ピメリン酸の製造方法
【課題】ピメリン酸の製造方法の提供。
【解決手段】プロモーターと作動的連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した微生物を培養し、ピメリン酸を生産させる、ピメリン酸の製造方法。プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、組換え微生物。
【解決手段】プロモーターと作動的連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した微生物を培養し、ピメリン酸を生産させる、ピメリン酸の製造方法。プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピメリン酸の製造方法に関する。より詳しくは、バイオマスからのピメリン酸の発酵生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチックの生産の原料として、化石資源由来原料が用いられている。プラスチックを廃棄する場合、再生利用する場合はともかく、燃焼等による廃棄は炭酸ガスの放出を招くことから、近年問題となりつつある。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料を再生可能資源のひとつであるバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。
【０００３】
代表的なプラスチックの製造原料のひとつとして、ジカルボン酸が上げられる。ジカルボン酸は、ポリアミドやポリエステルのモノマーとしてだけでなく、ポリオール、ポリアミンの原料として用いられている。ジカルボン酸の炭素数の違いにより、得られるプラスチックの物性が大きく変化することから、炭素数の異なるさまざまなジカルボン酸が現在使用されている。
【０００４】
バイオマス原料から製造されるジカルボン酸としては、炭素数４のコハク酸が知られている。しかし、それ以外に炭素数の長いバイオマス原料から製造されるジカルボン酸が求められていた。
【０００５】
微生物の代謝物で、炭素数４のコハク酸より大きな炭素数からなるジカルボン酸としては、ビオチン生合成中間体として、炭素数７のピメリン酸が知られている。ピメリン酸を出発原料として、ビオチンを生産する製造方法も開示されている（特許文献１）。
【０００６】
しかし、現時点において、微生物におけるピメリン酸の生合成経路は完全に解明されていない。
【０００７】
枯草菌におけるビオチン生合成酵素として、シトクロムＰ４５０系酸化酵素の一種であるＢｉｏＩが知られている（特許文献１）。
【０００８】
ＢｉｏＩは、菌体内で、脂肪酸−ＡＣＰ（アシルキャリアープロテイン）から、ピメリル−ＡＣＰを生成することが明らかとなっている（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、大腸菌でＢｉｏＩを過剰発現させた場合、Ｃ１４〜Ｃ１８脂肪酸ＡＣＰとＢｉｏＩの複合体が生じ、この複合体のターンオーバーでピメリルＡＣＰが生じることが報告されている。しかし、遊離のピメリル酸が生じることは報告されていない（非特許文献１）。
【０００９】
一方、インビトロでは遊離脂肪酸に対する活性もあることが報告されているが、活性は極めて小さい（非特許文献３）。
【００１０】
遊離脂肪酸の生合成系としては、脂肪酸−ＡＣＰ（アシルキャリアープロテイン）からの脂肪酸−ヒドラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１４）による加水分解、あるいは、トリグリセリドからのリパーゼによる加水分解が知られているが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、どちらの酵素遺伝子も保有していない（図１）。よって、大腸菌においては、遊離脂肪酸の生合成系を保有せず、菌体内に遊離脂肪酸が存在する報告は無い。
【００１１】
また、ピメリルＡＣＰから遊離ピメリル酸が生じるか否かはわかっていない。
【００１２】
加えて、ビオチン生合成系に関しても、これまでに明らかになっているのは、ピメリルＣｏＡが出発物質であり、ビオチン生合成中間体として遊離のピメリン酸が存在するかは、明らかになっていない。
【００１３】
ピメリン酸の微生物生産としては、Ｃ１１の直鎖状アルカン、或いは脂肪酸エステルや不飽和脂肪酸を原料にバチルス属の微生物と接触させる方法が報告されている（特許文献２、非特許文献４）が、この場合、原料はＣ１１の直鎖状アルカン、或いは脂肪酸エステルに限定され、原料が著しく制限されるという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平７−１７７８９５号
【特許文献２】特開昭６２−６６９２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３８４， ３５１（２０００）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ １０５， １５６９６（２００８）
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ８６ （２００４）
【非特許文献４】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６４９ （１９８３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、ナイロン原料等として有用なジカルボン酸の一種であるピメリン酸をバイオマスなどを原料として微生物にて製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、バイオマスを原料としてピメリン酸を製造する方法に関して鋭意検討を行った結果、ＢｉｏＩ遺伝子を形質転換した微生物を用いてピメリン酸を生産する方法を見出した。
【００１８】
すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである：
（１）プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した組換え微生物を培養し、ピメリン酸を生産させることを含む、ピメリン酸の製造方法。
（２）組換え微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記１記載のピメリン酸の製造方法。
（３）組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記１記載のピメリン酸の製造方法。
（４）プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。
（５）微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記４記載の組換え微生物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、バイオマス原料から、プラスチック原料として有用なピメリン酸を製造できる。得られたピメリン酸は、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物と重合することで、耐熱性のポリアミドを提供することができる。また、化石資源ではなく、非化石資源であるバイオマスを原料としてピメリン酸を製造できることから、本発明は、地球環境に対して優しい製造方法となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）遊離脂肪酸の生合成反応。脂肪酸−ＡＣＰヒドロラーゼおよびリパーゼがなければ脂肪酸−ＡＣＰおよびトリグリセリドからの遊離脂肪酸の合成は生じない。（Ｂ）大腸菌のグリセロ脂質代謝マップ（ＫＥＧＧ：Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓデータベースより）。大腸菌には、遊離脂肪酸の生合成経路が無いことを示す。無色の酵素番号は、大腸菌での欠損を意味する。
【図２】（Ａ）枯草菌ビオチン生合成オペロンを示す。（Ｂ）ｂｉｏＡ〜ｂｉｏＢがＴｃに置換されるｂｉｏＡ〜ｂｉｏＢ欠損を示す。
【図３】ｂｉｏＷ−Ｔｃ−ｂｉｏＩ遺伝子の作製方法を示す。Ｆ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｆ−Ｔｃ、Ｒ−Ｔｃ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｒ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎはプライマーを示す。ｙａｔＰ−Ｔｃ−ｂｉｏＩ遺伝子も、Ｆ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｆ−Ｔｃ、Ｒ−Ｔｃ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｙａｔＰ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｂｉｏＩを用いて同様に作製された。
【図４】増幅された遺伝子の電気泳動写真を示す。ｆｅｒは、増幅されたｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子、ｙｋｕＮは増幅されたｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ遺伝子、ｙｕｍＣは、ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ：ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子、ＢｉｏＩは、増幅されたｂｉｏＩ遺伝子、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣは増幅されたｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣは増幅されたｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子を示す。両端のレーンは、分子量マーカー（タカラバイオ製 ５００ｂｐＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）を示す。
【図５】ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子またはｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の作製方法を示す。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）、Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ、Ｆ−ｙｕｍＣ−ｂｉｏＩ、Ｒ−ｙｕｍＣ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ、Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはプライマーを示す。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）は、Ｆ−ｙｋｕＮプライマーまたはＦ−ｆｅｒプライマーを意味する。Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩは、Ｒ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩプライマーまたはＲ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩプライマーを意味する。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはＦ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーまたはＦ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーを意味する。Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはＲ−ｙｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ｙｕｍプライマーまたはＲ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーを意味する。
【図６】発現ベクターの構成を示す。ｐＨＴ０１は、コントロール用発現プラスミドである。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ蛋白質を発現する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣはｙｋｕＮ遺伝子、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ、ＹｋｕＮ、ＹｕｍＣの３つの蛋白質を発現する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣはｆｅｒ遺伝子、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ、Ｆｅｒ、ＹｕｍＣの３つの蛋白質を発現する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２はｂｉｏＩ遺伝子、ｏｒｆ２遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ蛋白質とｏｒｆ２遺伝子産物の２つを発現する。
【図７】（Ａ）ｂｉｏＩ遺伝子発現枯草菌培養上清中のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。Ｗｉｌｄは、形質転換されていないＩＳＷ１４１２野生株を意味する。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【図８】（Ａ）ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子発現枯草菌のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２は、ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。２４ｈは、２４時間培養、４８ｈは４８時間培養を示す。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【図９】（Ａ）ｂｉｏＩ発現大腸菌のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は、発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２はｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ｂｉｏＩ遺伝子を含有する発現ベクターによって形質転換した組換え微生物を用いてピメリン酸を製造する方法に係るものである。
【００２２】
本発明におけるｂｉｏＩ遺伝子は、ビオチン生合成に関与する遺伝子であり、Ａｃｙｌ−ＡＣＰ（脂肪酸のカルボン酸にアシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）が共有結合したもの）の炭素鎖を位置特異的に酸化的に切断し、Ｐｉｍｅｌｙｌ−ＡＣＰに変換する酵素をコードする遺伝子である。しかし、Ｃ１６前後の炭素数のＡｃｙｌ−ＡＣＰを基質とするようであるが正確にはわかっていない。Ａｃｙｌ−ＡＣＰをＰｉｍｅｌｙｌ−ＡＣＰに変換する酵素をコードする遺伝子であれば限定されないが、好ましくは、枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９２８：配列番号１）または枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子である。
【００２３】
枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子の核酸配列（配列番号１）：
gtgacaattgcatcgtcaactgcatcttctgagtttttgaaaaacccatattctttttacgacacattgcgagctgttcatcctatctataaagggagtttcttaaaatacccgggctggtatgtcacaggatatgaagaaacggctgctattttgaaagatgcgagattcaaagtccgcaccccgctgcctgagagctcaaccaaatatcaggacctttcacatgtgcaaaatcaaatgatgctgtttcagaaccagcctgatcatagacgattgcggacgcttgccagcggagcgtttacgccgagaacgacagagagttatcagccgtatatcattgaaactgtccatcatttgcttgatcaagtgcaaggtaaaaaaaagatggaggtcatttcggactttgcttttcctttagcaagttttgtcatagctaacattataggtgtaccggaggaagatagggagcaattaaaggagtgggctgcgagtctcattcaaacgattgattttacccgctcaagaaaggcattaacagagggcaatattatggctgtgcaggctatggcatatttcaaagagctgattcaaaagagaaaacgccaccctcaacaggatatgatcagcatgctcttgaaggggagagaaaaggataagctgacggaagaggaggcggcatctacgtgcatattgctggcgatcgccggacatgagacaacggtcaatctcatcagcaattcagtcctttgtctgctgcagcatccagaacagcttttgaaactgagagaaaatccagatcttattggtaccgcagtcgaggaatgtttacgctatgaaagccccacgcaaatgacagccagagttgcgtcagaggatattgacatctgcggggtgacgatccgtcaaggagaacaagtctatcttttgttaggagcggctaatcgagaccctagcatattcacgaaccccgatgtcttcgatattacgagaagtcctaatccgcatctttcattcgggcatggccatcatgtttgcttagggtcctcgctggcacgattagaagcgcaaattgcgattaacactcttctgcagcgaatgcccagccttaatcttgcggattttgaatggcggtatcggccgctttttggatttcgggcgcttgaggagctgccggtgacttttgaataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００２４】
枯草菌のｂｉｏＩのアミノ酸配列（配列番号２）：
MTIASSTASSEFLKNPYSFYDTLRAVHPIYKGSFLKYPGWYVTGYEETAAILKDARFKVRTPLPESSTKYQDLSHVQNQMMLFQNQPDHRRLRTLASGAFTPRTTESYQPYIIETVHHLLDQVQGKKKMEVISDFAFPLASFVIANIIGVPEEDREQLKEWAASLIQTIDFTRSRKALTEGNIMAVQAMAYFKELIQKRKRHPQQDMISMLLKGREKDKLTEEEAASTCILLAIAGHETTVNLISNSVLCLLQHPEQLLKLRENPDLIGTAVEECLRYESPTQMTARVASEDIDICGVTIRQGEQVYLLLGAANRDPSIFTNPDVFDITRSPNPHLSFGHGHHVCLGSSLARLEAQIAINTLLQRMPSLNLADFEWRYRPLFGFRALEELPVTFE
【００２５】
本発明で用いられるｂｉｏＩ遺伝子および下記遺伝子においては、塩基配列に修飾が加えられているものも含まれる。例えば、アミノ酸を欠失、好ましくは１〜数個欠失するような範囲で塩基が欠失されたものでもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が置換、好ましくは１〜数個置換されたものでもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が付加、好ましくは１〜数個付加されたものでもよい。但し、そのような修飾があっても、修飾前の活性を有するタンパク質をコードするものであることが必要である。このような改変された塩基配列（変異体）は、例えば、部位特異的変異法等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明の遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。
【００２６】
ｂｉｏＩ遺伝子の組み込みベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を利用することが出来る。シャトルベクターであっても良い。好ましくは、大腸菌、枯草菌、酵母のための発現用プラスミドである。
【００２７】
大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８が挙げられる。枯草菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫＤＮＡ、ｐＨＴ０１が挙げられる。酵母由来プラスミドとしては、例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５が挙げられる。これらのプラスミドは、市場より入手できる。
【００２８】
本発明の組換えベクターを適当な宿主に導入して、該宿主の形質転換を行うことによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
【００２９】
宿主としては、微生物であれば限定されないが、例えば、細菌、酵母などが挙げられる。好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ）等が挙げられる。これらの中でも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。これらの宿主は、市場より入手できる。
【００３０】
宿主は、生産されたピメリン酸がさらなる代謝を受けることを防ぐため、宿主のビオチン生合成系が欠損していてもよい。好ましくは、ｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、およびｂｉｏＡ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを欠損している宿主である。ｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、およびｂｉｏＡ遺伝子は、枯草菌のｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、ｂｉｏＡ遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子も含む。
【００３１】
枯草菌のｂｉｏＡ遺伝子の核酸配列（配列番号３４）：
atgactcatgatttgatagaaaaaagtaaaaagcacctctggctgccatttacccaaatgaaagattatgatgaaaaccccttaatcatcgaaagcgggactggaatcaaagtaaagacataaacggcaaggaatactatgacggtttttcatcggtttggcttaatgtccacggacaccgcaaaaaagaactagatgacgccataaaaaaacagctcggaaaaattgcgcactccacgttattgggcatgaccaatgttccagcaacccagcttgccgaaacattaatcgacatcagcccaaaaaagctcacgcgggtcttttattcagacagcggcgcagaggcgatggaaatagccctaaaaatggcgtttcagtattggaagaacatcgggaagcccgagaaacaaaaattcatcgcaatgaaaaacgggtatcacggtgatacgattggcgccgtcagtgtcggttcaattgagctttttcaccacgtatacggcccgttgatgttcgagagttacaaggccccgattccttatgtgtatcgttctgaaagcggtgatcctgatgagtgccgtgatcagtgcctccgagagcttgcacagctgcttgaggaacatcatgaggaaattgccgcgctttccattgaatcaatggtacaaggcgcgtccggtatgatcgtgatgccggaaggatatttggcaggcgtgcgcgagctatgtacaacatacgatgtcttaatgatcgttgatgaagtcgctacaggctttggccgtacaggaaaaatgtttgcgtgcgagcacgagaatgtccagcctgatctgatggctgccggtaaaggcattacaggaggctatttgccaattgccgttacgtttgccactgaagacatctataaggcattctatgatgattatgaaaacctaaaaacctttttccatggccattcctatacaggcaatcagcttggctgtgcggttgcgcttgaaaatctggcattatttgaatctgaaaacattgtggaacaagtagcggaaaaaagtaaaaagctccattttcttcttcaagatctgcacgctcttcctcatgttggggatattcggcagcttggctttatgtgcggtgcagagcttgtacgatcaaaggaaactaaagaaccttacccggctgatcggcggattggatacaaagtttccttaaaaatgagagagttaggaatgctgacaagaccgcttggggacgtgattgcatttcttcctcctcttgccagcacagctgaagagctctcggaaatggttgccattatgaaacaagcgatccacgaggttacgagccttgaagattga
【００３２】
枯草菌のｂｉｏＦ遺伝子の核酸配列（配列番号３５）：
ttgaagattgattcctggttaaacgagcggttagacagaatgaaagaagccggcgtacatcgtaacctgcggtcaatggatggagcgccggttccagagaggaatattgatggcgaaaatcaaacggtctggtcctcaaacaattatttagggctcgcaagcgatagacgtttgatcgatgcagcccaaacagcattgcagcaatttgggacaggaagcagcggttcacgtttaacgacaggcaattcggtctggcatgaaaagctagaaaagaagattgccagctttaaactgacagaagcggccctgctgttttcgagcggttacttggccaatgtcggtgtcctttcatccttgccagaaaaggaagatgtcattttaagtgaccagctcaatcatgcaagtatgatcgacggctgccgactttctaaggctgatacagttgtttatcggcatattgatatgaatgatcttgaaaacaagctgaatgaaacacagcgttatcagcgccgttttatcgtaacagacggagtattcagcatggatggcacaatcgcccctcttgatcagatcatctcacttgcgaaacgctatcatgccttcgtggtcgttgatgatgcccacgcaacaggagttttgggcgattcgggacaaggaacgagtgaatactttggtgtttgtcccgacattgttatcggcaccttaagcaaagctgttggcgcggaaggaggttttgcggcaggatcagcggtcttcatcgactttttgctgaaccatgccagaacatttatctttcaaaccgctattccgccagccagctgtgcggctgctcacgaggctttcaacatcattgaagccagcagggaaaaacgacagcttttattttcttatatcagcatgatcagaaccagtctgaagaatatgggttatgtggtgaaaggagatcacacaccgattattcctgtagtcattggcgatgcccataaaacggtcctatttgctgaaaaactgcagggcaagggaatttatgctcctgccattcggccgccaaccgttgcgccgggtgaaagccggattcgaattacaatcacgtctgaccacagtatgggtgatattgatcatttgctgcaaacatttcattcaatcggaaaggagctgcacatcatttga
【００３３】
枯草菌のｂｉｏＤ遺伝子の核酸配列（配列番号３６）：
ttgaggggtttttttgtgacgggaactgatacagaagtagggaaaacggttatatccagcggtcttgctgccttattgaaagacaataata gacatgtcggggtgtataaaccatttttaagcgggatatcgcgccatcatccagatagtgatacaagtttgctgaaagatatgtcgcagaccagtctttctcatgaagacattacgccttttgccttcaaggcgccgcttgcaccatacgttgcagggaaacttgagggaaagactgtcaccatggaagaggttttaagccattgggggcggattagagaaaaacatgaatgcttcatcgtagaaggtgcaggcggtatttctgtgccattgggagaggactatttggtcagtcatgtcataaaagcgttgcagcttcccatgattattgtggcgcgtcctcgccttggaaccattaatcatacctttttaactgtcaaatatgcagaaagcatggggcttccaatcgccggaattatcatcaatggaatcagtgactctcctgatgaagatgaaaaaaccaatcctgagatgattgagcgcttatgcggtgtgccgattttaggggttacgccaaagcttgccaacgtgacgaaagaaacggttctacatatggtaaaagaccatatcaatctatcattactgatgaatcaagtgggggtatga
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００３４】
枯草菌のｂｉｏＢ遺伝子の核酸配列（配列番号３７）：
atgaatcaatggatggaactcgcagaccgggtgctggctggagcagaagtgactgacgaagaggcgctttcaatattacattgtcctgatgaagatattttgctattaatgcacggggcttttcacatcagaaaacacttttacggaaaaaaagtaaagctcaatatgattatgaatgcgaaatccgggctctgcccggaaaactgcggctattgttcacagtctgcgatttcgaaagcgccgattgagtcttaccggatggtgaataaggaaacgctgcttgaaggcgcgaagcgggcgcacgatctgaatatcggcacatattgtatcgtggcaagcggcagaggtccgtctaacagagaagtggatcaggtcgtagatgcggttcaggaaattaaagagacgtatggactgaagatttgtgcatgtcttggactgttgaagccagagcaggcgaagcggctcaaagatgcaggagtagaccgctataatcataatttgaatacgtcacagagaaaccattcaaacat cacaacctcacatacatacgatgacagagtcaatacggttgaaatcgcaaaagaatcggggctgtctccgtgttcaggcgccattatcgggatgaaggagacgaaacaggatgtcattgacatcgccaaaagcttgaaggctcttgacgcggattccattcctgtgaattttttgcatgcaattgatggcacgccgttagaaggcgtcaacgaattaaacccgctgtattgtttaaaagtgctggcgctgttccgttttatcaatccatcaaaagaaattcgcatttccggaggaagagaggtcaatctccgcacattgcagccattagggctttacgccgcaaactccatttttgtcggagactacttaacaactgccgggcaagaggagacggaggatcataaaatgctgagtgatttaggctttgaagttgaatcagtcgaagaaatgaaggctagtttaagtgcgaaaagctga
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００３５】
宿主の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、組換えタンパク質生産法（生物化学実験法４５ 学会出版センター刊）に記載された、エレクトロポレーション法やカルシウム法によってコンピテントセルとした菌を用いる方法などがある。
【００３６】
プロモーターは、宿主中において、連結している外来遺伝子を発現させるものであれば限定されない。宿主が大腸菌である場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｒａｃプロモーターなど、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｇｒａｃプロモーターなど、宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
【００３７】
プロモーターに作動的に連結するとは、プロモーターの制御下で目的遺伝子産物が生成するようにプロモーターの下流に目的遺伝子を連結することを意味する。
【００３８】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した組換え微生物とは、上記の組換えＤＮＡ手法を用いて外からプロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入することでｂｉｏＩ遺伝子産物が生じるようになった微生物を意味する。プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子は、宿主のゲノムに組み込まれてもよいが、プラスミドに組み込まれた形態で存在することが好ましい。
【００３９】
形質転換体を培養するための培地には、該宿主が生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、グルコース、シュークロースなどの糖類を炭素源として、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキスなどの有機窒素源、さらに各種無機塩やビタミン類などを含有した培養液を用いることができる。培養は、宿主によって好気的または嫌気的であってもよい。培養時間は、形質転換体の増殖とピメリン酸の産生量から当業者は適宜設定することができるが、１日から１ヶ月程度培養を行えばよい。培養温度は、微生物の増殖可能な温度であれば限定されず、当業者は形質転換体の増殖とピメリン酸の産生量から適宜設定することができる。
【００４０】
ピメリン酸とは、以下の式：
【化１】
の化合物をいう。
【００４１】
ピメリン酸を生産させるとは、生産されたピメリン酸が菌体内に蓄積してもよいが、菌体外に分泌されることが好ましい。
【００４２】
フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）遺伝子とは、電子伝達体として機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフェレドキシン遺伝子（ｆｅｒ）である。フェレドキシンは、ＢｉｏＩと共役している。
【００４３】
枯草菌のフェレドキシン（ｆｅｒ）遺伝子の核酸配列（配列番号３）：
atggcaaagtacacaatcgtagacaaagatacatgtattgcatgcggcgcttgcggagctgctgcaccagacatttacgattacgatgatgaaggcatcgcgttcgtaacgcttgatgaaaacaaaggtgttgtcgaagttcctgaggtactggaagaagatatgattgacgcatttgaaggatgccctactgattccatcaaagtggcggatgagccatttgaaggcgacccgcttaaatttgaatag
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４４】
フラボドキシン（ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ）遺伝子とは、電子伝達体として機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフラボドキシン遺伝子（ｙｋｕＮ）である。フラボドキシンは、ＢｉｏＩと共役している。
【００４５】
枯草菌のフラボドキシン（ｙｋｕＮ）遺伝子の核酸配列（配列番号４）：
atggctaaagccttgattacatatgccagcatgtcaggaaatacagaagacattgccttcataataaaagatacgcttcaggaatatgagttggatatcgattgtgtcgagataaatgatatggatgcgtcttgtttaacctcctatgattatgtactgattggcacctatacatggggggacggcgatttgccctacgaagcggaggattttttcgaagaggtcaaacagattcagcttaatggtttaaaaacagcctgcttcgggtctggcgattattcttatccaaagttttgcgaagcggtgaatttgttcaatgtcatgctgcaagaggcgggagctgctgtttaccaggaaacactaaaaattgaattagcgcctgaaacagatgaagatgtggaaagctgccgagcgtttgcgagaggttttcttgcatgggcagattatatgaacaaggaaaaaatccatgtttcataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４６】
フェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ：ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子は、フェレドキシンＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＥＣ １．１８．１．３）遺伝子と同義であり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを還元型フェレドキシンによって酸化してＮＡＤ（Ｐ）＋を再生するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ遺伝子（ｙｕｍＣ）である。フェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼはＢｉｏＩと共役している。
【００４７】
枯草菌のフェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ（ｙｕｍＣ）遺伝子の核酸配列（配列番号５）：
atgcgagaggatacaaaggtttatgatattacaattataggcgggggaccggtcggcttattcaccgctttttacggcgggatgagacaggcaagcgtcaaaattatcgaaagcctgcctcagctcggcggacagcttagcgccctataccctgagaagtatatatatgatgtagcgggattcccgaaaatccgcgcgcaagagcttatcaataacctaaaagagcaaatggcgaaattcgaccaaaccatttgtctggagcaagcggttgaatctgttgagaaacaagcggacggcgtgtttaagcttgtacaaatgaagaaacccactactctaaaacggtcatgcataactgcaggaaacggcgcattcaaaccgagaaagctggaacttgaaaatgccgagcagtatgaaggcaaaaacctccattacttcgttgatgatctgcaaaaattcgccggcagacgcgttgcgatccttggcggtggagattccgcggttgactgggcgcttatgcttgagccaatcgcaaaagaagtatcgatcattcaccgccgcgacaagttccgagcgcacgagcacagtgtggaaaaccttcatgcgtcgaaggttaatgtcctgacaccattcgtccctgcggagctgatcggcgaagacaaaatcgaacagctagtgcttgaagaagtgaaaggcgaccgcaaagagattttagaaattgatgacttaatcgtcaactacggtttcgtttcatctcttggaccgatcaaaaactggggcctggacatcgagaaaaattccattgtcgtgaaatcaacaatggaaacaaatatcgaaggcttctttgcagcaggtgacatttgtacatacgaaggaaaagtcaacctgattgccagcggcttcggcgaggcaccgacagcagtgaacaacgccaaggcttacatggacccgaaagcccgcgtacagcctcttcactcaacaagtctttttgaaaataaataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４８】
枯草菌のｏｒｆ２遺伝子とは、枯草菌ビオチン生合成オペロンのｂｉｏＩの下流に見出される蛋白質がコードされていると推測される下記配列番号６の配列を有する遺伝子であるが、ｏｒｆ２遺伝子産物は、特定されていない。
【００４９】
枯草菌のｏｒｆ２の核酸配列（配列番号６）：
gcctaagaatgtgagtgccaaaaaagtgtcagccccgccgaaaatgggcaatctataaaaaaggggagtgaacatcgtgaaaaaagtgctgatcgccggcggaaatggtgtgattgggagactgcttgctgaagggcttatttcagactatgaagtgactgtgcttgataaagatcatttcgatggcaaagcctcttccattcaggctgacgcggcaaattatgaggagctgttgaagaagattccaaaagataccgatgccatcttgaatttactcgctgtgaaaatcaaatacgatattatggacatcgctgagtttgaaaaaatgacggatgttttctatagggcaagctattatctgtgccgtgcggcagcggagctcggcattcaaaagctcgtgttcgccagcagcaatcatgtcacagatgtatatgaaaaagacgggcgctcgctcttaggacgggaaatcacaacaagcgattatccgctgtcaaaaaacttgtacggtgtattaaagctgacctctgaacagatcggccatttgttttatttggaaaataagctatcagtaatcaaccttcgaatcggaacagtcgtgacagatgaaatggatacgctgcatgaaaaagaacggacgaaaaagacactgctttctcaccccgatctgctgtcgattttcaaagccgccattgagaccaacatccggtatggcacttattacgccgtctctgataatccgggccggccatggtccattgaatctgccgtgaatgaacttgggttttcgccacaaatcaatacggctgaacttctgaacgaggaggagaacggagcataa
下線は推定開始コドン及び推定停止コドンを示す。
枯草菌のビオチン生合成オペロン遺伝子の核酸およびアミノ酸配列はアクセッション番号：Ｕ５１８６８で登録されている。
【００５０】
本発明の組換え微生物は、ｂｉｏＩ遺伝子と共に、ｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子からなる群から選択させる少なくとも１つを発現させることが好ましい。より好ましくは、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子とｙｕｍＣ遺伝子の共発現、ｂｉｏＩ遺伝子、ｆｅｒ遺伝子とｙｕｍＣ遺伝子の共発現、またはｂｉｏＩ遺伝子とｏｒｆ２遺伝子の共発現である。ｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子は、枯草菌のｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子も含む。
【００５１】
本発明で使用する、微生物、組換えＤＮＡ、ＰＣＲ、発現、培養技術等の分子生物学実験技術は、当業者に周知であり、一般的な教科書（例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）； ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）； ＰＣＲ：ＴＨＥ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）； ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ，ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．１９９９）；及びＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓなど）に詳細に説明されている。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５３】
実施例１、枯草菌ビオチン合成オペロン欠損株の作製
枯草菌ビオチン合成オペロンの構造はＰｅｒｋｉｎｓらによって報告された（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．１９９６，ｐ．６３６１−６３６５）。図２Ａにその構造を示す。本研究では、ｂｉｏＩ遺伝子発現プラスミドの宿主として、枯草菌株ＩＳＷ１２１４株（タカラバイオより入手）よりｂｉｏＡからｂｉｏＢまたはｂｉｏＷからｂｉｏＢまでの領域をテトラサイクリン耐性遺伝子に置換した株を作製した（図２Ｂ）。作製方法を以下に示す。
【００５４】
枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株からのゲノムＤＮＡ抽出：
本実験には、ＱＩＡＧＥＮ社のゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ，Ｃａｔ． Ｎｏ．１９０６０；Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２２３）を用いた。
【００５５】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を試験管に入った６ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。遠心により４ｍＬ分の培養液から１．５ｍＬチューブに菌体を回収し、あらかじめ２μＬの１００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）を添加した１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ Ｂ１に菌体を懸濁した。２０μＬの１００ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液（Ｗａｋｏ，Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ， Ｃａｔ．Ｎｏ．１２６−０５０１３，水で調製した）を加えて撹拌し、さらに２０ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１３１）を４５μＬ加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した（保温後、液が透明になり、もやもやしたものが確認できた）。次に、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ２を０．３５ｍＬ加えて撹拌し、５０℃で４０分間保温した。
【００５６】
あらかじめ２ｍＬのＢｕｆｆｅｒ ＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐカラムにこのサンプル液を移し、圧をかけながら液を流した。サンプルを流した後、同様の方法でＢｕｆｆｅｒ ＱＣを３ｍＬ（１ｍＬ×３回）流し、カラムを洗浄した。あらかじめ５０℃で保温したＢｕｆｆｅｒ ＱＦ（１ｍＬ×２回）で吸着していたＤＮＡを溶出した。得られた約２ｍＬのＤＮＡ溶液を０．５ｍＬずつ１．５ｍＬチューブに小分けし、０．３５ｍＬずつ２−プロパノールを加えて撹拌した（この際、白い繊維状の沈殿を確認した）。遠心により沈殿を回収し、７０％エタノールを１ｍＬ加えて沈殿を洗浄した。遠心後、上清を除き、沈殿を乾燥した。各チューブに２５μＬずつＴＥｂｕｆｆｅｒを加えてＤＮＡを溶解後、４本分を１本のチューブにまとめ、精製ゲノムＤＮＡ溶液とし（約１００μＬ）、−２０℃で保存した。
【００５７】
（１）ｂｉｏＡからｂｉｏＢ領域欠損株作製用融合遺伝子（ｂｉｏＩ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｂｉｏＷ遺伝子）の作製（図３）
（１−１）ｂｉｏＩ遺伝子（約１．２ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ（配列番号：７）：５′−ＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧ−３′
Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ（配列番号：８）：５′−ＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００５８】
ＰＣＲはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）と添付の反応バッファーを使用し、反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤを１ユニット使用し、９４℃ ２分加熱した後、９４℃ ４５秒、５４℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った（Ｂｉｏ-Ｒａｄ、ＭｙＣｙｃｌｅｒ）。
【００５９】
（１−２）ｂｉｏＷ遺伝子（約０．８ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ（配列番号：９）：５′−ＡＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＣ−３′
Ｒ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ（配列番号：１０）：５′−ＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００６０】
ＰＣＲはｂｉｏＩ遺伝子増幅と同条件で行った。
【００６１】
（１−３）テトラサイクリン耐性遺伝子（約１．５ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−Ｔｃ（配列番号：１１）：５′−ＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＴＡＴＴＧ−３′
Ｒ−Ｔｃ（配列番号：１２）：５′−ＴＴＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＣ−３′
【００６２】
ＰＣＲはｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ（タカラバイオ）１０ｎｇを鋳型として、ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）と添付の反応バッファーを使用し、反応条件は反応体積５０μｌ、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤを１ユニット使用し、９４℃ ５分加熱した後、９４℃ １５秒、６５℃ ３０秒（１サイクルごとに０．３℃低下させた）、６８℃ ９０秒のサイクルを３０回行った。
【００６３】
（１−４）融合遺伝子（ｂｉｏＷ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｂｉｏＩ遺伝子）の増幅（図３）
上記の方法で増幅したｂｉｏＩ遺伝子（２６．８ｎｇ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（６８ｎｇ）及びｂｉｏＷ遺伝子（３２．６ｎｇ）を混合し、以下の２種類のプライマーを用いてｂｉｏＩ遺伝子の増幅の場合と同条件でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物はＲＥＣＯＴＩＰ（タカラバイオ社）を用いて精製した。
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：１３）：５′−ＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣ−３′
Ｒ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：１４）：５′−ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＧ−３′
【００６４】
（１−５）枯草菌の形質転換とｂｉｏＡからｂｉｏＢまでの欠損株のスクリーニング
融合遺伝子（ＰＣＲ産物）１μｇを用い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ添付の取扱説明書に従って、枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ（株））へ形質転換した。
【００６５】
コンピテントセルの調製方法：
（ｉ）第１培養
１）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株をＬ−ｂｒｏｔｈ ５ｍｌに接種。３７℃で一晩振とう培養する。
２）一晩培養液をＳＰＩ培地に植菌後（接種量約１％）、３７℃で振とう培養する。
３）生育が対数増殖期後期に達した時点で、培養液にグリセロールを終濃度１２．５％になる様、添加する。
４）ミクロ遠心管（エッペンドルフ型、ポリプロピレン）に４００μｌずつ分注後、ドライアイス−エタノールで急速凍結し、−７０℃で保存する。
【００６６】
（ｉｉ）第２培養
１）保存しておいた培養液を３７℃ですみやかに融解する。
２）ＳＰＩＩ培地で７．５倍に希釈する。
３）３７℃で９０分間振とう培養を行ない、その培養液をコンピテントセルとして用いる。
【００６７】
ＳＰＩ培地：（ＮＨ４）ＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６％、Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、＊Ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５％、＊Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．０２％、＊Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．１％、＊Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ ５０μｇ／ｍｌ、＊Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ５０μｇ／ｍｌ
＊ 別殺菌
【００６８】
ＳＰＩＩ培地：（ＮＨ４）ＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６％、Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、＊Ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５％、＊Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．０２％、＊ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、＊Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ ５μｇ／ｍｌ、＊Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ５μｇ／ｍｌ
＊ 別殺菌
【００６９】
形質転換および目的欠損株のスクリーニング方法：
１）コンピテントセル液５００μｌに融合遺伝子溶液５００μｌ（融合遺伝子１μｇ）を加える。
２）３７℃で３０分間振とうする。
３）１００μｌのＬ−ｂｒｏｔｈを加え、さらに３７℃で６０分間振とう後、集菌する。
４）テトラサイクリンを２μｇ／ｍｌ含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択し、分離したテトラサイクリン耐性株のｂｉｏｔｉｎ要求性を、ロイシン及びメチオニンを５０μｇ／ｍｌ含有するＳｐｉｚｉｚｅｎ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ寒天培地におけるｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性の増殖で確認する。
【００７０】
ｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性に増殖する菌株を目的欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）、図２Ｂ）として得た。
【００７１】
（２）ｂｉｏＷからｂｉｏＢ領域欠損株作製用融合遺伝子（ｂｉｏＩ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｙａｔＰ遺伝子）の作製
（２−１）ｙａｔＰ遺伝子の増幅（約１．０ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ（配列番号：１５）：５′−ＡＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣ−３′
Ｒ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ（配列番号：１６）：５′−ＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＧＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００７２】
（２−２）融合遺伝子（ｂｉｏＩ−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｙａｔＰ遺伝子）の作製
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｙａｔＰ（配列番号：１７）：５′−ＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＣＧ−３′
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｂｉｏＩ（配列番号：１８）：５′−ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＧ−３′
【００７３】
３遺伝子の融合遺伝子の増幅は、反応体積５０μｌ中で、ｂｉｏＩ遺伝子（２６．８ｎｇ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（３４０ｎｇ）及びｙａｔＰ遺伝子（２８５ｎｇ）を混合し、上記２種類のプライマー各２００ｎＭ、ＫＯＤプラス１ユニットを使用して、９４℃ ２分加熱した後、９４℃ ４５秒、５４℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。
【００７４】
（２−３）枯草菌の形質転換とｂｉｏＷからｂｉｏＢまでの欠損株のスクリーニング
ＰＣＲ産物をＲＥＣＯＴＩＰ（タカラバイオ社）で精製し、融合遺伝子１μｇを用いｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ添付の取扱説明書に従って、枯草菌ＩＳＷ１４１２へ形質転換した。目的欠損株のスクリーニングは、上記のｂｉｏＡからｂｉｏＢまでの領域欠損株の場合と同条件で行った。ｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性に増殖する菌株を目的欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））として選択し、分離した。
【００７５】
実施例２、ｂｉｏＩ発現プラスミドの作製（図６）
ｂｉｏＩ遺伝子の増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：１９）：５′−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＡＧ−３′
Ｒ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号：２０）：５′−ＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′
【００７６】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ４分加熱した後、９４℃ ４５秒、５５℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した後、プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）とｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた。
【００７７】
実施例３、ｂｉｏＩとｂｉｏＩ蛋白酸化還元パートナー遺伝子との共発現プラスミドの作製
（１）枯草菌ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ遺伝子（ｙｋｕＮ）、ｂｉｏＩ遺伝子及びｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ−ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（ｙｕｍＣ）の発現プラスミドの作製（図６）
（１−１）枯草菌ｙｋｕＮ遺伝子増幅（約０．６ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。なお、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、ｙｋｕＮ遺伝子３′側とｂｉｏＩ遺伝子５′側（下線部）の融合プライマーである。
Ｆ−ｙｋｕＮ（配列番号：２１）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧ−３′
Ｒ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ（配列番号：２２）：５′−ＣＡＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＣ−３′
【００７８】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のサイクルを２５回行った（図４）。
【００７９】
（１−２）枯草菌ｂｉｏＩ遺伝子増幅（約１．２ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：２３）：５′−ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧ−３′
Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：２４）：５′−ＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′
【００８０】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８１】
（１−３）枯草菌ｙｕｍＣ遺伝子増幅（約１．１ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。なおｆｏｒｗａｒｄプライマーはｂｉｏＩ遺伝子３′側（下線部）とｙｕｍＣ遺伝子５′側の融合プライマーである。
Ｆ−ｙｕｍＣ−ｂｉｏＩ（配列番号：２５）：５′−ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＣ−３′
Ｒ−ｙｕｍＣ（配列番号：２６）：５′−ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧ−３′
【００８２】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８３】
（１−４）ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子（約２．７ｋｂｐ）の作製（図５）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｙｋｕ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：２７）：５′−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧ−３′
Ｒ−ｙｋｕ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：２８）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣ−３′
【００８４】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、ｙｋｕＮ ２３ｎｇ、ｂｉｏＩ １３８ｎｇ、ｙｕｍＣ ３４ｎｇの各ＤＮＡ断片を混和し、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ３分のサイクルを２５回行った（図４）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した後、プラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００８５】
（２）枯草菌ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子（ｆｅｒ）、ｂｉｏＩ遺伝子及びｙｕｍＣ遺伝子の発現プラスミドの作製
（２−１）枯草菌ｆｅｒ遺伝子の増幅（約０．３ｋｂｐ）
枯草菌ｆｅｒ遺伝子増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。なおｒｅｖｅｒｓｅプライマーはｆｅｒ遺伝子３′側とｂｉｏＩ遺伝子５′側（下線部）の融合プライマーである。
Ｆ−ｆｅｒ（配列番号：２９）：５′−ＧＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣ−３′
Ｒ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ（配列番号：３０）：５′−ＣＡＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣＣ−３′
【００８６】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラス１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８７】
（２−２）ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣの融合遺伝子（約２．５ｋｂｐ）の作製（図５）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：３１）：５′−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＡＴＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴＡＣ−３′
Ｒ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：３２）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣ−３′
【００８８】
ＰＣＲはｆｅｒ １５ｎｇ、ｂｉｏＩ １３８ｎｇ、ｙｕｍＣ ３４ｎｇを鋳型として、９４℃３分加熱した後、９４℃１５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ３分のサイクルを２５回行った（図４）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した。形質転換菌よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００８９】
実施例４、枯草菌ビオチン合成オペロンのｏｒｆ２遺伝子とｂｉｏＩ遺伝子の共発現プラスミドの作製（図６）
枯草菌ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：１９）および
Ｒ−ＯＲＦ２（配列番号：３３）：５′−ＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧ−３′
【００９０】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ４分加熱した後、９４℃ ４５秒、５５℃ ４５ 秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した。形質転換菌よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へ、ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００９１】
実施例５、ｂｉｏＩ組み込み菌によるピメリン酸の産生
（１）枯草菌及び大腸菌への形質転換
枯草菌エレクトロポーレーション用コンピテントセル（ＩＳＷ１４１２、ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）、ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））はｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ（タカラバイオ社）添付の取扱説明書に従って調製した。
【００９２】
エレクトロポレーション用セルの調製方法
１）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を Ｌ−ｂｒｏｔｈで３７℃、一晩前培養する。
２）前培養液２ｍｌを本培養液（Ｌ−ｂｒｏｔｈ＋０．５Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ）３２ｍｌに加え、３７℃で本培養を行う。
３）Ａ６６０＝０．８５〜０．９５で本培養を止める（約２．５時間）。
４）氷中に１０分間放置する。
５）５，０００×ｇで５分間遠心する。
６）氷冷したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（０．５Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ０．５Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ， １０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で菌体を４回洗浄する。
７）菌体を０．８ｍｌ（培養液の１／４０量）のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａに懸濁する。
８）６０μｌずつ分注し、−８０℃で保存する。これをエレクトロポレーション用セルとする。
【００９３】
枯草菌への形質転換は、ＥＱＵＩＢＩＯ社Ｅａｓｙｊｅｔ ｏｐｔｉｍａの装置及びｃｅｌｌ ｐｒｏｊｅｃｔｓ社ＥＰ−１０２のキュベットを用いたエレクトロポレーション法（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）によって行った。大腸菌の形質転換は、Ｅｃｏｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＤＨ５α（ニッポンジーン社）を用いたカルシウム法によって行った。
【００９４】
枯草菌の形質転換体は、形質転換後の菌を終濃度３μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３０℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択して得た。
【００９５】
大腸菌の形質転換体は、形質転換後の菌を終濃度５０μｇ／ｍｌカルベニシリン含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択して得た。
【００９６】
（２）ｂｉｏＩ組み込み菌の培養条件
枯草菌の場合は終濃度３μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、大腸菌の場合は終濃度５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＢＤ社製ＬＢ培地を使用した。培養は一晩培養液（培養温度３０℃）６０μｌを３ｍｌ培養液の入った試験管に加え、培養温度３０℃または３７℃、往復振盪速度１８０／ｍｉｎで行った。ＢｉｏＩ遺伝子発現誘導はＯＤ６００＝０．８〜０．９になった時点で、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧ及び２ｍＭアミノレブリン酸（ヘム合成促進のため）を添加した。培養は遺伝子発現誘導後、２０時間から４８時間まで行った。
【００９７】
Ｌ−ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地：
トリプトン １％（ｗ／ｖ）
酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ）
【００９８】
（３）ピメリン酸分析方法
培養上清１ｍｌに５Ｍ ＨＣｌ ３０μｌを添加した後、真空乾燥し、得られた残留物を１ｍｌメタノールに溶解した。遠心して不溶物を除き、上清０．９ｍｌに０．１ｍｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅを添加、室温３０分インキュベートした。遠心して上清を回収し、ピメリン酸ジメチルをＧＣ／ＭＳ（日本電子製ＪＭＳ−ＧＣｍａｔｅＩＩ）にて分析した。ピメリン酸ジメチルの標準品は和光純薬社商品番号３２３−８６００１を用いた。
【００９９】
分析条件
カラム：ＣＰＷＡＸ５２ＣＢ Φ０．２５ｍｍ×６０ｍ 膜厚０．２５μｍ
温度：５０℃（３ｍｉｎ）−１０℃／ｍｉｎ−２５０℃Ｈｏｌｄ
注入口温度：２５０℃、インターフェース：２５０℃、キャリアガス：１．０ｍｌ／ｍｉｎ（Ｈｅ）
スプリット：スプリットレス、注入量：０．５μｌ
【０１００】
ＭＳ条件
加速電圧：２．５ｋＶ、イオン源温度：２１０℃、イオン化法：ＳＩＭ（選択イオンモニタリング）
選択イオン：ｍ／ｚ＝１１５（定量用）、ｍ／ｚ＝７４（確認用）、ｍ／ｚ＝１５７（確認用）
【０１０１】
ピメリン酸の定量は、濃度既知のピメリン酸ジメチル標準品のＧＣ／ＭＳ−ＳＩＭスペクトラムピーク面積から作成した検量線を元に定量した。
【０１０２】
結果
（１）ｂｉｏＩ発現枯草菌によるピメリン酸産生
図７ＡにｂｉｏＩ発現枯草菌（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））培養上清中のピメリン酸産生量を示す。ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養し、培養上清を回収した。非欠損株（Ｗｉｌｄ）ではピメリン酸の産生は認められなかったが、欠損株（ｐＨＴ０１）でわずかなピメリン酸の産生が認められた。欠損株でｂｉｏＩを発現させる（ｐＢｉｏＩ）ことでピメリン酸の産生が驚くべきことに１８倍も増加した。さらに、ｆｅｒ蛋白質及びｙｕｍＣ蛋白質を共発現する（ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）ことによって、ピメリン酸の産生量が増加し、ｂｉｏＩ蛋白と酸化還元パートナーとの共発現により産生量を向上させることができた。一方、ｙｋｕＮ蛋白質及びｙｕｍＣ蛋白質の共発現（ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）では、菌の増殖は低下したが、ピメリン酸の産生量はｂｉｏＩ単独の場合と同レベルであった。
【０１０３】
ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））の場合（図８Ａ）、ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４および４８時間培養し、培養上清を回収した。ｂｉｏＩ単独（ｐＢｉｏＩ）では、２４および４８時間培養後の上清中のピメリン酸産生量には違いは認められなかった（２４時間：１．８μＭ、４８時間：１．８４μＭ）が、ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２）では、２４時間後と比較して４８時間後で約２倍（２４時間：１．８６μＭ、４８時間：３．６２μＭ）のピメリン酸産生量の増加が認められた。
【０１０４】
また、宿主にｂｉｏＷ〜ｂｉｏＢ欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を用いた場合、ｂｉｏＩ遺伝子を有する形質転換体は、ｂｉｏＷ〜ｂｉｏＢ欠損株の場合と比較して、増殖は同程度であったが、ピメリン酸の産生は顕著に減少した。
【０１０５】
（２）ｂｉｏＩ発現大腸菌によるピメリン酸産生
ｂｉｏＩ発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、枯草菌と同様にＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養した後、培養上清中にピメリン酸が蓄積するかを調べた。結果を図９Ａに示す。大腸菌においても、ｂｉｏＩ蛋白発現によるピメリン酸の培地中への蓄積が確認され、さらにＦｅｒ蛋白質及びＹｕｍＣ蛋白質との共発現によって産生量が向上した（ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）。しかし、産生量は枯草菌の半分程度であった。一方、ＹｋｕＮ蛋白質及びＹｕｍＣ蛋白質の共発現（ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）では、菌の増殖は低下したが、ピメリン酸の産生量はｂｉｏＩ単独の場合と同レベルであった。
【０１０６】
ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ＤＨ５α）の場合（ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２）、ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養し、培養上清を回収した。枯草菌の場合と異なり、２４時間培養後において、ｂｉｏＩ単独（０．９１μＭ）と比較して、ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現では、約２倍（１．８５μＭ）のピメリン酸産生量の増加が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、プラスチック原料と使用できるピメリン酸を、バイオマスから生産することを可能とする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピメリン酸の製造方法に関する。より詳しくは、バイオマスからのピメリン酸の発酵生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチックの生産の原料として、化石資源由来原料が用いられている。プラスチックを廃棄する場合、再生利用する場合はともかく、燃焼等による廃棄は炭酸ガスの放出を招くことから、近年問題となりつつある。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料を再生可能資源のひとつであるバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。
【０００３】
代表的なプラスチックの製造原料のひとつとして、ジカルボン酸が上げられる。ジカルボン酸は、ポリアミドやポリエステルのモノマーとしてだけでなく、ポリオール、ポリアミンの原料として用いられている。ジカルボン酸の炭素数の違いにより、得られるプラスチックの物性が大きく変化することから、炭素数の異なるさまざまなジカルボン酸が現在使用されている。
【０００４】
バイオマス原料から製造されるジカルボン酸としては、炭素数４のコハク酸が知られている。しかし、それ以外に炭素数の長いバイオマス原料から製造されるジカルボン酸が求められていた。
【０００５】
微生物の代謝物で、炭素数４のコハク酸より大きな炭素数からなるジカルボン酸としては、ビオチン生合成中間体として、炭素数７のピメリン酸が知られている。ピメリン酸を出発原料として、ビオチンを生産する製造方法も開示されている（特許文献１）。
【０００６】
しかし、現時点において、微生物におけるピメリン酸の生合成経路は完全に解明されていない。
【０００７】
枯草菌におけるビオチン生合成酵素として、シトクロムＰ４５０系酸化酵素の一種であるＢｉｏＩが知られている（特許文献１）。
【０００８】
ＢｉｏＩは、菌体内で、脂肪酸−ＡＣＰ（アシルキャリアープロテイン）から、ピメリル−ＡＣＰを生成することが明らかとなっている（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、大腸菌でＢｉｏＩを過剰発現させた場合、Ｃ１４〜Ｃ１８脂肪酸ＡＣＰとＢｉｏＩの複合体が生じ、この複合体のターンオーバーでピメリルＡＣＰが生じることが報告されている。しかし、遊離のピメリル酸が生じることは報告されていない（非特許文献１）。
【０００９】
一方、インビトロでは遊離脂肪酸に対する活性もあることが報告されているが、活性は極めて小さい（非特許文献３）。
【００１０】
遊離脂肪酸の生合成系としては、脂肪酸−ＡＣＰ（アシルキャリアープロテイン）からの脂肪酸−ヒドラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１４）による加水分解、あるいは、トリグリセリドからのリパーゼによる加水分解が知られているが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、どちらの酵素遺伝子も保有していない（図１）。よって、大腸菌においては、遊離脂肪酸の生合成系を保有せず、菌体内に遊離脂肪酸が存在する報告は無い。
【００１１】
また、ピメリルＡＣＰから遊離ピメリル酸が生じるか否かはわかっていない。
【００１２】
加えて、ビオチン生合成系に関しても、これまでに明らかになっているのは、ピメリルＣｏＡが出発物質であり、ビオチン生合成中間体として遊離のピメリン酸が存在するかは、明らかになっていない。
【００１３】
ピメリン酸の微生物生産としては、Ｃ１１の直鎖状アルカン、或いは脂肪酸エステルや不飽和脂肪酸を原料にバチルス属の微生物と接触させる方法が報告されている（特許文献２、非特許文献４）が、この場合、原料はＣ１１の直鎖状アルカン、或いは脂肪酸エステルに限定され、原料が著しく制限されるという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平７−１７７８９５号
【特許文献２】特開昭６２−６６９２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３８４， ３５１（２０００）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ １０５， １５６９６（２００８）
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ８６ （２００４）
【非特許文献４】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６４９ （１９８３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、ナイロン原料等として有用なジカルボン酸の一種であるピメリン酸をバイオマスなどを原料として微生物にて製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、バイオマスを原料としてピメリン酸を製造する方法に関して鋭意検討を行った結果、ＢｉｏＩ遺伝子を形質転換した微生物を用いてピメリン酸を生産する方法を見出した。
【００１８】
すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである：
（１）プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した組換え微生物を培養し、ピメリン酸を生産させることを含む、ピメリン酸の製造方法。
（２）組換え微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記１記載のピメリン酸の製造方法。
（３）組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記１記載のピメリン酸の製造方法。
（４）プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。
（５）微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記４記載の組換え微生物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、バイオマス原料から、プラスチック原料として有用なピメリン酸を製造できる。得られたピメリン酸は、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物と重合することで、耐熱性のポリアミドを提供することができる。また、化石資源ではなく、非化石資源であるバイオマスを原料としてピメリン酸を製造できることから、本発明は、地球環境に対して優しい製造方法となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）遊離脂肪酸の生合成反応。脂肪酸−ＡＣＰヒドロラーゼおよびリパーゼがなければ脂肪酸−ＡＣＰおよびトリグリセリドからの遊離脂肪酸の合成は生じない。（Ｂ）大腸菌のグリセロ脂質代謝マップ（ＫＥＧＧ：Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓデータベースより）。大腸菌には、遊離脂肪酸の生合成経路が無いことを示す。無色の酵素番号は、大腸菌での欠損を意味する。
【図２】（Ａ）枯草菌ビオチン生合成オペロンを示す。（Ｂ）ｂｉｏＡ〜ｂｉｏＢがＴｃに置換されるｂｉｏＡ〜ｂｉｏＢ欠損を示す。
【図３】ｂｉｏＷ−Ｔｃ−ｂｉｏＩ遺伝子の作製方法を示す。Ｆ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｆ−Ｔｃ、Ｒ−Ｔｃ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｒ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎはプライマーを示す。ｙａｔＰ−Ｔｃ−ｂｉｏＩ遺伝子も、Ｆ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ、Ｆ−Ｔｃ、Ｒ−Ｔｃ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｙａｔＰ、Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｂｉｏＩを用いて同様に作製された。
【図４】増幅された遺伝子の電気泳動写真を示す。ｆｅｒは、増幅されたｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子、ｙｋｕＮは増幅されたｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ遺伝子、ｙｕｍＣは、ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ：ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子、ＢｉｏＩは、増幅されたｂｉｏＩ遺伝子、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣは増幅されたｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣは増幅されたｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子を示す。両端のレーンは、分子量マーカー（タカラバイオ製 ５００ｂｐＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）を示す。
【図５】ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子またはｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の作製方法を示す。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）、Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ、Ｆ−ｙｕｍＣ−ｂｉｏＩ、Ｒ−ｙｕｍＣ、Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ、Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ、Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはプライマーを示す。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）は、Ｆ−ｙｋｕＮプライマーまたはＦ−ｆｅｒプライマーを意味する。Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩは、Ｒ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩプライマーまたはＲ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩプライマーを意味する。Ｆ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはＦ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーまたはＦ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーを意味する。Ｒ−ｙｋｕＮ（ｆｅｒ）−ｂｉｏＩ−ｙｕｍはＲ−ｙｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ｙｕｍプライマーまたはＲ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍプライマーを意味する。
【図６】発現ベクターの構成を示す。ｐＨＴ０１は、コントロール用発現プラスミドである。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ蛋白質を発現する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣはｙｋｕＮ遺伝子、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ、ＹｋｕＮ、ＹｕｍＣの３つの蛋白質を発現する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣはｆｅｒ遺伝子、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ、Ｆｅｒ、ＹｕｍＣの３つの蛋白質を発現する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２はｂｉｏＩ遺伝子、ｏｒｆ２遺伝子発現プラスミドである。プロモーターｇｒａｃの制御下でＢｉｏＩ蛋白質とｏｒｆ２遺伝子産物の２つを発現する。
【図７】（Ａ）ｂｉｏＩ遺伝子発現枯草菌培養上清中のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。Ｗｉｌｄは、形質転換されていないＩＳＷ１４１２野生株を意味する。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【図８】（Ａ）ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子発現枯草菌のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２は、ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を意味する。２４ｈは、２４時間培養、４８ｈは４８時間培養を示す。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【図９】（Ａ）ｂｉｏＩ発現大腸菌のピメリン酸産生を示す。ｐＨＴ０１は、発現ベクターｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＢｉｏＩは、ｂｉｏＩ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣは、ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２はｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子の組み込まれたｐＨＴ０１で形質転換されたＤＨ５αを意味する。（Ｂ）増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ｂｉｏＩ遺伝子を含有する発現ベクターによって形質転換した組換え微生物を用いてピメリン酸を製造する方法に係るものである。
【００２２】
本発明におけるｂｉｏＩ遺伝子は、ビオチン生合成に関与する遺伝子であり、Ａｃｙｌ−ＡＣＰ（脂肪酸のカルボン酸にアシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）が共有結合したもの）の炭素鎖を位置特異的に酸化的に切断し、Ｐｉｍｅｌｙｌ−ＡＣＰに変換する酵素をコードする遺伝子である。しかし、Ｃ１６前後の炭素数のＡｃｙｌ−ＡＣＰを基質とするようであるが正確にはわかっていない。Ａｃｙｌ−ＡＣＰをＰｉｍｅｌｙｌ−ＡＣＰに変換する酵素をコードする遺伝子であれば限定されないが、好ましくは、枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９２８：配列番号１）または枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子である。
【００２３】
枯草菌のｂｉｏＩ遺伝子の核酸配列（配列番号１）：
gtgacaattgcatcgtcaactgcatcttctgagtttttgaaaaacccatattctttttacgacacattgcgagctgttcatcctatctataaagggagtttcttaaaatacccgggctggtatgtcacaggatatgaagaaacggctgctattttgaaagatgcgagattcaaagtccgcaccccgctgcctgagagctcaaccaaatatcaggacctttcacatgtgcaaaatcaaatgatgctgtttcagaaccagcctgatcatagacgattgcggacgcttgccagcggagcgtttacgccgagaacgacagagagttatcagccgtatatcattgaaactgtccatcatttgcttgatcaagtgcaaggtaaaaaaaagatggaggtcatttcggactttgcttttcctttagcaagttttgtcatagctaacattataggtgtaccggaggaagatagggagcaattaaaggagtgggctgcgagtctcattcaaacgattgattttacccgctcaagaaaggcattaacagagggcaatattatggctgtgcaggctatggcatatttcaaagagctgattcaaaagagaaaacgccaccctcaacaggatatgatcagcatgctcttgaaggggagagaaaaggataagctgacggaagaggaggcggcatctacgtgcatattgctggcgatcgccggacatgagacaacggtcaatctcatcagcaattcagtcctttgtctgctgcagcatccagaacagcttttgaaactgagagaaaatccagatcttattggtaccgcagtcgaggaatgtttacgctatgaaagccccacgcaaatgacagccagagttgcgtcagaggatattgacatctgcggggtgacgatccgtcaaggagaacaagtctatcttttgttaggagcggctaatcgagaccctagcatattcacgaaccccgatgtcttcgatattacgagaagtcctaatccgcatctttcattcgggcatggccatcatgtttgcttagggtcctcgctggcacgattagaagcgcaaattgcgattaacactcttctgcagcgaatgcccagccttaatcttgcggattttgaatggcggtatcggccgctttttggatttcgggcgcttgaggagctgccggtgacttttgaataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００２４】
枯草菌のｂｉｏＩのアミノ酸配列（配列番号２）：
MTIASSTASSEFLKNPYSFYDTLRAVHPIYKGSFLKYPGWYVTGYEETAAILKDARFKVRTPLPESSTKYQDLSHVQNQMMLFQNQPDHRRLRTLASGAFTPRTTESYQPYIIETVHHLLDQVQGKKKMEVISDFAFPLASFVIANIIGVPEEDREQLKEWAASLIQTIDFTRSRKALTEGNIMAVQAMAYFKELIQKRKRHPQQDMISMLLKGREKDKLTEEEAASTCILLAIAGHETTVNLISNSVLCLLQHPEQLLKLRENPDLIGTAVEECLRYESPTQMTARVASEDIDICGVTIRQGEQVYLLLGAANRDPSIFTNPDVFDITRSPNPHLSFGHGHHVCLGSSLARLEAQIAINTLLQRMPSLNLADFEWRYRPLFGFRALEELPVTFE
【００２５】
本発明で用いられるｂｉｏＩ遺伝子および下記遺伝子においては、塩基配列に修飾が加えられているものも含まれる。例えば、アミノ酸を欠失、好ましくは１〜数個欠失するような範囲で塩基が欠失されたものでもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が置換、好ましくは１〜数個置換されたものでもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が付加、好ましくは１〜数個付加されたものでもよい。但し、そのような修飾があっても、修飾前の活性を有するタンパク質をコードするものであることが必要である。このような改変された塩基配列（変異体）は、例えば、部位特異的変異法等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明の遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。
【００２６】
ｂｉｏＩ遺伝子の組み込みベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を利用することが出来る。シャトルベクターであっても良い。好ましくは、大腸菌、枯草菌、酵母のための発現用プラスミドである。
【００２７】
大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８が挙げられる。枯草菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫＤＮＡ、ｐＨＴ０１が挙げられる。酵母由来プラスミドとしては、例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５が挙げられる。これらのプラスミドは、市場より入手できる。
【００２８】
本発明の組換えベクターを適当な宿主に導入して、該宿主の形質転換を行うことによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
【００２９】
宿主としては、微生物であれば限定されないが、例えば、細菌、酵母などが挙げられる。好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ）等が挙げられる。これらの中でも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。これらの宿主は、市場より入手できる。
【００３０】
宿主は、生産されたピメリン酸がさらなる代謝を受けることを防ぐため、宿主のビオチン生合成系が欠損していてもよい。好ましくは、ｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、およびｂｉｏＡ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを欠損している宿主である。ｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、およびｂｉｏＡ遺伝子は、枯草菌のｂｉｏＢ遺伝子、ｂｉｏＤ遺伝子、ｂｉｏＦ遺伝子、ｂｉｏＡ遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子も含む。
【００３１】
枯草菌のｂｉｏＡ遺伝子の核酸配列（配列番号３４）：
atgactcatgatttgatagaaaaaagtaaaaagcacctctggctgccatttacccaaatgaaagattatgatgaaaaccccttaatcatcgaaagcgggactggaatcaaagtaaagacataaacggcaaggaatactatgacggtttttcatcggtttggcttaatgtccacggacaccgcaaaaaagaactagatgacgccataaaaaaacagctcggaaaaattgcgcactccacgttattgggcatgaccaatgttccagcaacccagcttgccgaaacattaatcgacatcagcccaaaaaagctcacgcgggtcttttattcagacagcggcgcagaggcgatggaaatagccctaaaaatggcgtttcagtattggaagaacatcgggaagcccgagaaacaaaaattcatcgcaatgaaaaacgggtatcacggtgatacgattggcgccgtcagtgtcggttcaattgagctttttcaccacgtatacggcccgttgatgttcgagagttacaaggccccgattccttatgtgtatcgttctgaaagcggtgatcctgatgagtgccgtgatcagtgcctccgagagcttgcacagctgcttgaggaacatcatgaggaaattgccgcgctttccattgaatcaatggtacaaggcgcgtccggtatgatcgtgatgccggaaggatatttggcaggcgtgcgcgagctatgtacaacatacgatgtcttaatgatcgttgatgaagtcgctacaggctttggccgtacaggaaaaatgtttgcgtgcgagcacgagaatgtccagcctgatctgatggctgccggtaaaggcattacaggaggctatttgccaattgccgttacgtttgccactgaagacatctataaggcattctatgatgattatgaaaacctaaaaacctttttccatggccattcctatacaggcaatcagcttggctgtgcggttgcgcttgaaaatctggcattatttgaatctgaaaacattgtggaacaagtagcggaaaaaagtaaaaagctccattttcttcttcaagatctgcacgctcttcctcatgttggggatattcggcagcttggctttatgtgcggtgcagagcttgtacgatcaaaggaaactaaagaaccttacccggctgatcggcggattggatacaaagtttccttaaaaatgagagagttaggaatgctgacaagaccgcttggggacgtgattgcatttcttcctcctcttgccagcacagctgaagagctctcggaaatggttgccattatgaaacaagcgatccacgaggttacgagccttgaagattga
【００３２】
枯草菌のｂｉｏＦ遺伝子の核酸配列（配列番号３５）：
ttgaagattgattcctggttaaacgagcggttagacagaatgaaagaagccggcgtacatcgtaacctgcggtcaatggatggagcgccggttccagagaggaatattgatggcgaaaatcaaacggtctggtcctcaaacaattatttagggctcgcaagcgatagacgtttgatcgatgcagcccaaacagcattgcagcaatttgggacaggaagcagcggttcacgtttaacgacaggcaattcggtctggcatgaaaagctagaaaagaagattgccagctttaaactgacagaagcggccctgctgttttcgagcggttacttggccaatgtcggtgtcctttcatccttgccagaaaaggaagatgtcattttaagtgaccagctcaatcatgcaagtatgatcgacggctgccgactttctaaggctgatacagttgtttatcggcatattgatatgaatgatcttgaaaacaagctgaatgaaacacagcgttatcagcgccgttttatcgtaacagacggagtattcagcatggatggcacaatcgcccctcttgatcagatcatctcacttgcgaaacgctatcatgccttcgtggtcgttgatgatgcccacgcaacaggagttttgggcgattcgggacaaggaacgagtgaatactttggtgtttgtcccgacattgttatcggcaccttaagcaaagctgttggcgcggaaggaggttttgcggcaggatcagcggtcttcatcgactttttgctgaaccatgccagaacatttatctttcaaaccgctattccgccagccagctgtgcggctgctcacgaggctttcaacatcattgaagccagcagggaaaaacgacagcttttattttcttatatcagcatgatcagaaccagtctgaagaatatgggttatgtggtgaaaggagatcacacaccgattattcctgtagtcattggcgatgcccataaaacggtcctatttgctgaaaaactgcagggcaagggaatttatgctcctgccattcggccgccaaccgttgcgccgggtgaaagccggattcgaattacaatcacgtctgaccacagtatgggtgatattgatcatttgctgcaaacatttcattcaatcggaaaggagctgcacatcatttga
【００３３】
枯草菌のｂｉｏＤ遺伝子の核酸配列（配列番号３６）：
ttgaggggtttttttgtgacgggaactgatacagaagtagggaaaacggttatatccagcggtcttgctgccttattgaaagacaataata gacatgtcggggtgtataaaccatttttaagcgggatatcgcgccatcatccagatagtgatacaagtttgctgaaagatatgtcgcagaccagtctttctcatgaagacattacgccttttgccttcaaggcgccgcttgcaccatacgttgcagggaaacttgagggaaagactgtcaccatggaagaggttttaagccattgggggcggattagagaaaaacatgaatgcttcatcgtagaaggtgcaggcggtatttctgtgccattgggagaggactatttggtcagtcatgtcataaaagcgttgcagcttcccatgattattgtggcgcgtcctcgccttggaaccattaatcatacctttttaactgtcaaatatgcagaaagcatggggcttccaatcgccggaattatcatcaatggaatcagtgactctcctgatgaagatgaaaaaaccaatcctgagatgattgagcgcttatgcggtgtgccgattttaggggttacgccaaagcttgccaacgtgacgaaagaaacggttctacatatggtaaaagaccatatcaatctatcattactgatgaatcaagtgggggtatga
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００３４】
枯草菌のｂｉｏＢ遺伝子の核酸配列（配列番号３７）：
atgaatcaatggatggaactcgcagaccgggtgctggctggagcagaagtgactgacgaagaggcgctttcaatattacattgtcctgatgaagatattttgctattaatgcacggggcttttcacatcagaaaacacttttacggaaaaaaagtaaagctcaatatgattatgaatgcgaaatccgggctctgcccggaaaactgcggctattgttcacagtctgcgatttcgaaagcgccgattgagtcttaccggatggtgaataaggaaacgctgcttgaaggcgcgaagcgggcgcacgatctgaatatcggcacatattgtatcgtggcaagcggcagaggtccgtctaacagagaagtggatcaggtcgtagatgcggttcaggaaattaaagagacgtatggactgaagatttgtgcatgtcttggactgttgaagccagagcaggcgaagcggctcaaagatgcaggagtagaccgctataatcataatttgaatacgtcacagagaaaccattcaaacat cacaacctcacatacatacgatgacagagtcaatacggttgaaatcgcaaaagaatcggggctgtctccgtgttcaggcgccattatcgggatgaaggagacgaaacaggatgtcattgacatcgccaaaagcttgaaggctcttgacgcggattccattcctgtgaattttttgcatgcaattgatggcacgccgttagaaggcgtcaacgaattaaacccgctgtattgtttaaaagtgctggcgctgttccgttttatcaatccatcaaaagaaattcgcatttccggaggaagagaggtcaatctccgcacattgcagccattagggctttacgccgcaaactccatttttgtcggagactacttaacaactgccgggcaagaggagacggaggatcataaaatgctgagtgatttaggctttgaagttgaatcagtcgaagaaatgaaggctagtttaagtgcgaaaagctga
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００３５】
宿主の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、組換えタンパク質生産法（生物化学実験法４５ 学会出版センター刊）に記載された、エレクトロポレーション法やカルシウム法によってコンピテントセルとした菌を用いる方法などがある。
【００３６】
プロモーターは、宿主中において、連結している外来遺伝子を発現させるものであれば限定されない。宿主が大腸菌である場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｒａｃプロモーターなど、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｇｒａｃプロモーターなど、宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
【００３７】
プロモーターに作動的に連結するとは、プロモーターの制御下で目的遺伝子産物が生成するようにプロモーターの下流に目的遺伝子を連結することを意味する。
【００３８】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した組換え微生物とは、上記の組換えＤＮＡ手法を用いて外からプロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入することでｂｉｏＩ遺伝子産物が生じるようになった微生物を意味する。プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子は、宿主のゲノムに組み込まれてもよいが、プラスミドに組み込まれた形態で存在することが好ましい。
【００３９】
形質転換体を培養するための培地には、該宿主が生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、グルコース、シュークロースなどの糖類を炭素源として、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキスなどの有機窒素源、さらに各種無機塩やビタミン類などを含有した培養液を用いることができる。培養は、宿主によって好気的または嫌気的であってもよい。培養時間は、形質転換体の増殖とピメリン酸の産生量から当業者は適宜設定することができるが、１日から１ヶ月程度培養を行えばよい。培養温度は、微生物の増殖可能な温度であれば限定されず、当業者は形質転換体の増殖とピメリン酸の産生量から適宜設定することができる。
【００４０】
ピメリン酸とは、以下の式：
【化１】
の化合物をいう。
【００４１】
ピメリン酸を生産させるとは、生産されたピメリン酸が菌体内に蓄積してもよいが、菌体外に分泌されることが好ましい。
【００４２】
フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）遺伝子とは、電子伝達体として機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフェレドキシン遺伝子（ｆｅｒ）である。フェレドキシンは、ＢｉｏＩと共役している。
【００４３】
枯草菌のフェレドキシン（ｆｅｒ）遺伝子の核酸配列（配列番号３）：
atggcaaagtacacaatcgtagacaaagatacatgtattgcatgcggcgcttgcggagctgctgcaccagacatttacgattacgatgatgaaggcatcgcgttcgtaacgcttgatgaaaacaaaggtgttgtcgaagttcctgaggtactggaagaagatatgattgacgcatttgaaggatgccctactgattccatcaaagtggcggatgagccatttgaaggcgacccgcttaaatttgaatag
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４４】
フラボドキシン（ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ）遺伝子とは、電子伝達体として機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフラボドキシン遺伝子（ｙｋｕＮ）である。フラボドキシンは、ＢｉｏＩと共役している。
【００４５】
枯草菌のフラボドキシン（ｙｋｕＮ）遺伝子の核酸配列（配列番号４）：
atggctaaagccttgattacatatgccagcatgtcaggaaatacagaagacattgccttcataataaaagatacgcttcaggaatatgagttggatatcgattgtgtcgagataaatgatatggatgcgtcttgtttaacctcctatgattatgtactgattggcacctatacatggggggacggcgatttgccctacgaagcggaggattttttcgaagaggtcaaacagattcagcttaatggtttaaaaacagcctgcttcgggtctggcgattattcttatccaaagttttgcgaagcggtgaatttgttcaatgtcatgctgcaagaggcgggagctgctgtttaccaggaaacactaaaaattgaattagcgcctgaaacagatgaagatgtggaaagctgccgagcgtttgcgagaggttttcttgcatgggcagattatatgaacaaggaaaaaatccatgtttcataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４６】
フェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ：ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子は、フェレドキシンＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＥＣ １．１８．１．３）遺伝子と同義であり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを還元型フェレドキシンによって酸化してＮＡＤ（Ｐ）＋を再生するタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、枯草菌のフェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ遺伝子（ｙｕｍＣ）である。フェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼはＢｉｏＩと共役している。
【００４７】
枯草菌のフェレドキシン−ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼ（ｙｕｍＣ）遺伝子の核酸配列（配列番号５）：
atgcgagaggatacaaaggtttatgatattacaattataggcgggggaccggtcggcttattcaccgctttttacggcgggatgagacaggcaagcgtcaaaattatcgaaagcctgcctcagctcggcggacagcttagcgccctataccctgagaagtatatatatgatgtagcgggattcccgaaaatccgcgcgcaagagcttatcaataacctaaaagagcaaatggcgaaattcgaccaaaccatttgtctggagcaagcggttgaatctgttgagaaacaagcggacggcgtgtttaagcttgtacaaatgaagaaacccactactctaaaacggtcatgcataactgcaggaaacggcgcattcaaaccgagaaagctggaacttgaaaatgccgagcagtatgaaggcaaaaacctccattacttcgttgatgatctgcaaaaattcgccggcagacgcgttgcgatccttggcggtggagattccgcggttgactgggcgcttatgcttgagccaatcgcaaaagaagtatcgatcattcaccgccgcgacaagttccgagcgcacgagcacagtgtggaaaaccttcatgcgtcgaaggttaatgtcctgacaccattcgtccctgcggagctgatcggcgaagacaaaatcgaacagctagtgcttgaagaagtgaaaggcgaccgcaaagagattttagaaattgatgacttaatcgtcaactacggtttcgtttcatctcttggaccgatcaaaaactggggcctggacatcgagaaaaattccattgtcgtgaaatcaacaatggaaacaaatatcgaaggcttctttgcagcaggtgacatttgtacatacgaaggaaaagtcaacctgattgccagcggcttcggcgaggcaccgacagcagtgaacaacgccaaggcttacatggacccgaaagcccgcgtacagcctcttcactcaacaagtctttttgaaaataaataa
下線は開始コドン及び停止コドンを示す。
【００４８】
枯草菌のｏｒｆ２遺伝子とは、枯草菌ビオチン生合成オペロンのｂｉｏＩの下流に見出される蛋白質がコードされていると推測される下記配列番号６の配列を有する遺伝子であるが、ｏｒｆ２遺伝子産物は、特定されていない。
【００４９】
枯草菌のｏｒｆ２の核酸配列（配列番号６）：
gcctaagaatgtgagtgccaaaaaagtgtcagccccgccgaaaatgggcaatctataaaaaaggggagtgaacatcgtgaaaaaagtgctgatcgccggcggaaatggtgtgattgggagactgcttgctgaagggcttatttcagactatgaagtgactgtgcttgataaagatcatttcgatggcaaagcctcttccattcaggctgacgcggcaaattatgaggagctgttgaagaagattccaaaagataccgatgccatcttgaatttactcgctgtgaaaatcaaatacgatattatggacatcgctgagtttgaaaaaatgacggatgttttctatagggcaagctattatctgtgccgtgcggcagcggagctcggcattcaaaagctcgtgttcgccagcagcaatcatgtcacagatgtatatgaaaaagacgggcgctcgctcttaggacgggaaatcacaacaagcgattatccgctgtcaaaaaacttgtacggtgtattaaagctgacctctgaacagatcggccatttgttttatttggaaaataagctatcagtaatcaaccttcgaatcggaacagtcgtgacagatgaaatggatacgctgcatgaaaaagaacggacgaaaaagacactgctttctcaccccgatctgctgtcgattttcaaagccgccattgagaccaacatccggtatggcacttattacgccgtctctgataatccgggccggccatggtccattgaatctgccgtgaatgaacttgggttttcgccacaaatcaatacggctgaacttctgaacgaggaggagaacggagcataa
下線は推定開始コドン及び推定停止コドンを示す。
枯草菌のビオチン生合成オペロン遺伝子の核酸およびアミノ酸配列はアクセッション番号：Ｕ５１８６８で登録されている。
【００５０】
本発明の組換え微生物は、ｂｉｏＩ遺伝子と共に、ｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子からなる群から選択させる少なくとも１つを発現させることが好ましい。より好ましくは、ｂｉｏＩ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子とｙｕｍＣ遺伝子の共発現、ｂｉｏＩ遺伝子、ｆｅｒ遺伝子とｙｕｍＣ遺伝子の共発現、またはｂｉｏＩ遺伝子とｏｒｆ２遺伝子の共発現である。ｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子は、枯草菌のｆｅｒ遺伝子、ｙｕｍＣ遺伝子、ｙｕｋＮ遺伝子およびｏｒｆ２遺伝子に相当する他の微生物の遺伝子も含む。
【００５１】
本発明で使用する、微生物、組換えＤＮＡ、ＰＣＲ、発現、培養技術等の分子生物学実験技術は、当業者に周知であり、一般的な教科書（例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）； ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）； ＰＣＲ：ＴＨＥ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）； ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ，ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．１９９９）；及びＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓなど）に詳細に説明されている。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５３】
実施例１、枯草菌ビオチン合成オペロン欠損株の作製
枯草菌ビオチン合成オペロンの構造はＰｅｒｋｉｎｓらによって報告された（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．１９９６，ｐ．６３６１−６３６５）。図２Ａにその構造を示す。本研究では、ｂｉｏＩ遺伝子発現プラスミドの宿主として、枯草菌株ＩＳＷ１２１４株（タカラバイオより入手）よりｂｉｏＡからｂｉｏＢまたはｂｉｏＷからｂｉｏＢまでの領域をテトラサイクリン耐性遺伝子に置換した株を作製した（図２Ｂ）。作製方法を以下に示す。
【００５４】
枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株からのゲノムＤＮＡ抽出：
本実験には、ＱＩＡＧＥＮ社のゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ，Ｃａｔ． Ｎｏ．１９０６０；Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２２３）を用いた。
【００５５】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を試験管に入った６ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。遠心により４ｍＬ分の培養液から１．５ｍＬチューブに菌体を回収し、あらかじめ２μＬの１００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）を添加した１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ Ｂ１に菌体を懸濁した。２０μＬの１００ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液（Ｗａｋｏ，Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ， Ｃａｔ．Ｎｏ．１２６−０５０１３，水で調製した）を加えて撹拌し、さらに２０ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１３１）を４５μＬ加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した（保温後、液が透明になり、もやもやしたものが確認できた）。次に、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ２を０．３５ｍＬ加えて撹拌し、５０℃で４０分間保温した。
【００５６】
あらかじめ２ｍＬのＢｕｆｆｅｒ ＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐカラムにこのサンプル液を移し、圧をかけながら液を流した。サンプルを流した後、同様の方法でＢｕｆｆｅｒ ＱＣを３ｍＬ（１ｍＬ×３回）流し、カラムを洗浄した。あらかじめ５０℃で保温したＢｕｆｆｅｒ ＱＦ（１ｍＬ×２回）で吸着していたＤＮＡを溶出した。得られた約２ｍＬのＤＮＡ溶液を０．５ｍＬずつ１．５ｍＬチューブに小分けし、０．３５ｍＬずつ２−プロパノールを加えて撹拌した（この際、白い繊維状の沈殿を確認した）。遠心により沈殿を回収し、７０％エタノールを１ｍＬ加えて沈殿を洗浄した。遠心後、上清を除き、沈殿を乾燥した。各チューブに２５μＬずつＴＥｂｕｆｆｅｒを加えてＤＮＡを溶解後、４本分を１本のチューブにまとめ、精製ゲノムＤＮＡ溶液とし（約１００μＬ）、−２０℃で保存した。
【００５７】
（１）ｂｉｏＡからｂｉｏＢ領域欠損株作製用融合遺伝子（ｂｉｏＩ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｂｉｏＷ遺伝子）の作製（図３）
（１−１）ｂｉｏＩ遺伝子（約１．２ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ（配列番号：７）：５′−ＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧ−３′
Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｌａｃｋ（配列番号：８）：５′−ＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００５８】
ＰＣＲはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）と添付の反応バッファーを使用し、反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤを１ユニット使用し、９４℃ ２分加熱した後、９４℃ ４５秒、５４℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った（Ｂｉｏ-Ｒａｄ、ＭｙＣｙｃｌｅｒ）。
【００５９】
（１−２）ｂｉｏＷ遺伝子（約０．８ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ（配列番号：９）：５′−ＡＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＣ−３′
Ｒ−ｂｉｏＷ−Ｌａｃｋ（配列番号：１０）：５′−ＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００６０】
ＰＣＲはｂｉｏＩ遺伝子増幅と同条件で行った。
【００６１】
（１−３）テトラサイクリン耐性遺伝子（約１．５ｋｂｐ）増幅
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−Ｔｃ（配列番号：１１）：５′−ＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＴＡＴＴＧ−３′
Ｒ−Ｔｃ（配列番号：１２）：５′−ＴＴＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＣ−３′
【００６２】
ＰＣＲはｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ（タカラバイオ）１０ｎｇを鋳型として、ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）と添付の反応バッファーを使用し、反応条件は反応体積５０μｌ、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤを１ユニット使用し、９４℃ ５分加熱した後、９４℃ １５秒、６５℃ ３０秒（１サイクルごとに０．３℃低下させた）、６８℃ ９０秒のサイクルを３０回行った。
【００６３】
（１−４）融合遺伝子（ｂｉｏＷ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｂｉｏＩ遺伝子）の増幅（図３）
上記の方法で増幅したｂｉｏＩ遺伝子（２６．８ｎｇ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（６８ｎｇ）及びｂｉｏＷ遺伝子（３２．６ｎｇ）を混合し、以下の２種類のプライマーを用いてｂｉｏＩ遺伝子の増幅の場合と同条件でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物はＲＥＣＯＴＩＰ（タカラバイオ社）を用いて精製した。
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：１３）：５′−ＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣ−３′
Ｒ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：１４）：５′−ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＧ−３′
【００６４】
（１−５）枯草菌の形質転換とｂｉｏＡからｂｉｏＢまでの欠損株のスクリーニング
融合遺伝子（ＰＣＲ産物）１μｇを用い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ添付の取扱説明書に従って、枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ（株））へ形質転換した。
【００６５】
コンピテントセルの調製方法：
（ｉ）第１培養
１）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株をＬ−ｂｒｏｔｈ ５ｍｌに接種。３７℃で一晩振とう培養する。
２）一晩培養液をＳＰＩ培地に植菌後（接種量約１％）、３７℃で振とう培養する。
３）生育が対数増殖期後期に達した時点で、培養液にグリセロールを終濃度１２．５％になる様、添加する。
４）ミクロ遠心管（エッペンドルフ型、ポリプロピレン）に４００μｌずつ分注後、ドライアイス−エタノールで急速凍結し、−７０℃で保存する。
【００６６】
（ｉｉ）第２培養
１）保存しておいた培養液を３７℃ですみやかに融解する。
２）ＳＰＩＩ培地で７．５倍に希釈する。
３）３７℃で９０分間振とう培養を行ない、その培養液をコンピテントセルとして用いる。
【００６７】
ＳＰＩ培地：（ＮＨ４）ＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６％、Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、＊Ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５％、＊Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．０２％、＊Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．１％、＊Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ ５０μｇ／ｍｌ、＊Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ５０μｇ／ｍｌ
＊ 別殺菌
【００６８】
ＳＰＩＩ培地：（ＮＨ４）ＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６％、Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、＊Ｇｌｕｃｏｓｅ ０．５％、＊Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．０２％、＊ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、＊Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ ５μｇ／ｍｌ、＊Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ５μｇ／ｍｌ
＊ 別殺菌
【００６９】
形質転換および目的欠損株のスクリーニング方法：
１）コンピテントセル液５００μｌに融合遺伝子溶液５００μｌ（融合遺伝子１μｇ）を加える。
２）３７℃で３０分間振とうする。
３）１００μｌのＬ−ｂｒｏｔｈを加え、さらに３７℃で６０分間振とう後、集菌する。
４）テトラサイクリンを２μｇ／ｍｌ含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択し、分離したテトラサイクリン耐性株のｂｉｏｔｉｎ要求性を、ロイシン及びメチオニンを５０μｇ／ｍｌ含有するＳｐｉｚｉｚｅｎ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ寒天培地におけるｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性の増殖で確認する。
【００７０】
ｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性に増殖する菌株を目的欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）、図２Ｂ）として得た。
【００７１】
（２）ｂｉｏＷからｂｉｏＢ領域欠損株作製用融合遺伝子（ｂｉｏＩ遺伝子−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｙａｔＰ遺伝子）の作製
（２−１）ｙａｔＰ遺伝子の増幅（約１．０ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ（配列番号：１５）：５′−ＡＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣ−３′
Ｒ−ｙａｔＰ−Ｌａｃｋ（配列番号：１６）：５′−ＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＧＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧ−３′
下線は、テトラサイクリン耐性遺伝子部分の配列を示す。
【００７２】
（２−２）融合遺伝子（ｂｉｏＩ−テトラサイクリン耐性遺伝子−ｙａｔＰ遺伝子）の作製
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｙａｔＰ（配列番号：１７）：５′−ＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＣＧ−３′
Ｆ−Ｌａｃｋ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｂｉｏＩ（配列番号：１８）：５′−ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＧ−３′
【００７３】
３遺伝子の融合遺伝子の増幅は、反応体積５０μｌ中で、ｂｉｏＩ遺伝子（２６．８ｎｇ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（３４０ｎｇ）及びｙａｔＰ遺伝子（２８５ｎｇ）を混合し、上記２種類のプライマー各２００ｎＭ、ＫＯＤプラス１ユニットを使用して、９４℃ ２分加熱した後、９４℃ ４５秒、５４℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。
【００７４】
（２−３）枯草菌の形質転換とｂｉｏＷからｂｉｏＢまでの欠損株のスクリーニング
ＰＣＲ産物をＲＥＣＯＴＩＰ（タカラバイオ社）で精製し、融合遺伝子１μｇを用いｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ添付の取扱説明書に従って、枯草菌ＩＳＷ１４１２へ形質転換した。目的欠損株のスクリーニングは、上記のｂｉｏＡからｂｉｏＢまでの領域欠損株の場合と同条件で行った。ｂｉｏｔｉｎ（５ｎｇ／ｍｌ）依存性に増殖する菌株を目的欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））として選択し、分離した。
【００７５】
実施例２、ｂｉｏＩ発現プラスミドの作製（図６）
ｂｉｏＩ遺伝子の増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：１９）：５′−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＡＧ−３′
Ｒ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号：２０）：５′−ＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′
【００７６】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ４分加熱した後、９４℃ ４５秒、５５℃ ４５秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した後、プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）とｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた。
【００７７】
実施例３、ｂｉｏＩとｂｉｏＩ蛋白酸化還元パートナー遺伝子との共発現プラスミドの作製
（１）枯草菌ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ遺伝子（ｙｋｕＮ）、ｂｉｏＩ遺伝子及びｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ−ＮＡＤ（Ｐ）＋ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（ｙｕｍＣ）の発現プラスミドの作製（図６）
（１−１）枯草菌ｙｋｕＮ遺伝子増幅（約０．６ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。なお、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、ｙｋｕＮ遺伝子３′側とｂｉｏＩ遺伝子５′側（下線部）の融合プライマーである。
Ｆ−ｙｋｕＮ（配列番号：２１）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧ−３′
Ｒ−ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ（配列番号：２２）：５′−ＣＡＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＣ−３′
【００７８】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のサイクルを２５回行った（図４）。
【００７９】
（１−２）枯草菌ｂｉｏＩ遺伝子増幅（約１．２ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：２３）：５′−ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧ−３′
Ｒ−ｂｉｏＩ−Ｆｕｓｉｏｎ（配列番号：２４）：５′−ＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′
【００８０】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８１】
（１−３）枯草菌ｙｕｍＣ遺伝子増幅（約１．１ｋｂｐ）
以下の２種類のプライマーを用いた。なおｆｏｒｗａｒｄプライマーはｂｉｏＩ遺伝子３′側（下線部）とｙｕｍＣ遺伝子５′側の融合プライマーである。
Ｆ−ｙｕｍＣ−ｂｉｏＩ（配列番号：２５）：５′−ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＣ−３′
Ｒ−ｙｕｍＣ（配列番号：２６）：５′−ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧ−３′
【００８２】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８３】
（１−４）ｙｋｕＮ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣ遺伝子（約２．７ｋｂｐ）の作製（図５）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｙｋｕ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：２７）：５′−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧ−３′
Ｒ−ｙｋｕ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：２８）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣ−３′
【００８４】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、ｙｋｕＮ ２３ｎｇ、ｂｉｏＩ １３８ｎｇ、ｙｕｍＣ ３４ｎｇの各ＤＮＡ断片を混和し、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ３分のサイクルを２５回行った（図４）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した後、プラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００８５】
（２）枯草菌ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子（ｆｅｒ）、ｂｉｏＩ遺伝子及びｙｕｍＣ遺伝子の発現プラスミドの作製
（２−１）枯草菌ｆｅｒ遺伝子の増幅（約０．３ｋｂｐ）
枯草菌ｆｅｒ遺伝子増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。なおｒｅｖｅｒｓｅプライマーはｆｅｒ遺伝子３′側とｂｉｏＩ遺伝子５′側（下線部）の融合プライマーである。
Ｆ−ｆｅｒ（配列番号：２９）：５′−ＧＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣ−３′
Ｒ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ（配列番号：３０）：５′−ＣＡＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣＣ−３′
【００８６】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型とし、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラス１ユニット使用し、９４℃ ３分加熱した後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ２分のサイクルを２５回行った（図４）。
【００８７】
（２−２）ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍＣの融合遺伝子（約２．５ｋｂｐ）の作製（図５）
以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：３１）：５′−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＡＴＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴＡＣ−３′
Ｒ−ｆｅｒ−ｂｉｏＩ−ｙｕｍ（配列番号：３２）：５′−ＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣ−３′
【００８８】
ＰＣＲはｆｅｒ １５ｎｇ、ｂｉｏＩ １３８ｎｇ、ｙｕｍＣ ３４ｎｇを鋳型として、９４℃３分加熱した後、９４℃１５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ３分のサイクルを２５回行った（図４）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した。形質転換菌よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００８９】
実施例４、枯草菌ビオチン合成オペロンのｏｒｆ２遺伝子とｂｉｏＩ遺伝子の共発現プラスミドの作製（図６）
枯草菌ｂｉｏＩ−ｏｒｆ２遺伝子増幅は以下の２種類のプライマーを用いた。
Ｆ−ＢｉｏＩ−ｓｏｌｏ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：１９）および
Ｒ−ＯＲＦ２（配列番号：３３）：５′−ＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧ−３′
【００９０】
ＰＣＲは反応体積５０μｌ、枯草菌ＩＳＷ１４１２染色体ＤＮＡ１７０ｎｇを鋳型として、上記プライマーを各２００ｎＭ、ＫＯＤプラスを１ユニット使用し、９４℃ ４分加熱した後、９４℃ ４５秒、５５℃ ４５ 秒、６８℃ ６０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に手順書に従って組込み、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換した。形質転換菌よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで切断し、同酵素で切断した枯草菌用シャトル発現ベクターｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ社）へ、ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させた（図６）。
【００９１】
実施例５、ｂｉｏＩ組み込み菌によるピメリン酸の産生
（１）枯草菌及び大腸菌への形質転換
枯草菌エレクトロポーレーション用コンピテントセル（ＩＳＷ１４１２、ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）、ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））はｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ（タカラバイオ社）添付の取扱説明書に従って調製した。
【００９２】
エレクトロポレーション用セルの調製方法
１）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を Ｌ−ｂｒｏｔｈで３７℃、一晩前培養する。
２）前培養液２ｍｌを本培養液（Ｌ−ｂｒｏｔｈ＋０．５Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ）３２ｍｌに加え、３７℃で本培養を行う。
３）Ａ６６０＝０．８５〜０．９５で本培養を止める（約２．５時間）。
４）氷中に１０分間放置する。
５）５，０００×ｇで５分間遠心する。
６）氷冷したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（０．５Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ０．５Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ， １０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で菌体を４回洗浄する。
７）菌体を０．８ｍｌ（培養液の１／４０量）のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａに懸濁する。
８）６０μｌずつ分注し、−８０℃で保存する。これをエレクトロポレーション用セルとする。
【００９３】
枯草菌への形質転換は、ＥＱＵＩＢＩＯ社Ｅａｓｙｊｅｔ ｏｐｔｉｍａの装置及びｃｅｌｌ ｐｒｏｊｅｃｔｓ社ＥＰ−１０２のキュベットを用いたエレクトロポレーション法（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）によって行った。大腸菌の形質転換は、Ｅｃｏｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＤＨ５α（ニッポンジーン社）を用いたカルシウム法によって行った。
【００９４】
枯草菌の形質転換体は、形質転換後の菌を終濃度３μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３０℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択して得た。
【００９５】
大腸菌の形質転換体は、形質転換後の菌を終濃度５０μｇ／ｍｌカルベニシリン含むＬ−ｂｒｏｔｈのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養し、増殖する菌株を選択して得た。
【００９６】
（２）ｂｉｏＩ組み込み菌の培養条件
枯草菌の場合は終濃度３μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、大腸菌の場合は終濃度５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＢＤ社製ＬＢ培地を使用した。培養は一晩培養液（培養温度３０℃）６０μｌを３ｍｌ培養液の入った試験管に加え、培養温度３０℃または３７℃、往復振盪速度１８０／ｍｉｎで行った。ＢｉｏＩ遺伝子発現誘導はＯＤ６００＝０．８〜０．９になった時点で、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧ及び２ｍＭアミノレブリン酸（ヘム合成促進のため）を添加した。培養は遺伝子発現誘導後、２０時間から４８時間まで行った。
【００９７】
Ｌ−ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地：
トリプトン １％（ｗ／ｖ）
酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ）
【００９８】
（３）ピメリン酸分析方法
培養上清１ｍｌに５Ｍ ＨＣｌ ３０μｌを添加した後、真空乾燥し、得られた残留物を１ｍｌメタノールに溶解した。遠心して不溶物を除き、上清０．９ｍｌに０．１ｍｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅを添加、室温３０分インキュベートした。遠心して上清を回収し、ピメリン酸ジメチルをＧＣ／ＭＳ（日本電子製ＪＭＳ−ＧＣｍａｔｅＩＩ）にて分析した。ピメリン酸ジメチルの標準品は和光純薬社商品番号３２３−８６００１を用いた。
【００９９】
分析条件
カラム：ＣＰＷＡＸ５２ＣＢ Φ０．２５ｍｍ×６０ｍ 膜厚０．２５μｍ
温度：５０℃（３ｍｉｎ）−１０℃／ｍｉｎ−２５０℃Ｈｏｌｄ
注入口温度：２５０℃、インターフェース：２５０℃、キャリアガス：１．０ｍｌ／ｍｉｎ（Ｈｅ）
スプリット：スプリットレス、注入量：０．５μｌ
【０１００】
ＭＳ条件
加速電圧：２．５ｋＶ、イオン源温度：２１０℃、イオン化法：ＳＩＭ（選択イオンモニタリング）
選択イオン：ｍ／ｚ＝１１５（定量用）、ｍ／ｚ＝７４（確認用）、ｍ／ｚ＝１５７（確認用）
【０１０１】
ピメリン酸の定量は、濃度既知のピメリン酸ジメチル標準品のＧＣ／ＭＳ−ＳＩＭスペクトラムピーク面積から作成した検量線を元に定量した。
【０１０２】
結果
（１）ｂｉｏＩ発現枯草菌によるピメリン酸産生
図７ＡにｂｉｏＩ発現枯草菌（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））培養上清中のピメリン酸産生量を示す。ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養し、培養上清を回収した。非欠損株（Ｗｉｌｄ）ではピメリン酸の産生は認められなかったが、欠損株（ｐＨＴ０１）でわずかなピメリン酸の産生が認められた。欠損株でｂｉｏＩを発現させる（ｐＢｉｏＩ）ことでピメリン酸の産生が驚くべきことに１８倍も増加した。さらに、ｆｅｒ蛋白質及びｙｕｍＣ蛋白質を共発現する（ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）ことによって、ピメリン酸の産生量が増加し、ｂｉｏＩ蛋白と酸化還元パートナーとの共発現により産生量を向上させることができた。一方、ｙｋｕＮ蛋白質及びｙｕｍＣ蛋白質の共発現（ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）では、菌の増殖は低下したが、ピメリン酸の産生量はｂｉｏＩ単独の場合と同レベルであった。
【０１０３】
ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＡ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ））の場合（図８Ａ）、ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４および４８時間培養し、培養上清を回収した。ｂｉｏＩ単独（ｐＢｉｏＩ）では、２４および４８時間培養後の上清中のピメリン酸産生量には違いは認められなかった（２４時間：１．８μＭ、４８時間：１．８４μＭ）が、ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２）では、２４時間後と比較して４８時間後で約２倍（２４時間：１．８６μＭ、４８時間：３．６２μＭ）のピメリン酸産生量の増加が認められた。
【０１０４】
また、宿主にｂｉｏＷ〜ｂｉｏＢ欠損株（ＩＳＷ１４１２ ｂｉｏ−（ΔｂｉｏＷ−ｂｉｏＢ：：Ｔｃ）を用いた場合、ｂｉｏＩ遺伝子を有する形質転換体は、ｂｉｏＷ〜ｂｉｏＢ欠損株の場合と比較して、増殖は同程度であったが、ピメリン酸の産生は顕著に減少した。
【０１０５】
（２）ｂｉｏＩ発現大腸菌によるピメリン酸産生
ｂｉｏＩ発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、枯草菌と同様にＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養した後、培養上清中にピメリン酸が蓄積するかを調べた。結果を図９Ａに示す。大腸菌においても、ｂｉｏＩ蛋白発現によるピメリン酸の培地中への蓄積が確認され、さらにＦｅｒ蛋白質及びＹｕｍＣ蛋白質との共発現によって産生量が向上した（ｐＦｅｒ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）。しかし、産生量は枯草菌の半分程度であった。一方、ＹｋｕＮ蛋白質及びＹｕｍＣ蛋白質の共発現（ｐＹｋｕＮ−ＢｉｏＩ−ＹｕｍＣ）では、菌の増殖は低下したが、ピメリン酸の産生量はｂｉｏＩ単独の場合と同レベルであった。
【０１０６】
ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現（ＤＨ５α）の場合（ｐＢｉｏＩ−ｏｒｆ２）、ＩＰＴＧ及びアミノレブリン酸の添加によるインダクション後、培養温度３０℃、２４時間培養し、培養上清を回収した。枯草菌の場合と異なり、２４時間培養後において、ｂｉｏＩ単独（０．９１μＭ）と比較して、ｂｉｏＩとｏｒｆ２との共発現では、約２倍（１．８５μＭ）のピメリン酸産生量の増加が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、プラスチック原料と使用できるピメリン酸を、バイオマスから生産することを可能とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した微生物を培養し、ピメリン酸を生産させることを含む、ピメリン酸の製造方法。
【請求項２】
微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であることを特徴とする請求項１記載のピメリン酸の製造方法。
【請求項３】
微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１記載のピメリン酸の製造方法。
【請求項４】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。
【請求項５】
微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記４記載の組換え微生物。
【請求項１】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した微生物を培養し、ピメリン酸を生産させることを含む、ピメリン酸の製造方法。
【請求項２】
微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であることを特徴とする請求項１記載のピメリン酸の製造方法。
【請求項３】
微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１記載のピメリン酸の製造方法。
【請求項４】
プロモーターに作動的に連結したｂｉｏＩ遺伝子を導入した、大腸菌を除く組換え微生物。
【請求項５】
微生物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、前記４記載の組換え微生物。
【図１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２１１９０８（Ｐ２０１１−２１１９０８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８０３１９（Ｐ２０１０−８０３１９）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]