ヒドロキシアパタイト標的化ポリ（エチレングリコール）および関連重合体
【課題】単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を提供すること
【解決手段】単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造およびそれらの生物学的活性結合体が提供されている。この重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格（例えば、ＰＥＧ骨格）を含み、この重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分（例えば、ビスホスホネート）に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、この化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない。ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造およびそれらの生物学的活性結合体を調製し使用する方法もまた、提供されている。
【解決手段】単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造およびそれらの生物学的活性結合体が提供されている。この重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格（例えば、ＰＥＧ骨格）を含み、この重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分（例えば、ビスホスホネート）に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、この化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない。ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造およびそれらの生物学的活性結合体を調製し使用する方法もまた、提供されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリ（エチレングリコール）および関連する親水性重合体の誘導体、それらの合成方法、およびそれらの重合体により修飾された表面および分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
親水性重合体であるポリ（エチレングリコール）（略してＰＥＧであり、これは、ポリ（エチレンオキシド）、略してＰＥＯとしても知られている）の分子および表面への共有結合は、生物工学および医学において、非常に有用である。最も一般的な形態では、ＰＥＧは、各末端が水酸基で終わっている直鎖重合体である：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
上記重合体であるα，ω−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）は、−ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨの省略形で表わすことができ、この場合、−ＰＥＧ−との記号は、以下の構造を表わすことが理解されている：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
ここで、ｎは、典型的には、約３〜約４０００の範囲である。
【０００３】
ＰＥＧは、通例、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（略してｍＰＥＧ）として使用され、ここで、１端は、比較的不活性なメトキシ基であるのに対して、他端は、即座に化学修飾を受ける水酸基である。ｍＰＥＧの構造を、以下で示す。
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体は、その化学的性質の点で、ＰＥＧに密接に関連しており、それらは、多くの用途において、ＰＥＧの代わりに使用できる。
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨＲＯ（ＣＨ２ＣＨＲＯ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ここで、Ｒ＝Ｈまたはアルキル（例えば、ＣＨ３）である。
【０００４】
ＰＥＧは、水および多くの有機溶媒中での溶解性、無毒性、および無免疫原性という性質を有する重合体である。ＰＥＧの１用途には、この重合体を不溶分子に共有結合して得られるＰＥＧ−分子「結合体」を可溶性にすることがある。例えば、水不溶性薬剤であるパクリタキセルは、ＰＥＧと結合すると、水溶性となることが明らかとなっている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１〜３３６（１９９５）。
【０００５】
ＰＥＧを分子（例えば、タンパク質）と結合するためには、しばしば、その末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を調製するために、そのＰＥＧを「活性化」する必要がある。この官能基は、このタンパク質上の特定部分（例えば、アミノ基）と反応でき、それにより、ＰＥＧ−タンパク質結合体を形成する。ＰＥＧの多くの活性化誘導体が記述されている。このような活性化誘導体の一例には、スクシンイミジルスクシネート「活性エステル」がある。
【０００６】
【化２】
以下、このスクシンイミジル活性エステル部分は、−ＣＯ２−ＮＳと表わす。
【０００７】
ＰＥＧの化学的性質の応用が洗練されるにつれて、ヘテロ官能性ＰＥＧ、すなわち、異なる末端基を有するＰＥＧがますます必要とされている：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｙ
ここで、ＸおよびＹは、異なる基である。適当な官能基を有するこのようなヘテロ二官能性ＰＥＧは、ＰＥＧを表面または生物学的活性分子に結合するのに使用され得、その他端は、例えば、生物学的活性分子、リポソームまたはバイオセンサに結合するのに使用され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１〜３３６（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物工学分野では、１種またはそれ以上の種々の物質（他の重合体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、オリゴヌクレオチド、脂質、リポソーム、細胞、薬物、表面、および他の生物学的活性部分を含めて）と結合体化するのに適した活性化重合体を継続的に開発することが望まれている。さらに、標的化または長時間放出処方に使用できる活性化重合体を開発できれば、有利となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、体内での寿命を持続させて生物学的活性剤を送達するために、ヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨）を利用する。ポリエチレングリコールは、しばしば、生物学的活性分子と共有結合されて、その循環半減期を長くするが、いくつかの結合体の滞留時間は、最適以下のままである。以下でさらに詳細に記述される本発明により提供される、体内での滞留時間の延長およびヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨）の標的化から利益を得る多くの生物学的活性剤（ポリペプチドおよび小薬剤分子の両方）が存在する。
【００１１】
本発明は、単離可能な活性化ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を提供し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基または保護された化学的反応性基に共有結合されている。例えば、前記ヒドロキシアパタイト標的化部分は、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択できる。前記化学的反応性基または保護された化学的反応性基は、好ましくは、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される。前記重合体骨格は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物を含有し得る。
【００１２】
前記化学的反応性基を生物学的活性剤と反応させることにより、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体は、生物学的活性剤を表面（例えば、骨表面）につなぎ留めるのに使用できる。該ヒドロキシアパタイト標的化重合体およびそれらの生物学的活性剤共役物の調製方法もまた、提供されている。
【００１３】
１実施態様では、本発明は、放出可能生物学的活性剤用のレザバとして骨を有する生物（例えば、哺乳動物）中の骨表面を利用する方法を提供する。該方法は、ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程を包含し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む。治療有効量の該重合体構造が骨を有する生物に投与され、該重合体構造の少なくとも一部が該ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合される。好ましくは、前記加水分解または酵素分解性結合は、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される。前記放出可能生物学的活性剤を備えたヒドロキシアパタイト標的重合体構造は、最初は、前記生物内の骨または骨髄表面を標的にし、それにより、該骨表面は、レザバまたはデポーとして使用する。該生物学的活性剤は、その分解性結合が分解するにつれて、長時間にわたって、該生物から放出される。
【発明の効果】
【００１４】
それゆえ、本発明により、生物学的活性剤は、インビボでヒドロキシアパタイト表面に係留でき、そして病気を治療するために、長時間にわたって、前記生物の他の部分に送達できるようになる。このようにして、前記生物学的活性剤の滞留時間は、延ばすことができ、その治療の効能が改善できる。それに加えて、本発明の活性化重合体誘導体は単離可能であり、その結果、その重合体が生物学的活性剤に結合する前に分離され精製でき、それにより、該生物学的活性重合体の収率および純度が高められる
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「反応性部位」、「化学的反応性基」および「化学的反応性部分」との用語は、当該技術分野で使用され、本明細書中では、ある分子の別個の定義できる部分または単位を意味する。これらの用語は、化学分野において、ある程度、同義であり、本明細書中では、ある機能または活性を発揮し、他の分子と反応性である分子部分を意味するように使用される。
【００１６】
「結合」または「リンカー」との用語は、本明細書中にて、通常、化学反応の結果として形成される基または結合であって、典型的には、共有結合された基または結合を意味するように使用される。加水分解に安定な結合とは、それらの結合が、水中で実質的に安定であり、例えば、有用なｐＨで、生理学的条件下にて、長時間（好ましくは、永久に）、水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の結合とは、その結合が、水中または水溶液（例えば、血液を含めて）中で分解性であることを意味する。酵素不安定性または分解性結合とは、その結合が、１種またはそれ以上の酵素で分解できることを意味する。
【００１７】
本明細書中で使用する「化合物」との用語は、固相、液相または気相にあろうと、粗混合物中であろうと精製され単離されていようと、化学物質を意味すると解釈される。「アルキル」、「アルケン」および「アルコキシ」との用語は、それぞれ、直鎖および分枝のアルキル、アルケンおよびアルコキシを含む。「低級アルキル」との用語は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを意味する。「アルコキシ」との用語は、例えば、式−ＯＲまたは−ＲＯＲ１の酸素置換アルキルを意味し、ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ別個に、選択したアルキルである。「置換アルキル」および「置換アルケン」との用語は、それぞれ、１個またはそれ以上の非妨害置換基（例えば、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど）；アセチレン；シアノ；アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）；低級アルカノイルオキシ（例えば、アセトキシ）；ヒドロキシ；カルボキシ；アミノ；低級アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ）；ケトン；ハロ（例えば、クロロまたはブロモ）；フェニル；置換フェニルなど）で置換されたアルキルおよびアルケンを意味する。「ハロゲン」との用語は、フッ素、塩素、ヨウ素および臭素を含む。
【００１８】
「アリール」とは、１個またはそれ以上の芳香環を意味し、これらは、それぞれ、５個または６個の炭素原子を有する。複数のアリール環は、ナフチルのように縮合され得、またはビフェニルのように非縮合であり得る。アリール環はまた、１個またはそれ以上の環状炭化水素環、ヘテロアリール環または複素環で縮合され得るか、非縮合であり得る。
【００１９】
「置換アリール」とは、置換基として１個またはそれ以上の非妨害基を有するアリールである。
【００２０】
「非妨害置換基」とは、安定な化合物を生じる基である。適当な非妨害置換基またはラジカルには、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ６〜Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍは、１〜８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０チオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１２アリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１２アリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、各ｍは、１〜８である）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する各Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、アラルキルまたはアルカリールである。
【００２１】
「アミノ酸」との用語は、全ての必須アミノ酸および非必須アミノ酸を含む。本明細書中では、当該技術分野で公知の標準的なアミノ酸の略語が使用されている。
【００２２】
「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」または「生物学的活性剤」との用語は、本明細書中で使用するとき、生物生物（ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかの物理的特性または生化学的特性に影響を与えることができる任意の物質を意味する。特に、本明細書中で使用する生物学的活性分子には、ヒトまたは他の動物における病気の診断、治療改善、治療または予防を目的としている任意の物質であるか、そうでなければ、ヒトまたは動物の物理的または精神的健康を高める任意の物質を含む。生物学的活性分子の例には、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬剤、染料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するのに適当な生物学的活性剤のクラスには、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管剤、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
「単離可能」との用語は、これらの活性化重合体が、生物学的活性剤と結合する前に、他の化合物から単離または分離できることを意味すると解釈される。許容できる単離または精製レベルは、種々の要因（例えば、精製の難易度、存在している汚染化合物の種類など）に依存している。このヒドロキシアパタイト標的化活性化重合体を生物学的活性剤に結合する前に単離または分離することにより、良好な収率および純度が達成される。それに加えて、この生物学的活性剤を取り込む前に、これらの重合体誘導体を単離すると、その重合体の定量分析および定性分析が可能となり、これは、次いで、この生物学的活性生成物の全体的な性質を高める。単離可能なヒドロキシアパタイト標的化活性化重合体を生物学的活性剤に結合するのに利用できるようにすると、組成の明確な結合体が得られ、この組成は、調節機関に簡単に伝達できる。下記の実施例で例示しているように、これらの活性化重合体誘導体は、一般に、沈殿に続いて溶媒抽出および／またはクロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により、単離され精製される。
【００２４】
本発明は、単離可能ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を提供し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない。
【００２５】
この重合体骨格は、実質的に非免疫原性の重合体（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））である。しかしながら、本発明を実施するのに使用するために、他の関連した重合体もまた適当であること、そしてＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）との用語の使用が、この点で、包括的であり限定的ではないことが理解できるはずである。好ましくは、この重合体骨格は、２〜約３００個の末端を有する。
【００２６】
ＰＥＧは、典型的には、透明で、無色無臭で、水溶性で、熱に安定であり、多くの化学試薬に不活性であり、加水分解または劣化せず、一般に、非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられており、すなわち、ＰＥＧは、害を及ぼすことなく、生体組織または生物と共存できる。さらに具体的には、ＰＥＧは、非免疫原性である、すなわち、ＰＥＧは、体内で免疫応答を生じる傾向がない。ＰＥＧは、体内である種の望ましい機能を有する分子（例えば、生物学的活性剤）と結合すると、その活性剤を遮蔽する傾向があり、生物が活性剤の存在に耐えることができるように、何らかの免疫応答をなくすか少なくできる。ＰＥＧ結合体は、実質的な免疫応答を生じないか凝固または他の望ましくない効果を引き起こさない傾向にある。ＰＥＧは、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは、約３〜約４０００、好ましくは、約３〜約２０００である）を有し、本発明を実施する際に有用な１重合体である。好ましくは、この重合体骨格として、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧが使用される。
【００２７】
この重合体骨格は、直鎖または分枝であり得る。分枝重合体骨格は、一般に、当該技術分野で公知である。典型的には、分枝重合体は、中心分枝コア部分と、その中心分枝コアに結合された複数の直鎖重合体鎖とを有する。ＰＥＧは、通例、分枝形状で使用され、これは、エチレンオキシドを種々のポリオール（例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）に付加することにより、調製できる。この中心コア部分はまた、数種のアミノ酸（例えば、リジン）から誘導できる。この分枝ポリエチレングリコールは、一般式Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表わすことができ、ここで、Ｒは、このコア部分（例えば、グリセロールまたはペンタエリスリトール）を表わし、そしてｍは、アームの数を表わす。
【００２８】
本発明では、他の多くの重合体もまた適当である。これらの重合体は、直鎖形状または分枝形状のいずれかであり、これらには、他のポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（プロピレン）グリコール（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体など）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元重合体、誘導体および混合物が挙げられるが、これらに限定されない。この重合体骨格の各鎖の分子量は、変化し得るが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、好ましくは、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００２９】
当業者は、実質的に水溶性で非免疫原性の重合体骨格についての前述のリストが、決して、全てを網羅するものではなく、単に例示であること、また、上記性質を有する全ての重合体材料が考慮されることを認識している。
【００３０】
このヒドロキシアパタイト標的化部分は、ヒドロキシアパタイト表面（すなわち、リン酸カルシウム）（例えば、骨）に結合できるかそれに対して化学親和性を示し得る任意の部分を含み得る。このヒドロキシアパタイト標的化部分は、好ましくは、任意のヒドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム表面に結合し得る。１実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分は、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される。特に好ましい実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分は、ビスホスホネートである。
【００３１】
本発明で使用するのに適当なビスホスホネートの一例を、以下に示す。
【００３２】
【化３】
ここで、ＹおよびＺは、別個に、水素、−ＯＨ、ハロゲン、アリール、置換アリール、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＳＨおよびＳＲ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリールまたは置換アリールであり、そしてＷは、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、Ｎａ＋およびＫ＋からなる群から選択される。好ましくは、Ｙは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐは、約２〜約６であり、Ｚは、−ＯＨであり、そして各Ｗは、水素である。特に好ましいビスホスホネートは、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二リン酸である。
【００３３】
ビスホスホネートは、２個の炭素−リン含有結合により特徴付けられ、ピロリン酸塩のＰ−Ｏ−Ｐ（リン−酸素−リン）結合において、酸素が炭素で置き換えられ、そのＰ−Ｃ−Ｐ結合は、化学的および酵素的な加水分解に対して耐性を与える。この炭素原子上の異なる置換基は、いくつかの異なるビスホスホネートを作り出し、各々は、その独自の薬理学的特性を有する。エチドロン酸は、その炭素原子上に水酸基およびメチル基という置換基を含み、治療で使用するビスホスホネートのうち、骨内で９０日を超える半減期を有する最初のビスホスホネートであった。引き続いて、他のさらに強力なビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）が開発され、これは、その炭素原子上に、アルキルアミンおよび水酸基という置換基を有する。
【００３４】
ビスホスホネートは、ヒドロキシアパタイト結晶に対して強力な親和性を有し、また、かなり高い用量で、物理化学的機構により、インビボでの骨の石灰化を阻害する。ビスホスホネートは、代謝されず、吸収され、排泄され、変化せずに保存されるようである。しかしながら、ビスホスホネートのある種のアナログの側鎖は、修飾され得る。吸収された画分の２０〜６０％が骨格に急速に吸収されるので、血漿クリアランスは、急速である（２時間程度の半減期）。その残りは、尿から排泄される。骨内での半減期は、非常に長く、ビスホスホネートの放出は、これらの化合物を吸収する骨の再吸収後にのみ生じる。
【００３５】
骨に対するビスホスホネートおよび他のヒドロキシアパタイト標的化部分の強力な親和性により、本発明の重合体は、生物学的活性剤のためのヒドロキシアパタイト標的化送達システムとして、使用することが可能となる。好ましくは、これらの単離可能な活性化ヒドロキシアパタイト標的化重合体は、単一工程で、この生物学的活性剤に効率的に結合できる。
【００３６】
上記のように、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体構造は、保護または未保護化学的反応性基に結合した少なくとも１個の末端を有する。この化学的反応性基は、好ましくは、生物学的活性剤の官能基に結合するのに適当である。適当な化学的反応性基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートが挙げられる。
【００３７】
当該技術分野で理解されているように、「保護」との用語は、特定反応条件下にて、化学的反応性基の反応を阻止する保護基または部分の存在を意味する。この保護基は、保護する化学的反応性基の種類に依存して変化し得る。例えば、もし、この化学的反応性基がアミンまたはヒドラジドであるなら、その保護基は、好ましくは、第三級ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択される。もし、この化学的反応性基がチオールであるなら、その保護基は、好ましくは、オルトピリジルジスルフィドである。もし、この化学的反応性基がカルボン酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）または水酸基であるなら、その保護基は、好ましくは、ベンジルである。当該技術分野で公知の他の保護基もまた、本発明で使用され得る。
【００３８】
１実施態様では、この化学的反応性基は、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾールカーボネート）および活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）からなる群から選択される。
【００３９】
１つの有用なヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般式を有する。Ｑ−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である。好ましくは、ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール））であり、これは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、そしてＴは、ビスホスホネートである。リンカーＬは、このヒドロキシアパタイト標的化部分を重合体骨格に結合するのに使用される官能基の残基である。例えば、リンカーＬは、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合またはカーバメート結合からなる群から選択される加水分解に安定な結合であり得る。リンカーＬはまた、以下でさらに詳細に記述するように、分解性結合であり得る。
【００４０】
別の実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般構造を有する。
Ｑ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ビスホスホネートである。有利には、ＰＥＧは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、ｎは、約３〜約２０００である。
【００４１】
第三実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般式を有する。
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｘ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、同一または異なり得る；
各Ｘは、別個に、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレートおよび−Ｌ−Ｔからなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＸは、−Ｌ−Ｔではない；
Ｒは、中心コア分子（例えば、アミノ酸またはポリオール）である；
Ｌは、リンカーである；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である。
【００４２】
好ましくは、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、共に、ポリ（エチレングリコール）であり、そしてＲは、トリメチロールプロパン、ジ−トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、リジンおよびジ−リジンからなる群から選択される。
【００４３】
本発明のヒドロキシアパタイト標的重合体の好ましい実施態様の一部の例は、以下のように提示される。
【００４４】
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ、
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−マレイミド−ω−ＡＨＰＤＰ、
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸、
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−タンパク質、
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ、および
ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ＡＨＰＤＰ）４
ここで、−ＡＨＰＤＰは、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二リン酸を表わす。
【００４５】
本発明はまた、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体と生物学的活性剤との共役物を包含する。例えば、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を提供する。
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的部分である。
【００４６】
別の実施態様では、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を提供する。
Ｄ−Ｌ’−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得、そしてＴは、ビスホスホネートである。
【００４７】
さらに、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を包含する。
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、同一または異なり得る；
各Ａは、別個に、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である（アミノ酸またはポリオール）；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得る；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；
ｑは、２〜約３００の整数である。
【００４８】
本発明により、放出可能生物学的活性剤用のレザバとしてヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨表面）を利用する方法もまた提供される。該方法は、ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程を包含し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む。例えば、これらの生物学的活性剤について上で示した構造のいずれかにおいて、Ｌ、Ｌ’、ＰＯＬＹまたはＰＥＧ部分は、その中に、加水分解性または酵素分解性結合を含み得る。例えば、ＰＥＧは、この重合体骨格内にて、加水分解を受けるエステル結合により調製できる。この加水分解により、この重合体は、以下で示すように、低分子量断片に開裂される。
【００４９】
【化４】
好ましくは、この加水分解性または酵素分解性結合は、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、式
【００５０】
【化５】
のカルバメート結合（ここで、Ａｒは、アリール基である）、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される。しかしながら、当該技術分野で公知の他の分解性結合は、使用され得る。
【００５１】
治療有効量の該重合体構造は、例えば、骨含有哺乳動物に重合体構造の少なくとも一部が、ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合されるように投与される。放出可能生物学的活性剤が結合されたヒドロキシアパタイト標的化重合体構造は、最初は、生物内の骨または骨髄表面を標的化し、それにより、骨表面は、レザバまたはデポーとして使用する。その重合体骨格またはリンカーのいずれかに分解性結合が存在しているので、生物学的活性剤は、その結合が分解するにつれて、長時間にわたって、生物中に放出される。この様式において、この生物学的活性剤は、病気または他の病態を処置する生物の他の部分に送達される。放出された生物学的活性剤は、この分解性結合の配置に依存して、ネイティブな形状であり得るか、またはリンカーに結合され得るか、またはリンカーと重合体骨格断片とに結合され得る。この生物学的活性剤を骨につなぎ留めるか係留することにより、その生物学的活性剤の滞留時間は、長くでき、これにより、高い処置効能を得ることができる。
【００５２】
「治療有効量」は、多数の要因に依存しており、これには、処置する病態または疾患の性質および重症度、使用する生物学的活性剤の種類、被験体のサイズ、年齢および一般的な健康状態、ならびに他の要因が挙げられる。
【００５３】
この重合体構造は、種々の経路により投与され得、これには、経口、肺、静脈内、皮下、筋肉内、舌下、鼻内、眼内および直腸が挙げられる。この重合体構造はまた、１種またはそれ以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と共に投与され得る。
【００５４】
本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体はまた、他のリン酸カルシウム表面または被覆に結合するのに使用でき、これには、ヒドロキシアパタイト被覆補綴物装置およびリン酸カルシウム粒子が挙げられる。例えば、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体は、タンパク質および細胞の補綴物装置への吸着を防止するために、または生物学的活性剤用の合成的に製造した送達装置の一部分として、使用できる。
【００５５】
本発明はまた、上記のヒドロキシアパタイト標的化重合体およびその生物学的活性剤共役物を調製する方法を包含する。好ましい実施態様では、これらの活性化重合体は、重合体構造を提供することにより調製され、重合体構造は、直鎖または分枝鎖の水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、第一保護化学的反応性基に共有結合されており、そして第二末端は、第二化学的反応性基に共有結合されており、この第二化学的反応性基は、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される。適当な活性カーボネートおよび活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートが挙げられる。第二化学的反応性基は、ヒドロキシアパタイト標的化部分と反応して、ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造が形成される。第一保護化学的反応性基は、好ましくは、保護ヒドロキシル、保護アミン、保護カルボン酸、保護ヒドラジンおよび保護チオールからなる群から選択される。このようにして、この重合体の少なくとも１個の末端は、そのヒドロキシアパタイト標的化部分がそこに結合されないように、保護されている。これにより、少なくとも１個の末端が生物学的活性剤との引き続いた反応に利用できることを保証する。１実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分と反応させるために、以下の重合体構造が使用される：
【００５６】
【化６】
ここで、Ｘは、活性カーボネートまたは活性エステルであり、Ｙ’は、ベンジルであり、そしてｎは、約３〜約２０００である、この方法は、さらに、化学的反応性基が、例えば、生物学的活性剤との反応に利用できるように、第一保護化学的反応性基を脱保護する工程を包含する。
【００５７】
生物学的活性ヒドロキシアパタイト標的化重合体を製造する方法は、好ましくは、重合体構造を提供する工程を包含し、この重合体構造は、直鎖または分枝鎖の水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標識部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されている。この化学的反応性基は、生物学的活性剤が重合体構造の第二末端に結合して、生物学的活性ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を形成するように、生物学的活性剤と反応される。当業者に理解されるように、化学的反応性基の選択は、この生物学的活性剤で利用できる官能基に依存している。例えば、もし、この生物学的活性剤が、アミン、ヒドロキシルまたはチオール官能基を含有するなら、この化学的反応性基として、活性カーボネートまたは活性エステルが使用され得る。生物学的活性部分と反応するのに有用な特に好ましい化学的反応性基には、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルが挙げられる。この生物学的活性剤は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬剤、染料、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子またはミセルを含有する。１実施態様では、この生物学的活性剤は、少なくとも１個の水酸基を有する（例えば、キニジン、カンプトセシンおよびパクリタキセル）。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を説明するために示されており、本発明の限定と見なされるべきではない。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−プロピオン酸（５．０ｇ、０．００２５モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（０．８０ｇ、０．００３２モル）およびトリエチルアミン（１．０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この反応混合物をリン酸緩衝液２０ｍｌ（４％、ｐＨ＝３）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして冷ジエチルエーテル４００ｍｌに添加した。沈殿した生成物を濾過により除き、そして減圧下にて乾燥した。収量４．３ｇ。
【００６０】
【化７】
（実施例２）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸（４．３０ｇ、０．００１８３モル）の無水塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２２ｇ、０．００１９２モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、１．９２ｍｌ、０．００１９２モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．５ｇ。
【００６１】
【化８】
（実施例３）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３．０ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液に、ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ（０．９３ｇ）およびトリエチルアミン（０．２５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、減圧下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（５０ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで６．５まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．６ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量２．３ｇ。
【００６２】
【化９】
（実施例４）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−マレイミド−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ（２．０ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液に、β−マレイミドプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．９３ｇ）およびトリエチルアミン（０．２５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量１．８ｇ。
【００６３】
【化１０】
（実施例５）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸のベンジルエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸（１０ｇ、０．００５０モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．３０ｇ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．０ｇ）、ベンジルアルコール（１０．８ｇ、０．１００モル）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、７．５ｍｌ、０．００７５モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を約５０ｍｌまで濃縮し、濾過し、そして冷ジエチルエーテル８００ｍｌに添加した。沈殿した生成物を濾過により除き、そして減圧下にて、乾燥した。収量８．２ｇ。
【００６４】
【化１１】
（実施例６）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ベンゾトリアゾールカーボネート−ω−プロピオン酸のベンジルエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸のベンジルエステル（８．２ｇ、０．００２５モル）のアセトニトリル（８２ｍｌ）溶液に、ピリジン（０．９８ｍｌ）およびジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネート（１．４８ｇ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、そして乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量６．８ｇ。
【００６５】
【化１２】
（実施例７）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ベンゾトリアゾールカーボネート−ω−プロピオン酸のベンジルエステル（５．７ｇ、０．００２５モル）のアセトニトリル（４０ｍｌ）溶液に、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二ホスホン酸のジテトラブチルアンモニウム塩（ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ）（１．９２ｇ）およびトリエチルアミン（０．６０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（１００ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで７．２まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．６ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４５ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量４．７ｇ。
【００６６】
【化１３】
（実施例８）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸（４．７ｇ、０．００２０当量）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７０ｇ、０．００２４モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、２．４ｍｌ、０．００２４モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。最後に、その生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．６ｇ。
【００６７】
【化１４】
（実施例９）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのタンパク質へのカップリング）
モデルタンパク質として、リゾチームを使用したが、その位置では、任意のタンパク質で置換できる。リゾチーム（鶏卵白、ＭＷ＝１４，３００Ｄａ、４ｍｇ、２．８Ｅ−７モル）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２ｍｌに溶解した。低い程度のＰＥＧ化を行うために、このリゾチーム溶液に、約１．１ｍｇ（５．６Ｅ−７モル）のＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、そして室温で、５時間混合した。高い程度のＰＥＧ化を行うために、このリゾチーム溶液に、約５．６ｍｇ（２．８Ｅ−６モル）のＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、そして室温で、５時間混合した。各ＰＥＧ−リゾチーム多量体（１−ＰＥＧマー、２−ＰＥＧマー、３−ＰＥＧマー）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（その溶離緩衝液として、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を使う）で分離した。これらの多量体の純度の分析は、ゲルおよび毛細管電気泳動で決定した。各精製した多量体を使用して、ヒドロキシアパタイトへの共役結合の効率を決定した。
【００６８】
（実施例１０）
（インビトロでのヒドロキシアパタイトへのＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−タンパク質の結合）
ヒドロキシアパタイト（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｆｌｕｋａ、１２０ｍｇ）を、３７℃で、２４時間にわたって、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで平衡化した。このヒドロキシアパタイト懸濁液に、１：１の容量比で、ネイティブなリゾチームまたはＰＥＧ−リゾチーム共役物を混合し、そして３７℃で攪拌した。種々の時点で、この混合物から、試料を取り出し、そしてゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、未結合タンパク質またはＰＥＧ−タンパク質共役物の割合について分析した。ネイティブなリゾチームは、ヒドロキシアパタイトに吸着しなかったのに対して、１・１／２（１．５）時間のインキュベーションにより、この３−ＰＥＧマーおよび２−ＰＥＧマーの１００％が吸着した。この１−ＰＥＧマー共役物は、１・１／２時間のインキュベーション後、吸着が限定されていた。全ての試料は、類似のタンパク質濃度を有していた。
【００６９】
（実施例１１）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシン）
ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−アミン（２．０ｇ、０．００１０モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水アセトニトリル（３０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシンｐ−ニトロフェニルエステル（０．４２ｇ、０．００１０モル）およびトリエチルアミン（０．３ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、減圧下にて、溶媒を留去した。その残渣をＤＩ水２００ｍｌに溶解し、得られた溶液をアニオン交換樹脂で濾過して（ｐ−ニトロフェノールを除去し）、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．３ｇ）を添加した。この混合物を、室温で、４０ｐｓｉ水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、その生成物を塩化メチレンで抽出した。その抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下にて、溶媒を留去した。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．２５ｇ。
【００７０】
【化１５】
（実施例１２）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミノ−ω−プロピオン酸（２．５０ｇ、０．００１２モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水アセトニトリル（３０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシンｐ−ニトロフェニルエステル（０．５４ｇ、０．００１２モル）およびトリエチルアミン（０．５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、減圧下にて、溶媒を留去した。その残渣をＤＩ水２２０ｍｌに溶解し、得られた溶液をアニオン交換樹脂で濾過してｐ−ニトロフェノールを除去した。ＮａＣｌ（２０ｇ）を添加し、その溶液のｐＨを、５％リン酸で３．０に調節した。その生成物を塩化メチレンで抽出した。その抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下にて、溶媒を留去した。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．７５ｇ。
【００７１】
【化１６】
（実施例１３）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸（１．６６ｇ、０．０００７０モル）の無水塩化メチレン（２０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０８９ｇ、０．０００７７モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、０．７７ｍｌ、０．０００７７モル）を添加した。その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．２６ｇ。
【００７２】
【化１７】
（実施例１４）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．１５ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（１５ｍｌ）溶液に、ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ（０．３６ｇ）およびトリエチルアミン（０．１０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（５０ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（２０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで６．５まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．３ｇ）を添加した。この混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。湿潤生成物を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、この生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量０．６５ｇ。
【００７３】
【化１８】
（実施例１５）
（インビトロでのヒドロキシアパタイトへのＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰおよび他のＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体の結合）
ヒドロキシアパタイト（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｆｌｕｋａ、１２ｍｇ）を、３７℃で、２４時間にわたって、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで平衡化した。このヒドロキシアパタイト懸濁液に、１：１の容量比で、ＡＨＰＤＰ、ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−ヒドロキシ、ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシン、ＰＥＧ（５，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ、およびＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ誘導体を、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．２）にて、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、個々に混合し、そして３７℃で攪拌した。種々の時点で、各混合物から、試料を取り出し、そしてゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、未結合ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体の割合について分析した。ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−ヒドロキシおよびＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシンは、ヒドロキシアパタイトに全く吸着を示さなかったのに対して、このＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体は、８時間のインキュベーションにより１００％が吸着を示した。ＡＨＰＤＰは、１分程度の吸着半減期を有していたのに対して、ＰＥＧ（５，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰおよびＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ誘導体は、それぞれ、４５分および１９分の吸着半減期を有していた。
【００７４】
（実施例１６）
（マウスでのＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンＩ１２５−ω−ＡＨＰＤＰの排泄研究）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰおよびｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンを、標準クロラミン−Ｔ手順（Ｂｏｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２４：１８〜２９，１９８６）を使用して、ヨウ素化した。要約すると、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰまたはｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン（２μｇ／μＬの全重量）の１５μＬアリコートを、５０ｍＭリン酸緩衝液５０μＬと混合した。これに、ＮａＩ１２５（１ｍＣｉ）およびクロラミン−Ｔ（１μｇ／μＬ）１０μＬを添加した。この混合物を、３０秒間にわたって、指で渦流にし、続いて、Ｌ−Ｃｙｓ（２μｇ／μＬ）１００μＬを添加し、続いて、さらに３０秒間にわたって、指で渦流にした。その精製は、逆相クロマトグラフィーにより実行した。それらの試料を、３７℃で、１．５ｍｌ／分で、３０分間にわたって、０．１％水性ＴＦＡに対するアセトニトリル（１９〜６３％）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の曲線勾配を使用して、溶出した。
【００７５】
オスＩＣＲマウス（２０〜２５ｇ）に、尾静脈注射（１００μＬ；ｉ．ｖ．）によって、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰまたはｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンのいずれか（２μＣｉ）を投与した。このマウスを代謝ケージに配置し、以下の時点で、尿および糞を集めた（注射の１、２、３、４、６および８時間後）（ｎ＝６）。これらの試料をガンマカウンタで数え、そのカウント数を、注射した全カウント数の割合に変換した。ｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンは、４７．５％の平均捕獲［１２５Ｉ］％を有しており、放射標識化合物の９５％以上が尿に排泄された。ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰは、８時間の過程中、ｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンよりも著しく低い割合（５分の１）の捕獲［１２５Ｉ］（７．７％）を有しており、再度、放射標識化合物の約９５％が尿に排泄された。これらの２種の化合物は、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰが体内での著しく高い［１２５Ｉ］保持割合を生じたこと以外は、８時間にわたって、類似の排出プロフィールを生じた。
【００７６】
（実施例１７）
（ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ＡＨＰＤＰ）４）
ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ベンゾトリアゾールカーボネート）４（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（４．２ｇ、０．０００４２モル）のアセトニトリル（４０ｍｌ）溶液に、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二ホスホン酸のジテトラブチルアンモニウム塩（ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ）（１．３２ｇ）およびトリエチルアミン（０．４ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（１００ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。次に、この水を、減圧下にて留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．１ｇ。
【００７７】
【化１９】
（実施例１８）
（ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
【００７８】
【化２０】
ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（３．４０ｇ、約１．００ｍｍｏｌ）、キニジン（０．４９ｇ、約１．５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（触媒量）およびＤＭＡＰ（０．１５ｇ、約１．２３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）に溶解した。この溶液をＤＣＣ（０．３１ｇ、約１．５０ｍｍｏｌ）（これは、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解した）で処理し、そして室温で、アルゴン下にて、一晩（約８時間）攪拌させた。その溶媒を真空下にて除去し、その残渣のシロップをトルエン（２５ｍｌ）に溶解し、そしてセライト（ｃｅｌｉｔｅ）のプラグで濾過した。そのトルエンを真空下にて除去し、そのシロップをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）に溶解した。ジエチルエーテルに添加して、白色沈殿物として、生成物が得られ、これを、濾過により集め、そして真空下にて乾燥した（収量２．７７ｇ、約８１％）。
【００７９】
（実施例１９）
（ＰＥＧ（３，４００）−α−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル（２．５０ｇ）をエチルアルコールに溶解し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．５ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、エタノールを留去した。収量２．１ｇ。その生成物のＮＭＲスペクトルにより、ＰＥＧ骨格に結合したアミン基が完全に脱保護されていることが示された。
【００８０】
（実施例２０）
（ＰＥＧ（５，４００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮＨＳエステル（１．２２ｇ、０．０００５０モル）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、ＰＥＧ（３，４００）−α−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル（１．８９ｇ、０．０００５０モル）を添加し、続いて、トリエチルアミン（０．１０ｍｌ）を添加した。この混合物を、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この反応生成物をエチルエーテルで沈殿し、そして減圧下にて乾燥した。収量３．０１ｇ。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、分子量５，７００Ｄａの生成物が形成されたことが示された（９８％）。
【００８１】
緩衝液（ｐＨ７．３）中でのＰＥＧ（５，４００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のキニジンエステルにおけるエステルの加水分解半減期は、２３９時間（２２℃で）および４６時間（３７℃で）であり、キニジンの放出を引き起こした。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の化合物（重合体構造）などが提供される。
（項１） 単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない、
重合体構造。
（項２） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項３） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、ビスホスホネートである、上記項１に記載の重合体構造。
（項４） 前記ビスホスホネートが、以下の構造を有する、上記項３に記載の重合体構造：
【化１】
ここで、ＹおよびＺは、独立して、水素、−ＯＨ、ハロゲン、アリール、置換アリール、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＳＨおよびＳＲ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリールまたは置換アリールであり、そしてＷは、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、Ｎａ＋およびＫ＋からなる群から選択される、
重合体構造。
（項５） Ｙが、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐが、約２〜約６であり、Ｚが、−ＯＨであり、そして各Ｗが、水素である、上記項４に記載の重合体構造。
（項６） 前記化学的反応性基が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項７） 前記化学的反応性基が、保護アミンまたは保護ヒドラジンであり、ここで、該保護基が、ｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項８） 前記化学的反応性基が、保護チオールであり、ここで、該保護基が、オルトピリジルジスルフィドである、上記項１に記載の重合体構造。
（項９） 前記化学的反応性基が、保護カルボン酸または保護ヒドロキシルであり、ここで、該保護基が、ベンジルである、上記項１に記載の重合体構造。
（項１０） 前記化学的反応性基が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項１１） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項１２） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）である、上記項１に記載の重合体構造。
（項１３） 前記重合体骨格が、ポリ（エチレングリコール）である、上記項１２に記載の重合体構造。
（項１４） 前記ポリ（アルキレングリコール）骨格が、加水分解性または酵素分解性結合を含む、上記項１２に記載の重合体構造。
（項１５） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項１４に記載の重合体構造。
（項１６） 前記重合体骨格が、２個〜約３００個の末端を有する、上記項１に記載の重合体構造。
（項１７） 前記重合体骨格が、以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｑ−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である、
重合体構造。
（項１８） ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項１９） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２０） ＰＯＬＹが、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２１） Ｔが、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２２） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２３） Ｑが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２４） Ｑが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２５） 以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｑ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、該化学的反応性基は、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択され、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ビスホスホネートである、
重合体構造。
（項２６） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項２５に記載の重合体構造。
（項２７） 以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｘ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ｘは、独立して、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレートおよびＬ−Ｔからなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＸは、ヒドロキシアパタイト標的化部分ではない；
Ｒは、中心コア分子である；
Ｌは、リンカーである；
Ｔは、該ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である、
重合体構造。
（項２８） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項２７に記載の重合体構造。
（項２９） Ｒが、トリメチロールプロパン、ジ−トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、リシンおよびジ−リシンからなる群から選択される、上記項２７に記載の重合体構造。
（項３０） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項２７に記載の重合体構造。
（項３１） ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
重合体構造。
（項３２） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項３１に記載の重合体構造。
（項３３） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよく、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分であり、ここで、ＰＯＬＹ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、重合体構造。
（項３４） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項３３に記載の重合体構造。
（項３５） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ａは、独立して、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよい；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；
ｑは、２〜約３００の整数である；ここで、ＰＯＬＹａ、ＰＯＬＹｂ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
重合体構造。
（項３６） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項３５に記載の重合体構造。
（項３７） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｄは、少なくとも１個の水酸基を有する生物学的活性剤であり、Ｌは、加水分解安定結合であり、Ｌ’は、加水分解性結合であり、そしてＴは、ビスホスホネート部分である、
重合体構造。
（項３８） Ｌ’が、エステル、カーバメート、カーボネートおよびアセタールからなる群から選択される、上記項３７に記載の重合体構造。
（項３９） Ｌが、エーテル、チオ−エーテル、アミドおよびカーバメートからなる群から選択される、上記項３７に記載の重合体構造。
（項４０） 単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
該重合体構造を提供する工程であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、第一保護化学的反応性基に共有結合されており、そして第二末端は、第二化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該第二化学的反応性基は、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、工程；ならびに
該第二化学的反応性基をヒドロキシアパタイト標的化部分と反応させて、ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を形成する工程、
を包含する、方法。
（項４１） 前記第一保護化学的反応性基が、保護ヒドロキシル、保護アミン、保護カルボン酸、保護ヒドラジンおよび保護チオールからなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４２） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ならびにそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４３） 前記第二化学的反応性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートからなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４４） 前記提供する工程が、以下の構造を有する重合体構造を提供する工程を包含する、上記項４０に記載の方法：
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｙ’
ここで、Ｘは、活性カーボネートまたは活性エステルであり、Ｙ’は、ベンジルであり、そしてｎは、約３〜約２０００である、
方法。
（項４５） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４６） さらに、以下の工程：
前記第一化学的反応性基を脱保護する工程；
該脱保護第一化学的反応性基を活性カーボネートまたは活性エステルに変換する工程；
該活性カーボネートまたは活性エステルを生物学的活性剤と反応させて、該生物学的活性剤が前記重合体構造に結合するようにする工程、
を包含する、上記項４０に記載の方法。
（項４７） 前記生物学的活性剤が、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、色素、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルからなる群から選択される、上記項４６に記載の方法。
（項４８） 放出可能な生物学的活性剤用のレザバとして生物中の骨表面を利用する方法であって、該方法は、以下の工程：
ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、方法；ならびに
治療有効量の該重合体構造を骨含有生物に投与して、該重合体構造の少なくとも一部が該ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合されるようにする工程、
を包含する、方法。
（項４９） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項４８に記載の方法。
（項５０） 前記ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造が、以下の構造を有する、上記項４８に記載の方法：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよく、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分であり、ここで、ＰＯＬＹ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、方法。
（項５１） ＰＯＬＹが、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、上記項５０に記載の方法。
（項５２） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項５０に記載の方法。
（項５３） 前記ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造が、以下の構造を有する、上記項４８に記載の方法：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ａは、独立して、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよい；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である；ここで、ＰＯＬＹａ、ＰＯＬＹｂ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
方法。
（項５４） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項５３に記載の方法。
（項５５） 前記投与する工程が、経口、肺、静脈内、皮下、筋肉内、舌下、鼻内、眼内および直腸からなる群から選択される経路により、前記重合体構造を投与する工程を包含する、上記項４８に記載の方法。
（項５６） 前記投与する工程が、少なくとも１種の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と共に前記重合体構造を投与する工程を包含する、上記項４８に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリ（エチレングリコール）および関連する親水性重合体の誘導体、それらの合成方法、およびそれらの重合体により修飾された表面および分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
親水性重合体であるポリ（エチレングリコール）（略してＰＥＧであり、これは、ポリ（エチレンオキシド）、略してＰＥＯとしても知られている）の分子および表面への共有結合は、生物工学および医学において、非常に有用である。最も一般的な形態では、ＰＥＧは、各末端が水酸基で終わっている直鎖重合体である：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
上記重合体であるα，ω−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）は、−ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨの省略形で表わすことができ、この場合、−ＰＥＧ−との記号は、以下の構造を表わすことが理解されている：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
ここで、ｎは、典型的には、約３〜約４０００の範囲である。
【０００３】
ＰＥＧは、通例、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（略してｍＰＥＧ）として使用され、ここで、１端は、比較的不活性なメトキシ基であるのに対して、他端は、即座に化学修飾を受ける水酸基である。ｍＰＥＧの構造を、以下で示す。
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体は、その化学的性質の点で、ＰＥＧに密接に関連しており、それらは、多くの用途において、ＰＥＧの代わりに使用できる。
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨＲＯ（ＣＨ２ＣＨＲＯ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ここで、Ｒ＝Ｈまたはアルキル（例えば、ＣＨ３）である。
【０００４】
ＰＥＧは、水および多くの有機溶媒中での溶解性、無毒性、および無免疫原性という性質を有する重合体である。ＰＥＧの１用途には、この重合体を不溶分子に共有結合して得られるＰＥＧ−分子「結合体」を可溶性にすることがある。例えば、水不溶性薬剤であるパクリタキセルは、ＰＥＧと結合すると、水溶性となることが明らかとなっている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１〜３３６（１９９５）。
【０００５】
ＰＥＧを分子（例えば、タンパク質）と結合するためには、しばしば、その末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を調製するために、そのＰＥＧを「活性化」する必要がある。この官能基は、このタンパク質上の特定部分（例えば、アミノ基）と反応でき、それにより、ＰＥＧ−タンパク質結合体を形成する。ＰＥＧの多くの活性化誘導体が記述されている。このような活性化誘導体の一例には、スクシンイミジルスクシネート「活性エステル」がある。
【０００６】
【化２】
以下、このスクシンイミジル活性エステル部分は、−ＣＯ２−ＮＳと表わす。
【０００７】
ＰＥＧの化学的性質の応用が洗練されるにつれて、ヘテロ官能性ＰＥＧ、すなわち、異なる末端基を有するＰＥＧがますます必要とされている：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｙ
ここで、ＸおよびＹは、異なる基である。適当な官能基を有するこのようなヘテロ二官能性ＰＥＧは、ＰＥＧを表面または生物学的活性分子に結合するのに使用され得、その他端は、例えば、生物学的活性分子、リポソームまたはバイオセンサに結合するのに使用され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１〜３３６（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物工学分野では、１種またはそれ以上の種々の物質（他の重合体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、オリゴヌクレオチド、脂質、リポソーム、細胞、薬物、表面、および他の生物学的活性部分を含めて）と結合体化するのに適した活性化重合体を継続的に開発することが望まれている。さらに、標的化または長時間放出処方に使用できる活性化重合体を開発できれば、有利となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、体内での寿命を持続させて生物学的活性剤を送達するために、ヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨）を利用する。ポリエチレングリコールは、しばしば、生物学的活性分子と共有結合されて、その循環半減期を長くするが、いくつかの結合体の滞留時間は、最適以下のままである。以下でさらに詳細に記述される本発明により提供される、体内での滞留時間の延長およびヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨）の標的化から利益を得る多くの生物学的活性剤（ポリペプチドおよび小薬剤分子の両方）が存在する。
【００１１】
本発明は、単離可能な活性化ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を提供し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基または保護された化学的反応性基に共有結合されている。例えば、前記ヒドロキシアパタイト標的化部分は、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択できる。前記化学的反応性基または保護された化学的反応性基は、好ましくは、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される。前記重合体骨格は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物を含有し得る。
【００１２】
前記化学的反応性基を生物学的活性剤と反応させることにより、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体は、生物学的活性剤を表面（例えば、骨表面）につなぎ留めるのに使用できる。該ヒドロキシアパタイト標的化重合体およびそれらの生物学的活性剤共役物の調製方法もまた、提供されている。
【００１３】
１実施態様では、本発明は、放出可能生物学的活性剤用のレザバとして骨を有する生物（例えば、哺乳動物）中の骨表面を利用する方法を提供する。該方法は、ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程を包含し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む。治療有効量の該重合体構造が骨を有する生物に投与され、該重合体構造の少なくとも一部が該ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合される。好ましくは、前記加水分解または酵素分解性結合は、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される。前記放出可能生物学的活性剤を備えたヒドロキシアパタイト標的重合体構造は、最初は、前記生物内の骨または骨髄表面を標的にし、それにより、該骨表面は、レザバまたはデポーとして使用する。該生物学的活性剤は、その分解性結合が分解するにつれて、長時間にわたって、該生物から放出される。
【発明の効果】
【００１４】
それゆえ、本発明により、生物学的活性剤は、インビボでヒドロキシアパタイト表面に係留でき、そして病気を治療するために、長時間にわたって、前記生物の他の部分に送達できるようになる。このようにして、前記生物学的活性剤の滞留時間は、延ばすことができ、その治療の効能が改善できる。それに加えて、本発明の活性化重合体誘導体は単離可能であり、その結果、その重合体が生物学的活性剤に結合する前に分離され精製でき、それにより、該生物学的活性重合体の収率および純度が高められる
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「反応性部位」、「化学的反応性基」および「化学的反応性部分」との用語は、当該技術分野で使用され、本明細書中では、ある分子の別個の定義できる部分または単位を意味する。これらの用語は、化学分野において、ある程度、同義であり、本明細書中では、ある機能または活性を発揮し、他の分子と反応性である分子部分を意味するように使用される。
【００１６】
「結合」または「リンカー」との用語は、本明細書中にて、通常、化学反応の結果として形成される基または結合であって、典型的には、共有結合された基または結合を意味するように使用される。加水分解に安定な結合とは、それらの結合が、水中で実質的に安定であり、例えば、有用なｐＨで、生理学的条件下にて、長時間（好ましくは、永久に）、水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の結合とは、その結合が、水中または水溶液（例えば、血液を含めて）中で分解性であることを意味する。酵素不安定性または分解性結合とは、その結合が、１種またはそれ以上の酵素で分解できることを意味する。
【００１７】
本明細書中で使用する「化合物」との用語は、固相、液相または気相にあろうと、粗混合物中であろうと精製され単離されていようと、化学物質を意味すると解釈される。「アルキル」、「アルケン」および「アルコキシ」との用語は、それぞれ、直鎖および分枝のアルキル、アルケンおよびアルコキシを含む。「低級アルキル」との用語は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを意味する。「アルコキシ」との用語は、例えば、式−ＯＲまたは−ＲＯＲ１の酸素置換アルキルを意味し、ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ別個に、選択したアルキルである。「置換アルキル」および「置換アルケン」との用語は、それぞれ、１個またはそれ以上の非妨害置換基（例えば、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど）；アセチレン；シアノ；アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）；低級アルカノイルオキシ（例えば、アセトキシ）；ヒドロキシ；カルボキシ；アミノ；低級アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ）；ケトン；ハロ（例えば、クロロまたはブロモ）；フェニル；置換フェニルなど）で置換されたアルキルおよびアルケンを意味する。「ハロゲン」との用語は、フッ素、塩素、ヨウ素および臭素を含む。
【００１８】
「アリール」とは、１個またはそれ以上の芳香環を意味し、これらは、それぞれ、５個または６個の炭素原子を有する。複数のアリール環は、ナフチルのように縮合され得、またはビフェニルのように非縮合であり得る。アリール環はまた、１個またはそれ以上の環状炭化水素環、ヘテロアリール環または複素環で縮合され得るか、非縮合であり得る。
【００１９】
「置換アリール」とは、置換基として１個またはそれ以上の非妨害基を有するアリールである。
【００２０】
「非妨害置換基」とは、安定な化合物を生じる基である。適当な非妨害置換基またはラジカルには、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ６〜Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍは、１〜８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０チオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１２アリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１２アリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、各ｍは、１〜８である）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する各Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、アラルキルまたはアルカリールである。
【００２１】
「アミノ酸」との用語は、全ての必須アミノ酸および非必須アミノ酸を含む。本明細書中では、当該技術分野で公知の標準的なアミノ酸の略語が使用されている。
【００２２】
「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」または「生物学的活性剤」との用語は、本明細書中で使用するとき、生物生物（ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかの物理的特性または生化学的特性に影響を与えることができる任意の物質を意味する。特に、本明細書中で使用する生物学的活性分子には、ヒトまたは他の動物における病気の診断、治療改善、治療または予防を目的としている任意の物質であるか、そうでなければ、ヒトまたは動物の物理的または精神的健康を高める任意の物質を含む。生物学的活性分子の例には、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬剤、染料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するのに適当な生物学的活性剤のクラスには、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管剤、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
「単離可能」との用語は、これらの活性化重合体が、生物学的活性剤と結合する前に、他の化合物から単離または分離できることを意味すると解釈される。許容できる単離または精製レベルは、種々の要因（例えば、精製の難易度、存在している汚染化合物の種類など）に依存している。このヒドロキシアパタイト標的化活性化重合体を生物学的活性剤に結合する前に単離または分離することにより、良好な収率および純度が達成される。それに加えて、この生物学的活性剤を取り込む前に、これらの重合体誘導体を単離すると、その重合体の定量分析および定性分析が可能となり、これは、次いで、この生物学的活性生成物の全体的な性質を高める。単離可能なヒドロキシアパタイト標的化活性化重合体を生物学的活性剤に結合するのに利用できるようにすると、組成の明確な結合体が得られ、この組成は、調節機関に簡単に伝達できる。下記の実施例で例示しているように、これらの活性化重合体誘導体は、一般に、沈殿に続いて溶媒抽出および／またはクロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により、単離され精製される。
【００２４】
本発明は、単離可能ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を提供し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない。
【００２５】
この重合体骨格は、実質的に非免疫原性の重合体（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））である。しかしながら、本発明を実施するのに使用するために、他の関連した重合体もまた適当であること、そしてＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）との用語の使用が、この点で、包括的であり限定的ではないことが理解できるはずである。好ましくは、この重合体骨格は、２〜約３００個の末端を有する。
【００２６】
ＰＥＧは、典型的には、透明で、無色無臭で、水溶性で、熱に安定であり、多くの化学試薬に不活性であり、加水分解または劣化せず、一般に、非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられており、すなわち、ＰＥＧは、害を及ぼすことなく、生体組織または生物と共存できる。さらに具体的には、ＰＥＧは、非免疫原性である、すなわち、ＰＥＧは、体内で免疫応答を生じる傾向がない。ＰＥＧは、体内である種の望ましい機能を有する分子（例えば、生物学的活性剤）と結合すると、その活性剤を遮蔽する傾向があり、生物が活性剤の存在に耐えることができるように、何らかの免疫応答をなくすか少なくできる。ＰＥＧ結合体は、実質的な免疫応答を生じないか凝固または他の望ましくない効果を引き起こさない傾向にある。ＰＥＧは、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは、約３〜約４０００、好ましくは、約３〜約２０００である）を有し、本発明を実施する際に有用な１重合体である。好ましくは、この重合体骨格として、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧが使用される。
【００２７】
この重合体骨格は、直鎖または分枝であり得る。分枝重合体骨格は、一般に、当該技術分野で公知である。典型的には、分枝重合体は、中心分枝コア部分と、その中心分枝コアに結合された複数の直鎖重合体鎖とを有する。ＰＥＧは、通例、分枝形状で使用され、これは、エチレンオキシドを種々のポリオール（例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）に付加することにより、調製できる。この中心コア部分はまた、数種のアミノ酸（例えば、リジン）から誘導できる。この分枝ポリエチレングリコールは、一般式Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表わすことができ、ここで、Ｒは、このコア部分（例えば、グリセロールまたはペンタエリスリトール）を表わし、そしてｍは、アームの数を表わす。
【００２８】
本発明では、他の多くの重合体もまた適当である。これらの重合体は、直鎖形状または分枝形状のいずれかであり、これらには、他のポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（プロピレン）グリコール（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体など）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元重合体、誘導体および混合物が挙げられるが、これらに限定されない。この重合体骨格の各鎖の分子量は、変化し得るが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、好ましくは、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００２９】
当業者は、実質的に水溶性で非免疫原性の重合体骨格についての前述のリストが、決して、全てを網羅するものではなく、単に例示であること、また、上記性質を有する全ての重合体材料が考慮されることを認識している。
【００３０】
このヒドロキシアパタイト標的化部分は、ヒドロキシアパタイト表面（すなわち、リン酸カルシウム）（例えば、骨）に結合できるかそれに対して化学親和性を示し得る任意の部分を含み得る。このヒドロキシアパタイト標的化部分は、好ましくは、任意のヒドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム表面に結合し得る。１実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分は、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される。特に好ましい実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分は、ビスホスホネートである。
【００３１】
本発明で使用するのに適当なビスホスホネートの一例を、以下に示す。
【００３２】
【化３】
ここで、ＹおよびＺは、別個に、水素、−ＯＨ、ハロゲン、アリール、置換アリール、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＳＨおよびＳＲ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリールまたは置換アリールであり、そしてＷは、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、Ｎａ＋およびＫ＋からなる群から選択される。好ましくは、Ｙは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐは、約２〜約６であり、Ｚは、−ＯＨであり、そして各Ｗは、水素である。特に好ましいビスホスホネートは、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二リン酸である。
【００３３】
ビスホスホネートは、２個の炭素−リン含有結合により特徴付けられ、ピロリン酸塩のＰ−Ｏ−Ｐ（リン−酸素−リン）結合において、酸素が炭素で置き換えられ、そのＰ−Ｃ−Ｐ結合は、化学的および酵素的な加水分解に対して耐性を与える。この炭素原子上の異なる置換基は、いくつかの異なるビスホスホネートを作り出し、各々は、その独自の薬理学的特性を有する。エチドロン酸は、その炭素原子上に水酸基およびメチル基という置換基を含み、治療で使用するビスホスホネートのうち、骨内で９０日を超える半減期を有する最初のビスホスホネートであった。引き続いて、他のさらに強力なビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）が開発され、これは、その炭素原子上に、アルキルアミンおよび水酸基という置換基を有する。
【００３４】
ビスホスホネートは、ヒドロキシアパタイト結晶に対して強力な親和性を有し、また、かなり高い用量で、物理化学的機構により、インビボでの骨の石灰化を阻害する。ビスホスホネートは、代謝されず、吸収され、排泄され、変化せずに保存されるようである。しかしながら、ビスホスホネートのある種のアナログの側鎖は、修飾され得る。吸収された画分の２０〜６０％が骨格に急速に吸収されるので、血漿クリアランスは、急速である（２時間程度の半減期）。その残りは、尿から排泄される。骨内での半減期は、非常に長く、ビスホスホネートの放出は、これらの化合物を吸収する骨の再吸収後にのみ生じる。
【００３５】
骨に対するビスホスホネートおよび他のヒドロキシアパタイト標的化部分の強力な親和性により、本発明の重合体は、生物学的活性剤のためのヒドロキシアパタイト標的化送達システムとして、使用することが可能となる。好ましくは、これらの単離可能な活性化ヒドロキシアパタイト標的化重合体は、単一工程で、この生物学的活性剤に効率的に結合できる。
【００３６】
上記のように、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体構造は、保護または未保護化学的反応性基に結合した少なくとも１個の末端を有する。この化学的反応性基は、好ましくは、生物学的活性剤の官能基に結合するのに適当である。適当な化学的反応性基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートが挙げられる。
【００３７】
当該技術分野で理解されているように、「保護」との用語は、特定反応条件下にて、化学的反応性基の反応を阻止する保護基または部分の存在を意味する。この保護基は、保護する化学的反応性基の種類に依存して変化し得る。例えば、もし、この化学的反応性基がアミンまたはヒドラジドであるなら、その保護基は、好ましくは、第三級ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択される。もし、この化学的反応性基がチオールであるなら、その保護基は、好ましくは、オルトピリジルジスルフィドである。もし、この化学的反応性基がカルボン酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）または水酸基であるなら、その保護基は、好ましくは、ベンジルである。当該技術分野で公知の他の保護基もまた、本発明で使用され得る。
【００３８】
１実施態様では、この化学的反応性基は、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾールカーボネート）および活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）からなる群から選択される。
【００３９】
１つの有用なヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般式を有する。Ｑ−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である。好ましくは、ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール））であり、これは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、そしてＴは、ビスホスホネートである。リンカーＬは、このヒドロキシアパタイト標的化部分を重合体骨格に結合するのに使用される官能基の残基である。例えば、リンカーＬは、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合またはカーバメート結合からなる群から選択される加水分解に安定な結合であり得る。リンカーＬはまた、以下でさらに詳細に記述するように、分解性結合であり得る。
【００４０】
別の実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般構造を有する。
Ｑ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ビスホスホネートである。有利には、ＰＥＧは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、ｎは、約３〜約２０００である。
【００４１】
第三実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化重合体は、以下の一般式を有する。
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｘ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、同一または異なり得る；
各Ｘは、別個に、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレートおよび−Ｌ−Ｔからなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＸは、−Ｌ−Ｔではない；
Ｒは、中心コア分子（例えば、アミノ酸またはポリオール）である；
Ｌは、リンカーである；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である。
【００４２】
好ましくは、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、共に、ポリ（エチレングリコール）であり、そしてＲは、トリメチロールプロパン、ジ−トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、リジンおよびジ−リジンからなる群から選択される。
【００４３】
本発明のヒドロキシアパタイト標的重合体の好ましい実施態様の一部の例は、以下のように提示される。
【００４４】
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ、
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−マレイミド−ω−ＡＨＰＤＰ、
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸、
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−タンパク質、
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ、および
ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ＡＨＰＤＰ）４
ここで、−ＡＨＰＤＰは、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二リン酸を表わす。
【００４５】
本発明はまた、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体と生物学的活性剤との共役物を包含する。例えば、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を提供する。
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的部分である。
【００４６】
別の実施態様では、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を提供する。
Ｄ−Ｌ’−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得、そしてＴは、ビスホスホネートである。
【００４７】
さらに、本発明は、以下の一般式のヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体を包含する。
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、同一または異なり得る；
各Ａは、別個に、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である（アミノ酸またはポリオール）；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一または異なり得る；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；
ｑは、２〜約３００の整数である。
【００４８】
本発明により、放出可能生物学的活性剤用のレザバとしてヒドロキシアパタイト表面（例えば、骨表面）を利用する方法もまた提供される。該方法は、ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程を包含し、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む。例えば、これらの生物学的活性剤について上で示した構造のいずれかにおいて、Ｌ、Ｌ’、ＰＯＬＹまたはＰＥＧ部分は、その中に、加水分解性または酵素分解性結合を含み得る。例えば、ＰＥＧは、この重合体骨格内にて、加水分解を受けるエステル結合により調製できる。この加水分解により、この重合体は、以下で示すように、低分子量断片に開裂される。
【００４９】
【化４】
好ましくは、この加水分解性または酵素分解性結合は、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、式
【００５０】
【化５】
のカルバメート結合（ここで、Ａｒは、アリール基である）、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される。しかしながら、当該技術分野で公知の他の分解性結合は、使用され得る。
【００５１】
治療有効量の該重合体構造は、例えば、骨含有哺乳動物に重合体構造の少なくとも一部が、ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合されるように投与される。放出可能生物学的活性剤が結合されたヒドロキシアパタイト標的化重合体構造は、最初は、生物内の骨または骨髄表面を標的化し、それにより、骨表面は、レザバまたはデポーとして使用する。その重合体骨格またはリンカーのいずれかに分解性結合が存在しているので、生物学的活性剤は、その結合が分解するにつれて、長時間にわたって、生物中に放出される。この様式において、この生物学的活性剤は、病気または他の病態を処置する生物の他の部分に送達される。放出された生物学的活性剤は、この分解性結合の配置に依存して、ネイティブな形状であり得るか、またはリンカーに結合され得るか、またはリンカーと重合体骨格断片とに結合され得る。この生物学的活性剤を骨につなぎ留めるか係留することにより、その生物学的活性剤の滞留時間は、長くでき、これにより、高い処置効能を得ることができる。
【００５２】
「治療有効量」は、多数の要因に依存しており、これには、処置する病態または疾患の性質および重症度、使用する生物学的活性剤の種類、被験体のサイズ、年齢および一般的な健康状態、ならびに他の要因が挙げられる。
【００５３】
この重合体構造は、種々の経路により投与され得、これには、経口、肺、静脈内、皮下、筋肉内、舌下、鼻内、眼内および直腸が挙げられる。この重合体構造はまた、１種またはそれ以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と共に投与され得る。
【００５４】
本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体はまた、他のリン酸カルシウム表面または被覆に結合するのに使用でき、これには、ヒドロキシアパタイト被覆補綴物装置およびリン酸カルシウム粒子が挙げられる。例えば、本発明のヒドロキシアパタイト標的化重合体は、タンパク質および細胞の補綴物装置への吸着を防止するために、または生物学的活性剤用の合成的に製造した送達装置の一部分として、使用できる。
【００５５】
本発明はまた、上記のヒドロキシアパタイト標的化重合体およびその生物学的活性剤共役物を調製する方法を包含する。好ましい実施態様では、これらの活性化重合体は、重合体構造を提供することにより調製され、重合体構造は、直鎖または分枝鎖の水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、第一保護化学的反応性基に共有結合されており、そして第二末端は、第二化学的反応性基に共有結合されており、この第二化学的反応性基は、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される。適当な活性カーボネートおよび活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートが挙げられる。第二化学的反応性基は、ヒドロキシアパタイト標的化部分と反応して、ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造が形成される。第一保護化学的反応性基は、好ましくは、保護ヒドロキシル、保護アミン、保護カルボン酸、保護ヒドラジンおよび保護チオールからなる群から選択される。このようにして、この重合体の少なくとも１個の末端は、そのヒドロキシアパタイト標的化部分がそこに結合されないように、保護されている。これにより、少なくとも１個の末端が生物学的活性剤との引き続いた反応に利用できることを保証する。１実施態様では、このヒドロキシアパタイト標的化部分と反応させるために、以下の重合体構造が使用される：
【００５６】
【化６】
ここで、Ｘは、活性カーボネートまたは活性エステルであり、Ｙ’は、ベンジルであり、そしてｎは、約３〜約２０００である、この方法は、さらに、化学的反応性基が、例えば、生物学的活性剤との反応に利用できるように、第一保護化学的反応性基を脱保護する工程を包含する。
【００５７】
生物学的活性ヒドロキシアパタイト標的化重合体を製造する方法は、好ましくは、重合体構造を提供する工程を包含し、この重合体構造は、直鎖または分枝鎖の水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標識部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されている。この化学的反応性基は、生物学的活性剤が重合体構造の第二末端に結合して、生物学的活性ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を形成するように、生物学的活性剤と反応される。当業者に理解されるように、化学的反応性基の選択は、この生物学的活性剤で利用できる官能基に依存している。例えば、もし、この生物学的活性剤が、アミン、ヒドロキシルまたはチオール官能基を含有するなら、この化学的反応性基として、活性カーボネートまたは活性エステルが使用され得る。生物学的活性部分と反応するのに有用な特に好ましい化学的反応性基には、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルが挙げられる。この生物学的活性剤は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬剤、染料、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子またはミセルを含有する。１実施態様では、この生物学的活性剤は、少なくとも１個の水酸基を有する（例えば、キニジン、カンプトセシンおよびパクリタキセル）。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を説明するために示されており、本発明の限定と見なされるべきではない。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−プロピオン酸（５．０ｇ、０．００２５モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（０．８０ｇ、０．００３２モル）およびトリエチルアミン（１．０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この反応混合物をリン酸緩衝液２０ｍｌ（４％、ｐＨ＝３）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして冷ジエチルエーテル４００ｍｌに添加した。沈殿した生成物を濾過により除き、そして減圧下にて乾燥した。収量４．３ｇ。
【００６０】
【化７】
（実施例２）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸（４．３０ｇ、０．００１８３モル）の無水塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２２ｇ、０．００１９２モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、１．９２ｍｌ、０．００１９２モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．５ｇ。
【００６１】
【化８】
（実施例３）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３．０ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液に、ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ（０．９３ｇ）およびトリエチルアミン（０．２５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、減圧下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（５０ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで６．５まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．６ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量２．３ｇ。
【００６２】
【化９】
（実施例４）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−マレイミド−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ（２．０ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液に、β−マレイミドプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．９３ｇ）およびトリエチルアミン（０．２５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量１．８ｇ。
【００６３】
【化１０】
（実施例５）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸のベンジルエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸（１０ｇ、０．００５０モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．３０ｇ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．０ｇ）、ベンジルアルコール（１０．８ｇ、０．１００モル）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、７．５ｍｌ、０．００７５モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を約５０ｍｌまで濃縮し、濾過し、そして冷ジエチルエーテル８００ｍｌに添加した。沈殿した生成物を濾過により除き、そして減圧下にて、乾燥した。収量８．２ｇ。
【００６４】
【化１１】
（実施例６）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ベンゾトリアゾールカーボネート−ω−プロピオン酸のベンジルエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ヒドロキシ−ω−プロピオン酸のベンジルエステル（８．２ｇ、０．００２５モル）のアセトニトリル（８２ｍｌ）溶液に、ピリジン（０．９８ｍｌ）およびジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネート（１．４８ｇ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、そして乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量６．８ｇ。
【００６５】
【化１２】
（実施例７）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ベンゾトリアゾールカーボネート−ω−プロピオン酸のベンジルエステル（５．７ｇ、０．００２５モル）のアセトニトリル（４０ｍｌ）溶液に、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二ホスホン酸のジテトラブチルアンモニウム塩（ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ）（１．９２ｇ）およびトリエチルアミン（０．６０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（１００ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで７．２まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．６ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４５ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量４．７ｇ。
【００６６】
【化１３】
（実施例８）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸（４．７ｇ、０．００２０当量）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７０ｇ、０．００２４モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、２．４ｍｌ、０．００２４モル）を添加した。この反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。最後に、その生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．６ｇ。
【００６７】
【化１４】
（実施例９）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのタンパク質へのカップリング）
モデルタンパク質として、リゾチームを使用したが、その位置では、任意のタンパク質で置換できる。リゾチーム（鶏卵白、ＭＷ＝１４，３００Ｄａ、４ｍｇ、２．８Ｅ−７モル）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２ｍｌに溶解した。低い程度のＰＥＧ化を行うために、このリゾチーム溶液に、約１．１ｍｇ（５．６Ｅ−７モル）のＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、そして室温で、５時間混合した。高い程度のＰＥＧ化を行うために、このリゾチーム溶液に、約５．６ｍｇ（２．８Ｅ−６モル）のＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、そして室温で、５時間混合した。各ＰＥＧ−リゾチーム多量体（１−ＰＥＧマー、２−ＰＥＧマー、３−ＰＥＧマー）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（その溶離緩衝液として、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を使う）で分離した。これらの多量体の純度の分析は、ゲルおよび毛細管電気泳動で決定した。各精製した多量体を使用して、ヒドロキシアパタイトへの共役結合の効率を決定した。
【００６８】
（実施例１０）
（インビトロでのヒドロキシアパタイトへのＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−タンパク質の結合）
ヒドロキシアパタイト（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｆｌｕｋａ、１２０ｍｇ）を、３７℃で、２４時間にわたって、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで平衡化した。このヒドロキシアパタイト懸濁液に、１：１の容量比で、ネイティブなリゾチームまたはＰＥＧ−リゾチーム共役物を混合し、そして３７℃で攪拌した。種々の時点で、この混合物から、試料を取り出し、そしてゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、未結合タンパク質またはＰＥＧ−タンパク質共役物の割合について分析した。ネイティブなリゾチームは、ヒドロキシアパタイトに吸着しなかったのに対して、１・１／２（１．５）時間のインキュベーションにより、この３−ＰＥＧマーおよび２−ＰＥＧマーの１００％が吸着した。この１−ＰＥＧマー共役物は、１・１／２時間のインキュベーション後、吸着が限定されていた。全ての試料は、類似のタンパク質濃度を有していた。
【００６９】
（実施例１１）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシン）
ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−アミン（２．０ｇ、０．００１０モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水アセトニトリル（３０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシンｐ−ニトロフェニルエステル（０．４２ｇ、０．００１０モル）およびトリエチルアミン（０．３ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、減圧下にて、溶媒を留去した。その残渣をＤＩ水２００ｍｌに溶解し、得られた溶液をアニオン交換樹脂で濾過して（ｐ−ニトロフェノールを除去し）、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．３ｇ）を添加した。この混合物を、室温で、４０ｐｓｉ水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、その生成物を塩化メチレンで抽出した。その抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下にて、溶媒を留去した。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．２５ｇ。
【００７０】
【化１５】
（実施例１２）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−ω−プロピオン酸）
ＰＥＧ（２，０００）−α−アミノ−ω−プロピオン酸（２．５０ｇ、０．００１２モル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の無水アセトニトリル（３０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシンｐ−ニトロフェニルエステル（０．５４ｇ、０．００１２モル）およびトリエチルアミン（０．５ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、減圧下にて、溶媒を留去した。その残渣をＤＩ水２２０ｍｌに溶解し、得られた溶液をアニオン交換樹脂で濾過してｐ−ニトロフェノールを除去した。ＮａＣｌ（２０ｇ）を添加し、その溶液のｐＨを、５％リン酸で３．０に調節した。その生成物を塩化メチレンで抽出した。その抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下にて、溶媒を留去した。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．７５ｇ。
【００７１】
【化１６】
（実施例１３）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸（１．６６ｇ、０．０００７０モル）の無水塩化メチレン（２０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０８９ｇ、０．０００７７モル）を添加し、続いて、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（塩化メチレン中の１．０Ｍ溶液、０．７７ｍｌ、０．０００７７モル）を添加した。その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この混合物を濾過し、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物を塩化メチレンに溶解し、そしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。その湿潤生成物を、減圧下にて乾燥した。収量１．２６ｇ。
【００７２】
【化１７】
（実施例１４）
（ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン−ω−プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．１５ｇ、０．０００４６モル）のアセトニトリル（１５ｍｌ）溶液に、ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ（０．３６ｇ）およびトリエチルアミン（０．１０ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（５０ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（２０ｍｌ）で濾過した。この溶液のｐＨを、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで６．５まで調節し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．３ｇ）を添加した。この混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、水を留去した。湿潤生成物を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、この生成物を、減圧下にて、乾燥した。収量０．６５ｇ。
【００７３】
【化１８】
（実施例１５）
（インビトロでのヒドロキシアパタイトへのＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰおよび他のＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体の結合）
ヒドロキシアパタイト（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｆｌｕｋａ、１２ｍｇ）を、３７℃で、２４時間にわたって、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで平衡化した。このヒドロキシアパタイト懸濁液に、１：１の容量比で、ＡＨＰＤＰ、ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−ヒドロキシ、ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシン、ＰＥＧ（５，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰ、およびＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ誘導体を、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．２）にて、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、個々に混合し、そして３７℃で攪拌した。種々の時点で、各混合物から、試料を取り出し、そしてゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、未結合ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体の割合について分析した。ＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−ヒドロキシおよびＰＥＧ（２，０００）−α−メトキシ−ω−Ｌ−チロシンは、ヒドロキシアパタイトに全く吸着を示さなかったのに対して、このＰＥＧ−ＡＨＰＤＰ誘導体は、８時間のインキュベーションにより１００％が吸着を示した。ＡＨＰＤＰは、１分程度の吸着半減期を有していたのに対して、ＰＥＧ（５，０００）−α−アミン−ω−ＡＨＰＤＰおよびＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰ誘導体は、それぞれ、４５分および１９分の吸着半減期を有していた。
【００７４】
（実施例１６）
（マウスでのＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンＩ１２５−ω−ＡＨＰＤＰの排泄研究）
ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰおよびｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンを、標準クロラミン−Ｔ手順（Ｂｏｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２４：１８〜２９，１９８６）を使用して、ヨウ素化した。要約すると、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰまたはｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン（２μｇ／μＬの全重量）の１５μＬアリコートを、５０ｍＭリン酸緩衝液５０μＬと混合した。これに、ＮａＩ１２５（１ｍＣｉ）およびクロラミン−Ｔ（１μｇ／μＬ）１０μＬを添加した。この混合物を、３０秒間にわたって、指で渦流にし、続いて、Ｌ−Ｃｙｓ（２μｇ／μＬ）１００μＬを添加し、続いて、さらに３０秒間にわたって、指で渦流にした。その精製は、逆相クロマトグラフィーにより実行した。それらの試料を、３７℃で、１．５ｍｌ／分で、３０分間にわたって、０．１％水性ＴＦＡに対するアセトニトリル（１９〜６３％）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の曲線勾配を使用して、溶出した。
【００７５】
オスＩＣＲマウス（２０〜２５ｇ）に、尾静脈注射（１００μＬ；ｉ．ｖ．）によって、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰまたはｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンのいずれか（２μＣｉ）を投与した。このマウスを代謝ケージに配置し、以下の時点で、尿および糞を集めた（注射の１、２、３、４、６および８時間後）（ｎ＝６）。これらの試料をガンマカウンタで数え、そのカウント数を、注射した全カウント数の割合に変換した。ｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンは、４７．５％の平均捕獲［１２５Ｉ］％を有しており、放射標識化合物の９５％以上が尿に排泄された。ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰは、８時間の過程中、ｍＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシンよりも著しく低い割合（５分の１）の捕獲［１２５Ｉ］（７．７％）を有しており、再度、放射標識化合物の約９５％が尿に排泄された。これらの２種の化合物は、ＰＥＧ（２，０００）−α−Ｌ−チロシン−ω−ＡＨＰＤＰが体内での著しく高い［１２５Ｉ］保持割合を生じたこと以外は、８時間にわたって、類似の排出プロフィールを生じた。
【００７６】
（実施例１７）
（ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ＡＨＰＤＰ）４）
ＰＥＧ（１０，０００）−（α−ベンゾトリアゾールカーボネート）４（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（４．２ｇ、０．０００４２モル）のアセトニトリル（４０ｍｌ）溶液に、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−二ホスホン酸のジテトラブチルアンモニウム塩（ＡＨＰＤＰ−２Ｂｕ４Ｎ）（１．３２ｇ）およびトリエチルアミン（０．４ｍｌ）を添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、乾燥状態まで、溶媒をエバポレートした。その粗生成物をＤＩ水（１００ｍｌ）に溶解し、そしてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（プラス）カラム（５０ｍｌ）で濾過した。次に、この水を、減圧下にて留去した。その湿潤生成物を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで、溶媒を留去した。最後に、その生成物を、減圧下にて乾燥した。収量３．１ｇ。
【００７７】
【化１９】
（実施例１８）
（ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
【００７８】
【化２０】
ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（３．４０ｇ、約１．００ｍｍｏｌ）、キニジン（０．４９ｇ、約１．５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（触媒量）およびＤＭＡＰ（０．１５ｇ、約１．２３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）に溶解した。この溶液をＤＣＣ（０．３１ｇ、約１．５０ｍｍｏｌ）（これは、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解した）で処理し、そして室温で、アルゴン下にて、一晩（約８時間）攪拌させた。その溶媒を真空下にて除去し、その残渣のシロップをトルエン（２５ｍｌ）に溶解し、そしてセライト（ｃｅｌｉｔｅ）のプラグで濾過した。そのトルエンを真空下にて除去し、そのシロップをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）に溶解した。ジエチルエーテルに添加して、白色沈殿物として、生成物が得られ、これを、濾過により集め、そして真空下にて乾燥した（収量２．７７ｇ、約８１％）。
【００７９】
（実施例１９）
（ＰＥＧ（３，４００）−α−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
ＰＥＧ（３，４００）−α−ＣＢＺ−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル（２．５０ｇ）をエチルアルコールに溶解し、そして活性炭上パラジウム（１０％）（０．５ｇ）を添加した。その混合物を、室温で、４０ｐｓｉの水素下にて、一晩水素化した。次に、この混合物を濾過し、そして減圧下にて、エタノールを留去した。収量２．１ｇ。その生成物のＮＭＲスペクトルにより、ＰＥＧ骨格に結合したアミン基が完全に脱保護されていることが示された。
【００８０】
（実施例２０）
（ＰＥＧ（５，４００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のキニジンエステル）
ＰＥＧ（２，０００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のＮＨＳエステル（１．２２ｇ、０．０００５０モル）の無水塩化メチレン（１００ｍｌ）溶液に、ＰＥＧ（３，４００）−α−アミン−ω−プロピオン酸のキニジンエステル（１．８９ｇ、０．０００５０モル）を添加し、続いて、トリエチルアミン（０．１０ｍｌ）を添加した。この混合物を、アルゴン雰囲気下にて、一晩攪拌した。次に、この反応生成物をエチルエーテルで沈殿し、そして減圧下にて乾燥した。収量３．０１ｇ。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、分子量５，７００Ｄａの生成物が形成されたことが示された（９８％）。
【００８１】
緩衝液（ｐＨ７．３）中でのＰＥＧ（５，４００）−α−ＡＨＰＤＰ−ω−プロピオン酸のキニジンエステルにおけるエステルの加水分解半減期は、２３９時間（２２℃で）および４６時間（３７℃で）であり、キニジンの放出を引き起こした。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の化合物（重合体構造）などが提供される。
（項１） 単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該化学的反応性基は、保護されているかまたは保護されていない、
重合体構造。
（項２） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項３） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、ビスホスホネートである、上記項１に記載の重合体構造。
（項４） 前記ビスホスホネートが、以下の構造を有する、上記項３に記載の重合体構造：
【化１】
ここで、ＹおよびＺは、独立して、水素、−ＯＨ、ハロゲン、アリール、置換アリール、ピリジル、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＳＨおよびＳＲ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリールまたは置換アリールであり、そしてＷは、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、Ｎａ＋およびＫ＋からなる群から選択される、
重合体構造。
（項５） Ｙが、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐが、約２〜約６であり、Ｚが、−ＯＨであり、そして各Ｗが、水素である、上記項４に記載の重合体構造。
（項６） 前記化学的反応性基が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項７） 前記化学的反応性基が、保護アミンまたは保護ヒドラジンであり、ここで、該保護基が、ｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項８） 前記化学的反応性基が、保護チオールであり、ここで、該保護基が、オルトピリジルジスルフィドである、上記項１に記載の重合体構造。
（項９） 前記化学的反応性基が、保護カルボン酸または保護ヒドロキシルであり、ここで、該保護基が、ベンジルである、上記項１に記載の重合体構造。
（項１０） 前記化学的反応性基が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項１１） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項１に記載の重合体構造。
（項１２） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）である、上記項１に記載の重合体構造。
（項１３） 前記重合体骨格が、ポリ（エチレングリコール）である、上記項１２に記載の重合体構造。
（項１４） 前記ポリ（アルキレングリコール）骨格が、加水分解性または酵素分解性結合を含む、上記項１２に記載の重合体構造。
（項１５） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項１４に記載の重合体構造。
（項１６） 前記重合体骨格が、２個〜約３００個の末端を有する、上記項１に記載の重合体構造。
（項１７） 前記重合体骨格が、以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｑ−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である、
重合体構造。
（項１８） ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項１９） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２０） ＰＯＬＹが、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２１） Ｔが、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２２） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２３） Ｑが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２４） Ｑが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アミン、保護アミン、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、上記項１７に記載の重合体構造。
（項２５） 以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｑ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＥＧは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、Ｑは、保護または非保護化学的反応性基であり、該化学的反応性基は、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択され、Ｌは、リンカーであり、そしてＴは、ビスホスホネートである、
重合体構造。
（項２６） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項２５に記載の重合体構造。
（項２７） 以下の構造を有する、上記項１に記載の重合体構造：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｘ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ｘは、独立して、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、チオール、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレートおよびＬ−Ｔからなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＸは、ヒドロキシアパタイト標的化部分ではない；
Ｒは、中心コア分子である；
Ｌは、リンカーである；
Ｔは、該ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である、
重合体構造。
（項２８） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項２７に記載の重合体構造。
（項２９） Ｒが、トリメチロールプロパン、ジ−トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、リシンおよびジ−リシンからなる群から選択される、上記項２７に記載の重合体構造。
（項３０） Ｌが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、アミン結合、尿素結合およびカーバメート結合からなる群から選択される、上記項２７に記載の重合体構造。
（項３１） ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
重合体構造。
（項３２） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項３１に記載の重合体構造。
（項３３） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよく、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分であり、ここで、ＰＯＬＹ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、重合体構造。
（項３４） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項３３に記載の重合体構造。
（項３５） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ａは、独立して、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよい；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；
ｑは、２〜約３００の整数である；ここで、ＰＯＬＹａ、ＰＯＬＹｂ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
重合体構造。
（項３６） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項３５に記載の重合体構造。
（項３７） 以下の構造を有する、上記項３１に記載の重合体構造：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｄは、少なくとも１個の水酸基を有する生物学的活性剤であり、Ｌは、加水分解安定結合であり、Ｌ’は、加水分解性結合であり、そしてＴは、ビスホスホネート部分である、
重合体構造。
（項３８） Ｌ’が、エステル、カーバメート、カーボネートおよびアセタールからなる群から選択される、上記項３７に記載の重合体構造。
（項３９） Ｌが、エーテル、チオ−エーテル、アミドおよびカーバメートからなる群から選択される、上記項３７に記載の重合体構造。
（項４０） 単離可能なヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
該重合体構造を提供する工程であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、第一保護化学的反応性基に共有結合されており、そして第二末端は、第二化学的反応性基に共有結合されており、ここで、該第二化学的反応性基は、活性カーボネートおよび活性エステルからなる群から選択される、工程；ならびに
該第二化学的反応性基をヒドロキシアパタイト標的化部分と反応させて、ヒドロキシアパタイト標的化重合体構造を形成する工程、
を包含する、方法。
（項４１） 前記第一保護化学的反応性基が、保護ヒドロキシル、保護アミン、保護カルボン酸、保護ヒドラジンおよび保護チオールからなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４２） 前記重合体骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ならびにそれらの共重合体、三元共重合体、誘導体および混合物からなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４３） 前記第二化学的反応性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートからなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４４） 前記提供する工程が、以下の構造を有する重合体構造を提供する工程を包含する、上記項４０に記載の方法：
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２Ｙ’
ここで、Ｘは、活性カーボネートまたは活性エステルであり、Ｙ’は、ベンジルであり、そしてｎは、約３〜約２０００である、
方法。
（項４５） 前記ヒドロキシアパタイト標的化部分が、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびアミノリン糖からなる群から選択される、上記項４０に記載の方法。
（項４６） さらに、以下の工程：
前記第一化学的反応性基を脱保護する工程；
該脱保護第一化学的反応性基を活性カーボネートまたは活性エステルに変換する工程；
該活性カーボネートまたは活性エステルを生物学的活性剤と反応させて、該生物学的活性剤が前記重合体構造に結合するようにする工程、
を包含する、上記項４０に記載の方法。
（項４７） 前記生物学的活性剤が、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、色素、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルからなる群から選択される、上記項４６に記載の方法。
（項４８） 放出可能な生物学的活性剤用のレザバとして生物中の骨表面を利用する方法であって、該方法は、以下の工程：
ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造を提供する工程であって、該重合体構造は、直鎖または分枝水溶性非ペプチド重合体骨格を含み、該重合体骨格は、少なくとも２個の末端を有し、第一末端は、ヒドロキシアパタイト標的化部分に共有結合されており、そして第二末端は、リンカーを介して、生物学的活性剤に共有結合されており、ここで、該重合体骨格および該リンカーの少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、方法；ならびに
治療有効量の該重合体構造を骨含有生物に投与して、該重合体構造の少なくとも一部が該ヒドロキシアパタイト標的化部分により骨表面に結合されるようにする工程、
を包含する、方法。
（項４９） 前記分解性結合が、イミン、カーボネート、カルボン酸エステル、ホスホエステル、オルトエステル、アセタール、カーバメート、ジスルフィドおよびペプチドからなる群から選択される、上記項４８に記載の方法。
（項５０） 前記ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造が、以下の構造を有する、上記項４８に記載の方法：
Ｄ−Ｌ’−ＰＯＬＹ−Ｌ−Ｔ
ここで、ＰＯＬＹは、水溶性非ペプチド重合体であり、Ｄは、生物学的活性剤であり、ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよく、そしてＴは、ヒドロキシアパタイト標的化部分であり、ここで、ＰＯＬＹ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、方法。
（項５１） ＰＯＬＹが、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、上記項５０に記載の方法。
（項５２） Ｔが、ビスホスホネートである、上記項５０に記載の方法。
（項５３） 前記ヒドロキシアパタイト標的化生物学的活性重合体構造が、以下の構造を有する、上記項４８に記載の方法：
Ｔ−Ｌ−ＰＯＬＹａ−Ｒ（−ＰＯＬＹｂ−Ｌ’−Ａ）ｑ
ここで、ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂは、水溶性非ペプチド重合体骨格であり、該重合体骨格は、同一でも異なってもよい；
各Ａは、独立して、ヒドロキシアパタイト標的化部分および生物学的活性剤からなる群から選択されるが、但し、少なくとも１個のＡは、生物学的活性剤である；
Ｒは、中心コア分子である；
ＬおよびＬ’は、リンカーであり、該リンカーは、同一でも異なってもよい；
Ｔは、ヒドロキシアパタイト標的化部分である；そして
ｑは、２〜約３００の整数である；ここで、ＰＯＬＹａ、ＰＯＬＹｂ、ＬおよびＬ’の少なくとも１個は、加水分解性または酵素分解性結合を含む、
方法。
（項５４） ＰＯＬＹａおよびＰＯＬＹｂが、ポリ（エチレングリコール）である、上記項５３に記載の方法。
（項５５） 前記投与する工程が、経口、肺、静脈内、皮下、筋肉内、舌下、鼻内、眼内および直腸からなる群から選択される経路により、前記重合体構造を投与する工程を包含する、上記項４８に記載の方法。
（項５６） 前記投与する工程が、少なくとも１種の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と共に前記重合体構造を投与する工程を包含する、上記項４８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【公開番号】特開２００９−１９７０２３（Ｐ２００９−１９７０２３Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２９７１８（Ｐ２００９−１２９７１８）
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【分割の表示】特願２００２−５４２４３０（Ｐ２００２−５４２４３０）の分割
【原出願日】平成１３年１０月１８日（２００１．１０．１８）
【出願人】（５００３２１４３８）ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【分割の表示】特願２００２−５４２４３０（Ｐ２００２−５４２４３０）の分割
【原出願日】平成１３年１０月１８日（２００１．１０．１８）
【出願人】（５００３２１４３８）ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
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