疫原のうち、前記アミノ酸配列に由来する免疫原の最小単位としては、「Pro Lys Lys」、「Asp Pro Lys」又は「Lys Lys Pro」を規定（考える）することができる。そして更に、これらのトリペプチドに他のアミノ酸、又はペプチドが付加したものを、本発明の抗体の免疫原として考えることができる。
【００４４】
なお、前記の本発明の抗体を産生させるための免疫原としての、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチドは、以下のいずれかの条件を満たすものである。
（Ａ）当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を得ることができるペプチド、又は、
（Ｂ）「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製された抗体と結合することができるペプチド。
【００４５】
なお、前記（１）の[2]の方法に従う場合、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原とすることもできる。
【００４６】
前記の免疫原としての、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプチド、又はＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質は、ヒト又は他の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製し、取得することができる。
【００４７】
なお、ＨＭＧ−１又はＨＭＧ−２のヒト胸腺、ブタ胸腺、ウシ胸腺、ヒト胎盤、好中球、ＨＬ−６０細胞株等からの取得の方法は、以下の文献等に記載されている（Ｈ．Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，４０５巻，２８０〜２９１頁，１９７５年発行；Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５巻，１１７〜１２４頁，１９８０年発行；Ｙ．Ａｄａｃｈｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，５３０巻，３９〜４６巻，１９９２年発行）。
【００４８】
そして、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の混合物が、和光純薬工業社より販売されているので、これよりウシＨＭＧ−１のみを精製し取得することもできる。
【００４９】
また、前記の各々の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学IV」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００５０】
更に、前記の各々の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学講座１ 遺伝子研究法II」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法III」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００５１】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００５２】
なお、抗体を産生させる際に担体を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００５３】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００５４】
（３）抗体の取得方法
[1]ポリクローナル抗体、抗血清
本発明の抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により取得することができる。
【００５５】
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を哺乳動物(マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ等)又は鳥類(ニワトリ等)等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウス一匹当り一回につき０．１μｇ〜数ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。また、ウサギの場合はウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
【００５６】
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
【００５７】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００５８】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本発明の抗体を含む抗血清を得る。
【００５９】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
【００６０】
ここで得られたポリクローナル抗体は、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体と、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体の両方よりなるものであるので、更に、これをＨＭＧ−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させる。ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧ−２）を介して固相に結合し、捕集される。これに対して、ＨＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（ＨＭＧ−２）に結合することなく、このカラムを素通りするので、素通りした画分を得ることにより、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体を取得することができる。
【００６１】
なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【００６２】
[2]モノクローナル抗体
本発明の抗体において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【００６３】
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００６４】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
【００６５】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００６６】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００６７】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
【００６８】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
【００６９】
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００７０】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又はヒトＨＭＧ−１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧ−１等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００７１】
また、前記のハイブリドーマの培養上清を、ヒトＨＭＧ−２等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧ−２等には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００７２】
この２種類のハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明の抗体（モノクローナル抗体）、即ちヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００７３】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
【００７４】
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることもできる。
【００７５】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。
【００７６】
２．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法
（１）総論
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法（以下「本発明の免疫学的測定方法」又は「本発明の測定方法」ということがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴とするものである。
【００７７】
即ち、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴とする測定方法である。これにより、本発明の測定方法では、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができるのである。
【００７８】
この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、このような性質を有するものであれば特に制限なく使用することができ、前記の効果を得ることができる。
【００７９】
なお、ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として２つの抗体を使用する免疫学的測定法においては、その２つの抗体のうち少なくとも１つが、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよい。そして、他方は「ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体」であれば如何なるものでもよい。また、両方の抗体とも、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であってもよい。
【００８０】
例えば、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれか一方又は両方が、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよい。
【００８１】
この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
なお、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」の詳細については、前記の「１．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」の項に記載したとおりである。
【００８２】
（２）免疫学的測定方法
本発明の測定方法は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合する抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用するものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００８３】
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００８４】
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方法を適用することができる。
また、本発明の測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００８５】
（３）測定試料
本発明の測定方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織もしくは細胞などの抽出液等、ＨＭＧ−１が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００８６】
（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、固相化抗体及び標識抗体のいずれか一方の抗体が「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよく、また固相化抗体及び標識抗体の両方が「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であってもよい。
【００８７】
前記測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００８８】
固相化抗体は、本発明の抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００８９】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００９０】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００９１】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００９２】
本発明の抗体等の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００９３】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００９４】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１＝標識抗体」の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたＨＭＧ−１の量（濃度）のみを測定することができる。
【００９５】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００９６】
（５）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明の測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００９７】
本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
【００９８】
本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００９９】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【０１００】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１０１】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ＨＭＧ−１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０１０２】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のＨＭＧ−１の濃度、本発明の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０１０３】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された「本発明の抗体」と試料中に含まれていた「ＨＭＧ−１」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【０１０４】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０１０５】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０１０６】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１０７】
３．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬
（１）総論
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬（以下「本発明の免疫学的測定試薬」又は「本発明の測定試薬」ということがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測定試薬において、前述した本発明の抗体を使用することを特徴とするものであり、前述した本発明の測定方法に使用することができるものである。従って、本発明の測定試薬に使用する抗体、測定原理等については、前述した本発明の測定方法と同様である。
【０１０８】
（２）その他の試薬成分
本発明の測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１０９】
また、本発明の測定試薬には、前記の本発明の抗体などの抗体を固相化した固相担体、前記の本発明の抗体などの抗体を感作した固相担体、及び／又は前記の本発明の抗体などの抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１１０】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油もしくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１１】
（３）測定試薬の構成
本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のＨＭＧ−１の測定に使用することができる。そして、そのもの単独にて、販売することができる。また、本発明の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のＨＭＧ−１の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕（ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列における、親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いアミノ酸配列の選択）
親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いアミノ酸配列を、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列より選択した。
【０１１３】
（１） ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列は、前記のウエンらのデータの通りである。〔Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行〕
【０１１４】
（２） このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を、前記のホップらの方法〔Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻，３８２４〜３８２８頁，１９８１年発行〕により行った。この結果は、前記の図１の通りである。
【０１１５】
（３） 次に、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列のうち親水性の高い配列を、ヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列〔Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１９９２年発行〕と比較した。そして、この親水性の高いアミノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択した。
【０１１６】
（４） ここで本発明者らが選択したアミノ酸配列の第１番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミノ酸残基（グリシン）より１１番目のアミノ酸残基（リシン）までの、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」である。なお、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」は、これに相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」と、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基が異なっている。〔ヒトＨＭＧ−１では「Lys」であり、これに対してヒトＨＭＧ−２では「Asn」である。〕
【０１１７】
（５） 次に、本発明者らが選択したアミノ酸配列の第２番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端から８７番目のアミノ酸残基（リシン）より１００番目のアミノ酸残基（アラニン）までの、「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」である。なお、このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」は、これに相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」と、Ｎ末端から８８番目のアミノ酸残基が異なっている。〔ヒトＨＭＧ−１では「Phe」であり、これに対してヒトＨＭＧ−２では「Lys」である。〕
【０１１８】
〔実施例２〕（ペプチドの合成）
実施例１で選択した２種類のアミノ酸配列の各々のＮ末端に、担体に結合させるためにシステインを結合させたアミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」及び「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」のペプチドをそれぞれ合成した。
【０１１９】
まず、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル４３０Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法でアミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」のペプチドの合成を行った。
【０１２０】
副反応を抑制するためにスカベンジャーとして、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾール、ｍ−クレゾール及びアニソールの存在下でフッ化水素法により樹脂から合成したペプチドの脱離を行った。
その後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行った。
【０１２１】
陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−Ｘ２（ＤＯＷＥＸ １−Ｘ２）により陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行った。
【０１２２】
そして、エバポレーターにより凍結乾燥をして濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取した。なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速７．０ｍＬ／分で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
【０１２３】
ここで精製分取した合成ペプチドをエバポレーターで凍結乾燥して濃縮した。
得られた合成ペプチドの純度をＨＰＬＣで分析した。装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｒ−ＯＤＳ−５（４．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速１．０ｍＬ／分、２５分間で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。これより得られた合成ペプチドの純度がほぼ１００％であることが分かった。
【０１２４】
また、前記と同様にして、アミノ酸配列「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」のペプチドの合成を行った。そして、得られた合成ペプチドの純度を前記と同様にＨＰＬＣで分析したところ、これも純度はほぼ１００％であることが分かった。
【０１２５】
〔実施例３〕（免疫原の調製）
担体であるスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）〔カルビオケム社製〕又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔生化学工業社製〕の１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解している２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社製〕溶液１５０μＬを加え室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
【０１２６】
これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたゲル濾過カラムであるセファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）カラム〔ファルマシア−エルケービー社製〕にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結合成分を分取した。
【０１２７】
このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例２で合成したペプチド「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を添加混合して１５０分間反応させた。
【０１２８】
反応後、水に対して３回透析した後、凍結乾燥を行って前記ペプチドと結合した担体よりなる免疫原を得た。
また、実施例２で合成したペプチド「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」についても、前記の通り操作を行って、前記ペプチドと結合した担体よりなる免疫原を得た。
【０１２９】
〔実施例４〕（モノクローナル抗体の調製）
実施例３で調製した免疫原を用いてモノクローナル抗体の調製を下記のようにして行った。
〔１〕 動物への免疫
（１） 実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）を１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。
【０１３０】
（２） 初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を５０μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【０１３１】
（３） 免疫動物であるこのマウスの血清中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。
[1] 実施例３で得た「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドに担体としてＢＳＡを結合させた免疫原を５μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置してこの免疫原の固相化を行った。
[2] このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
[3] このマイクロプレートのウェルに、抗体の産生を検査すべき前記マウスの血清を試料として１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
[4] また対照として、前記[2]のマイクロプレートのウェルに、ＨＡＴ培地を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、その後洗浄液で洗浄した。
[5] パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で２，０００倍に希釈した後、[3]及び[4]のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
[6] これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
[7] これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１３２】
（４） 初回免疫から１８週間目以降、抗体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で８００μｇ／ｍＬとした実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）の０．５ｍＬを注射した。その後３日目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【０１３３】
以上の（１）〜（４）の操作を、もう一方の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）についても同様に行い、免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【０１３４】
〔２〕 骨髄腫細胞の増殖
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（バイオセル社製）で増殖を行った。
【０１３５】
これは、この骨髄腫細胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び血球計で計数を行った。
【０１３６】
〔３〕 細胞融合
（１） 前記〔１〕で免疫動物のマウスより取得した脾臓を、ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分にほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離を行い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。
【０１３７】
（２） この脾臓細胞と前記の増殖させたＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した後、遠心分離を行った。混合した細胞を、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ・ダイアグノスティック社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液にゆっくりと懸濁した。そして、最終的にポリエチレングリコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈した。
【０１３８】
（３） これより細胞を遠心分離で分離し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オリゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平底の９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）のウェルに、１ウェル当り１０６個／１００μＬの細胞数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養した。
【０１３９】
（４） 細胞融合後１日目に、各ウェルに１００μＬのＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテリンとなるようにそれぞれを補充したもの、いずれも東京化成社製）を加えた。その後３日間は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後は、２〜３日ごとに同様の交換を行った。
【０１４０】
（５） 細胞は、顕微鏡で観察を行った。ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以降より出現し、１４日以降に「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で示されるアミノ酸配列を認識する抗体の産生を検査するため、ウェルの上澄み液をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
【０１４１】
（６） 前記（５）のスクリーニングにおいて、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を認識する抗体を産生していることが判明したウェルのハイブリドーマを、２４穴のウェルがあるプレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養した。
【０１４２】
（７） そして、ハイブリドーマはＨＴ培地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングファクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。
【０１４３】
（８） アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を認識する抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により前記（５）と同様にして調べたところ、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを３個確認した。
【０１４４】
以上の（１）〜（８）の操作を、もう一方の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドにＫＬＨを結合させたもの）を免疫して得た前記のマウス脾臓についても同様に行い、アミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」を含む「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを６個確認した。
【０１４５】
〔４〕 ハイブリドーマサブクローニング
（Ａ） 免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合
（１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する前記ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にてサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行った。
そして、これらのハイブリドーマを、１００μＬのＨＴ培地当り、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロプレートの１ウェル当り１００μＬずつ分注した。これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増殖させた。
【０１４６】
（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルのコロニー数を調べ、そして、「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマについて前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べた。１ウェル中に１コロニーが存在し、そしてこのような抗体を産生するハイブリドーマ（ウェル）を２個得ることができた。
【０１４７】
（３） これを、２４穴のプレートに移し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。
【０１４８】
（４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替えることと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この結果、前記のハイブリドーマのうち、１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体を産生する細胞株であることが判明した。
【０１４９】
（５） このハイブリドーマを、再度、前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そして、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを１個得た。
【０１５０】
（６） このハイブリドーマのクローンが産生する抗体の前記ヒトＨＭＧ−１との反応性を、再度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。この検討の結果、このハイブリドーマのクローンが産生する抗体（モノクローナル抗体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが確かめられた。
【０１５１】
（７） 次に、このハイブリドーマが産生する抗体の、参考例３で調製したウシＨＭＧ−１、ウシＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例３で調製したウシＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替えることと、試料をこのハイブリドーマ（このウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
【０１５２】
この検討の結果、このハイブリドーマが産生する抗体は、ウシＨＭＧ−１には結合するが、ウシＨＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。
なお、免疫原のペプチドのアミノ酸配列として採用したＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」、及びこの配列に対応するＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列である。
【０１５３】
従って、以上のことより、このハイブリドーマが産生する抗体（モノクローナル抗体）が、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）であることが明らかになった。
【０１５４】
このハイブリドーマは、ＭＤ７７と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−１８４０４として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。
【０１５５】
（Ｂ） 免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合
（１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する前記ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にてサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行った。
【０１５６】
そして、これらのハイブリドーマを、１００μＬのＨＴ培地当り、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロプレートの１ウェル当り１００μＬずつ分注した。これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増殖させた。
【０１５７】
（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルのコロニー数を調べ、そして、「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマについて前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べた。１ウェル中に１コロニーが存在し、そしてこのような抗体を産生するハイブリドーマ（ウェル）を４個得ることができた。
【０１５８】
（３） これを、２４穴のプレートに移し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。
【０１５９】
（４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替えることと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この結果、前記のハイブリドーマのうち、１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体を産生する細胞株であることが判明した。
【０１６０】
（５） このハイブリドーマを、再度、前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そして、アミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」を含む「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを２個得た。
【０１６１】
（６） これらの２個のハイブリドーマのクローンが産生する各々の抗体の前記ヒトＨＭＧ−１との反応性を、再度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。この検討の結果、これらの２個のハイブリドーマのクローンが産生する各々の抗体（モノクローナル抗体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが確かめられた。
【０１６２】
（７） 次に、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体の、参考例３で調製したウシＨＭＧ−１、ウシＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例３で調製したウシＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替えることと、試料をこれらのハイブリドーマ（このウェル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。
この検討の結果、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体は、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の両方に結合することが確かめられた。
【０１６３】
なお、免疫原のペプチドのアミノ酸配列として採用したＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」、及びこの配列に対応するＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列である。
【０１６４】
従って、以上のことより、これらの２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体（モノクローナル抗体）が、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）であることが明らかになった。
【０１６５】
これらのハイブリドーマは、ＭＤ７８と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８４０５として平成１３年７月４日付けにて寄託されている。
【０１６６】
〔５〕 モノクローナル抗体の産生
（１） 前記〔４〕で得た各々のモノクローナル抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）を、それぞれ中型ボトル（ヌンク社製）の中に１つずつ入れ、底面の約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地中で培養を行った。
（２） その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。次に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁した。
（３） 前もって、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射した。注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかった場合には、再度これを繰り返し行った。
（４） このマウスの腹部の膨張が認められた時に腹水を採取した。これを２００ｇ、５分間の遠心分離にかけ、ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体を含む上澄み液を、ハイブリドーマから分離して取得した。
【０１６７】
〔６〕 モノクローナル抗体の精製
（１） 前記〔５〕で得た、ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体を含む上澄み液の各々の１０ｍＬに、２２℃で硫酸ナトリウム１．８ｇを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に１時間撹拌を続けて塩析を行った。
（２） これを２２℃で遠心分離（７０００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。
（３） 次に、これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のものを除去した。
（４） これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１０ｃｍ〕に流速０．４ｍＬ／分で通して、溶出液を２ｍＬずつ集めた。
（５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。
（６） 更に、これをプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製を行い、精製したモノクローナル抗体を得た。
【０１６８】
なお、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の得られた量は、タンパク質量として０．５ｍｇであった。
【０１６９】
また、免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）の得られた量は、タンパク質量として０．４ｍｇであった。
【０１７０】
〔実施例５〕（パーオキシダーゼ標識抗体の調製）
実施例４で得たヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを標識化して、パーオキシダーゼ標識抗体を調製した。
（１）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入
パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加して、３０℃で６０分間反応させた。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。以上の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド基を導入した。
【０１７１】
（２）抗体へのチオール基の導入
実施例４で得た、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加して、室温で３０分間反応させた。
【０１７２】
その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で５分間放置した。
【０１７３】
次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。
以上の操作により、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）に、チオール基を導入した。
【０１７４】
（３）標識抗体の調製
前記（１）で調製したマレイミド基を導入したパーオキシダーゼ及び前記（２）で調製したチオール基を導入した抗体を一対一で混合し、３０℃で２０時間反応させて、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を行った。その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４のカラムに通し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このゲル濾過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。このパーオキシダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、パーオキシダーゼが結合した抗体、即ちパーオキシダーゼ標識抗体を得た。そして、このパーオキシダーゼ標識抗体を含む溶液のタンパク質濃度を測定した。
【０１７５】
〔実施例６〕（マイクロプレート固相化抗体）
実施例４で得たヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートに固相化して、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
（１） 実施例４で得た、免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍＬとした後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固相化した。
（２） この抗体が固相化されたマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１７６】
以上の操作により、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１７７】
〔実施例７〕（ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を使用するヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法）
実施例５で調製したパーオキシダーゼ標識抗体及び実施例６で調製したマイクロプレート固相化抗体を免疫学的測定試薬として使用し、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１及び参考例３で調製したウシＨＭＧ−１の酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定を行った。そして、この免疫学的測定方法における検量線を作成した。
【０１７８】
１．測定試薬
[1] パーオキシダーゼ標識抗体
実施例５で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを結合させたパーオキシダーゼ標識抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用した。
[2] マイクロプレート固相化抗体
実施例６で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートの各ウェルに固相化したマイクロプレート固相化抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用した。
[3] 洗浄液
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とした。
[4] パーオキシダーゼ基質液
３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したものを調製して、標識としたパーオキシダーゼの基質、即ちパーオキシダーゼ基質液とした。
[5] 反応停止液
６Ｎ硫酸水溶液を調製して、反応停止液とした。
【０１７９】
２．試料
[1] ヒトＨＭＧ−１を含む試料
参考例２において調製したヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後の前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。そして、この前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、前記ヒトＨＭＧ−１濃度が、３６０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ又は１，０８０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
[2] ウシＨＭＧ−１を含む試料
参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。そして、このウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
[3] ０ｎｇ／ｍＬの試料
前記の０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を、ヒトＨＭＧ−１濃度及びウシＨＭＧ−１濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
【０１８０】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
[1] 前記２で調製した、３種類の前記ヒトＨＭＧ−１を含む試料、４種類の前記ウシＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ、生理食塩水で２倍に希釈した。
[2] 前記[1]で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
[3] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[4] 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。次にこれを、前記[3]の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
[5] その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[6] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
[7] 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の反応停止液を、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
[8] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により測定した。
[9] 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値、即ち検量線を図に示した。前記のヒトＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線を、図２に示した。また、前記のウシＨＭＧ−１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線を、図３に示した。
【０１８１】
なお、これらの図において、横軸は試料中に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１又は前記ウシＨＭＧ−１の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０１８２】
４．まとめ
図２より、前記ヒトＨＭＧ−１を含む試料においては、含まれる前記ヒトＨＭＧ−１濃度に比例して得られる吸光度が増加しており、試料に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１濃度に比例した測定値を得ることができることが分かった。
よって、本発明の測定試薬及び測定方法により、試料中に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１を正確に測定することができることが確かめられた。
【０１８３】
図３より、前記ウシＨＭＧ−１を含む試料においては、含まれる前記ウシＨＭＧ−１濃度に比例して得られる吸光度が増加しており、試料に含まれる前記ウシＨＭＧ−１濃度に比例した測定値を得ることができることが分かった。
【０１８４】
〔実施例８〕（本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法による血清試料の測定）
本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法について、血清試料に含まれるＨＭＧ−１を測定して、血清試料の測定時の正確性を確かめた。
【０１８５】
１．測定試薬
実施例７の「１．測定試薬」の「[1] パーオキシダーゼ標識抗体」、「[2] マイクロプレート固相化抗体」、「[3] 洗浄液」、「[4] パーオキシダーゼ基質液」及び「[5] 反応停止液」をそれぞれ使用した。
【０１８６】
２．試料
[1] 参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。
【０１８７】
そして、このウシＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃度が、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ又は４００ｎｇ／ｍＬの溶液をそれぞれ調製した。
【０１８８】
[2] 前記[1]で調製した３種類の溶液をそれぞれ生理食塩水で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ−１濃度が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬの血清を含まない試料をそれぞれ調製した。
[3] また、前記[1]で調製した３種類の溶液をそれぞれヒト血清で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ−１濃度が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬの血清試料をそれぞれ調製した。
【０１８９】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
[1] 前記２で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
[2] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[3] 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。次にこれを、前記[2]の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
[4] その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
[5] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
[6] 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の反応停止液を前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
[7] 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により測定した。
[8] 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値を表に示した。なお、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０１９０】
【表１】
【０１９１】
４．まとめ
前記の表より、各々のウシＨＭＧ−１濃度において、生理食塩水で希釈した血清を含まない試料の測定値（吸光度）と、ヒト血清で希釈した血清試料の測定値（吸光度）は、ほとんど同じであることが分かる。
【０１９２】
血清は種々の成分を含み複雑な組成のものであるが、本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、このような血清又は血清を含む試料においても、ＨＭＧ−１の濃度を正確に測定することができるものであることが確かめられた。
【０１９３】
なお、先に述べたように、前記測定を行った本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に使用した抗体はいずれも、ヒトとウシとで全くアミノ酸配列が同一な箇所を免疫原に使用して作成したものであり、そして、実施例７において本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、前記ヒトＨＭＧ−１も前記ウシＨＭＧ−１も正確に測定できることが確かめられているので、例え、試料としてウシＨＭＧ−１の代わりにヒトＨＭＧ−１を血清で希釈したものを用いたとしても、同じ結果が得られることは明白である。
【０１９４】
〔実施例９〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性の確認）
実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）、及び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）のそれぞれについて、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各々との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０１９５】
１．ウエスタンブロット法
（１）ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）
[1] ヒト血清を、タイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、これに前記のヒト血清の２μＬを接触させた。
[2] そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。
[3] 前記[2]の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
【０１９６】
まず、前記[2]において電気泳動を行ったアガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。
[4] この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
[5] 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[6] 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解し、この溶液に前記[5]の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[7] 前記[6]の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
[8] 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、これに前記[7]のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[9] このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記[9]のニトロセルロース膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
【０１９７】
以上の操作により、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０１９８】
（２）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）
前記（１）の[6]における「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）」を、「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）」に変えること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０１９９】
（３）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクローナル抗体）
前記（１）の[6]における「実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）」を、「参考例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）」に変えること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、参考例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）におけるウエスタンブロット法の結果を得た。
【０２００】
２．実験結果
（１）ウエスタンブロット法の結果
前記１の（１）、（２）及び（３）におけるウエスタンブロット法の結果を図４に示した。
なお、この図において、「ＭＡ１」はヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）における結果であり、「ＭＡ２」はヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（実施例４で調製したモノクローナル抗体）における結果であり、「ＰＡ」はヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクローナル抗体）における結果である。
【０２０１】
そして、この図において、「１」のバンドはヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−１によるバンドであり、「２」のバンドはヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−２によるバンドである。
〔これは、別途、ヒト血清の替わりに、精製して得たウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２をそれぞれ電気泳動して、ウエスタンブロット法を行い、得られたバンドの位置より確かめておいた。（ヒトＨＭＧ−１とウシＨＭＧ−１、そしてヒトＨＭＧ−２とウシＨＭＧ−２のアミノ酸配列の相同性は、それぞれ非常に高いので、電気泳動においてほぼ同じ位置に泳動される。）〕
【０２０２】
（２）対照（コントロール）
前記１の（１）、（２）及び（３）における（１）の[5]の操作までを行ったもう一枚の各ニトロセルロース膜について、前記（１）の[6]の操作は行わず、しかし前記（１）の[7]以下の操作は同様に行って、これを対照（コントロール）とした。
【０２０３】
この、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体も、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をも作用させていない対照（コントロール）においては、ヒトＨＭＧ−１のバンドが現れる位置及びヒトＨＭＧ−２のバンドが現れる位置のいずれにおいても何ら発色は認められなかった。
このことより、前記の各ウエスタンブロット法においては、非特異的な発色が起きていないことが確かめられた。
【０２０４】
３．まとめ
図４より、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）、及び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）では、ヒトＨＭＧ−１が泳動される位置とヒトＨＭＧ−２が泳動される位置の両方において発色が見られることが分かる。
このことより、ヒト血清中には、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方が存在することが確かめられた。
【０２０５】
そして、前記のヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）とヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）は、確かにヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の両方に結合することが、このウエスタンブロット法の結果より確認できた。
【０２０６】
また、図４より、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）では、ヒトＨＭＧ−１が泳動される位置には発色が見られるものの、ヒトＨＭＧ−２が泳動される位置には発色が見られないことが分かる。
【０２０７】
このことより、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体は、確かにヒトＨＭＧ−１には結合するものの、ヒトＨＭＧ−２には結合しないことが、このウエスタンブロット法の結果より確認できた。
【０２０８】
〔参考例１〕（ヒトＨＭＧ−１遺伝子の調製）
ヒトＨＭＧ−１をヒト脳ｃＤＮＡからＤＮＡ増幅を行いクローン化した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで修飾し、シークエンス・ベクターのｐＣＡＬ−ｎベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化し、ＤＮＡ配列の確認を行った。
【０２０９】
〔参考例２〕（ＤＮＡ組換え法によるヒトＨＭＧ−１の調製）
このＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIで修飾されたＰＣＲ産物をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させるために、ｐＥＸ発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化した。
【０２１０】
次に、このリコンビナントプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１に、トランスフォームした。
トランスフォームされた細胞を１Ｌ程で培養を行った後、ＩＰＴＧの誘導をかけ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１で発現させた。
【０２１１】
この発現させたＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１を集菌後、３０ｍＬ程度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム及び５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）〕に分散させた。
【０２１２】
そして、これを超音波処理により破砕し、遠心分離後、上澄み液を回収した。
この上澄み液中に含まれるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質をグルタチオン・カラム（ファルマシア社）により精製した。
【０２１３】
次に、この精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質から、第Ｘａ因子を作用させて、ヒトＨＭＧ−１を切り出した。
以上のＤＮＡ組換え操作により、ヒトＨＭＧ−１を取得、調製した。
【０２１４】
〔参考例３〕（ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の調製）
ウシの胸腺より、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２をサンダースらの方法〔Ｃ．Ｓａｎｄｅｒｓら，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，７８巻，１０３４〜１０４２頁，１９７７年発行〕に従って調製した。
[1] まず、ウシの胸腺５００ｇを、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む６００ｍＬの緩衝液中で破砕を行った。
[2] 次に、この破砕物を遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。
[3] これに、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液を加えて撹拌した後、遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。この洗浄操作を２回繰り返して行った。
[4] 次に、得られた沈殿物に、０．７５Ｍの過塩素酸の３００ｍＬを加えた。そして、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。残った沈殿物に０．７５Ｍの過塩素酸の４００ｍＬを加えた。これについても、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。この上澄み液と先に分取した上澄み液とを合わせた。なお、沈殿物は廃棄した。
[5] 前記の合わせた上澄み液に０．７５Ｍの過塩素酸を加えて、全体の容量を１，０００ｍＬとした。次に、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液をグラスフィルター（グレード４）で濾過した。
[6] 前記の濾過の濾液に、３，５００ｍＬのアセトンと２１ｍＬの濃塩酸の混合液を加えた。濁りが生じてくるので、遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分取した。この上澄み液に、アセトン２，５００ｍＬを加えた。そして、再度、濁りが生じてくるので、これを遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分離し、残った沈殿物を集めた。
[7] この集めた沈殿物を室温で自然乾燥させた。
【０２１５】
以上の操作により、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を含むタンパク質画分が、およそ２００ｍｇ得られた。
[8] 前記のＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を含むタンパク質画分を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍＬに溶解した後、この２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で充分に透析を行った。
[9] この透析の後、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに添加した。
【０２１６】
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
この溶出パターンを図５に示した。なお、この図において、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は溶出画分の番号を示す。
【０２１７】
[10] そして、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、その易動度より、図５において「Ａ」で示した溶出画分及び「Ｂ」で示した溶出画分はウシＨＭＧ−１を含む画分であり、更に「Ｃ」で示した溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分はウシＨＭＧ−２を含む画分であることが確かめられた。
【０２１８】
よって、図５において「Ａ」で示した溶出画分及び「Ｂ」で示した溶出画分を混合して集め、更に「Ｃ」で示した溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分を混合して集めた。
【０２１９】
〔参考例４〕（ポリクローナル抗体の調製）
参考例３で調製したウシＨＭＧ−１を用いてポリクローナル抗体の調製を下記のようにして行った。
〔１〕 動物への免疫
（１） 前記の参考例３で得たウシＨＭＧ−１を４００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、ウサギ（北山ラベス社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。
【０２２０】
（２） 初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を３００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【０２２１】
（３） 免疫動物であるこのウサギの血清中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。
[1] 参考例３で得たウシＨＭＧ−１を５μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置してこのウシＨＭＧ−１の固相化を行った。
[2] このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
[3] 抗体の産生を検査すべき前記ウサギの血清を、生理食塩水で１，０００倍、１０，０００倍、そして１００，０００倍と希釈し、これらをマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
[4] また対照として、前記[2]のマイクロプレートのウェルに、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、その後洗浄液で洗浄した。
[5] パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、[3]及び[4]のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
[6] これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
[7] これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０２２２】
（４） 初回免疫から１２週間目以降、抗体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物であるウサギの全採血を行った。そして、このウサギの血液より抗血清を得た。
（５） 前記（４）で得た抗血清について、２２〜２５℃において、この抗血清１ｍＬに対して０．１８ｇの比率で硫酸ナトリウムを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に３０分間撹拌を続けて塩析を行った。
（６） これを２２〜２５℃で、遠心分離（７０００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿をリン酸緩衝生理食塩水の１ｍＬに溶解した。
（７） 次に、これをリン酸緩衝生理食塩水に対して充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のものを除去した。
（８） これをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×２．５ｃｍ〕に通して、溶出液を集めた。
（９） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて濃縮した。
【０２２３】
（１０） 次に、これを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１を固定化したカラムに通して、アフィニティークロマトグラフィーを行った。この操作を以下に示した。
[1] 参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１の２ｍｇに対して１ｇのＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシアバイオテック社製）をその取扱説明書に従って反応させ、前記のＨＭＧ−１を固定化したアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを調製した。
[2] このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておき、その後、前記（９）にて濃縮した成分（ポリクローナル抗体）を通した。
[3] これにリン酸緩衝生理食塩水を充分に通して洗浄した後、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通した。
[4] これにより溶出した画分を集め、リン酸緩衝生理食塩水で透析を行い、その後、濃縮を行った。
【０２２４】
以上のアフィニティークロマトグラフィーの操作により、ヒトＨＭＧ−１に結合するポリクローナル抗体を分取した。
【０２２５】
（１１） 以上の操作により得られたウサギのポリクローナル抗体は、ヒトＨＭＧ−１に結合することができるものである。また、ヒトＨＭＧ−１と相同性の高いヒトＨＭＧ−２とも結合することができるものである。
【０２２６】
〔実施例１０〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性の確認）
実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）について、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各々との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０２２７】
なお、前記実施例９においては、ヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と各抗体との反応性を確かめたが、本実施例においては、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と前記抗体との反応性の確認を行った。
【０２２８】
１．ウエスタンブロット法
（１）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
[1] 後述する参考例５においてヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２をタイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、これに前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を各々０．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）の２μＬを接触させた。
[2] そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。
[3] 前記[2]の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
【０２２９】
まず、前記[2]において電気泳動を行ったアガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。
【０２３０】
[4] この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
[5] 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[6] 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解し、この溶液に前記[5]の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[7] 前記[6]の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
[8] 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、これに前記[7]のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
[9] このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
[10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記[9]のニトロセルロース膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
【０２３１】
以上の操作により、実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性に関するウエスタンブロット法の結果を得た。
【０２３２】
（２）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
参考として、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）に替えて、市販のヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）〔品名：Ａｎｔｉ ＨＭＧ−２（Ｃ−１９），Human、品番：SC-8758、メーカー：サンタクルズ社（米国）、販売：コスモ・バイオ社〕を前記（１）の[6]において用いること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、バンドを得て、本ウエスタンブロット法におけるヒトＨＭＧ−２のバンドの位置の確認に用いた。
【０２３３】
（３）ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法
参考として、前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に替えて、参考例３においてウシ胸腺より調製したウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の等量混合液を用いること以外は、前記（１）の[1]〜[10]の通りに操作を行い、バンドを得て、本ウエスタンブロット法におけるウシＨＭＧ−１のバンドの位置の確認に用いた。
【０２３４】
２．実験結果
（１）ウエスタンブロット法の結果
前記１におけるウエスタンブロット法の結果を図６に示した。
なお、この図において、「Ｈ[1]」のレーンは前記１の（１）のウエスタンブロット法のレーンであり、「Ｈ[2]」のレーンは前記１の（２）のウエスタンブロット法のレーンであり、そして、「Ｂ[1]」のレーンは前記１の（３）のウエスタンブロット法のレーンである。
【０２３５】
この図６より、以下のことが分かる。
・ 「Ｈ[1]」のレーンにおいては、ただ一本のバンドだけが認められる。
・ 「Ｈ[1]」のレーンにおいては、「Ｈ[2]」のレーンにおけるバンドの位置にはバンドが認められない。
・ 「Ｈ[1]」のレーンと「Ｂ[1]」のレーンは、同じ位置にバンドが認められる。
【０２３６】
すなわち、
[1] ヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を反応させた「Ｈ[2]」のレーンのバンドの位置に、「Ｈ[1]」のレーンではバンドが認められないことが分かる。
[2] ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を泳動させた「Ｈ[1]」のレーンにおいて、ただ一本のバンドだけが認められ、そのバンドの位置が、ヒトＨＭＧ−１と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−２を泳動させた「Ｂ[1]」のレーンの唯一のバンドの位置と同じであることが分かる。
【０２３７】
以上のことより、実施例４で調製された抗体（モノクローナル抗体）は、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１に結合し、かつ、ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。
【０２３８】
（２）対照（コントロール）
前記１の（１）の[5]の操作までを行ったもう一枚のニトロセルロース膜について、前記[6]の操作は行わず、しかし前記[7]以下の操作は同様に行って、これを対照（コントロール）とした。
前記１の（２）及び（３）においても、同様に対照（コントロール）を作成した。
【０２３９】
これらのいずれの抗体も作用させていない対照（コントロール）においては、何ら発色は認められなかった。
このことより、前記の各ウエスタンブロット法においては、非特異的な発色が起きていないことが確かめられた。
【０２４０】
〔参考例５〕（ヒト細胞よりのヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の調製）
ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を調製した。
[1] まず、ＲＰＭＩ１６４０にて培養したヒト細胞（ＨＬ６０細胞）の培養液の上清の３Ｌを、約２５０ｍＬに濃縮した。
[2] 次に、終濃度が２００ｍＭとなるように、塩化ナトリウムを添加した。
[3] これを遠心分離機で遠心分離を行い（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）、その上清を分取して、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過を行った。
[4] この濾液を、ハイトラップ・ヘパリン・カラム（アマシャムファルマシア社製）に通した。
[5] このカラムに、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を流して洗った。
[6] 次に、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）において、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭから２，０００ｍＭまでのグラジエントをかけて前記カラムより溶出させた。
[7] 前記の各溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を同定した。この画分は、塩化ナトリウム濃度が５００ｍＭから１，０００ｍＭにあるときに溶出した画分であった。
[8] 前記[7]のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに通した。
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
[9] ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１を含む画分、及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を各々同定した。
以上の操作により、ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１を調製し、また、ヒトＨＭＧ−２をも調製した
【配列表フリーテキスト】
【０２４１】
配列番号１：ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド
配列番号２：ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全てについて、ホップらの方法により、各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を行った結果を示した図である。
【図２】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定方法により、ヒトＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成した検量線を示した図である。
【図３】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定方法により、ウシＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成した検量線を示した図である。
【図４】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果を示した図である。
【図５】ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の調製における陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示した図である。
【図６】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体。
【請求項２】
次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製される請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマＭＤ７７（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４０４）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項３記載の抗体。
【請求項５】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列とヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のアミノ酸配列とを比較対照して、相同性の低いヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に結合し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体であることを確認するか又は選択して、取得される抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化した固相担体に通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該固相担体にリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、固相担体を素通りした画分として得られるポリクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項７】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該カラムにリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、カラムを素通りした画分として得られるポリクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項８】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列とヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のアミノ酸配列とを比較対照して、相同性の低いヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に結合し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体であることを確認するか又は選択して、取得することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項９】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化した固相担体に通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該固相担体にリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、固相担体を素通りした画分を得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体の製造方法。
【請求項１０】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該カラムにリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、カラムを素通りした画分を得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体の製造方法。
【請求項１】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体。
【請求項２】
次式（Ｉ）：
Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製される請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマＭＤ７７（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４０４）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項３記載の抗体。
【請求項５】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列とヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のアミノ酸配列とを比較対照して、相同性の低いヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に結合し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体であることを確認するか又は選択して、取得される抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化した固相担体に通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該固相担体にリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、固相担体を素通りした画分として得られるポリクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項７】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該カラムにリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、カラムを素通りした画分として得られるポリクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
【請求項８】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列とヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のアミノ酸配列とを比較対照して、相同性の低いヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１に結合し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しない抗体であることを確認するか又は選択して、取得することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項９】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化した固相担体に通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該固相担体にリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、固相担体を素通りした画分を得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体の製造方法。
【請求項１０】
ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列の全部又は前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を免疫原として動物に免疫し、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２には結合しないポリクローナル抗体と、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体とを含むポリクローナル抗体を取得し、次いで、得られたポリクローナル抗体を、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２をリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに通し接触させ、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１及びヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２のいずれにも結合するポリクローナル抗体を当該カラムにリガンドとして固相に固定化されたヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−２を介して固相に結合させ、当該リガンドに結合することなく、カラムを素通りした画分を得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−５０２６９（Ｐ２００９−５０２６９Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５０５１５（Ｐ２００８−２５０５１５）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【分割の表示】特願２００２−２００９４６（Ｐ２００２−２００９４６）の分割
【原出願日】平成１４年７月１０日（２００２．７．１０）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【分割の表示】特願２００２−２００９４６（Ｐ２００２−２００９４６）の分割
【原出願日】平成１４年７月１０日（２００２．７．１０）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
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