プリオンアッセイ
本発明は、試料中のタンパク質を実質的に完全に消化するための少なくとも１種の配列特異的プロテアーゼを用いて、ＰｒＰＳｃの存在を検出するアッセイ法であって、ＰｒＰＳｃ、ＰｒＰＣ双方におけるオクタリピート領域を無傷で残し、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアを無傷で、オクタリピート領域に結合したままに残す一方、ＰｒＰＳｃ中のプロテアーゼ耐性コアに対応するＰｒＰＣ中のアミノ酸配列の少なくとも一部を消化・除去するアッセイ法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２１，９５１号、および２００８年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０６６，７０４号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出するアッセイ法に関する。本発明は、該アッセイ法で使用される試薬を含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アミロイド病は、可溶性タンパク質の不溶性凝集形態への変化で起こる。この変換は、二次および三次構造に対する立体構造的変化とも関連している証拠が存在する。タンパク質沈着物の蓄積は、細胞及び組織を損傷する結果、疾患を招くという証拠が増加している。幾つかの疾患は、特定のタンパク質の沈着と関連している。
【０００４】
１群の立体構造性疾患は、「プリオン病」または「感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）」と呼称される。こうした疾患は、人間および動物に現れる。人間においては、プリオン病には、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、変異ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症およびクールーが含まれる（例えば、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編（１９９４年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．；Ｍｅｄｏｒｉら（１９９２年） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３２６巻、４４４〜９頁を参照されたい）。動物においては、プリオン病には、ヒツジスクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、感染性ミンク脳症、ならびに捕らえられたミュールジカおよびエルクの慢性疲労病が含まれる（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ、（１９９０年）、Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ内、Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．、（２２８９〜２３２４頁）を参照されたい）。
【０００５】
最近、ＢＳＥの急速な広がり、および人間におけるＴＳＥ発生率の上昇とのその相関性が、人間外哺乳類におけるＴＳＥ検出に対する関心を高めてきた。こうした疾患の偶発的感染の悲劇的結果（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｍｙｌｏｉｄｓ， ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ Ｐｒｉｏｎｓ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ内、Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｉｎ， Ｐｕｂ．（１９９６年）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ、３４０巻、２４〜２７頁（１９９２年）を参照されたい）、除染の難しさ（Ａｓｈｅｒら（１９８６年）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｆｅｔｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ内、Ｍｉｌｌｅｒ編（５９〜７１頁）Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏ．）、及びＢＳＥに関する懸念（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ． Ｊ． （１９９５年）３１１巻、１４１５〜１４２１頁）が、ＴＳＥの人間および動物を特定すると思われる診断試験、ならびに感染対象に対する治療の両方を得る緊急性の根底にある。
【０００６】
プリオンは、細菌、ウィルスおよびウィロイドとはかなり異なる。支配的な仮説は、他のすべての感染性病原体とは異なり、疾患が、鋳型として作用し、正常なプリオン立体構造を異常で異型の立体構造へ変換する、プリオンタンパク質の異常な立体構造により起こされるというものである。プリオンタンパク質即ちＰｒＰは、１９８０年代前半にその特性が決定された。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８巻、１３０９〜１３１１頁； Ｐｒｕｓｉｎｅｒら（１９８２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１巻、６９４２〜６９５０頁；ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）、Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい）。それ以来、完全なプリオンタンパク質コード遺伝子が、クローン化され、配列決定され、トランスジェニック動物中で発現されてきた。（例えば、Ｂａｓｌｅｒら、（１９８６年）Ｃｅｌｌ４６巻、４１７〜４２８頁を参照されたい）。ＰｒＰＣとも呼称される、プリオンタンパク質の正常な細胞形態は、機能不確定な３３〜３５ｋＤａのタンパク質であり、人間においては、２０番染色体の短腕上にある遺伝子で転写される。異常な形状のプリオンタンパク質は、スクレイピータンパク質または病原性プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）とも呼称される。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＰｒＰＳｃの沈着は、神経変性と関連しており、常に致命的である。ＰｒＰＳｃは感染性であり、感染力を含んだ組織に曝されると、発病する恐れがある。霊長類、ヒツジ、げっ歯類およびトランスジェニックマウスを含む実験動物にＰｒＰＳｃを実験的に接種した結果、プリオン病の感染が起こった。（例えば、Ｚｈａｎｇ ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６巻（１２号）、３５４３〜３５５３頁；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ （１９９８年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７巻、７９３〜８１９頁；Ｐａｎ ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻、１０９６２〜１０９６６頁；Ｓａｆａｒら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８巻、２０２７６〜２０２８４頁を参照されたい）。
【０００７】
ＰｒＰＣの主にαヘリックス折畳み非疾患形態と比較して、ＰｒＰＳｃの実質的なβシート構造が、光学分光法および結晶解析研究から明らかとなった。（例えば、Ｗｉｌｌｅ ら（２００１年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９巻、３５６３〜３５６８頁；Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４〜６２２頁；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、（１９９９年）５巻、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ内、Ｓ． Ｐｒｕｓｉｎｅｒ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．（１９１〜２２８頁）を参照されたい）。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの構造変化は、以下のような生化学的性質の変化を伴うようである。即ち、ＰｒＰＣは非変性誘発性洗浄剤中で可溶であり、ＰｒＰＳｃは不溶で、１０００分子もの多数からなるオリゴマーを形成すること、ＰｒＰＣがプロテアーゼで容易に消化される一方、ＰｒＰＳｃは、部分的に耐性を示し、「ＰｒＰ２７−３０」（２７〜３０ｋＤａ）、「ＰｒＰｒｅｓ」または「ＰＫ耐性」（プロテイナーゼＫ耐性）の形態またはコアとして知られているアミノ末端側切断断片を形成するが、この断片は、シグナルペプチドを含む、ヒトまたはシリアンハムスターのＰｒＰ全長配列に従って付番した場合、約９０位から約２３１位のアミノ酸残基のＰｒＰ断片に対応する。（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻、１９１９７〜１９２００頁；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ ら（１９８２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１巻、６９４２〜６９５０頁；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、３４９〜３５８頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ， Ｍ．Ｓ．（１９９７年）Ｐｒｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。それに加え、ＰｒＰＳｃはＰｒＰＣを病原性の立体構造へ変換することができる。（例えば、Ｋａｎｅｋｏら（１９９５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２巻、１１１６０〜１１１６４頁；Ｃａｕｇｈｅｙ（２００３年）Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ． ６６巻、１０９〜２０頁；Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９５年）Ｃｅｌｌ ８３巻、７９〜９０頁；Ｋａｎｅｋｏら（１９９７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４巻、１００６９〜１００７４頁；ＤｅｂＢｕｒｍａｎら（１９９７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４巻、１３９３８〜１３９４３頁；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら（１９９９年）ＥＭＢＯＪ． １８巻、３１９３〜３２０３頁；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら（２０００年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７巻、５８３６〜５８４１頁；Ｋｏｃｉｓｋｏら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻、４７１〜４７４頁を参照されたい）。
【０００８】
生存対象、および生存対象から得た試料における、立体構造的疾患タンパク質の病原イソフォームの検出は、困難であることが判明した。アミロイド一般の検出はコンゴレッド染色で実現できるが、この種の染色は不正確で感度が高くない。細胞、組織またはホモジェネートなどにおける、他のタンパク質存在下での所与のタンパク質の特異的で高親和性の検出は、標的タンパク質に特異的な抗体を用いて普通行なわれる。しかし、同じ配列を共有しながら立体構造が異なるタンパク質では、抗体による識別的検出が複雑になる。実際、ＰｒＰに対して生じた抗体の大多数は、ＰｒＰＣに、またはＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方に結合する。（例えば、Ｍａｔｓｕｎａｇａら（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４巻、１１０〜１１８頁を参照されたい）。それに加え、ＰｒＰＳｃの凝集により、抗体にとって有効なエピトープ濃度が減少し、そのため特異抗体のＰｒＰに対する有効な結合が阻害される。したがって、ＰｒＰＳｃの有効な免疫検出には、ＰｒＰＳｃを解離・変性してＰｒＰＣ様配座異性体に変えると同時に、元のＰｒＰＣと識別することが必要になる。
【０００９】
公表された数種の免疫アッセイ法は、ＰｒＰＳｃの存在を判定するために、自然なＰｒＰＣだけに結合するが、自然なＰｒＰＳｃには結合しない抗体の結合量と、自然なＰｒＰＳｃ、ＰｒＰＣの両方に結合する抗体の結合量とを比較することに基づいていた。（例えば、特許文献１および特許文献２を参照されたい）。別の免疫アッセイ法も、抗体結合量の比較に基づいていたが、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣを変性させる変性工程を含んでおり、その後で自然なＰｒＰＣに結合させるために使用した抗体と同じ抗体にそれらを結合させた。（特許文献３を参照されたい）。しかし、こうした方法を用いると、ＰｒＰＣの量が非常に少ないときにしかＰｒＰＳｃの有効な抗体検出を得ることができないので、こうしたアッセイ法には限界がある。ＰｒＰＣが過剰な場合、例えば、プリオン病の初期段階の対象から試料を採取した場合、ＰｒＰＳｃの存在による免疫検出の増加を認めることは、困難であり、または不可能でさえある。例えば、ＰｒＰＣが１０００倍多い血漿試料中の変性ＰｒＰＳｃの検出は、ＰｒＰＣ検出による圧倒的なシグナルのために不可能となろう。したがって、ＰｒＰＳｃを含むまたは含まない試料間の単純な識別は、あまり妥当ではない。
【００１０】
この困難を克服するために、ＰｒＰＳｃの変性および検出の前に、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）またはディスパーゼなどの非特異的プロテアーゼで試料を処理することがしばしばある。（例えば、特許文献４および特許文献５を参照されたい）。ＰｒＰＳｃイソフォームの構造のために、ＰｒＰＳｃはプロテアーゼ消化に非常に耐性を示す。他方、ＰｒＰＣイソフォームは、このようなプロテアーゼによる処理で完全に分解する。したがって、幾つかの条件下（例えば、５０μｇ／ｍＬを３７℃、３０分間）、ＰＫなどの非特異的プロテアーゼで試料を処理することにより、存在するＰｒＰＣをすべて除去し、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア（約９０位から約２３１位までのアミノ酸残基）をほぼ無傷で残すことができる。
【００１１】
ＰＫ処理の主要な１つの制約は、ＰｒＰＳｃのアミノ末端またはアミノ近接残基（約２３位から約８９位まで）の分解である。ＰｒＰのこの領域は、オクタリピート領域中のエピトープを含め幾つものエピトープを含有するので、免疫検出にとって有用になり得る。オクタリピート領域は、オクタリピート配列のＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）を数コピー含有する。このオクタリピート配列は、様々な種由来のプリオンタンパク質中に高度に保存されており、５回反復を有するウシＰｒＰおよび３回反復を有するサルＰｒＰを除く大部分の種において、ヒトまたはシリアンハムスターのＰｒＰ全長配列に従って付番した場合、約５８〜８９位残基の間に４回反復される。（幾つかの種のＰｒＰ配列の整列については図１を参照されたい）。この配列はＰｒＰに独特なものであり、数種のＰｒＰ特異抗体、例えばＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７が、この配列に結合することが示されてきた。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ、４巻、８０５〜８１４頁；Ｋｒａｓｅｍａｎｎら（１９９６年）、Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁；特許文献６を参照されたい）。
【００１２】
一般に、大部分の抗体は、本来２個の結合部位（即ち、２本の結合アーム）を含有していても、タンパク質上に１度だけ提示されるエピトープに結合する。この種の結合は一価結合と称する。一価結合は、両方の抗体結合部位が、同じタンパク質上の２個のエピトープと同時に相互作用する事象（即ち、多価結合）より弱い。アビディティと呼ばれる多価結合の総括強度は、単一部位の結合強度である親和性より大きいが、その理由は、抗体が抗原を放出するために、両結合部位が同時に解離しなければならないからである。例えば、この性質は、普通その表面上に複数の同一エピトープを有する細菌またはウィルスに対して、抗体が結合する際に非常に重要である。したがって、ＰｒＰのオクタリピート領域は、複数のオクタリピートエピトープの独自性と、多価結合との双方を介して、シグナルの増強を可能にする。ＰＫは、全長成熟ＰｒＰＳｃ（２３〜２３１位アミノ酸）の２３〜８９位残基を消化するので、完全なＰＫ消化後の有用な抗体のレパートリーは、プロテアーゼ耐性コア（約９０〜２３１位アミノ酸）内にある配列に結合する抗体に限られ、オクタリピート領域に対する抗体は、使用することができない。そのため、ＰＫ消化を用いる免疫アッセイは、あまり感度が高くない。
【００１３】
ＰＫのような非特異的プロテアーゼを使用する付加的な欠点は、ＰｒＰＳｃが部分的にしか耐性を示さないため、高い濃度および十分な時間を用いれば、９０〜２３１位残基の大部分またはすべてさえも消化されると見込まれることである。ＰｒＰＳｃの一部の配座異性体は、他のものより消化に敏感であり、このような処理が検出感度を低下させることが示されている。（例えば、Ｓａｆａｒら（１９９８年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４巻、１１５７〜６５頁を参照されたい）。このことと符合して、ＰＫは、ＰｒＰＳｃおよびプリオンの感染力レベルを数ログ低下させるという知見がある（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい）。
【００１４】
最近記載された免疫アッセイ法は、ＰｒＰＣは完全に消化されるが、ＰｒＰＳｃは部分的にしか消化されず、オクタリピート領域のすべてまたは幾らかが保持されるようにＰＫ消化条件を制御することにより、上記に考察した制約に対処した。（特許文献６を参照されたい）。しかし、この解決法は、適当な条件が、異なる試料に対して変動し、そのため実現に手が掛かり、標準化が困難になる恐れがあるので、理想的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６２１４５６５号明細書
【特許文献２】米国特許第６４０６８６４号明細書
【特許文献３】米国特許第５８９１６４１号明細書
【特許文献４】米国特許第７１６３７９８号明細書
【特許文献５】欧州特許第１１１９７７３号明細書
【特許文献６】米国特許第７０９７９９７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、様々な試料、例えば、生存対象から得た試料、供血、家畜、ならびに他の人間用および動物用供給食品における試料において、病原性プリオンタンパク質の存在を検出するために、特異的で感度が良く、相対的に単純または迅速な方法、およびそのような方法を用いたキットに対する必要性が、依然として存在する。本発明は、この目的ならびに他の重要な目的を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、病原性プリオンタンパク質の存在を検出するために、アッセイの方法およびキットの形で、新規で単純で特異的であって感度良好な方策を提供し、該方策は、とりわけ、プリオン関連疾患（例えば、人間または人間外動物対象における）の診断、実質的にＰｒＰＳｃを含まない供血、供給血液製剤または供給食品の確保、移植用の臓器および組織試料の分析、手術用道具および装置の除染ならびに病原性プリオンの有無に関する知識が重要な他の任意の状況のモニタリングをするための各方法に関して使用し得る。
【００１８】
本開示におけるアッセイ法は、実質的に完全な消化後に、既知ＰｒＰ配列のオクタリピート領域中、またはＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア中で切断しないが、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣ中のアミノ酸の少なくとも一部を切断・除去する、部位特異的プロテアーゼによる処理を利用し、この処理により、ＰｒＰＳｃの特異的で感度良好な検出のために、オクタリピート領域中のエピトープまたは更に上流のエピトープさえも、プロテアーゼ耐性コア領域中のエピトープと組み合わせて利用することが、可能となり、好都合となる。
【００１９】
本発明の一部は、プリオンタンパク質のタンパク分解消化が実質的に完全な条件下で、試料を部位特異的プロテアーゼと接触させ、試料の更なるプロテアーゼ消化を防止し、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーと結合させることにより、任意のＰｒＰＳｃの存在を検出することによって、試料中のＰｒＰＳｃの存在を検出する方法であって、一方の結合パートナーは、ＰｒＰのアミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域中のエピトープと特異的に結合し、他方の結合パートナーは、プロテアーゼ耐性コア領域内のエピトープと特異的に結合する方法に関する。
【００２０】
本発明は、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある試料中のタンパク質を実質的に完全に消化するために、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼ、好ましくはトリプシンまたは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ（Ｓ−Ｖ８）を用いて、病原型プリオンタンパク質、即ちＰｒＰＳｃの存在を検出する方法であって、試料が、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい方法を提供する。該ＰｒＰＳｃは、オクタリピート領域内、またはオクタリピート領域とプロテアーゼ耐性コアとの間に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位を有していない。したがって、実質的に完全なタンパク分解消化の後、オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアとの結合を維持し、そのプロテアーゼ耐性コアは無傷のままである。ＰｒＰＣが存在する場合、それは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、部位特異的プロテアーゼに対する利用可能な切断部位を少なくとも１つ有しており、少なくとも１つの利用可能なその切断部位は、実質的に完全なタンパク分解消化により切断される。本発明の方法に適切な部位特異的プロテアーゼについては、本明細書で更に説明する。
【００２１】
該方法は、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程を更に含み、該工程は、プロテアーゼ阻害剤の添加、または部位特異的プロテアーゼの除去により実現することができる。
【００２２】
該方法は、更なるタンパク分解消化を防止する工程の後で、部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させ、それにより変性ＰｒＰＳｃを得る工程を更に含む。
【００２３】
該方法は、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いてＰｒＰＳｃの存在を検出する工程を更に含み、第１の結合パートナーは、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持する、ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域の断片内、好ましくはオクタリピート領域中にある第１のエピトープと特異的に結合し、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にある第２のエピトープと特異的に結合しており、第２の該エピトープは、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、第１のエピトープから分離された、ＰｒＰＣの領域中にある。
【００２４】
ある種の実施形態では、ＰｒＰＳｃは、配列番号１〜１０より選択される配列を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域内にあるエピトープと結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２６】
他のある種の実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２７】
ある種の実施形態では、該方法に使用される部位特異的プロテアーゼは、トリプシンであり、トリプシンは、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）残基のカルボキシル側にあるアミノ酸が、プロリン（Ｐ）でない限り、ＫおよびＲのカルボキシル側でペプチド結合を特異的に加水分解する。こうした実施形態に対して、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、ＰｒＰＣでは、トリプシン消化により切断・除去されてしまい、したがって第１のエピトープから分離されている、任意のエピトープに対して特異的になり得る。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２８】
トリプシンが使用される方法の好ましい実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＣの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰＣの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置しているエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２９】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される部位特異的プロテアーゼは、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）残基のカルボキシル側で特異的に切断する、Ｓ−Ｖ８である。こうした実施形態に対して、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、ＰｒＰＣではＳ−Ｖ８により切断・除去されてしまった、任意のエピトープに対して特異的になり得る。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００３０】
該方法のある種の実施形態では、検出工程は、ＥＬＩＳＡ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施される。このような一実施形態は、捕捉結合パートナーとして、ＰｒＰのアミノ近接領域内、特にオクタリピート領域内のエピトープに結合する第１の結合パートナー、および検出結合パートナーとして、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープに結合する第２の結合パートナーを利用する。このような別の実施形態では、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープに結合する第２の結合パートナーが、捕捉結合パートナーとして利用され、アミノ近接領域内のエピトープに結合する第１の結合パートナーが、検出結合パートナーとして利用される。
【００３１】
ある種の好ましい実施形態では、上記に考察した検出結合パートナーは標識される。こうした実施形態中のある種のものでは、検出結合パートナーは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートで標識される。
【００３２】
ある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、該抗体は、それだけに限らないが、本明細書に開示した例示的なモノクローナル抗体から選択することができる。
【００３３】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【００３４】
該方法の一実施形態では、前記の部位特異的プロテアーゼは、固体支持体上に固定化される。
【００３５】
別の実施形態では、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、部位特異的プロテアーゼによる試料の更なるタンパク分解消化を防止するために、該方法に使用されるプロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）である。
【００３６】
ある種の実施形態では、該方法における変性工程は、グアニジニウム化合物、例えば、塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）またはグアニジンチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）で消化済み試料を処理する工程を含む。
【００３７】
変性剤としてグアニジニウム化合物を使用した実施形態中のある種のものでは、試料を希釈する更なる工程が、変性後に含まれる。
【００３８】
他のある種の実施形態では、該方法における変性工程は、高ｐＨまたは低ｐＨで消化済み試料を処理し、場合により、前記変性後の前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和することを含む。
【００３９】
該方法のある種の実施形態では、試料は、生存中または死後の生物体から得られる。こうした実施形態における例示的な生物体には、ヒト、サル、ハムスター、ウシ、ヒツジ、マウス、エルクおよびシカが挙げられる。
【００４０】
ある種の実施形態では、該方法に使用される試料は、供給食品、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液、臓器、細胞、脳組織、神経系組織、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検、剖検および汚染機器からなる群に由来する。
【００４１】
ある種の実施形態では、該方法に使用される試料は、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球および血清からなる群に由来する。
【００４２】
ある種の実施形態では、試料は、生検、検視または剖検から得られる。
【００４３】
本発明の一部は、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある試料において、病原型プリオンタンパク質、即ちＰｒＰＳｃの存在を検出するキットであって、試料が、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含有することも含有しないこともあり、本明細書で考察する方法において有用な試薬を含むキットにも関する。
【００４４】
具体的には、該キットは、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼを含み、ＰｒＰＳｃは、オクタリピート領域内、またはオクタリピート領域とプロテアーゼ耐性コアとの間に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、したがって、ＰｒＰＳｃの該プロテアーゼによる実質的に完全なタンパク分解消化の後、オクタリピート領域を含む、ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域の断片は、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している。ＰｒＰＣが存在する場合、それは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、部位特異的プロテアーゼに対する利用可能な切断部位を少なくとも１つ有する。
【００４５】
該キットは、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを含む。第１の結合パートナーは、キット中の部位特異的プロテアーゼによる、ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後で、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持するアミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープと特異的に結合する。第２の結合パートナーは、プロテアーゼ耐性コア内に位置する第２のエピトープと特異的に結合しており、第２の該エピトープは、キット中の部位特異的プロテアーゼによる、ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後で、第１のエピトープから分離された、ＰｒＰＣの領域中にある。
【００４６】
該キットは、病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、キットを使用するための説明書を更に含む。
【００４７】
場合により、該キットは、キット中の部位特異的プロテアーゼの活性を阻害できる、プロテアーゼ阻害剤を更に含む。
【００４８】
やはり場合により、該キットは、ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤を更に含む。
【００４９】
キットに関するある種の実施形態では、ＰｒＰＳｃは、配列番号１〜１０より選択される配列を含む。
【００５０】
キットに関するある種の好ましい実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域内のエピトープと特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５１】
キットに関する他のある種の実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５２】
キットに関するある種の実施形態では、キット中の部位特異的プロテアーゼは、トリプシンである。こうした実施形態に対して、こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５３】
トリプシンが部位特異的プロテアーゼである、キットに関する好ましい実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＣの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰＣの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置しているエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５４】
他のある種の実施形態では、キット中の部位特異的プロテアーゼは、Ｓ−Ｖ８である。こうした実施形態に対して、こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５５】
キットに関するある種の実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡキット、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡキットを含む。このような実施形態の中で、ある種の実施形態は、捕捉結合パートナーとして第１の結合パートナー、および検出結合パートナーとして第２の結合パートナーを有する。更に他のある種の実施形態は、捕捉結合パートナーとして第２の結合パートナー、および検出結合パートナーとして第１の結合パートナーを有する。
【００５６】
キットに関するある種の実施形態では、上記に考察した検出結合パートナーは標識される。こうした実施形態中のある種のものでは、検出結合パートナーは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートで標識される。
【００５７】
ある種の実施形態では、キット中の結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、該抗体は、それだけに限らないが、上記に示した例示的なモノクローナル抗体から選択することができる。
【００５８】
他のある種の実施形態では、キット中の結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【００５９】
キットに関する一実施形態では、部位特異的プロテアーゼは固定化される。
【００６０】
キットに関する別の実施形態では、任意選択のプロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）である。
【００６１】
キットに関するある種の実施形態では、任意選択の変性剤は、グアニジニウム化合物である。
【００６２】
キットに関する他のある種の実施形態では、任意選択の変性剤は、塩基性試薬または酸性試薬である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ】（１Ａおよび１Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびトリプシン切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。（プロテアーゼ耐性コア領域の正確な開始および終止アミノ酸位置は、異なる種間および異なる系統間で、ならびに異なるプロテアーゼ消化条件により若干変化することに留意されたい）。トリプシン切断部位である、カルボキシル側にプロリン（Ｐ）を有していないアミノ酸のリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）には、一本下線を引いてある。
【図１Ｂ】（１Ａおよび１Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびトリプシン切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。（プロテアーゼ耐性コア領域の正確な開始および終止アミノ酸位置は、異なる種間および異なる系統間で、ならびに異なるプロテアーゼ消化条件により若干変化することに留意されたい）。トリプシン切断部位である、カルボキシル側にプロリン（Ｐ）を有していないアミノ酸のリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）には、一本下線を引いてある。
【図２Ａ】（２Ａおよび２Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびＳ−Ｖ８切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。Ｓ−Ｖ８切断部位である、アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）には、一本下線を引いてある。
【図２Ｂ】（２Ａおよび２Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびＳ−Ｖ８切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。Ｓ−Ｖ８切断部位である、アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）には、一本下線を引いてある。
【図３】本発明の一実施形態の概要を示す図である。一本線は、プリオンタンパク質を表し、コイル部は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアを表し、波線部は、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃイソフォームのα−ヘリックス性の高い部分を表す。ＰｒＰＳｃまたはＰｒＰＣタンパク質の様々な位置番号は、異なる領域のアミノ酸境界を表す。箱形は、抗プリオン抗体が認識するエピトープ領域を示し、塗潰し棒は、オクタリピート領域を表し、三角形は、部位特異的プロテアーゼの切断部位を表す。白抜きの箱形は、アミノ近接領域内、好ましくはオクタリピート領域内のエピトープ領域を表し、一方、斜線付き箱形は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア内のエピトープ領域、またはプロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣのアミノ酸配列内にある同じエピトープ領域を表す。白抜き三角形は、ＰｒＰＳｃまたはＰｒＰＣの天然型において、部位特異的プロテアーゼに対して利用可能な切断部位を表す。斜線付き三角形は、ＰｒＰＳｃの天然型において、部位特異的プロテアーゼに対して利用不可能な切断部位を表す。Ｙは抗体を表す。
【図４】捕捉抗体としてＳＡＦ−３２および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲート３Ｆ４（３Ｆ４ＡＰ）を用いて、トリプシンまたはＰＫで消化した正常またはｖＣＪＤのヒト脳ホモジェネート（ＢＨ）試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例６に開示されている。プロテアーゼ消化後、試料は、変性させないままとし、または４Ｍ ＧｄｎＨＣｌで変性させ、その後ＰｒＰＳｃを検出した。検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。
【図５】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲートＰＯＭ２（ＰＯＭ２ＡＰ）を用いて、様々な条件下でトリプシンまたはＰＫで消化した、スクレイピー感染シリアンハムスター（ＳＨａ）のＢＨ試料における、ＰｒＰＳｃのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例７に開示されている。正常ＢＨシグナルに対するスクレイピー感染シグナルの比が、示されている（Ｓ／Ｎ値）。
【図６】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲートＰＯＭ１７（ＰＯＭ１７ＡＰ）を用いて、様々な条件下でトリプシンまたはＰＫで消化した、スクレイピー感染ＳＨａのＢＨ試料における、ＰｒＰＳｃのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例７に開示されている。正常ＢＨシグナルに対するスクレイピー感染シグナルの比が、示されている（Ｓ／Ｎ値）。
【図７】（図７Ａ）全長成熟ＰｒＰ配列、ＰｒＰＳｃのＰＫ耐性コア、およびトリプシン切断部位の概略マップである。トリプシン切断部位は三角形で示され、ＰＫ耐性コア内にある該部位は、ＰｒＰＳｃにおけるトリプシン切断には一般に利用不可能なことを示すために、灰色三角形として示されている。（図７Ｂ）ウェスタンブロット分析の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例８に開示されている。トリプシンまたはＰＫの５０μｇ／ｍｌ消化を、正常、ｖＣＪＤ ＭＭ（１２９位コドンの多形、白色ｖＣＪＤ系統）、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶのＢＨ試料について比較した。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１７抗体で免疫ブロットをした。ローディング対照として、アクチン免疫ブロットを行なった。
【図８】別のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例８に開示されている。正常またはｖＣＪＤのＢＨ試料を０、２５、５０、７５または１００μｇ／ｍｌのトリプシンで消化した後、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１抗体による免疫ブロットで分析した。
【図９】（図９Ａ）トリプシン切断部位および数個の抗体用エピトープの位置を印した全長成熟ＰｒＰ配列の概要を示す図である。３Ｆ４またはＰＯＭ１７用エピトープ領域のトリプシン切断部位は、灰色三角形で示され、ＰｒＰＳｃにおけるトリプシン切断には一般に利用不可能なことを示す。（図９ＢおよびＣ）「受動被覆」直接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例９に開示されている。正常またはＣＪＤのＢＨを、トリプシン（塗潰し記号）またはＰＫ（白抜き記号）の増加する濃度で消化した。消化物を遠心し、ＰｒＰＳｃペレットを変性させ、ＰＯＭ２（上段パネル）、３Ｆ４（中段パネル）またはＰＯＭ１７（下段パネル）抗体による直接ＥＬＩＳＡで検出した。検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。図９Ｂは、正常なＢＨ（三角形）およびｖＣＪＤ ＭＭのＢＨ（円形）の生データを示す。図９Ｃは、ｖＣＪＤ ＭＭ、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶのＢＨ試料の規格化データを示す。結果は、「感染−正常（ＲＬＵ）」で表現されている。
【図１０】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰを用いて、トリプシン（各パネルの左半部）またはＰＫ（各パネルの右半部）の増加する濃度で消化した正常または各種ＣＪＤのヒトＢＨ試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を棒グラフで示した図である。実験の詳細は、実施例１０に開示されている。生データとして得られた検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。黒塗り棒は正常ＢＨのデータを表し、灰色棒は各種ＣＪＤ ＢＨのデータを表す。
【図１１】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰを用いて、トリプシン（塗潰し円）またはＰＫ（白抜き円）の増加する濃度で消化した正常またはｖＣＪＤのヒトＢＨ試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を折れ線グラフで示した図である。図１０の実験の一部である、この実験の詳細は、実施例１０に開示されている。生データとして得られた検出シグナルの相対量は、左側パネルおよび中央パネルに相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。ＰｒＰＳｃが占めるシグナル量は、ｖＣＪＤ ＢＨ由来のシグナルから正常ＢＨ由来のシグナルを差し引くことにより、推定しており、右側パネルに「ｖＣＪＤ−正常（ＲＬＵ）」として示してある。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
（詳細な説明）
本開示の実施には、別途指示しない限り、当分野の技術内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来法が使用されよう。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．を参照されたい。
【００６５】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
定義
以下の精選した用語は、本明細書で使用する文脈で考察することになる。用語の複数形および単数形は共に、考察する形に関係なく包含される。
【００６７】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は、病原性プリオンタンパク質形態（スクレイピータンパク質、病原性タンパク質形態、病原性イソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃとも称する）および非病原性プリオン形態（正常形態、細胞性タンパク質形態、細胞性イソフォーム、非病原性イソフォーム、非病原性プリオンタンパク質およびＰｒＰＣとも称する）の双方、ならびに変性形態、および病原性立体構造、正常細胞性立体構造のいずれをも有していないこともある、プリオンタンパク質の各種組換え形態を指示するために、互換的に使用される。
【００６８】
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」または「コンホメーション病タンパク質」の使用は、本明細書に記載の配列に正確に合った配列を有するポリペプチドに限定されることを意図していない。該用語が、特定済みまたは未特定の種（例えば、ヒト、ウシ）または疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）のいずれかに由来するコンホメーション病タンパク質を包含することは、容易に明らかである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有する米国特許公開第２００５０１１８６４５号および第２００６００３５２４２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０６／０７６６８７号も参照されたい。本開示および当該技術の教示に鑑みて、当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ））、または構造的特徴もしくはモチーフの同定および整列を用いて、他の任意のプリオンタンパク質において、本明細書に開示する配列に対応する領域を決定することができる。
【００６９】
「病原性の」とは、タンパク質が、実際に疾患を起こす、またはタンパク質が、疾患に関連しており、したがって疾患が存在する場合には、存在していることを意味する。したがって、病原性タンパク質は、本明細書で使用する場合、疾患の特定の原因物質であるタンパク質とは限らない。「病原型」タンパク質とは、疾患が存在する場合に存在しているタンパク質の立体構造を意味するが、それは、感染性であることもないこともある。病原性のコンホメーション病タンパク質、または病原型タンパク質の例は、ＰｒＰＳｃである。したがって、用語「非病原性の」または「正常型」は、疾患を通常起こさない、または発病と通常関連していないタンパク質を表す。コンホメーション病タンパク質の非病原型または正常型の例は、ＰｒＰＣである。
【００７０】
「プリオン関連疾患」とは、病原性プリオンタンパク質または病原型プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）が、全般的または部分的に起こす疾患を指す。プリオン関連疾患の例には、限定することなく、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、慢性疲労病（ＣＷＤ）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）が挙げられる。
【００７１】
用語「変性する」または「変性した」とは、タンパク質構造に適用した場合に従来の意味を有し、そのタンパク質が、本来の二次および三次構造を喪失したことを意味する。病原性プリオンタンパク質に関しては、「変性した」病原性プリオンタンパク質は、本来の病原性立体構造をもはや保持しておらず、したがってそのタンパク質は、もはや「病原性」ではない。変性した病原性プリオンタンパク質は、変性した非病原性プリオンタンパク質と類似または同一の立体構造を有する。
【００７２】
用語「標識」、「標識された」、「検出可能な標識」または「検出可能に標識された」とは、それだけに限らないが、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）、蛍光ナノ粒子、金ナノ粒子などを含む、検出可能な分子を指す。使用できる標識の特定の例には、それだけに限らないが、フルオレッセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル、ＮＡＤＰＨ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび尿素が挙げられる。該標識は、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグ）、抗体、または増幅可能な、そうでなければ検出可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
【００７３】
「タンパク分解消化」または「プロテアーゼ消化」とは、タンパク質中のペプチド結合の加水分解または切断を介した、プロテアーゼによるタンパク質の指定された消化または分解を指す。
【００７４】
「部位特異的プロテアーゼ」とは、タンパク質基質において、１つの形式で、または異なる少数のアミノ酸残基において、ペプチド結合を切断する酵素（プロテアーゼ）を指す。部位特異的プロテアーゼに対する「切断部位」とは、隣接するペプチド結合が、通常のタンパク分解消化条件下で、部位特異的プロテアーゼにより加水分解または「切断」される、タンパク質基質中の特定のアミノ酸残基（複数）を指す。部位特異的プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ（脂肪族、芳香族および疎水性残基で切断する）、およびカルボキシペプチダーゼＹ（カルボキシ末端に始まって全残基を逐次切断する）のような非特異的プロテアーゼとは区別される。例えば、トリプシンは、特に、ＬｙｓおよびＡｒｇのカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基においてだけ切断する部位特異的プロテアーゼである。（例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｒｔ（１９５０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．４６巻、７０頁；Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ（１９６４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５２巻、８８４〜８８９頁；Ｗａｌｓｈ（１９７０年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９巻、４１頁を参照されたい）。そのため、トリプシンに対する切断部位は、ＬｙｓおよびＡｒｇのカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基を意味する。トリプシンに対する切断部位は、「トリプシン部位」とも称する。もう１つの例は、ＧｌｕおよびＡｓｐ残基で特異的に切断するプロテアーゼＳ−Ｖ８である。（例えば、Ｄｒａｐｅａｕら（１９７２年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４７巻、６７２０〜６７２６頁、およびＨｏｕｍａｒｄ ａｎｄ Ｄｒａｐｅａｕ（１９７２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９巻、３５０６〜３５０９頁を参照されたい）。トリプシンおよびＳ−Ｖ８は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．の一部門のＰｉｅｒｃｅ、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．などの企業から市販されている。
【００７５】
「実質的に完全な」消化、または「実質的に消化された」とは、タンパク質が、利用可能なすべてのプロテアーゼ切断部位のうち、少なくとも９０％、好ましくは９９％でプロテアーゼにより切断された消化を意味する。「利用可能な切断部位」とは、プロテアーゼにより切断部位と認識され、しかもタンパク質の立体構造においてプロテアーゼとの接触のために利用できる、アミノ酸配列を有する部位を意図している。例えば、プリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア内に現れるプロテアーゼ切断部位は、プリオンタンパク質がＰｒＰＳｃの立体構造を採るとき、プロテアーゼ消化には一般に利用できず、したがってＰｒＰＳｃにおいては「利用可能な切断部位」ではない。
【００７６】
「オクタリピート領域」とは、これまでに確認されたすべての種に由来する、プリオンタンパク質のＮ末端に近接して見出される反復配列領域を指す。オクタリピートは、普通ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）と書かれる８（または９）アミノ酸配列のコピーを、一般に３〜５個、普通４個含有する。この配列は、高度に保存されており（この配列は、該リピートの幾つかでは若干変化することもある）、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約５８〜８９位残基内に一般に現れる。オクタリピート領域は、普通、プロテアーゼ耐性領域に隣接しており、Ｎ末端に近接性している。
【００７７】
プリオンタンパク質の「プロテアーゼ耐性コア」（時々「プロテイナーゼＫ耐性コア」と呼ばれる）は、ＰｒＰＣ形態のプリオンタンパク質を実質的に消化するのに十分な条件下に、ＰｒＰＳｃをプロテイナーゼＫに曝した後、ＰｒＰＳｃ立体構造を採るプリオンタンパク質の存続している領域によって定義される。一般に、大部分のプリオンタンパク質種については、プロテアーゼ耐性コア領域は、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約９０位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域を含む。図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂは、様々な種からの多くのプリオンタンパク質の整列を示し、括弧付き領域はプロテアーゼ耐性コア領域を示す。
【００７８】
「プロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣのアミノ酸領域」とは、前記ＰｒＰＣと一次アミノ酸配列が同じ病原型プリオンタンパク質において、プロテアーゼ耐性コアを形成する領域と同じである、ＰｒＰＣの領域を指す。一般に、大部分のプリオンタンパク質種については、この領域も、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約９０位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域を指す。
【００７９】
ＰｒＰＣの「球状ドメイン」は、ヒトのＰｒＰ種に従って付番した場合、およそ１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までである。
【００８０】
本明細書における「エピトープ」とは、限定することなく、抗体およびアプタマーを含めた結合パートナーに認識される（例えば、特異的に結合する）、標的タンパク質の領域を意味する。エピトープは、エピトープに特有の空間的立体構造中に３個以上のアミノ酸を含む。一般には、エピトープは、少なくとも５個のそのようなアミノ酸からなり、より普通には、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。更に、所与のタンパク質におけるエピトープの特定は、疎水性試験の使用および部位選択的血清法などの、当技術分野で周知の技法を用いて容易に実現される。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８４年）８１巻、３９９８〜４００２頁（所与の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するために、ペプチドを迅速に合成する一般法）；米国特許第４７０８８７１号（抗原のエピトープを同定し、化学合成するための手順）およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）２３巻、７０９〜７１５頁（所与の抗体に親和性の高いペプチドを同定する技法）も参照されたい。
【００８１】
「アミノ近接領域」とは、ヒトまたはハムスターのＰｒＰ配列に従って付番した場合、２３位から約８９位までのアミノ酸を包含する、成熟ＰｒＰタンパク質のＮ末端領域を指す。
【００８２】
「結合パートナー」とは、エピトープなどのリガンドを特異的に認識し、非共有結合でそれに結合する分子を指す。本開示で考察するような結合パートナーには、限定することなく、抗体およびアプタマーが含まれる。
【００８３】
「捕捉結合パートナー」とは、ＰｒＰタンパク質などのリガンドと特異的に結合し、それを捕捉するために、固体支持体上に被覆された結合パートナーを指す。
【００８４】
「検出結合パートナー」とは、捕捉結合パートナーが結合し、捕捉した任意のリガンドを特異的に検出するために、固体支持体上の試料に対して、溶液中に添加される結合パートナーを指す。
【００８５】
アッセイ法のある種の実施形態では、結合パートナーはアプタマーである。アプタマーは、抗体の分子認識性を有する核酸である。しかし、アプタマーは、抗体より小さく、抗体ほどに複雑ではないため、製造および修飾が、より容易になり得る。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら（１９９７年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １巻、５〜９頁；Ｂｕｎｋａら（２００６年）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４巻、５８８〜５９６頁を参照されたい）。タンパク質エピトープに特異的なアプタマーを生成する方法は、容易に入手できる（例えば、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、５０５〜５１０頁；Ｃｏｘら（１９９８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １４巻、８４５〜８５０頁；Ｃｏｘら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻、ｅ１０８頁を参照されたい）。アプタマーは、検出容易な活性を有する酵素に結合することができる（例えば、Ｄｒｏｌｅｔら（１９９６年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻、１０２１頁を参照されたい）。
【００８６】
プロテアーゼで試料を「処理する」またはその「処理」は、反応、特にペプチド結合の加水分解または切断が起こるのに十分な時間長の間、試料およびプロテアーゼを接触させ、一緒に維持することを意味する。
【００８７】
一般的概観
本開示の前に、公表されたある特許に、ＰＫを用いてＰｒＰＳｃを消化し、結合パートナー（リガンド）と結合するためにオクタリピート領域を保持する方法であって、ＰｒＰＳｃを部分的に消化するが、ＰｒＰＣを完全に消化するために、制御された消化条件を必要とする方法が開示された。（米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）。既に開示されたこの方法の１つの問題は、適当な条件が試料の違いで変化し、そのため実現に手がかかり、標準化が困難になり得ることである。既に開示されたこの方法は、ＰｒＰＳｃをＰｒＰＣと識別するために、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに結合する第２の結合パートナーを全く使用しなかった。
【００８８】
ＰＫのような非特異的プロテアーゼの使用に伴う制約を回避するために、本発明者らは、ＰｒＰのオクタリピート領域内に切断部位を有していない他のプロテアーゼ、特に部位特異的プロテアーゼの使用を研究した。そのため、実質的に完全な消化をしても、オクタリピート領域は、消化されず、結合パートナーによる特異的で強力な結合のために、一貫して利用できる。ＰＫによる部分的消化と比較して、部位特異的プロテアーゼによる実質的に完全な消化は、実施および標準化が容易である。それに加え、本開示は、プロテアーゼによるＰｒＰＣからの対応エピトープの除去により、ＰｒＰＳｃには結合するが、ＰｒＰＣには結合しない第２の結合パートナーの使用を含むため、本開示法は、ＰｒＰの２型間の高い選択性という利点を得ている。
【００８９】
したがって、本明細書に記載の方法は、多量のＰｒＰＣを有し得る試料におけるＰｒＰＳｃの検出に関して、特異性、感度、使用し易さおよび再現性を高めることのできる改良に関する。
【００９０】
本開示のある種の実施形態では、使用する部位特異的プロテアーゼは、トリプシンまたはＳ−Ｖ８であり、その特異的切断部位は、図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示すように、既知のＰｒＰ配列のオクタリピート領域中に存在しない。それに加え、ＰＫの場合と異なり、トリプシンまたはＳ−Ｖ８による消化は、プリオン感染性に影響せず、ＰｒＰＳｃが、ＰＫよりこれらのプロテアーゼに対して耐性が高いことが示唆される（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ、３５巻、５７〜６２頁、およびＬａｎｇｅｖｅｌｄら（２００３年）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １８８巻、１７８２〜１７８９頁を参照されたい）。トリプシンまたはＳ−Ｖ８によりＰｒＰＳｃを処理すると、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア内の潜在的切断部位が保護されるため、（ヒトまたはシリアンハムスターの種に従って付番した場合）、各々４９〜２３１位または２３〜２３１位の残基を有するプロテアーゼ耐性断片が生成されよう。他方、ＰＫによりＰｒＰＳｃを処理すると、８０〜１００位あたりの残基で始まるＰＫ耐性断片のＮ末端を有する複数のプロテアーゼ耐性断片が生成されよう。ＰＫによるＰｒＰＳｃの正確な切断部位は、ＰｒＰＳｃが異なる立体構造を採ることができるので、変化を受けよう（Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、２０７９〜２０８２頁を参照されたい）。したがって、トリプシンまたはＳ−Ｖ８によるＰｒＰＳｃの処理は、ＰＫによる処理より一貫性が高く、長く、有用な断片を産生することになろう。
【００９１】
本開示の前に、１つの刊行物により、ＰｒＰＳｃに対してエピトープをアンマスクし、ＰｒＰＣの対応エピトープの利用可能性を除くために、トリプシンの使用が提案された。（国際公開第ＷＯ９９／１９３６０Ａ１号を参照されたい）。国際公開第９９／１９３６０Ａ１号で提案された免疫アッセイ法は、本開示法でトリプシンを使用した目的または結果が、ＰｒＰＳｃに対してエピトープをアンマスクすることではないので、本開示法とは異なる。それに加え、国際公開第９９／１９３６０Ａ１号で提案された方法は、オクタリピート領域に特異的な抗体とＰｒＰＳｃを結合させることを開示していなかった。したがって、本開示法は、結合パートナーをオクタリピート領域に結合させる高いアビディティによる高感度の利点を提供する。
【００９２】
本開示前の別の刊行物として国際公開第ＷＯ０３／００１２１１Ａ１号は、ＰＫなどのプロテアーゼによる限定的タンパク分解を伴う、プリオンタンパク質の存在を検出する方法を開示した。国際公開第０３／００１２１１Ａ１号に記載の方法の一実施形態では、トリプシンなどのプロテアーゼが、細胞または組織を溶解する工程および溶解物をＰＫで処理する工程の前に、組織解離を促進するために、細胞膜を破壊しないと見込まれる条件下で短時間使用された。
【００９３】
それに加え、本開示前の別の刊行物として国際公開第ＷＯ２００６／０８８２８１Ａ１号は、多量体形成性ポリペプチド（プリオンなど）の単量体から多量体を検出するための方法であって、トリプシンによる処理を伴う方法を開示した。国際公開第２００６／０８８２８１Ａ１号に開示された方法は、本開示法とは異なる。国際公開第２００６／０８８２８１Ａ１号は、この刊行物に開示された方法を用いると、オクタリピート配列に対する抗体がバックグランドを増加させたので、オクタリピート配列などの反復配列より、プリオンタンパク質中の非反復配列に対する抗体の使用を特異的に推進した。
【００９４】
最近の刊行物では、プロテアーゼのサーモリシンが、プリオン病の診断に用いられた（Ｏｗｅｎら（２００７年）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３５巻、１６１〜１７０頁を参照されたい）。サーモリシンは、プロテアーゼが接触可能なＰｒＰＳｃのアミノ末端領域にはない残基である、幾つかの疎水性残基で特異的に切断する。
【００９５】
したがって、本発明は、
（ａ）プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料であって、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい試料を得る工程、
（ｂ）前記ＰｒＰＳｃ、および存在する場合には前記ＰｒＰＣのタンパク分解消化が、実質的に完全である条件下で、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼで前記試料を処理する工程であって、
ｉ）前記ＰｒＰＳｃが、前記オクタリピート領域内または前記オクタリピート領域と前記プロテアーゼ耐性コアとの間に、前記プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、前記オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、前記プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有しており、前記少なくとも１つの利用可能な切断部位が、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、切断される
工程、
（ｃ）プロテアーゼ阻害剤の添加または前記プロテアーゼの除去により、（ｂ）における前記の実質的に完全なタンパク分解消化に続く、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程、
（ｄ）前記の部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させることにより、変性ＰｒＰＳｃを得る工程、ならびに
（ｅ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いて前記変性ＰｒＰＳｃの存在を検出する工程であって、
ｉ）前記第１の結合パートナーが、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、アミノ近接領域の前記断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合しており、
ｉｉ）前記第２の結合パートナーが、前記プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合しており、前記第２のエピトープが、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記第１のエピトープから分離されている、前記ＰｒＰＣの領域中にある
工程
を含む、アッセイ法を提供する。
【００９６】
本発明は、病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料であり、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい試料において、プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する前記ＰｒＰＳｃの存在を検出するキットであって、
（ａ）少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼであり、
ｉ）前記ＰｒＰＳｃが、前記オクタリピート領域内または前記オクタリピート領域と前記プロテアーゼ耐性コアとの間に、前記プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、前記オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、前記プロテアーゼによるＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、前記プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有している
プロテアーゼ、
（ｂ）場合により、前記プロテアーゼの活性を阻害できるプロテアーゼ阻害剤、
（ｃ）場合により、前記ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤、
（ｄ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーであり、
ｉ）前記第１の結合パートナーが、前記プロテアーゼによる前記ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、アミノ近接領域の前記断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合しており、
ｉｉ）前記第２の結合パートナーが、前記プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合しており、前記第２のエピトープが、前記プロテアーゼによる前記ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記第１のエピトープから分離されている、前記ＰｒＰＣの領域中にある
結合パートナー、ならびに
（ｅ）任意の病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、前記キットを使用するための説明書
を含むキットも提供する。
【００９７】
部位特異的プロテアーゼ
本発明において有用な部位特異的プロテアーゼは、特定の個別のアミノ酸残基のペプチド結合を切断するプロテアーゼである。一般に、部位特異的プロテアーゼは、１つの形式で、または少数の特定のアミノ酸残基において、タンパク質を切断するため、プリオンタンパク質の切断において予測性が可能となる。このような部位特異的プロテアーゼの例は、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）のカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＫまたはＲ残基のカルボキシ側において切断する部位特異的プロテアーゼであるトリプシン、ならびにＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基のカルボキシ側において切断する、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８株由来の部位特異的プロテアーゼであるＳ−Ｖ８である。トリプシン切断の特異性については、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら（１９５０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．４６巻、７０頁；Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ（１９６４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５２巻、８８４〜８８９頁；Ｗａｌｓｈ（１９７０年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９巻、４１頁を参照されたい。Ｓ−Ｖ８切断の特異性については、例えば、Ｄｒａｐｅａｕら（１９７２年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４７巻、６７２０〜６７２６頁、およびＨｏｕｍａｒｄ ら（１９７２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９巻、３５０６〜３５０９頁を参照されたい。トリプシンおよびＳ−Ｖ８は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬの一部門のＰｉｅｒｃｅ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯなどの様々な企業から市販されている。
【００９８】
他のこのような部位特異的プロテアーゼは、当業者により容易に選択することができる。
【００９９】
それに加え、該方法で有用となるには、プリオンタンパク質において、アッセイ法で使用される２種の結合パートナーが認識するエピトープ間の領域に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位があらねばならない。少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼ耐性コア領域（プリオンタンパク質のおよそ９０〜２３１位アミノ酸）内にあり、この部位は、プリオンタンパク質がＰｒＰＣ形態を採る場合にだけ、部位特異的プロテアーゼにより切断され、プリオンタンパク質がＰｒＰＳｃ形態を採る場合には、切断されることはなかろう。該エピトープの少なくとも１つは、プリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア領域にあるのが好ましかろう。少なくとも１つの他のエピトープは、プリオンタンパク質のアミノ近接領域内に位置するのが好ましく、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内に位置するのが、より好ましかろう。好ましくは、部位特異的プロテアーゼは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内の部位で切断しない。オクタリピート領域の反復コア配列は、ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）であるが、これは、様々な種からのプリオンでは若干変化し得る（オクタリピート配列を示す異なる１０種のプリオンタンパク質の配列については、図１Ａおよび１Ｂまたは２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。一部の文献では、オクタリピート領域の反復コア配列は、Ｐ（Ｈ／Ｑ）ＧＧＧ（−／Ｔ）ＷＧＱ（例えば、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）（配列番号１２）と開示されたが、これは、本明細書に開示したオクタリピート配列を若干、移動・変化させたものであるとはいえ、両オクタリピート配列は、明らかに同じ領域に関係している。図３は、オクタリピート領域、例示的なエピトープ部位、および例示的な部位特異的プロテアーゼ切断部位を示す、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃ形態の概略表示を示す。部位特異的プロテアーゼは、ＥＬＩＳＡで使用される２種の結合パートナー、好ましくは抗プリオン抗体が認識するエピトープ間の少なくとも１つの部位で、ＰｒＰＣ形態を切断することになろう。したがって、ＰｒＰＣ形態は、ＥＬＩＳＡで検出されることはなかろう。しかし、ＰｒＰＳｃ形態は、このイソフォームの立体構造が当該部位をプロテアーゼ切断に対して利用不能にするので、２個のエピトープ間の領域で部位特異的プロテアーゼにより切断されることはなかろう。したがつて、ＰｒＰＳｃはＥＬＩＳＡで検出されよう。
【０１００】
プロテアーゼ処理
上記のように、分析しようとする試料は、当然ながら多量のＰｒＰＣを含有し得る。ＰＫは、ＰｒＰＣ形態を消化して、耐性のより高いＰｒＰＳｃ形態を残すために、他の状況で使用されてきた。しかし、ＰｒＰＳｃは、ＰＫ処理がこの病原型の感染性を低下させるという事実で示されるように、高濃度のＰＫおよび／または長い曝露時間を使用すれば、タンパク分解に対して完全には耐性でない。ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい。そのため、ＰＫ処理は、ＰｒＰＣ形態を完全に切断するが、ＰｒＰＳｃ形態の耐性コアを無傷で残すために、注意深く制御しなければならない。ＰＫ消化が過少であれば、残存ＰｒＰＣ形態をを残して、検出段階で擬陽性を生じ、ＰＫ消化が過多であれば、ＰｒＰＳｃ耐性コアを切断して、検出段階で検知不能となろう。それに加え、該病原型が複数の立体構造を採ることができるため、ＰｒＰＳｃの特定のＰＫ消化部位（複数も）は変化するが、ＰｒＰＳｃのＰＫ消化は、９０〜２３１位残基あたりに複数のプロテアーゼ耐性断片を通常生成し、このため、この領域中のエピトープに対して向けられる抗プリオン抗体の結合が、低下または消失することもある。Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、２０７９〜２０８２頁を参照されたい。
【０１０１】
本開示では、病原型プリオンタンパク質を含有する疑いのある試料は、任意の非病原性プリオンタンパク質が実質的に完全に消化されると思われる条件下で、選定した部位特異的プロテアーゼで処理される。当業者には、適当な条件を決定するだけの能力がある。実質的に完全な消化条件は、組換えＰｒＰを用いた試験により、容易に決定することができる。部位特異的プロテアーゼとしてトリプシンについては、通常、好ましくは１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．２Ｍ ＣａＣｌ２入りのＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１時間、３７℃に対して、トリプシン濃度５０μｇ／ｍｌ、およびＴＢＳＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％サルコシル）中で１時間、３７℃に対して、トリプシン濃度１０μｇ／ｍｌが、共に十分である。
【０１０２】
非病原性プリオンタンパク質の実質的に完全な消化の後、例えば、検出に使用されることになる抗プリオン抗体の更なる何らかのプロテアーゼ消化を防止するために、部位特異的プロテアーゼを除去、不活性化または阻害しなければならない。該プロテアーゼは、１種または複数のプロテアーゼ阻害剤の添加により阻害し得る。プロテアーゼ阻害剤は、当技術分野で周知であり、それには、とりわけ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）および１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＬＣＫ）が挙げられる。あるいは、一部のプロテアーゼは、従来手段（例えば、遠心分離、ろ過など）により反応物から容易に除去できる固定化型（例えば、アガロースマトリックス中）で入手できる。
【０１０３】
変性
部位特異的プロテアーゼによる試料の消化および該プロテアーゼの阻害／除去をした後、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある消化済み試料は、エピトープを感度良く検出するために、変性される。
【０１０４】
変性は、幾つもの方法で実現することができる。一実施形態では、カオトロピック剤、好ましくはグアニジニウム化合物、例えばグアニジンチオシアネートまたは塩酸グアニジンが、３Ｍ〜６Ｍの間の濃度まで添加される。こうした濃度のカオトロピック剤の添加は、病原性プリオンタンパク質を変性させる。この実施形態については、カオトロピック剤は、結合パートナー、例えばＥＬＩＳＡで使用する抗プリオン抗体のプリオンエピトープへの結合を妨害すると見込まれるので、検出を行う前に除去または希釈しなければならない。
【０１０５】
別の実施形態では、変性は、ｐＨを１２以上（「高ｐＨ」）へ上げること、またはｐＨを２以下（「低ｐＨ」）へ下げることのいずれかで、実現される。ｐＨ解離／変性技法の詳細は、その開示内容の全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ第２００６／００１４３７号および米国特許出願第１１／５１８０９１号に記載されている。未変性ＰｒＰＳｃの高ｐＨまたは低ｐＨいずれかへの曝露によって、病原性プリオンタンパク質の変性が起こる。この実施形態では、ＰｒＰＳｃの高ｐＨへの曝露が好ましい。１２．０〜１３．０の間のｐＨが、一般に十分であり、好ましくは１２．５〜１３．０の間のｐＨが使用され、より好ましくは１２．７〜１２．９のｐＨ、最も好ましくは１２．９のｐＨが使用される。あるいは、ＰｒＰＳｃの低ｐＨへの曝露を、病原性プリオンタンパク質を変性させるために、使用することができる。この代替法については、１．０〜２．０の間のｐＨが十分である。プロテアーゼ消化試料の高ｐＨまたは低ｐＨいずれかへの曝露は、ほんの短時間、例えば６０分間、好ましくは１５分間以下、より好ましくは１０分間以下、実施される。これより長く曝露すると、検出工程で使用する結合パートナーにより認識されるエピトープが破壊されるほど、病原性プリオンタンパク質の構造が相当に劣化する恐れがある。
【０１０６】
ＰｒＰＳｃの変性に十分な時間曝露した後、酸性試薬（高ｐＨの変性条件を使用した場合）または塩基性試薬（低ｐＨの変性条件を使用した場合）いずれかの添加によって、ｐＨを中性（即ち、約７．０〜７．５の間のｐＨ）に容易に再調整することができる。当業者は、適当な手順を容易に決定することができ、実施例が、本明細書に記載されている。変性工程で使用する高ｐＨまたは低ｐＨは、小容量の適切な酸または塩基の添加により、中性に容易に再調整できるので、この実施形態によって、追加の洗浄をせず、試料容量をさほど増加させずに、検出工程、例えばＥＬＩＳＡにおける直接使用が可能になる。
【０１０７】
一般に、高ｐＨの変性条件を生み出すには、約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度へのＮａＯＨの添加で十分である。好ましくは、ＮａＯＨが０．０５Ｎ〜０．１５Ｎの間の濃度へ添加され、より好ましくは０．１Ｎ ＮａＯＨが使用される。ＰｒＰＳｃの変性が実現した後、酸性溶液、例えばリン酸、一塩基性リン酸ナトリウムを適量添加することにより、中性（即ち、約７．０〜７．５の間）にｐＨを再調整することができる。
【０１０８】
一般に、低ｐＨの変性条件を生み出すには、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度へのＨ３ＰＯ４の添加で十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４が０．３Ｍ〜０．６Ｍの間の濃度へ添加され、より好ましくは０．５Ｍ Ｈ３ＰＯ４が使用される。ＰｒＰＳｃの変性が実現した後、塩基性溶液、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨを適量添加することにより、中性（即ち、約７．０〜７．５の間）にｐＨを再調整することができる。
【０１０９】
変性試料は、ＰｒＰＳｃを更に検出するために使用することができる。
【０１１０】
検出
変性したＰｒＰＳｃは、プリオン配列に特異的な少なくとも２種の結合パートナーで検出でき、一方の結合パートナーが、変性ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域にあるエピトープに特異的に結合し、他方の結合パートナーが、プロテアーゼ切断によりＰｒＰＣ中ではもはや利用できない、変性ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアにあるエピトープに特異的に結合する。
【０１１１】
該方法のある種の実施形態では、結合パートナーは抗体であり、こうした中の好ましい実施形態は、ＥＬＩＳＡを用いて実施される検出工程を有する。
【０１１２】
他のある種の実施形態では、該方法で使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【０１１３】
プリオン、特にＰｒＰＣまたは変性ＰｒＰに結合する抗体、修飾抗体および他の試薬は、これまでに記載されており、こうしたものの一部は市販されている（例えば、Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４頁；Ｐｅｒｅｔｚら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１２巻、７３９頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２巻、９４１３頁；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）上記参照；米国特許第６７６５０８８号に記載の抗プリオン抗体を参照されたい）。こうしたものの一部および他のものは、とりわけ、Ｉｎ Ｐｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ， Ｚｕｒｉｃｈから市販されている。修飾抗体の記載については国際公開第０３／０８５０８６号も参照されたい。
【０１１４】
好ましい抗プリオン抗体は、病原性プリオンの変性型に結合する抗体となろう。
【０１１５】
特に好ましい第１の抗体は、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内に位置する第１のエピトープに対する抗体となろう。このような抗体の例は、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７である。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ４巻、８０５〜８１４頁；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）。
【０１１６】
ある種の実施形態では、第１の抗体は、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと結合しよう。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる（例えば、Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁を参照されたい）。
【０１１７】
好ましい第２の抗体は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、プロテアーゼ切断によりＰｒＰＣ中ではもはや利用できない、第２のエピトープを認識する抗体となろう。ＰｒＰＣのプロテアーゼ耐性コア領域中のトリプシンに対する第１の切断部位は、Ｓ−Ｖ８に対する相当部位と異なるので（ヒトＰｒＰに従って付番した場合、トリプシンに対してＫ−１０６およびＳ−Ｖ８に対してＤ−１４４）、トリプシン消化ＰｒＰＳｃには、Ｓ−Ｖ８に対するより、有用なエピトープが存在することになろう。
【０１１８】
トリプシンで消化される実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４（米国特許第４８０６６２７号）、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９（ＰＯＭ抗体については、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ４巻、８０５〜８１４頁を参照されたい）、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０（Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号）、Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４頁）、６Ｈ４（Ｌｉｕら（２００３年）Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１巻、１０６５頁）およびＢＤＩ１１５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）などのモノクローナル抗体が挙げられる。３Ｆ４抗体は、ヒトＰｒＰの１０９〜１１２位アミノ酸にあるエピトープＭＫＨＭを認識する。他の抗体は、ヒトＰｒＰ種に従って付番した場合、約１０７位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域内にある各種エピトープを認識する。
【０１１９】
トリプシンを使用する方法のある種の実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置するエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１２０】
Ｓ−Ｖ８で消化される実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１２１】
他の抗プリオン抗体は、当技術分野で周知の方法により容易に生成することができる。
【０１２２】
本明細書における開示から、当業者であれば、第１および第２の抗体は、第１の抗体が、アミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域にある第１のエピトープに特異的に結合し、第２の抗体が、ＰｒＰＣ中では切断・除去されてしまった、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアの領域内にある第２のエピトープに特異的に結合するように、選択されることが理解されよう。このようにして、部位特異的プロテアーゼによる消化の後、第１および第２の抗体により認識されるエピトープは、ＰｒＰＣの異なる断片上に存在する（そのため、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出できない）が、これらのエピトープは、ＰｒＰＳｃの単一断片上に存在する（そのため、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出できる）ことになろう。
【０１２３】
一部の抗プリオン抗体は、１つまたは限定数の動物種に由来するプリオンタンパク質に特異的であり、他の該抗体は、多くの動物種に由来するプリオンタンパク質に結合できる。分析しようとする試料および試験目的に基づいて適切な抗プリオン抗体を選定することは、明白であろう。
【０１２４】
プロテアーゼ消化し、変性した病原性プリオンタンパク質は、好ましくは、直接ＥＬＩＳＡ型または抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイのいずれかとしてのＥＬＩＳＡ型アッセイで検出されるが、これらのアッセイについては以下でより十分に説明する。抗プリオン抗体による検出を述べるために、用語「ＥＬＩＳＡ」を使用するが、このアッセイは、抗体が「酵素結合」されているアッセイに限らない。検出抗体は、本明細書に記載され、免疫アッセイ技術分野で周知の検出可能標識のいずれかで標識することができる。
【０１２５】
該方法の好ましい実施形態では、プロテアーゼ消化し、変性した病原性プリオンタンパク質は、抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて検出される。この実施形態では、変性プリオンタンパク質は、捕捉抗体を含む固体支持体上に捕捉されるが、その抗体は、異なる実施形態において第１の抗体、第２の抗体いずれの場合もある。捕捉プリオンタンパク質を有する固体支持体は、未結合物質を除くために、場合により洗浄し、次いで、検出抗体が捕捉プリオンタンパク質に結合するのを可能にする条件下で、捕捉抗体がどんなものであるか（捕捉抗体は検出抗体と異なる）に応じて、第２の抗体、第１の抗体いずれの場合もある検出抗体と接触させる。前記サンドイッチＥＬＩＳＡを実施する方法は、良く知られており、本明細書の実施例に記載されている。
【０１２６】
適切な固体支持体には、不溶性マトリックスであり、病原性プリオン特異試薬を結合または結び付けできる、剛直または半剛直な表面を有する任意の材料が含まれる。例示的な固体支持体には、それだけに限らないが、ニトロセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、多糖類、ポリフッ化ビニル；ジアゾ紙；活性化ビーズ、磁気応答ビーズ、ならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリッド形成反応、免疫アッセイおよび他のそのような応用に汎用される任意の材料が挙げられる。該支持体は、粒状でもよく、または連続表面の形態を採ってもよく、それには膜、メッシュ、板、ペレット、スライド、円板、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、中実繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、多孔ガラスビーズ、シリカゲル、場合によりジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によりＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズ、ならびに疎水性ポリマーをコートしたガラス粒子などの基質が挙げられる。第１の抗体に対する好ましい固体支持体は、マイクロタイタープレートである。
【０１２７】
好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体または検出抗体のいずれかは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内にあるエピトープを認識する。幾つかの実施形態では、検出抗体は検出可能に標識される。更なる実施形態では、検出抗体は酵素で標識される。
【０１２８】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーはアプタマーである。アプタマーは、抗体の分子認識性を有する核酸である。アプタマーは、抗体より小さく、抗体ほど複雑ではないため、製造および修飾をより容易にし得る。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら（１９９７年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １巻、５〜９頁；Ｂｕｎｋａら（２００６年）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４巻、５８８〜５９６頁を参照されたい）。タンパク質エピトープに特異的なアプタマーを生成する方法は、容易に入手できる（例えば、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、５０５〜５１０頁；Ｃｏｘら（１９９８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １４巻、８４５〜８５０頁；Ｃｏｘら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻、ｅ１０８頁を参照されたい）。アプタマーは、検出容易な活性を有する酵素に結合することができる（例えば、Ｄｒｏｌｅｔら（１９９６年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻、１０２１頁を参照されたい）。
【０１２９】
病原性プリオンに対する上記の検出法のいずれも、任意の試料においてプリオン関連疾患を診断する方法において使用することができる。
【０１３０】
本明細書に記載の方法で使用するために、試料は、病原性プリオンタンパク質を含有することが知られている、または疑われる任意の試料でもよい。幾つかの実施形態では、試料は、生体試料（即ち、生存中または死後の生物体）または非生体試料である。幾つかの実施形態では、試料は生体試料である。生体試料の非限定的例は、臓器（例えば、脳、肝臓および腎臓）、細胞、全血、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、筋肉および脂肪組織（例えば、肉）、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検、剖検、生存中または死後の生物体から供給される食物、ならびに植物材料などの他の任意の有機物である。幾つかの実施形態では、生体試料は、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球または血清を含む。生体試料は、血液の提供もしくはスクリーニング、生検、検視もしくは剖検などの保健関連の手順中に、または動物の選択および屠殺ならびに最終製品の品質保証試験などの食品調製の工程もしくは手順中に得ることができる。幾つかの実施形態では、試料は非生体試料である。非生体試料の非限定的例には、医薬品、化粧品およびパーソナルケア製品、汚染機器、ならびに生存中または死後の生物体以外から供給される食物などが挙げられる。
【０１３１】
適切な対照も、本明細書に記載のアッセイで使用することができる。例えば、ＰｒＰＣの陰性対照が、該アッセイで使用することができる。ＰｒＰＳｃ（またはＰｒＰｒｅｓ）の陽性対照も、該アッセイで使用することができる。このような対照には、場合により検出可能に標識することができる。
【０１３２】
キット
部位特異的プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤（任意選択）、変性剤（または変質剤、任意選択）、抗体などの抗プリオン結合パートナーなどを含む上記のアッセイ試薬は、上記の検出アッセイを行うために、適切な使用説明書および他の必要試薬と共に、キットに入れて提供することができる。該キットは、上記のように、適切な陽性および陰性対照を更に含有し得る。該キットは、使用する特定の検出アッセイに応じて、適切な標識、ならびに他の包装入り試薬および材料（即ち、洗浄緩衝液など）を含有することもできる。
【実施例】
【０１３３】
本明細書に開示した発明をより効率的に理解できるように、実施例を以下に示す。こうした実施例は、例示だけを目的としており、本発明をいかようにも限定しようとするものではないことを理解されたい。
【０１３４】
（実施例１）
３Ｆ４凍結乾燥プレートのコーティング
以下に示す幾つかの実施例における捕捉抗体として、市販のモノクローナル抗体３Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）を使用した。これは、ヒトプリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア領域に位置する、１０９〜１１２位残基（アミノ酸ＭＫＨＭ）を特異的に認識する。それをコーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９）中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、撹拌しながら室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。希釈抗体３Ｆ４を、１５０μＬ／ウェルの容量でＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ ＭｉｃｒｏＬｉｔｅ ２＋の各マイクロプレートに添加し、次いで湿気を含んだラップ密封トレー中でＲＴで終夜インキュベートした。プレートは、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｌｘ４５０洗浄器上でＴｗｅｅｎ ２０入りＴｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液（３％スクロース入りＴｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に０．０１×ＢｌｏｃｋｅｒＣａｓｅｉｎ）を、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｌｘ４５０洗浄器上で３００μＬ／ウェルの容量でプレートに分配し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートは、１６℃で終夜凍結乾燥し、各プレートを乾燥剤３個入りのパウチ中に入れ、二重に密封し、４℃で保存した。一般に、すべての被覆プレートは、使用前に、３７℃で１時間、０．０２％カゼインでブロックした。
【０１３５】
（実施例２）
正常ヒト血漿試料のトリプシン消化
（Ａ）トリプシンによる血漿の消化
トリプシンが、ＰｒＰＣを分解し、ＥＬＩＳＡによるその検出を不能にするか否かを試験するために、ＴＢＳＴ中の１０％正常ヒト血漿を、増加するトリプシン濃度で処理した（表１）。この実施例および以下の実施例で使用したトリプシンは、Ｐｉｅｒｃｅ（ＴＰＣＫ Ｔｒｙｐｓｉｎ、カタログ番号２０２３３）から得た。消化物は、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした。消化は、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、最終濃度１ｍＭ）を添加し、ＲＴで１５分間、インキュベーションすることにより停止させた。トリプシン処理試料は、１％（正常ヒト血漿に対し）に希釈し、１５０μＬをＥＬＩＳＡ用の各ウェル中で使用した。
【０１３６】
（Ｂ）ＰｒＰＣのＥＬＩＳＡ分析
捕捉抗体として３Ｆ４、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートしたＰＯＭ２抗体（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、上記）による検出を用いて、光検出のために化学発光基質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＰｒＰＣの有無について試料を試験した。ＰＯＭ２は、５９〜９１位残基内にあるオクタリピートエピトープを特異的に認識する。
【０１３７】
手短に言うと、トリプシン処理血漿試料をＴＢＳＴ中１％（元のヒト血漿に対し）に希釈し、１５０μＬ／ウェルの容量で３Ｆ４被覆プレートへ移した。プレートを４００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした後、ＴＢＳＴで６回洗浄した。ＡＰコンジュゲートＰＯＭ２検出抗体（０．０１μｇ／ｍＬ）を１５０μＬ／ウェルの容量でプレート中に添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートを再びＴＢＳＴで６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質１５０μＬ／ウェルをプレートに添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし、シグナルをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。その結果を表１に示し、測定単位を相対発光量（ＲＬＵ）で規定している。
【０１３８】
【表１】
この結果は、トリプシンがヒト血漿中のＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣの検出が、より高いトリプシン濃度で処理した試料では無効になったことを示している（表１）。検出ＰｒＰＣレベルとトリプシン濃度との間に用量応答が見出された。トリプシン濃度４００μｇ／ｍＬでは、ＰｒＰＣレベルが、バックグランドレベルの１／１００に低下した。
【０１３９】
（実施例３）
シリアンハムスターの正常脳ホモジェネート試料のトリプシン消化
この実施例では、シリアンハムスター（ＳＨａ）の正常脳ホモジェネート（ＢＨ）中に存在するＰｒＰＣのトリプシン消化を試験した。
【０１４０】
１０％のＳＨａ ＢＨ（ｗ／ｖ）５μＬを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．２Ｍ ＣａＣｌ２入りのＴＢＳＴ中で、７５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、増加するトリプシン濃度（表２）でトリプシン５μＬと混合した。各消化試料をＴＢＳ１４０μＬの添加により希釈し、１００ｍＭ ＰＭＳＦ１．５μｌ／ウェルの添加（最終ＰＭＳＦ濃度１ｍＭとする）、および７５０ｒｐｍの振とうを伴うＲＴで１０分間のインキュベーションによって、消化を停止させた。
【０１４１】
トリプシン消化ＳＨａ ＢＨ試料は、実施例２に記載のように、捕捉抗体として３Ｆ４、およびＡＰコンジュゲートＰＯＭ２抗体による検出を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＰｒＰＣの有無について試験した。消化溶液各１５０μＬを３Ｆ４被覆マイクロプレートの各ウェル中へ移し、３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、０．０１×カゼイン−ＴＢＳＴ中のＡＰコンジュゲートＰＯＭ２ ０．０１μｇ／ｍＬを１５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。基質を添加し、実施例２に記載のように、プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。その結果を表２に示す。
【０１４２】
【表２】
ヒト血漿の結果と同様、トリプシンは、ＳＨａ脳ホモジェネート中のＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣの検出は、やはり無効になった（表２）。血漿とは対照的に、脳ホモジェネート中のＰｒＰＣの効率的分解が、血漿中のＰｒＰＣの効率的分解に必要なトリプシン濃度より遥かに低い、トリプシン濃度２５μｇ／ｍＬで実現された。
【０１４３】
（実施例４）
シリアンハムスターの脳ホモジェネート試料のトリプシンおよびＰＫ消化、ならびにＰＯＭおよび３Ｆ４抗体による検出
この実施例では、異なる４対のモノクローナル抗体ならびにＰＫおよびトリプシンの濃度１点を用いて、シリアンハムスターの病原型プリオンＰｒＰＳｃのＥＬＩＳＡ検出に対する、トリプシンおよびＰＫ消化の効果を比較した。
【０１４４】
（Ａ）トリプシンまたはＰＫによるＳＨａ ＢＨの消化、および消化試料の変性
５％のＳＨａ ＢＨ試料（正常または感染）２μＬを、同一濃度の２５μｇ／ｍＬ、各最終反応容量２μＬのトリプシンまたはＰＫで、３７℃で１時間処理した。消化は、ＰＭＳＦ（２ｍＭ、ＲＴで１０分間）で停止させた。
【０１４５】
抗体のＰｒＰＳｃに対する最大限の結合を確保するために、試料を塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）で変性させた（最終濃度３Ｍ、ＲＴで１時間）。次いで、変性試料を０．１Ｍ ＧｄｎＨＣｌに希釈し、様々なｍＡｂで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加した。
【０１４６】
（Ｂ）ＰｒＰＳｃのＥＬＩＳＡ分析
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９中、２．５μｇ／ｍＬのｍＡｂとして３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７の１５０μＬで、４℃で終夜コーティングした。使用前に、プレートを０．０２％カゼインで３７℃で１時間ブロックした。ＰＯＭ１７は、約９０〜２３１位残基のプロテアーゼ耐性断片内にあるエピトープ、特に、約１２２〜２３１位残基の球状ドメイン内にあるエピトープを認識する。
【０１４７】
プロテアーゼ消化した後、変性したＳＨａ ＢＨ試料を、３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７で被覆したプレートへ、最終容量１５０μＬ／ウェルで移した。プレートを３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗浄した。共に最終濃度０．０１μｇ／ｍＬのＡＰコンジュゲートＰＯＭ２（ＰＯＭ２ＡＰ）またはＡＰコンジュゲートＰＯＭ１７（ＰＯＭ１７ＡＰ）を、最終容量１５０μＬ／ウェルでプレート中に添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートを再びＴＢＳＴで洗浄し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質を添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし、実施例２に示すように、シグナルを読み取った。このサンドイッチＥＬＩＳＡ実験の結果を表３に示す。
【０１４８】
【表３】
表３に示した結果から、ＰＫは、トリプシン消化試料と比較して、全例において検出シグナルを低下させることが判明した。感染脳ホモジェネートにおける検出抗体または捕捉抗体のいずれかとしてＰＯＭ２を使用したとき（１、３および４行目）、トリプシンおよびＰＫの消化試料間で７０％超の低下が認められた。例えば、３Ｆ４／ＰＯＭ２ＡＰ（捕捉／検出）で得たシグナルは、２３７０から５２７ＲＬＵへ低下した。同様な比率のシグナル低下が、ＰＯＭ２／ＰＯＭ１７ＡＰよびＰＯＭ１７／ＰＯＭ２ＡＰについても認められた。シグナル低下の原因は、ＰＯＭ２に認識され、２３〜８９位残基内にあるオクタリピートエピトープのＰＫ消化である。
【０１４９】
感染脳ホモジェネート試料をＰＫで処理し、３Ｆ４／ＰＯＭ１７ＡＰで検出したとき、これらの抗体に対するエピトープがプロテアーゼ耐性コア中にあっても、シグナルの２０％低下も認めた。このシグナル低下は、制限されたＰＫ消化でも、９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性断片に影響し得ることを示唆している。ＰｒＰのオクタリピート領域に特異的に結合するＰＯＭ２を、トリプシン消化後の検出抗体として使用したとき、最高の読取値が認められたことは、注目に値する。ＰＯＭ２を捕捉抗体として使用したとき、２番目に高い読取値が認められた。結論として、４個のオクタリピートの存在下で、ＰＯＭ２は、複数のエピトープに結合し、そのため、１個だけのエピトープを認識するＰＯＭ１７、３Ｆ４などの抗体より強力な結合を有する。
【０１５０】
（実施例５）
様々な種のＰｒＰに対する抗ＰｒＰ抗体のスクリーニング
オクタリピート領域に対するモノクローナル抗体のＳＡＦ−３２を含め、表４に示すような多数の抗ＰｒＰ抗体について、様々な動物種の組換えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）およびマウスＰｒＰＳｃに対する結合能をスクリーニングした。
【０１５１】
【表４】
（Ａ）各種ＰｒＰによるプレートのコーティング
こうした工程の後で、幾つかのマイクロプレートをウシ、シカ、ヒト、ヒツジまたはマウスの組換えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）でコーティングした。各ｒＰｒＰを、１、０．１、０．０１および０．００１μｇ／ｍｌに希釈し、３Ｍグアニジンチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）中で変性させ、ＲＴで１０分間インキュベートし、変性ｒＰｒＰの１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに２ウェルずつ添加した。次いで、各ウェルに０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８を１００μｌ添加し、プレートを４℃で終夜インキュベートした。
【０１５２】
こうした工程の後で、他のマイクロプレートはマウスＢＨのＰｒＰＳｃでコーティングした。ＰｒＰＳｃ感染マウスＢＨ（４００μＬの１０％ＢＨ）を、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳ中で融解し、４℃で１時間の遠心２００００ｒｐｍで沈降させた。その沈澱をｐＨ７．５のＴＢＳ１ｍＬで各々洗浄し、４℃で１０分間の遠心２００００ｒｐｍで再沈降させた。そのペレット各々を３ＭのＧｄｎＳＣＮ ４ｍＬ中に再懸濁させて、最終濃度を１％ＢＨに到達させ、ＲＴで１５分間で変性させた。変性ＢＨ試料を３ＭのＧｄｎＳＣＮ中０．１％、０．０１％および０．００１％に希釈し、各濃度のＢＨを１００μｌ／ウェル、プレートに二重に添加した。０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８の１００μｌ／ウェルを、ＢＨ試料の各ウェルに添加した。インキュベーションを４℃で終夜行った。
【０１５３】
（Ｂ）各種抗体の被覆ＰｒＰに対する結合を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ
各プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、各ウェルを２００μＬのＴＢＳ中３％ＢＳＡでブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。緩衝液を吸引した後、スクリーニングしようとする一次抗体１００μＬ／ウェルを、１％ＢＳＡ入りＴＢＳ中に０．５μｇ／ｍｌで添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した後、スクリーニングされる一次抗体に結合し、１％ＢＳＡ入りＴＢＳ中に１：５０００で希釈された、ＡＰコンジュゲート二次抗体１００μＬ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで６回再び洗浄した。０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質１００μＬ／ウェルを添加し、３７℃で３０分間、インキュベートした。シグナルをルミノメーターで読み取り、各ＰｒＰの異なる被覆量２点、即ち、各ｒＰｒＰに対してアッセイ当たり０．１ｎｇおよび１ｎｇ、ならびにマウスＢＨのＰｒＰＳｃに対してアッセイ当たり０．１ｍｇおよび１ｍｇに関する結果を表５に示す。
【０１５４】
表５における結果は、オクタリピート領域を特異的に認識するＳＡＦ−３２が、試験したすべての動物種、即ちウシ、シカ、ヒト、ヒツジおよびマウスのＰｒＰタンパク質に結合したことを示す。ＳＡＦ−３２の最強の結合は、ウシ、シカ、ヒトおよびヒツジのｒＰｒＰに対する結合であった。この結果は、ＳＡＦ−３２と脳ホモジェネート中のマウスＰｒＰＳｃとの間にも、相当程度の結合を示した。
【０１５５】
【表５】
（実施例６）
プロテアーゼ処理し、変性を伴うまたは伴わない、ヒト正常またはｖＣＪＤ ＢＨ試料におけるＰｒＰのＳＡＦ−３２および３Ｆ４ＡＰ抗体を用いた検出
この実施例では、ヒト正常またはｖＣＪＤ感染ＢＨ試料をトリプシンまたはＰＫで処理し、次いで変性させるか、または変性させないままにした後、捕捉抗体としてＳＡＦ−３２および検出抗体として３Ｆ４ＡＰを用いて検出した。
【０１５６】
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨ２ＣＯ３３、ｐＨ８．８中で希釈した３．３μｇ／ｍＬのＳＡＦ−３２を１５０μＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜コーティングし、ＴＢＳＴで洗浄し、使用前に、３７℃で１時間、１％カゼインでブロックした。
【０１５７】
１０％ヒト正常またはｖＣＪＤ ＢＨ試料（ｗ／ｖ）１μｌを、トリプシンまたはＰＫの最終濃度が２５μｇ／ｍＬとなるようにトリプシンまたはＰＫを有する、ＴＢＳＴＴ（ＴＢＳ、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−００）の１μＬに添加した。プロテアーゼによる消化を３７℃で１０分間、実施した後、２ｍＭのＰＭＳＦで停止させた。消化試料を変性させないままか、または４ＭのＧｄＨＣｌによりＲＴで１時間変性させた。非変性試料は、ＴＢＳＴで１５０μＬに希釈した。変性溶液は、最終濃度が０．１ＭのＧｄＨＣｌとなるように、ＴＢＳＴで１５０μＬに希釈した。試料を、ＳＡＦ−３２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で被覆したマイクロプレートに、容量１５０μＬ／ウェルで４℃で終夜の間添加した。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＡＰコンジュゲート３Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｓ）の１５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、既述した実施例に示すように、シグナルのレベルをルミノメーターで測定した。測定単位は、相対発光量（ＲＬＵ）で規定される。結果は、表６および図４に示されており、ｖＣＪＤ試料と正常試料との結果の比率を計算し、表７に示してある。
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
【表７】
結果に示すように、トリプシンまたはＰＫによる処理は、正常組織中のＰｒＰＣを大部分またはすべて消化し、検出は、変性後にようやく５０．４ＲＬＵ以下であった。非変性ｖＣＪＤ組織は、何ら有意の読取値を示さなかった。したがって、ＳＡＦ−３２および３Ｆ４の抗体併用によるＰｒＰＳｃの効率的検出には、ＰｒＰＳｃの変性が必要であると結論することができる。
【０１６０】
それに加え、本実施例における結果は、ｖＣＪＤ ＢＨ試料のトリプシンによる処理と、その後の変性が、正常ＢＨ試料で検出されるシグナルより３２倍高い、１６５３ＲＬＵの強いシグナルを生じることを示した。ＰＫによるｖＣＪＤ試料の同様な処理は、トリプシン処理と比較して、２２６ＲＬＵの遥かに低いシグナルを生じており、このシグナルは、ＰＫ処理正常試料で検出されるシグナルより１２．５倍高い。この実施例も、ＰｒＰＳｃＮ末端中のオクタリピート領域内で切断するＰＫ消化後のＰｒＰＳｃの検出は、オクタリピート領域に影響しないトリプシン処理後のＰｒＰＳｃの検出より劣ることを示している。この効果は、共にオクタリピート領域に結合する異なる２種の抗体、ＰＯＭ２およびＳＡＦ−３２を用いた、本実施例および実施例４において今や認められる。この知見により、トリプシン処理と組み合わせた、オクタリピート領域に対する各種抗体の使用が、単一エピトープに対する抗体の使用および／またはＰＫ処理より、ＰｒＰＳｃ検出の感度増加を起こすことが示唆される。
【０１６１】
（実施例７）
様々な消化条件下における、トリプシンおよびＰＫによるシリアンハムスター脳ホモジェネートの消化比較
最近の報告（米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）では、ＰＫで軽く処理すれば、ＰｒＰＣを効率的に除去すると同時に、ＰｒＰＳｃのオクタリピートエピトープのすべてまたは一部を保持し、オクタリピートに結合する抗体の使用により、検出を増強できるのではないかと示唆されている。本実施例における２つの実験の目的は、シリアンハムスター（ＳＨａ）の脳ホモジェネート（ＢＨ）からＰｒＰＣを除去すると同時に、ＳＨａのＰｒＰＳｃ検出の感度を維持する上でのＰＫ消化の有効性を、トリプシン消化を用いる本発明の方法と、様々な消化条件下で比較することである。
【０１６２】
ＳＨａの１０％正常またはスクレイピー感染ＢＨ（ｗ／ｖ）１μＬの消化を、トリプシンまたはＰＫの増加する量（０〜１００μｇ／ｍＬ）で、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．０２Ｍ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ５０μＬ中、３７℃で１０分間行なった。各消化を、ＲＴで１５分間、２ｍＭのＰＭＳＦで停止させ、０．１Ｎ ＮａＯＨの７５μＬで１０分間変性させ、次いで０．３Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４の３０μＬで、ＲＴで５分間中和した。
【０１６３】
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨ２ＣＯ３、ｐＨ８．９中で希釈した２．５μｇ／ｍＬの３Ｆ４の１５０μＬで、４℃で終夜コーティングし、ＴＢＳＴで洗浄し、使用前に０．１％カゼインでブロックした。
【０１６４】
消化試料各１５０μＬ／ウェルを、ＥＬＩＳＡアッセイのために３Ｆ４被覆プレートに添加した。プレートを４℃で終夜インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、検出抗体のＰＯＭ２ＡＰ（０．０１μｇ／ｍＬ）またはＰＯＭ１７ＡＰ（０．１μｇ／ｍＬ、アッセイ感度がＰＯＭ２と同等になるように）１５０μＬをウェル毎に添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、基質（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、前の実施例に示すように、シグナルのレベルをルミノメーターで測定した。測定単位は、相対発光量（ＲＬＵ）で規定される。
【０１６５】
ＰＯＭ２ＡＰで行なった実験の結果を表８および図５に示し、ＰＯＭ１７ＡＰの結果を表９および図６に示す。両実験（ＰＯＭ２ＡＰおよびＰＯＭ１７ＡＰ）に対するシグナル／正常比の計算を行い、表１０に示す。
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
【表１０】
表８および図５に示すように、ＰＯＭ２ＡＰで検出したとき、プロテアーゼで全く処理していない正常ＢＨ試料は、高いＰｒＰＣ含量のために２０００ＲＬＵあたりのシグナルを有する。トリプシン５０μｇ／ｍＬで処理すると、この値が３ＲＬＵのバックグランドレベルに低下した。スクレイピー感染ＢＨ試料をトリプシン５０μｇ／ｍＬで同様に処理すると、検出レベル１５４４ＲＬＵが得られ、正常に対するスクレイピー感染シグナル（Ｓ／Ｎ）は４４７倍であり、トリプシン１００μｇ／ｍＬで処理すると、Ｓ／Ｎは３４６倍となった。ＰＫ５０μｇ／ｍＬで処理すると、Ｓ／Ｎは７３倍に過ぎず、ＰＫ１００μｇ／ｍＬでは、スクレイピー感染シグナルが大部分消失し、Ｓ／Ｎは１７．５倍であった。
【０１６９】
表９および図６に示すように、ＰＯＭ１７ＡＰで検出したとき（ＰＯＭ２ＡＰより１０倍高い濃度で）、スクレイピー感染試料におけるＰｒＰＳｃの検出は、トリプシン５０μｇ／ｍＬで処理後に最大で、Ｓ／Ｎ５６０で示されるのに対し、ＰＫによる最良の検出は、ＰＫ１０μｇ／ｍＬでのＳ／Ｎ２２９であった。ＰＫ１００μｇ／ｍＬでは、スクレイピー感染シグナルが４．７ＲＬＵに弱まり、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアの完全な分解が示唆された。同様なトリプシン濃度１００μｇ／ｍＬでは、ＲＬＵが３４５であった。
【０１７０】
ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰのいずれかを用いた、表１０に要約したような結果から、ＰｒＰＳｃの検出は、所与の任意のプロテアーゼ濃度で、ＰＫよりトリプシンを用いた方が良好に観察され、トリプシン消化試料のより高いＳ／Ｎ値で示された。
【０１７１】
ＰＫで消化し、ＰＯＭ２ＡＰで検出した場合、スクレイピー感染ＳＨａ ＢＨにおけるＰｒＰＳｃの検出レベルは、低いＳ／Ｎ値で示されるように最低であった。同じ試料をＰＯＭ１７で検出した場合、シグナルは、最適ＰＫ濃度で約４倍高かった。以上の結果は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性特性に関して知られており、予想される結果と合致している。即ち、９０〜２３１位残基は、穏和なプロテアーゼ消化に耐性があり、そのため、この領域内にエピトープを有するＰＯＭ１７のような抗体で検出できるのに対し、２３〜９０位Ｎ末端は、敏感であり、オクタリピート領域に結合するＰＯＭ２およびＳＡＦ−３２のような抗体は、その結合部位を失うことになろう。ＰＫの濃度を上げるにつれ、Ｎ末端および９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性コアが、同時に消化されることも明らかである。したがって、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号で提案されたような目標を実現するためには、ＰＫの濃度に対して入念に力価を決定しなければならない。インキュベーションの時間および温度は、酵素活性に影響すると見込まれるので、各試験を特定の条件に合わせる必要があり、それを手の掛かる不安定なプロセスにする。別レベルの複雑さは、ＰＫの調製、バッチおよび起源の違いに伴う酵素比活性の変動である。
【０１７２】
トリプシン処理には、ＰＫと同じ制約がない。オクタリピート領域が無傷のままであったので、ＰＯＭ２のような高アビディティの抗体を使用することができる。ＰＫが２３〜８９位の残基内で切断する一方、トリプシンは、２３〜４８位の残基内だけで切断し、４９〜８９位の残基を残すが、該残基は、９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性コアの他に検出に利用できる、オクタリピート領域を含有する（図１Ａおよび１Ｂ）。したがって、本発明者らは、検出感度の向上のために、異なる検出抗体を一緒に混合し、同時に使用できることを提案する。例えば、ＰＯＭ２およびＰＯＭ１７は共に、ＡＰなどの標識とコンジュゲートにすると、３Ｆ４などの別の抗体を用いてトリプシン消化ＰｒＰＳｃを捕捉する場合、検出抗体として同時に使用することができる。
【０１７３】
それに加え、トリプシン１００μｇ／ｍＬでは、Ｓ／Ｎ値が依然として１００を超えるので、ＰｒＰＳｃは、ＰＫよりトリプシンに対して耐性が高いように見える。このことは、ＰＫが、ＰｒＰＳｃ量およびプリオン感染力を数ログ低下させるのに対し、トリプシンは低下させないことを示した以前の研究と合致している（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年） Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁）。ＰＯＭ２ＡＰで検出した試料のうち、ＰＫ５０μｇ／ｍＬで処理した試料ではＳ／Ｎが７３であるのに対して、同濃度のトリプシンで処理した試料ではＳ／Ｎが４４８であり、ＰＫの使用と比較してトリプシンの使用は６倍の改善を示す。ＰＯＭ１７ＡＰで検出した場合、トリプシン５０μｇ／ｍＬで２５倍超（４１５対１７ＲＬＵ）の改善が認められ、トリプシン２０μｇ／ｍＬで２倍超（５６０対２０３ＲＬＵ）の改善が認められた。したがって両方の抗体に対して、トリプシン処理の方が良好な検出を示した。ＰＯＭ２ＡＰは、０．１μｇ／ｍｌで使用されたＰＯＭ１７ＡＰと比較して、０．０１μｇ／ｍｌで使用されたが、検出量は同等であったことに留意されたい。
【０１７４】
（実施例８）
トリプシンは、ほぼ全長のＰｒＰＳｃを保持しながらＰｒＰＣを消化する
トリプシンがＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃに対して異なった消化をすることを確認するために、以下のように免疫ブロットアッセイを実施した。
【０１７５】
全長成熟ＰｒＰ配列、ＰｒＰＳｃのＰＫ耐性コア、およびＰｒＰのトリプシン切断部位マップの概要が、図７Ａに示されている。
【０１７６】
感染性ヒトｖＣＪＤおよびｓＣＪＤのＢＨ試料を、英国の国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）ＣＪＤ資料センターから入手したが、これらは、それぞれ白色ｖＣＪＤ（ＭＭ）、赤色ｓＣＪＤ（ＭＭ）および黄色ｓＣＪＤ（ＭＶ）の系統に対応する。正常な脳ホモジェネートは、患者ＮＲＰＥ３２７に対応する、チューリッヒ大学の血管性脳症患者から得られた。正常または感染ヒトＢＨ試料２５μｇを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む０．５×ＴＢＳ中、トリプシンまたはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）５０μｇ／ｍｌで、３７℃で１時間消化させた。比較のために非消化試料１０μｇと平行に、試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＰｒＰ抗体（３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７）で免疫ブロットした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いて、ウェスタンブロットを検出した。化学発光像は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４０００ＭＭにより得た。結果を図７Ｂに示す。
【０１７７】
それに加え、正常またはｖＣＪＤヒトＢＨ試料を、トリプシンの増加する濃度で消化し、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１抗体について別々に上記したのと同じように、免疫ブロットすることにより分析した。ＰＯＭ１は、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープ、特に、約１２２〜２３１位残基の球状ドメイン内のエピトープを認識する。その結果を図８に示す。
【０１７８】
消化物の免疫ブロット分析から、トリプシン耐性ＰｒＰＳｃ断片（約４９〜２３１位であると予想される）は、ＰＫ耐性断片（約９０〜２３１位）より大きく、分子の実質的部分が保持されていることが示された（図７Ｂ、３Ｆ４およびＰＯＭ１７のブロット）。重要なことには、ヒト組換えＰｒＰ２３−２３１の質量分析で、トリプシンが、ＰｒＰ配列で予測される全部位で切断できることが実証され、したがってトリプシン部位が、ＰｒＰＳｃでは真に立体構造的に保護されていることが確認された（データは示していない）。更なる調査により、ＰＫではなく、トリプシンによる消化は、ＰＯＭ２抗体が認識するＰｒＰオクタペプチドリピートを保持することが明らかとなった（図７Ｂ、ＰＯＭ２ブロット）。
【０１７９】
対照的に、ＰｒＰＣは両プロテアーゼにより消化され、ＰＯＭ２（約５９〜８９位残基）または３Ｆ４（約１０９〜１１２位残基）によりもはや検出されなかった（図７Ｂおよび図８、正常試料のレーン）。しかし、ＰＯＭ１７またはＰＯＭ１でＰｒＰＣ消化物を免疫ブロットした（ヘリックス１に対して、約１４４〜１５５位残基）とき、約２５ｋＤａのトリプシン耐性断片が観察された。ＰｒＰＣの構造が、非構造化アミノ末端に続く球状ドメイン（約１２２〜２３１位）で構成されている（Ｚａｈｎ， Ｒ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻、１４５〜１５０頁）ことを考慮すると、２５ｋＤａトリプシン断片は、適正な分子量であり、ＰＯＭ１およびＰＯＭ１７で検出されたが、ＰＯＭ２または３Ｆ４で検出されなかった（図７Ｂ、８）ので、恐らくは球状ドメインを含んでいた。興味深いことに、このことから、球状ドメインは、緊密に折り畳まれており、ＰＯＭ１７／ＰＯＭ１エピトープ内のトリプシン切断部位（Ｒ１４８およびＲ１５１）は、溶液構造中に出現する状態（Ｚａｈｎ， Ｒ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻、１４５〜１５０頁）とは異なり、切断には利用できないことが示唆されよう。このドメインの消化に対する耐性に関して理解を深めるために、正常またはｖＣＪＤの両ＢＨをトリプシンの増加する量で消化した。試験したトリプシン濃度のいずれでも、ＰＯＭ２または３Ｆ４のいずれによってもＰｒＰが検出されなかったので、ＰｒＰＣのアミノ末端配列は、極めて不安定であることが判明したが、ＰｒＰＣの球状ドメインおよびｖＣＪＤのＢＨ由来のＰｒＰＳｃは、消化に耐性を示した（図８、ＰＯＭ１）。その上、トリプシン消化したＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣの移動パターンは、大きく異なったため、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣのトリプシン耐性断片を識別することができた。したがって、トリプシン消化は、ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃとを分別する妥当な方法であると結論される。
【０１８０】
（実施例９）
トリプシン消化に対するＣＪＤ系統の安定性の測定
ＰＫは、ＰｒＰＳｃの立体構造における系統依存的多様性を特徴付けるために汎用されてきた。こうした差は、１型および２型のｓＣＪＤについて認められるように、プロテアーゼに対する感受性およびアミノ末端切断部位の変化として明示される。しかし、トリプシンによる消化は、切断部位が既知であり、幾つかの部位は、特性の明確な抗体エピトープ内にあるという特有の利点を有する（図９Ａ）。したがって、タンパク分解切断に対する特定のＰｒＰ配列の感受性を評価することができよう。そこで、正常（１２９ＭＭ）、ｖＣＪＤ（１２９ＭＭ）および散発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）（１２９ＭＭおよび１２９ＭＶ）に対して、プロテアーゼの増加する量でトリプシンまたはＰＫによる消化の後、残存ＰｒＰ配列の検出を試みた。
【０１８１】
２％サルコシル入りのＴＢＳ（ＴＢＳＳ）中で希釈した１％ＢＨ（約１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質）を、０、１、１０または１００μｇ／ｍｌのトリプシンまたはＰＫで３７℃で１時間消化した。消化を、２ｍＭのＰＭＳＦおよびＴＢＳ４倍容中のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の添加で停止させた。次いで、試料を直接ＥＬＩＳＡにより検出した。消化済み１０％ＢＨおよそ５００ｎｌを、１４０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心した。ＰｒＰＳｃペレットを６Ｍ ＧｄｎＳＣＮ中に再懸濁し、等容量の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに終夜で受動的にコーティングした。プレートをＴＢＳ中の０．１×ＢｌｏｃｋｅｒＣａｓｅｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）中でブロックし、被覆ＰｒＰを、０．１μｇ／ｍｌの３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７抗体、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出した。すべての試料は、ＥＬＩＳＡにより三重に分析し、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ， Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ， ＭＩ）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、発光をＬｕｍｉｓｋａｎルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）により測定した。正常およびｖＣＪＤ ＢＨ試料の生データを図９Ｂに示すが、ｖＣＪＤ ＭＭ、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶの規格化データ（感染−正常、ＲＬＵ）は図９Ｃに示す。
【０１８２】
注目すべきことに、正常、感染両ＢＨの非消化試料のペレット中には、ＰｒＰＣ由来シグナルが殆ど存在せず、わずか１μｇ／ｍｌのプロテアーゼで完全に消失した（図９Ｂ）。更に、ＰｒＰＣの約２５ｋＤａのトリプシン耐性断片は、ペレット中に検出されず、このドメインが、遠心中に溶液中に残っていることを示唆した（図９Ｂ、ＰＯＭ１７）。
【０１８３】
ｖＣＪＤ ＢＨのＰｒＰＳｃを調べたとき、エピトープのトリプシン対ＰＫへの曝露に有意差が見出された。３Ｆ４エピトープは、いずれのプロテアーゼを利用しても同じ割合で保持されたが（図９Ｂ、３Ｆ４）、ＰＯＭ２エピトープは、劇的に異なる結果を示した。オクタリピートは、トリプシン濃度の高いときにだけ切除されたが、ＰＫ消化により急速に消失した（図９Ｂ、ＰＯＭ２）。各プロテアーゼが保持するＰｒＰＳｃ量を直接比較するために、正常ＢＨ中に検出されるＰｒＰＳｃ由来シグナルを感染試料の各々から差し引くことにより、規格化シグナルを得た（図９Ｃ、感染−正常）。その図に示されるように、トリプシン１００μｇ／ｍｌで消化した後、ＰＯＭ２により検出されるｖＣＪＤまたはｓＣＪＤにおける規格化シグナル量は、ＰＫわずか１μｇ／ｍｌで消化した後の同じＣＪＤにおける検出量より高いか、またはほぼ同じである。この比較によって、トリプシン消化は、オクタリピート領域内にトリプシン切断部位がないので、ＰＫより多くのＰＯＭ２検出ＰｒＰＳｃを明らかに保持していた。
【０１８４】
興味深いことには、ＰｒＰＳｃコア粒子のＰＯＭ１７検出によって、ヘリックス１の圧倒的大部分、即ちＰＯＭ１７が認識するエピトープを含有する領域は、試験したどのトリプシン濃度でも耐性を示す（図９Ｃ、ＰＯＭ１７）ことが明らかとなり、Ｒ１４８およびＲ１５１が立体構造的に保護されていることが示唆された。しかし、ＰＫは、以前の報告（Ａｇｕｚｚｉ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕ、（２００４年）Ｃｅｌｌ １１６巻、３１３〜３２７頁を参照されたい）と一致して、プロテアーゼ濃度の増加と共にＰＯＭ１７検出ＰｒＰＳｃを消化した。
【０１８５】
実施例８に示した免疫ブロットの分析結果を合わせて考えると、以上の結果は、プロテアーゼの特により高い濃度におけるＰｒＰＳｃのトリプシン消化によって、一方の集団が約４９〜２３１位の残基を包含すると予想される長い断片であり、他方の集団が、約１１１〜２３１位の残基を包含し、３Ｆ４エピトープおよびオクタリピートを欠いている、２集団のトリプシン耐性断片が生成されることを示唆している。結論として、本発明者らは、３Ｆ４エピトープは、トリプシンまたはＰＫによる切断に等しく曝されているが、オクタリピートおよびヘリックス１領域などの他の配列は、トリプシン消化において特異に保持されており、トリプシンがＰｒＰＳｃの分析に理想的なツールであることを見出している。
【０１８６】
（実施例１０）
各種ヒトＣＪＤ系統の脳ホモジェネート試料のトリプシンおよびＰＫ消化、ならびにＰＯＭおよび３Ｆ４抗体による検出
この実施例では、シリアンハムスターＢＨ試料の代わりに数種のヒトＢＨ試料に関して、実施例７に記載の実験に類似した実験を行った。ｖＣＪＤ（Ｍ／Ｍ）、ｓＣＪＤ（Ｍ／Ｍ１）およびｓＣＪＤ（Ｍ／Ｖ２）を含む、正常または各種ＣＪＤ感染ヒトＢＨ試料を、トリプシンまたはＰＫの増加する濃度で消化し、サンドイッチＥＬＩＳＡで検出した。トリプシン消化によるオクタリピート領域の保持が、ＰｒＰ検出を増強できるか否かを確かめるために、オクタリピート領域の検出抗体であるＰＯＭ２ＡＰを、非オクタリピート領域に対する別の検出抗体であるＰＯＭ１７ＡＰと同じ濃度で使用し、それと比較した。実施例７では、ＰＯＭ２ＡＰをＰＯＭ１７ＡＰ濃度の１／１０で使用した。
【０１８７】
２％サルコシル入りのＴＢＳ（ＴＢＳＳ）中で１０倍に希釈した１０％ＢＨを、０、１、１０または１００μｇ／ｍｌのトリプシンまたはＰＫで３７℃で１時間消化した。消化を、２ｍＭのＰＭＳＦおよびＴＢＳ４倍容中のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の添加で停止させた。次いで、試料をサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。消化済み１０％ＢＨの２５０ｎｌを、０．１Ｍ ＮａＯＨで２５℃で１０分間変性させ、ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．３で中和した後、ＰｒＰを３Ｆ４被覆プレート（３７５ｎｇ／ウェル）で捕捉し、０．０２μｇ／ｍｌのＡＰコンジュゲートＰＯＭ２またはＰＯＭ１７で検出した。すべての試料は、ＥＬＩＳＡにより三重に分析し、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ， Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ， ＭＩ）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、発光をＬｕｍｉｓｋａｎルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）により測定した。正常および各種ＣＪＤ ＢＨ試料の生データを図１０に示すが、ｖＣＪＤ（Ｍ／Ｍ）（ｖＣＪＤ−正常、ＲＬＵ）のＰｒＰＳｃ推定量は図１１に示す。
【０１８８】
図１０および１１に示すように、ＴＢＳＳ中トリプシン消化濃度１０μｇ／ｍｌで、正常ＢＨ試料中のＰｒＰＣは、３Ｆ４で捕捉したとき、ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰで検出できないが、ＣＪＤ ＢＨ試料中のＰｒＰＳｃは、３Ｆ４で捕捉したとき、ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰで検出できる長いトリプシン耐性断片を有意量残していた。しかし、ＰＫ消化は、ＰＫ濃度が、ＰｒＰＣから生成するバックグランドシグナルを消去するのに十分高いとき、ＰＯＭ２ＡＰによるオクタリピート領域の検出を保持していなかった。ｖＣＪＤおよびｓＣＪＤの両系統について、ＰＯＭ１７ＡＰ検出ＰｒＰ量は、トリプシンまたはＰＫ消化試料に対して同等であったが、トリプシンは、特定のプロテアーゼ濃度でより多くのエピトープを保持していた。対照的に、ＰＯＭ２ＡＰ検出ＰｒＰＳｃ量は、消化におけるＰＫ量の増加と共に急速に消失したが、トリプシン量の増加と共に遥かにより遅く減少した。更に、０．０２μｇ／ｍｌの同じ検出濃度で、ＰＯＭ２ＡＰは、様々なトリプシン濃度で消化したＣＪＤ全３系統のＢＨ試料において、ＰＯＭ１７ＡＰが生成したシグナルの約１０倍のシグナル（ＲＬＵ）を生成したが、この結果は、反復オクタペプチド配列に対するＰＯＭ２ＡＰ抗体のアビディティに起因する。結論として、オクタリピート領域の保持が、ＰｒＰＳｃ検出を有意に高めた。
【０１８９】
当業者であれば理解されるであろうが、本発明の趣旨から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に多くの変更および改変を加えることができる。このようなすべての変更は、本発明の範囲内に入ることを意図している。本特許文書で引用した特許、出願、および書籍を含む印刷刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれることも意図している。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２１，９５１号、および２００８年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０６６，７０４号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出するアッセイ法に関する。本発明は、該アッセイ法で使用される試薬を含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アミロイド病は、可溶性タンパク質の不溶性凝集形態への変化で起こる。この変換は、二次および三次構造に対する立体構造的変化とも関連している証拠が存在する。タンパク質沈着物の蓄積は、細胞及び組織を損傷する結果、疾患を招くという証拠が増加している。幾つかの疾患は、特定のタンパク質の沈着と関連している。
【０００４】
１群の立体構造性疾患は、「プリオン病」または「感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）」と呼称される。こうした疾患は、人間および動物に現れる。人間においては、プリオン病には、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、変異ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症およびクールーが含まれる（例えば、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編（１９９４年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．；Ｍｅｄｏｒｉら（１９９２年） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３２６巻、４４４〜９頁を参照されたい）。動物においては、プリオン病には、ヒツジスクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、感染性ミンク脳症、ならびに捕らえられたミュールジカおよびエルクの慢性疲労病が含まれる（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ、（１９９０年）、Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ内、Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．、（２２８９〜２３２４頁）を参照されたい）。
【０００５】
最近、ＢＳＥの急速な広がり、および人間におけるＴＳＥ発生率の上昇とのその相関性が、人間外哺乳類におけるＴＳＥ検出に対する関心を高めてきた。こうした疾患の偶発的感染の悲劇的結果（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｍｙｌｏｉｄｓ， ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ Ｐｒｉｏｎｓ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ内、Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｉｎ， Ｐｕｂ．（１９９６年）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ、３４０巻、２４〜２７頁（１９９２年）を参照されたい）、除染の難しさ（Ａｓｈｅｒら（１９８６年）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｆｅｔｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ内、Ｍｉｌｌｅｒ編（５９〜７１頁）Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏ．）、及びＢＳＥに関する懸念（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ． Ｊ． （１９９５年）３１１巻、１４１５〜１４２１頁）が、ＴＳＥの人間および動物を特定すると思われる診断試験、ならびに感染対象に対する治療の両方を得る緊急性の根底にある。
【０００６】
プリオンは、細菌、ウィルスおよびウィロイドとはかなり異なる。支配的な仮説は、他のすべての感染性病原体とは異なり、疾患が、鋳型として作用し、正常なプリオン立体構造を異常で異型の立体構造へ変換する、プリオンタンパク質の異常な立体構造により起こされるというものである。プリオンタンパク質即ちＰｒＰは、１９８０年代前半にその特性が決定された。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８巻、１３０９〜１３１１頁； Ｐｒｕｓｉｎｅｒら（１９８２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１巻、６９４２〜６９５０頁；ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）、Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい）。それ以来、完全なプリオンタンパク質コード遺伝子が、クローン化され、配列決定され、トランスジェニック動物中で発現されてきた。（例えば、Ｂａｓｌｅｒら、（１９８６年）Ｃｅｌｌ４６巻、４１７〜４２８頁を参照されたい）。ＰｒＰＣとも呼称される、プリオンタンパク質の正常な細胞形態は、機能不確定な３３〜３５ｋＤａのタンパク質であり、人間においては、２０番染色体の短腕上にある遺伝子で転写される。異常な形状のプリオンタンパク質は、スクレイピータンパク質または病原性プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）とも呼称される。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＰｒＰＳｃの沈着は、神経変性と関連しており、常に致命的である。ＰｒＰＳｃは感染性であり、感染力を含んだ組織に曝されると、発病する恐れがある。霊長類、ヒツジ、げっ歯類およびトランスジェニックマウスを含む実験動物にＰｒＰＳｃを実験的に接種した結果、プリオン病の感染が起こった。（例えば、Ｚｈａｎｇ ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６巻（１２号）、３５４３〜３５５３頁；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ （１９９８年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７巻、７９３〜８１９頁；Ｐａｎ ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻、１０９６２〜１０９６６頁；Ｓａｆａｒら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８巻、２０２７６〜２０２８４頁を参照されたい）。
【０００７】
ＰｒＰＣの主にαヘリックス折畳み非疾患形態と比較して、ＰｒＰＳｃの実質的なβシート構造が、光学分光法および結晶解析研究から明らかとなった。（例えば、Ｗｉｌｌｅ ら（２００１年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９巻、３５６３〜３５６８頁；Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４〜６２２頁；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、（１９９９年）５巻、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ内、Ｓ． Ｐｒｕｓｉｎｅｒ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．（１９１〜２２８頁）を参照されたい）。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの構造変化は、以下のような生化学的性質の変化を伴うようである。即ち、ＰｒＰＣは非変性誘発性洗浄剤中で可溶であり、ＰｒＰＳｃは不溶で、１０００分子もの多数からなるオリゴマーを形成すること、ＰｒＰＣがプロテアーゼで容易に消化される一方、ＰｒＰＳｃは、部分的に耐性を示し、「ＰｒＰ２７−３０」（２７〜３０ｋＤａ）、「ＰｒＰｒｅｓ」または「ＰＫ耐性」（プロテイナーゼＫ耐性）の形態またはコアとして知られているアミノ末端側切断断片を形成するが、この断片は、シグナルペプチドを含む、ヒトまたはシリアンハムスターのＰｒＰ全長配列に従って付番した場合、約９０位から約２３１位のアミノ酸残基のＰｒＰ断片に対応する。（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻、１９１９７〜１９２００頁；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ ら（１９８２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１巻、６９４２〜６９５０頁；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、３４９〜３５８頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ， Ｍ．Ｓ．（１９９７年）Ｐｒｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。それに加え、ＰｒＰＳｃはＰｒＰＣを病原性の立体構造へ変換することができる。（例えば、Ｋａｎｅｋｏら（１９９５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２巻、１１１６０〜１１１６４頁；Ｃａｕｇｈｅｙ（２００３年）Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ． ６６巻、１０９〜２０頁；Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９５年）Ｃｅｌｌ ８３巻、７９〜９０頁；Ｋａｎｅｋｏら（１９９７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４巻、１００６９〜１００７４頁；ＤｅｂＢｕｒｍａｎら（１９９７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４巻、１３９３８〜１３９４３頁；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら（１９９９年）ＥＭＢＯＪ． １８巻、３１９３〜３２０３頁；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら（２０００年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７巻、５８３６〜５８４１頁；Ｋｏｃｉｓｋｏら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻、４７１〜４７４頁を参照されたい）。
【０００８】
生存対象、および生存対象から得た試料における、立体構造的疾患タンパク質の病原イソフォームの検出は、困難であることが判明した。アミロイド一般の検出はコンゴレッド染色で実現できるが、この種の染色は不正確で感度が高くない。細胞、組織またはホモジェネートなどにおける、他のタンパク質存在下での所与のタンパク質の特異的で高親和性の検出は、標的タンパク質に特異的な抗体を用いて普通行なわれる。しかし、同じ配列を共有しながら立体構造が異なるタンパク質では、抗体による識別的検出が複雑になる。実際、ＰｒＰに対して生じた抗体の大多数は、ＰｒＰＣに、またはＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方に結合する。（例えば、Ｍａｔｓｕｎａｇａら（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４巻、１１０〜１１８頁を参照されたい）。それに加え、ＰｒＰＳｃの凝集により、抗体にとって有効なエピトープ濃度が減少し、そのため特異抗体のＰｒＰに対する有効な結合が阻害される。したがって、ＰｒＰＳｃの有効な免疫検出には、ＰｒＰＳｃを解離・変性してＰｒＰＣ様配座異性体に変えると同時に、元のＰｒＰＣと識別することが必要になる。
【０００９】
公表された数種の免疫アッセイ法は、ＰｒＰＳｃの存在を判定するために、自然なＰｒＰＣだけに結合するが、自然なＰｒＰＳｃには結合しない抗体の結合量と、自然なＰｒＰＳｃ、ＰｒＰＣの両方に結合する抗体の結合量とを比較することに基づいていた。（例えば、特許文献１および特許文献２を参照されたい）。別の免疫アッセイ法も、抗体結合量の比較に基づいていたが、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣを変性させる変性工程を含んでおり、その後で自然なＰｒＰＣに結合させるために使用した抗体と同じ抗体にそれらを結合させた。（特許文献３を参照されたい）。しかし、こうした方法を用いると、ＰｒＰＣの量が非常に少ないときにしかＰｒＰＳｃの有効な抗体検出を得ることができないので、こうしたアッセイ法には限界がある。ＰｒＰＣが過剰な場合、例えば、プリオン病の初期段階の対象から試料を採取した場合、ＰｒＰＳｃの存在による免疫検出の増加を認めることは、困難であり、または不可能でさえある。例えば、ＰｒＰＣが１０００倍多い血漿試料中の変性ＰｒＰＳｃの検出は、ＰｒＰＣ検出による圧倒的なシグナルのために不可能となろう。したがって、ＰｒＰＳｃを含むまたは含まない試料間の単純な識別は、あまり妥当ではない。
【００１０】
この困難を克服するために、ＰｒＰＳｃの変性および検出の前に、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）またはディスパーゼなどの非特異的プロテアーゼで試料を処理することがしばしばある。（例えば、特許文献４および特許文献５を参照されたい）。ＰｒＰＳｃイソフォームの構造のために、ＰｒＰＳｃはプロテアーゼ消化に非常に耐性を示す。他方、ＰｒＰＣイソフォームは、このようなプロテアーゼによる処理で完全に分解する。したがって、幾つかの条件下（例えば、５０μｇ／ｍＬを３７℃、３０分間）、ＰＫなどの非特異的プロテアーゼで試料を処理することにより、存在するＰｒＰＣをすべて除去し、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア（約９０位から約２３１位までのアミノ酸残基）をほぼ無傷で残すことができる。
【００１１】
ＰＫ処理の主要な１つの制約は、ＰｒＰＳｃのアミノ末端またはアミノ近接残基（約２３位から約８９位まで）の分解である。ＰｒＰのこの領域は、オクタリピート領域中のエピトープを含め幾つものエピトープを含有するので、免疫検出にとって有用になり得る。オクタリピート領域は、オクタリピート配列のＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）を数コピー含有する。このオクタリピート配列は、様々な種由来のプリオンタンパク質中に高度に保存されており、５回反復を有するウシＰｒＰおよび３回反復を有するサルＰｒＰを除く大部分の種において、ヒトまたはシリアンハムスターのＰｒＰ全長配列に従って付番した場合、約５８〜８９位残基の間に４回反復される。（幾つかの種のＰｒＰ配列の整列については図１を参照されたい）。この配列はＰｒＰに独特なものであり、数種のＰｒＰ特異抗体、例えばＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７が、この配列に結合することが示されてきた。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ、４巻、８０５〜８１４頁；Ｋｒａｓｅｍａｎｎら（１９９６年）、Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁；特許文献６を参照されたい）。
【００１２】
一般に、大部分の抗体は、本来２個の結合部位（即ち、２本の結合アーム）を含有していても、タンパク質上に１度だけ提示されるエピトープに結合する。この種の結合は一価結合と称する。一価結合は、両方の抗体結合部位が、同じタンパク質上の２個のエピトープと同時に相互作用する事象（即ち、多価結合）より弱い。アビディティと呼ばれる多価結合の総括強度は、単一部位の結合強度である親和性より大きいが、その理由は、抗体が抗原を放出するために、両結合部位が同時に解離しなければならないからである。例えば、この性質は、普通その表面上に複数の同一エピトープを有する細菌またはウィルスに対して、抗体が結合する際に非常に重要である。したがって、ＰｒＰのオクタリピート領域は、複数のオクタリピートエピトープの独自性と、多価結合との双方を介して、シグナルの増強を可能にする。ＰＫは、全長成熟ＰｒＰＳｃ（２３〜２３１位アミノ酸）の２３〜８９位残基を消化するので、完全なＰＫ消化後の有用な抗体のレパートリーは、プロテアーゼ耐性コア（約９０〜２３１位アミノ酸）内にある配列に結合する抗体に限られ、オクタリピート領域に対する抗体は、使用することができない。そのため、ＰＫ消化を用いる免疫アッセイは、あまり感度が高くない。
【００１３】
ＰＫのような非特異的プロテアーゼを使用する付加的な欠点は、ＰｒＰＳｃが部分的にしか耐性を示さないため、高い濃度および十分な時間を用いれば、９０〜２３１位残基の大部分またはすべてさえも消化されると見込まれることである。ＰｒＰＳｃの一部の配座異性体は、他のものより消化に敏感であり、このような処理が検出感度を低下させることが示されている。（例えば、Ｓａｆａｒら（１９９８年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４巻、１１５７〜６５頁を参照されたい）。このことと符合して、ＰＫは、ＰｒＰＳｃおよびプリオンの感染力レベルを数ログ低下させるという知見がある（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい）。
【００１４】
最近記載された免疫アッセイ法は、ＰｒＰＣは完全に消化されるが、ＰｒＰＳｃは部分的にしか消化されず、オクタリピート領域のすべてまたは幾らかが保持されるようにＰＫ消化条件を制御することにより、上記に考察した制約に対処した。（特許文献６を参照されたい）。しかし、この解決法は、適当な条件が、異なる試料に対して変動し、そのため実現に手が掛かり、標準化が困難になる恐れがあるので、理想的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６２１４５６５号明細書
【特許文献２】米国特許第６４０６８６４号明細書
【特許文献３】米国特許第５８９１６４１号明細書
【特許文献４】米国特許第７１６３７９８号明細書
【特許文献５】欧州特許第１１１９７７３号明細書
【特許文献６】米国特許第７０９７９９７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、様々な試料、例えば、生存対象から得た試料、供血、家畜、ならびに他の人間用および動物用供給食品における試料において、病原性プリオンタンパク質の存在を検出するために、特異的で感度が良く、相対的に単純または迅速な方法、およびそのような方法を用いたキットに対する必要性が、依然として存在する。本発明は、この目的ならびに他の重要な目的を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、病原性プリオンタンパク質の存在を検出するために、アッセイの方法およびキットの形で、新規で単純で特異的であって感度良好な方策を提供し、該方策は、とりわけ、プリオン関連疾患（例えば、人間または人間外動物対象における）の診断、実質的にＰｒＰＳｃを含まない供血、供給血液製剤または供給食品の確保、移植用の臓器および組織試料の分析、手術用道具および装置の除染ならびに病原性プリオンの有無に関する知識が重要な他の任意の状況のモニタリングをするための各方法に関して使用し得る。
【００１８】
本開示におけるアッセイ法は、実質的に完全な消化後に、既知ＰｒＰ配列のオクタリピート領域中、またはＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア中で切断しないが、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣ中のアミノ酸の少なくとも一部を切断・除去する、部位特異的プロテアーゼによる処理を利用し、この処理により、ＰｒＰＳｃの特異的で感度良好な検出のために、オクタリピート領域中のエピトープまたは更に上流のエピトープさえも、プロテアーゼ耐性コア領域中のエピトープと組み合わせて利用することが、可能となり、好都合となる。
【００１９】
本発明の一部は、プリオンタンパク質のタンパク分解消化が実質的に完全な条件下で、試料を部位特異的プロテアーゼと接触させ、試料の更なるプロテアーゼ消化を防止し、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーと結合させることにより、任意のＰｒＰＳｃの存在を検出することによって、試料中のＰｒＰＳｃの存在を検出する方法であって、一方の結合パートナーは、ＰｒＰのアミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域中のエピトープと特異的に結合し、他方の結合パートナーは、プロテアーゼ耐性コア領域内のエピトープと特異的に結合する方法に関する。
【００２０】
本発明は、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある試料中のタンパク質を実質的に完全に消化するために、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼ、好ましくはトリプシンまたは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ（Ｓ−Ｖ８）を用いて、病原型プリオンタンパク質、即ちＰｒＰＳｃの存在を検出する方法であって、試料が、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい方法を提供する。該ＰｒＰＳｃは、オクタリピート領域内、またはオクタリピート領域とプロテアーゼ耐性コアとの間に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位を有していない。したがって、実質的に完全なタンパク分解消化の後、オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアとの結合を維持し、そのプロテアーゼ耐性コアは無傷のままである。ＰｒＰＣが存在する場合、それは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、部位特異的プロテアーゼに対する利用可能な切断部位を少なくとも１つ有しており、少なくとも１つの利用可能なその切断部位は、実質的に完全なタンパク分解消化により切断される。本発明の方法に適切な部位特異的プロテアーゼについては、本明細書で更に説明する。
【００２１】
該方法は、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程を更に含み、該工程は、プロテアーゼ阻害剤の添加、または部位特異的プロテアーゼの除去により実現することができる。
【００２２】
該方法は、更なるタンパク分解消化を防止する工程の後で、部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させ、それにより変性ＰｒＰＳｃを得る工程を更に含む。
【００２３】
該方法は、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いてＰｒＰＳｃの存在を検出する工程を更に含み、第１の結合パートナーは、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持する、ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域の断片内、好ましくはオクタリピート領域中にある第１のエピトープと特異的に結合し、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にある第２のエピトープと特異的に結合しており、第２の該エピトープは、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、第１のエピトープから分離された、ＰｒＰＣの領域中にある。
【００２４】
ある種の実施形態では、ＰｒＰＳｃは、配列番号１〜１０より選択される配列を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域内にあるエピトープと結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２６】
他のある種の実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２７】
ある種の実施形態では、該方法に使用される部位特異的プロテアーゼは、トリプシンであり、トリプシンは、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）残基のカルボキシル側にあるアミノ酸が、プロリン（Ｐ）でない限り、ＫおよびＲのカルボキシル側でペプチド結合を特異的に加水分解する。こうした実施形態に対して、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、ＰｒＰＣでは、トリプシン消化により切断・除去されてしまい、したがって第１のエピトープから分離されている、任意のエピトープに対して特異的になり得る。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２８】
トリプシンが使用される方法の好ましい実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＣの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰＣの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置しているエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２９】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される部位特異的プロテアーゼは、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）残基のカルボキシル側で特異的に切断する、Ｓ−Ｖ８である。こうした実施形態に対して、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、ＰｒＰＣではＳ−Ｖ８により切断・除去されてしまった、任意のエピトープに対して特異的になり得る。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００３０】
該方法のある種の実施形態では、検出工程は、ＥＬＩＳＡ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施される。このような一実施形態は、捕捉結合パートナーとして、ＰｒＰのアミノ近接領域内、特にオクタリピート領域内のエピトープに結合する第１の結合パートナー、および検出結合パートナーとして、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープに結合する第２の結合パートナーを利用する。このような別の実施形態では、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープに結合する第２の結合パートナーが、捕捉結合パートナーとして利用され、アミノ近接領域内のエピトープに結合する第１の結合パートナーが、検出結合パートナーとして利用される。
【００３１】
ある種の好ましい実施形態では、上記に考察した検出結合パートナーは標識される。こうした実施形態中のある種のものでは、検出結合パートナーは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートで標識される。
【００３２】
ある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、該抗体は、それだけに限らないが、本明細書に開示した例示的なモノクローナル抗体から選択することができる。
【００３３】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【００３４】
該方法の一実施形態では、前記の部位特異的プロテアーゼは、固体支持体上に固定化される。
【００３５】
別の実施形態では、実質的に完全なタンパク分解消化の後で、部位特異的プロテアーゼによる試料の更なるタンパク分解消化を防止するために、該方法に使用されるプロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）である。
【００３６】
ある種の実施形態では、該方法における変性工程は、グアニジニウム化合物、例えば、塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）またはグアニジンチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）で消化済み試料を処理する工程を含む。
【００３７】
変性剤としてグアニジニウム化合物を使用した実施形態中のある種のものでは、試料を希釈する更なる工程が、変性後に含まれる。
【００３８】
他のある種の実施形態では、該方法における変性工程は、高ｐＨまたは低ｐＨで消化済み試料を処理し、場合により、前記変性後の前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和することを含む。
【００３９】
該方法のある種の実施形態では、試料は、生存中または死後の生物体から得られる。こうした実施形態における例示的な生物体には、ヒト、サル、ハムスター、ウシ、ヒツジ、マウス、エルクおよびシカが挙げられる。
【００４０】
ある種の実施形態では、該方法に使用される試料は、供給食品、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液、臓器、細胞、脳組織、神経系組織、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検、剖検および汚染機器からなる群に由来する。
【００４１】
ある種の実施形態では、該方法に使用される試料は、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球および血清からなる群に由来する。
【００４２】
ある種の実施形態では、試料は、生検、検視または剖検から得られる。
【００４３】
本発明の一部は、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある試料において、病原型プリオンタンパク質、即ちＰｒＰＳｃの存在を検出するキットであって、試料が、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含有することも含有しないこともあり、本明細書で考察する方法において有用な試薬を含むキットにも関する。
【００４４】
具体的には、該キットは、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼを含み、ＰｒＰＳｃは、オクタリピート領域内、またはオクタリピート領域とプロテアーゼ耐性コアとの間に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、したがって、ＰｒＰＳｃの該プロテアーゼによる実質的に完全なタンパク分解消化の後、オクタリピート領域を含む、ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域の断片は、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している。ＰｒＰＣが存在する場合、それは、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、部位特異的プロテアーゼに対する利用可能な切断部位を少なくとも１つ有する。
【００４５】
該キットは、それだけに限らないが抗体およびアプタマーを含め、少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを含む。第１の結合パートナーは、キット中の部位特異的プロテアーゼによる、ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後で、プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持するアミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープと特異的に結合する。第２の結合パートナーは、プロテアーゼ耐性コア内に位置する第２のエピトープと特異的に結合しており、第２の該エピトープは、キット中の部位特異的プロテアーゼによる、ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後で、第１のエピトープから分離された、ＰｒＰＣの領域中にある。
【００４６】
該キットは、病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、キットを使用するための説明書を更に含む。
【００４７】
場合により、該キットは、キット中の部位特異的プロテアーゼの活性を阻害できる、プロテアーゼ阻害剤を更に含む。
【００４８】
やはり場合により、該キットは、ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤を更に含む。
【００４９】
キットに関するある種の実施形態では、ＰｒＰＳｃは、配列番号１〜１０より選択される配列を含む。
【００５０】
キットに関するある種の好ましい実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域内のエピトープと特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５１】
キットに関する他のある種の実施形態では、第１の結合パートナーは、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５２】
キットに関するある種の実施形態では、キット中の部位特異的プロテアーゼは、トリプシンである。こうした実施形態に対して、こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５３】
トリプシンが部位特異的プロテアーゼである、キットに関する好ましい実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰＣの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰＣの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置しているエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５４】
他のある種の実施形態では、キット中の部位特異的プロテアーゼは、Ｓ−Ｖ８である。こうした実施形態に対して、こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５５】
キットに関するある種の実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡキット、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡキットを含む。このような実施形態の中で、ある種の実施形態は、捕捉結合パートナーとして第１の結合パートナー、および検出結合パートナーとして第２の結合パートナーを有する。更に他のある種の実施形態は、捕捉結合パートナーとして第２の結合パートナー、および検出結合パートナーとして第１の結合パートナーを有する。
【００５６】
キットに関するある種の実施形態では、上記に考察した検出結合パートナーは標識される。こうした実施形態中のある種のものでは、検出結合パートナーは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートで標識される。
【００５７】
ある種の実施形態では、キット中の結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり、該抗体は、それだけに限らないが、上記に示した例示的なモノクローナル抗体から選択することができる。
【００５８】
他のある種の実施形態では、キット中の結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【００５９】
キットに関する一実施形態では、部位特異的プロテアーゼは固定化される。
【００６０】
キットに関する別の実施形態では、任意選択のプロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）である。
【００６１】
キットに関するある種の実施形態では、任意選択の変性剤は、グアニジニウム化合物である。
【００６２】
キットに関する他のある種の実施形態では、任意選択の変性剤は、塩基性試薬または酸性試薬である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ】（１Ａおよび１Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびトリプシン切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。（プロテアーゼ耐性コア領域の正確な開始および終止アミノ酸位置は、異なる種間および異なる系統間で、ならびに異なるプロテアーゼ消化条件により若干変化することに留意されたい）。トリプシン切断部位である、カルボキシル側にプロリン（Ｐ）を有していないアミノ酸のリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）には、一本下線を引いてある。
【図１Ｂ】（１Ａおよび１Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびトリプシン切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。（プロテアーゼ耐性コア領域の正確な開始および終止アミノ酸位置は、異なる種間および異なる系統間で、ならびに異なるプロテアーゼ消化条件により若干変化することに留意されたい）。トリプシン切断部位である、カルボキシル側にプロリン（Ｐ）を有していないアミノ酸のリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）には、一本下線を引いてある。
【図２Ａ】（２Ａおよび２Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびＳ−Ｖ８切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。Ｓ−Ｖ８切断部位である、アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）には、一本下線を引いてある。
【図２Ｂ】（２Ａおよび２Ｂ） ヒト（配列番号１）、サル（配列番号２）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号３）、ウシ（配列番号４）、ヒツジ（配列番号５）、マウス（配列番号６）、エルク（配列番号７）、ファロージカ（ファロー）（配列番号８）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号９）およびオジロジカ（白）（配列番号１０）由来のプリオンタンパク質の、アミノ酸配列の整列およびＳ−Ｖ８切断部位を示す図である。オクタリピート領域には、二重下線を引いてある。プロテアーゼ耐性コア領域は、配列整列の上下にある括弧で示される。Ｓ−Ｖ８切断部位である、アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）には、一本下線を引いてある。
【図３】本発明の一実施形態の概要を示す図である。一本線は、プリオンタンパク質を表し、コイル部は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアを表し、波線部は、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃイソフォームのα−ヘリックス性の高い部分を表す。ＰｒＰＳｃまたはＰｒＰＣタンパク質の様々な位置番号は、異なる領域のアミノ酸境界を表す。箱形は、抗プリオン抗体が認識するエピトープ領域を示し、塗潰し棒は、オクタリピート領域を表し、三角形は、部位特異的プロテアーゼの切断部位を表す。白抜きの箱形は、アミノ近接領域内、好ましくはオクタリピート領域内のエピトープ領域を表し、一方、斜線付き箱形は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア内のエピトープ領域、またはプロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣのアミノ酸配列内にある同じエピトープ領域を表す。白抜き三角形は、ＰｒＰＳｃまたはＰｒＰＣの天然型において、部位特異的プロテアーゼに対して利用可能な切断部位を表す。斜線付き三角形は、ＰｒＰＳｃの天然型において、部位特異的プロテアーゼに対して利用不可能な切断部位を表す。Ｙは抗体を表す。
【図４】捕捉抗体としてＳＡＦ−３２および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲート３Ｆ４（３Ｆ４ＡＰ）を用いて、トリプシンまたはＰＫで消化した正常またはｖＣＪＤのヒト脳ホモジェネート（ＢＨ）試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例６に開示されている。プロテアーゼ消化後、試料は、変性させないままとし、または４Ｍ ＧｄｎＨＣｌで変性させ、その後ＰｒＰＳｃを検出した。検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。
【図５】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲートＰＯＭ２（ＰＯＭ２ＡＰ）を用いて、様々な条件下でトリプシンまたはＰＫで消化した、スクレイピー感染シリアンハムスター（ＳＨａ）のＢＨ試料における、ＰｒＰＳｃのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例７に開示されている。正常ＢＨシグナルに対するスクレイピー感染シグナルの比が、示されている（Ｓ／Ｎ値）。
【図６】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてアルカリホスファターゼコンジュゲートＰＯＭ１７（ＰＯＭ１７ＡＰ）を用いて、様々な条件下でトリプシンまたはＰＫで消化した、スクレイピー感染ＳＨａのＢＨ試料における、ＰｒＰＳｃのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す図である。実験の詳細は、実施例７に開示されている。正常ＢＨシグナルに対するスクレイピー感染シグナルの比が、示されている（Ｓ／Ｎ値）。
【図７】（図７Ａ）全長成熟ＰｒＰ配列、ＰｒＰＳｃのＰＫ耐性コア、およびトリプシン切断部位の概略マップである。トリプシン切断部位は三角形で示され、ＰＫ耐性コア内にある該部位は、ＰｒＰＳｃにおけるトリプシン切断には一般に利用不可能なことを示すために、灰色三角形として示されている。（図７Ｂ）ウェスタンブロット分析の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例８に開示されている。トリプシンまたはＰＫの５０μｇ／ｍｌ消化を、正常、ｖＣＪＤ ＭＭ（１２９位コドンの多形、白色ｖＣＪＤ系統）、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶのＢＨ試料について比較した。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１７抗体で免疫ブロットをした。ローディング対照として、アクチン免疫ブロットを行なった。
【図８】別のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例８に開示されている。正常またはｖＣＪＤのＢＨ試料を０、２５、５０、７５または１００μｇ／ｍｌのトリプシンで消化した後、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１抗体による免疫ブロットで分析した。
【図９】（図９Ａ）トリプシン切断部位および数個の抗体用エピトープの位置を印した全長成熟ＰｒＰ配列の概要を示す図である。３Ｆ４またはＰＯＭ１７用エピトープ領域のトリプシン切断部位は、灰色三角形で示され、ＰｒＰＳｃにおけるトリプシン切断には一般に利用不可能なことを示す。（図９ＢおよびＣ）「受動被覆」直接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す図である。実験の詳細は、実施例９に開示されている。正常またはＣＪＤのＢＨを、トリプシン（塗潰し記号）またはＰＫ（白抜き記号）の増加する濃度で消化した。消化物を遠心し、ＰｒＰＳｃペレットを変性させ、ＰＯＭ２（上段パネル）、３Ｆ４（中段パネル）またはＰＯＭ１７（下段パネル）抗体による直接ＥＬＩＳＡで検出した。検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。図９Ｂは、正常なＢＨ（三角形）およびｖＣＪＤ ＭＭのＢＨ（円形）の生データを示す。図９Ｃは、ｖＣＪＤ ＭＭ、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶのＢＨ試料の規格化データを示す。結果は、「感染−正常（ＲＬＵ）」で表現されている。
【図１０】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰを用いて、トリプシン（各パネルの左半部）またはＰＫ（各パネルの右半部）の増加する濃度で消化した正常または各種ＣＪＤのヒトＢＨ試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を棒グラフで示した図である。実験の詳細は、実施例１０に開示されている。生データとして得られた検出シグナルの相対量は、相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。黒塗り棒は正常ＢＨのデータを表し、灰色棒は各種ＣＪＤ ＢＨのデータを表す。
【図１１】捕捉抗体として３Ｆ４および検出抗体としてＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰを用いて、トリプシン（塗潰し円）またはＰＫ（白抜き円）の増加する濃度で消化した正常またはｖＣＪＤのヒトＢＨ試料における、ＰｒＰのサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を折れ線グラフで示した図である。図１０の実験の一部である、この実験の詳細は、実施例１０に開示されている。生データとして得られた検出シグナルの相対量は、左側パネルおよび中央パネルに相対発光量（ＲＬＵ）で示されている。ＰｒＰＳｃが占めるシグナル量は、ｖＣＪＤ ＢＨ由来のシグナルから正常ＢＨ由来のシグナルを差し引くことにより、推定しており、右側パネルに「ｖＣＪＤ−正常（ＲＬＵ）」として示してある。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
（詳細な説明）
本開示の実施には、別途指示しない限り、当分野の技術内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来法が使用されよう。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．を参照されたい。
【００６５】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
定義
以下の精選した用語は、本明細書で使用する文脈で考察することになる。用語の複数形および単数形は共に、考察する形に関係なく包含される。
【００６７】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は、病原性プリオンタンパク質形態（スクレイピータンパク質、病原性タンパク質形態、病原性イソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃとも称する）および非病原性プリオン形態（正常形態、細胞性タンパク質形態、細胞性イソフォーム、非病原性イソフォーム、非病原性プリオンタンパク質およびＰｒＰＣとも称する）の双方、ならびに変性形態、および病原性立体構造、正常細胞性立体構造のいずれをも有していないこともある、プリオンタンパク質の各種組換え形態を指示するために、互換的に使用される。
【００６８】
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」または「コンホメーション病タンパク質」の使用は、本明細書に記載の配列に正確に合った配列を有するポリペプチドに限定されることを意図していない。該用語が、特定済みまたは未特定の種（例えば、ヒト、ウシ）または疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）のいずれかに由来するコンホメーション病タンパク質を包含することは、容易に明らかである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有する米国特許公開第２００５０１１８６４５号および第２００６００３５２４２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０６／０７６６８７号も参照されたい。本開示および当該技術の教示に鑑みて、当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ））、または構造的特徴もしくはモチーフの同定および整列を用いて、他の任意のプリオンタンパク質において、本明細書に開示する配列に対応する領域を決定することができる。
【００６９】
「病原性の」とは、タンパク質が、実際に疾患を起こす、またはタンパク質が、疾患に関連しており、したがって疾患が存在する場合には、存在していることを意味する。したがって、病原性タンパク質は、本明細書で使用する場合、疾患の特定の原因物質であるタンパク質とは限らない。「病原型」タンパク質とは、疾患が存在する場合に存在しているタンパク質の立体構造を意味するが、それは、感染性であることもないこともある。病原性のコンホメーション病タンパク質、または病原型タンパク質の例は、ＰｒＰＳｃである。したがって、用語「非病原性の」または「正常型」は、疾患を通常起こさない、または発病と通常関連していないタンパク質を表す。コンホメーション病タンパク質の非病原型または正常型の例は、ＰｒＰＣである。
【００７０】
「プリオン関連疾患」とは、病原性プリオンタンパク質または病原型プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）が、全般的または部分的に起こす疾患を指す。プリオン関連疾患の例には、限定することなく、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、慢性疲労病（ＣＷＤ）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）が挙げられる。
【００７１】
用語「変性する」または「変性した」とは、タンパク質構造に適用した場合に従来の意味を有し、そのタンパク質が、本来の二次および三次構造を喪失したことを意味する。病原性プリオンタンパク質に関しては、「変性した」病原性プリオンタンパク質は、本来の病原性立体構造をもはや保持しておらず、したがってそのタンパク質は、もはや「病原性」ではない。変性した病原性プリオンタンパク質は、変性した非病原性プリオンタンパク質と類似または同一の立体構造を有する。
【００７２】
用語「標識」、「標識された」、「検出可能な標識」または「検出可能に標識された」とは、それだけに限らないが、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）、蛍光ナノ粒子、金ナノ粒子などを含む、検出可能な分子を指す。使用できる標識の特定の例には、それだけに限らないが、フルオレッセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル、ＮＡＤＰＨ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび尿素が挙げられる。該標識は、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグ）、抗体、または増幅可能な、そうでなければ検出可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
【００７３】
「タンパク分解消化」または「プロテアーゼ消化」とは、タンパク質中のペプチド結合の加水分解または切断を介した、プロテアーゼによるタンパク質の指定された消化または分解を指す。
【００７４】
「部位特異的プロテアーゼ」とは、タンパク質基質において、１つの形式で、または異なる少数のアミノ酸残基において、ペプチド結合を切断する酵素（プロテアーゼ）を指す。部位特異的プロテアーゼに対する「切断部位」とは、隣接するペプチド結合が、通常のタンパク分解消化条件下で、部位特異的プロテアーゼにより加水分解または「切断」される、タンパク質基質中の特定のアミノ酸残基（複数）を指す。部位特異的プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ（脂肪族、芳香族および疎水性残基で切断する）、およびカルボキシペプチダーゼＹ（カルボキシ末端に始まって全残基を逐次切断する）のような非特異的プロテアーゼとは区別される。例えば、トリプシンは、特に、ＬｙｓおよびＡｒｇのカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基においてだけ切断する部位特異的プロテアーゼである。（例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｒｔ（１９５０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．４６巻、７０頁；Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ（１９６４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５２巻、８８４〜８８９頁；Ｗａｌｓｈ（１９７０年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９巻、４１頁を参照されたい）。そのため、トリプシンに対する切断部位は、ＬｙｓおよびＡｒｇのカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基を意味する。トリプシンに対する切断部位は、「トリプシン部位」とも称する。もう１つの例は、ＧｌｕおよびＡｓｐ残基で特異的に切断するプロテアーゼＳ−Ｖ８である。（例えば、Ｄｒａｐｅａｕら（１９７２年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４７巻、６７２０〜６７２６頁、およびＨｏｕｍａｒｄ ａｎｄ Ｄｒａｐｅａｕ（１９７２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９巻、３５０６〜３５０９頁を参照されたい）。トリプシンおよびＳ−Ｖ８は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．の一部門のＰｉｅｒｃｅ、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．などの企業から市販されている。
【００７５】
「実質的に完全な」消化、または「実質的に消化された」とは、タンパク質が、利用可能なすべてのプロテアーゼ切断部位のうち、少なくとも９０％、好ましくは９９％でプロテアーゼにより切断された消化を意味する。「利用可能な切断部位」とは、プロテアーゼにより切断部位と認識され、しかもタンパク質の立体構造においてプロテアーゼとの接触のために利用できる、アミノ酸配列を有する部位を意図している。例えば、プリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア内に現れるプロテアーゼ切断部位は、プリオンタンパク質がＰｒＰＳｃの立体構造を採るとき、プロテアーゼ消化には一般に利用できず、したがってＰｒＰＳｃにおいては「利用可能な切断部位」ではない。
【００７６】
「オクタリピート領域」とは、これまでに確認されたすべての種に由来する、プリオンタンパク質のＮ末端に近接して見出される反復配列領域を指す。オクタリピートは、普通ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）と書かれる８（または９）アミノ酸配列のコピーを、一般に３〜５個、普通４個含有する。この配列は、高度に保存されており（この配列は、該リピートの幾つかでは若干変化することもある）、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約５８〜８９位残基内に一般に現れる。オクタリピート領域は、普通、プロテアーゼ耐性領域に隣接しており、Ｎ末端に近接性している。
【００７７】
プリオンタンパク質の「プロテアーゼ耐性コア」（時々「プロテイナーゼＫ耐性コア」と呼ばれる）は、ＰｒＰＣ形態のプリオンタンパク質を実質的に消化するのに十分な条件下に、ＰｒＰＳｃをプロテイナーゼＫに曝した後、ＰｒＰＳｃ立体構造を採るプリオンタンパク質の存続している領域によって定義される。一般に、大部分のプリオンタンパク質種については、プロテアーゼ耐性コア領域は、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約９０位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域を含む。図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂは、様々な種からの多くのプリオンタンパク質の整列を示し、括弧付き領域はプロテアーゼ耐性コア領域を示す。
【００７８】
「プロテアーゼ耐性コアに対応する、ＰｒＰＣのアミノ酸領域」とは、前記ＰｒＰＣと一次アミノ酸配列が同じ病原型プリオンタンパク質において、プロテアーゼ耐性コアを形成する領域と同じである、ＰｒＰＣの領域を指す。一般に、大部分のプリオンタンパク質種については、この領域も、ヒトおよびハムスターのＰｒＰ種に従って付番した場合、約９０位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域を指す。
【００７９】
ＰｒＰＣの「球状ドメイン」は、ヒトのＰｒＰ種に従って付番した場合、およそ１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までである。
【００８０】
本明細書における「エピトープ」とは、限定することなく、抗体およびアプタマーを含めた結合パートナーに認識される（例えば、特異的に結合する）、標的タンパク質の領域を意味する。エピトープは、エピトープに特有の空間的立体構造中に３個以上のアミノ酸を含む。一般には、エピトープは、少なくとも５個のそのようなアミノ酸からなり、より普通には、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。更に、所与のタンパク質におけるエピトープの特定は、疎水性試験の使用および部位選択的血清法などの、当技術分野で周知の技法を用いて容易に実現される。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８４年）８１巻、３９９８〜４００２頁（所与の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するために、ペプチドを迅速に合成する一般法）；米国特許第４７０８８７１号（抗原のエピトープを同定し、化学合成するための手順）およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）２３巻、７０９〜７１５頁（所与の抗体に親和性の高いペプチドを同定する技法）も参照されたい。
【００８１】
「アミノ近接領域」とは、ヒトまたはハムスターのＰｒＰ配列に従って付番した場合、２３位から約８９位までのアミノ酸を包含する、成熟ＰｒＰタンパク質のＮ末端領域を指す。
【００８２】
「結合パートナー」とは、エピトープなどのリガンドを特異的に認識し、非共有結合でそれに結合する分子を指す。本開示で考察するような結合パートナーには、限定することなく、抗体およびアプタマーが含まれる。
【００８３】
「捕捉結合パートナー」とは、ＰｒＰタンパク質などのリガンドと特異的に結合し、それを捕捉するために、固体支持体上に被覆された結合パートナーを指す。
【００８４】
「検出結合パートナー」とは、捕捉結合パートナーが結合し、捕捉した任意のリガンドを特異的に検出するために、固体支持体上の試料に対して、溶液中に添加される結合パートナーを指す。
【００８５】
アッセイ法のある種の実施形態では、結合パートナーはアプタマーである。アプタマーは、抗体の分子認識性を有する核酸である。しかし、アプタマーは、抗体より小さく、抗体ほどに複雑ではないため、製造および修飾が、より容易になり得る。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら（１９９７年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １巻、５〜９頁；Ｂｕｎｋａら（２００６年）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４巻、５８８〜５９６頁を参照されたい）。タンパク質エピトープに特異的なアプタマーを生成する方法は、容易に入手できる（例えば、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、５０５〜５１０頁；Ｃｏｘら（１９９８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １４巻、８４５〜８５０頁；Ｃｏｘら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻、ｅ１０８頁を参照されたい）。アプタマーは、検出容易な活性を有する酵素に結合することができる（例えば、Ｄｒｏｌｅｔら（１９９６年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻、１０２１頁を参照されたい）。
【００８６】
プロテアーゼで試料を「処理する」またはその「処理」は、反応、特にペプチド結合の加水分解または切断が起こるのに十分な時間長の間、試料およびプロテアーゼを接触させ、一緒に維持することを意味する。
【００８７】
一般的概観
本開示の前に、公表されたある特許に、ＰＫを用いてＰｒＰＳｃを消化し、結合パートナー（リガンド）と結合するためにオクタリピート領域を保持する方法であって、ＰｒＰＳｃを部分的に消化するが、ＰｒＰＣを完全に消化するために、制御された消化条件を必要とする方法が開示された。（米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）。既に開示されたこの方法の１つの問題は、適当な条件が試料の違いで変化し、そのため実現に手がかかり、標準化が困難になり得ることである。既に開示されたこの方法は、ＰｒＰＳｃをＰｒＰＣと識別するために、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアに結合する第２の結合パートナーを全く使用しなかった。
【００８８】
ＰＫのような非特異的プロテアーゼの使用に伴う制約を回避するために、本発明者らは、ＰｒＰのオクタリピート領域内に切断部位を有していない他のプロテアーゼ、特に部位特異的プロテアーゼの使用を研究した。そのため、実質的に完全な消化をしても、オクタリピート領域は、消化されず、結合パートナーによる特異的で強力な結合のために、一貫して利用できる。ＰＫによる部分的消化と比較して、部位特異的プロテアーゼによる実質的に完全な消化は、実施および標準化が容易である。それに加え、本開示は、プロテアーゼによるＰｒＰＣからの対応エピトープの除去により、ＰｒＰＳｃには結合するが、ＰｒＰＣには結合しない第２の結合パートナーの使用を含むため、本開示法は、ＰｒＰの２型間の高い選択性という利点を得ている。
【００８９】
したがって、本明細書に記載の方法は、多量のＰｒＰＣを有し得る試料におけるＰｒＰＳｃの検出に関して、特異性、感度、使用し易さおよび再現性を高めることのできる改良に関する。
【００９０】
本開示のある種の実施形態では、使用する部位特異的プロテアーゼは、トリプシンまたはＳ−Ｖ８であり、その特異的切断部位は、図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示すように、既知のＰｒＰ配列のオクタリピート領域中に存在しない。それに加え、ＰＫの場合と異なり、トリプシンまたはＳ−Ｖ８による消化は、プリオン感染性に影響せず、ＰｒＰＳｃが、ＰＫよりこれらのプロテアーゼに対して耐性が高いことが示唆される（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ、３５巻、５７〜６２頁、およびＬａｎｇｅｖｅｌｄら（２００３年）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １８８巻、１７８２〜１７８９頁を参照されたい）。トリプシンまたはＳ−Ｖ８によりＰｒＰＳｃを処理すると、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア内の潜在的切断部位が保護されるため、（ヒトまたはシリアンハムスターの種に従って付番した場合）、各々４９〜２３１位または２３〜２３１位の残基を有するプロテアーゼ耐性断片が生成されよう。他方、ＰＫによりＰｒＰＳｃを処理すると、８０〜１００位あたりの残基で始まるＰＫ耐性断片のＮ末端を有する複数のプロテアーゼ耐性断片が生成されよう。ＰＫによるＰｒＰＳｃの正確な切断部位は、ＰｒＰＳｃが異なる立体構造を採ることができるので、変化を受けよう（Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、２０７９〜２０８２頁を参照されたい）。したがって、トリプシンまたはＳ−Ｖ８によるＰｒＰＳｃの処理は、ＰＫによる処理より一貫性が高く、長く、有用な断片を産生することになろう。
【００９１】
本開示の前に、１つの刊行物により、ＰｒＰＳｃに対してエピトープをアンマスクし、ＰｒＰＣの対応エピトープの利用可能性を除くために、トリプシンの使用が提案された。（国際公開第ＷＯ９９／１９３６０Ａ１号を参照されたい）。国際公開第９９／１９３６０Ａ１号で提案された免疫アッセイ法は、本開示法でトリプシンを使用した目的または結果が、ＰｒＰＳｃに対してエピトープをアンマスクすることではないので、本開示法とは異なる。それに加え、国際公開第９９／１９３６０Ａ１号で提案された方法は、オクタリピート領域に特異的な抗体とＰｒＰＳｃを結合させることを開示していなかった。したがって、本開示法は、結合パートナーをオクタリピート領域に結合させる高いアビディティによる高感度の利点を提供する。
【００９２】
本開示前の別の刊行物として国際公開第ＷＯ０３／００１２１１Ａ１号は、ＰＫなどのプロテアーゼによる限定的タンパク分解を伴う、プリオンタンパク質の存在を検出する方法を開示した。国際公開第０３／００１２１１Ａ１号に記載の方法の一実施形態では、トリプシンなどのプロテアーゼが、細胞または組織を溶解する工程および溶解物をＰＫで処理する工程の前に、組織解離を促進するために、細胞膜を破壊しないと見込まれる条件下で短時間使用された。
【００９３】
それに加え、本開示前の別の刊行物として国際公開第ＷＯ２００６／０８８２８１Ａ１号は、多量体形成性ポリペプチド（プリオンなど）の単量体から多量体を検出するための方法であって、トリプシンによる処理を伴う方法を開示した。国際公開第２００６／０８８２８１Ａ１号に開示された方法は、本開示法とは異なる。国際公開第２００６／０８８２８１Ａ１号は、この刊行物に開示された方法を用いると、オクタリピート配列に対する抗体がバックグランドを増加させたので、オクタリピート配列などの反復配列より、プリオンタンパク質中の非反復配列に対する抗体の使用を特異的に推進した。
【００９４】
最近の刊行物では、プロテアーゼのサーモリシンが、プリオン病の診断に用いられた（Ｏｗｅｎら（２００７年）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３５巻、１６１〜１７０頁を参照されたい）。サーモリシンは、プロテアーゼが接触可能なＰｒＰＳｃのアミノ末端領域にはない残基である、幾つかの疎水性残基で特異的に切断する。
【００９５】
したがって、本発明は、
（ａ）プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料であって、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい試料を得る工程、
（ｂ）前記ＰｒＰＳｃ、および存在する場合には前記ＰｒＰＣのタンパク分解消化が、実質的に完全である条件下で、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼで前記試料を処理する工程であって、
ｉ）前記ＰｒＰＳｃが、前記オクタリピート領域内または前記オクタリピート領域と前記プロテアーゼ耐性コアとの間に、前記プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、前記オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、前記プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有しており、前記少なくとも１つの利用可能な切断部位が、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、切断される
工程、
（ｃ）プロテアーゼ阻害剤の添加または前記プロテアーゼの除去により、（ｂ）における前記の実質的に完全なタンパク分解消化に続く、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程、
（ｄ）前記の部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させることにより、変性ＰｒＰＳｃを得る工程、ならびに
（ｅ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いて前記変性ＰｒＰＳｃの存在を検出する工程であって、
ｉ）前記第１の結合パートナーが、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、アミノ近接領域の前記断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合しており、
ｉｉ）前記第２の結合パートナーが、前記プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合しており、前記第２のエピトープが、前記の実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記第１のエピトープから分離されている、前記ＰｒＰＣの領域中にある
工程
を含む、アッセイ法を提供する。
【００９６】
本発明は、病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料であり、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい試料において、プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する前記ＰｒＰＳｃの存在を検出するキットであって、
（ａ）少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼであり、
ｉ）前記ＰｒＰＳｃが、前記オクタリピート領域内または前記オクタリピート領域と前記プロテアーゼ耐性コアとの間に、前記プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、前記オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、前記プロテアーゼによるＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、前記プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有している
プロテアーゼ、
（ｂ）場合により、前記プロテアーゼの活性を阻害できるプロテアーゼ阻害剤、
（ｃ）場合により、前記ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤、
（ｄ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーであり、
ｉ）前記第１の結合パートナーが、前記プロテアーゼによる前記ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、アミノ近接領域の前記断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合しており、
ｉｉ）前記第２の結合パートナーが、前記プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合しており、前記第２のエピトープが、前記プロテアーゼによる前記ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後、前記第１のエピトープから分離されている、前記ＰｒＰＣの領域中にある
結合パートナー、ならびに
（ｅ）任意の病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、前記キットを使用するための説明書
を含むキットも提供する。
【００９７】
部位特異的プロテアーゼ
本発明において有用な部位特異的プロテアーゼは、特定の個別のアミノ酸残基のペプチド結合を切断するプロテアーゼである。一般に、部位特異的プロテアーゼは、１つの形式で、または少数の特定のアミノ酸残基において、タンパク質を切断するため、プリオンタンパク質の切断において予測性が可能となる。このような部位特異的プロテアーゼの例は、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）のカルボキシ側のアミノ酸がＰｒｏでない場合、ＫまたはＲ残基のカルボキシ側において切断する部位特異的プロテアーゼであるトリプシン、ならびにＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基のカルボキシ側において切断する、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８株由来の部位特異的プロテアーゼであるＳ−Ｖ８である。トリプシン切断の特異性については、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら（１９５０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．４６巻、７０頁；Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ（１９６４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５２巻、８８４〜８８９頁；Ｗａｌｓｈ（１９７０年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９巻、４１頁を参照されたい。Ｓ−Ｖ８切断の特異性については、例えば、Ｄｒａｐｅａｕら（１９７２年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４７巻、６７２０〜６７２６頁、およびＨｏｕｍａｒｄ ら（１９７２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９巻、３５０６〜３５０９頁を参照されたい。トリプシンおよびＳ−Ｖ８は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬの一部門のＰｉｅｒｃｅ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯなどの様々な企業から市販されている。
【００９８】
他のこのような部位特異的プロテアーゼは、当業者により容易に選択することができる。
【００９９】
それに加え、該方法で有用となるには、プリオンタンパク質において、アッセイ法で使用される２種の結合パートナーが認識するエピトープ間の領域に、部位特異的プロテアーゼに対する切断部位があらねばならない。少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼ耐性コア領域（プリオンタンパク質のおよそ９０〜２３１位アミノ酸）内にあり、この部位は、プリオンタンパク質がＰｒＰＣ形態を採る場合にだけ、部位特異的プロテアーゼにより切断され、プリオンタンパク質がＰｒＰＳｃ形態を採る場合には、切断されることはなかろう。該エピトープの少なくとも１つは、プリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア領域にあるのが好ましかろう。少なくとも１つの他のエピトープは、プリオンタンパク質のアミノ近接領域内に位置するのが好ましく、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内に位置するのが、より好ましかろう。好ましくは、部位特異的プロテアーゼは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内の部位で切断しない。オクタリピート領域の反復コア配列は、ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）であるが、これは、様々な種からのプリオンでは若干変化し得る（オクタリピート配列を示す異なる１０種のプリオンタンパク質の配列については、図１Ａおよび１Ｂまたは２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。一部の文献では、オクタリピート領域の反復コア配列は、Ｐ（Ｈ／Ｑ）ＧＧＧ（−／Ｔ）ＷＧＱ（例えば、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）（配列番号１２）と開示されたが、これは、本明細書に開示したオクタリピート配列を若干、移動・変化させたものであるとはいえ、両オクタリピート配列は、明らかに同じ領域に関係している。図３は、オクタリピート領域、例示的なエピトープ部位、および例示的な部位特異的プロテアーゼ切断部位を示す、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃ形態の概略表示を示す。部位特異的プロテアーゼは、ＥＬＩＳＡで使用される２種の結合パートナー、好ましくは抗プリオン抗体が認識するエピトープ間の少なくとも１つの部位で、ＰｒＰＣ形態を切断することになろう。したがって、ＰｒＰＣ形態は、ＥＬＩＳＡで検出されることはなかろう。しかし、ＰｒＰＳｃ形態は、このイソフォームの立体構造が当該部位をプロテアーゼ切断に対して利用不能にするので、２個のエピトープ間の領域で部位特異的プロテアーゼにより切断されることはなかろう。したがつて、ＰｒＰＳｃはＥＬＩＳＡで検出されよう。
【０１００】
プロテアーゼ処理
上記のように、分析しようとする試料は、当然ながら多量のＰｒＰＣを含有し得る。ＰＫは、ＰｒＰＣ形態を消化して、耐性のより高いＰｒＰＳｃ形態を残すために、他の状況で使用されてきた。しかし、ＰｒＰＳｃは、ＰＫ処理がこの病原型の感染性を低下させるという事実で示されるように、高濃度のＰＫおよび／または長い曝露時間を使用すれば、タンパク分解に対して完全には耐性でない。ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁を参照されたい。そのため、ＰＫ処理は、ＰｒＰＣ形態を完全に切断するが、ＰｒＰＳｃ形態の耐性コアを無傷で残すために、注意深く制御しなければならない。ＰＫ消化が過少であれば、残存ＰｒＰＣ形態をを残して、検出段階で擬陽性を生じ、ＰＫ消化が過多であれば、ＰｒＰＳｃ耐性コアを切断して、検出段階で検知不能となろう。それに加え、該病原型が複数の立体構造を採ることができるため、ＰｒＰＳｃの特定のＰＫ消化部位（複数も）は変化するが、ＰｒＰＳｃのＰＫ消化は、９０〜２３１位残基あたりに複数のプロテアーゼ耐性断片を通常生成し、このため、この領域中のエピトープに対して向けられる抗プリオン抗体の結合が、低下または消失することもある。Ｔｅｌｌｉｎｇら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、２０７９〜２０８２頁を参照されたい。
【０１０１】
本開示では、病原型プリオンタンパク質を含有する疑いのある試料は、任意の非病原性プリオンタンパク質が実質的に完全に消化されると思われる条件下で、選定した部位特異的プロテアーゼで処理される。当業者には、適当な条件を決定するだけの能力がある。実質的に完全な消化条件は、組換えＰｒＰを用いた試験により、容易に決定することができる。部位特異的プロテアーゼとしてトリプシンについては、通常、好ましくは１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．２Ｍ ＣａＣｌ２入りのＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１時間、３７℃に対して、トリプシン濃度５０μｇ／ｍｌ、およびＴＢＳＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％サルコシル）中で１時間、３７℃に対して、トリプシン濃度１０μｇ／ｍｌが、共に十分である。
【０１０２】
非病原性プリオンタンパク質の実質的に完全な消化の後、例えば、検出に使用されることになる抗プリオン抗体の更なる何らかのプロテアーゼ消化を防止するために、部位特異的プロテアーゼを除去、不活性化または阻害しなければならない。該プロテアーゼは、１種または複数のプロテアーゼ阻害剤の添加により阻害し得る。プロテアーゼ阻害剤は、当技術分野で周知であり、それには、とりわけ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）および１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＬＣＫ）が挙げられる。あるいは、一部のプロテアーゼは、従来手段（例えば、遠心分離、ろ過など）により反応物から容易に除去できる固定化型（例えば、アガロースマトリックス中）で入手できる。
【０１０３】
変性
部位特異的プロテアーゼによる試料の消化および該プロテアーゼの阻害／除去をした後、ＰｒＰＳｃを含有する疑いのある消化済み試料は、エピトープを感度良く検出するために、変性される。
【０１０４】
変性は、幾つもの方法で実現することができる。一実施形態では、カオトロピック剤、好ましくはグアニジニウム化合物、例えばグアニジンチオシアネートまたは塩酸グアニジンが、３Ｍ〜６Ｍの間の濃度まで添加される。こうした濃度のカオトロピック剤の添加は、病原性プリオンタンパク質を変性させる。この実施形態については、カオトロピック剤は、結合パートナー、例えばＥＬＩＳＡで使用する抗プリオン抗体のプリオンエピトープへの結合を妨害すると見込まれるので、検出を行う前に除去または希釈しなければならない。
【０１０５】
別の実施形態では、変性は、ｐＨを１２以上（「高ｐＨ」）へ上げること、またはｐＨを２以下（「低ｐＨ」）へ下げることのいずれかで、実現される。ｐＨ解離／変性技法の詳細は、その開示内容の全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ第２００６／００１４３７号および米国特許出願第１１／５１８０９１号に記載されている。未変性ＰｒＰＳｃの高ｐＨまたは低ｐＨいずれかへの曝露によって、病原性プリオンタンパク質の変性が起こる。この実施形態では、ＰｒＰＳｃの高ｐＨへの曝露が好ましい。１２．０〜１３．０の間のｐＨが、一般に十分であり、好ましくは１２．５〜１３．０の間のｐＨが使用され、より好ましくは１２．７〜１２．９のｐＨ、最も好ましくは１２．９のｐＨが使用される。あるいは、ＰｒＰＳｃの低ｐＨへの曝露を、病原性プリオンタンパク質を変性させるために、使用することができる。この代替法については、１．０〜２．０の間のｐＨが十分である。プロテアーゼ消化試料の高ｐＨまたは低ｐＨいずれかへの曝露は、ほんの短時間、例えば６０分間、好ましくは１５分間以下、より好ましくは１０分間以下、実施される。これより長く曝露すると、検出工程で使用する結合パートナーにより認識されるエピトープが破壊されるほど、病原性プリオンタンパク質の構造が相当に劣化する恐れがある。
【０１０６】
ＰｒＰＳｃの変性に十分な時間曝露した後、酸性試薬（高ｐＨの変性条件を使用した場合）または塩基性試薬（低ｐＨの変性条件を使用した場合）いずれかの添加によって、ｐＨを中性（即ち、約７．０〜７．５の間のｐＨ）に容易に再調整することができる。当業者は、適当な手順を容易に決定することができ、実施例が、本明細書に記載されている。変性工程で使用する高ｐＨまたは低ｐＨは、小容量の適切な酸または塩基の添加により、中性に容易に再調整できるので、この実施形態によって、追加の洗浄をせず、試料容量をさほど増加させずに、検出工程、例えばＥＬＩＳＡにおける直接使用が可能になる。
【０１０７】
一般に、高ｐＨの変性条件を生み出すには、約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度へのＮａＯＨの添加で十分である。好ましくは、ＮａＯＨが０．０５Ｎ〜０．１５Ｎの間の濃度へ添加され、より好ましくは０．１Ｎ ＮａＯＨが使用される。ＰｒＰＳｃの変性が実現した後、酸性溶液、例えばリン酸、一塩基性リン酸ナトリウムを適量添加することにより、中性（即ち、約７．０〜７．５の間）にｐＨを再調整することができる。
【０１０８】
一般に、低ｐＨの変性条件を生み出すには、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度へのＨ３ＰＯ４の添加で十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４が０．３Ｍ〜０．６Ｍの間の濃度へ添加され、より好ましくは０．５Ｍ Ｈ３ＰＯ４が使用される。ＰｒＰＳｃの変性が実現した後、塩基性溶液、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨを適量添加することにより、中性（即ち、約７．０〜７．５の間）にｐＨを再調整することができる。
【０１０９】
変性試料は、ＰｒＰＳｃを更に検出するために使用することができる。
【０１１０】
検出
変性したＰｒＰＳｃは、プリオン配列に特異的な少なくとも２種の結合パートナーで検出でき、一方の結合パートナーが、変性ＰｒＰＳｃのアミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域にあるエピトープに特異的に結合し、他方の結合パートナーが、プロテアーゼ切断によりＰｒＰＣ中ではもはや利用できない、変性ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアにあるエピトープに特異的に結合する。
【０１１１】
該方法のある種の実施形態では、結合パートナーは抗体であり、こうした中の好ましい実施形態は、ＥＬＩＳＡを用いて実施される検出工程を有する。
【０１１２】
他のある種の実施形態では、該方法で使用される結合パートナーは、第１のエピトープおよび第２のエピトープに特異的なアプタマーである。
【０１１３】
プリオン、特にＰｒＰＣまたは変性ＰｒＰに結合する抗体、修飾抗体および他の試薬は、これまでに記載されており、こうしたものの一部は市販されている（例えば、Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４頁；Ｐｅｒｅｔｚら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１２巻、７３９頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２巻、９４１３頁；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）上記参照；米国特許第６７６５０８８号に記載の抗プリオン抗体を参照されたい）。こうしたものの一部および他のものは、とりわけ、Ｉｎ Ｐｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ， Ｚｕｒｉｃｈから市販されている。修飾抗体の記載については国際公開第０３／０８５０８６号も参照されたい。
【０１１４】
好ましい抗プリオン抗体は、病原性プリオンの変性型に結合する抗体となろう。
【０１１５】
特に好ましい第１の抗体は、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内に位置する第１のエピトープに対する抗体となろう。このような抗体の例は、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７である。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ４巻、８０５〜８１４頁；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）。
【０１１６】
ある種の実施形態では、第１の抗体は、オクタリピート領域の外部にあるエピトープと結合しよう。こうした実施形態における例示的な第１の結合パートナーには、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３などのモノクローナル抗体が挙げられる（例えば、Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁を参照されたい）。
【０１１７】
好ましい第２の抗体は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コア領域内にあり、プロテアーゼ切断によりＰｒＰＣ中ではもはや利用できない、第２のエピトープを認識する抗体となろう。ＰｒＰＣのプロテアーゼ耐性コア領域中のトリプシンに対する第１の切断部位は、Ｓ−Ｖ８に対する相当部位と異なるので（ヒトＰｒＰに従って付番した場合、トリプシンに対してＫ−１０６およびＳ−Ｖ８に対してＤ−１４４）、トリプシン消化ＰｒＰＳｃには、Ｓ−Ｖ８に対するより、有用なエピトープが存在することになろう。
【０１１８】
トリプシンで消化される実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、３Ｆ４（米国特許第４８０６６２７号）、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９（ＰＯＭ抗体については、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ４巻、８０５〜８１４頁を参照されたい）、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０（Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ら（１９９６年）Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｅｒａｕｄｅｔら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号）、Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３巻、６１４頁）、６Ｈ４（Ｌｉｕら（２００３年）Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１巻、１０６５頁）およびＢＤＩ１１５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）などのモノクローナル抗体が挙げられる。３Ｆ４抗体は、ヒトＰｒＰの１０９〜１１２位アミノ酸にあるエピトープＭＫＨＭを認識する。他の抗体は、ヒトＰｒＰ種に従って付番した場合、約１０７位アミノ酸から約２３１位アミノ酸までの領域内にある各種エピトープを認識する。
【０１１９】
トリプシンを使用する方法のある種の実施形態では、第２の結合パートナーは、ＰｒＰの球状ドメイン（即ち、ＰｒＰの約１２２位アミノ酸から約２３１位アミノ酸まで）内に位置するエピトープに特異的に結合する。こうした実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１２０】
Ｓ−Ｖ８で消化される実施形態における例示的な第２の結合パートナーには、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５などのモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１２１】
他の抗プリオン抗体は、当技術分野で周知の方法により容易に生成することができる。
【０１２２】
本明細書における開示から、当業者であれば、第１および第２の抗体は、第１の抗体が、アミノ近接領域、好ましくはオクタリピート領域にある第１のエピトープに特異的に結合し、第２の抗体が、ＰｒＰＣ中では切断・除去されてしまった、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアの領域内にある第２のエピトープに特異的に結合するように、選択されることが理解されよう。このようにして、部位特異的プロテアーゼによる消化の後、第１および第２の抗体により認識されるエピトープは、ＰｒＰＣの異なる断片上に存在する（そのため、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出できない）が、これらのエピトープは、ＰｒＰＳｃの単一断片上に存在する（そのため、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出できる）ことになろう。
【０１２３】
一部の抗プリオン抗体は、１つまたは限定数の動物種に由来するプリオンタンパク質に特異的であり、他の該抗体は、多くの動物種に由来するプリオンタンパク質に結合できる。分析しようとする試料および試験目的に基づいて適切な抗プリオン抗体を選定することは、明白であろう。
【０１２４】
プロテアーゼ消化し、変性した病原性プリオンタンパク質は、好ましくは、直接ＥＬＩＳＡ型または抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイのいずれかとしてのＥＬＩＳＡ型アッセイで検出されるが、これらのアッセイについては以下でより十分に説明する。抗プリオン抗体による検出を述べるために、用語「ＥＬＩＳＡ」を使用するが、このアッセイは、抗体が「酵素結合」されているアッセイに限らない。検出抗体は、本明細書に記載され、免疫アッセイ技術分野で周知の検出可能標識のいずれかで標識することができる。
【０１２５】
該方法の好ましい実施形態では、プロテアーゼ消化し、変性した病原性プリオンタンパク質は、抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて検出される。この実施形態では、変性プリオンタンパク質は、捕捉抗体を含む固体支持体上に捕捉されるが、その抗体は、異なる実施形態において第１の抗体、第２の抗体いずれの場合もある。捕捉プリオンタンパク質を有する固体支持体は、未結合物質を除くために、場合により洗浄し、次いで、検出抗体が捕捉プリオンタンパク質に結合するのを可能にする条件下で、捕捉抗体がどんなものであるか（捕捉抗体は検出抗体と異なる）に応じて、第２の抗体、第１の抗体いずれの場合もある検出抗体と接触させる。前記サンドイッチＥＬＩＳＡを実施する方法は、良く知られており、本明細書の実施例に記載されている。
【０１２６】
適切な固体支持体には、不溶性マトリックスであり、病原性プリオン特異試薬を結合または結び付けできる、剛直または半剛直な表面を有する任意の材料が含まれる。例示的な固体支持体には、それだけに限らないが、ニトロセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、多糖類、ポリフッ化ビニル；ジアゾ紙；活性化ビーズ、磁気応答ビーズ、ならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリッド形成反応、免疫アッセイおよび他のそのような応用に汎用される任意の材料が挙げられる。該支持体は、粒状でもよく、または連続表面の形態を採ってもよく、それには膜、メッシュ、板、ペレット、スライド、円板、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、中実繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、多孔ガラスビーズ、シリカゲル、場合によりジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によりＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズ、ならびに疎水性ポリマーをコートしたガラス粒子などの基質が挙げられる。第１の抗体に対する好ましい固体支持体は、マイクロタイタープレートである。
【０１２７】
好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体または検出抗体のいずれかは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内にあるエピトープを認識する。幾つかの実施形態では、検出抗体は検出可能に標識される。更なる実施形態では、検出抗体は酵素で標識される。
【０１２８】
他のある種の実施形態では、該方法に使用される結合パートナーはアプタマーである。アプタマーは、抗体の分子認識性を有する核酸である。アプタマーは、抗体より小さく、抗体ほど複雑ではないため、製造および修飾をより容易にし得る。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら（１９９７年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １巻、５〜９頁；Ｂｕｎｋａら（２００６年）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４巻、５８８〜５９６頁を参照されたい）。タンパク質エピトープに特異的なアプタマーを生成する方法は、容易に入手できる（例えば、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻、５０５〜５１０頁；Ｃｏｘら（１９９８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １４巻、８４５〜８５０頁；Ｃｏｘら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻、ｅ１０８頁を参照されたい）。アプタマーは、検出容易な活性を有する酵素に結合することができる（例えば、Ｄｒｏｌｅｔら（１９９６年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻、１０２１頁を参照されたい）。
【０１２９】
病原性プリオンに対する上記の検出法のいずれも、任意の試料においてプリオン関連疾患を診断する方法において使用することができる。
【０１３０】
本明細書に記載の方法で使用するために、試料は、病原性プリオンタンパク質を含有することが知られている、または疑われる任意の試料でもよい。幾つかの実施形態では、試料は、生体試料（即ち、生存中または死後の生物体）または非生体試料である。幾つかの実施形態では、試料は生体試料である。生体試料の非限定的例は、臓器（例えば、脳、肝臓および腎臓）、細胞、全血、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、筋肉および脂肪組織（例えば、肉）、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検、剖検、生存中または死後の生物体から供給される食物、ならびに植物材料などの他の任意の有機物である。幾つかの実施形態では、生体試料は、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球または血清を含む。生体試料は、血液の提供もしくはスクリーニング、生検、検視もしくは剖検などの保健関連の手順中に、または動物の選択および屠殺ならびに最終製品の品質保証試験などの食品調製の工程もしくは手順中に得ることができる。幾つかの実施形態では、試料は非生体試料である。非生体試料の非限定的例には、医薬品、化粧品およびパーソナルケア製品、汚染機器、ならびに生存中または死後の生物体以外から供給される食物などが挙げられる。
【０１３１】
適切な対照も、本明細書に記載のアッセイで使用することができる。例えば、ＰｒＰＣの陰性対照が、該アッセイで使用することができる。ＰｒＰＳｃ（またはＰｒＰｒｅｓ）の陽性対照も、該アッセイで使用することができる。このような対照には、場合により検出可能に標識することができる。
【０１３２】
キット
部位特異的プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤（任意選択）、変性剤（または変質剤、任意選択）、抗体などの抗プリオン結合パートナーなどを含む上記のアッセイ試薬は、上記の検出アッセイを行うために、適切な使用説明書および他の必要試薬と共に、キットに入れて提供することができる。該キットは、上記のように、適切な陽性および陰性対照を更に含有し得る。該キットは、使用する特定の検出アッセイに応じて、適切な標識、ならびに他の包装入り試薬および材料（即ち、洗浄緩衝液など）を含有することもできる。
【実施例】
【０１３３】
本明細書に開示した発明をより効率的に理解できるように、実施例を以下に示す。こうした実施例は、例示だけを目的としており、本発明をいかようにも限定しようとするものではないことを理解されたい。
【０１３４】
（実施例１）
３Ｆ４凍結乾燥プレートのコーティング
以下に示す幾つかの実施例における捕捉抗体として、市販のモノクローナル抗体３Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）を使用した。これは、ヒトプリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性コア領域に位置する、１０９〜１１２位残基（アミノ酸ＭＫＨＭ）を特異的に認識する。それをコーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９）中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、撹拌しながら室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。希釈抗体３Ｆ４を、１５０μＬ／ウェルの容量でＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ ＭｉｃｒｏＬｉｔｅ ２＋の各マイクロプレートに添加し、次いで湿気を含んだラップ密封トレー中でＲＴで終夜インキュベートした。プレートは、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｌｘ４５０洗浄器上でＴｗｅｅｎ ２０入りＴｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液（３％スクロース入りＴｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に０．０１×ＢｌｏｃｋｅｒＣａｓｅｉｎ）を、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｌｘ４５０洗浄器上で３００μＬ／ウェルの容量でプレートに分配し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートは、１６℃で終夜凍結乾燥し、各プレートを乾燥剤３個入りのパウチ中に入れ、二重に密封し、４℃で保存した。一般に、すべての被覆プレートは、使用前に、３７℃で１時間、０．０２％カゼインでブロックした。
【０１３５】
（実施例２）
正常ヒト血漿試料のトリプシン消化
（Ａ）トリプシンによる血漿の消化
トリプシンが、ＰｒＰＣを分解し、ＥＬＩＳＡによるその検出を不能にするか否かを試験するために、ＴＢＳＴ中の１０％正常ヒト血漿を、増加するトリプシン濃度で処理した（表１）。この実施例および以下の実施例で使用したトリプシンは、Ｐｉｅｒｃｅ（ＴＰＣＫ Ｔｒｙｐｓｉｎ、カタログ番号２０２３３）から得た。消化物は、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした。消化は、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、最終濃度１ｍＭ）を添加し、ＲＴで１５分間、インキュベーションすることにより停止させた。トリプシン処理試料は、１％（正常ヒト血漿に対し）に希釈し、１５０μＬをＥＬＩＳＡ用の各ウェル中で使用した。
【０１３６】
（Ｂ）ＰｒＰＣのＥＬＩＳＡ分析
捕捉抗体として３Ｆ４、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートしたＰＯＭ２抗体（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、上記）による検出を用いて、光検出のために化学発光基質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＰｒＰＣの有無について試料を試験した。ＰＯＭ２は、５９〜９１位残基内にあるオクタリピートエピトープを特異的に認識する。
【０１３７】
手短に言うと、トリプシン処理血漿試料をＴＢＳＴ中１％（元のヒト血漿に対し）に希釈し、１５０μＬ／ウェルの容量で３Ｆ４被覆プレートへ移した。プレートを４００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした後、ＴＢＳＴで６回洗浄した。ＡＰコンジュゲートＰＯＭ２検出抗体（０．０１μｇ／ｍＬ）を１５０μＬ／ウェルの容量でプレート中に添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートを再びＴＢＳＴで６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質１５０μＬ／ウェルをプレートに添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし、シグナルをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。その結果を表１に示し、測定単位を相対発光量（ＲＬＵ）で規定している。
【０１３８】
【表１】
この結果は、トリプシンがヒト血漿中のＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣの検出が、より高いトリプシン濃度で処理した試料では無効になったことを示している（表１）。検出ＰｒＰＣレベルとトリプシン濃度との間に用量応答が見出された。トリプシン濃度４００μｇ／ｍＬでは、ＰｒＰＣレベルが、バックグランドレベルの１／１００に低下した。
【０１３９】
（実施例３）
シリアンハムスターの正常脳ホモジェネート試料のトリプシン消化
この実施例では、シリアンハムスター（ＳＨａ）の正常脳ホモジェネート（ＢＨ）中に存在するＰｒＰＣのトリプシン消化を試験した。
【０１４０】
１０％のＳＨａ ＢＨ（ｗ／ｖ）５μＬを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．２Ｍ ＣａＣｌ２入りのＴＢＳＴ中で、７５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、増加するトリプシン濃度（表２）でトリプシン５μＬと混合した。各消化試料をＴＢＳ１４０μＬの添加により希釈し、１００ｍＭ ＰＭＳＦ１．５μｌ／ウェルの添加（最終ＰＭＳＦ濃度１ｍＭとする）、および７５０ｒｐｍの振とうを伴うＲＴで１０分間のインキュベーションによって、消化を停止させた。
【０１４１】
トリプシン消化ＳＨａ ＢＨ試料は、実施例２に記載のように、捕捉抗体として３Ｆ４、およびＡＰコンジュゲートＰＯＭ２抗体による検出を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＰｒＰＣの有無について試験した。消化溶液各１５０μＬを３Ｆ４被覆マイクロプレートの各ウェル中へ移し、３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、０．０１×カゼイン−ＴＢＳＴ中のＡＰコンジュゲートＰＯＭ２ ０．０１μｇ／ｍＬを１５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。基質を添加し、実施例２に記載のように、プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。その結果を表２に示す。
【０１４２】
【表２】
ヒト血漿の結果と同様、トリプシンは、ＳＨａ脳ホモジェネート中のＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣの検出は、やはり無効になった（表２）。血漿とは対照的に、脳ホモジェネート中のＰｒＰＣの効率的分解が、血漿中のＰｒＰＣの効率的分解に必要なトリプシン濃度より遥かに低い、トリプシン濃度２５μｇ／ｍＬで実現された。
【０１４３】
（実施例４）
シリアンハムスターの脳ホモジェネート試料のトリプシンおよびＰＫ消化、ならびにＰＯＭおよび３Ｆ４抗体による検出
この実施例では、異なる４対のモノクローナル抗体ならびにＰＫおよびトリプシンの濃度１点を用いて、シリアンハムスターの病原型プリオンＰｒＰＳｃのＥＬＩＳＡ検出に対する、トリプシンおよびＰＫ消化の効果を比較した。
【０１４４】
（Ａ）トリプシンまたはＰＫによるＳＨａ ＢＨの消化、および消化試料の変性
５％のＳＨａ ＢＨ試料（正常または感染）２μＬを、同一濃度の２５μｇ／ｍＬ、各最終反応容量２μＬのトリプシンまたはＰＫで、３７℃で１時間処理した。消化は、ＰＭＳＦ（２ｍＭ、ＲＴで１０分間）で停止させた。
【０１４５】
抗体のＰｒＰＳｃに対する最大限の結合を確保するために、試料を塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）で変性させた（最終濃度３Ｍ、ＲＴで１時間）。次いで、変性試料を０．１Ｍ ＧｄｎＨＣｌに希釈し、様々なｍＡｂで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加した。
【０１４６】
（Ｂ）ＰｒＰＳｃのＥＬＩＳＡ分析
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９中、２．５μｇ／ｍＬのｍＡｂとして３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７の１５０μＬで、４℃で終夜コーティングした。使用前に、プレートを０．０２％カゼインで３７℃で１時間ブロックした。ＰＯＭ１７は、約９０〜２３１位残基のプロテアーゼ耐性断片内にあるエピトープ、特に、約１２２〜２３１位残基の球状ドメイン内にあるエピトープを認識する。
【０１４７】
プロテアーゼ消化した後、変性したＳＨａ ＢＨ試料を、３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７で被覆したプレートへ、最終容量１５０μＬ／ウェルで移した。プレートを３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗浄した。共に最終濃度０．０１μｇ／ｍＬのＡＰコンジュゲートＰＯＭ２（ＰＯＭ２ＡＰ）またはＡＰコンジュゲートＰＯＭ１７（ＰＯＭ１７ＡＰ）を、最終容量１５０μＬ／ウェルでプレート中に添加し、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートを再びＴＢＳＴで洗浄し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質を添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし、実施例２に示すように、シグナルを読み取った。このサンドイッチＥＬＩＳＡ実験の結果を表３に示す。
【０１４８】
【表３】
表３に示した結果から、ＰＫは、トリプシン消化試料と比較して、全例において検出シグナルを低下させることが判明した。感染脳ホモジェネートにおける検出抗体または捕捉抗体のいずれかとしてＰＯＭ２を使用したとき（１、３および４行目）、トリプシンおよびＰＫの消化試料間で７０％超の低下が認められた。例えば、３Ｆ４／ＰＯＭ２ＡＰ（捕捉／検出）で得たシグナルは、２３７０から５２７ＲＬＵへ低下した。同様な比率のシグナル低下が、ＰＯＭ２／ＰＯＭ１７ＡＰよびＰＯＭ１７／ＰＯＭ２ＡＰについても認められた。シグナル低下の原因は、ＰＯＭ２に認識され、２３〜８９位残基内にあるオクタリピートエピトープのＰＫ消化である。
【０１４９】
感染脳ホモジェネート試料をＰＫで処理し、３Ｆ４／ＰＯＭ１７ＡＰで検出したとき、これらの抗体に対するエピトープがプロテアーゼ耐性コア中にあっても、シグナルの２０％低下も認めた。このシグナル低下は、制限されたＰＫ消化でも、９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性断片に影響し得ることを示唆している。ＰｒＰのオクタリピート領域に特異的に結合するＰＯＭ２を、トリプシン消化後の検出抗体として使用したとき、最高の読取値が認められたことは、注目に値する。ＰＯＭ２を捕捉抗体として使用したとき、２番目に高い読取値が認められた。結論として、４個のオクタリピートの存在下で、ＰＯＭ２は、複数のエピトープに結合し、そのため、１個だけのエピトープを認識するＰＯＭ１７、３Ｆ４などの抗体より強力な結合を有する。
【０１５０】
（実施例５）
様々な種のＰｒＰに対する抗ＰｒＰ抗体のスクリーニング
オクタリピート領域に対するモノクローナル抗体のＳＡＦ−３２を含め、表４に示すような多数の抗ＰｒＰ抗体について、様々な動物種の組換えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）およびマウスＰｒＰＳｃに対する結合能をスクリーニングした。
【０１５１】
【表４】
（Ａ）各種ＰｒＰによるプレートのコーティング
こうした工程の後で、幾つかのマイクロプレートをウシ、シカ、ヒト、ヒツジまたはマウスの組換えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）でコーティングした。各ｒＰｒＰを、１、０．１、０．０１および０．００１μｇ／ｍｌに希釈し、３Ｍグアニジンチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）中で変性させ、ＲＴで１０分間インキュベートし、変性ｒＰｒＰの１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに２ウェルずつ添加した。次いで、各ウェルに０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８を１００μｌ添加し、プレートを４℃で終夜インキュベートした。
【０１５２】
こうした工程の後で、他のマイクロプレートはマウスＢＨのＰｒＰＳｃでコーティングした。ＰｒＰＳｃ感染マウスＢＨ（４００μＬの１０％ＢＨ）を、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳ中で融解し、４℃で１時間の遠心２００００ｒｐｍで沈降させた。その沈澱をｐＨ７．５のＴＢＳ１ｍＬで各々洗浄し、４℃で１０分間の遠心２００００ｒｐｍで再沈降させた。そのペレット各々を３ＭのＧｄｎＳＣＮ ４ｍＬ中に再懸濁させて、最終濃度を１％ＢＨに到達させ、ＲＴで１５分間で変性させた。変性ＢＨ試料を３ＭのＧｄｎＳＣＮ中０．１％、０．０１％および０．００１％に希釈し、各濃度のＢＨを１００μｌ／ウェル、プレートに二重に添加した。０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８の１００μｌ／ウェルを、ＢＨ試料の各ウェルに添加した。インキュベーションを４℃で終夜行った。
【０１５３】
（Ｂ）各種抗体の被覆ＰｒＰに対する結合を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ
各プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、各ウェルを２００μＬのＴＢＳ中３％ＢＳＡでブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。緩衝液を吸引した後、スクリーニングしようとする一次抗体１００μＬ／ウェルを、１％ＢＳＡ入りＴＢＳ中に０．５μｇ／ｍｌで添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した後、スクリーニングされる一次抗体に結合し、１％ＢＳＡ入りＴＢＳ中に１：５０００で希釈された、ＡＰコンジュゲート二次抗体１００μＬ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで６回再び洗浄した。０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質１００μＬ／ウェルを添加し、３７℃で３０分間、インキュベートした。シグナルをルミノメーターで読み取り、各ＰｒＰの異なる被覆量２点、即ち、各ｒＰｒＰに対してアッセイ当たり０．１ｎｇおよび１ｎｇ、ならびにマウスＢＨのＰｒＰＳｃに対してアッセイ当たり０．１ｍｇおよび１ｍｇに関する結果を表５に示す。
【０１５４】
表５における結果は、オクタリピート領域を特異的に認識するＳＡＦ−３２が、試験したすべての動物種、即ちウシ、シカ、ヒト、ヒツジおよびマウスのＰｒＰタンパク質に結合したことを示す。ＳＡＦ−３２の最強の結合は、ウシ、シカ、ヒトおよびヒツジのｒＰｒＰに対する結合であった。この結果は、ＳＡＦ−３２と脳ホモジェネート中のマウスＰｒＰＳｃとの間にも、相当程度の結合を示した。
【０１５５】
【表５】
（実施例６）
プロテアーゼ処理し、変性を伴うまたは伴わない、ヒト正常またはｖＣＪＤ ＢＨ試料におけるＰｒＰのＳＡＦ−３２および３Ｆ４ＡＰ抗体を用いた検出
この実施例では、ヒト正常またはｖＣＪＤ感染ＢＨ試料をトリプシンまたはＰＫで処理し、次いで変性させるか、または変性させないままにした後、捕捉抗体としてＳＡＦ−３２および検出抗体として３Ｆ４ＡＰを用いて検出した。
【０１５６】
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨ２ＣＯ３３、ｐＨ８．８中で希釈した３．３μｇ／ｍＬのＳＡＦ−３２を１５０μＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜コーティングし、ＴＢＳＴで洗浄し、使用前に、３７℃で１時間、１％カゼインでブロックした。
【０１５７】
１０％ヒト正常またはｖＣＪＤ ＢＨ試料（ｗ／ｖ）１μｌを、トリプシンまたはＰＫの最終濃度が２５μｇ／ｍＬとなるようにトリプシンまたはＰＫを有する、ＴＢＳＴＴ（ＴＢＳ、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−００）の１μＬに添加した。プロテアーゼによる消化を３７℃で１０分間、実施した後、２ｍＭのＰＭＳＦで停止させた。消化試料を変性させないままか、または４ＭのＧｄＨＣｌによりＲＴで１時間変性させた。非変性試料は、ＴＢＳＴで１５０μＬに希釈した。変性溶液は、最終濃度が０．１ＭのＧｄＨＣｌとなるように、ＴＢＳＴで１５０μＬに希釈した。試料を、ＳＡＦ−３２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で被覆したマイクロプレートに、容量１５０μＬ／ウェルで４℃で終夜の間添加した。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＡＰコンジュゲート３Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｓ）の１５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ基質を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、既述した実施例に示すように、シグナルのレベルをルミノメーターで測定した。測定単位は、相対発光量（ＲＬＵ）で規定される。結果は、表６および図４に示されており、ｖＣＪＤ試料と正常試料との結果の比率を計算し、表７に示してある。
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
【表７】
結果に示すように、トリプシンまたはＰＫによる処理は、正常組織中のＰｒＰＣを大部分またはすべて消化し、検出は、変性後にようやく５０．４ＲＬＵ以下であった。非変性ｖＣＪＤ組織は、何ら有意の読取値を示さなかった。したがって、ＳＡＦ−３２および３Ｆ４の抗体併用によるＰｒＰＳｃの効率的検出には、ＰｒＰＳｃの変性が必要であると結論することができる。
【０１６０】
それに加え、本実施例における結果は、ｖＣＪＤ ＢＨ試料のトリプシンによる処理と、その後の変性が、正常ＢＨ試料で検出されるシグナルより３２倍高い、１６５３ＲＬＵの強いシグナルを生じることを示した。ＰＫによるｖＣＪＤ試料の同様な処理は、トリプシン処理と比較して、２２６ＲＬＵの遥かに低いシグナルを生じており、このシグナルは、ＰＫ処理正常試料で検出されるシグナルより１２．５倍高い。この実施例も、ＰｒＰＳｃＮ末端中のオクタリピート領域内で切断するＰＫ消化後のＰｒＰＳｃの検出は、オクタリピート領域に影響しないトリプシン処理後のＰｒＰＳｃの検出より劣ることを示している。この効果は、共にオクタリピート領域に結合する異なる２種の抗体、ＰＯＭ２およびＳＡＦ−３２を用いた、本実施例および実施例４において今や認められる。この知見により、トリプシン処理と組み合わせた、オクタリピート領域に対する各種抗体の使用が、単一エピトープに対する抗体の使用および／またはＰＫ処理より、ＰｒＰＳｃ検出の感度増加を起こすことが示唆される。
【０１６１】
（実施例７）
様々な消化条件下における、トリプシンおよびＰＫによるシリアンハムスター脳ホモジェネートの消化比較
最近の報告（米国特許第７０９７９９７Ｂ１号を参照されたい）では、ＰＫで軽く処理すれば、ＰｒＰＣを効率的に除去すると同時に、ＰｒＰＳｃのオクタリピートエピトープのすべてまたは一部を保持し、オクタリピートに結合する抗体の使用により、検出を増強できるのではないかと示唆されている。本実施例における２つの実験の目的は、シリアンハムスター（ＳＨａ）の脳ホモジェネート（ＢＨ）からＰｒＰＣを除去すると同時に、ＳＨａのＰｒＰＳｃ検出の感度を維持する上でのＰＫ消化の有効性を、トリプシン消化を用いる本発明の方法と、様々な消化条件下で比較することである。
【０１６２】
ＳＨａの１０％正常またはスクレイピー感染ＢＨ（ｗ／ｖ）１μＬの消化を、トリプシンまたはＰＫの増加する量（０〜１００μｇ／ｍＬ）で、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．０２Ｍ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ５０μＬ中、３７℃で１０分間行なった。各消化を、ＲＴで１５分間、２ｍＭのＰＭＳＦで停止させ、０．１Ｎ ＮａＯＨの７５μＬで１０分間変性させ、次いで０．３Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４の３０μＬで、ＲＴで５分間中和した。
【０１６３】
マイクロプレートを、０．１Ｍ ＮａＨ２ＣＯ３、ｐＨ８．９中で希釈した２．５μｇ／ｍＬの３Ｆ４の１５０μＬで、４℃で終夜コーティングし、ＴＢＳＴで洗浄し、使用前に０．１％カゼインでブロックした。
【０１６４】
消化試料各１５０μＬ／ウェルを、ＥＬＩＳＡアッセイのために３Ｆ４被覆プレートに添加した。プレートを４℃で終夜インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、検出抗体のＰＯＭ２ＡＰ（０．０１μｇ／ｍＬ）またはＰＯＭ１７ＡＰ（０．１μｇ／ｍＬ、アッセイ感度がＰＯＭ２と同等になるように）１５０μＬをウェル毎に添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、基質（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、前の実施例に示すように、シグナルのレベルをルミノメーターで測定した。測定単位は、相対発光量（ＲＬＵ）で規定される。
【０１６５】
ＰＯＭ２ＡＰで行なった実験の結果を表８および図５に示し、ＰＯＭ１７ＡＰの結果を表９および図６に示す。両実験（ＰＯＭ２ＡＰおよびＰＯＭ１７ＡＰ）に対するシグナル／正常比の計算を行い、表１０に示す。
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
【表１０】
表８および図５に示すように、ＰＯＭ２ＡＰで検出したとき、プロテアーゼで全く処理していない正常ＢＨ試料は、高いＰｒＰＣ含量のために２０００ＲＬＵあたりのシグナルを有する。トリプシン５０μｇ／ｍＬで処理すると、この値が３ＲＬＵのバックグランドレベルに低下した。スクレイピー感染ＢＨ試料をトリプシン５０μｇ／ｍＬで同様に処理すると、検出レベル１５４４ＲＬＵが得られ、正常に対するスクレイピー感染シグナル（Ｓ／Ｎ）は４４７倍であり、トリプシン１００μｇ／ｍＬで処理すると、Ｓ／Ｎは３４６倍となった。ＰＫ５０μｇ／ｍＬで処理すると、Ｓ／Ｎは７３倍に過ぎず、ＰＫ１００μｇ／ｍＬでは、スクレイピー感染シグナルが大部分消失し、Ｓ／Ｎは１７．５倍であった。
【０１６９】
表９および図６に示すように、ＰＯＭ１７ＡＰで検出したとき（ＰＯＭ２ＡＰより１０倍高い濃度で）、スクレイピー感染試料におけるＰｒＰＳｃの検出は、トリプシン５０μｇ／ｍＬで処理後に最大で、Ｓ／Ｎ５６０で示されるのに対し、ＰＫによる最良の検出は、ＰＫ１０μｇ／ｍＬでのＳ／Ｎ２２９であった。ＰＫ１００μｇ／ｍＬでは、スクレイピー感染シグナルが４．７ＲＬＵに弱まり、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアの完全な分解が示唆された。同様なトリプシン濃度１００μｇ／ｍＬでは、ＲＬＵが３４５であった。
【０１７０】
ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰのいずれかを用いた、表１０に要約したような結果から、ＰｒＰＳｃの検出は、所与の任意のプロテアーゼ濃度で、ＰＫよりトリプシンを用いた方が良好に観察され、トリプシン消化試料のより高いＳ／Ｎ値で示された。
【０１７１】
ＰＫで消化し、ＰＯＭ２ＡＰで検出した場合、スクレイピー感染ＳＨａ ＢＨにおけるＰｒＰＳｃの検出レベルは、低いＳ／Ｎ値で示されるように最低であった。同じ試料をＰＯＭ１７で検出した場合、シグナルは、最適ＰＫ濃度で約４倍高かった。以上の結果は、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性特性に関して知られており、予想される結果と合致している。即ち、９０〜２３１位残基は、穏和なプロテアーゼ消化に耐性があり、そのため、この領域内にエピトープを有するＰＯＭ１７のような抗体で検出できるのに対し、２３〜９０位Ｎ末端は、敏感であり、オクタリピート領域に結合するＰＯＭ２およびＳＡＦ−３２のような抗体は、その結合部位を失うことになろう。ＰＫの濃度を上げるにつれ、Ｎ末端および９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性コアが、同時に消化されることも明らかである。したがって、米国特許第７０９７９９７Ｂ１号で提案されたような目標を実現するためには、ＰＫの濃度に対して入念に力価を決定しなければならない。インキュベーションの時間および温度は、酵素活性に影響すると見込まれるので、各試験を特定の条件に合わせる必要があり、それを手の掛かる不安定なプロセスにする。別レベルの複雑さは、ＰＫの調製、バッチおよび起源の違いに伴う酵素比活性の変動である。
【０１７２】
トリプシン処理には、ＰＫと同じ制約がない。オクタリピート領域が無傷のままであったので、ＰＯＭ２のような高アビディティの抗体を使用することができる。ＰＫが２３〜８９位の残基内で切断する一方、トリプシンは、２３〜４８位の残基内だけで切断し、４９〜８９位の残基を残すが、該残基は、９０〜２３１位のプロテアーゼ耐性コアの他に検出に利用できる、オクタリピート領域を含有する（図１Ａおよび１Ｂ）。したがって、本発明者らは、検出感度の向上のために、異なる検出抗体を一緒に混合し、同時に使用できることを提案する。例えば、ＰＯＭ２およびＰＯＭ１７は共に、ＡＰなどの標識とコンジュゲートにすると、３Ｆ４などの別の抗体を用いてトリプシン消化ＰｒＰＳｃを捕捉する場合、検出抗体として同時に使用することができる。
【０１７３】
それに加え、トリプシン１００μｇ／ｍＬでは、Ｓ／Ｎ値が依然として１００を超えるので、ＰｒＰＳｃは、ＰＫよりトリプシンに対して耐性が高いように見える。このことは、ＰＫが、ＰｒＰＳｃ量およびプリオン感染力を数ログ低下させるのに対し、トリプシンは低下させないことを示した以前の研究と合致している（ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８３年） Ｃｅｌｌ ３５巻、５７〜６２頁）。ＰＯＭ２ＡＰで検出した試料のうち、ＰＫ５０μｇ／ｍＬで処理した試料ではＳ／Ｎが７３であるのに対して、同濃度のトリプシンで処理した試料ではＳ／Ｎが４４８であり、ＰＫの使用と比較してトリプシンの使用は６倍の改善を示す。ＰＯＭ１７ＡＰで検出した場合、トリプシン５０μｇ／ｍＬで２５倍超（４１５対１７ＲＬＵ）の改善が認められ、トリプシン２０μｇ／ｍＬで２倍超（５６０対２０３ＲＬＵ）の改善が認められた。したがって両方の抗体に対して、トリプシン処理の方が良好な検出を示した。ＰＯＭ２ＡＰは、０．１μｇ／ｍｌで使用されたＰＯＭ１７ＡＰと比較して、０．０１μｇ／ｍｌで使用されたが、検出量は同等であったことに留意されたい。
【０１７４】
（実施例８）
トリプシンは、ほぼ全長のＰｒＰＳｃを保持しながらＰｒＰＣを消化する
トリプシンがＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃに対して異なった消化をすることを確認するために、以下のように免疫ブロットアッセイを実施した。
【０１７５】
全長成熟ＰｒＰ配列、ＰｒＰＳｃのＰＫ耐性コア、およびＰｒＰのトリプシン切断部位マップの概要が、図７Ａに示されている。
【０１７６】
感染性ヒトｖＣＪＤおよびｓＣＪＤのＢＨ試料を、英国の国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）ＣＪＤ資料センターから入手したが、これらは、それぞれ白色ｖＣＪＤ（ＭＭ）、赤色ｓＣＪＤ（ＭＭ）および黄色ｓＣＪＤ（ＭＶ）の系統に対応する。正常な脳ホモジェネートは、患者ＮＲＰＥ３２７に対応する、チューリッヒ大学の血管性脳症患者から得られた。正常または感染ヒトＢＨ試料２５μｇを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む０．５×ＴＢＳ中、トリプシンまたはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）５０μｇ／ｍｌで、３７℃で１時間消化させた。比較のために非消化試料１０μｇと平行に、試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＰｒＰ抗体（３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７）で免疫ブロットした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いて、ウェスタンブロットを検出した。化学発光像は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４０００ＭＭにより得た。結果を図７Ｂに示す。
【０１７７】
それに加え、正常またはｖＣＪＤヒトＢＨ試料を、トリプシンの増加する濃度で消化し、ＰＯＭ２、３Ｆ４またはＰＯＭ１抗体について別々に上記したのと同じように、免疫ブロットすることにより分析した。ＰＯＭ１は、プロテアーゼ耐性コア内のエピトープ、特に、約１２２〜２３１位残基の球状ドメイン内のエピトープを認識する。その結果を図８に示す。
【０１７８】
消化物の免疫ブロット分析から、トリプシン耐性ＰｒＰＳｃ断片（約４９〜２３１位であると予想される）は、ＰＫ耐性断片（約９０〜２３１位）より大きく、分子の実質的部分が保持されていることが示された（図７Ｂ、３Ｆ４およびＰＯＭ１７のブロット）。重要なことには、ヒト組換えＰｒＰ２３−２３１の質量分析で、トリプシンが、ＰｒＰ配列で予測される全部位で切断できることが実証され、したがってトリプシン部位が、ＰｒＰＳｃでは真に立体構造的に保護されていることが確認された（データは示していない）。更なる調査により、ＰＫではなく、トリプシンによる消化は、ＰＯＭ２抗体が認識するＰｒＰオクタペプチドリピートを保持することが明らかとなった（図７Ｂ、ＰＯＭ２ブロット）。
【０１７９】
対照的に、ＰｒＰＣは両プロテアーゼにより消化され、ＰＯＭ２（約５９〜８９位残基）または３Ｆ４（約１０９〜１１２位残基）によりもはや検出されなかった（図７Ｂおよび図８、正常試料のレーン）。しかし、ＰＯＭ１７またはＰＯＭ１でＰｒＰＣ消化物を免疫ブロットした（ヘリックス１に対して、約１４４〜１５５位残基）とき、約２５ｋＤａのトリプシン耐性断片が観察された。ＰｒＰＣの構造が、非構造化アミノ末端に続く球状ドメイン（約１２２〜２３１位）で構成されている（Ｚａｈｎ， Ｒ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻、１４５〜１５０頁）ことを考慮すると、２５ｋＤａトリプシン断片は、適正な分子量であり、ＰＯＭ１およびＰＯＭ１７で検出されたが、ＰＯＭ２または３Ｆ４で検出されなかった（図７Ｂ、８）ので、恐らくは球状ドメインを含んでいた。興味深いことに、このことから、球状ドメインは、緊密に折り畳まれており、ＰＯＭ１７／ＰＯＭ１エピトープ内のトリプシン切断部位（Ｒ１４８およびＲ１５１）は、溶液構造中に出現する状態（Ｚａｈｎ， Ｒ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻、１４５〜１５０頁）とは異なり、切断には利用できないことが示唆されよう。このドメインの消化に対する耐性に関して理解を深めるために、正常またはｖＣＪＤの両ＢＨをトリプシンの増加する量で消化した。試験したトリプシン濃度のいずれでも、ＰＯＭ２または３Ｆ４のいずれによってもＰｒＰが検出されなかったので、ＰｒＰＣのアミノ末端配列は、極めて不安定であることが判明したが、ＰｒＰＣの球状ドメインおよびｖＣＪＤのＢＨ由来のＰｒＰＳｃは、消化に耐性を示した（図８、ＰＯＭ１）。その上、トリプシン消化したＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣの移動パターンは、大きく異なったため、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣのトリプシン耐性断片を識別することができた。したがって、トリプシン消化は、ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃとを分別する妥当な方法であると結論される。
【０１８０】
（実施例９）
トリプシン消化に対するＣＪＤ系統の安定性の測定
ＰＫは、ＰｒＰＳｃの立体構造における系統依存的多様性を特徴付けるために汎用されてきた。こうした差は、１型および２型のｓＣＪＤについて認められるように、プロテアーゼに対する感受性およびアミノ末端切断部位の変化として明示される。しかし、トリプシンによる消化は、切断部位が既知であり、幾つかの部位は、特性の明確な抗体エピトープ内にあるという特有の利点を有する（図９Ａ）。したがって、タンパク分解切断に対する特定のＰｒＰ配列の感受性を評価することができよう。そこで、正常（１２９ＭＭ）、ｖＣＪＤ（１２９ＭＭ）および散発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）（１２９ＭＭおよび１２９ＭＶ）に対して、プロテアーゼの増加する量でトリプシンまたはＰＫによる消化の後、残存ＰｒＰ配列の検出を試みた。
【０１８１】
２％サルコシル入りのＴＢＳ（ＴＢＳＳ）中で希釈した１％ＢＨ（約１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質）を、０、１、１０または１００μｇ／ｍｌのトリプシンまたはＰＫで３７℃で１時間消化した。消化を、２ｍＭのＰＭＳＦおよびＴＢＳ４倍容中のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の添加で停止させた。次いで、試料を直接ＥＬＩＳＡにより検出した。消化済み１０％ＢＨおよそ５００ｎｌを、１４０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心した。ＰｒＰＳｃペレットを６Ｍ ＧｄｎＳＣＮ中に再懸濁し、等容量の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．９で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに終夜で受動的にコーティングした。プレートをＴＢＳ中の０．１×ＢｌｏｃｋｅｒＣａｓｅｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）中でブロックし、被覆ＰｒＰを、０．１μｇ／ｍｌの３Ｆ４、ＰＯＭ２またはＰＯＭ１７抗体、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出した。すべての試料は、ＥＬＩＳＡにより三重に分析し、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ， Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ， ＭＩ）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、発光をＬｕｍｉｓｋａｎルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）により測定した。正常およびｖＣＪＤ ＢＨ試料の生データを図９Ｂに示すが、ｖＣＪＤ ＭＭ、ｓＣＪＤ ＭＭおよびｓＣＪＤ ＭＶの規格化データ（感染−正常、ＲＬＵ）は図９Ｃに示す。
【０１８２】
注目すべきことに、正常、感染両ＢＨの非消化試料のペレット中には、ＰｒＰＣ由来シグナルが殆ど存在せず、わずか１μｇ／ｍｌのプロテアーゼで完全に消失した（図９Ｂ）。更に、ＰｒＰＣの約２５ｋＤａのトリプシン耐性断片は、ペレット中に検出されず、このドメインが、遠心中に溶液中に残っていることを示唆した（図９Ｂ、ＰＯＭ１７）。
【０１８３】
ｖＣＪＤ ＢＨのＰｒＰＳｃを調べたとき、エピトープのトリプシン対ＰＫへの曝露に有意差が見出された。３Ｆ４エピトープは、いずれのプロテアーゼを利用しても同じ割合で保持されたが（図９Ｂ、３Ｆ４）、ＰＯＭ２エピトープは、劇的に異なる結果を示した。オクタリピートは、トリプシン濃度の高いときにだけ切除されたが、ＰＫ消化により急速に消失した（図９Ｂ、ＰＯＭ２）。各プロテアーゼが保持するＰｒＰＳｃ量を直接比較するために、正常ＢＨ中に検出されるＰｒＰＳｃ由来シグナルを感染試料の各々から差し引くことにより、規格化シグナルを得た（図９Ｃ、感染−正常）。その図に示されるように、トリプシン１００μｇ／ｍｌで消化した後、ＰＯＭ２により検出されるｖＣＪＤまたはｓＣＪＤにおける規格化シグナル量は、ＰＫわずか１μｇ／ｍｌで消化した後の同じＣＪＤにおける検出量より高いか、またはほぼ同じである。この比較によって、トリプシン消化は、オクタリピート領域内にトリプシン切断部位がないので、ＰＫより多くのＰＯＭ２検出ＰｒＰＳｃを明らかに保持していた。
【０１８４】
興味深いことには、ＰｒＰＳｃコア粒子のＰＯＭ１７検出によって、ヘリックス１の圧倒的大部分、即ちＰＯＭ１７が認識するエピトープを含有する領域は、試験したどのトリプシン濃度でも耐性を示す（図９Ｃ、ＰＯＭ１７）ことが明らかとなり、Ｒ１４８およびＲ１５１が立体構造的に保護されていることが示唆された。しかし、ＰＫは、以前の報告（Ａｇｕｚｚｉ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕ、（２００４年）Ｃｅｌｌ １１６巻、３１３〜３２７頁を参照されたい）と一致して、プロテアーゼ濃度の増加と共にＰＯＭ１７検出ＰｒＰＳｃを消化した。
【０１８５】
実施例８に示した免疫ブロットの分析結果を合わせて考えると、以上の結果は、プロテアーゼの特により高い濃度におけるＰｒＰＳｃのトリプシン消化によって、一方の集団が約４９〜２３１位の残基を包含すると予想される長い断片であり、他方の集団が、約１１１〜２３１位の残基を包含し、３Ｆ４エピトープおよびオクタリピートを欠いている、２集団のトリプシン耐性断片が生成されることを示唆している。結論として、本発明者らは、３Ｆ４エピトープは、トリプシンまたはＰＫによる切断に等しく曝されているが、オクタリピートおよびヘリックス１領域などの他の配列は、トリプシン消化において特異に保持されており、トリプシンがＰｒＰＳｃの分析に理想的なツールであることを見出している。
【０１８６】
（実施例１０）
各種ヒトＣＪＤ系統の脳ホモジェネート試料のトリプシンおよびＰＫ消化、ならびにＰＯＭおよび３Ｆ４抗体による検出
この実施例では、シリアンハムスターＢＨ試料の代わりに数種のヒトＢＨ試料に関して、実施例７に記載の実験に類似した実験を行った。ｖＣＪＤ（Ｍ／Ｍ）、ｓＣＪＤ（Ｍ／Ｍ１）およびｓＣＪＤ（Ｍ／Ｖ２）を含む、正常または各種ＣＪＤ感染ヒトＢＨ試料を、トリプシンまたはＰＫの増加する濃度で消化し、サンドイッチＥＬＩＳＡで検出した。トリプシン消化によるオクタリピート領域の保持が、ＰｒＰ検出を増強できるか否かを確かめるために、オクタリピート領域の検出抗体であるＰＯＭ２ＡＰを、非オクタリピート領域に対する別の検出抗体であるＰＯＭ１７ＡＰと同じ濃度で使用し、それと比較した。実施例７では、ＰＯＭ２ＡＰをＰＯＭ１７ＡＰ濃度の１／１０で使用した。
【０１８７】
２％サルコシル入りのＴＢＳ（ＴＢＳＳ）中で１０倍に希釈した１０％ＢＨを、０、１、１０または１００μｇ／ｍｌのトリプシンまたはＰＫで３７℃で１時間消化した。消化を、２ｍＭのＰＭＳＦおよびＴＢＳ４倍容中のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の添加で停止させた。次いで、試料をサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。消化済み１０％ＢＨの２５０ｎｌを、０．１Ｍ ＮａＯＨで２５℃で１０分間変性させ、ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．３で中和した後、ＰｒＰを３Ｆ４被覆プレート（３７５ｎｇ／ウェル）で捕捉し、０．０２μｇ／ｍｌのＡＰコンジュゲートＰＯＭ２またはＰＯＭ１７で検出した。すべての試料は、ＥＬＩＳＡにより三重に分析し、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した。最後に、０．０５％ＳＤＳ入りＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ， Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ， ＭＩ）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、発光をＬｕｍｉｓｋａｎルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）により測定した。正常および各種ＣＪＤ ＢＨ試料の生データを図１０に示すが、ｖＣＪＤ（Ｍ／Ｍ）（ｖＣＪＤ−正常、ＲＬＵ）のＰｒＰＳｃ推定量は図１１に示す。
【０１８８】
図１０および１１に示すように、ＴＢＳＳ中トリプシン消化濃度１０μｇ／ｍｌで、正常ＢＨ試料中のＰｒＰＣは、３Ｆ４で捕捉したとき、ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰで検出できないが、ＣＪＤ ＢＨ試料中のＰｒＰＳｃは、３Ｆ４で捕捉したとき、ＰＯＭ２ＡＰまたはＰＯＭ１７ＡＰで検出できる長いトリプシン耐性断片を有意量残していた。しかし、ＰＫ消化は、ＰＫ濃度が、ＰｒＰＣから生成するバックグランドシグナルを消去するのに十分高いとき、ＰＯＭ２ＡＰによるオクタリピート領域の検出を保持していなかった。ｖＣＪＤおよびｓＣＪＤの両系統について、ＰＯＭ１７ＡＰ検出ＰｒＰ量は、トリプシンまたはＰＫ消化試料に対して同等であったが、トリプシンは、特定のプロテアーゼ濃度でより多くのエピトープを保持していた。対照的に、ＰＯＭ２ＡＰ検出ＰｒＰＳｃ量は、消化におけるＰＫ量の増加と共に急速に消失したが、トリプシン量の増加と共に遥かにより遅く減少した。更に、０．０２μｇ／ｍｌの同じ検出濃度で、ＰＯＭ２ＡＰは、様々なトリプシン濃度で消化したＣＪＤ全３系統のＢＨ試料において、ＰＯＭ１７ＡＰが生成したシグナルの約１０倍のシグナル（ＲＬＵ）を生成したが、この結果は、反復オクタペプチド配列に対するＰＯＭ２ＡＰ抗体のアビディティに起因する。結論として、オクタリピート領域の保持が、ＰｒＰＳｃ検出を有意に高めた。
【０１８９】
当業者であれば理解されるであろうが、本発明の趣旨から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に多くの変更および改変を加えることができる。このようなすべての変更は、本発明の範囲内に入ることを意図している。本特許文書で引用した特許、出願、および書籍を含む印刷刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれることも意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料を得る工程であって、該試料は正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい工程、
（ｂ）該ＰｒＰＳｃ、および存在する場合には該ＰｒＰＣのタンパク分解消化が、実質的に完全である条件下で、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼで該試料を処理する工程であって、
ｉ）該ＰｒＰＳｃが、該オクタリピート領域内または該オクタリピート領域と該プロテアーゼ耐性コアとの間に、該プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、該オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）該ＰｒＰＣが、該プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、該プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有しており、該少なくとも１つの利用可能な切断部位が、該実質的に完全なタンパク分解消化により、切断される
工程、
（ｃ）プロテアーゼ阻害剤の添加または該プロテアーゼの除去により、（ｂ）における該実質的に完全なタンパク分解消化、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程、
（ｄ）該部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させることにより、変性ＰｒＰＳｃを得る工程、ならびに
（ｅ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いて該変性ＰｒＰＳｃの存在を検出する工程であって、
ｉ）該第１の結合パートナーが、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、該アミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合し、
ｉｉ）該第２の結合パートナーが、該プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合し、該第２のエピトープが、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該第１のエピトープから分離されている、該ＰｒＰＣの領域中にある
工程
を含む、アッセイ方法。
【請求項２】
前記ＰｒＰＳｃが、配列番号１〜１０から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域の外部にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記部位特異的プロテアーゼが、トリプシンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記部位特異的プロテアーゼが、Ｓ−Ｖ８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合パートナーが、アプタマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出する工程が、ＥＬＩＳＡを用いて実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第２の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第１の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出結合パートナーが、標識されている、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出結合パートナーが、アルカリホスファターゼコンジュゲートで標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の結合パートナーが、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の結合パートナーが、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の結合パートナーが、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸配列内に球状ドメインを含有し、前記第２のエピトープが、該球状ドメイン内に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の結合パートナーが、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の結合パートナーが、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記部位特異的プロテアーゼが、固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、フッ化フェニルメチルスルホニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記変性させる工程が、グアニジニウム化合物で前記試料を処理する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変性させる工程に続いて、前記試料を希釈する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記変性させる工程が、高ｐＨまたは低ｐＨに前記試料を曝露することにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記変性させる工程に続いて、前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和する工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が、生存中または死後の生物体から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記生存中または死後の生物体が、ヒト、サル、ハムスター、ウシ、ヒツジ、マウス、エルクおよびシカからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、供給食品、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液、臓器、細胞、脳組織、神経系組織、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検体、剖検体および汚染機器からなる群に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球および血清からなる群に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、生検体、検視体または剖検体から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料において、プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有するＰｒＰＳｃの存在を検出するためのキットであって、該試料は、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよく、該キットは、
（ａ）少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼであり、
ｉ）該ＰｒＰＳｃが、該オクタリピート領域内または該オクタリピート領域と該プロテアーゼ耐性コアとの間に、該プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、該オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、該プロテアーゼによるＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）該ＰｒＰＣが、該プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、該プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有している
プロテアーゼ、
（ｂ）場合により、該プロテアーゼの活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤、
（ｃ）場合により、該ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤、
（ｄ）少なくとも２種の結合パートナーである、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーであって、
ｉ）該第１の結合パートナーが、該プロテアーゼによる該ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、該アミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合し、
ｉｉ）該第２の結合パートナーが、該プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合し、該第２のエピトープが、該プロテアーゼによる該ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該第１のエピトープから分離されている、該ＰｒＰＣの領域中にある
結合パートナー、ならびに
（ｅ）任意の病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、該キットを使用するための説明書
を含むキット。
【請求項３３】
前記ＰｒＰＳｃが、配列番号１〜１０から選択される配列を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域内にある、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域の外部にある、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記部位特異的プロテアーゼが、トリプシンである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３７】
前記部位特異的プロテアーゼが、Ｓ−Ｖ８である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記結合パートナーが、アプタマーである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３９】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項４０】
ＥＬＩＳＡキットを含む、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項４１】
前記第１の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第２の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記第２の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーとしてであり、前記第１の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーとしてである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記検出結合パートナーが、標識されている、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記検出結合パートナーが、アルカリホスファターゼコンジュゲートで標識されている、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４６】
前記第１の結合パートナーが、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３４に記載のキット。
【請求項４７】
前記第１の結合パートナーが、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３５に記載のキット。
【請求項４８】
前記第２の結合パートナーが、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸配列内に球状ドメインを含有し、前記第２のエピトープが、該球状ドメイン内に位置する、請求項３６に記載のキット。
【請求項５０】
前記第２の結合パートナーが、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記第２の結合パートナーが、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３７に記載のキット。
【請求項５２】
前記部位特異的プロテアーゼが、固定化されている、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５３】
前記任意選択のプロテアーゼ阻害剤が、フッ化フェニルメチルスルホニルである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５４】
前記任意選択の変性剤が、グアニジニウム化合物である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５５】
前記任意選択の変性剤が、塩基性試薬または酸性試薬である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項１】
（ａ）プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有する病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料を得る工程であって、該試料は正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよい工程、
（ｂ）該ＰｒＰＳｃ、および存在する場合には該ＰｒＰＣのタンパク分解消化が、実質的に完全である条件下で、少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼで該試料を処理する工程であって、
ｉ）該ＰｒＰＳｃが、該オクタリピート領域内または該オクタリピート領域と該プロテアーゼ耐性コアとの間に、該プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、該オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）該ＰｒＰＣが、該プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、該プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有しており、該少なくとも１つの利用可能な切断部位が、該実質的に完全なタンパク分解消化により、切断される
工程、
（ｃ）プロテアーゼ阻害剤の添加または該プロテアーゼの除去により、（ｂ）における該実質的に完全なタンパク分解消化、更なる任意のタンパク分解消化を防止する工程、
（ｄ）該部位特異的プロテアーゼで処理したＰｒＰＳｃを変性させることにより、変性ＰｒＰＳｃを得る工程、ならびに
（ｅ）少なくとも２種の結合パートナーとして、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを用いて該変性ＰｒＰＳｃの存在を検出する工程であって、
ｉ）該第１の結合パートナーが、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、該アミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合し、
ｉｉ）該第２の結合パートナーが、該プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合し、該第２のエピトープが、該実質的に完全なタンパク分解消化の後、該第１のエピトープから分離されている、該ＰｒＰＣの領域中にある
工程
を含む、アッセイ方法。
【請求項２】
前記ＰｒＰＳｃが、配列番号１〜１０から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域の外部にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記部位特異的プロテアーゼが、トリプシンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記部位特異的プロテアーゼが、Ｓ−Ｖ８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合パートナーが、アプタマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出する工程が、ＥＬＩＳＡを用いて実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第２の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第１の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出結合パートナーが、標識されている、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出結合パートナーが、アルカリホスファターゼコンジュゲートで標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の結合パートナーが、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の結合パートナーが、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の結合パートナーが、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸配列内に球状ドメインを含有し、前記第２のエピトープが、該球状ドメイン内に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の結合パートナーが、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の結合パートナーが、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記部位特異的プロテアーゼが、固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、フッ化フェニルメチルスルホニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記変性させる工程が、グアニジニウム化合物で前記試料を処理する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変性させる工程に続いて、前記試料を希釈する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記変性させる工程が、高ｐＨまたは低ｐＨに前記試料を曝露することにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記変性させる工程に続いて、前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和する工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が、生存中または死後の生物体から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記生存中または死後の生物体が、ヒト、サル、ハムスター、ウシ、ヒツジ、マウス、エルクおよびシカからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、供給食品、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳髄液、臓器、細胞、脳組織、神経系組織、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検体、剖検体および汚染機器からなる群に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、全血、血液製剤、血液分画、血液成分、血漿、血小板、赤血球および血清からなる群に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、生検体、検視体または剖検体から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
病原型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を含有する疑いのある試料において、プロテアーゼ耐性コアおよびオクタリピート領域を有するＰｒＰＳｃの存在を検出するためのキットであって、該試料は、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）を含んでも含まなくてもよく、該キットは、
（ａ）少なくとも１種の部位特異的プロテアーゼであり、
ｉ）該ＰｒＰＳｃが、該オクタリピート領域内または該オクタリピート領域と該プロテアーゼ耐性コアとの間に、該プロテアーゼに対する切断部位を有しておらず、そのため、該オクタリピート領域を含むアミノ近接領域の断片は、該プロテアーゼによるＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持しており、
ｉｉ）該ＰｒＰＣが、該プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸領域内に、該プロテアーゼに対する少なくとも１つの利用可能な切断部位を有している
プロテアーゼ、
（ｂ）場合により、該プロテアーゼの活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤、
（ｃ）場合により、該ＰｒＰＳｃを変性させることができる変性剤、
（ｄ）少なくとも２種の結合パートナーである、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーであって、
ｉ）該第１の結合パートナーが、該プロテアーゼによる該ＰｒＰＳｃの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該プロテアーゼ耐性コアとの結合を維持している、該アミノ近接領域の断片内に位置する、第１のエピトープに特異的に結合し、
ｉｉ）該第２の結合パートナーが、該プロテアーゼ耐性コア内に位置する、第２のエピトープに特異的に結合し、該第２のエピトープが、該プロテアーゼによる該ＰｒＰＣの実質的に完全なタンパク分解消化の後、該第１のエピトープから分離されている、該ＰｒＰＣの領域中にある
結合パートナー、ならびに
（ｅ）任意の病原型プリオンタンパク質の存在を検出するために、該キットを使用するための説明書
を含むキット。
【請求項３３】
前記ＰｒＰＳｃが、配列番号１〜１０から選択される配列を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域内にある、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記第１のエピトープが、前記オクタリピート領域の外部にある、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記部位特異的プロテアーゼが、トリプシンである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３７】
前記部位特異的プロテアーゼが、Ｓ−Ｖ８である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記結合パートナーが、アプタマーである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３９】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項４０】
ＥＬＩＳＡキットを含む、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項４１】
前記第１の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーであり、前記第２の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記第２の結合パートナーが、プリオンタンパク質を捕捉するための捕捉結合パートナーとしてであり、前記第１の結合パートナーが、前記ＰｒＰＳｃを検出するための検出結合パートナーとしてである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記検出結合パートナーが、標識されている、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記検出結合パートナーが、アルカリホスファターゼコンジュゲートで標識されている、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４６】
前記第１の結合パートナーが、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５およびＳＡＦ−３７からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３４に記載のキット。
【請求項４７】
前記第１の結合パートナーが、ＢＡＲ２１０、ＢＡＲ２３１および１４Ｄ３からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３５に記載のキット。
【請求項４８】
前記第２の結合パートナーが、３Ｆ４、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ３０８、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＰｒＰＣが、前記プロテアーゼ耐性コアに対応するアミノ酸配列内に球状ドメインを含有し、前記第２のエピトープが、該球状ドメイン内に位置する、請求項３６に記載のキット。
【請求項５０】
前記第２の結合パートナーが、ＰＯＭ１、ＰＯＭ４、ＰＯＭ５、ＰＯＭ６、ＰＯＭ７、ＰＯＭ８、ＰＯＭ９、ＰＯＭ１０、ＰＯＭ１３、ＰＯＭ１５、ＰＯＭ１６、ＰＯＭ１７、ＰＯＭ１９、ＳＡＦ−２、ＳＡＦ−４、ＳＡＦ−８、ＳＡＦ−９、ＳＡＦ−１０、ＳＡＦ−１２、ＳＡＦ−１３、ＳＡＦ−１４、ＳＡＦ−２２、ＳＡＦ−２４、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６８、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、ＳＡＦ−８２、ＳＡＦ−８３、ＳＡＦ−８４、ＳＡＦ−９５、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２１５、ＢＡＲ２２１、ＢＡＲ２２４、ＢＡＲ２３３、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、Ｄ１８、６Ｈ４およびＢＤＩ１１５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記第２の結合パートナーが、ＳＡＦ−５３、ＳＡＦ−５４、ＳＡＦ−６０、ＳＡＦ−６１、ＳＡＦ−６６、ＳＡＦ−６９、ＳＡＦ−７０、ＳＡＦ−７５、ＳＡＦ−７６、Ｐｒｉ９１７、ＢＡＲ２３４、Ｓｈａ３１、１１Ｂ９、１２Ｆ１０、６Ｈ４およびＰＯＭ５からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項３７に記載のキット。
【請求項５２】
前記部位特異的プロテアーゼが、固定化されている、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５３】
前記任意選択のプロテアーゼ阻害剤が、フッ化フェニルメチルスルホニルである、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５４】
前記任意選択の変性剤が、グアニジニウム化合物である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項５５】
前記任意選択の変性剤が、塩基性試薬または酸性試薬である、請求項３２または３３に記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５２３９７７（Ｐ２０１０−５２３９７７Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２１５０（Ｐ２０１０−５０２１５０）
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４０９８
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４０９８
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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