ブレベトキシン誘導体の定量方法
【課題】神経性貝毒であるブレベトキシン誘導体のひとつであるＢＴＸ−Ｂ２等の新規定量法の提供。
【解決手段】
下記工程：試料を酸化反応処理すること、及び、該試料中の式（Ｉ）：
の化合物を定量することを含む、上記化合物の定量方法。
【解決手段】
下記工程：試料を酸化反応処理すること、及び、該試料中の式（Ｉ）：
の化合物を定量することを含む、上記化合物の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有毒プランクトンに由来する神経性貝毒であるブレベトキシンＢＴＸ−Ｂ２等の新規定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
貝中毒はその原因毒によってその特徴的症状が異なる。世界的に、麻痺性貝中毒（ＰＳＰ）、下痢性貝中毒（ＤＳＰ）、記憶喪失性貝中毒（ＡＳＰ）と神経性貝中毒（ＮＳＰ）の４種がよく知られている。これらの貝中毒についての研究の過程でＰＳＰに関わる有毒プランクトンが貝中腸腺内で確認されたのを機に、各貝中毒の原因毒、原因毒産生プランクトン、貝の毒化機構、原因毒の分析法等に関する研究が精力的に行われてきた。その結果、ＰＳＰ原因毒の一つはサキシトキシン（Saxitoxin）、ネオ−サキシトキシン（Neo-saxitoxin）とゴニオトキシン（Gonyautoxin）の、及びＤＳＰではオカダ酸（Okadaic Acid）、ジノフィシストキシン（Dinophysis Toxin）、ペクテノトキシン（Pectenotoxin）とエソトキシン（Yessotoxin）であることが突止められ、これらを産生する各々のプランクトンが特定された。また、取り込まれたプランクトン中の毒が貝に直接蓄積されることも見いだされた。ＡＳＰの場合、ドウモイ酸（Domoic acid）が蓄積毒の一つで、その産生プランクトンの一種が明らかにされた。
【０００３】
一方、Walkerはフロリダ西海岸で１８８０年に初めてＮＳＰを記録した。その後、アメリカ合衆国のフロリダから北はノースカロライナ、西はテキサスに至るメキシコ湾沿岸において、渦鞭毛藻類Ｋ．brebisの赤潮が発生し、多くの海洋生物の瀕死が起こる現象は、現在まで続いている。１９６５年には、この赤潮に曝された二枚貝をヒトが摂取することで頭痛、知覚異常、四肢の麻痺、呼吸困難、嘔吐、下痢、胃痛等の症状をともなう食中毒が起きることが明らかとなった。この中毒症状が、それまでに知られていた他の貝中毒とは異なり、神経系及び消化器系障害が主な兆候であることから、ＮＳＰと称されてきた（非特許文献１）。渦鞭毛藻の一つ、K. brebisはブレベトキシン（brevetoxin）である、ＰｂＴｘ−１、ＰｂＴｘ−２及びＰｂＴｘ−３を、１．４：９．８：３．０の比で産生すると報告されている（非特許文献２）。これらのことから、ＮＳＰはK. brebisが作りだすブレベトキシンが貝に蓄積され、それにより貝中毒が引き起こされると推定されているが、これまで実証されてこなかった。
【０００４】
現在、世界の多くの国では、貝の毒化（貝が毒産生プランクトンに汚染されて毒性を有するようになること）を監視するために、漁場海水中のプランクトンモニタリングを行っている。特定の有毒プランクトンが検出され、その密度が規制値を超えた場合は、漁獲対象の貝の毒力測定を実施している。毒力測定は、米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）記載のＰＳＰ、ＤＳＰ、ＡＳＰ、及びＮＳＰのいずれかの原因毒の毒力を測るマウスを用いた試験法（マウスアッセイ）に従って成され、その結果より、陸揚げ、出荷の可否が決められている。しかし、これらの方法は、貝がどの毒によって、どの程度毒化したかを正確に測定するという観点からは、感度、正確さ、定量性に乏しいことから、汎用性が高く、迅速で、かつ精度の高い貝毒の分析定量法の開発が強く求められている。これらの要件を満たす方法として機器分析学的方法がある。しかし、機器分析学的方法においては、測定すべき対象がすべて特定され機器分析学的に同定できることが必要である。
【０００５】
これまでブレベトキシンで汚染された貝類より単離された神経性貝毒として明らかとなったブレベトキシン（またはブレベトキシン誘導体）には、図１に示すような、ＰｂＴｘ−２、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ１、ＢＴＸ−Ｂ２（請求項１に示す式（Ｉ）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ４（請求項１に示す式（II）および（III）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ５等がある（特許文献１、非特許文献３および図１）。しかし、これら一連のブレベトキシンは、プランクトン中で生合成されたＰｂＴｘ−２が、貝類中で解毒作用を受けることによって生成された代謝物（ブレベトキシン誘導体）と推測されている（貝類にとっては、毒性が低下しているが魚類や人間にとっては未だ毒性は高い）。そして、図２に示すような代謝経路が提案されている（非特許文献３および４）が、その全容は不明のままである。従って、未だ同定されていないブレベトキシン誘導体（代謝中間体）も存在していると推測されている。例えば、図２に示す、ＰｂＴｘ−２からＢＴＸ−Ｂ２およびＢＴＸ−Ｂ４に至る過程に示されている化学構造（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のようなブレベトキシン誘導体が未だ同定されていないがその存在が推測されている。そのため、機器分析学的手法による貝類中に存在するブレベトキシンの測定では、すべてのブレベトキシン誘導体の量を測定できているとはいえず正確とはいえなかった。すなわち、未だ同定されていない毒性を有するブレベトキシン誘導体（例えば図２の化学構造（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のブレベトキシン誘導体）があってもそれらを測定できていなかった。
【０００６】
これに対し、本発明人は、これら存在しながら隠れているブレベトキシン誘導体の測定を可能とし、貝類中に存在するブレベトキシン量をより正確に機器分析学的手法による定量に反映させる方法を見出した。これは、ブレベトキシン誘導体を含む試料を酸化することによってＢＴＸ−Ｂ２の量が顕著に増加することを見出したことによる。この増加は、おそらく未同定のＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体（図２の化学構造（Ｂ）のブレベトキシン誘導体）が酸化反応によりＢＴＸ−Ｂ２に変換したことによるものと推測される。
【０００７】
これまで、ブレベトキシン誘導体の酸化については、特許文献１において触媒ＳｅＯ2の存在下で過酸化水素によりＰｂＴｘ−２のアルデヒドがカルボン酸に変換されＢＴＸ−Ｂ５が生成することが開示されているだけである。また図２に示すようなブレベトキシンの酸化反応（おそらく酵素反応による選択的酸化反応）は推測に過ぎず、このような推測の酸化反応をブレベトキシンに生じさせる方法は知られていなかった。従って、本発明に見られる簡単な酸化反応処理を施すだけで、隠れていたＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体がＢＴＸ−Ｂ２となり、ＢＴＸ−Ｂ２の測定量が顕著に増加することはまったく予想されていなかった。
【特許文献１】特願２００３−３９９６８３
【非特許文献１】E F MaFarren, et.al., Toxicon, 3, 5521-5524(1982)
【非特許文献２】H-N Chou, Y Shimizu, TetrahedronLetters, 23, 5521-5524(1982)
【非特許文献３】A Nozawa, et.al., Toxicon, (2003)Jul; 42(1): 91-103.
【非特許文献４】K Murata, et.al., Tetrahedron, Vol.54(1998) pp.735-742
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、神経性貝毒であるブレベトキシン誘導体のひとつであるＢＴＸ−Ｂ２等の新規定量法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、神経性貝毒の検査を必要とする生体試料中の神経性貝毒の機器分析学的定量分析において、当該生体試料に直接または当該生体試料由来の調製物に酸化反応処理を施し、当該酸化反応処理により式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物へと変換された式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物の酸化前前駆体を、当該酸化反応処理前から当該生体試料中または当該生体試料由来の調製物中に存在する式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物とそれぞれあわせて、式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物とし、それらの少なくとも一つを定量する方法に関する。
【００１０】
（１）本発明は、
下記工程：
試料を酸化反応処理すること、及び、
該試料中の式（Ｉ）：
【化４】
式（II）：
【化５】
または
式（III）：
【化６】
の化合物の少なくとも一つを定量することを含む、上記化合物の定量方法に関する。
【００１１】
（２）本発明は、酸化剤を含む、（１）に記載の化合物の検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、試料中に存在しながら隠れていたＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体をＢＴＸ−Ｂ２として定量できるようになった。これにより、分析機器の検出感度を上げることなく、ＢＴＸ−Ｂ２の検出感度を上げることが可能となった。また、ＢＴＸ−Ｂ２の検出感度が上がったことによりＢＴＸ−Ｂ２と神経性毒性との関連性をより正確に評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に用いる試料は、生体由来の試料であり、好ましくは、トリガイ、イガイ、カキ、アサリ、ハマグリ、カラス貝、ホタテ貝、アカ貝、ムール貝などの貝類、渦鞭毛藻Ｋ．brebis、K. mikimotoiなどの海洋性プランクトン類、ハマチ、ブリ、タイ、ヒラメ、アジ、サバ、イサキ、ハゼ、メジナ、マグロなどの魚類、ジュゴン、ラッコ、イルカ、クジラなどの海洋動物、ヒト、ネコ、イヌ、カモメ、カメ、スッポン、ハト、ニワトリなどが挙げられるが、神経性貝毒の検査を必要とする生物であればこれらに限定されない。
【００１４】
神経性貝毒とは、人が摂取することで頭痛、知覚異常、四肢の麻痺、呼吸困難、嘔吐、下痢、胃痛などの神経系及び消化器系障害の兆候を示す食中毒を引き起こす毒化合物を指し、特にブレベトキシンを指す。
【００１５】
試料として用いる時は、肉、内臓、体液（血液を含む）など生体のいずれの部分でも構わない。試料が肉、内臓などの固形体の場合には、試料は予めホモジナイザーなどを用いてすり潰されたホモジネート状態であることが好ましい。
【００１６】
本発明に用いる試料は、例えば以下のような方法でさらに調製されることが好ましい。
試料の調製方法は、０．０５〜１０ｇ、好ましくは０．５ｇの剥き身の貝類などのホモジネートに対して、重量で２〜２０倍量、好ましくは５倍量の１０〜１００％メタノール、１０〜１００％のエタノール、１００％アセトン、１００％アセトニトリルのいずれか１つ、好ましくは８０％メタノールで、２５〜９０℃、好ましくは６０℃の還流下、３〜６０分間、好ましくは２０分間の攪拌抽出を、１〜４回、好ましくは２回行い、得られた抽出液を合わせた後、真空エバポレーターなどを用いて濃縮乾固する。濃縮乾固後の残渣は、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの２０〜１００％メタノール、好ましくは８０％メタノールに溶解後、残渣の溶解に用いた溶媒と当量の１００％ｎ−ヘキサンで分配し、メタノール層部（好ましくは８０％メタノール層部）を分析試料溶液として用いる。場合により、濃縮乾固後の残渣は、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの水に溶解又は懸濁後、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの１００％メチレンクロライド、１００％エチルエーテル、１００％酢酸エチルのいずれか１つ、好ましくは１００％メチレンクロライドで１〜３回、好ましくは２回の抽出を行い、続いて、合わせた有機溶媒層部（好ましくは１００％メチレンクロライド層部）を０．５〜５．０ml、好ましくは０．５mlの２０〜１００％メタノール、好ましくは８０％メタノールと０．５〜５．０ml、好ましくは０．５mlのｎ−ヘキサンで分配し、メタノール層部（好ましくは８０％メタノール層部）を分析試料溶液として用いる。本試料の調製は特に指定しない限り、２３℃程度の室温、１気圧の大気圧下で実施される。ただし、上記試料調製の条件は、機器分析用にブレベトキシンを試料より調製できれば、上記条件に限定されることはない。
【００１７】
本発明に用いる試料を酸化反応処理するとは、好ましくは上記の試料の調製方法によって調製された分析試料溶液に酸化剤を添加すること、または分析試料溶液を酸素に曝すことによって実施される分析試料溶液の酸化反応処理を意味するが、場合によっては上記調製前の試料に直接、酸化剤を添加したり、または試料を酸素に曝して酸化反応処理を実施しても構わない。
本発明に用いる酸化剤には、例えば、過酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＯＨ）、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ2）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、二酸化マンガン（ＭｎＯ2）、クロム酸（Ｈ2ＣｒＯ4），過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）などが挙げられるが、好ましくは、二酸化マンガン、過酸化水素、過酢酸、より好ましくは過酸化水素である。過酸化水素は、市販の３０％過酸化水素水でも構わない。
【００１８】
添加する酸化剤の量は、例えば市販の３０％過酸化水素水を用いた場合、例えば０．５ｇ／０．５mlの分析試料溶液（０．５ｇの試料のホモジネートを上記試料の調製方法により最終的に０．５mlの８０％メタノールに調製したものであることを意味する）０．５mlに対して、５〜１００μl、好ましく２０〜５０μl、より好ましくは４０μlである。当然、上記分析試料溶液の濃度、量または添加する過酸化水素水の濃度が変われば、それに合わせて添加する過酸化水素水の量も変化し得る。
酸化反応処理時間は、例えば市販の３０％過酸化水素水を用いた場合、０．１〜５時間、好ましくは０．５〜２時間、より好ましくは１時間である。当然、上記分析試料溶液の濃度、量または添加する過酸化水素水の濃度が変われば、それに合わせて酸化反応処理時間も変化し得る。
酸化反応処理温度は、０〜３０℃、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは１０℃付近の温度である。酸化反応処理時の圧力は、１気圧の大気圧である。
さらに、酸化剤の種類が変われば、上記酸化反応処理の条件（酸化剤の濃度、添加量、反応時間、反応温度、反応圧力）が変化し得ることは当業者においては周知のことであり、上記３０％過酸化水素水による酸化反応処理と同じ酸化効力を示す酸化剤または酸化反応処理条件であれば酸化剤の種類または酸化反応処理の条件が変化しても構わない。
【００１９】
また、試料を酸素に曝す場合には、空気中に分析試料溶液を置いて酸化させるが、この時の温度は、０〜３０℃、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは２０℃付近の室温である。期間は、１〜１２ヶ月、好ましくは３〜６ヶ月、より好ましくは３ヶ月である。さらに、バブリング等を用いて強制的に酸素を添加しても構わないが、この場合の条件は、上記酸化剤による酸化反応処理の場合と同様な酸化効力を発揮する酸化反応処理条件（酸素の濃度、添加量、反応時間、反応温度、反応圧力）であればよい。
【００２０】
本発明に用いる化合物の分析および定量には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＵＶ検出器、ＨＰＬＣ−蛍光検出器、キャピラリー−ＭＳ／ＭＳなどの機器分析学的方法が挙げられるが、特にＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析および定量が好ましい。
ＥＳＩを備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳとは、静電噴霧イオン化が可能な液体クロマトグラフィー質量分析装置をさす。すなわち、ＬＣ−ＭＳとは四重極の質量分析装置を検出器に用いた高速液体クロマトグラフィー分析装置であり、ＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる化合物の分析および定量法は、当業者には周知である。
【００２１】
ブレベトキシンのＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定条件等は非特許文献３、非特許文献４、H Ishida, et. al., Toxicon, 701-712(2004)およびH Ishida, et. al., Tetrahedron Letters, 29-33(2004)に記載があり、測定に用いる装置、試薬、条件等は以下に限定されないが、例えば、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置は、Alliance system(Waters Corp., Milford, MA, USA)、液体クロマトグラフィー用分離カラムは、Cadenza CD-C18（３×１５０mm、３μm、Intact）カラムを用いることができ、ＨＰＬＣ条件は、例えば、移動相；２０分間の０．１％ギ酸−アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）（２０〜８０％ＣＨ3ＣＮ）の勾配、流速；０．２mL/min、カラム温度；４５℃、２０μL試料溶液の注入で実施できる。
【００２２】
ＥＳＩを備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置は、例えば、ＥＳＩインターフェースを備えたQuattro Ultima triple-stage quadrupole MS system (Micromass、Cheshire、UK)、データ補足解析等はMasslynx NT software (version 3.5)などが使用できる。測定条件は、コリジョン（衝突）エネルギー、５０〜１５０eV，好ましくは１００eV、コーン電圧、４０〜８０Ｖ，好ましくは６０Ｖ、キャピラリー電圧、３．５〜５．５Ｖ，好ましくは５．５Ｖである。衝突ガスとしてはアルゴンまたは窒素ガスを用いることができる。
【００２３】
本発明のＢＴＸ−Ｂ２（式（Ｉ）の化合物）の定量は、予め既知量のＢＴＸ−Ｂ２をＥＳＩ法によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、検量線を作製することで、試料中で測定されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラム上のＢＴＸ−Ｂ２のピーク面積を比較することで定量できる。
【００２４】
ＢＴＸ−Ｂ２以外のＰｂＴｘ−２、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ１、ＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ４（式（II）および（III）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ５の定量も、ＢＴＸ−Ｂ２の定量と同様に、予め既知量の各ブレベトキシン誘導体の検量線を作製しておき、試料中で測定されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳのクロマトグラム上のそれぞれの対応するブレベトキシン誘導体のピーク面積を比較することで定量できる。
【００２５】
本発明で用いる検出キットには、先に記載の試料の調製に必要な溶媒、用具、先に記載した少なくとも一つの酸化剤から構成されており、必要に応じて、標準マーカーとして、式（Ｉ）に示すＢＴＸ−Ｂ２または式（II）もしくは（III）に示すＢＴＸ−Ｂ４の少なくとも一つを含んでもよい。
【実施例１】
【００２６】
貝試料
１９９３年１月に、ニュージーランドで採られたWhangarei産の毒化トリガイ（cockle(Austrovenus stutchburyi)）とTiki Road及びMcGregor Bay産の毒化カキ（Pacific oyster (Crassostrea gigas)）、及び２月にBay of PlentyとCanon Hillでそれぞれ採取された毒化イガイ（Pipi (Paphles austrailis)とgreenshell mussel (Perna canaliculus)）を用いた。尚、全ての貝は、使用時までは−３０℃で保存した。
【００２７】
標品
ＢＴＸ−Ｂ２は、１９９３年２月に、ニュージーランド（ＮＺ）のCoromandelで採取された毒化イガイより安元らの報告（非特許文献４）に従って調製した。すなわち、この毒化イガイの虫腸腺部（３０Ｋｇ）をホモジネート後、アセトンで抽出した。抽出物を水と酢酸エチルで分配した。水層部をｎ−ブタノールで抽出し、得た抽出部を濃縮後、高速液体クロマトグラフィーを用いて、Develosil Lop C8カラム，ToyopearlHW-40カラム，Develosil TMS-5カラムで順次精製し、約３０mgのＢＴＸ−Ｂ２を得た。
【００２８】
分析試料調製
貝の剥き身の一定量を小ビーカーに入れ、氷冷下PHYSCOTRONホモジナイザー（ニチオン製（東京））でホモジナイズした。次いで、この貝ホモジネート（０．５ｇ）に８０％メタノール（２．５ml）を加え、６０℃、２０分間の攪拌抽出を２回行った。得た抽出液を濃縮乾固し、抽出物を得た。これを８０％メタノール（０．５ml）に溶解した後、ｎ−ヘキサン（０．５ml）で分配した。８０％メタノール分画を分析試料溶液とした。または、場合により、濃縮乾固後の残渣を、０．５mlの水に溶解又は懸濁後、１００％メチレンクロライドで２回の抽出を行い、続いて、合わせたメチレンクロライド層部を０．５mlの８０％メタノールと０．５mlのｎ−ヘキサンで分配し、８０％メタノール層部を分析試料溶液とした。
【００２９】
酸化剤
３０％Ｈ2Ｏ2（過酸化水素水、和光純薬製特級）を用いた。
【００３０】
機器
ＥＳＩ法によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、液体クロマトグラフィー装置にAlliance system 2795(Waters製）またはAgillent 1100 LC system(Agillent製）を、ＭＳ／ＭＳにはQuattro Ultima triple-stage quadrupole MS system(Micromass製）とAPI3000 LC-MS/MS System (AB Bio製）を、そして、データ取り込みと解析にMasslynx NT（Micromass製）とAnalyst（アプライドバイオ社（AB Bio）製）を適宜組み合わせて行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のＨＰＬＣカラムとして、Cadenza CD-C18 (ψ３×１５０mm, ３μm, Intact製）を用いた。
【００３１】
分析および定量方法
全スキャンマス（Full-scan mass）スペクトルは各貝から調製した分析試料溶液２０μlを ＭＳ／ＭＳ装置に流速０．２ml／分で直接導入（direct infusion法）し、ＭＳ１にてｍ／ｚ３００〜１２００をスキャンすることで測定した。移動相は、０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１：１）を、ネガティブモードで用いた。
Quattro Ultima triple-stage quadrupole MS systemにおいては全スキャン衝突誘起解離（Full-scan collision-induced dissociation (CID)）スペクトル測定は、アルゴンガスにて約１．３×１０-4mbarに調整した衝突セル（Ｑ２）内でquadrupole 1（Ｑ１）において選択した前駆体イオン（precursor ion）を衝突させ、ｍ／ｚ５０〜９００の範囲をquadrupole ＭＳ（Ｑ３）でスキャンすることで行った。
定量は、まず標品ＢＴＸ−Ｂ２のＣＩＤスペクトル測定のための前駆体イオンと産物イオン（product ion）を選択し、選択反応モニタリング液体クロマトグラフィータンデムマススペクトラム（selective reacted monitoring liquid chromatography-tandem mass spectrometry （ＳＲＭ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ））を実施した。イオン源のソース温度とデソルベーション温度はそれぞれ１００℃と３００℃に、デソルベーションガスとコーンガスの流速はそれぞれ６８０と０ｌ／時間にそれぞれ設定した。エレクトロスプレーキャピラリー電圧とコーン電圧は展開溶媒毎に最適化した。
【００３２】
定量は、分析試料溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入し、得られたピーク面積値を用いて行った。尚、試料によっては、一定時間毎に標品試料の分析を実施した。カラム温度は４５℃、注入量は２０μlとした。
【００３３】
展開相に０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１６分かけてＣＨ3ＣＮを２０から７０％へ）を用いて、ポジティブモードにて１０μg/ml濃度のＢＴＸ−Ｂ２のマススペクトルを測定した。その結果、両ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置において分子関連イオンｍ／ｚ１０３４（［Ｍ＋Ｈ］＋）を検出した。このイオン強度は、Quattro Ultimaで、コーンエネルギー５６Ｖの時に最高となった。イオン強度が最高となるコーンエネルギーは１１０Ｖであった（図３）。
【００３４】
ポジティブモードでＢＴＸ−Ｂ２の［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ１０３４をプリカーサー（前駆体）イオンとしてＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ実験を行った。その結果、プロダクト（産物）イオン（ｍ／ｚ８８）を高感度で検出できた（図３）。
以上のことから、ＢＴＸ−Ｂ２のＳＲＭ分析に使用する前駆体イオン及び産物イオンの組み合わせを、ｍ／ｚ１０３４→８８とした。
移動相に０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１６分かけてＣＨ3ＣＮを２０から７０％にするグラジュエントで）を用いたＢＴＸ−Ｂ２の保持時間は１４．０分で、クロマトグラムのピーク形状は良好であった（図４）。
【００３５】
検討した濃度範囲、約０．５〜５００ng/mlにおいてＢＴＸ−Ｂ２の直線性は良好（ｒ2≧１．００）であった（図５）。
また、シグナル−ノイズ比が５を確保できる濃度を計算で求めた結果、ＢＴＸ−Ｂ２の検出下限は、注入量として０．０２ngであった。
ＢＴＸ−Ｂ２を、それぞれ市販の無毒のトリガイに２〜８００ng/gの濃度範囲で添加後の８０％メタノールによる回収率は９０〜９５％、イガイでは、８１〜８７％、カキにおいては、８０〜８１％の範囲の値となった。このように、いずれの貝に於いても、検討した抽出溶媒では、添加回収率は、添加濃度に依らずほぼ一定であった。
【実施例２】
【００３６】
酸化条件
上述した毒化トリガイ（１９９３年１月）を用いて、分析試料溶液（０．５ｇ／０．５ml、トリガイの剥き身のホモジネート０．５ｇからの８０％メタノール分画を８０％メタノール０．５mlに溶解した試料であることを意味する）に温度１０℃で過酸化水素を添加した後のＢＴＸ−Ｂ２の分析値を表２に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
過酸化水素による酸化反応処理で分析試料溶液中のＢＴＸ−Ｂ２の測定量が顕著に増加（過酸化水素水４０μlの添加時には約１０倍の増加）することが観察された。４０μlの過酸化水素水の添加後では、１時間後から８時間後までの定量値はほぼ一定となった。
以上のように、ＢＴＸ−Ｂ２分析用の貝からの分析試料溶液（０．５ｇ／０．５ml）０．５mlに温度１０℃で３０％過酸化水素水４０μl添加した場合には１時間の反応で十分なことがわかった。
【００３９】
今回の試料の酸化反応処理によるＢＴＸ−Ｂ２の増加は、貝中には酸化前の前駆体化合物（図２（Ｂ））がＰｂＴｘの代謝物として大量に存在し、それが、過酸化水素によっておそらく定量的にＢＴＸ−Ｂ２に変換されたことによるものと考えられる。
また、この分析試料溶液を約３ヶ月間冷蔵庫（約３度）保存した場合にも同様なＢＴＸ−Ｂ２の顕著な増加が観察された（データは示していない）。
【実施例３】
【００４０】
毒化したトリガイ，イガイ及びカキ中のＢＴＸ−Ｂ２の濃度の測定
上述の方法を用いて、顕著なマウス毒性を示した１９９３年ニュージーランド産毒化トリガイ，イガイ及びカキ中のＢＴＸ−Ｂ２の分析を行った。そのＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＳＲＭクロマトグラムを図６に示した。その分析結果をマウス毒性試験の結果と供に表３に示した。
【００４１】
マウスアッセイ
厚生省（現在は厚生労働省）により定められている貝毒試験法に準じて行った。
具体的には、昭和５５年７月１日付け環乳第３０号「貝毒の検査方法等について」、及び昭和５６年５月１９日付け環乳第３７号「下痢性貝毒の検査について」に従った。
３〜４週令（体重１０ｇ前後）のｄｄＹ系雄性マウスを日本ＳＬＣより購入して用いた。
貝をむき身し、その一定量を５倍量の８０％メタノールで、還流下１５分間抽出した。可溶部を濾取したのち、残差を再度同様の方法で抽出した。このようにして得た濾液を合わせ、濃縮乾固し、８０％メタノール抽出物を得た。これをＨ2Ｏに溶解または懸濁した後、ＣＨ2Ｃｌ2で２回の抽出を行った。続いて、ＣＨ2Ｃｌ2層部を８０％メタノールとｎ−ヘキサンで分配した。その８０％メタノール分画を濃縮乾固後、１％Tween60生理食塩水に溶解または懸濁し、検体とした。
以上の様に調製した各検体の０．５mLを腹腔内投与した。
投与後の致死時間を測定し、その時間より、米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）により定められたＮＳＰの毒力換算表を用いて、投与後の致死時間から、検体の毒力（マウスユニット，ＭＵ）を求めた。尚、１匹のマウスを致死せしめる量が１ＭＵと定義されている。
【００４２】
【表２】
【００４３】
食中毒発生時に採られた毒化トリガイ、毒化イガイ及び毒化カキに高濃度のＢＴＸ−Ｂ２が検出された。このうち、これまで毒化イガイでは、ＢＴＸ−Ｂ２の検出は報告されていたが、毒化トリガイにおいては、ＢＴＸ−Ｂ２の検出は報告されていなかった。そのため、ブレベトキシンの代謝系はイガイとトリガイ間では異なり、トリガイ中ではＢＴＸ−Ｂ２が生成されにくいと考えられていた（H Ishida, et.al., Tetrahedron Letters, 29-33(2004)）。
しかし、今回の実験から、マウス毒性試験（マウスアッセイ）によりブレベトキシンで汚染されていることの確認された三種類の貝すべてにＢＴＸ−Ｂ２が高濃度で含まれていることが明らかとなった。これは、本発明のような酸化反応処理により、トリガイのようなＢＴＸ−Ｂ２を生成（検出）しにくい貝類においても、有為な量のＢＴＸ−Ｂ２を生じさせることができ、本発明の方法を用いればＢＴＸ−Ｂ２を貝類のブレベトキシンによる毒化の共通マーカーにすることができることを意味している。すなわち、本発明の方法よりＢＴＸ−Ｂ２の量を測定することで、貝類のブレベトキシン汚染（毒化）の状況を把握できることがあきらかとなった。なお、市販の無毒の両二枚貝にはそれらを検出できなかった。
【００４４】
また、ＢＴＸ−Ｂ４も、図２に示すようにＢＴＸ−Ｂ２と同様のＳ−酸化過程を有していると推測されるので、ＢＴＸ−Ｂ４も本方法により酸化前前駆体として隠れている化合物（（図２（Ｃ）であって、ｎ＝１２の化合物およびｎ＝１４の化合物）をＢＴＸ−Ｂ４として測定が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の方法から、マウス毒性試験（マウスアッセイ）によりブレベトキシンで汚染された貝には、共通してＢＴＸ−Ｂ２と酸化によりＢＴＸ−Ｂ２に変換されるその前駆体が高濃度で含まれていることが明らかとなった。従って、ＢＴＸ−Ｂ２を、神経性貝毒の定量におけるマーカーとして、ブレベトキシンで汚染された貝類などに含まれている神経性貝毒のモニタリングに使用できる。そして、貝類、海洋プランクトン類、魚類などのブレベトキシンによる汚染の程度をＢＴＸ−Ｂ２として測定し、魚介類の陸揚げ、出荷における食品としての安全性の評価および検定に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はブレベトキシン誘導体の化学構造式を示す。
【図２】図２は、ニュージーランドの貝類中でのＰｂＴｘ−２の推定代謝経路を示す。
【図３】図３は、ＢＴＸ−Ｂ２の［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ１０３４）のポジティブ産物イオンマススペクトルを示す。条件：移動相；０．１％ギ酸−アセトニトリル（１：１）；キャピラリー電圧、５．５kV；コーン電圧、５６Ｖ；衝突エネルギー、１１０eV。
【図４】図４は、ポジティブＥＳＩで得られた標準ＢＴＸ−Ｂ２（５０ng/ml）のＳＲＭ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラム。ＳＲＭ検出において使用された前駆体−産物イオンの組み合わせが示されている。
【図５】図５は、ＬＣ分離後のＳＲＭにより得られたＢＴＸ−Ｂ２のピーク面積に関する検量線。各々のポイントは３回の分析の平均である。重み係数、１／ｘ。
【図６】図６は、標準ＢＴＸ−Ｂ２（５０ng/ml）（Ａ）及び毒化トリガイ（Ｂ）、イガイ（Ｃ）及び（Ｄ）カキの８０％メタノール抽出物からの８０％メタノール画分（ｇ／mL）の、それぞれ、ポジティブＥＳＩでの高速液体クロマトグラフィー ＳＲＭ−タンデムマススペクトメトリークロマトグラム。ＳＲＭ検出で使用された前駆体−産物イオンの組み合わせ及び極性（ｍ／ｚ１０３４「Ｍ＋Ｈ」＋＞８８）を示す。ＨＰＬＣ条件：カラム、Cadenza CD-C18（３mm×１５０mm、３μm）；移動相、１６分間の０．１％ギ酸−アセトニトリル（２０〜７０％アセトニトリル）の勾配、２１分において１００％まで上げ、１０分間その状態を維持；流速、０．２mL／分；１０μL注入。コーン電圧は、５６Ｖで設定され、衝突誘起解離は、ＢＴＸ−Ｂ２に対して、それぞれ１１０eVの衝突エネルギーで実施された。窒素が、衝突ガスとして使用された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有毒プランクトンに由来する神経性貝毒であるブレベトキシンＢＴＸ−Ｂ２等の新規定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
貝中毒はその原因毒によってその特徴的症状が異なる。世界的に、麻痺性貝中毒（ＰＳＰ）、下痢性貝中毒（ＤＳＰ）、記憶喪失性貝中毒（ＡＳＰ）と神経性貝中毒（ＮＳＰ）の４種がよく知られている。これらの貝中毒についての研究の過程でＰＳＰに関わる有毒プランクトンが貝中腸腺内で確認されたのを機に、各貝中毒の原因毒、原因毒産生プランクトン、貝の毒化機構、原因毒の分析法等に関する研究が精力的に行われてきた。その結果、ＰＳＰ原因毒の一つはサキシトキシン（Saxitoxin）、ネオ−サキシトキシン（Neo-saxitoxin）とゴニオトキシン（Gonyautoxin）の、及びＤＳＰではオカダ酸（Okadaic Acid）、ジノフィシストキシン（Dinophysis Toxin）、ペクテノトキシン（Pectenotoxin）とエソトキシン（Yessotoxin）であることが突止められ、これらを産生する各々のプランクトンが特定された。また、取り込まれたプランクトン中の毒が貝に直接蓄積されることも見いだされた。ＡＳＰの場合、ドウモイ酸（Domoic acid）が蓄積毒の一つで、その産生プランクトンの一種が明らかにされた。
【０００３】
一方、Walkerはフロリダ西海岸で１８８０年に初めてＮＳＰを記録した。その後、アメリカ合衆国のフロリダから北はノースカロライナ、西はテキサスに至るメキシコ湾沿岸において、渦鞭毛藻類Ｋ．brebisの赤潮が発生し、多くの海洋生物の瀕死が起こる現象は、現在まで続いている。１９６５年には、この赤潮に曝された二枚貝をヒトが摂取することで頭痛、知覚異常、四肢の麻痺、呼吸困難、嘔吐、下痢、胃痛等の症状をともなう食中毒が起きることが明らかとなった。この中毒症状が、それまでに知られていた他の貝中毒とは異なり、神経系及び消化器系障害が主な兆候であることから、ＮＳＰと称されてきた（非特許文献１）。渦鞭毛藻の一つ、K. brebisはブレベトキシン（brevetoxin）である、ＰｂＴｘ−１、ＰｂＴｘ−２及びＰｂＴｘ−３を、１．４：９．８：３．０の比で産生すると報告されている（非特許文献２）。これらのことから、ＮＳＰはK. brebisが作りだすブレベトキシンが貝に蓄積され、それにより貝中毒が引き起こされると推定されているが、これまで実証されてこなかった。
【０００４】
現在、世界の多くの国では、貝の毒化（貝が毒産生プランクトンに汚染されて毒性を有するようになること）を監視するために、漁場海水中のプランクトンモニタリングを行っている。特定の有毒プランクトンが検出され、その密度が規制値を超えた場合は、漁獲対象の貝の毒力測定を実施している。毒力測定は、米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）記載のＰＳＰ、ＤＳＰ、ＡＳＰ、及びＮＳＰのいずれかの原因毒の毒力を測るマウスを用いた試験法（マウスアッセイ）に従って成され、その結果より、陸揚げ、出荷の可否が決められている。しかし、これらの方法は、貝がどの毒によって、どの程度毒化したかを正確に測定するという観点からは、感度、正確さ、定量性に乏しいことから、汎用性が高く、迅速で、かつ精度の高い貝毒の分析定量法の開発が強く求められている。これらの要件を満たす方法として機器分析学的方法がある。しかし、機器分析学的方法においては、測定すべき対象がすべて特定され機器分析学的に同定できることが必要である。
【０００５】
これまでブレベトキシンで汚染された貝類より単離された神経性貝毒として明らかとなったブレベトキシン（またはブレベトキシン誘導体）には、図１に示すような、ＰｂＴｘ−２、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ１、ＢＴＸ−Ｂ２（請求項１に示す式（Ｉ）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ４（請求項１に示す式（II）および（III）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ５等がある（特許文献１、非特許文献３および図１）。しかし、これら一連のブレベトキシンは、プランクトン中で生合成されたＰｂＴｘ−２が、貝類中で解毒作用を受けることによって生成された代謝物（ブレベトキシン誘導体）と推測されている（貝類にとっては、毒性が低下しているが魚類や人間にとっては未だ毒性は高い）。そして、図２に示すような代謝経路が提案されている（非特許文献３および４）が、その全容は不明のままである。従って、未だ同定されていないブレベトキシン誘導体（代謝中間体）も存在していると推測されている。例えば、図２に示す、ＰｂＴｘ−２からＢＴＸ−Ｂ２およびＢＴＸ−Ｂ４に至る過程に示されている化学構造（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のようなブレベトキシン誘導体が未だ同定されていないがその存在が推測されている。そのため、機器分析学的手法による貝類中に存在するブレベトキシンの測定では、すべてのブレベトキシン誘導体の量を測定できているとはいえず正確とはいえなかった。すなわち、未だ同定されていない毒性を有するブレベトキシン誘導体（例えば図２の化学構造（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のブレベトキシン誘導体）があってもそれらを測定できていなかった。
【０００６】
これに対し、本発明人は、これら存在しながら隠れているブレベトキシン誘導体の測定を可能とし、貝類中に存在するブレベトキシン量をより正確に機器分析学的手法による定量に反映させる方法を見出した。これは、ブレベトキシン誘導体を含む試料を酸化することによってＢＴＸ−Ｂ２の量が顕著に増加することを見出したことによる。この増加は、おそらく未同定のＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体（図２の化学構造（Ｂ）のブレベトキシン誘導体）が酸化反応によりＢＴＸ−Ｂ２に変換したことによるものと推測される。
【０００７】
これまで、ブレベトキシン誘導体の酸化については、特許文献１において触媒ＳｅＯ2の存在下で過酸化水素によりＰｂＴｘ−２のアルデヒドがカルボン酸に変換されＢＴＸ−Ｂ５が生成することが開示されているだけである。また図２に示すようなブレベトキシンの酸化反応（おそらく酵素反応による選択的酸化反応）は推測に過ぎず、このような推測の酸化反応をブレベトキシンに生じさせる方法は知られていなかった。従って、本発明に見られる簡単な酸化反応処理を施すだけで、隠れていたＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体がＢＴＸ−Ｂ２となり、ＢＴＸ−Ｂ２の測定量が顕著に増加することはまったく予想されていなかった。
【特許文献１】特願２００３−３９９６８３
【非特許文献１】E F MaFarren, et.al., Toxicon, 3, 5521-5524(1982)
【非特許文献２】H-N Chou, Y Shimizu, TetrahedronLetters, 23, 5521-5524(1982)
【非特許文献３】A Nozawa, et.al., Toxicon, (2003)Jul; 42(1): 91-103.
【非特許文献４】K Murata, et.al., Tetrahedron, Vol.54(1998) pp.735-742
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、神経性貝毒であるブレベトキシン誘導体のひとつであるＢＴＸ−Ｂ２等の新規定量法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、神経性貝毒の検査を必要とする生体試料中の神経性貝毒の機器分析学的定量分析において、当該生体試料に直接または当該生体試料由来の調製物に酸化反応処理を施し、当該酸化反応処理により式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物へと変換された式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物の酸化前前駆体を、当該酸化反応処理前から当該生体試料中または当該生体試料由来の調製物中に存在する式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物とそれぞれあわせて、式（Ｉ）、（II）、（III）の化合物とし、それらの少なくとも一つを定量する方法に関する。
【００１０】
（１）本発明は、
下記工程：
試料を酸化反応処理すること、及び、
該試料中の式（Ｉ）：
【化４】
式（II）：
【化５】
または
式（III）：
【化６】
の化合物の少なくとも一つを定量することを含む、上記化合物の定量方法に関する。
【００１１】
（２）本発明は、酸化剤を含む、（１）に記載の化合物の検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、試料中に存在しながら隠れていたＢＴＸ−Ｂ２の酸化前前駆体をＢＴＸ−Ｂ２として定量できるようになった。これにより、分析機器の検出感度を上げることなく、ＢＴＸ−Ｂ２の検出感度を上げることが可能となった。また、ＢＴＸ−Ｂ２の検出感度が上がったことによりＢＴＸ−Ｂ２と神経性毒性との関連性をより正確に評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に用いる試料は、生体由来の試料であり、好ましくは、トリガイ、イガイ、カキ、アサリ、ハマグリ、カラス貝、ホタテ貝、アカ貝、ムール貝などの貝類、渦鞭毛藻Ｋ．brebis、K. mikimotoiなどの海洋性プランクトン類、ハマチ、ブリ、タイ、ヒラメ、アジ、サバ、イサキ、ハゼ、メジナ、マグロなどの魚類、ジュゴン、ラッコ、イルカ、クジラなどの海洋動物、ヒト、ネコ、イヌ、カモメ、カメ、スッポン、ハト、ニワトリなどが挙げられるが、神経性貝毒の検査を必要とする生物であればこれらに限定されない。
【００１４】
神経性貝毒とは、人が摂取することで頭痛、知覚異常、四肢の麻痺、呼吸困難、嘔吐、下痢、胃痛などの神経系及び消化器系障害の兆候を示す食中毒を引き起こす毒化合物を指し、特にブレベトキシンを指す。
【００１５】
試料として用いる時は、肉、内臓、体液（血液を含む）など生体のいずれの部分でも構わない。試料が肉、内臓などの固形体の場合には、試料は予めホモジナイザーなどを用いてすり潰されたホモジネート状態であることが好ましい。
【００１６】
本発明に用いる試料は、例えば以下のような方法でさらに調製されることが好ましい。
試料の調製方法は、０．０５〜１０ｇ、好ましくは０．５ｇの剥き身の貝類などのホモジネートに対して、重量で２〜２０倍量、好ましくは５倍量の１０〜１００％メタノール、１０〜１００％のエタノール、１００％アセトン、１００％アセトニトリルのいずれか１つ、好ましくは８０％メタノールで、２５〜９０℃、好ましくは６０℃の還流下、３〜６０分間、好ましくは２０分間の攪拌抽出を、１〜４回、好ましくは２回行い、得られた抽出液を合わせた後、真空エバポレーターなどを用いて濃縮乾固する。濃縮乾固後の残渣は、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの２０〜１００％メタノール、好ましくは８０％メタノールに溶解後、残渣の溶解に用いた溶媒と当量の１００％ｎ−ヘキサンで分配し、メタノール層部（好ましくは８０％メタノール層部）を分析試料溶液として用いる。場合により、濃縮乾固後の残渣は、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの水に溶解又は懸濁後、０．５〜１０．０ml、好ましくは０．５mlの１００％メチレンクロライド、１００％エチルエーテル、１００％酢酸エチルのいずれか１つ、好ましくは１００％メチレンクロライドで１〜３回、好ましくは２回の抽出を行い、続いて、合わせた有機溶媒層部（好ましくは１００％メチレンクロライド層部）を０．５〜５．０ml、好ましくは０．５mlの２０〜１００％メタノール、好ましくは８０％メタノールと０．５〜５．０ml、好ましくは０．５mlのｎ−ヘキサンで分配し、メタノール層部（好ましくは８０％メタノール層部）を分析試料溶液として用いる。本試料の調製は特に指定しない限り、２３℃程度の室温、１気圧の大気圧下で実施される。ただし、上記試料調製の条件は、機器分析用にブレベトキシンを試料より調製できれば、上記条件に限定されることはない。
【００１７】
本発明に用いる試料を酸化反応処理するとは、好ましくは上記の試料の調製方法によって調製された分析試料溶液に酸化剤を添加すること、または分析試料溶液を酸素に曝すことによって実施される分析試料溶液の酸化反応処理を意味するが、場合によっては上記調製前の試料に直接、酸化剤を添加したり、または試料を酸素に曝して酸化反応処理を実施しても構わない。
本発明に用いる酸化剤には、例えば、過酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＯＨ）、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ2）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、二酸化マンガン（ＭｎＯ2）、クロム酸（Ｈ2ＣｒＯ4），過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）などが挙げられるが、好ましくは、二酸化マンガン、過酸化水素、過酢酸、より好ましくは過酸化水素である。過酸化水素は、市販の３０％過酸化水素水でも構わない。
【００１８】
添加する酸化剤の量は、例えば市販の３０％過酸化水素水を用いた場合、例えば０．５ｇ／０．５mlの分析試料溶液（０．５ｇの試料のホモジネートを上記試料の調製方法により最終的に０．５mlの８０％メタノールに調製したものであることを意味する）０．５mlに対して、５〜１００μl、好ましく２０〜５０μl、より好ましくは４０μlである。当然、上記分析試料溶液の濃度、量または添加する過酸化水素水の濃度が変われば、それに合わせて添加する過酸化水素水の量も変化し得る。
酸化反応処理時間は、例えば市販の３０％過酸化水素水を用いた場合、０．１〜５時間、好ましくは０．５〜２時間、より好ましくは１時間である。当然、上記分析試料溶液の濃度、量または添加する過酸化水素水の濃度が変われば、それに合わせて酸化反応処理時間も変化し得る。
酸化反応処理温度は、０〜３０℃、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは１０℃付近の温度である。酸化反応処理時の圧力は、１気圧の大気圧である。
さらに、酸化剤の種類が変われば、上記酸化反応処理の条件（酸化剤の濃度、添加量、反応時間、反応温度、反応圧力）が変化し得ることは当業者においては周知のことであり、上記３０％過酸化水素水による酸化反応処理と同じ酸化効力を示す酸化剤または酸化反応処理条件であれば酸化剤の種類または酸化反応処理の条件が変化しても構わない。
【００１９】
また、試料を酸素に曝す場合には、空気中に分析試料溶液を置いて酸化させるが、この時の温度は、０〜３０℃、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは２０℃付近の室温である。期間は、１〜１２ヶ月、好ましくは３〜６ヶ月、より好ましくは３ヶ月である。さらに、バブリング等を用いて強制的に酸素を添加しても構わないが、この場合の条件は、上記酸化剤による酸化反応処理の場合と同様な酸化効力を発揮する酸化反応処理条件（酸素の濃度、添加量、反応時間、反応温度、反応圧力）であればよい。
【００２０】
本発明に用いる化合物の分析および定量には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＵＶ検出器、ＨＰＬＣ−蛍光検出器、キャピラリー−ＭＳ／ＭＳなどの機器分析学的方法が挙げられるが、特にＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析および定量が好ましい。
ＥＳＩを備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳとは、静電噴霧イオン化が可能な液体クロマトグラフィー質量分析装置をさす。すなわち、ＬＣ−ＭＳとは四重極の質量分析装置を検出器に用いた高速液体クロマトグラフィー分析装置であり、ＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる化合物の分析および定量法は、当業者には周知である。
【００２１】
ブレベトキシンのＥＳＩ法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定条件等は非特許文献３、非特許文献４、H Ishida, et. al., Toxicon, 701-712(2004)およびH Ishida, et. al., Tetrahedron Letters, 29-33(2004)に記載があり、測定に用いる装置、試薬、条件等は以下に限定されないが、例えば、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置は、Alliance system(Waters Corp., Milford, MA, USA)、液体クロマトグラフィー用分離カラムは、Cadenza CD-C18（３×１５０mm、３μm、Intact）カラムを用いることができ、ＨＰＬＣ条件は、例えば、移動相；２０分間の０．１％ギ酸−アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）（２０〜８０％ＣＨ3ＣＮ）の勾配、流速；０．２mL/min、カラム温度；４５℃、２０μL試料溶液の注入で実施できる。
【００２２】
ＥＳＩを備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置は、例えば、ＥＳＩインターフェースを備えたQuattro Ultima triple-stage quadrupole MS system (Micromass、Cheshire、UK)、データ補足解析等はMasslynx NT software (version 3.5)などが使用できる。測定条件は、コリジョン（衝突）エネルギー、５０〜１５０eV，好ましくは１００eV、コーン電圧、４０〜８０Ｖ，好ましくは６０Ｖ、キャピラリー電圧、３．５〜５．５Ｖ，好ましくは５．５Ｖである。衝突ガスとしてはアルゴンまたは窒素ガスを用いることができる。
【００２３】
本発明のＢＴＸ−Ｂ２（式（Ｉ）の化合物）の定量は、予め既知量のＢＴＸ−Ｂ２をＥＳＩ法によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、検量線を作製することで、試料中で測定されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラム上のＢＴＸ−Ｂ２のピーク面積を比較することで定量できる。
【００２４】
ＢＴＸ−Ｂ２以外のＰｂＴｘ−２、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ１、ＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ４（式（II）および（III）の化合物）、ＢＴＸ−Ｂ５の定量も、ＢＴＸ−Ｂ２の定量と同様に、予め既知量の各ブレベトキシン誘導体の検量線を作製しておき、試料中で測定されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳのクロマトグラム上のそれぞれの対応するブレベトキシン誘導体のピーク面積を比較することで定量できる。
【００２５】
本発明で用いる検出キットには、先に記載の試料の調製に必要な溶媒、用具、先に記載した少なくとも一つの酸化剤から構成されており、必要に応じて、標準マーカーとして、式（Ｉ）に示すＢＴＸ−Ｂ２または式（II）もしくは（III）に示すＢＴＸ−Ｂ４の少なくとも一つを含んでもよい。
【実施例１】
【００２６】
貝試料
１９９３年１月に、ニュージーランドで採られたWhangarei産の毒化トリガイ（cockle(Austrovenus stutchburyi)）とTiki Road及びMcGregor Bay産の毒化カキ（Pacific oyster (Crassostrea gigas)）、及び２月にBay of PlentyとCanon Hillでそれぞれ採取された毒化イガイ（Pipi (Paphles austrailis)とgreenshell mussel (Perna canaliculus)）を用いた。尚、全ての貝は、使用時までは−３０℃で保存した。
【００２７】
標品
ＢＴＸ−Ｂ２は、１９９３年２月に、ニュージーランド（ＮＺ）のCoromandelで採取された毒化イガイより安元らの報告（非特許文献４）に従って調製した。すなわち、この毒化イガイの虫腸腺部（３０Ｋｇ）をホモジネート後、アセトンで抽出した。抽出物を水と酢酸エチルで分配した。水層部をｎ−ブタノールで抽出し、得た抽出部を濃縮後、高速液体クロマトグラフィーを用いて、Develosil Lop C8カラム，ToyopearlHW-40カラム，Develosil TMS-5カラムで順次精製し、約３０mgのＢＴＸ−Ｂ２を得た。
【００２８】
分析試料調製
貝の剥き身の一定量を小ビーカーに入れ、氷冷下PHYSCOTRONホモジナイザー（ニチオン製（東京））でホモジナイズした。次いで、この貝ホモジネート（０．５ｇ）に８０％メタノール（２．５ml）を加え、６０℃、２０分間の攪拌抽出を２回行った。得た抽出液を濃縮乾固し、抽出物を得た。これを８０％メタノール（０．５ml）に溶解した後、ｎ−ヘキサン（０．５ml）で分配した。８０％メタノール分画を分析試料溶液とした。または、場合により、濃縮乾固後の残渣を、０．５mlの水に溶解又は懸濁後、１００％メチレンクロライドで２回の抽出を行い、続いて、合わせたメチレンクロライド層部を０．５mlの８０％メタノールと０．５mlのｎ−ヘキサンで分配し、８０％メタノール層部を分析試料溶液とした。
【００２９】
酸化剤
３０％Ｈ2Ｏ2（過酸化水素水、和光純薬製特級）を用いた。
【００３０】
機器
ＥＳＩ法によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、液体クロマトグラフィー装置にAlliance system 2795(Waters製）またはAgillent 1100 LC system(Agillent製）を、ＭＳ／ＭＳにはQuattro Ultima triple-stage quadrupole MS system(Micromass製）とAPI3000 LC-MS/MS System (AB Bio製）を、そして、データ取り込みと解析にMasslynx NT（Micromass製）とAnalyst（アプライドバイオ社（AB Bio）製）を適宜組み合わせて行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のＨＰＬＣカラムとして、Cadenza CD-C18 (ψ３×１５０mm, ３μm, Intact製）を用いた。
【００３１】
分析および定量方法
全スキャンマス（Full-scan mass）スペクトルは各貝から調製した分析試料溶液２０μlを ＭＳ／ＭＳ装置に流速０．２ml／分で直接導入（direct infusion法）し、ＭＳ１にてｍ／ｚ３００〜１２００をスキャンすることで測定した。移動相は、０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１：１）を、ネガティブモードで用いた。
Quattro Ultima triple-stage quadrupole MS systemにおいては全スキャン衝突誘起解離（Full-scan collision-induced dissociation (CID)）スペクトル測定は、アルゴンガスにて約１．３×１０-4mbarに調整した衝突セル（Ｑ２）内でquadrupole 1（Ｑ１）において選択した前駆体イオン（precursor ion）を衝突させ、ｍ／ｚ５０〜９００の範囲をquadrupole ＭＳ（Ｑ３）でスキャンすることで行った。
定量は、まず標品ＢＴＸ−Ｂ２のＣＩＤスペクトル測定のための前駆体イオンと産物イオン（product ion）を選択し、選択反応モニタリング液体クロマトグラフィータンデムマススペクトラム（selective reacted monitoring liquid chromatography-tandem mass spectrometry （ＳＲＭ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ））を実施した。イオン源のソース温度とデソルベーション温度はそれぞれ１００℃と３００℃に、デソルベーションガスとコーンガスの流速はそれぞれ６８０と０ｌ／時間にそれぞれ設定した。エレクトロスプレーキャピラリー電圧とコーン電圧は展開溶媒毎に最適化した。
【００３２】
定量は、分析試料溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入し、得られたピーク面積値を用いて行った。尚、試料によっては、一定時間毎に標品試料の分析を実施した。カラム温度は４５℃、注入量は２０μlとした。
【００３３】
展開相に０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１６分かけてＣＨ3ＣＮを２０から７０％へ）を用いて、ポジティブモードにて１０μg/ml濃度のＢＴＸ−Ｂ２のマススペクトルを測定した。その結果、両ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置において分子関連イオンｍ／ｚ１０３４（［Ｍ＋Ｈ］＋）を検出した。このイオン強度は、Quattro Ultimaで、コーンエネルギー５６Ｖの時に最高となった。イオン強度が最高となるコーンエネルギーは１１０Ｖであった（図３）。
【００３４】
ポジティブモードでＢＴＸ−Ｂ２の［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ１０３４をプリカーサー（前駆体）イオンとしてＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ実験を行った。その結果、プロダクト（産物）イオン（ｍ／ｚ８８）を高感度で検出できた（図３）。
以上のことから、ＢＴＸ−Ｂ２のＳＲＭ分析に使用する前駆体イオン及び産物イオンの組み合わせを、ｍ／ｚ１０３４→８８とした。
移動相に０．１％ＨＣＯ2Ｈ−ＣＨ3ＣＮ（１６分かけてＣＨ3ＣＮを２０から７０％にするグラジュエントで）を用いたＢＴＸ−Ｂ２の保持時間は１４．０分で、クロマトグラムのピーク形状は良好であった（図４）。
【００３５】
検討した濃度範囲、約０．５〜５００ng/mlにおいてＢＴＸ−Ｂ２の直線性は良好（ｒ2≧１．００）であった（図５）。
また、シグナル−ノイズ比が５を確保できる濃度を計算で求めた結果、ＢＴＸ−Ｂ２の検出下限は、注入量として０．０２ngであった。
ＢＴＸ−Ｂ２を、それぞれ市販の無毒のトリガイに２〜８００ng/gの濃度範囲で添加後の８０％メタノールによる回収率は９０〜９５％、イガイでは、８１〜８７％、カキにおいては、８０〜８１％の範囲の値となった。このように、いずれの貝に於いても、検討した抽出溶媒では、添加回収率は、添加濃度に依らずほぼ一定であった。
【実施例２】
【００３６】
酸化条件
上述した毒化トリガイ（１９９３年１月）を用いて、分析試料溶液（０．５ｇ／０．５ml、トリガイの剥き身のホモジネート０．５ｇからの８０％メタノール分画を８０％メタノール０．５mlに溶解した試料であることを意味する）に温度１０℃で過酸化水素を添加した後のＢＴＸ−Ｂ２の分析値を表２に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
過酸化水素による酸化反応処理で分析試料溶液中のＢＴＸ−Ｂ２の測定量が顕著に増加（過酸化水素水４０μlの添加時には約１０倍の増加）することが観察された。４０μlの過酸化水素水の添加後では、１時間後から８時間後までの定量値はほぼ一定となった。
以上のように、ＢＴＸ−Ｂ２分析用の貝からの分析試料溶液（０．５ｇ／０．５ml）０．５mlに温度１０℃で３０％過酸化水素水４０μl添加した場合には１時間の反応で十分なことがわかった。
【００３９】
今回の試料の酸化反応処理によるＢＴＸ−Ｂ２の増加は、貝中には酸化前の前駆体化合物（図２（Ｂ））がＰｂＴｘの代謝物として大量に存在し、それが、過酸化水素によっておそらく定量的にＢＴＸ−Ｂ２に変換されたことによるものと考えられる。
また、この分析試料溶液を約３ヶ月間冷蔵庫（約３度）保存した場合にも同様なＢＴＸ−Ｂ２の顕著な増加が観察された（データは示していない）。
【実施例３】
【００４０】
毒化したトリガイ，イガイ及びカキ中のＢＴＸ−Ｂ２の濃度の測定
上述の方法を用いて、顕著なマウス毒性を示した１９９３年ニュージーランド産毒化トリガイ，イガイ及びカキ中のＢＴＸ−Ｂ２の分析を行った。そのＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＳＲＭクロマトグラムを図６に示した。その分析結果をマウス毒性試験の結果と供に表３に示した。
【００４１】
マウスアッセイ
厚生省（現在は厚生労働省）により定められている貝毒試験法に準じて行った。
具体的には、昭和５５年７月１日付け環乳第３０号「貝毒の検査方法等について」、及び昭和５６年５月１９日付け環乳第３７号「下痢性貝毒の検査について」に従った。
３〜４週令（体重１０ｇ前後）のｄｄＹ系雄性マウスを日本ＳＬＣより購入して用いた。
貝をむき身し、その一定量を５倍量の８０％メタノールで、還流下１５分間抽出した。可溶部を濾取したのち、残差を再度同様の方法で抽出した。このようにして得た濾液を合わせ、濃縮乾固し、８０％メタノール抽出物を得た。これをＨ2Ｏに溶解または懸濁した後、ＣＨ2Ｃｌ2で２回の抽出を行った。続いて、ＣＨ2Ｃｌ2層部を８０％メタノールとｎ−ヘキサンで分配した。その８０％メタノール分画を濃縮乾固後、１％Tween60生理食塩水に溶解または懸濁し、検体とした。
以上の様に調製した各検体の０．５mLを腹腔内投与した。
投与後の致死時間を測定し、その時間より、米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）により定められたＮＳＰの毒力換算表を用いて、投与後の致死時間から、検体の毒力（マウスユニット，ＭＵ）を求めた。尚、１匹のマウスを致死せしめる量が１ＭＵと定義されている。
【００４２】
【表２】
【００４３】
食中毒発生時に採られた毒化トリガイ、毒化イガイ及び毒化カキに高濃度のＢＴＸ−Ｂ２が検出された。このうち、これまで毒化イガイでは、ＢＴＸ−Ｂ２の検出は報告されていたが、毒化トリガイにおいては、ＢＴＸ−Ｂ２の検出は報告されていなかった。そのため、ブレベトキシンの代謝系はイガイとトリガイ間では異なり、トリガイ中ではＢＴＸ−Ｂ２が生成されにくいと考えられていた（H Ishida, et.al., Tetrahedron Letters, 29-33(2004)）。
しかし、今回の実験から、マウス毒性試験（マウスアッセイ）によりブレベトキシンで汚染されていることの確認された三種類の貝すべてにＢＴＸ−Ｂ２が高濃度で含まれていることが明らかとなった。これは、本発明のような酸化反応処理により、トリガイのようなＢＴＸ−Ｂ２を生成（検出）しにくい貝類においても、有為な量のＢＴＸ−Ｂ２を生じさせることができ、本発明の方法を用いればＢＴＸ−Ｂ２を貝類のブレベトキシンによる毒化の共通マーカーにすることができることを意味している。すなわち、本発明の方法よりＢＴＸ−Ｂ２の量を測定することで、貝類のブレベトキシン汚染（毒化）の状況を把握できることがあきらかとなった。なお、市販の無毒の両二枚貝にはそれらを検出できなかった。
【００４４】
また、ＢＴＸ−Ｂ４も、図２に示すようにＢＴＸ−Ｂ２と同様のＳ−酸化過程を有していると推測されるので、ＢＴＸ−Ｂ４も本方法により酸化前前駆体として隠れている化合物（（図２（Ｃ）であって、ｎ＝１２の化合物およびｎ＝１４の化合物）をＢＴＸ−Ｂ４として測定が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の方法から、マウス毒性試験（マウスアッセイ）によりブレベトキシンで汚染された貝には、共通してＢＴＸ−Ｂ２と酸化によりＢＴＸ−Ｂ２に変換されるその前駆体が高濃度で含まれていることが明らかとなった。従って、ＢＴＸ−Ｂ２を、神経性貝毒の定量におけるマーカーとして、ブレベトキシンで汚染された貝類などに含まれている神経性貝毒のモニタリングに使用できる。そして、貝類、海洋プランクトン類、魚類などのブレベトキシンによる汚染の程度をＢＴＸ−Ｂ２として測定し、魚介類の陸揚げ、出荷における食品としての安全性の評価および検定に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はブレベトキシン誘導体の化学構造式を示す。
【図２】図２は、ニュージーランドの貝類中でのＰｂＴｘ−２の推定代謝経路を示す。
【図３】図３は、ＢＴＸ−Ｂ２の［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ１０３４）のポジティブ産物イオンマススペクトルを示す。条件：移動相；０．１％ギ酸−アセトニトリル（１：１）；キャピラリー電圧、５．５kV；コーン電圧、５６Ｖ；衝突エネルギー、１１０eV。
【図４】図４は、ポジティブＥＳＩで得られた標準ＢＴＸ−Ｂ２（５０ng/ml）のＳＲＭ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラム。ＳＲＭ検出において使用された前駆体−産物イオンの組み合わせが示されている。
【図５】図５は、ＬＣ分離後のＳＲＭにより得られたＢＴＸ−Ｂ２のピーク面積に関する検量線。各々のポイントは３回の分析の平均である。重み係数、１／ｘ。
【図６】図６は、標準ＢＴＸ−Ｂ２（５０ng/ml）（Ａ）及び毒化トリガイ（Ｂ）、イガイ（Ｃ）及び（Ｄ）カキの８０％メタノール抽出物からの８０％メタノール画分（ｇ／mL）の、それぞれ、ポジティブＥＳＩでの高速液体クロマトグラフィー ＳＲＭ−タンデムマススペクトメトリークロマトグラム。ＳＲＭ検出で使用された前駆体−産物イオンの組み合わせ及び極性（ｍ／ｚ１０３４「Ｍ＋Ｈ」＋＞８８）を示す。ＨＰＬＣ条件：カラム、Cadenza CD-C18（３mm×１５０mm、３μm）；移動相、１６分間の０．１％ギ酸−アセトニトリル（２０〜７０％アセトニトリル）の勾配、２１分において１００％まで上げ、１０分間その状態を維持；流速、０．２mL／分；１０μL注入。コーン電圧は、５６Ｖで設定され、衝突誘起解離は、ＢＴＸ−Ｂ２に対して、それぞれ１１０eVの衝突エネルギーで実施された。窒素が、衝突ガスとして使用された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
試料を酸化反応処理すること、及び、該試料中の
式（Ｉ）：
【化１】
式（II）：
【化２】
または
式（III）：
【化３】
の化合物の少なくとも一つを定量することを含む、上記化合物の定量方法。
【請求項２】
酸化剤を含む、請求項１に記載の化合物の検出キット。
【請求項１】
下記工程：
試料を酸化反応処理すること、及び、該試料中の
式（Ｉ）：
【化１】
式（II）：
【化２】
または
式（III）：
【化３】
の化合物の少なくとも一つを定量することを含む、上記化合物の定量方法。
【請求項２】
酸化剤を含む、請求項１に記載の化合物の検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１６２２６３（Ｐ２００６−１６２２６３Ａ）
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３４９５６２（Ｐ２００４−３４９５６２）
【出願日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
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