ビタミンＫ低含有納豆及びその製造方法並びにビタミンＫ低生産性納豆菌及びその選抜方法
【課題】製造された納豆のメナキノン量を厳格に制御することにより、納豆に含まれるメナキノン量を任意に調整でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害するおそれのないビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【解決手段】ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆粉に添加して大豆粉を発酵させ、次いで大豆粉に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で生成された大豆粉を納豆用蒸煮大豆に所定量混同する第３工程とを有する構造となっている。これにより、ビタミンＫ低生産性納豆菌によりメナキノンが生産されるが、第２工程でメナキノン量が定性されるので、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を所望の値に設定でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害しない納豆を製造することができる。
【解決手段】ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆粉に添加して大豆粉を発酵させ、次いで大豆粉に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で生成された大豆粉を納豆用蒸煮大豆に所定量混同する第３工程とを有する構造となっている。これにより、ビタミンＫ低生産性納豆菌によりメナキノンが生産されるが、第２工程でメナキノン量が定性されるので、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を所望の値に設定でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害しない納豆を製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメナキノン量の生産が少ない納豆菌及びその納豆菌を使用した納豆の製造方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆は原料として大豆を使用し、稲ワラや枯れ草等に多く生息する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の亜種である納豆菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）を繁殖させて作った発酵食品であり、その粘性から糸引き納豆ともいわれている。そして、納豆は良質なたんぱく質やイソフラボン等の有効成分を豊富に含み、優良な食品として広く知られている一方、納豆菌が血液凝固因子等の生成に関与するビタミンＫ（主にビタミンＫ２（メナキノン））を生産することも知られている。このビタミンＫは、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬と拮抗し、医薬の抗血液凝固作用を低下させる等の悪影響を及ぼすおそれがある。
【０００３】
従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬を服用する血栓塞栓症患者等は、栄養成分を豊富に含むが、納豆中に含まれるビタミンＫのために、納豆の厳格な食餌制限がなされている。
【０００４】
しかしながら、これでは納豆の効能として知られている更年期障害の改善や骨粗鬆症に対する予防（納豆は骨粗鬆症に対する特定保健用食品としての表示が許可されている）という利益を得ることができないし、また、血栓塞栓症患者に限らず高齢者の場合は加齢に伴い心臓や脳の血管の脆弱化が避けられないため、高齢者の場合も血栓塞栓症患者ほどではないにしても、納豆の食餌に対しては注意を払う必要があった。
【０００５】
このような問題点を解決するため、抗生物質が添加された培地に納豆菌を接種し、その後に培地から生育可能な納豆菌（ビタミンＫ低生産性納豆菌）を選抜し、この選抜された納豆菌により納豆を製造する方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００６−２３０２５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のビタミンＫ低生産性納豆菌による納豆の製造方法では、納豆菌体の生産能を低下させても納豆製造時（大豆発酵時）に際して菌体の増殖に伴い納豆としてメナキノン含有量を低下できず、更に、体内で生成されるメナキノン量に関しても制御できないことから、抗血液凝固作用を有する医薬を服用する患者や高齢者にとっては未だ不十分なものとなっていた。
【０００７】
本発明の目的は、前記従来の課題に鑑み、製造された納豆のメナキノン量を厳格に制御することにより、納豆に含まれるメナキノン量を任意に設定でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害するおそれのないビタミンＫ低含有納豆の製造方法及びビタミンＫ低含有納豆を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は前記課題を解決するため、本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法は、ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して大豆を発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する
ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する構造となっている。
【０００９】
本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法によれば、ビタミンＫ低生産性納豆菌によりメナキノンが生産されるが、第２工程でメナキノン量が定性されるので、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を任意に設定及び制御することができ、医薬の抗血液凝固作用を阻害しない納豆を製造することができる。
【００１０】
また、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、抗生物質耐性を有する納豆菌を選抜するビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法において、抗生物質耐性を有する納豆菌のうち、低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜してなるものである。
【００１１】
本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法によれば、ビタミンＫ低生産性納豆菌のうち低ｐＨで死滅する納豆菌が選抜されるため、納豆を摂食した後、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境下で納豆菌が死滅する可能性があり、腸内に残存してメナキノンを生成するという危険性が低減される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法によれば、納豆に含まれるメナキノン量を任意に設定及び制御でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害することがない。
【００１３】
本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法によれば、腸内でメナキノンが生成されるという危険性が低減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１はビタミンＫ低生産性納豆の製造方法の第１実施形態を示す工程図であり、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を図１を参照して説明する。
【００１５】
本実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を説明する当たり、その前提技術である従来の納豆製造工程について図２を参照して説明する。
【００１６】
一般に納豆を製造するときは、まず、選定された状態の良い大豆を洗浄機で洗浄し、混入した異物を除去したり、大豆の表面に付着した汚れを洗い流す（選定・洗浄工程Ｓ１ａ）。次いで、大豆を水に１６〜１０時間に亘って浸漬する（浸漬工程Ｓ１ｂ）。これにより、大豆が吸水して体積が２倍ほどとなる。この浸漬工程Ｓ１ｂの後に、高圧釜を用いて大豆を蒸す。一般的には原料が丸大豆であれば圧力１．３〜１．５ｋｇ／ｃｍ2で３０〜３５分間、ひき割り大豆であれば圧力０．７ｋｇ／ｃｍ2で１〜２分間に亘って蒸す（蒸煮工程Ｓ１ｃ）。蒸煮工程Ｓ１ｃの後、大豆温度８０〜９０℃で納豆菌を散布する。納豆菌の接種量は１０4／１００ｇ程度となっている（納豆菌散布Ｓ１ｄ）。その後、納豆菌を増殖させるために納豆菌が散布された大豆を発酵させる。一般的には、室温３０〜４０℃で、湿度８０〜９０％の条件下で１８〜２０時間に亘って発酵させる（発酵工程Ｓ１ｅ）。しかる後、発酵により増殖した納豆菌の生育を休止させ、香味を安定させるために熟成させる。一般的には３〜５℃程度の冷蔵庫内に一昼夜置く（熟成工程Ｓ１ｆ）。
【００１７】
従来は、以上のような工程で納豆が製造されるが、これでは納豆に含まれるメナキノン量を調整することができない。そこで、本実施形態ではメナキノン量を設定及び制御可能な製造方法を提案する。
【００１８】
本実施形態に係る納豆の製造方法は、ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程Ｓ１０と、第１工程Ｓ１０で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆粉に接種して大豆粉を発酵させ次いで大豆粉に含まれるメナキノン量を定性する第２工程Ｓ２０と、第２工程Ｓ２０で製造された大豆粉を納豆用蒸煮大豆に所定量混同する第３工程Ｓ３０とから構成される。
【００１９】
まず、第１工程Ｓ１０を説明する。第１工程Ｓ１０では本実施形態に好適なビタミンＫ低生産性納豆菌を得る。まず、納豆菌を培養する。この培養工程Ｓ１０ａでは納豆菌の供試菌株を液体培地に接種し、振とう培養を行う（培養工程Ｓ１０ａ）。使用される納豆菌は、市販されている納豆菌、市販されている納豆から分離して得られる納豆菌、その他所定の研究施設に保存していた納豆菌、又は、例えば自然界、具体的には土壌、落ち葉、枯れ草花、及び稲ワラ等より分離されて得られる納豆菌を用いてもよい。また、培地は納豆菌の増殖が可能なものであれば、培地組成は何れでもよい。
【００２０】
培養工程Ｓ１０ａの後に、納豆菌の培養液を抗生物質添加液体培地に接種し、振とう培養し、その後に増殖した菌株を選抜する（納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂ）。この選抜方法は、ビタミンＫ生産能が低下すると抗生物質の取り込み能が低下し耐性を得るという特性を活用したもので、これにより、ビタミンＫ低生産性納豆菌が選抜される。なお、添加される抗生物質は、納豆菌に作用するものであれば何れでもよいが、アミノグルコシド系抗生物質が好ましい。また、培地組成は培養工程Ｓ１０ａで使用したものと同一のものでよい。
【００２１】
納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂの後に、ｐＨを低くした緩衝液を生成し、この緩衝液に納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂで選抜された菌株を接種して、納豆菌の死滅率を調べた（低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃ）。試験に供した緩衝液は、塩酸-塩化カリウム緩衝液（ｐＨ１．０〜２．２）、グリシン-塩酸緩衝液（ｐＨ２．２〜３．６）など、ｐＨ緩衝能を低域に設定できるものであれば何れのものでもよい。また、培地組成は培養工程Ｓ１０ａで使用したものと同一のものでよい。
【００２２】
低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃで選抜された菌株を用い、従来の納豆製造工程Ｓ１で納豆を製造する。製造された納豆の曳糸性及び香味性を試験し、これらの性質に好適な菌株を選抜する（曳糸・香味性試験工程Ｓ１０ｄ）。なお、納豆製造工程Ｓ１の工程中、発酵工程Ｓ１ｅでは室温１０〜６０℃の間で試験を行っている。
【００２３】
以上のような納豆菌選抜工程（Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｄ）により最適な納豆菌、即ち、メナキノン量の生産が少なく、かつ、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境において死滅する可能性を有する納豆菌が選抜される。
【００２４】
納豆菌選抜工程で選抜された納豆菌を抗生物質添加液体培地に接種し、再度、納豆菌の抗生物質耐性（ビタミンＫ低生産性）を確認しつつ納豆菌を本培養する（ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅ）。なお、抗生物質添加液体培地は納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂと同様の組成でよい。
【００２５】
ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで得られた納豆菌培養液を遠心分離にかけ、培養液から集菌する。その際、菌体に付着した培地成分を除去するため、滅菌水又は滅菌生理食塩水を用いて、２〜３回に亘って菌体洗浄と集菌を繰り返し、所定量の納豆菌を集菌する（集菌工程Ｓ１０ｆ）。
【００２６】
集菌工程Ｓ１０ｆで得られた菌体を滅菌水で適宜希釈し、この納豆菌を使用するときまで冷凍保存する（納豆菌液調整工程Ｓ１０ｇ）。
【００２７】
以上のような、各工程Ｓ１０ａ〜１０ｇにより第１工程が終了する。
【００２８】
次に、第２工程について説明する。第２工程では、まず、丸大豆を粉状にした大豆粉と加工水とを混合し（混合比；大豆粉：加工水（１０：９０〜９０：１０））、所定量の大豆粉液を成形する（大豆粉液成形工程Ｓ２０ａ）。
【００２９】
大豆粉液成形工程Ｓ２０ａで製造された大豆粉液を高温高圧下で加熱処理する（温度８０〜１３０℃，時間：１０〜１２０ｍｉｎ．）（蒸煮工程２０ｂ）。
【００３０】
蒸煮工程Ｓ２０ｂで成形された大豆粉に納豆菌調整工程Ｓ１０ｇで生成された納豆菌液を所定量散布し、大豆粉と納豆菌液を混合する（納豆菌散布工程Ｓ２０ｃ）。
【００３１】
納豆菌散布工程Ｓ２０ｃで成形された半流動体状の大豆粉を発酵する（温度：１０〜６０℃、時間：１２〜９６ｈｒｓ．）（発酵工程Ｓ２０ｄ）。また、培養時間を長期設定することに伴い増殖した納豆菌を溶菌させる。
【００３２】
発酵工程Ｓ２０ｄで製造された大豆粉（発酵物）を冷凍する（冷凍工程Ｓ２０ｅ）。この冷凍工程Ｓ２０ｅにより発酵物を凍結させ、納豆菌の増殖を抑制する。また、冷凍工程Ｓ２０ｅの後に急激に加熱処理を行う（解凍工程Ｓ２０ｆ）。解凍工程Ｓ２０ｇにより菌体にストレスを加え溶菌する。これらの冷凍工程Ｓ２０ｅ及び解凍工程Ｓ２０ｆを多数回繰り返し、納豆菌の溶菌作用を更に促進させる。
【００３３】
冷凍工程Ｓ２０ｅ及び解凍工程Ｓ２０ｆの後に所定量のエタノールを発酵物に添加し、紫外線を照射する（ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇ）。これにより、納豆菌で生成されたメナキノンが物理的に分解され、発酵物中のメナキノン量を減少させる。
【００３４】
ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇが終了したときは、発酵物のメナキノン量を定性し（定性工程Ｓ２０ｈ）、大豆粉を冷蔵して熟成する（熟成工程Ｓ２０ｉ）。この定性工程Ｓ２０ｈにより、最終製品である納豆のメナキノン含有量が制御されるため、抗血液凝固作用を有する医薬を服用する患者に対しても安全な納豆を提供することができる。
【００３５】
以上の各工程Ｓ２０ａ〜Ｓ２０ｉにより第２工程が終了し、メナキノン量が定性された発酵物を得ることができる。
【００３６】
続いて、第３工程について説明する。第３工程では、最終製品の納豆の原材料である大豆を選定・洗浄し（選定・洗浄工程Ｓ３０ａ）、その後、低温度条件で所定時間に亘って浸漬し、大豆の体積が２倍程度になるまで吸水させる（浸漬工程Ｓ３０ｂ）。
【００３７】
浸漬工程Ｓ３０ｂで吸水拡大した大豆を高温高圧下で加熱処理する（温度：８０〜１３０℃、時間：１０〜１２０ｍｉｎ．）（蒸煮工程３０ｃ）。
【００３８】
蒸煮工程３０ｃの後に前記第２工程を経た発酵物を混合する（混合工程Ｓ３０ｄ）。ここで、発酵物と蒸煮大豆との混合比率は、前記定性工程Ｓ２０ｉで確認した含有量から設定を行い、１０〜２００μｇ／１００ｇに制御する。
【００３９】
混合工程Ｓ３０ｄの後に、高濃度に製造した豆乳などの添加食材を表面に噴霧する（噴霧工程Ｓ３０ｅ）。前記蒸煮工程を経た納豆は曳糸性を有するが、納豆特有の菌体の被りは得られない。そこで、視覚面の改良として煮大豆液（豆乳）を噴霧した。この噴霧工程Ｓ３０ｅにより最終製品である納豆の表面を茶色に着色している。なお、この噴霧工程Ｓ３０ｅは納豆の視覚性の改善にあるから、添加食材として豆乳に限定されるものではなく、餅粉、コラーゲン粉末、カルシウム粉末などを用いることができ、これにより、最終製品の納豆の栄養価をコントロールすることができる。
【００４０】
噴霧工程Ｓ３０ｅを経た大豆は脱酸素剤などにより嫌気条件下に置かれる（熟成工程Ｓ３０ｆ）。これにより、菌体の増殖を抑制しつつ化学的酵素処理が行われ、納豆の香味を安定させる。
【００４１】
以上の各工程Ｓ３０ａ〜Ｓ３０ｆにて第３工程が終了し、最終製品である納豆が製造される。
【００４２】
本実施形態によれば、第１工程で医薬の抗血液凝固作用を阻害しない好適なビタミンＫ低生産性納豆菌が選抜されるし、また、第２工程でビタミンＫ低生産性納豆菌により生産されるメナキノン量が定性されるため、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を任意の含有量に制御できるという利点を有している。
【００４３】
また、第１工程の低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃで低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜しているため、納豆を摂食した後、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境下で納豆菌が死滅する可能性があり、腸内に残存してメナキノンを生成するという危険性が低減される。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を実施例を掲げて説明する。
【００４５】
［第１工程］
まず、第１工程Ｓ１０の培養工程Ｓ１０ａで使用される培地は、表１に示す培地を使用した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
この培地を複数の試験管に１０ｍｌずつ分注する。各試験管の中に納豆菌体、具体的には市販されている納豆から分離した納豆菌株、納豆菌研究により選抜されたその他の納豆菌株（ＳＩ，Ｏ−Ｚ，ＤＦ３，Ｎ５−２ｉ，Ｎ５−２ｐ，Ｏｚ−６）をそれぞれ１白金耳接種し、それを振とう培養した（回転数：１２０ｒｐｍ、温度：２７℃、時間：２４ｈｒｓ）。
【００４８】
続いて行わる納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂでは表２に示す抗生物質（カナマイシン）添加培地を使用した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
この培地を各試験管に１０ｍｌ分注し、そこに、前記培養工程Ｓ１０ａで納豆菌が培養された培養液を１００μｍ接種し、更にこれを振とう培養した（回転数：１２０ｒｐｍ、温度：２７℃、時間：４８ｈｒｓ）。なお、抗生物質の添加量（ＰＰｍ）は２０，５０，１００，…，２０００と各種用意して試験した。納豆菌の培養後、各試験管の培養液を攪拌し、生菌濁度（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ）を測定し、増殖状況を調べた。この調査の結果、表３に示す結果が得られた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この表３から次のことが分かる。即ち、納豆菌種ＳＩ、Ｏ−Ｚ、Ｎ５−２ｉ及びＮ５−２ｐが抗生物質添加量２０００ｐｐｍでも生育が可能であり、これらの４株は高濃度の抗生物質添加に対して耐性を示したことから、ビタミンＫ生産能が低下していることが分かる。
【００５３】
低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃでは表４に示す緩衝液を使用する。
【００５４】
【表４】
【００５５】
この緩衝液として、塩酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）とグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いた２種類を用意し、この緩衝液を複数の試験管に１０ｍｌずつ分注した。そして、各試験管には納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂで選抜された納豆菌種、市販納豆分離株、Ｏ−Ｚ、Ｎ５−２ｉ及びＮ５−２ｐの菌株培養液を１００μｌ接種した。しかる後、３７℃で 静置培養を行い、経時的（０ｍｉｎ．，６０ｍｉｎ．，１２０ｍｉｎ．）に希釈平板法により生菌数を計数し、菌体の生存率を調べた。試験の結果、表５のとおりとなった。
【００５６】
【表５】
【００５７】
試験の結果、市販されている納豆から分離した菌株は６０分後に一度増殖傾向を示し１２０分後においても７０〜８０％の生存が認められた。その他３株は６０分後より減少傾向を示し生存率は１５〜５０％であった。さらに、１２０分において、Ｎ５−２ｉはｐＨ３の緩衝液で５．６％、ｐＨ２の緩衝液で３．９％であった。この試験結果から、Ｎ５−２ｉは胃酸などにより大多数が死滅することが明らかになった。
【００５８】
なお、納豆菌種Ｎ５−２ｉについては、平成１９年１２月２５日付けで受託者表示「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＯＡ−ｉ」及び受託番号「ＦＥＲＭＰ−２１４７７」で独立行政法人産業技術総合研究所に受託されている。
【００５９】
以上のような工程Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｃを経て適切な納豆菌Ｎ５−２ｉが選抜されるが、本実施例では納豆菌Ｎ５−２ｉによって製造される納豆が食餌に適するか否かを確認するため、従来製法（図３）によって納豆菌Ｎ５−２ｉによる納豆を製造して納豆の曳糸性及び香味性を確かめたところ、食餌に適することが確認された（曳糸・香味性試験工程Ｓ１０ｄ）。
【００６０】
以上の工程Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｄで選抜された納豆菌Ｎ５−２ｉを用いるときは、再度、ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで確認される。即ち、表２の液体培地を試験管に１０ｍｌずつ分注し、そこに、前培養液を５００μｇずつ接種した。培養量は１菌体当たり５本（５０ｍｌ）作成した。それを、振とう培養した（回転数；１２０ｒｐｍ、温度；２７℃、時間；４９ｈｒｓ．）。
【００６１】
そして、ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで得られた培養液を遠心分離（回転数；５０００ｒｐｍ、時間；１５ｍｉｎ．）により集菌した（集菌工程Ｓ１０ｆ）。また、菌体に付着している培地成分などを完全に除去するために、滅菌水または滅菌生理食塩水を用いて、２〜３回、菌体洗浄及び集菌を繰り返し行った。
【００６２】
集菌工程１０ｆで回収された菌体を滅菌水で適宜希釈を行い、その希釈水を直ちに冷凍庫（−８０℃）に移し使用時まで凍結させた（納豆菌液調整工程Ｓ１０ｇ）。
【００６３】
以上の工程Ｓ１０ｅ〜Ｓ１０ｇを経て最適な納豆菌が選抜され、また、第２工程Ｓ２０の納豆菌散布工程Ｓ２０ｃの準備が完了する。
【００６４】
［第２工程］
第２工程Ｓ２０の大豆粉液成形工程Ｓ２０ａでは、大豆粉（生大豆）と加工水を混合し（１：１）、全体がペースト状になるようにする。そして、大豆粉ペーストを発酵規模などに合わせて一定量を容器に充填し密閉した。その後、大豆粉ペーストを高温高圧下で蒸煮処理を行った（蒸煮工程Ｓ２０ｂ）。
【００６５】
この蒸煮処理Ｓ２０ｂの後、ペースト状の蒸煮大豆粉に第１工程で作成された納豆菌液を散布した（納豆菌散布工程Ｓ２０ｃ）。この納豆菌散布工程Ｓ２０ｃでは、蒸煮大豆粉末を１００ｇ取りだして細かく粉砕する一方、１０００μｍｌの納豆菌調整液を解凍し、両者を混合した。この納豆菌散布工程Ｓ２０ｃの後、混合大豆粉末を温度４５℃、湿度９０％以上、７２時間で発酵した（発酵工程Ｓ２０ｄ）。なお、発酵時間が比較的長い時間に設定したため、培養時に増殖した納豆菌の一部が溶出する。
【００６６】
次いで、発酵した大豆粉末を−８０℃で冷凍処理し（冷凍工程Ｓ２０ｅ）、続いて、電子レンジで加熱処理を行った（解凍工程Ｓ２０ｆ）。冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを一組とする回数と納豆菌数との関係を試験したところ、表６に示す通りとなった。
【００６７】
【表６】
【００６８】
表６に示す試験結果によれば、冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを繰り返す回数が多くなればなるほど、納豆菌の個体数が減少するという結果がでた。なお、実施例では冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを繰り返す回数を１０回とした。
【００６９】
また、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆによるメナキノン量の減少率を納豆菌毎に試験した結果、表７に示すような結果となった。
【００７０】
【表７】
【００７１】
表７に示すように、市販納豆菌分離株の減量率を「１００％」とするとき、納豆菌Ｎ５−２Ｐが「６０％」、納豆菌Ｎ５−２ｉが「６２％」、納豆菌Ｏ−Ｚが「６６％」となり、納豆菌Ｎ５−２Ｐ，Ｎ５−２ｉ，Ｏ−Ｚの何れもが市販納豆菌分離株と比較してメナキノン量が著しく減少し、優れた効果を示している。
【００７２】
冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ後に行われるＵＶ照射工程Ｓ２０ｇでは、発酵大豆粉末１００ｇに７０％エタノールを２０００μｌ添加して攪拌し紫外線を２０分間に亘って照射するという処理を、合計６回に亘って繰り返した。
【００７３】
ここで、ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇの単独の影響を検討するため、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆを行うことなくＵＶ照射工程Ｓ２０ｇを行ったときは（納豆菌はＮ５−２ｉを使用）、表８に示す結果が得られた。
【００７４】
【表８】
【００７５】
表８に示す試験結果によれば、ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇにて紫外線照射処理を行った場合には未処理の場合と比較し、納豆菌Ｎ５−２ｉではメナキノンの分解率が１８．８％となり、市販納豆分離株でも分解率が２７．４％となっており、菌体の破壊及びメナキノンの物理的分解効果として影響することが明らかとなった。
【００７６】
また、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆとＵＶ照射工程Ｓ２０ｇを共に行ったときは（納豆菌はＮ５−２ｉを使用）、表９に示す結果が得られた。
【００７７】
【表９】
【００７８】
表９に示す結果によれば、これら各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合は未処理の場合と比較し、メナキノンの分解率が２０．６％まで向上した。
【００７９】
以上のように、発酵工程Ｓ２０ｄ、冷凍工程Ｓ２０ｅ、解凍工程Ｓ２０ｆ及びＵＶ照射工程Ｓ２０ｇは納豆菌からメナキノンを溶出する溶出工程Ｓ２０ｊとなっている。
【００８０】
この溶出工程２０ｊの後に行われる定性工程は一つに限定されるものではないが、本実施例では以下のとおり行った。
【００８１】
まず、溶出工程Ｓ２０ｈを終えた大豆粉末（５ｇ）を乳鉢に取り、そこに研磨剤（ガラスビーズ、海砂）５ｇを混合した。次いで、７０％２−プロパノールを１０ｍｌ添加し、ペースト状になるまで十分にすり潰した。１００ｍｌ容三角フラスコに試料全量を移し、そこに、ヘキサン１０ｍｌを添加した。室温にて１５分間に亘って攪拌・遠心分離を行い、その後、上澄みになるヘキサン層を採取した。このヘキサン層をロータリーエバポレータで減圧乾燥させ、Ｃｅｐ-ＰａｋＣ１８カラムを用いてメナキノン成分の精製を行った。Ｓｅｐ-Ｐａｋ Ｃ１８ ｃａｒｔｒｉｃｌｇｅからヘキサンージエチルエーテル（３：９７）溶液で溶出させた。さらに、ロータリーエバポレーターで減圧乾燥させた。エタノール１ｍｌにて乾燥試料を溶解した。最後に、吸収波長Ｏ．Ｄ．２４８〜２６１ｎｍｌにてメナキノン成分の定性を行った。
【００８２】
［第３工程］
第３工程Ｓ３０の選定・洗浄工程Ｓ３０ａでは、原料大豆として平成１５年秋田県産コスズ（小粒）を使用した。続く浸漬工程Ｓ３０ｂではこの原料大豆に対して蒸留水６００ｍｌを温度１０℃にて４８時間漬けた。これにより、大豆の体積が２．３倍になった。その後、蒸煮工程Ｓ３０ｃで高温高圧下（温度：１２６℃、圧力：１．２ａｔｍ．、時間：６０ｍｉｎ．）で蒸煮した。
【００８３】
混合工程Ｓ３０ｄでは蒸煮大豆１００ｇに対して第２工程Ｓ２０で生成された発酵粉末大豆１０ｇを添加し攪拌した。これにより、混合大豆が曳糸性を発揮する。混合工程Ｓ３０ｄの後に行われる噴霧工程Ｓ３０ｅでは粉末大豆２０ｇを蒸留水３００ｍｌで３分間煮沸して煮大豆溶液を得、煮大豆溶液を混合大豆１００ｇ当たり３ｍｌ添加した。熟成工程Ｓ３０ｆでは脱酸素剤をいれた密閉性の高い容器に噴霧工程Ｓ３０ｅを終えた混合大豆を入れ、温度４５℃で３０分間に亘って熟成させた。
【００８４】
なお、第３工程Ｓ３０で製造された納豆のメナキノン含有量を定性したところ、表１０に示す結果となった。
【００８５】
【表１０】
【００８６】
この結果から分かるように、第２工程Ｓ２０の各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合（１２５μｇ／１００ｇ）も、また、各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行わなかった場合（１５４μｇ／１００ｇ）もメナキノン量の低下率が見られ、特に、各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合にはその効果が極めて顕著なものとなっている。
【００８７】
図３はビタミンＫ低生産性納豆の製造方法の第２実施形態を示す工程図であり、第１実施形態と同一工程部分は同一符号で示し、その説明を省略する。
【００８８】
前記第１実施形態では発酵の対象となる大豆として、大豆を粉状にした大豆粉を用いている。これに対して、第２実施形態では発酵の対象となる大豆として丸大豆を用いた。
【００８９】
即ち、第２工程Ｓ２０において大豆粉液成形工程に代えて丸大豆準備工程２０ａ’を用いる。この丸大豆準備工程２０ａ’において状態の良い丸大豆を選定し、汚れなどを除去して待機し、この丸大豆に第２工程Ｓ２０の各工程Ｓ２０ｂ〜Ｓ２０ｉを行うようになっている。
【００９０】
また、第３工程Ｓ３０においては、前記第１実施形態の混合工程及び噴霧工程に代えて合わせ工程Ｓ３０ｄ’を行うようになっている。この合わせ工程Ｓ３０ｄ’では蒸煮工程Ｓ３０ｃを経た納豆用蒸煮大豆と第２工程で成形された定性済みの発酵丸大豆とを合わせて納豆を製造する。なお、この合わせ工程Ｓ３０ｄ’で納豆用蒸煮大豆と発酵丸大豆を納豆容器に収納する際は、菌体の繁殖が見られる発酵丸大豆を上側（開放蓋側）に配置し、蒸煮大豆を下側（容器の底側）に配置し、製品としての視覚性を損なうことがないようにする。
【００９１】
以上のように、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法においては、納豆菌の定性が可能であれば良く、発酵される大豆が粉状であろうと或いは丸大豆であろうと、更にはひき割り状であっても良い。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】第１実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を示す工程図
【図２】従来の納豆の製造工程図
【図３】第２実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を示す工程図
【符号の説明】
【００９３】
Ｓ１０…第１工程、Ｓ２０…第２工程、Ｓ３０…第３工程。
【技術分野】
【０００１】
本発明はメナキノン量の生産が少ない納豆菌及びその納豆菌を使用した納豆の製造方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆は原料として大豆を使用し、稲ワラや枯れ草等に多く生息する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の亜種である納豆菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）を繁殖させて作った発酵食品であり、その粘性から糸引き納豆ともいわれている。そして、納豆は良質なたんぱく質やイソフラボン等の有効成分を豊富に含み、優良な食品として広く知られている一方、納豆菌が血液凝固因子等の生成に関与するビタミンＫ（主にビタミンＫ２（メナキノン））を生産することも知られている。このビタミンＫは、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬と拮抗し、医薬の抗血液凝固作用を低下させる等の悪影響を及ぼすおそれがある。
【０００３】
従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬を服用する血栓塞栓症患者等は、栄養成分を豊富に含むが、納豆中に含まれるビタミンＫのために、納豆の厳格な食餌制限がなされている。
【０００４】
しかしながら、これでは納豆の効能として知られている更年期障害の改善や骨粗鬆症に対する予防（納豆は骨粗鬆症に対する特定保健用食品としての表示が許可されている）という利益を得ることができないし、また、血栓塞栓症患者に限らず高齢者の場合は加齢に伴い心臓や脳の血管の脆弱化が避けられないため、高齢者の場合も血栓塞栓症患者ほどではないにしても、納豆の食餌に対しては注意を払う必要があった。
【０００５】
このような問題点を解決するため、抗生物質が添加された培地に納豆菌を接種し、その後に培地から生育可能な納豆菌（ビタミンＫ低生産性納豆菌）を選抜し、この選抜された納豆菌により納豆を製造する方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００６−２３０２５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のビタミンＫ低生産性納豆菌による納豆の製造方法では、納豆菌体の生産能を低下させても納豆製造時（大豆発酵時）に際して菌体の増殖に伴い納豆としてメナキノン含有量を低下できず、更に、体内で生成されるメナキノン量に関しても制御できないことから、抗血液凝固作用を有する医薬を服用する患者や高齢者にとっては未だ不十分なものとなっていた。
【０００７】
本発明の目的は、前記従来の課題に鑑み、製造された納豆のメナキノン量を厳格に制御することにより、納豆に含まれるメナキノン量を任意に設定でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害するおそれのないビタミンＫ低含有納豆の製造方法及びビタミンＫ低含有納豆を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は前記課題を解決するため、本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法は、ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して大豆を発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する
ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する構造となっている。
【０００９】
本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法によれば、ビタミンＫ低生産性納豆菌によりメナキノンが生産されるが、第２工程でメナキノン量が定性されるので、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を任意に設定及び制御することができ、医薬の抗血液凝固作用を阻害しない納豆を製造することができる。
【００１０】
また、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、抗生物質耐性を有する納豆菌を選抜するビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法において、抗生物質耐性を有する納豆菌のうち、低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜してなるものである。
【００１１】
本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法によれば、ビタミンＫ低生産性納豆菌のうち低ｐＨで死滅する納豆菌が選抜されるため、納豆を摂食した後、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境下で納豆菌が死滅する可能性があり、腸内に残存してメナキノンを生成するという危険性が低減される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るビタミンＫ低含有納豆の製造方法によれば、納豆に含まれるメナキノン量を任意に設定及び制御でき、医薬の抗血液凝固作用を阻害することがない。
【００１３】
本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法によれば、腸内でメナキノンが生成されるという危険性が低減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１はビタミンＫ低生産性納豆の製造方法の第１実施形態を示す工程図であり、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を図１を参照して説明する。
【００１５】
本実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を説明する当たり、その前提技術である従来の納豆製造工程について図２を参照して説明する。
【００１６】
一般に納豆を製造するときは、まず、選定された状態の良い大豆を洗浄機で洗浄し、混入した異物を除去したり、大豆の表面に付着した汚れを洗い流す（選定・洗浄工程Ｓ１ａ）。次いで、大豆を水に１６〜１０時間に亘って浸漬する（浸漬工程Ｓ１ｂ）。これにより、大豆が吸水して体積が２倍ほどとなる。この浸漬工程Ｓ１ｂの後に、高圧釜を用いて大豆を蒸す。一般的には原料が丸大豆であれば圧力１．３〜１．５ｋｇ／ｃｍ2で３０〜３５分間、ひき割り大豆であれば圧力０．７ｋｇ／ｃｍ2で１〜２分間に亘って蒸す（蒸煮工程Ｓ１ｃ）。蒸煮工程Ｓ１ｃの後、大豆温度８０〜９０℃で納豆菌を散布する。納豆菌の接種量は１０4／１００ｇ程度となっている（納豆菌散布Ｓ１ｄ）。その後、納豆菌を増殖させるために納豆菌が散布された大豆を発酵させる。一般的には、室温３０〜４０℃で、湿度８０〜９０％の条件下で１８〜２０時間に亘って発酵させる（発酵工程Ｓ１ｅ）。しかる後、発酵により増殖した納豆菌の生育を休止させ、香味を安定させるために熟成させる。一般的には３〜５℃程度の冷蔵庫内に一昼夜置く（熟成工程Ｓ１ｆ）。
【００１７】
従来は、以上のような工程で納豆が製造されるが、これでは納豆に含まれるメナキノン量を調整することができない。そこで、本実施形態ではメナキノン量を設定及び制御可能な製造方法を提案する。
【００１８】
本実施形態に係る納豆の製造方法は、ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程Ｓ１０と、第１工程Ｓ１０で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆粉に接種して大豆粉を発酵させ次いで大豆粉に含まれるメナキノン量を定性する第２工程Ｓ２０と、第２工程Ｓ２０で製造された大豆粉を納豆用蒸煮大豆に所定量混同する第３工程Ｓ３０とから構成される。
【００１９】
まず、第１工程Ｓ１０を説明する。第１工程Ｓ１０では本実施形態に好適なビタミンＫ低生産性納豆菌を得る。まず、納豆菌を培養する。この培養工程Ｓ１０ａでは納豆菌の供試菌株を液体培地に接種し、振とう培養を行う（培養工程Ｓ１０ａ）。使用される納豆菌は、市販されている納豆菌、市販されている納豆から分離して得られる納豆菌、その他所定の研究施設に保存していた納豆菌、又は、例えば自然界、具体的には土壌、落ち葉、枯れ草花、及び稲ワラ等より分離されて得られる納豆菌を用いてもよい。また、培地は納豆菌の増殖が可能なものであれば、培地組成は何れでもよい。
【００２０】
培養工程Ｓ１０ａの後に、納豆菌の培養液を抗生物質添加液体培地に接種し、振とう培養し、その後に増殖した菌株を選抜する（納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂ）。この選抜方法は、ビタミンＫ生産能が低下すると抗生物質の取り込み能が低下し耐性を得るという特性を活用したもので、これにより、ビタミンＫ低生産性納豆菌が選抜される。なお、添加される抗生物質は、納豆菌に作用するものであれば何れでもよいが、アミノグルコシド系抗生物質が好ましい。また、培地組成は培養工程Ｓ１０ａで使用したものと同一のものでよい。
【００２１】
納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂの後に、ｐＨを低くした緩衝液を生成し、この緩衝液に納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂで選抜された菌株を接種して、納豆菌の死滅率を調べた（低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃ）。試験に供した緩衝液は、塩酸-塩化カリウム緩衝液（ｐＨ１．０〜２．２）、グリシン-塩酸緩衝液（ｐＨ２．２〜３．６）など、ｐＨ緩衝能を低域に設定できるものであれば何れのものでもよい。また、培地組成は培養工程Ｓ１０ａで使用したものと同一のものでよい。
【００２２】
低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃで選抜された菌株を用い、従来の納豆製造工程Ｓ１で納豆を製造する。製造された納豆の曳糸性及び香味性を試験し、これらの性質に好適な菌株を選抜する（曳糸・香味性試験工程Ｓ１０ｄ）。なお、納豆製造工程Ｓ１の工程中、発酵工程Ｓ１ｅでは室温１０〜６０℃の間で試験を行っている。
【００２３】
以上のような納豆菌選抜工程（Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｄ）により最適な納豆菌、即ち、メナキノン量の生産が少なく、かつ、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境において死滅する可能性を有する納豆菌が選抜される。
【００２４】
納豆菌選抜工程で選抜された納豆菌を抗生物質添加液体培地に接種し、再度、納豆菌の抗生物質耐性（ビタミンＫ低生産性）を確認しつつ納豆菌を本培養する（ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅ）。なお、抗生物質添加液体培地は納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂと同様の組成でよい。
【００２５】
ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで得られた納豆菌培養液を遠心分離にかけ、培養液から集菌する。その際、菌体に付着した培地成分を除去するため、滅菌水又は滅菌生理食塩水を用いて、２〜３回に亘って菌体洗浄と集菌を繰り返し、所定量の納豆菌を集菌する（集菌工程Ｓ１０ｆ）。
【００２６】
集菌工程Ｓ１０ｆで得られた菌体を滅菌水で適宜希釈し、この納豆菌を使用するときまで冷凍保存する（納豆菌液調整工程Ｓ１０ｇ）。
【００２７】
以上のような、各工程Ｓ１０ａ〜１０ｇにより第１工程が終了する。
【００２８】
次に、第２工程について説明する。第２工程では、まず、丸大豆を粉状にした大豆粉と加工水とを混合し（混合比；大豆粉：加工水（１０：９０〜９０：１０））、所定量の大豆粉液を成形する（大豆粉液成形工程Ｓ２０ａ）。
【００２９】
大豆粉液成形工程Ｓ２０ａで製造された大豆粉液を高温高圧下で加熱処理する（温度８０〜１３０℃，時間：１０〜１２０ｍｉｎ．）（蒸煮工程２０ｂ）。
【００３０】
蒸煮工程Ｓ２０ｂで成形された大豆粉に納豆菌調整工程Ｓ１０ｇで生成された納豆菌液を所定量散布し、大豆粉と納豆菌液を混合する（納豆菌散布工程Ｓ２０ｃ）。
【００３１】
納豆菌散布工程Ｓ２０ｃで成形された半流動体状の大豆粉を発酵する（温度：１０〜６０℃、時間：１２〜９６ｈｒｓ．）（発酵工程Ｓ２０ｄ）。また、培養時間を長期設定することに伴い増殖した納豆菌を溶菌させる。
【００３２】
発酵工程Ｓ２０ｄで製造された大豆粉（発酵物）を冷凍する（冷凍工程Ｓ２０ｅ）。この冷凍工程Ｓ２０ｅにより発酵物を凍結させ、納豆菌の増殖を抑制する。また、冷凍工程Ｓ２０ｅの後に急激に加熱処理を行う（解凍工程Ｓ２０ｆ）。解凍工程Ｓ２０ｇにより菌体にストレスを加え溶菌する。これらの冷凍工程Ｓ２０ｅ及び解凍工程Ｓ２０ｆを多数回繰り返し、納豆菌の溶菌作用を更に促進させる。
【００３３】
冷凍工程Ｓ２０ｅ及び解凍工程Ｓ２０ｆの後に所定量のエタノールを発酵物に添加し、紫外線を照射する（ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇ）。これにより、納豆菌で生成されたメナキノンが物理的に分解され、発酵物中のメナキノン量を減少させる。
【００３４】
ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇが終了したときは、発酵物のメナキノン量を定性し（定性工程Ｓ２０ｈ）、大豆粉を冷蔵して熟成する（熟成工程Ｓ２０ｉ）。この定性工程Ｓ２０ｈにより、最終製品である納豆のメナキノン含有量が制御されるため、抗血液凝固作用を有する医薬を服用する患者に対しても安全な納豆を提供することができる。
【００３５】
以上の各工程Ｓ２０ａ〜Ｓ２０ｉにより第２工程が終了し、メナキノン量が定性された発酵物を得ることができる。
【００３６】
続いて、第３工程について説明する。第３工程では、最終製品の納豆の原材料である大豆を選定・洗浄し（選定・洗浄工程Ｓ３０ａ）、その後、低温度条件で所定時間に亘って浸漬し、大豆の体積が２倍程度になるまで吸水させる（浸漬工程Ｓ３０ｂ）。
【００３７】
浸漬工程Ｓ３０ｂで吸水拡大した大豆を高温高圧下で加熱処理する（温度：８０〜１３０℃、時間：１０〜１２０ｍｉｎ．）（蒸煮工程３０ｃ）。
【００３８】
蒸煮工程３０ｃの後に前記第２工程を経た発酵物を混合する（混合工程Ｓ３０ｄ）。ここで、発酵物と蒸煮大豆との混合比率は、前記定性工程Ｓ２０ｉで確認した含有量から設定を行い、１０〜２００μｇ／１００ｇに制御する。
【００３９】
混合工程Ｓ３０ｄの後に、高濃度に製造した豆乳などの添加食材を表面に噴霧する（噴霧工程Ｓ３０ｅ）。前記蒸煮工程を経た納豆は曳糸性を有するが、納豆特有の菌体の被りは得られない。そこで、視覚面の改良として煮大豆液（豆乳）を噴霧した。この噴霧工程Ｓ３０ｅにより最終製品である納豆の表面を茶色に着色している。なお、この噴霧工程Ｓ３０ｅは納豆の視覚性の改善にあるから、添加食材として豆乳に限定されるものではなく、餅粉、コラーゲン粉末、カルシウム粉末などを用いることができ、これにより、最終製品の納豆の栄養価をコントロールすることができる。
【００４０】
噴霧工程Ｓ３０ｅを経た大豆は脱酸素剤などにより嫌気条件下に置かれる（熟成工程Ｓ３０ｆ）。これにより、菌体の増殖を抑制しつつ化学的酵素処理が行われ、納豆の香味を安定させる。
【００４１】
以上の各工程Ｓ３０ａ〜Ｓ３０ｆにて第３工程が終了し、最終製品である納豆が製造される。
【００４２】
本実施形態によれば、第１工程で医薬の抗血液凝固作用を阻害しない好適なビタミンＫ低生産性納豆菌が選抜されるし、また、第２工程でビタミンＫ低生産性納豆菌により生産されるメナキノン量が定性されるため、第３工程で製造される納豆のメナキノン量を任意の含有量に制御できるという利点を有している。
【００４３】
また、第１工程の低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃで低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜しているため、納豆を摂食した後、生体内で胃酸などの低ｐＨ環境下で納豆菌が死滅する可能性があり、腸内に残存してメナキノンを生成するという危険性が低減される。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を実施例を掲げて説明する。
【００４５】
［第１工程］
まず、第１工程Ｓ１０の培養工程Ｓ１０ａで使用される培地は、表１に示す培地を使用した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
この培地を複数の試験管に１０ｍｌずつ分注する。各試験管の中に納豆菌体、具体的には市販されている納豆から分離した納豆菌株、納豆菌研究により選抜されたその他の納豆菌株（ＳＩ，Ｏ−Ｚ，ＤＦ３，Ｎ５−２ｉ，Ｎ５−２ｐ，Ｏｚ−６）をそれぞれ１白金耳接種し、それを振とう培養した（回転数：１２０ｒｐｍ、温度：２７℃、時間：２４ｈｒｓ）。
【００４８】
続いて行わる納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂでは表２に示す抗生物質（カナマイシン）添加培地を使用した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
この培地を各試験管に１０ｍｌ分注し、そこに、前記培養工程Ｓ１０ａで納豆菌が培養された培養液を１００μｍ接種し、更にこれを振とう培養した（回転数：１２０ｒｐｍ、温度：２７℃、時間：４８ｈｒｓ）。なお、抗生物質の添加量（ＰＰｍ）は２０，５０，１００，…，２０００と各種用意して試験した。納豆菌の培養後、各試験管の培養液を攪拌し、生菌濁度（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ）を測定し、増殖状況を調べた。この調査の結果、表３に示す結果が得られた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この表３から次のことが分かる。即ち、納豆菌種ＳＩ、Ｏ−Ｚ、Ｎ５−２ｉ及びＮ５−２ｐが抗生物質添加量２０００ｐｐｍでも生育が可能であり、これらの４株は高濃度の抗生物質添加に対して耐性を示したことから、ビタミンＫ生産能が低下していることが分かる。
【００５３】
低ｐＨ条件死滅率試験工程Ｓ１０ｃでは表４に示す緩衝液を使用する。
【００５４】
【表４】
【００５５】
この緩衝液として、塩酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）とグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いた２種類を用意し、この緩衝液を複数の試験管に１０ｍｌずつ分注した。そして、各試験管には納豆菌生存試験工程Ｓ１０ｂで選抜された納豆菌種、市販納豆分離株、Ｏ−Ｚ、Ｎ５−２ｉ及びＮ５−２ｐの菌株培養液を１００μｌ接種した。しかる後、３７℃で 静置培養を行い、経時的（０ｍｉｎ．，６０ｍｉｎ．，１２０ｍｉｎ．）に希釈平板法により生菌数を計数し、菌体の生存率を調べた。試験の結果、表５のとおりとなった。
【００５６】
【表５】
【００５７】
試験の結果、市販されている納豆から分離した菌株は６０分後に一度増殖傾向を示し１２０分後においても７０〜８０％の生存が認められた。その他３株は６０分後より減少傾向を示し生存率は１５〜５０％であった。さらに、１２０分において、Ｎ５−２ｉはｐＨ３の緩衝液で５．６％、ｐＨ２の緩衝液で３．９％であった。この試験結果から、Ｎ５−２ｉは胃酸などにより大多数が死滅することが明らかになった。
【００５８】
なお、納豆菌種Ｎ５−２ｉについては、平成１９年１２月２５日付けで受託者表示「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＯＡ−ｉ」及び受託番号「ＦＥＲＭＰ−２１４７７」で独立行政法人産業技術総合研究所に受託されている。
【００５９】
以上のような工程Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｃを経て適切な納豆菌Ｎ５−２ｉが選抜されるが、本実施例では納豆菌Ｎ５−２ｉによって製造される納豆が食餌に適するか否かを確認するため、従来製法（図３）によって納豆菌Ｎ５−２ｉによる納豆を製造して納豆の曳糸性及び香味性を確かめたところ、食餌に適することが確認された（曳糸・香味性試験工程Ｓ１０ｄ）。
【００６０】
以上の工程Ｓ１０ａ〜Ｓ１０ｄで選抜された納豆菌Ｎ５−２ｉを用いるときは、再度、ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで確認される。即ち、表２の液体培地を試験管に１０ｍｌずつ分注し、そこに、前培養液を５００μｇずつ接種した。培養量は１菌体当たり５本（５０ｍｌ）作成した。それを、振とう培養した（回転数；１２０ｒｐｍ、温度；２７℃、時間；４９ｈｒｓ．）。
【００６１】
そして、ビタミンＫ低生産性確認工程Ｓ１０ｅで得られた培養液を遠心分離（回転数；５０００ｒｐｍ、時間；１５ｍｉｎ．）により集菌した（集菌工程Ｓ１０ｆ）。また、菌体に付着している培地成分などを完全に除去するために、滅菌水または滅菌生理食塩水を用いて、２〜３回、菌体洗浄及び集菌を繰り返し行った。
【００６２】
集菌工程１０ｆで回収された菌体を滅菌水で適宜希釈を行い、その希釈水を直ちに冷凍庫（−８０℃）に移し使用時まで凍結させた（納豆菌液調整工程Ｓ１０ｇ）。
【００６３】
以上の工程Ｓ１０ｅ〜Ｓ１０ｇを経て最適な納豆菌が選抜され、また、第２工程Ｓ２０の納豆菌散布工程Ｓ２０ｃの準備が完了する。
【００６４】
［第２工程］
第２工程Ｓ２０の大豆粉液成形工程Ｓ２０ａでは、大豆粉（生大豆）と加工水を混合し（１：１）、全体がペースト状になるようにする。そして、大豆粉ペーストを発酵規模などに合わせて一定量を容器に充填し密閉した。その後、大豆粉ペーストを高温高圧下で蒸煮処理を行った（蒸煮工程Ｓ２０ｂ）。
【００６５】
この蒸煮処理Ｓ２０ｂの後、ペースト状の蒸煮大豆粉に第１工程で作成された納豆菌液を散布した（納豆菌散布工程Ｓ２０ｃ）。この納豆菌散布工程Ｓ２０ｃでは、蒸煮大豆粉末を１００ｇ取りだして細かく粉砕する一方、１０００μｍｌの納豆菌調整液を解凍し、両者を混合した。この納豆菌散布工程Ｓ２０ｃの後、混合大豆粉末を温度４５℃、湿度９０％以上、７２時間で発酵した（発酵工程Ｓ２０ｄ）。なお、発酵時間が比較的長い時間に設定したため、培養時に増殖した納豆菌の一部が溶出する。
【００６６】
次いで、発酵した大豆粉末を−８０℃で冷凍処理し（冷凍工程Ｓ２０ｅ）、続いて、電子レンジで加熱処理を行った（解凍工程Ｓ２０ｆ）。冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを一組とする回数と納豆菌数との関係を試験したところ、表６に示す通りとなった。
【００６７】
【表６】
【００６８】
表６に示す試験結果によれば、冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを繰り返す回数が多くなればなるほど、納豆菌の個体数が減少するという結果がでた。なお、実施例では冷凍工程Ｓ２０ｅと解凍工程Ｓ２０ｆを繰り返す回数を１０回とした。
【００６９】
また、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆによるメナキノン量の減少率を納豆菌毎に試験した結果、表７に示すような結果となった。
【００７０】
【表７】
【００７１】
表７に示すように、市販納豆菌分離株の減量率を「１００％」とするとき、納豆菌Ｎ５−２Ｐが「６０％」、納豆菌Ｎ５−２ｉが「６２％」、納豆菌Ｏ−Ｚが「６６％」となり、納豆菌Ｎ５−２Ｐ，Ｎ５−２ｉ，Ｏ−Ｚの何れもが市販納豆菌分離株と比較してメナキノン量が著しく減少し、優れた効果を示している。
【００７２】
冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ後に行われるＵＶ照射工程Ｓ２０ｇでは、発酵大豆粉末１００ｇに７０％エタノールを２０００μｌ添加して攪拌し紫外線を２０分間に亘って照射するという処理を、合計６回に亘って繰り返した。
【００７３】
ここで、ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇの単独の影響を検討するため、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆを行うことなくＵＶ照射工程Ｓ２０ｇを行ったときは（納豆菌はＮ５−２ｉを使用）、表８に示す結果が得られた。
【００７４】
【表８】
【００７５】
表８に示す試験結果によれば、ＵＶ照射工程Ｓ２０ｇにて紫外線照射処理を行った場合には未処理の場合と比較し、納豆菌Ｎ５−２ｉではメナキノンの分解率が１８．８％となり、市販納豆分離株でも分解率が２７．４％となっており、菌体の破壊及びメナキノンの物理的分解効果として影響することが明らかとなった。
【００７６】
また、冷解凍工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆとＵＶ照射工程Ｓ２０ｇを共に行ったときは（納豆菌はＮ５−２ｉを使用）、表９に示す結果が得られた。
【００７７】
【表９】
【００７８】
表９に示す結果によれば、これら各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合は未処理の場合と比較し、メナキノンの分解率が２０．６％まで向上した。
【００７９】
以上のように、発酵工程Ｓ２０ｄ、冷凍工程Ｓ２０ｅ、解凍工程Ｓ２０ｆ及びＵＶ照射工程Ｓ２０ｇは納豆菌からメナキノンを溶出する溶出工程Ｓ２０ｊとなっている。
【００８０】
この溶出工程２０ｊの後に行われる定性工程は一つに限定されるものではないが、本実施例では以下のとおり行った。
【００８１】
まず、溶出工程Ｓ２０ｈを終えた大豆粉末（５ｇ）を乳鉢に取り、そこに研磨剤（ガラスビーズ、海砂）５ｇを混合した。次いで、７０％２−プロパノールを１０ｍｌ添加し、ペースト状になるまで十分にすり潰した。１００ｍｌ容三角フラスコに試料全量を移し、そこに、ヘキサン１０ｍｌを添加した。室温にて１５分間に亘って攪拌・遠心分離を行い、その後、上澄みになるヘキサン層を採取した。このヘキサン層をロータリーエバポレータで減圧乾燥させ、Ｃｅｐ-ＰａｋＣ１８カラムを用いてメナキノン成分の精製を行った。Ｓｅｐ-Ｐａｋ Ｃ１８ ｃａｒｔｒｉｃｌｇｅからヘキサンージエチルエーテル（３：９７）溶液で溶出させた。さらに、ロータリーエバポレーターで減圧乾燥させた。エタノール１ｍｌにて乾燥試料を溶解した。最後に、吸収波長Ｏ．Ｄ．２４８〜２６１ｎｍｌにてメナキノン成分の定性を行った。
【００８２】
［第３工程］
第３工程Ｓ３０の選定・洗浄工程Ｓ３０ａでは、原料大豆として平成１５年秋田県産コスズ（小粒）を使用した。続く浸漬工程Ｓ３０ｂではこの原料大豆に対して蒸留水６００ｍｌを温度１０℃にて４８時間漬けた。これにより、大豆の体積が２．３倍になった。その後、蒸煮工程Ｓ３０ｃで高温高圧下（温度：１２６℃、圧力：１．２ａｔｍ．、時間：６０ｍｉｎ．）で蒸煮した。
【００８３】
混合工程Ｓ３０ｄでは蒸煮大豆１００ｇに対して第２工程Ｓ２０で生成された発酵粉末大豆１０ｇを添加し攪拌した。これにより、混合大豆が曳糸性を発揮する。混合工程Ｓ３０ｄの後に行われる噴霧工程Ｓ３０ｅでは粉末大豆２０ｇを蒸留水３００ｍｌで３分間煮沸して煮大豆溶液を得、煮大豆溶液を混合大豆１００ｇ当たり３ｍｌ添加した。熟成工程Ｓ３０ｆでは脱酸素剤をいれた密閉性の高い容器に噴霧工程Ｓ３０ｅを終えた混合大豆を入れ、温度４５℃で３０分間に亘って熟成させた。
【００８４】
なお、第３工程Ｓ３０で製造された納豆のメナキノン含有量を定性したところ、表１０に示す結果となった。
【００８５】
【表１０】
【００８６】
この結果から分かるように、第２工程Ｓ２０の各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合（１２５μｇ／１００ｇ）も、また、各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行わなかった場合（１５４μｇ／１００ｇ）もメナキノン量の低下率が見られ、特に、各工程Ｓ２０ｅ，Ｓ２０ｆ，Ｓ２０ｇを行った場合にはその効果が極めて顕著なものとなっている。
【００８７】
図３はビタミンＫ低生産性納豆の製造方法の第２実施形態を示す工程図であり、第１実施形態と同一工程部分は同一符号で示し、その説明を省略する。
【００８８】
前記第１実施形態では発酵の対象となる大豆として、大豆を粉状にした大豆粉を用いている。これに対して、第２実施形態では発酵の対象となる大豆として丸大豆を用いた。
【００８９】
即ち、第２工程Ｓ２０において大豆粉液成形工程に代えて丸大豆準備工程２０ａ’を用いる。この丸大豆準備工程２０ａ’において状態の良い丸大豆を選定し、汚れなどを除去して待機し、この丸大豆に第２工程Ｓ２０の各工程Ｓ２０ｂ〜Ｓ２０ｉを行うようになっている。
【００９０】
また、第３工程Ｓ３０においては、前記第１実施形態の混合工程及び噴霧工程に代えて合わせ工程Ｓ３０ｄ’を行うようになっている。この合わせ工程Ｓ３０ｄ’では蒸煮工程Ｓ３０ｃを経た納豆用蒸煮大豆と第２工程で成形された定性済みの発酵丸大豆とを合わせて納豆を製造する。なお、この合わせ工程Ｓ３０ｄ’で納豆用蒸煮大豆と発酵丸大豆を納豆容器に収納する際は、菌体の繁殖が見られる発酵丸大豆を上側（開放蓋側）に配置し、蒸煮大豆を下側（容器の底側）に配置し、製品としての視覚性を損なうことがないようにする。
【００９１】
以上のように、本発明に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法においては、納豆菌の定性が可能であれば良く、発酵される大豆が粉状であろうと或いは丸大豆であろうと、更にはひき割り状であっても良い。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】第１実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を示す工程図
【図２】従来の納豆の製造工程図
【図３】第２実施形態に係るビタミンＫ低生産性納豆の製造方法を示す工程図
【符号の説明】
【００９３】
Ｓ１０…第１工程、Ｓ２０…第２工程、Ｓ３０…第３工程。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、
前記第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して大豆を発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、
前記第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する
ビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項２】
前記第１工程には、前記ビタミンＫ低生産性納豆菌のビタミンＫ低生産性を確認するビタミンＫ低生産性確認工程を有する
ことを特徴とする請求項１記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項３】
前記第２工程には納豆菌からメナキノンを溶出させる溶出工程を有する
ことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項４】
前記溶出工程は、発酵した大豆に対して冷凍と解凍を繰り返す冷凍・解凍工程又は発酵した大豆粉に紫外線を照射する紫外線照射工程の少なくとも一方からなる
ことを特徴とする請求項３記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項５】
前記第１工程でビタミンＫ低生産性納豆菌が接種される大豆として紛状にした大豆粉を用い、
前記第３工程は、大豆粉が添加された納豆用蒸煮大豆に対して豆乳、餅粉、コラーゲン粉末、カルシウム粉末などの添加食材を噴霧する添加食材噴霧工程を有する
ことを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れか一項記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項６】
前記第１工程でビタミンＫ低生産性納豆菌が接種される大豆として丸大豆を用いた
ことを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れか一項記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項７】
前記請求項１乃至前記請求項６の何れか一項に記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法によって製造される
ことを特徴とするビタミンＫ低含有納豆。
【請求項８】
抗生物質耐性を有する納豆菌を選抜するビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法において、
抗生物質耐性を有する納豆菌のうち、低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜してなる
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項９】
前記請求項８のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で得られた
ビタミンＫ低生産性納豆菌。
【請求項１０】
前記請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載のビタミンＫ低生産性納豆菌は前記請求項９で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌からなる
ことを特徴とするビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項１】
ビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜する第１工程と、
前記第１工程で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌を大豆に接種して大豆を発酵させ、次いで大豆に含まれるメナキノン量を定性する第２工程と、
前記第２工程で製造された大豆と納豆用蒸煮大豆とを合わせてなる第３工程とを有する
ビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項２】
前記第１工程には、前記ビタミンＫ低生産性納豆菌のビタミンＫ低生産性を確認するビタミンＫ低生産性確認工程を有する
ことを特徴とする請求項１記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項３】
前記第２工程には納豆菌からメナキノンを溶出させる溶出工程を有する
ことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項４】
前記溶出工程は、発酵した大豆に対して冷凍と解凍を繰り返す冷凍・解凍工程又は発酵した大豆粉に紫外線を照射する紫外線照射工程の少なくとも一方からなる
ことを特徴とする請求項３記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項５】
前記第１工程でビタミンＫ低生産性納豆菌が接種される大豆として紛状にした大豆粉を用い、
前記第３工程は、大豆粉が添加された納豆用蒸煮大豆に対して豆乳、餅粉、コラーゲン粉末、カルシウム粉末などの添加食材を噴霧する添加食材噴霧工程を有する
ことを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れか一項記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項６】
前記第１工程でビタミンＫ低生産性納豆菌が接種される大豆として丸大豆を用いた
ことを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れか一項記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【請求項７】
前記請求項１乃至前記請求項６の何れか一項に記載のビタミンＫ低含有納豆の製造方法によって製造される
ことを特徴とするビタミンＫ低含有納豆。
【請求項８】
抗生物質耐性を有する納豆菌を選抜するビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法において、
抗生物質耐性を有する納豆菌のうち、低ｐＨで死滅する納豆菌を選抜してなる
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項９】
前記請求項８のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で得られた
ビタミンＫ低生産性納豆菌。
【請求項１０】
前記請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載のビタミンＫ低生産性納豆菌は前記請求項９で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌からなる
ことを特徴とするビタミンＫ低含有納豆の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１８３１５５（Ｐ２００９−１８３１５５Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３１９９（Ｐ２００８−２３１９９）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（３０００５４６３１）有限会社エフ・テイ・イノベーション (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（３０００５４６３１）有限会社エフ・テイ・イノベーション (14)
【Ｆターム（参考）】
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