プトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを用いたプトレッシンの製造方法
本発明は、プトレッシン生成代謝経路を有する微生物において、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が不活化または欠失されているプトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを嫌気条件下で培養してプトレッシンを高収率にて製造する方法に関する。本発明に係るプトレッシン高生成能を有する変異微生物は、産業的に汎用されるプトレッシンを高収率にて製造する上で有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを用いたプトレッシンの製造方法に係り、さらに詳しくは、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が不活化または欠失されているプトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを嫌気条件下で培養してプトレッシンを高収率にて製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレッシン（または、１,４ブタンジアミン）は、ナイロン４,６を含むポリアミド４,６の産生のための重要な原料物質であり、アクリロニトリルに水素シアン化物を添加することにより産生されるサクシノニトニルの水素化による産業的規模において主として産生された。これらの化学物質の合成経路においては、非再生的な石油化学的産物を原料物質として必要とし、相対的に多重段階、多重反応器設計だけではなく、高価な触媒システムと関連する高い温度と圧力が必要である。しかも、極めて強い毒性と可燃性がある反応物であるため、既存の化学合成経路は環境的な側面から良くない。この理由から、前記化学生産工程の代案として、再生可能なバイオマス由来炭素源からプトレッシンを産生することが望まれるのが現状である。
【０００３】
プトレッシンは、バクテリアから動植物などに至る全範囲の有機体において発見されるポリアミンの一種である。例えば、プトレッシンは細胞増殖と正常細胞成長において重要な役割を演じており、酸化的ストレスへの防御機作にも重要な物質であることが知られている（Tkachenko et al., Arch. Microbiol., 176:155-157, 2001）。一方、細胞内ポリアミンの含量は、生合成、分解、吸収、及び分泌によってきめ細かく調節される（Igarashi and Kashiwagi et al., J. Bacteriol., 170(7):3131-3135, 1988）。大腸菌におけるプトレッシン濃度は約２.８ｇ／Ｌであって、極めて高いことが知られている。また、微生物は高濃度のポリアミンに潜在的に良好な耐性を有している。例えば、Mimitsukaらは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、３０ｇ／Ｌ以上のカダベリンの存在下でも成長することができることを報告した。このため、産業的に利用可能な高濃度のポリアミン（プトレッシン）を産生するために微生物を利用しようとする研究が持続的になされている。
【０００４】
ヨーロッパ公開特許（ＥＰ０７２６２４０Ａ１）は、安価な産業廃棄物もしくは主な成分としてタンパク質をもつ物質を用いて発酵によりプトレッシンを産生する方法を開示しているが、開示物質が極めて複雑であるため、プトレッシンとカダベリンを産生するためには多くの精製段階を経なければならないという不都合があった。また、ヨーロッパ公開特許（ＥＰ１７８４４９６Ａ１）は、炭素源としてグルコースが追加された最小塩培地における微生物成長によるプトレッシン生化学的合成を開示している。これは、オルニチンのプトレッシンへの変形を向上させるために、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるｓｐｅＣまたはｓｐｅＦを過剰に発現させて、オルニチン・デカルボキシラーゼの活性を増加させた。しかしながら、オルニチン・デカルボキシラーゼ活性が増加するに伴ってプトレッシンの含有量が増大されたとき、プトレッシン生合成の阻害があり、プトレッシンの分解誘導作用が進んでしまうという不都合があった（Igarashi and Kashiwagi et al., Biochem. J., 347:297-303, 2000）。
【０００５】
微生物内におけるプトレッシン分解及び利用活性度についての研究は、下記の通りである。Bowmanらは、ｓｐｅＥ遺伝子産物であるスペルミジン合成酵素が大腸菌内においてプトレッシンからスペルミジンの生合成を促進することを報告した（Bowman et al., J. Biol. Chem., 248:2480-2486, 1973）。スペルミジン合成酵素（ＥＣ：２．５．１．１６）はほとんど全ての細胞システムにおいてスペルミジンの合成のために存在する。
【０００６】
Haywoodらは、キャンディダ・ボイディニ酵母がＮ−アセチルトランスフェラーゼによりプトレッシンをＮ−アセチルプトレッシンにアセチル化させることを報告した。大腸菌において、ｓｐｅＧ遺伝子産物であるスペルミジン・アセチルトランスフェラーゼは酵母のＮ−アセチルトランスフェラーゼとの相同性が極めて高いため、プトレッシン・アセチルトランスフェラーゼを有することが求められる（Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985）。
【０００７】
また、Samsonovaらは、大腸菌において、γ-グルタミレーションなしで、ＹｇｊＧプトレッシン・トランスアミナーゼ及びＹｄｃＷデヒドロゲナーゼ複合作用によりプトレッシンはγ−アミノ酪酸に転換されるという別のプトレッシン分解経路について説明した（Samsonova et al., BMC Microbiol., 3:2, 2003, ; Samsonova et al., FEBS Lett., 579:4107-4112, 2005）。
【０００８】
そして、Kuriharaらは、「Puu pathway」と呼ばれるプトレッシン分解経路は大腸菌内のγ−グルタミル化代謝体と深い関連性を有することを明らかに報告した。この経路のγ−グルタミレーションを通じてアルデヒド中間体であるγ−アミノブチルアルデヒドを安定化させることができる。ｐｕｕＡ遺伝子の産物であるγ−グルタミルプトレッシン合成酵素はプトレッシンをγ−グルタミル−Ｌ−プトレッシンに形質転換させながら、この経路の最初の反応を促進させる。また、Ｐｕｕ異化経路は大腸菌が唯一の窒素源であって、プトレッシンを含む培地において成長するとき、主な要素となることを判明した。また、ｐｕｕＰ遺伝子産物であるプトレッシン・インポータはＰｕｕ異化経路と主なプトレッシン・インポータに関連性があることを認めた（Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280:4602-4608, 2005）。
【０００９】
そこで、本発明者らは、プトレッシンを産生する微生物において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させた変異菌株を製造し、これを嫌気条件下で培養した結果、プトレッシンを高収率にて製造することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明の目的は、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が不活化または欠失されており、プトレッシンの高産生能を有する変異微生物及び前記変異微生物の製造方法を提供するところにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記変異微生物を嫌気条件下で培養して、プトレッシンを高収率にて製造する方法を提供するところにある。
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモータに置換されており、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入または増幅されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルコースからのプトレッシンの合成経路を示す模式図である。
【図２】ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図３】ＸＱ３９菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図４】ＸＱ４３菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図５】ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において、「不活化」とは、当該遺伝子の一部の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入して当該遺伝子により発現される酵素の活性を減少させることを包括する概念であり、当該遺伝子の酵素が関与する生合成経路の一部またはかなりの部分を遮断するあらゆることを含む。
【００１９】
本発明において、「欠失」とは、当該遺伝子の一部または全体の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入して当該遺伝子が発現することを抑制したり、あるいは、発現されるとしても酵素活性を示さないようにすることを包括する概念であり、当該遺伝子の酵素が関与する生合成経路を遮断するあらゆることを含む。
【００２０】
本発明において、「増幅」とは、当該遺伝子の一部の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入したり、または同じ酵素をコードする他の微生物由来の遺伝子を導入して、対応する酵素の活性を増加させることを包括する概念である。
【００２１】
図１は、グルコースからのプトレッシンの合成経路を示す模式図である。図１に示すように、本発明においては、プトレッシン生成能を有する微生物において、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）を不活化または欠失させると、プトレッシンを高収率にて製造することができるということを確認しようとした。前記プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）の減少した活性は、それぞれの野生型レベルと比較して減少された転写的、翻訳的効率によって確認することができた。
【００２２】
本発明の一実施例においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を欠失させた変異微生物を製造し、製造された変異微生物のプトレッシン生成能が向上されたことを確認した。
【００２３】
このため、本発明は、一観点において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法に関する。
【００２４】
本発明において、前記変異微生物は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するγ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることもできる。
【００２５】
前記オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）は、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）のアイソザイムであり、前記γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）は、前記プトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）の隣接遺伝子であり、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）は、プトレッシンの分解に関与する遺伝子である。
【００２６】
さらに、本発明において、前記変異微生物は、プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されうる。前記プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ｇｄｈＡ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥなどを例示することができる。
【００２７】
さらに、本発明において、前記変異微生物は、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とすることができる。前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とし、前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されうる。
【００２８】
本発明において、前記微生物は、グルコースからプトレッシンを生成する微生物であれば、制限なしに使用することができ、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)などを例示することができる。
【００２９】
さらに、本発明においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が欠失されている変異微生物において、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより、プトレッシンを一層高収率にて製造することができるということを確認しようとした。
【００３０】
本発明の一実施例においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）及びｌａｃオペロンリプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）が欠失された変異微生物において、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）のプロモーターを強力なプロモーターであるｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３３）、ａｒｇＥＣＢＨと誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３７）、ａｒｇＥＣＢＨ、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥとアセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３９）及びａｒｇＥＣＢＨ、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ、ａｒｇＤとオルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ４３）を製造し、これらの変異微生物のプトレッシン生成能が急激に増加することを確認した。
【００３１】
このため、本発明は、他の観点において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力なプロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法に関する。
【００３２】
本発明において、前記アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）は、共同調節オペロンであって、側面に２つのコンバージェント・プロモーターであるａｒｇＥｐ、ａｒｇＣＢＨｐと内部にオペレーターを含む。前記両プロモーターはアルギニンにより抑制される（Charlier and Glansdorff, 2004）。このため、ａｒｇＥＣＢＨオペロンの野生型プロモータを強力なプロモーターに置換させると、オルニチンに対する代謝フラックスを増加させることができる。前記ａｒｇＥはＮ−アセチルオルニチナーゼをコードする遺伝子であり、ａｒｇＣはＮ−アセチルグルタミルフォスフェイト還元酵素をコードする遺伝子であり、ａｒｇＢはＮ−アセチルグルタメート・キナーゼをコードする遺伝子であり、ａｒｇＨはアルギニノスクシナーゼをコードする遺伝子である。
【００３３】
また、低いｐＨにおいて誘導されるオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）は誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする。このため、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンの野生型プロモーターを強力なプロモーターに置換させると、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンを常時発現させることができるので、プトレッシンの生成能を向上させることができる。
【００３４】
さらに、前記アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）のプロモーターはアルギニンにより抑制される（Charlier and Glansdorff, 2004）。このため、ａｒｇＤオペロンの野生型プロモーターを強力なプロモーターに置換させると、オルニチンに対する代謝フラックスを増加させることができる。
【００３５】
前記変異微生物は、上述したように、γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されうる。
【００３６】
また、前記プトレッシン生成能を有する変異微生物はプトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とすることができる。
【００３７】
本発明において、前記オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入されたことが好ましい。
【００３８】
本発明において、前記遺伝子プロモーターの置換及びオルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）の導入と関連する強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選ばれることを特徴とすることができる。
【００３９】
このため、本発明において、最も好ましい例は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力なプロモーターに置換されており、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入または増幅されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物であることができる。
【００４０】
本発明は、さらに他の観点において、前記変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法に関する。
【００４１】
本発明において、変異微生物の培養及びプトレッシンの取得過程は、従来の発酵工程において通常的に知られている培養方法（回分式培養、流加式培養）及びプトレッシンの分離及び精製方法を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明において、プトレッシンの生物工学的生産は、細胞内（インビボ）もしくは細胞外（インビトロ）において行われうる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
特に、下記の実施例においては、本発明に係る遺伝子を除去するために、特定のベクターと宿主細胞としてプトレッシン生成微生物であるエシェリキア属微生物だけを例示したが、他の種類のベクターとプトレッシン生成微生物を使用することも当業者にとって自明な事項であると言える。
【００４５】
実施例１：プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子欠失変異微生物の製造
本発明において、染色体上の遺伝子（ｐｕｕＡ、ｐｕｕＰ、ｙｇｊＧ、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＦ、ａｒｇＩ）の欠失は二重交差相同組換えにより行われた（Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci., 97:6640-6645, 2000）。ｌｏｘ７１−クロラムフェニコール・マーカー（ＣｍＲ）−ｌｏｘ６６カセットは、ターゲット遺伝子の上流配列および下流配列と相同性を有する５０個のヌクレオチドを含むプライマーを用いてＰＣＲによって製造した。ｌｏｘ７１−ＣｍＲ−ｌｏｘ６６カセットを含むｐＥＣｍｕｌｏｘ（Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008）をＰＣＲの鋳型として使用した。前記ＰＣＲ産物を用いて、λリコンビナーゼを含む電気衝撃用大腸菌細胞をトランスフォメーションした。コロニーはクロラムフェニコール（Ｃｍ；３４μｇ／ｍＬ）を含むルリア-ベルターニ（ＬＢ）寒天(Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）プレートにおいて選択された。ＣｍＲの遺伝子置換の成功は、直接コロニーＰＣＲにより確認された。前記抗生剤マーカーは、今後、温度感受性複製起源とＩＰＴＧ誘導可能なｃｒｅリコンビナーゼ（Palmeros et al., Gene, 247(1):255-264, 2000）を含むヘルパープラスミドｐＪＷ１６８により除去された。
【００４６】
１−１：ＷＬ３１１０菌株の製造
配列番号１及び２のプライマー、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｌａｃＩ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、λリコンビナーゼを含有する電気衝撃用大腸菌（Ｗ３１１０）にエレクトロポレーションしてＷＬ３１１０（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ）を製造した。
［配列番号１］：５’−ＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＲＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＡＣＡＣＧＴＣＴＴＧ−３’
［配列番号２］：５’−ＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧ−３’
【００４７】
１−２：ＸＱ０８菌株の製造
配列番号３及び４のプライマー、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＥ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ０８菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）を製造した。
［配列番号３］：５’−ＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号４］：５’−ＡＴＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００４８】
１−３：ＸＱ１７菌株の製造
配列番号５及び６のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ１７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
［配列番号５］：５’−ＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＧＴＡＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号６］：５’−ＣＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００４９】
１−４：ＸＱ２２菌株の製造
配列番号６及び７のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−３において製造されたＸＱ１７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
［配列番号６］：５’−ＣＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
［配列番号７］：５’−ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＡＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
【００５０】
１−５：ＸＱ２３菌株の製造
配列番号８及び９のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＥ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ２３−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）を製造した。
［配列番号８］：５’−ＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号９］：５’−ＡＴＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５１】
配列番号１０及び１１のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、先に製造されたＸＱ２３−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）を製造した。
［配列番号１０］：５’−ＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１１］：５’−ＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５２】
配列番号１２及び１３のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ａｒｇＩ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。
［配列番号１２］：５’−ＴＡＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＧＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１３］：５’−ＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＴＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５３】
次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、これを鋳型とし、配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。製造されたＰＣＲ産物を精製した後、先に製造されたＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ）を製造した。
［配列番号１４］：５’−ＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＧＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴ−３’
［配列番号１５］：５’−ＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡ−３’
【００５４】
１−６：ＸＱ２６菌株の製造
前記１−３において製造されたｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物及び前記１−４において製造されたｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を順次にＸＱ２３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５５】
１−７：ＸＱ２７菌株の製造
配列番号１６及び１７のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｙｇｊＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。
［配列番号１６］：５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＣＴＴＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１７］：５’−ＣＧＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５６】
製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−５において製造されたＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２７−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ）を製造し、ここに前記１−３において製造されたｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物及び前記１−４において製造されたｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を順次にエレクトロポレーションしてＸＱ２７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５７】
１−８：ＸＱ２９菌株の製造
前記１−７において製造されたｙｇｊＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を前記１−６において製造されたＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５８】
実施例２：プロモーターの置換
プトレッシンの生成能を向上させるために、前記実施例１において製造された変異菌株（ＸＱ２６）のプロモーターを強力なプロモーターであるｔｒｃに置換させた。
【００５９】
２−１：ＸＱ３３菌株の製造
ａｒｇＥＣＢＨオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の内容に従い行った。
【００６０】
融合されたｌｏｘ７１−クロラムフェニコール抗生剤マーカー−ｌｏｘ６６ＤＮＡ断片は、鋳型としてｐＥＣｍｕｌｏｘ、プライマーとして配列番号１８、１９を用いて最初のＰＣＲを通じて得た。
［配列番号１８］：５’−ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１９］：５’−ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００６１】
ｔｒｃプロモーターを導入するために、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号２０及び２１のプライマーを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。
［配列番号２０］：５’−ＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
［配列番号２１］：５’−ＴＣＴＣＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００６２】
最終ＰＣＲ産物に相同性部位を導入するために、２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２２と２３のプライマーを用いて３回目のＰＣＲ反応を行った。
［配列番号２２］：５’−ＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＴＡＣＡＴＡＧＧＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣ−３’
［配列番号２３］：５’−ＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＣＧＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴ−３’
【００６３】
最終ＰＣＲ産物を前記１−６において製造されたＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションして組換え微生物を製作した後、これをクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングして、ＸＱ３３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株のｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換は、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【００６４】
２−２：ＸＱ３７菌株の製造
ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。
【００６５】
最初のＰＣＲ反応は、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘと上記の配列番号１９と下記の配列番号２４プライマーを用いて行った。
［配列番号２４］：５’−ＡＣＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
【００６６】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号２５及び２６のプライマーを用いて行った。
［配列番号２５］：５’−ＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＣＧＡＣＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡ−３’
［配列番号２６］：５’−ＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００６７】
３回目のＰＣＲ反応は、２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマーを用いて行った。
［配列番号２７］：５’−ＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＴ−３’
［配列番号２８］：５’−ＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＡＣＡＴＴＣＴＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’
【００６８】
最終ＰＣＲ産物を前記２−１において製造されたＸＱ３３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションして組換え微生物を製作した後、これをクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングしてＸＱ３７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００６９】
２−３：ＸＱ３９菌株の製造
ａｒｇＤオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。
【００７０】
最初のＰＣＲ反応は、ｐＥＣｍｕｌｏｘを鋳型とし、上記の配列番号１９と下記の配列番号２９のプライマーを用いて行った。
［配列番号２９］：５’−ＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３
【００７１】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３０及び３１のプライマーを用いて行った。
［配列番号３０］：５’−ＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴ−３’
［配列番号３１］：５’−ＣＧＣＧＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００７２】
３回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３２及び３３のプライマーを用いて行った。
［配列番号３２］：５’−ＴＴＡＴＧＧＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡ−３’
［配列番号３３］：５’−ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＣＧＣＧＣＧＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴ−３’
【００７３】
最終ＰＣＲ産物は前記２−２において製造されたＸＱ３７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションしてＸＱ３９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株をクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングした。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００７４】
２−４：ＸＱ４３菌株の製造
ｓｐｅＣ遺伝子の野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。最初のＰＣＲ反応は、ｐＥＣｍｕｌｏｘを鋳型とし、上記の配列番号１９と下記の配列番号３６のプライマーを用いて行った。
［配列番号３６］：５’−ＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＣＴＴＡＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３
【００７５】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３７及び３８のプライマーを用いて行った。
［配列番号３７］：５’−ＴＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴ−３’
［配列番号３８］：５’−ＴＡＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴ−３’
【００７６】
３回目のＰＣＲ反応は、２回目のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３９及び４０のプライマーを用いて行った。
［配列番号３９］：５’−ＧＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴ−３’
［配列番号４０］：５’−ＡＴＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡ−３’
【００７７】
最終ＰＣＲ産物は前記２−３において製造されたＸＱ３９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションしてＸＱ４３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＣ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株をクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングした。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００７８】
実施例３：変異微生物を用いたプトレッシンの製造
実施例１及び２において製造された表１の変異菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＷＬ３１１０変異体）を４ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１３．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌ クエン酸、０．７ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）微量金属溶液よりなる最小Ｒ培地（Lee, S. Y., & Chang, H. N., Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993）においてフラスコ培養した。微量金属溶液は、１リットル当たりに５ＭのＨＣｌ：１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び０．１ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含む。グルコース（１００ｇ／Ｌ）貯蔵溶液は別途に滅菌させ、最終濃度１０ｇ／Ｌまで滅菌された培地に追加した。
【００７９】
ＬＢ培地において活性化された１００μＬ細胞培養物を予備最小培地に接種した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２４時間かけて最大ＯＤ６００が５になるまで培養した。その後、これらのうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて１５時間培養した。遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液をＨＰＬＣにより分析した。上澄液に含まれているアミンはヒューレットパッカード１１００シリーズ装備（２３０ｎｍ領域）においてオフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体により検出した。この装備は、a C18-reverse phase column equilibrated to buffer A (buffer A, 45% 0.1 M sodium acetate pH 7.2/Methanol buffer B methanol)を使用する。分析は、下記の条件(1-6min 100% A equilibration, 6-10min linear gradient from 0 to 30% buffer B, 10-15min 30% to 50% buffer B, 15-19min 50% to 100% buffer B, 19-23min 100% buffer B and 23-25 min from 100% to 30% buffer B, 25-28min from 30% B to 100% A with a flow rate of 0.8 mL/min)において行われた。このとき、補正のために標準物質を使用し、測定されたプトレッシンの濃度を下記表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１から、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｐｕｕＰ、ｐｕｕＡ、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ）が欠失された変異微生物は、欠失された遺伝子の種類及びその数によってプトレッシンの生成能が増加されたことを確認することができた。前記変異微生物のアルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）プロモーターが強力なプロモーターに交換された場合、プトレッシンの生成能が一層増加されたことを確認することができた。
【００８２】
実施例４：オルニチン・デカルボキシラーゼ（オルニチン・デカルボキシラーゼ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）の増幅
４−１：プラスミドｐＫＫＳｐｅＣの製造
常時的且つ生合成的なＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｓｐｅＣをコードするオルニチン・デカルボキシラーゼは、ｔａｃプロモーターの強力な遺伝子発現を進行するｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden ）発現ベクターによりクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来、λ−、Ｆ−、原栄養性）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、合成された配列番号３４と３５のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）を製造した。
［配列番号３４］：５’−ＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣ−３’
［配列番号３５］：５’−ＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＡＣＣＧＴＡ−３’
【００８３】
次に、製造されたｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）及びｐＫＫ２２３−３プラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素により切断されたｓｐｅＣ断片及びｐＫＫ２２３−３プラスミドを重合させることにより、高複製数の組換えプラスミドであるベクターｐＫＫＳｐｅＣを製造した。
【００８４】
４−２：プラスミドｐ１５ＳｐｅＣの製造
常時的且つ生合成的なＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｓｐｅＣをコードするオルニチン・デカルボキシラーゼは、ｔａｃプロモーターの強い遺伝子発現を進行するｐＴａｃ１５Ｋ（p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock）発現ベクターによりクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来、λ−、Ｆ−、原栄養性）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、合成された配列番号３４と３５のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）を製造した。
【００８５】
次に、製造されたｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）及びｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素により切断されたｓｐｅＣ断片及びｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを重合させることにより、低複製数の組換えプラスミドであるベクターｐ１５ＳｐｅＣを製造した。
【００８６】
４−３：ＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８７】
４−４：ＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−３において製造されたＸＱ１７菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８８】
４−５：ＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−４において製造されたＸＱ２２菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８９】
４−６：ＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−６において製造されたＸＱ２６菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９０】
４−７：ＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−１において製造されたＸＱ３３菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９１】
４−８：ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−２において製造されたＸＱ３７菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９２】
４−９：ＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−３において製造されたＸＱ３９菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９３】
４−１０：ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−４において製造されたＸＱ４３菌株に前記４−２において製造されたｐ１５ＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９４】
実施例５：オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が増幅された変異微生物を用いたプトレッシンの製造
実施例４において製造された変異菌株を実施例３と同じ培地を含有する振とうフラスコにおいて培養した。
【００９５】
ＬＢ培地において活性化された１００μＬ細胞培養物を予備最小培地に接種させた後、３０℃、２２０ｒｐｍにて３０時間最大ＯＤ６００が５になるまで培養した。その後、これらのうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２７時間培養した。遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液をＨＰＬＣにより実施例３と同じ条件下で分析し、その結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】
【００９７】
表２から、オルニチン・デカルボキシラーゼｓｐｅＣと一緒に同時発現されたとき、減少したプトレッシン分解及び利用活性度を有する変異微生物（ＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ及びＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ）は、ｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣが導入されていない表１の変異微生物（ＷＬ３１１０、ＸＱ１７、ＸＱ２２、ＸＱ２６、ＸＱ３３、ＸＱ３７、ＸＱ３９及びＸＱ４３）よりもプトレッシン産生が大幅に増加されたことが分かる。
【００９８】
実施例６：ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
減少したプトレッシン分解及び利用活性度のポテンシャルを増加されたオルニチン・デカルボキシラーゼ活性度と一緒に流加式発酵により分析した。流加式発酵は、Ｒ培地２リットルに１０ｇ／Ｌ濃度のグルコースを添加した後、６．６リットル発酵器（Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ）において行った。ＬＢ培地において活性化されたＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ培養物のうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２４時間ＯＤ６００が５になるまで培養した。予備培養物２００ｍＬは、その後、発酵器により接種するために使用された。溶存酸素は８５０ｒｐｍの攪拌速度を自動的に増加させることにより飽和空気２０％に維持された。グルコースの枯渇に伴い固定されたｐＨ６．８よりも約０．０２程度さらに上昇したとき、グルコースの濃度を３ｇ／Ｌ以上に増加させるために供給溶液は自動的に追加された。また、供給溶液は５００ｇ／Ｌのグルコースと２００ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。グルコースの枯渇に伴うｐＨ増加の短い時間を除くと、ほとんど２８％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を追加することにより、ｐＨを６．８に維持した。サンプルを採取し、遠心分離を用いて細胞を分離した後に、上澄液を実施例３の方法と同様にしてＨＰＬＣ分析した。図２に示すように、ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株は接種５５．８時間後に１４．３ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種４７時間後に０．２８ｇＬ−１ｈ−１であった。
【００９９】
実施例７：ＸＱ３９菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の代わりにＸＱ３９菌株を使用した以外は、実施例６の方法と同様にして流加式発酵を行い、発酵液をＨＰＬＣにより分析した。図３に示すように、ＸＱ３９菌株は接種３６時間後に１４．７ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種３１時間後に０．４２ｇＬ−１ｈ−１であった。
【０１００】
実施例８：ＸＱ４３菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
実施例２において製造されたＸＱ４３菌株を２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、６．７５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ／Ｌクエン酸、０．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）の微量金属溶液からなる最小Ｒ／２培地（Qian et al., Biotechnol.and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008）に３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４が追加された培地５０ｍＬにおいてフラスコ培養した。
【０１０１】
微量金属溶液は、１リットル当たりに５Ｍ ＨＣｌ：１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び０．１ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含む。グルコース（１００ｇ／Ｌ）貯蔵溶液は別途に滅菌させ、最終濃度１０ｇ／Ｌまで滅菌された培地に追加した。このとき、ＬＢ培地において活性化されたＸＱ４３培養物のうち１ｍＬを上述した培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３７℃、２２０ｒｐｍにて２４時間ＯＤ６００が３．３になるまで培養した。予備培養物２００ｍＬは、その後、発酵器により接種するために使用された。溶存酸素は１０００ｒｐｍの攪拌速度を自動的に増加させることにより飽和空気２０％に維持された。
【０１０２】
ＸＱ４３菌株の流加式発酵は、上記と同じ培地に１０ｇ／Ｌ濃度のグルコースを添加した後、６．６リットル発酵器（Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ）において行った。グルコースの枯渇に伴い固定されたｐＨ６．８よりも０．０１程度にさらに上昇したとき、グルコース濃度を２ｇ／Ｌ以上に増加させるために供給溶液は自動的に追加された。また、供給溶液は５２２ｇ／Ｌのグルコースと８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４及び１７０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。グルコースの枯渇に伴うｐＨ増加の短い時間を除くと、ほとんど１０Ｍ ＫＯＨ溶液を追加することによりｐＨを６．８に維持した。サンプルを採取し、遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液を実施例３の方法と同様にしてＨＰＬＣ分析した。図４に示すように、ＸＱ４３菌株は、接種３０時間後に１８．０ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種２８時間後に０．６３ｇＬ−１ｈ−１であった。
【０１０３】
実施例９：ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
ＸＱ４３菌株の代わりにＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株を使用した以外は、実施例８の方法と同様にして流加式発酵を行い、発酵液をＨＰＬＣにより分析した。図５に示すように、ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株は、接種３７時間後に２１．７ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種３７時間後に０．５８ｇＬ−１ｈ−１であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
以上、詳述したように、本発明は、プトレッシン生成能を有する変異微生物を製造し、これを利用することにより、産業的に汎用されるプトレッシンを高収率にて製造する上で有用である。
【０１０５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを用いたプトレッシンの製造方法に係り、さらに詳しくは、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が不活化または欠失されているプトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを嫌気条件下で培養してプトレッシンを高収率にて製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレッシン（または、１,４ブタンジアミン）は、ナイロン４,６を含むポリアミド４,６の産生のための重要な原料物質であり、アクリロニトリルに水素シアン化物を添加することにより産生されるサクシノニトニルの水素化による産業的規模において主として産生された。これらの化学物質の合成経路においては、非再生的な石油化学的産物を原料物質として必要とし、相対的に多重段階、多重反応器設計だけではなく、高価な触媒システムと関連する高い温度と圧力が必要である。しかも、極めて強い毒性と可燃性がある反応物であるため、既存の化学合成経路は環境的な側面から良くない。この理由から、前記化学生産工程の代案として、再生可能なバイオマス由来炭素源からプトレッシンを産生することが望まれるのが現状である。
【０００３】
プトレッシンは、バクテリアから動植物などに至る全範囲の有機体において発見されるポリアミンの一種である。例えば、プトレッシンは細胞増殖と正常細胞成長において重要な役割を演じており、酸化的ストレスへの防御機作にも重要な物質であることが知られている（Tkachenko et al., Arch. Microbiol., 176:155-157, 2001）。一方、細胞内ポリアミンの含量は、生合成、分解、吸収、及び分泌によってきめ細かく調節される（Igarashi and Kashiwagi et al., J. Bacteriol., 170(7):3131-3135, 1988）。大腸菌におけるプトレッシン濃度は約２.８ｇ／Ｌであって、極めて高いことが知られている。また、微生物は高濃度のポリアミンに潜在的に良好な耐性を有している。例えば、Mimitsukaらは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、３０ｇ／Ｌ以上のカダベリンの存在下でも成長することができることを報告した。このため、産業的に利用可能な高濃度のポリアミン（プトレッシン）を産生するために微生物を利用しようとする研究が持続的になされている。
【０００４】
ヨーロッパ公開特許（ＥＰ０７２６２４０Ａ１）は、安価な産業廃棄物もしくは主な成分としてタンパク質をもつ物質を用いて発酵によりプトレッシンを産生する方法を開示しているが、開示物質が極めて複雑であるため、プトレッシンとカダベリンを産生するためには多くの精製段階を経なければならないという不都合があった。また、ヨーロッパ公開特許（ＥＰ１７８４４９６Ａ１）は、炭素源としてグルコースが追加された最小塩培地における微生物成長によるプトレッシン生化学的合成を開示している。これは、オルニチンのプトレッシンへの変形を向上させるために、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるｓｐｅＣまたはｓｐｅＦを過剰に発現させて、オルニチン・デカルボキシラーゼの活性を増加させた。しかしながら、オルニチン・デカルボキシラーゼ活性が増加するに伴ってプトレッシンの含有量が増大されたとき、プトレッシン生合成の阻害があり、プトレッシンの分解誘導作用が進んでしまうという不都合があった（Igarashi and Kashiwagi et al., Biochem. J., 347:297-303, 2000）。
【０００５】
微生物内におけるプトレッシン分解及び利用活性度についての研究は、下記の通りである。Bowmanらは、ｓｐｅＥ遺伝子産物であるスペルミジン合成酵素が大腸菌内においてプトレッシンからスペルミジンの生合成を促進することを報告した（Bowman et al., J. Biol. Chem., 248:2480-2486, 1973）。スペルミジン合成酵素（ＥＣ：２．５．１．１６）はほとんど全ての細胞システムにおいてスペルミジンの合成のために存在する。
【０００６】
Haywoodらは、キャンディダ・ボイディニ酵母がＮ−アセチルトランスフェラーゼによりプトレッシンをＮ−アセチルプトレッシンにアセチル化させることを報告した。大腸菌において、ｓｐｅＧ遺伝子産物であるスペルミジン・アセチルトランスフェラーゼは酵母のＮ−アセチルトランスフェラーゼとの相同性が極めて高いため、プトレッシン・アセチルトランスフェラーゼを有することが求められる（Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985）。
【０００７】
また、Samsonovaらは、大腸菌において、γ-グルタミレーションなしで、ＹｇｊＧプトレッシン・トランスアミナーゼ及びＹｄｃＷデヒドロゲナーゼ複合作用によりプトレッシンはγ−アミノ酪酸に転換されるという別のプトレッシン分解経路について説明した（Samsonova et al., BMC Microbiol., 3:2, 2003, ; Samsonova et al., FEBS Lett., 579:4107-4112, 2005）。
【０００８】
そして、Kuriharaらは、「Puu pathway」と呼ばれるプトレッシン分解経路は大腸菌内のγ−グルタミル化代謝体と深い関連性を有することを明らかに報告した。この経路のγ−グルタミレーションを通じてアルデヒド中間体であるγ−アミノブチルアルデヒドを安定化させることができる。ｐｕｕＡ遺伝子の産物であるγ−グルタミルプトレッシン合成酵素はプトレッシンをγ−グルタミル−Ｌ−プトレッシンに形質転換させながら、この経路の最初の反応を促進させる。また、Ｐｕｕ異化経路は大腸菌が唯一の窒素源であって、プトレッシンを含む培地において成長するとき、主な要素となることを判明した。また、ｐｕｕＰ遺伝子産物であるプトレッシン・インポータはＰｕｕ異化経路と主なプトレッシン・インポータに関連性があることを認めた（Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280:4602-4608, 2005）。
【０００９】
そこで、本発明者らは、プトレッシンを産生する微生物において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させた変異菌株を製造し、これを嫌気条件下で培養した結果、プトレッシンを高収率にて製造することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明の目的は、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が不活化または欠失されており、プトレッシンの高産生能を有する変異微生物及び前記変異微生物の製造方法を提供するところにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記変異微生物を嫌気条件下で培養して、プトレッシンを高収率にて製造する方法を提供するところにある。
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモータに置換されており、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入または増幅されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルコースからのプトレッシンの合成経路を示す模式図である。
【図２】ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図３】ＸＱ３９菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図４】ＸＱ４３菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【図５】ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株からグルコースを用いた流加式発酵においてプトレッシンの産生を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において、「不活化」とは、当該遺伝子の一部の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入して当該遺伝子により発現される酵素の活性を減少させることを包括する概念であり、当該遺伝子の酵素が関与する生合成経路の一部またはかなりの部分を遮断するあらゆることを含む。
【００１９】
本発明において、「欠失」とは、当該遺伝子の一部または全体の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入して当該遺伝子が発現することを抑制したり、あるいは、発現されるとしても酵素活性を示さないようにすることを包括する概念であり、当該遺伝子の酵素が関与する生合成経路を遮断するあらゆることを含む。
【００２０】
本発明において、「増幅」とは、当該遺伝子の一部の塩基を変異、置換、または削除したり、一部の塩基を導入したり、または同じ酵素をコードする他の微生物由来の遺伝子を導入して、対応する酵素の活性を増加させることを包括する概念である。
【００２１】
図１は、グルコースからのプトレッシンの合成経路を示す模式図である。図１に示すように、本発明においては、プトレッシン生成能を有する微生物において、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）を不活化または欠失させると、プトレッシンを高収率にて製造することができるということを確認しようとした。前記プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）の減少した活性は、それぞれの野生型レベルと比較して減少された転写的、翻訳的効率によって確認することができた。
【００２２】
本発明の一実施例においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を欠失させた変異微生物を製造し、製造された変異微生物のプトレッシン生成能が向上されたことを確認した。
【００２３】
このため、本発明は、一観点において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法に関する。
【００２４】
本発明において、前記変異微生物は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するγ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることもできる。
【００２５】
前記オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）は、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）のアイソザイムであり、前記γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）は、前記プトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）の隣接遺伝子であり、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）は、プトレッシンの分解に関与する遺伝子である。
【００２６】
さらに、本発明において、前記変異微生物は、プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されうる。前記プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ｇｄｈＡ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥなどを例示することができる。
【００２７】
さらに、本発明において、前記変異微生物は、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とすることができる。前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とし、前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されうる。
【００２８】
本発明において、前記微生物は、グルコースからプトレッシンを生成する微生物であれば、制限なしに使用することができ、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)などを例示することができる。
【００２９】
さらに、本発明においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子が欠失されている変異微生物において、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより、プトレッシンを一層高収率にて製造することができるということを確認しようとした。
【００３０】
本発明の一実施例においては、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ、ｐｕｕＰ）及びｌａｃオペロンリプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）が欠失された変異微生物において、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）のプロモーターを強力なプロモーターであるｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３３）、ａｒｇＥＣＢＨと誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３７）、ａｒｇＥＣＢＨ、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥとアセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ３９）及びａｒｇＥＣＢＨ、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ、ａｒｇＤとオルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）のプロモーターをｔｒｃに置換させた変異微生物（ＸＱ４３）を製造し、これらの変異微生物のプトレッシン生成能が急激に増加することを確認した。
【００３１】
このため、本発明は、他の観点において、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力なプロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物及びこの製造方法に関する。
【００３２】
本発明において、前記アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）は、共同調節オペロンであって、側面に２つのコンバージェント・プロモーターであるａｒｇＥｐ、ａｒｇＣＢＨｐと内部にオペレーターを含む。前記両プロモーターはアルギニンにより抑制される（Charlier and Glansdorff, 2004）。このため、ａｒｇＥＣＢＨオペロンの野生型プロモータを強力なプロモーターに置換させると、オルニチンに対する代謝フラックスを増加させることができる。前記ａｒｇＥはＮ−アセチルオルニチナーゼをコードする遺伝子であり、ａｒｇＣはＮ−アセチルグルタミルフォスフェイト還元酵素をコードする遺伝子であり、ａｒｇＢはＮ−アセチルグルタメート・キナーゼをコードする遺伝子であり、ａｒｇＨはアルギニノスクシナーゼをコードする遺伝子である。
【００３３】
また、低いｐＨにおいて誘導されるオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）は誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする。このため、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンの野生型プロモーターを強力なプロモーターに置換させると、ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンを常時発現させることができるので、プトレッシンの生成能を向上させることができる。
【００３４】
さらに、前記アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）のプロモーターはアルギニンにより抑制される（Charlier and Glansdorff, 2004）。このため、ａｒｇＤオペロンの野生型プロモーターを強力なプロモーターに置換させると、オルニチンに対する代謝フラックスを増加させることができる。
【００３５】
前記変異微生物は、上述したように、γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されうる。
【００３６】
また、前記プトレッシン生成能を有する変異微生物はプトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とすることができる。
【００３７】
本発明において、前記オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入されたことが好ましい。
【００３８】
本発明において、前記遺伝子プロモーターの置換及びオルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）の導入と関連する強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選ばれることを特徴とすることができる。
【００３９】
このため、本発明において、最も好ましい例は、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力なプロモーターに置換されており、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入または増幅されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物であることができる。
【００４０】
本発明は、さらに他の観点において、前記変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法に関する。
【００４１】
本発明において、変異微生物の培養及びプトレッシンの取得過程は、従来の発酵工程において通常的に知られている培養方法（回分式培養、流加式培養）及びプトレッシンの分離及び精製方法を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明において、プトレッシンの生物工学的生産は、細胞内（インビボ）もしくは細胞外（インビトロ）において行われうる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
特に、下記の実施例においては、本発明に係る遺伝子を除去するために、特定のベクターと宿主細胞としてプトレッシン生成微生物であるエシェリキア属微生物だけを例示したが、他の種類のベクターとプトレッシン生成微生物を使用することも当業者にとって自明な事項であると言える。
【００４５】
実施例１：プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子欠失変異微生物の製造
本発明において、染色体上の遺伝子（ｐｕｕＡ、ｐｕｕＰ、ｙｇｊＧ、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＦ、ａｒｇＩ）の欠失は二重交差相同組換えにより行われた（Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci., 97:6640-6645, 2000）。ｌｏｘ７１−クロラムフェニコール・マーカー（ＣｍＲ）−ｌｏｘ６６カセットは、ターゲット遺伝子の上流配列および下流配列と相同性を有する５０個のヌクレオチドを含むプライマーを用いてＰＣＲによって製造した。ｌｏｘ７１−ＣｍＲ−ｌｏｘ６６カセットを含むｐＥＣｍｕｌｏｘ（Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008）をＰＣＲの鋳型として使用した。前記ＰＣＲ産物を用いて、λリコンビナーゼを含む電気衝撃用大腸菌細胞をトランスフォメーションした。コロニーはクロラムフェニコール（Ｃｍ；３４μｇ／ｍＬ）を含むルリア-ベルターニ（ＬＢ）寒天(Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）プレートにおいて選択された。ＣｍＲの遺伝子置換の成功は、直接コロニーＰＣＲにより確認された。前記抗生剤マーカーは、今後、温度感受性複製起源とＩＰＴＧ誘導可能なｃｒｅリコンビナーゼ（Palmeros et al., Gene, 247(1):255-264, 2000）を含むヘルパープラスミドｐＪＷ１６８により除去された。
【００４６】
１−１：ＷＬ３１１０菌株の製造
配列番号１及び２のプライマー、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｌａｃＩ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、λリコンビナーゼを含有する電気衝撃用大腸菌（Ｗ３１１０）にエレクトロポレーションしてＷＬ３１１０（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ）を製造した。
［配列番号１］：５’−ＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＲＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＡＣＡＣＧＴＣＴＴＧ−３’
［配列番号２］：５’−ＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧ−３’
【００４７】
１−２：ＸＱ０８菌株の製造
配列番号３及び４のプライマー、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＥ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ０８菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）を製造した。
［配列番号３］：５’−ＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号４］：５’−ＡＴＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００４８】
１−３：ＸＱ１７菌株の製造
配列番号５及び６のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ１７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
［配列番号５］：５’−ＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＧＴＡＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号６］：５’−ＣＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００４９】
１−４：ＸＱ２２菌株の製造
配列番号６及び７のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−３において製造されたＸＱ１７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
［配列番号６］：５’−ＣＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
［配列番号７］：５’−ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＡＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
【００５０】
１−５：ＸＱ２３菌株の製造
配列番号８及び９のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＥ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株にエレクトロポレーションしてＸＱ２３−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）を製造した。
［配列番号８］：５’−ＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号９］：５’−ＡＴＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５１】
配列番号１０及び１１のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、先に製造されたＸＱ２３−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）を製造した。
［配列番号１０］：５’−ＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１１］：５’−ＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５２】
配列番号１２及び１３のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ａｒｇＩ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。
［配列番号１２］：５’−ＴＡＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＧＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１３］：５’−ＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＴＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５３】
次に、製造されたＰＣＲ産物を精製した後、これを鋳型とし、配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。製造されたＰＣＲ産物を精製した後、先に製造されたＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ）を製造した。
［配列番号１４］：５’−ＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＧＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴ−３’
［配列番号１５］：５’−ＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡ−３’
【００５４】
１−６：ＸＱ２６菌株の製造
前記１−３において製造されたｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物及び前記１−４において製造されたｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を順次にＸＱ２３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５５】
１−７：ＸＱ２７菌株の製造
配列番号１６及び１７のプライマー、鋳型としてプラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘを用いてＰＣＲを行うことにより、ｙｇｊＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を製造した。
［配列番号１６］：５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＣＴＴＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１７］：５’−ＣＧＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００５６】
製造されたＰＣＲ産物を精製した後、前記１−５において製造されたＸＱ２３−２菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２７−１菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ）を製造し、ここに前記１−３において製造されたｐｕｕＡ遺伝子欠失ＰＣＲ産物及び前記１−４において製造されたｐｕｕＰ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を順次にエレクトロポレーションしてＸＱ２７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５７】
１−８：ＸＱ２９菌株の製造
前記１−７において製造されたｙｇｊＧ遺伝子欠失ＰＣＲ産物を前記１−６において製造されたＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションしてＸＱ２９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔｙｇｊＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）を製造した。
【００５８】
実施例２：プロモーターの置換
プトレッシンの生成能を向上させるために、前記実施例１において製造された変異菌株（ＸＱ２６）のプロモーターを強力なプロモーターであるｔｒｃに置換させた。
【００５９】
２−１：ＸＱ３３菌株の製造
ａｒｇＥＣＢＨオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の内容に従い行った。
【００６０】
融合されたｌｏｘ７１−クロラムフェニコール抗生剤マーカー−ｌｏｘ６６ＤＮＡ断片は、鋳型としてｐＥＣｍｕｌｏｘ、プライマーとして配列番号１８、１９を用いて最初のＰＣＲを通じて得た。
［配列番号１８］：５’−ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
［配列番号１９］：５’−ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’
【００６１】
ｔｒｃプロモーターを導入するために、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号２０及び２１のプライマーを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。
［配列番号２０］：５’−ＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
［配列番号２１］：５’−ＴＣＴＣＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００６２】
最終ＰＣＲ産物に相同性部位を導入するために、２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２２と２３のプライマーを用いて３回目のＰＣＲ反応を行った。
［配列番号２２］：５’−ＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＴＡＣＡＴＡＧＧＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣ−３’
［配列番号２３］：５’−ＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＣＧＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴ−３’
【００６３】
最終ＰＣＲ産物を前記１−６において製造されたＸＱ２６菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ）にエレクトロポレーションして組換え微生物を製作した後、これをクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングして、ＸＱ３３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株のｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換は、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【００６４】
２−２：ＸＱ３７菌株の製造
ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。
【００６５】
最初のＰＣＲ反応は、鋳型としてプラスミドであるｐＥＣｍｕｌｏｘと上記の配列番号１９と下記の配列番号２４プライマーを用いて行った。
［配列番号２４］：５’−ＡＣＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’
【００６６】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号２５及び２６のプライマーを用いて行った。
［配列番号２５］：５’−ＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＣＧＡＣＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡ−３’
［配列番号２６］：５’−ＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００６７】
３回目のＰＣＲ反応は、２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマーを用いて行った。
［配列番号２７］：５’−ＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＴ−３’
［配列番号２８］：５’−ＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＡＣＡＴＴＣＴＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’
【００６８】
最終ＰＣＲ産物を前記２−１において製造されたＸＱ３３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションして組換え微生物を製作した後、これをクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングしてＸＱ３７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００６９】
２−３：ＸＱ３９菌株の製造
ａｒｇＤオペロンの野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。
【００７０】
最初のＰＣＲ反応は、ｐＥＣｍｕｌｏｘを鋳型とし、上記の配列番号１９と下記の配列番号２９のプライマーを用いて行った。
［配列番号２９］：５’−ＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３
【００７１】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３０及び３１のプライマーを用いて行った。
［配列番号３０］：５’−ＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴ−３’
［配列番号３１］：５’−ＣＧＣＧＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’
【００７２】
３回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３２及び３３のプライマーを用いて行った。
［配列番号３２］：５’−ＴＴＡＴＧＧＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡ−３’
［配列番号３３］：５’−ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＣＧＣＧＣＧＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴ−３’
【００７３】
最終ＰＣＲ産物は前記２−２において製造されたＸＱ３７菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションしてＸＱ３９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株をクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングした。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００７４】
２−４：ＸＱ４３菌株の製造
ｓｐｅＣ遺伝子の野生型プロモーターのｔｒｃプロモーターへの交換は下記の方式に従い行った。最初のＰＣＲ反応は、ｐＥＣｍｕｌｏｘを鋳型とし、上記の配列番号１９と下記の配列番号３６のプライマーを用いて行った。
［配列番号３６］：５’−ＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＣＴＴＡＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３
【００７５】
２回目のＰＣＲ反応は、最初のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３７及び３８のプライマーを用いて行った。
［配列番号３７］：５’−ＴＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴ−３’
［配列番号３８］：５’−ＴＡＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴ−３’
【００７６】
３回目のＰＣＲ反応は、２回目のＰＣＲ産物を鋳型として使用し、配列番号３９及び４０のプライマーを用いて行った。
［配列番号３９］：５’−ＧＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴ−３’
［配列番号４０］：５’−ＡＴＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡ−３’
【００７７】
最終ＰＣＲ産物は前記２−３において製造されたＸＱ３９菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：Ｐｔｒｃ）にエレクトロポレーションしてＸＱ４３菌株（Ｗ３１１０ ΔｌａｃＩ ΔｓｐｅＥ ΔｓｐｅＧ ΔａｒｇＩ ΔｐｕｕＰ ΔｐｕｕＡ ＰａｒｇＥＣＢＨ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ：：ＰｔｒｃＰａｒｇＤ：：ＰｔｒｃＰｓｐｅＣ：：Ｐｔｒｃ）を製造した。次に、製造された菌株をクロラムフェニコール含有寒天固体培地において培養しながら、二重相同性組換えの進んだ細胞だけをスクリーニングした。ｔｒｃプロモーターへのプロモーター交換はＤＮＡ配列分析により確認した。
【００７８】
実施例３：変異微生物を用いたプトレッシンの製造
実施例１及び２において製造された表１の変異菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＷＬ３１１０変異体）を４ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１３．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌ クエン酸、０．７ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）微量金属溶液よりなる最小Ｒ培地（Lee, S. Y., & Chang, H. N., Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993）においてフラスコ培養した。微量金属溶液は、１リットル当たりに５ＭのＨＣｌ：１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び０．１ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含む。グルコース（１００ｇ／Ｌ）貯蔵溶液は別途に滅菌させ、最終濃度１０ｇ／Ｌまで滅菌された培地に追加した。
【００７９】
ＬＢ培地において活性化された１００μＬ細胞培養物を予備最小培地に接種した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２４時間かけて最大ＯＤ６００が５になるまで培養した。その後、これらのうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて１５時間培養した。遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液をＨＰＬＣにより分析した。上澄液に含まれているアミンはヒューレットパッカード１１００シリーズ装備（２３０ｎｍ領域）においてオフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体により検出した。この装備は、a C18-reverse phase column equilibrated to buffer A (buffer A, 45% 0.1 M sodium acetate pH 7.2/Methanol buffer B methanol)を使用する。分析は、下記の条件(1-6min 100% A equilibration, 6-10min linear gradient from 0 to 30% buffer B, 10-15min 30% to 50% buffer B, 15-19min 50% to 100% buffer B, 19-23min 100% buffer B and 23-25 min from 100% to 30% buffer B, 25-28min from 30% B to 100% A with a flow rate of 0.8 mL/min)において行われた。このとき、補正のために標準物質を使用し、測定されたプトレッシンの濃度を下記表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１から、プトレッシンの分解または利用経路に関与する遺伝子（ｐｕｕＰ、ｐｕｕＡ、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＧ、ａｒｇＩ）が欠失された変異微生物は、欠失された遺伝子の種類及びその数によってプトレッシンの生成能が増加されたことを確認することができた。前記変異微生物のアルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）、オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）プロモーターが強力なプロモーターに交換された場合、プトレッシンの生成能が一層増加されたことを確認することができた。
【００８２】
実施例４：オルニチン・デカルボキシラーゼ（オルニチン・デカルボキシラーゼ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）の増幅
４−１：プラスミドｐＫＫＳｐｅＣの製造
常時的且つ生合成的なＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｓｐｅＣをコードするオルニチン・デカルボキシラーゼは、ｔａｃプロモーターの強力な遺伝子発現を進行するｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden ）発現ベクターによりクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来、λ−、Ｆ−、原栄養性）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、合成された配列番号３４と３５のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）を製造した。
［配列番号３４］：５’−ＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣ−３’
［配列番号３５］：５’−ＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＡＣＣＧＴＡ−３’
【００８３】
次に、製造されたｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）及びｐＫＫ２２３−３プラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素により切断されたｓｐｅＣ断片及びｐＫＫ２２３−３プラスミドを重合させることにより、高複製数の組換えプラスミドであるベクターｐＫＫＳｐｅＣを製造した。
【００８４】
４−２：プラスミドｐ１５ＳｐｅＣの製造
常時的且つ生合成的なＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｓｐｅＣをコードするオルニチン・デカルボキシラーゼは、ｔａｃプロモーターの強い遺伝子発現を進行するｐＴａｃ１５Ｋ（p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock）発現ベクターによりクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来、λ−、Ｆ−、原栄養性）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、合成された配列番号３４と３５のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、ｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）を製造した。
【００８５】
次に、製造されたｓｐｅＣ断片（２１５６ｂｐ）及びｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素により切断されたｓｐｅＣ断片及びｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを重合させることにより、低複製数の組換えプラスミドであるベクターｐ１５ＳｐｅＣを製造した。
【００８６】
４−３：ＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−１において製造されたＷＬ３１１０菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８７】
４−４：ＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−３において製造されたＸＱ１７菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８８】
４−５：ＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−４において製造されたＸＱ２２菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００８９】
４−６：ＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例１−６において製造されたＸＱ２６菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９０】
４−７：ＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−１において製造されたＸＱ３３菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９１】
４−８：ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−２において製造されたＸＱ３７菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９２】
４−９：ＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−３において製造されたＸＱ３９菌株に前記４−１において製造されたｐＫＫＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９３】
４−１０：ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株の製造
実施例２−４において製造されたＸＱ４３菌株に前記４−２において製造されたｐ１５ＳｐｅＣベクターを導入させてＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株を製造した。次に、製造された菌株をアンピシリン含有寒天固体培地において培養しながら組換えられた変異微生物を選別した。
【００９４】
実施例５：オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が増幅された変異微生物を用いたプトレッシンの製造
実施例４において製造された変異菌株を実施例３と同じ培地を含有する振とうフラスコにおいて培養した。
【００９５】
ＬＢ培地において活性化された１００μＬ細胞培養物を予備最小培地に接種させた後、３０℃、２２０ｒｐｍにて３０時間最大ＯＤ６００が５になるまで培養した。その後、これらのうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２７時間培養した。遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液をＨＰＬＣにより実施例３と同じ条件下で分析し、その結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】
【００９７】
表２から、オルニチン・デカルボキシラーゼｓｐｅＣと一緒に同時発現されたとき、減少したプトレッシン分解及び利用活性度を有する変異微生物（ＷＬ３１１０／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ１７／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ２２／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ２６／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３３／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ、ＸＱ３９／ｐＫＫＳｐｅＣ及びＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ）は、ｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣが導入されていない表１の変異微生物（ＷＬ３１１０、ＸＱ１７、ＸＱ２２、ＸＱ２６、ＸＱ３３、ＸＱ３７、ＸＱ３９及びＸＱ４３）よりもプトレッシン産生が大幅に増加されたことが分かる。
【００９８】
実施例６：ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
減少したプトレッシン分解及び利用活性度のポテンシャルを増加されたオルニチン・デカルボキシラーゼ活性度と一緒に流加式発酵により分析した。流加式発酵は、Ｒ培地２リットルに１０ｇ／Ｌ濃度のグルコースを添加した後、６．６リットル発酵器（Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ）において行った。ＬＢ培地において活性化されたＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ培養物のうち１ｍＬを同じ培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍにて２４時間ＯＤ６００が５になるまで培養した。予備培養物２００ｍＬは、その後、発酵器により接種するために使用された。溶存酸素は８５０ｒｐｍの攪拌速度を自動的に増加させることにより飽和空気２０％に維持された。グルコースの枯渇に伴い固定されたｐＨ６．８よりも約０．０２程度さらに上昇したとき、グルコースの濃度を３ｇ／Ｌ以上に増加させるために供給溶液は自動的に追加された。また、供給溶液は５００ｇ／Ｌのグルコースと２００ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。グルコースの枯渇に伴うｐＨ増加の短い時間を除くと、ほとんど２８％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を追加することにより、ｐＨを６．８に維持した。サンプルを採取し、遠心分離を用いて細胞を分離した後に、上澄液を実施例３の方法と同様にしてＨＰＬＣ分析した。図２に示すように、ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株は接種５５．８時間後に１４．３ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種４７時間後に０．２８ｇＬ−１ｈ−１であった。
【００９９】
実施例７：ＸＱ３９菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
ＸＱ３７／ｐＫＫＳｐｅＣ菌株の代わりにＸＱ３９菌株を使用した以外は、実施例６の方法と同様にして流加式発酵を行い、発酵液をＨＰＬＣにより分析した。図３に示すように、ＸＱ３９菌株は接種３６時間後に１４．７ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種３１時間後に０．４２ｇＬ−１ｈ−１であった。
【０１００】
実施例８：ＸＱ４３菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
実施例２において製造されたＸＱ４３菌株を２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、６．７５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ／Ｌクエン酸、０．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）の微量金属溶液からなる最小Ｒ／２培地（Qian et al., Biotechnol.and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008）に３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４が追加された培地５０ｍＬにおいてフラスコ培養した。
【０１０１】
微量金属溶液は、１リットル当たりに５Ｍ ＨＣｌ：１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び０．１ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含む。グルコース（１００ｇ／Ｌ）貯蔵溶液は別途に滅菌させ、最終濃度１０ｇ／Ｌまで滅菌された培地に追加した。このとき、ＬＢ培地において活性化されたＸＱ４３培養物のうち１ｍＬを上述した培地５０ｍＬを含む３５０ｍＬバッフルフラスコに添加した後、３７℃、２２０ｒｐｍにて２４時間ＯＤ６００が３．３になるまで培養した。予備培養物２００ｍＬは、その後、発酵器により接種するために使用された。溶存酸素は１０００ｒｐｍの攪拌速度を自動的に増加させることにより飽和空気２０％に維持された。
【０１０２】
ＸＱ４３菌株の流加式発酵は、上記と同じ培地に１０ｇ／Ｌ濃度のグルコースを添加した後、６．６リットル発酵器（Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ）において行った。グルコースの枯渇に伴い固定されたｐＨ６．８よりも０．０１程度にさらに上昇したとき、グルコース濃度を２ｇ／Ｌ以上に増加させるために供給溶液は自動的に追加された。また、供給溶液は５２２ｇ／Ｌのグルコースと８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４及び１７０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。グルコースの枯渇に伴うｐＨ増加の短い時間を除くと、ほとんど１０Ｍ ＫＯＨ溶液を追加することによりｐＨを６．８に維持した。サンプルを採取し、遠心分離を用いて細胞を分離した後、上澄液を実施例３の方法と同様にしてＨＰＬＣ分析した。図４に示すように、ＸＱ４３菌株は、接種３０時間後に１８．０ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種２８時間後に０．６３ｇＬ−１ｈ−１であった。
【０１０３】
実施例９：ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株の流加式培養を通じたプトレッシンの製造
ＸＱ４３菌株の代わりにＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株を使用した以外は、実施例８の方法と同様にして流加式発酵を行い、発酵液をＨＰＬＣにより分析した。図５に示すように、ＸＱ４３／ｐ１５ＳｐｅＣ菌株は、接種３７時間後に２１．７ｇ／Ｌのプトレッシンを産生し、最大プトレッシン産生性は接種３７時間後に０．５８ｇＬ−１ｈ−１であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
以上、詳述したように、本発明は、プトレッシン生成能を有する変異微生物を製造し、これを利用することにより、産業的に汎用されるプトレッシンを高収率にて製造する上で有用である。
【０１０５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項２】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項３】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項４】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項５】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項４に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項６】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項７】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項８】
プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項９】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１０】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１１】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１２】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項１１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１３】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８または請求項１２に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１４】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１５】
プトレッシン生成経路を有する微生物から、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１６】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１７】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１８】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１９】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項１８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２０】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２１】
前記発現ベクターはｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣであることを特徴とする請求項１９に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２２】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２３】
プトレッシン生成経路を有する微生物から、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させて、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターを強力プロモーターに置換されることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２４】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２５】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失させることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２６】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅させることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２７】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項２６に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２８】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３または請求項２７に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターはｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣであることを特徴とする請求項２７に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３０】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４の中いずれか１項の変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法。
【請求項１】
プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されていることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項２】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項３】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項４】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項５】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項４に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項６】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項７】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項８】
プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上が不活化または欠失されており、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターが強力プロモーターに置換されたことを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項９】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１０】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失されていることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１１】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅されていることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１２】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項１１に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１３】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８または請求項１２に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１４】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物。
【請求項１５】
プトレッシン生成経路を有する微生物から、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１６】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１７】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１８】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅させることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項１９】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項１８に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２０】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２１】
前記発現ベクターはｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣであることを特徴とする請求項１９に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２２】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２３】
プトレッシン生成経路を有する微生物から、プトレッシンの分解または利用経路に関与するスペルミジン合成酵素をコードする遺伝子（ｓｐｅＥ）、スペルミジンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＧ）、オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子（ａｒｇＩ）及びプトレッシン・インポータをコードする遺伝子（ｐｕｕＰ）よりなる群から選ばれる１以上を不活化または欠失させて、アルギニン生合成のためのオペロンをコードする遺伝子（ａｒｇＥＣＢＨ）、アセチルオルニチン・アミノ・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＤ）及び誘導可能なオルニチン・デカルボキシラーゼとプトレッシン／オルニチン・アンチポータをコードする遺伝子（ｓｐｅＦ−ｐｏｔＥ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子プロモーターを強力プロモーターに置換されることを特徴とするプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２４】
γ−グルタミルプトレッシン合成酵素をコードする遺伝子（ｐｕｕＡ）、プトレッシン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子（ｙｇｊＧ）及びオルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼＦをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）よりなる群から選ばれる１以上がさらに不活化または欠失されることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２５】
プトレッシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増加されるようにｌａｃオペロン・リプレッサーをコードする遺伝子（ｌａｃＩ）がさらに欠失させることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２６】
オルニチン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）がさらに導入または増幅させることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２７】
前記デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）は、強力なプロモーターを含有する発現ベクターの形で導入することを特徴とする請求項２６に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２８】
前記強力なプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３または請求項２７に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターはｐＫＫＳｐｅＣまたはｐ１５ＳｐｅＣであることを特徴とする請求項２７に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３０】
前記微生物は、バチルス属(Bacillus sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)及びサッカロミセス属(Saccharomyces sp.) よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のプトレッシン生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４の中いずれか１項の変異微生物を培養してプトレッシンを生成した後、培養液からプトレッシンを回収することを特徴とするプトレッシンの製造方法。
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３５０２８（Ｐ２０１０−５３５０２８Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９１６３（Ｐ２０１０−５１９１６３）
【出願日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２５９２４
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２５９２４
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【Ｆターム（参考）】
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