プリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びに異常プリオン蛋白質の発現抑制方法
【課題】 プリオン病の予防、又はプリオン病の発症抑制を含む治療用に有効な薬剤を提供し、また、異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法を提供する。
【解決手段】 プリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有する。異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いる。
【解決手段】 プリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有する。異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプリオン病の予防、或は発症抑制を含む治療用に有効な薬剤、並びに異常プリオン蛋白質の発現抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病は感染因子となる異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）の蓄積により中枢神経が侵される疾患であり、ヒトをはじめウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなど多くの哺乳動物においてその発症が認められている。代表的なプリオン病としては、ヒトではクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）や致死性家族性不眠症（ＦＦＩ：Ｆａｔａｌ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｉｎｓｏｍｎｉａ）、ヒト以外では、例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）などが挙げられる。ＰｒＰｒｅｓは正常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）と一次構造が同一であるが高次構造が異なり、一般的な高圧蒸気滅菌、乾熱滅菌によってもその感染性がなくなることがなく、ホルマリンやアルコールなどによって変性不活化されない。また、ＰｒＰｃ前駆体のアミノ酸配列は哺乳動物種間での相同性が高く、例えば、ヒトとマウス、ハムスターのようなげっ歯類動物とでは９５％以上のホモロジーを有している。これが、動物種を超えてプリオンが感染、伝達される理由であると考えられている。
【０００３】
このようなプリオン病の予防や治療用の薬剤、或はＰｒＰｒｅｓの増殖を抑制する方法として、ペントサンポリサルフェート、キニーネ類、ライソゾーム親和性薬剤、リアクティブ・ダイ〔例えば、特許文献１参照〕、ロイシン、イソロイシン、バリンなどのアミノ酸、またはトレハロース〔例えば、特許文献２参照〕、キノリン誘導体、またはナフチリジン誘導体〔例えば、特許文献３参照〕、可溶性ラミニン受容体前駆体（ＬＲＰ）の発現を減少させ又は阻害するアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムからなる薬剤組成物〔例えば、特許文献４参照〕、３７ｋＤａ／６７ｋＤａのラミニン受容体（ＬＲＰ／ＬＲ）に特異的な抗体〔例えば、非特許文献１〕、プリオン蛋白質遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用い正常型プリオン蛋白質の発現を抑制することによる異常型プリオン蛋白質抑制方法〔例えば、特許文献５参照〕などの提案がある。しかしながら、有効なプリオン病の予防用薬や治療用薬は未だ見出されていないという現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−４０７７８号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２４３７号公報
【特許文献３】特開２００４−９９５５３号公報
【特許文献４】特表２００２−５０１３８５号公報
【特許文献５】特開２００５−７３５７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ロイト Ｃ．ら（Ｌｅｕｃｈｔ Ｃ．，ｅｔ ａｌ）、イーエムビーオー レポート（ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ）２００３年、４巻、３号、２９０−２９５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる現状に鑑みてなされた本発明の目的は、プリオン病の予防、又はプリオン病の発症抑制を含む治療用に有効な薬剤を提供することにある。また、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によるプリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用又は発現、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有することを特徴とする。このようなプリオン病の予防及び／又は治療用薬において、Ｇａｂｒｂ１調節物質が、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であることが好ましく、また、ＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターが、サリチリデンサリチルヒドラジド（Ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ：ＳＣＳ）及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることが好適である。そして、Ｇａｂｒｂ１調節物質が、細胞内に導入されてＲＮＡ干渉を誘導しＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡ発現量を低下させる二本鎖ＲＮＡ又は発現ベクターであることが好ましい。ここで、二本鎖ＲＮＡが、配列番号（３）の塩基配列を有する（化学合成オリゴヌクレオチド）Ｇｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有する（化学合成オリゴヌクレオチド）Ｇｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものであることが好ましく、また、発現ベクターが、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成ること、或は、発現ベクターが、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成ることが好適である。
【０００８】
また、上記目的を達成するため、本発明による異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、ＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）の作用又は発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びにプリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質発現抑制方法によれば、正常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）の発現には殆んど影響を及ぼすことなく、異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）の産生を抑制することができる。また、ＧＡＢＡＡ受容体におけるβ１サブユニット以外のサブユニットの発現や作用、機能にも影響を与えることがなく、しかも、β１サブユニットについてもその発現量を低下させるものの、完全に発現を抑えるものではないことから、ほぼ正常な脳機能を維持したまま、異常型プリオン蛋白質の発現量を抑えることができるという優れた効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１に係る二本鎖ＲＮＡを用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。
【図２】同、実施例１の二本鎖ＲＮＡを用いた場合におけるＧａｂｒｂ１及びＰｒＰのｍＲＮＡ発現量について試験を行なった結果の一例を示すグラフである。
【図３】同、比較例１、２の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例１、レーン２：比較例２）。
【図４】同、比較例３、４の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例３、レーン２：比較例４）。
【図５】同、比較例５、６の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例５、レーン２：比較例６）。
【図６】同、実施例２、３の発現ベクターを用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：実施例２、レーン２：実施例３）。
【図７】同、実施例２、３の発現ベクターを用いた場合におけるＧａｂｒｂ１及びＰｒＰのｍＲＮＡ発現量について試験を行なった結果の一例を示すグラフである。
【図８】同、比較例の発現ベクターを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例７、レーン２：比較例８）。
【図９】同、比較例の発現ベクターを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例９、レーン２：比較例１０）。
【図１０】同、実施例４の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。
【図１１】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１１：ピクロトキシン）
【図１２】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１２：イソグバシン）
【図１３】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１３：ムシモール）
【図１４】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１４：無水エタノール）
【図１５】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１５：ペントバルビタール）
【図１６】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１６：γーアミノ酪酸）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態例について、詳細に説明する。
この実施形態におけるプリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用（機能）、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用（機能）を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有するものである。また、異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞において異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用（機能）を阻害的に調節すること、即ち、Ｇａｂｒｂ１調節物質を用いて異常プリオン蛋白質の発現又は作用を抑制するものである。本実施形態で対象とするプリオン病は、発症が確認されているヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなどヒトを含む全ての哺乳動物に係る全てのプリオン病であり、例えば、ＣＪＤ、ＧＳＳ、ＦＦＩ、ＢＳＥ、スクレイピー、ＣＷＤ、ＴＭＥを挙げることができる。プリオン感染哺乳動物細胞についても上記のようなプリオン病の感染細胞を対象とすることができる。
【００１２】
ＧＡＢＡＡ受容体（γ−アミノ酪酸受容体タイプＡ）は、塩化物イオンのチャネルであり、活性化により塩化物イオンを細胞内に流入させ過分極を起こすことにより神経伝達において抑制性に働いている。殆んどのＧＡＢＡＡ 受容体は５量体で構成され、構成サブユニットはα、β、γ、δ、ε、π、σに分類され少なくとも１６種類が存在する。αサブユニットはα１〜α６（Ｇａｂｒａ１〜Ｇａｂｒａ６）、βサブユニットではβ１〜β３（Ｇａｂｒｂ１〜Ｇａｂｒｂ３）、γサブユニットではγ１〜γ３（Ｇａｂｒｇ１〜Ｇａｂｒｇ３）のサブタイプ（アイソフォーム）がある〔オルセンＲ．Ｗ．ら（ＯＬＳＥＮ Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ）、ファーマコロジカル レビュー（ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷＳ）２００８年、６０巻、２４３〜２６０頁〕。本実施形態では、このようなＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットの内でＧａｂｒｂ１を標的とするＧａｂｒｂ１調節物質を用いるものである。Ｇａｂｒｂ１は、哺乳動物において種差による差異は殆んど認められず、蛋白質アミノ酸レベルで、例えばヒト、マウス、ウシにおける相同性は９７％以上である。Ｇａｂｒｂ１のｍＲＮＡを相補するＤＮＡの塩基配列は、マウス（ＮＭ＿００８０６９）では配列番号（１）、ヒト（ＮＭ＿０００８１２）では配列番号（２）で表される。配列番号（１）における残基番号１〜１４２５の塩基配列に相当するマウスＧａｂｒｂ１ｍＲＮＡのコード領域配列の９９．８％（１４２３／１４２５）は、配列番号（２）におけるヒトＧａｂｒｂ１ｍＲＮＡのコード領域のうちの残基番号９１〜１５１３の塩基配列と９１％の相同性を有している。本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質は、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節する物質であれば特に限定されず、例えば、ＲＮＡ、天然抽出或は合成の有機化合物、ペプチドや蛋白質、発現ベクターを挙げることができる。これらのＧａｂｒｂ１調節物質を複数併せて用いることもできる。
【００１３】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としてのＲＮＡは、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、細胞内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導しＧａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節（抑制）するＲＮＡ分子であれば特に限定されないが、二本鎖ＲＮＡが好ましい。ここで、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉは〔エルバッシュ Ｓ．Ｍ．ら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２００１年、４１１巻、４２８−４２９頁〕、細胞内に導入或は細胞内に産生させた二本鎖ＲＮＡによって、その配列特異的に標的ＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が抑制されるものである。細胞内に導入或は細胞内に産生させた二本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ＲＮＡｉの機構についても多くの研究がなされ解明が進んでおり、その概要は、細胞内に導入された二本鎖ＲＮＡがＤｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩファミリー酵素によって２１塩基前後のｓｉＲＮＡとされた後、ＲＮＡヘリカーゼで一本鎖化され、一本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に取り込まれ、取り込まれたｓｉＲＮＡをガイド鎖としてガイド鎖に相補的な標的ｍＲＮＡを認識し、ＲＩＳＣを構成するＡＧＯ２によって標的ｍＲＮＡをが切断されてメッセージ量が減り、これにより翻訳が十分行なわれず、結果的に標的遺伝子の発現を抑制するものである。したがって、ガイド鎖としてアンチセンス鎖が選択されるように二本鎖ＲＮＡを設計することが好ましく、また、標的遺伝子以外の遺伝子との相同性が高い（例えば１５塩基長以上一致するような）配列を選択することを避ける事が好ましい。これにより標的遺伝子以外の発現を抑制してしまうオフターゲット効果を引き起こす可能性を減じることができる。
【００１４】
この実施形態における二本鎖ＲＮＡの塩基長は、インターフェロン反応を誘導する可能性が低い点では３０塩基長以下とすることが好ましく、１７塩基以上、２９塩基以下がより好ましく、１９塩基以上、２７塩基以下がさらに好ましい。即ち、対象とする哺乳動物におけるＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡの塩基配列、例えばマウスを対象とする場合は、配列番号（１）で表される配列から３０塩基長以下の部分配列（対応するＲＮＡ鎖）を標的塩基配列（センス鎖）として選定すれば良く、ヒトの場合は配列番号（２）で表される配列から３０塩基長以下の部分配列を選定すれば良い。また、哺乳動物におけるＧａｂｒｂ１は動物種間の相同性が高く、例えば、ヒトを対象とする標的配列（センスＲＮＡ鎖）として、マウスで選定した標的配列を適用できる場合がある。さらに、センスＲＮＡ鎖には、例えば３〜４箇所にＣ⇒Ｕ、又はＡ⇒Ｇへの変異を加えることもでき、これによりオフターゲット効果を抑えたり、安定なＲＮＡｉを誘導できる場合がある点で好ましい。また、二本鎖ＲＮＡには、コレステロール修飾、ホスホロチオエート化修飾、２−Ｏ−メチル化修飾のような化学修飾を加えることもでき、これによりヌクレアーゼによる分解を抑えたり、安定的に効率よく細胞に導入できる場合がある点で好ましい。そして、さらに効率の高いＲＮＡｉを誘導することができる二本鎖ＲＮＡの設計についても多くの研究がなされ、二本鎖ＲＮＡの設計プログラムが公知であり、このような公知の設計プログラムを利用して二本鎖ＲＮＡを選定することもできる。
【００１５】
設計した二本鎖ＲＮＡは、公知の化学合成法、市販の合成装置を用いて合成することができる。また、ｃＤＮＡフラグメントなどを鋳型にＩｎ ｖｉｔｒｏ 転写でＲＮＡ鎖を調製し、二本鎖ＲＮＡを得ることもできるが、多くの煩雑な工程を要し操作の自動化が図り難い点で化学合成法に劣ることがあり、化学合成法が好ましい。得られたＲＮＡ鎖は、公知のアニーリング条件で二本鎖化することができる。アニーリング条件は、例えば、２〜１０ｎＭの等量のセンス鎖、アンチセンス鎖を混合、８５℃〜９５℃で数分間加熱した後、徐冷することによって二本鎖化することができる。本実施形態における好ましい二本鎖ＲＮＡの具体例は、例えば、配列番号（３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものを挙げることができる。二本鎖ＲＮＡの細胞への導入法は、各種トランスフェクション試薬による化学的方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような物理的方法など公知の核酸導入方法を利用することができ、導入する細胞の種類に応じて選択すれば良い。簡便であり、またトランスフェクションの効率、再現性が高い場合がある点ではリポソーム系のトランスフェクション試薬が好ましい。
【００１６】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としての発現ベクターは、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、細胞内でＲＮＡｉを誘導しＧａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節する発現ベクターであれば特に限定されない。ベクターとしては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどいずれのベクターであっても利用できる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、又はＩＩＩ系のプロモーターを有するベクターが好ましく、転写効率が高く発現量が多い場合がある点ではＨ１プロモーターやＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系のプロモーターを備えるプラスミドベクターがより好ましい。このようなベクターのプロモーター下流に、標的遺伝子を分解することのできるｓｉＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖を挿入し、ライゲーションすることにより発現ベクターを構築することができる。目的のｓｉＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖は、ヘアピン型ＲＮＡを発現させるように設計することが望ましく、設計したＤＮＡ鎖は公知の化学合成法、市販の合成装置を用いて合成することができる。ヘアピン型ＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖の設計は、例えば、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの塩基配列における１９塩基以上、３０塩基以下の塩基長で選定した標的配列でなるセンスＤＮＡ鎖と、このセンスＤＮＡ鎖に相補的な標的配列でなるアンチセンスＤＮＡ鎖との間にヘアピンループ配列を挟み、５′末端にライゲーション用のクローニングサイトと、３′末端にターミネーター配列とを配置するようにトップ鎖を設計することができる。
【００１７】
ここで、センスＤＮＡ鎖の設計は前述した二本鎖ＲＮＡの設計法と同様の方法により行なうことができる。ヘアピンループ配列は、ループ構造を構成する公知の配列とすることができ、その塩基長は３塩基以上、３０塩基以下とすることが好ましく、１０塩基以上、３０塩基以下がより好ましい。ターミネーター配列は、転写を中止させる配列を含む塩基配列であれば良く、例えば、４以上のＴ又はＡが連続する塩基配列で構成することができる。センスＤＮＡ鎖の５′端側の転写開始部位がＧ又はＡでない場合には、Ｇ又はＡを付加することが好ましい。また、ヘアピンループ配列とセンスＤＮＡ鎖又はアンチセンスＤＮＡ鎖とに跨る配列において、Ｔが４以上連続することがない様に設計することが望ましく、これにより転写がストップされることを防ぐことができる場合がある。なお、二本鎖ＲＮＡの設計と同様、センス鎖に変異や化学修飾を加えることもできる。また、このようなトップ鎖に相補的な塩基配列を有するボトム鎖を合成する。ボトム鎖の合成に際して、ボトム鎖の５′末端にはライゲーション用のクローニングサイトを配置することが好ましい。合成したトップ鎖とボトム鎖を混合、アニーリングすることによって二本鎖化することが好ましい。アニーリングの条件は、上述の二本鎖ＲＮＡの場合と同様の条件とすることができる。ベクターのクローニングサイトを制限酵素で切断した部位に二本鎖化済ＤＮＡを挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションすることで発現ベクターを構築できる。サブクローニングした発現ベクターは大腸菌（コンピテントセル）などに導入増幅し使用することができる。このような発現ベクターは、上述の二本鎖ＲＮＡの場合と同様にして細胞に導入することができる。本実施形態における好ましい発現ベクターの具体例としては、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成るプラスミドベクター、或は、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成るプラスミドベクターを挙げることができる。
【００１８】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としての有機化合物は、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節する天然抽出或は合成の有機化合物であれば、特に限定されない。Ｇａｂｒｂ１は動物組織において単独での存在は確認はされておらず、哺乳動物における単独の作用は特定することができないものの、アフリカツメガエルの卵での強制発現でＧａｂｒｂ１単独発現による塩化物イオンチャネルの形成が確認されている〔サンナ Ｅ．ら、（Ｓａｎｎａ Ｅ， ｅｔ ａｌ）モレキュラー ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） １９９５年、４７巻、２号、２１３−２１７頁〕。また、サリチリデンサリチルヒドラジド（ＳＣＳ）は、選択的にＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体に対して作用調節し、ＳＣＳが阻害的に作用するためにはＧａｂｒｂ１のＴｈｒ（２５５）、Ｉｌｅ（３０８）のアミノ酸残基部位が重要であることが示唆されている〔トンプソン Ｓ．Ａ．ら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ）ブリティッシュ ジャーナル オブ ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２００４年、１４２巻、９７−１０６頁〕。そして、後述する実験３．において、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターである薬剤、サリチリデンサリチルヒドラジドをプリオン感染哺乳動物細胞の培養液に添加して培養することによりＰｒＰｒｅｓの産生を抑制することが確認され、他のＧＡＢＡＡ受容体に対するアンタゴニストやアゴニストはＰｒＰｒｅｓの産生に影響を及ぼさないことが確認されている。したがって、サリチリデンサリチルヒドラジド及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれた薬剤はプリオン病の予防及び／又は治療薬の有効成分として有用である。
サリチリデンサリチルヒドラジドは以下の式（１）で示されるものである。
【００１９】
【化１】
【００２０】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としてのペプチドや蛋白質は、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するオリゴペプチド、ポリペプチドなどのペプチドや蛋白質であれば特に限定されない。ペプチドや蛋白質としては、例えば、Ｇａｂｒｂ１蛋白質に対しての抗体、Ｇａｂｒｂ１に親和性を有しＧａｂｒｂ１の機能を阻害するペプチドや蛋白質などを挙げることができる。抗体は、モノクローナル抗体が好ましく、また、パパインやペプシンなどのプロテアーゼで消化分解させて得られるＦａｂやＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２の半分子型還元体Ｆａｂ’など、フラグメント化した抗体であっても良い。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明によるプリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びに異常プリオン蛋白質発現抑制方法ついて、実施例、比較例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００２２】
［実験１：二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡｉによる検討］
〔１−１．標的配列及び二本鎖ＲＮＡ〕
（実施例１）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、マウスＧａｂｒｂ１（ＮＭ＿００８０６９：配列番号（１））の塩基配列における第８２０番（Ｇ）〜８４４番（Ａ）配列に相当する２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｆ：５′−ＧＣＣＡＧＡＧＵＣＧＣＡＣＵＡＧＧＡＡＵＣＡＣＵＡ：配列番号（３））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｒ：５′−ＵＡＧＵＧＡＵＵＣＣＵＡＧＵＧＣＧＡＣＵＣＵＧＧＣ：配列番号（４））から成る二本鎖ＲＮＡ（Ｇｂ１−ｃ）を用いた。Ｇａｂｒｂ１標的化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｆ、及びＧａｂｒｂ１標的化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｒは、その標的配列の設計から化学合成、精製までが成され、アニーリングにより二本鎖化されており、Ｇａｂｒｂ１遺伝子の発現抑制が保証された市販品（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。この二本鎖ＲＮＡは、センス鎖がｓｉＲＮＡとして働かないように化学修飾が施されており、ＲＮＡａｓｅを含まない水、ここではＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネイト）処理水に溶解させて使用した。
【００２３】
（比較例１）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒａ５（ＧＡＢＡＡ受容体α５サブユニット）遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−１Ｆ：５′−ＡＡＣＡＵＡＧＡＣＡＡＣＵＵＣＡＧＡＡＵＵＡＧＧＧ：配列番号（５））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−１Ｒ：５′−ＣＣＣＵＡＡＵＵＣＵＧＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＵＧＵＵ：配列番号（６））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は実施例１の場合と同様の市販品（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
【００２４】
（比較例２）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒａ５遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒａ５化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−２Ｆ：５′−ＵＵＡＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＵＵＵＣＡＵＣＵＵＵＣＣ：配列番号（７））とアンチセンスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒａ５化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−２Ｒ：５′−ＧＧＡＡＡＧＡＵＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣＧＧＵＵＵＡＡ：配列番号（８））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様とした。
【００２５】
（比較例３）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ２遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−１Ｆ：５′−ＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＵＧＵＣＵＵＡＣＡＡ：配列番号（９））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−１Ｒ：５′−ＵＵＧＵＡＡＧＡＣＡＧＣＣＵＣＵＵＧＵＣＵＣＵＣＣ：配列番号（１０））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２６】
（比較例４）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ２遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒｂ２化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−２Ｆ：５′−ＣＣＧＵＡＵＧＡＵＵＣＧＡＵＵＧＣＡＵＣＣＣＧＡＵ：配列番号（１１））とアンチセンスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒｂ２化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−２Ｒ：５′−ＡＵＣＧＧＧＡＵＧＣＡＡＵＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＧＧ：配列番号（１２））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２７】
（比較例５）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ３遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−１Ｆ：５′−ＵＣＡＣＣＵＵＣＧＧＧＡＧＡＣＵＣＵＡＣＣＣＡＡＡ：配列番号（１３））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−１Ｒ：５′−ＵＵＵＧＧＧＵＡＧＡＧＵＣＵＣＣＣＧＡＡＧＧＵＧＡ：配列番号（１４））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２８】
（比較例６）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ３遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−２Ｆ：５′−ＵＧＧＵＵＵＧＣＵＧＣＧＣＵＣＡＧＡＧＣＧＵＡＡＡ：配列番号（１５））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−２Ｒ：５′−ＵＵＵＡＣＧＣＵＣＵＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＡ：配列番号（１６））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２９】
〔１−２．プリオン感染哺乳動物細胞及び二本鎖ＲＮＡの導入、細胞培養系〕
プリオン感染哺乳動物細胞として、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を用い、実験１−１で得た実施例１、比較例１乃至６の各二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入を行った。培養液には１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、細胞培養は、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベータ内に培養フラスコ又はプレートを静置することにより行なった（以降、細胞培養条件共通）。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈して細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に２ｍＬずつ注入し、翌日にリポソーム系トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２．０μＬ／穴（ウェル）、実施例１、比較例１乃至６の各ｓｉＲＮＡを２０ｎＭの濃度となるように添加混合した混合液を各穴に添加、培養することによって細胞に二本鎖ＲＮＡを導入した。なお、二本鎖ＲＮＡを添加することなく、リポソーム系トランスフェクション試薬のみを加えて、実施例、比較例の場合と同様に培養し対照とした。二本鎖ＲＮＡの導入翌日に培地（培養液）を交換し、導入後三日目に培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］を洗浄液として細胞を洗浄した後、洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００３０】
〔１−３．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量（発現量）確認試験〕
実験１−２．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、リシス液［ｌｙｓｉｓ液：０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ ＮＰ−４０（商品名、和光純薬工業（株） オクチルフェニルエーテル）、残部ＰＢＳ］０．５ｍＬを用いて細胞を溶解し、軽く遠心分離して高分子核酸を除いた。
【００３１】
プロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）産生量確認用サンプルの調製は、高分子核酸除去細胞溶解液にトリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（ＰＫ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎ ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＭＳＦ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて蛋白質分解反応を停止させた。蛋白質分解処理した細胞溶解液に核酸分離用シリカとして市販されているＦＯＧ（（商品名）、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を滅菌水（オートクレーブ滅菌蒸留水）で２５０倍希釈したシリカ懸濁液１０μＬを加え遠心分離（２０，０００×ｇ、２０分間）してシリカを沈殿させ上清を除いた。この沈殿全量に対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー２０μＬを加えて懸濁し、９５℃１０分間の熱変性後にイシカワ、ドウウラ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの方法［イシカワ Ｋ．、ドウウラ Ｋ．ら、ジャーナル オブ ジェネラル ヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２００４年、８５巻、１７８５−１７９０頁］に準じて１５％ トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でプロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈））、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製、（２００００倍希釈））、化学発光検出試薬（アマシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名））を使用してプリオン蛋白質の検出を行った。
【００３２】
総プリオン蛋白質（Ｔｏｔａｌ ＰｒＰ）産生量確認用サンプルの調製は、ＰｒＰｒｅｓと同様に高分子核酸を除いた細胞溶解液に５倍濃度のサンプルバッファーを４分の１容加えて９５℃５分間の熱変性後１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法で各蛋白を検出した。細胞培養乃至電気泳動における蛋白質量の指標となる（正常）コントロールとしてのβ−アクチン（Ａｃｔｉｎ）、及びグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）についても、総プリオン蛋白質産生量確認用サンプルの調製と同様に各サンプル調製を行なった後、１０％又は１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法で各蛋白を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈））、β−Ａｃｔｉｎに対するモノクローナル抗体（ｓｉｇｍａ社製）、ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製、（２００００倍希釈））、化学発光検出試薬（アマシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名））を使用して各蛋白質の検出を行った。
【００３３】
〔１−４．Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量確認試験〕
実験１−２．において、実施例１の二本鎖ＲＮＡを導入して得られた回収細胞及び対照回収細胞（各ウェル毎）につき、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの発現量及びＰｒＰ ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。各回収細胞についてＲＮＡ抽出試薬（Ｉｓｏｇｅｎ（商品名）、株式会社ニッポンジーン社製）を使用して総ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ）の抽出を行い、抽出した総ＲＮＡの２μｇを鋳型に、ランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写酵素ＲＴａｓｅを含むｃＤＮＡ合成試薬キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（商品名）、タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、Ｇａｂｒｂ１遺伝子特異的プライマー、又はプリオン（ＰｒＰ）遺伝子特異的プライマーを用い、ＤＮＡポリメラーゼ、検出用色素を含むリアルタイム定量ＰＣＲ用試薬キット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ７３００型、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。Ｇａｂｒｂ１遺伝子特異的プライマーとしては、Ｇａｂｒｂ１プライマｒＧｂ１−１Ｆ：５′−ＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧ：配列番号（１７）、及びＧａｂｒｂ１プライマｒＧｂ１−１Ｒ：５′−ＧＧＣＡＴＧＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴ：配列番号（１８）を用いた。ＰｒＰ遺伝子特異的プライマーとしては、ＰｒＰプライマｒＰｒＰ−１Ｆ：５′−ＡＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＡ：配列番号（１９）、及びＰｒＰプライマｒＰｒＰ−１Ｒ：５′−ＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧ：配列番号（２０）を用いた。内部標準としてβ−アクチンを用いた。β−アクチン遺伝子特異的プライマーとして、ａｃｔｉｎ−Ｆ：５′−ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡ：配列番号（２１）、及びａｃｔｉｎ−Ｒ：５′−ＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＴＴ：配列番号（２２）を用いた。
【００３４】
〔実験１の結果〕
実施例１の二本鎖ＲＮＡをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験１−３．の結果を図１に、また、実験１−４による結果を図２に示した。比較例１乃至６の二本鎖ＲＮＡをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験１−３．の結果を夫々図３乃至５に示した。図１、２から、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ２０ｎＭのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によってＲＮＡｉが誘導され、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ発現量が減少すること、また、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量が増加し、総ＰｒＰ蛋白質産生量も増加するが、ＰｒＰｒｅｓ産生量は顕著に減少することが確認された。一方、図３乃至５から、比較例１、２のＧａｂｒａ５遺伝子（図３）、比較例３、４のＧａｂｒｂ２遺伝子（図４）、比較例５、６のＧａｂｒｂ３遺伝子（図５）を夫々標的とする二本鎖ＲＮＡ２０ｎＭのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によっては、いずれもＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することはなく、ＧＡＢＡＡ受容体α５サブユニット、β２サブユニット、β３サブユニットは、ＰｒＰｒｅｓ産生に関与しないことが確認された。
【００３５】
［実験２：発現ベクターを用いたＲＮＡｉによる検討］
〔２−１．標的配列及び発現ベクター〕
（実施例２）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）系のヒトＨ１プロモーターを有するｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクター（ｐＢＡｓｉ−ｈＨ１（商品名）、タカラバイオ社製）におけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られた（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧｂ１−ｖ−１を用いた。発現ベクターＧｂ１−ｖ−１に挿入する合成ＤＮＡは、マウスＧａｂｒｂ１（ＮＭ＿００８０６９：配列番号（１））の塩基配列における第６６３番（Ｇ）〜６８３番（Ｇ）に一部変異を加えた２１塩基長の標的配列（センスＤＮＡ鎖）、このセンスＤＮＡ鎖に相補的な標的配列（アンチセンスＤＮＡ鎖）、５′末端にライゲーション用のクローニングサイト、センスＤＮＡ鎖とアンチセンスＤＮＡ鎖との間にヘアピンループ配列、３′端にターミネーター配列を配置した（Ｔｏｐ鎖）Ｇｂ１−ｖ−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＴＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２３））と、このＧｂ１−ｖ−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇｂ１−ｖ−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＧ：配列番号（２４））とした。標的配列の設計は、タカラバイオ株式会社Ｗｅｂサイト内にある設計プログラムを利用して、他の遺伝子と重複せず、安定したヘアピンループを形成する配列を選定した。Ｇｂ１−ｖ−１Ｆ、Ｇｂ１−ｖ−１Ｒの化学合成は、シグマ社に製造委託した。得られた合成ＤＮＡ Ｇｂ１−ｖ−１ＦとＧｂ１−ｖ−１Ｒを混合し９５度に加熱してから徐冷してアニーリングさせた後、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにアニーリング済合成ＤＮＡを挿入、ライゲーションし、発現ベクターＧｂ１−ｖ−１を得た。合成ＤＮＡを挿入したプラスミド（発現ベクターＧｂ１−ｖ−１）を大腸菌で増幅後、精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商品名）、Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミド（発現ベクターＧｂ１−ｖ−１）を回収した。
【００３６】
（実施例３）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、標的配列（センスＤＮＡ鎖）が異なる他は実施例２の場合と同様にして得た発現ベクターＧｂ１−ｖ−２を用いた。発現ベクターＧｂ１−ｖ−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇｂ１−ｖ−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２５））と、このＧｂ１−ｖ−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇｂ１−ｖ−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧ：配列番号（２６））とした。
【００３７】
（比較例７）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｄ（ＧＡＢＡＡ受容体δサブユニット）遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧａｂｒｄ−１を用いた。この発現ベクターＧａｂｒｄ−１は、実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られる。発現ベクターＧａｂｒｄ−１に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｄ−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２７））と、このＧａｂｒｄ−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｄ−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＧ：配列番号（２８））とした。他の事項は実施例２の場合と同様とした。
【００３８】
（比較例８）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｄ遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する発現ベクターＧａｂｒｄ−２を用いた。実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に挿入され、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡが比較例７と異なる以外は比較例７と同様とした。発現ベクターＧａｂｒｄ−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｄ−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＣＴＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２９））と、このＧａｂｒｄ−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｄ−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧ：配列番号（３０））とした。
【００３９】
（比較例９）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｇ２（ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット）遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧａｂｒｇ２−１を用いた。この発現ベクターＧａｂｒｇ２−１は、実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られる。発現ベクターＧａｂｒｇ２−１に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｇ２−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（３１））と、このＧａｂｒｇ２−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｇ２−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＣＣＡＧＧＴＧ：配列番号（３２））とした。他の事項は実施例２の場合と同様とした。
【００４０】
（比較例１０）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｇ２遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する発現ベクターＧａｂｒｇ２−２を用いた。実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に挿入され、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡが比較例９と異なる以外は比較例９と同様とした。発現ベクターＧａｂｒｇ２−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｇ２−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（３３））と、このＧａｂｒｇ２−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｇ２−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＧ：配列番号（３４））とした。
【００４１】
〔２−２．プリオン感染哺乳動物細胞及び発現ベクターの導入、細胞培養系〕
プリオン感染哺乳動物細胞として、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を用い、実験２−１．で得た実施例２、３、比較例７乃至１０の各（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターの導入を行った。培養液には１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、細胞培養は、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベータ内に培養フラスコ又はプレートを静置することにより行なった（以降、細胞培養条件共通）。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈して細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に２ｍＬずつ注入し、翌日にリポソーム系トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１．５μＬ／穴（ウェル）、実施例２、３、比較例７乃至１０の各発現ベクター（ベクター型ｓｉＲＮＡ）を０．４μｇ／穴となるよう添加混合した混合液を各穴に添加、培養することによって細胞に各発現ベクターを導入した。なお、空のプラスミドベクターを０．４μｇ／穴加えて、実施例、比較例の場合と同様に培養し対照（Ｍｏｃｋ）とした。発現ベクターの導入翌日に培地（培養液）を交換し、導入後三日目に培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］を洗浄液として細胞を洗浄した後、洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００４２】
〔２−３．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量確認試験〕
実験２−２．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−３．の場合と同様にして、異常型プリオン蛋白質産生量、総プリオン蛋白質産生量を確認する試験を行なった。
【００４３】
〔２−４．Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量確認試験〕
実験２−２．において、実施例２、３の発現ベクターを導入して得られた回収細胞及び対照回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−４．の場合と同様にしてＧａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの発現量及びＰｒＰ ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００４４】
〔実験２の結果〕
実施例２、３の発現ベクターをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験２−３．の結果を図６に、また、実験２−４による結果を図７に示した。比較例７乃至１０の発現ベクターをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験２−３．の結果を、夫々、図８、９に示した。図６、７に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によってＲＮＡｉが誘導され、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ発現量が減少すること、また、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量は大きな変動はなく（２〜３割増加）、総ＰｒＰ蛋白質産生量も殆んど変動を認めないが、ＰｒＰｒｅｓ産生量はＧａｂｒｂ１メッセージ量に応じて減少することが確認された。また、図８、９に示した結果から、比較例７、８のＧａｂｒｄ遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡ、並びに比較例９、１０のＧａｂｒｇ２遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によっては、ＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することはなく、ＧＡＢＡＡ受容体δサブユニット、並びにγ２サブユニットは、ＰｒＰｒｅｓ産生に関与しないことが確認された。
【００４５】
〔実験３：有機化合物を用いた検討〕
〔３−１．ＧＡＢＡＡ受容体関連有機化合物の添加培養試験〕
（実施例４）
Ｇａｂｒｂ１の作用又はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、Ｇａｂｒｂ１に選択的に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の一つであるサリチリデンサリチルヒドラジド（Ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ：ＳＣＳ、Ｔｏｃｒｉｓ社製）を用いた。また、プリオン感染哺乳動物細胞としては、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を使用した。１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に１ｍＬずつ注入して、薬剤（ＳＣＳ）を０、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１０００ｎＭの各濃度になるように添加した。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈し２ｍＬずつ注入して３日間培養した。培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］で細胞を洗浄して洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００４６】
（比較例１１）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアンタゴニストであるピクロトキシン（Ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４７】
（比較例１２）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるイソグバシン塩酸塩（Ｉｓｏｇｕｖａｃｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４８】
（比較例１３）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるムシモール（Ｍｕｓｃｉｍｏｌ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４９】
（比較例１４）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストである無水エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ（９９．５％）、ナカライテスク社製）を用い、添加濃度を０、０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、３ｐｐｍ、１０ｐｐｍとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５０】
（比較例１５）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるペントバルビタール（Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ、大日本製薬社製、（商品名：ネンブタール））を用い、添加濃度を０、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５１】
（比較例１６）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、５μＭ、５０μＭ、５００μＭ、５０００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５２】
〔３−２．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量確認試験〕
実験３−１．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−３．の場合と同様にして、異常型プリオン蛋白質産生量、総プリオン蛋白質産生量を確認する試験を行なった。
【００５３】
〔実験３の結果〕
実施例４の薬剤を用いた場合における実験３−２．の結果を図１０に示した。また、比較例１１乃至比較例１６の薬剤を用いた場合における実験３−２．（異常型プリオン蛋白質の産生量）の結果を夫々、図１１乃至図１６に示した。図１０に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用又はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として実施例４の薬剤を用いることにより、ＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することが確認された。また、図１１乃至１６に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１に選択的に作用するものではないＧＡＢＡＡ受容体のアンタゴニスト、アゴニストである比較例１１乃至１６のような薬剤を用いてもＰｒＰｒｅｓ産生量は減少しないことが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプリオン病の予防、或は発症抑制を含む治療用に有効な薬剤、並びに異常プリオン蛋白質の発現抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病は感染因子となる異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）の蓄積により中枢神経が侵される疾患であり、ヒトをはじめウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなど多くの哺乳動物においてその発症が認められている。代表的なプリオン病としては、ヒトではクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）や致死性家族性不眠症（ＦＦＩ：Ｆａｔａｌ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｉｎｓｏｍｎｉａ）、ヒト以外では、例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）などが挙げられる。ＰｒＰｒｅｓは正常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）と一次構造が同一であるが高次構造が異なり、一般的な高圧蒸気滅菌、乾熱滅菌によってもその感染性がなくなることがなく、ホルマリンやアルコールなどによって変性不活化されない。また、ＰｒＰｃ前駆体のアミノ酸配列は哺乳動物種間での相同性が高く、例えば、ヒトとマウス、ハムスターのようなげっ歯類動物とでは９５％以上のホモロジーを有している。これが、動物種を超えてプリオンが感染、伝達される理由であると考えられている。
【０００３】
このようなプリオン病の予防や治療用の薬剤、或はＰｒＰｒｅｓの増殖を抑制する方法として、ペントサンポリサルフェート、キニーネ類、ライソゾーム親和性薬剤、リアクティブ・ダイ〔例えば、特許文献１参照〕、ロイシン、イソロイシン、バリンなどのアミノ酸、またはトレハロース〔例えば、特許文献２参照〕、キノリン誘導体、またはナフチリジン誘導体〔例えば、特許文献３参照〕、可溶性ラミニン受容体前駆体（ＬＲＰ）の発現を減少させ又は阻害するアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムからなる薬剤組成物〔例えば、特許文献４参照〕、３７ｋＤａ／６７ｋＤａのラミニン受容体（ＬＲＰ／ＬＲ）に特異的な抗体〔例えば、非特許文献１〕、プリオン蛋白質遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用い正常型プリオン蛋白質の発現を抑制することによる異常型プリオン蛋白質抑制方法〔例えば、特許文献５参照〕などの提案がある。しかしながら、有効なプリオン病の予防用薬や治療用薬は未だ見出されていないという現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−４０７７８号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２４３７号公報
【特許文献３】特開２００４−９９５５３号公報
【特許文献４】特表２００２−５０１３８５号公報
【特許文献５】特開２００５−７３５７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ロイト Ｃ．ら（Ｌｅｕｃｈｔ Ｃ．，ｅｔ ａｌ）、イーエムビーオー レポート（ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ）２００３年、４巻、３号、２９０−２９５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる現状に鑑みてなされた本発明の目的は、プリオン病の予防、又はプリオン病の発症抑制を含む治療用に有効な薬剤を提供することにある。また、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によるプリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用又は発現、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有することを特徴とする。このようなプリオン病の予防及び／又は治療用薬において、Ｇａｂｒｂ１調節物質が、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であることが好ましく、また、ＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターが、サリチリデンサリチルヒドラジド（Ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ：ＳＣＳ）及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることが好適である。そして、Ｇａｂｒｂ１調節物質が、細胞内に導入されてＲＮＡ干渉を誘導しＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡ発現量を低下させる二本鎖ＲＮＡ又は発現ベクターであることが好ましい。ここで、二本鎖ＲＮＡが、配列番号（３）の塩基配列を有する（化学合成オリゴヌクレオチド）Ｇｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有する（化学合成オリゴヌクレオチド）Ｇｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものであることが好ましく、また、発現ベクターが、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成ること、或は、発現ベクターが、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成ることが好適である。
【０００８】
また、上記目的を達成するため、本発明による異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、ＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）の作用又は発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びにプリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質発現抑制方法によれば、正常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）の発現には殆んど影響を及ぼすことなく、異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）の産生を抑制することができる。また、ＧＡＢＡＡ受容体におけるβ１サブユニット以外のサブユニットの発現や作用、機能にも影響を与えることがなく、しかも、β１サブユニットについてもその発現量を低下させるものの、完全に発現を抑えるものではないことから、ほぼ正常な脳機能を維持したまま、異常型プリオン蛋白質の発現量を抑えることができるという優れた効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１に係る二本鎖ＲＮＡを用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。
【図２】同、実施例１の二本鎖ＲＮＡを用いた場合におけるＧａｂｒｂ１及びＰｒＰのｍＲＮＡ発現量について試験を行なった結果の一例を示すグラフである。
【図３】同、比較例１、２の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例１、レーン２：比較例２）。
【図４】同、比較例３、４の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例３、レーン２：比較例４）。
【図５】同、比較例５、６の二本鎖ＲＮＡを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例５、レーン２：比較例６）。
【図６】同、実施例２、３の発現ベクターを用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：実施例２、レーン２：実施例３）。
【図７】同、実施例２、３の発現ベクターを用いた場合におけるＧａｂｒｂ１及びＰｒＰのｍＲＮＡ発現量について試験を行なった結果の一例を示すグラフである。
【図８】同、比較例の発現ベクターを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例７、レーン２：比較例８）。
【図９】同、比較例の発現ベクターを用いた場合における異常型プリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である（レーン１：比較例９、レーン２：比較例１０）。
【図１０】同、実施例４の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。
【図１１】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１１：ピクロトキシン）
【図１２】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１２：イソグバシン）
【図１３】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１３：ムシモール）
【図１４】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１４：無水エタノール）
【図１５】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１５：ペントバルビタール）
【図１６】同、比較例の薬剤を用いた場合におけるプリオン蛋白質産生量について試験を行なった結果の一例としてウェスタンブロットによる泳動像を示す図面代用写真である。（比較例１６：γーアミノ酪酸）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態例について、詳細に説明する。
この実施形態におけるプリオン病の予防及び／又は治療用薬は、ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用（機能）、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用（機能）を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有するものである。また、異常プリオン蛋白質発現抑制方法は、プリオン感染哺乳動物細胞において異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用（機能）を阻害的に調節すること、即ち、Ｇａｂｒｂ１調節物質を用いて異常プリオン蛋白質の発現又は作用を抑制するものである。本実施形態で対象とするプリオン病は、発症が確認されているヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなどヒトを含む全ての哺乳動物に係る全てのプリオン病であり、例えば、ＣＪＤ、ＧＳＳ、ＦＦＩ、ＢＳＥ、スクレイピー、ＣＷＤ、ＴＭＥを挙げることができる。プリオン感染哺乳動物細胞についても上記のようなプリオン病の感染細胞を対象とすることができる。
【００１２】
ＧＡＢＡＡ受容体（γ−アミノ酪酸受容体タイプＡ）は、塩化物イオンのチャネルであり、活性化により塩化物イオンを細胞内に流入させ過分極を起こすことにより神経伝達において抑制性に働いている。殆んどのＧＡＢＡＡ 受容体は５量体で構成され、構成サブユニットはα、β、γ、δ、ε、π、σに分類され少なくとも１６種類が存在する。αサブユニットはα１〜α６（Ｇａｂｒａ１〜Ｇａｂｒａ６）、βサブユニットではβ１〜β３（Ｇａｂｒｂ１〜Ｇａｂｒｂ３）、γサブユニットではγ１〜γ３（Ｇａｂｒｇ１〜Ｇａｂｒｇ３）のサブタイプ（アイソフォーム）がある〔オルセンＲ．Ｗ．ら（ＯＬＳＥＮ Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ）、ファーマコロジカル レビュー（ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷＳ）２００８年、６０巻、２４３〜２６０頁〕。本実施形態では、このようなＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットの内でＧａｂｒｂ１を標的とするＧａｂｒｂ１調節物質を用いるものである。Ｇａｂｒｂ１は、哺乳動物において種差による差異は殆んど認められず、蛋白質アミノ酸レベルで、例えばヒト、マウス、ウシにおける相同性は９７％以上である。Ｇａｂｒｂ１のｍＲＮＡを相補するＤＮＡの塩基配列は、マウス（ＮＭ＿００８０６９）では配列番号（１）、ヒト（ＮＭ＿０００８１２）では配列番号（２）で表される。配列番号（１）における残基番号１〜１４２５の塩基配列に相当するマウスＧａｂｒｂ１ｍＲＮＡのコード領域配列の９９．８％（１４２３／１４２５）は、配列番号（２）におけるヒトＧａｂｒｂ１ｍＲＮＡのコード領域のうちの残基番号９１〜１５１３の塩基配列と９１％の相同性を有している。本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質は、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節する物質であれば特に限定されず、例えば、ＲＮＡ、天然抽出或は合成の有機化合物、ペプチドや蛋白質、発現ベクターを挙げることができる。これらのＧａｂｒｂ１調節物質を複数併せて用いることもできる。
【００１３】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としてのＲＮＡは、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、細胞内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導しＧａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節（抑制）するＲＮＡ分子であれば特に限定されないが、二本鎖ＲＮＡが好ましい。ここで、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉは〔エルバッシュ Ｓ．Ｍ．ら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２００１年、４１１巻、４２８−４２９頁〕、細胞内に導入或は細胞内に産生させた二本鎖ＲＮＡによって、その配列特異的に標的ＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が抑制されるものである。細胞内に導入或は細胞内に産生させた二本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ＲＮＡｉの機構についても多くの研究がなされ解明が進んでおり、その概要は、細胞内に導入された二本鎖ＲＮＡがＤｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩファミリー酵素によって２１塩基前後のｓｉＲＮＡとされた後、ＲＮＡヘリカーゼで一本鎖化され、一本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に取り込まれ、取り込まれたｓｉＲＮＡをガイド鎖としてガイド鎖に相補的な標的ｍＲＮＡを認識し、ＲＩＳＣを構成するＡＧＯ２によって標的ｍＲＮＡをが切断されてメッセージ量が減り、これにより翻訳が十分行なわれず、結果的に標的遺伝子の発現を抑制するものである。したがって、ガイド鎖としてアンチセンス鎖が選択されるように二本鎖ＲＮＡを設計することが好ましく、また、標的遺伝子以外の遺伝子との相同性が高い（例えば１５塩基長以上一致するような）配列を選択することを避ける事が好ましい。これにより標的遺伝子以外の発現を抑制してしまうオフターゲット効果を引き起こす可能性を減じることができる。
【００１４】
この実施形態における二本鎖ＲＮＡの塩基長は、インターフェロン反応を誘導する可能性が低い点では３０塩基長以下とすることが好ましく、１７塩基以上、２９塩基以下がより好ましく、１９塩基以上、２７塩基以下がさらに好ましい。即ち、対象とする哺乳動物におけるＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡの塩基配列、例えばマウスを対象とする場合は、配列番号（１）で表される配列から３０塩基長以下の部分配列（対応するＲＮＡ鎖）を標的塩基配列（センス鎖）として選定すれば良く、ヒトの場合は配列番号（２）で表される配列から３０塩基長以下の部分配列を選定すれば良い。また、哺乳動物におけるＧａｂｒｂ１は動物種間の相同性が高く、例えば、ヒトを対象とする標的配列（センスＲＮＡ鎖）として、マウスで選定した標的配列を適用できる場合がある。さらに、センスＲＮＡ鎖には、例えば３〜４箇所にＣ⇒Ｕ、又はＡ⇒Ｇへの変異を加えることもでき、これによりオフターゲット効果を抑えたり、安定なＲＮＡｉを誘導できる場合がある点で好ましい。また、二本鎖ＲＮＡには、コレステロール修飾、ホスホロチオエート化修飾、２−Ｏ−メチル化修飾のような化学修飾を加えることもでき、これによりヌクレアーゼによる分解を抑えたり、安定的に効率よく細胞に導入できる場合がある点で好ましい。そして、さらに効率の高いＲＮＡｉを誘導することができる二本鎖ＲＮＡの設計についても多くの研究がなされ、二本鎖ＲＮＡの設計プログラムが公知であり、このような公知の設計プログラムを利用して二本鎖ＲＮＡを選定することもできる。
【００１５】
設計した二本鎖ＲＮＡは、公知の化学合成法、市販の合成装置を用いて合成することができる。また、ｃＤＮＡフラグメントなどを鋳型にＩｎ ｖｉｔｒｏ 転写でＲＮＡ鎖を調製し、二本鎖ＲＮＡを得ることもできるが、多くの煩雑な工程を要し操作の自動化が図り難い点で化学合成法に劣ることがあり、化学合成法が好ましい。得られたＲＮＡ鎖は、公知のアニーリング条件で二本鎖化することができる。アニーリング条件は、例えば、２〜１０ｎＭの等量のセンス鎖、アンチセンス鎖を混合、８５℃〜９５℃で数分間加熱した後、徐冷することによって二本鎖化することができる。本実施形態における好ましい二本鎖ＲＮＡの具体例は、例えば、配列番号（３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものを挙げることができる。二本鎖ＲＮＡの細胞への導入法は、各種トランスフェクション試薬による化学的方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような物理的方法など公知の核酸導入方法を利用することができ、導入する細胞の種類に応じて選択すれば良い。簡便であり、またトランスフェクションの効率、再現性が高い場合がある点ではリポソーム系のトランスフェクション試薬が好ましい。
【００１６】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としての発現ベクターは、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、細胞内でＲＮＡｉを誘導しＧａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節する発現ベクターであれば特に限定されない。ベクターとしては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどいずれのベクターであっても利用できる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、又はＩＩＩ系のプロモーターを有するベクターが好ましく、転写効率が高く発現量が多い場合がある点ではＨ１プロモーターやＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系のプロモーターを備えるプラスミドベクターがより好ましい。このようなベクターのプロモーター下流に、標的遺伝子を分解することのできるｓｉＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖を挿入し、ライゲーションすることにより発現ベクターを構築することができる。目的のｓｉＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖は、ヘアピン型ＲＮＡを発現させるように設計することが望ましく、設計したＤＮＡ鎖は公知の化学合成法、市販の合成装置を用いて合成することができる。ヘアピン型ＲＮＡを発現させるＤＮＡ鎖の設計は、例えば、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの塩基配列における１９塩基以上、３０塩基以下の塩基長で選定した標的配列でなるセンスＤＮＡ鎖と、このセンスＤＮＡ鎖に相補的な標的配列でなるアンチセンスＤＮＡ鎖との間にヘアピンループ配列を挟み、５′末端にライゲーション用のクローニングサイトと、３′末端にターミネーター配列とを配置するようにトップ鎖を設計することができる。
【００１７】
ここで、センスＤＮＡ鎖の設計は前述した二本鎖ＲＮＡの設計法と同様の方法により行なうことができる。ヘアピンループ配列は、ループ構造を構成する公知の配列とすることができ、その塩基長は３塩基以上、３０塩基以下とすることが好ましく、１０塩基以上、３０塩基以下がより好ましい。ターミネーター配列は、転写を中止させる配列を含む塩基配列であれば良く、例えば、４以上のＴ又はＡが連続する塩基配列で構成することができる。センスＤＮＡ鎖の５′端側の転写開始部位がＧ又はＡでない場合には、Ｇ又はＡを付加することが好ましい。また、ヘアピンループ配列とセンスＤＮＡ鎖又はアンチセンスＤＮＡ鎖とに跨る配列において、Ｔが４以上連続することがない様に設計することが望ましく、これにより転写がストップされることを防ぐことができる場合がある。なお、二本鎖ＲＮＡの設計と同様、センス鎖に変異や化学修飾を加えることもできる。また、このようなトップ鎖に相補的な塩基配列を有するボトム鎖を合成する。ボトム鎖の合成に際して、ボトム鎖の５′末端にはライゲーション用のクローニングサイトを配置することが好ましい。合成したトップ鎖とボトム鎖を混合、アニーリングすることによって二本鎖化することが好ましい。アニーリングの条件は、上述の二本鎖ＲＮＡの場合と同様の条件とすることができる。ベクターのクローニングサイトを制限酵素で切断した部位に二本鎖化済ＤＮＡを挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションすることで発現ベクターを構築できる。サブクローニングした発現ベクターは大腸菌（コンピテントセル）などに導入増幅し使用することができる。このような発現ベクターは、上述の二本鎖ＲＮＡの場合と同様にして細胞に導入することができる。本実施形態における好ましい発現ベクターの具体例としては、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成るプラスミドベクター、或は、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成るプラスミドベクターを挙げることができる。
【００１８】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としての有機化合物は、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節する天然抽出或は合成の有機化合物であれば、特に限定されない。Ｇａｂｒｂ１は動物組織において単独での存在は確認はされておらず、哺乳動物における単独の作用は特定することができないものの、アフリカツメガエルの卵での強制発現でＧａｂｒｂ１単独発現による塩化物イオンチャネルの形成が確認されている〔サンナ Ｅ．ら、（Ｓａｎｎａ Ｅ， ｅｔ ａｌ）モレキュラー ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） １９９５年、４７巻、２号、２１３−２１７頁〕。また、サリチリデンサリチルヒドラジド（ＳＣＳ）は、選択的にＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体に対して作用調節し、ＳＣＳが阻害的に作用するためにはＧａｂｒｂ１のＴｈｒ（２５５）、Ｉｌｅ（３０８）のアミノ酸残基部位が重要であることが示唆されている〔トンプソン Ｓ．Ａ．ら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ）ブリティッシュ ジャーナル オブ ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２００４年、１４２巻、９７−１０６頁〕。そして、後述する実験３．において、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターである薬剤、サリチリデンサリチルヒドラジドをプリオン感染哺乳動物細胞の培養液に添加して培養することによりＰｒＰｒｅｓの産生を抑制することが確認され、他のＧＡＢＡＡ受容体に対するアンタゴニストやアゴニストはＰｒＰｒｅｓの産生に影響を及ぼさないことが確認されている。したがって、サリチリデンサリチルヒドラジド及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれた薬剤はプリオン病の予防及び／又は治療薬の有効成分として有用である。
サリチリデンサリチルヒドラジドは以下の式（１）で示されるものである。
【００１９】
【化１】
【００２０】
本実施形態におけるＧａｂｒｂ１調節物質としてのペプチドや蛋白質は、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するオリゴペプチド、ポリペプチドなどのペプチドや蛋白質であれば特に限定されない。ペプチドや蛋白質としては、例えば、Ｇａｂｒｂ１蛋白質に対しての抗体、Ｇａｂｒｂ１に親和性を有しＧａｂｒｂ１の機能を阻害するペプチドや蛋白質などを挙げることができる。抗体は、モノクローナル抗体が好ましく、また、パパインやペプシンなどのプロテアーゼで消化分解させて得られるＦａｂやＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２の半分子型還元体Ｆａｂ’など、フラグメント化した抗体であっても良い。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明によるプリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びに異常プリオン蛋白質発現抑制方法ついて、実施例、比較例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００２２】
［実験１：二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡｉによる検討］
〔１−１．標的配列及び二本鎖ＲＮＡ〕
（実施例１）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、マウスＧａｂｒｂ１（ＮＭ＿００８０６９：配列番号（１））の塩基配列における第８２０番（Ｇ）〜８４４番（Ａ）配列に相当する２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｆ：５′−ＧＣＣＡＧＡＧＵＣＧＣＡＣＵＡＧＧＡＡＵＣＡＣＵＡ：配列番号（３））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｒ：５′−ＵＡＧＵＧＡＵＵＣＣＵＡＧＵＧＣＧＡＣＵＣＵＧＧＣ：配列番号（４））から成る二本鎖ＲＮＡ（Ｇｂ１−ｃ）を用いた。Ｇａｂｒｂ１標的化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｆ、及びＧａｂｒｂ１標的化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ１−ｃ−Ｒは、その標的配列の設計から化学合成、精製までが成され、アニーリングにより二本鎖化されており、Ｇａｂｒｂ１遺伝子の発現抑制が保証された市販品（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。この二本鎖ＲＮＡは、センス鎖がｓｉＲＮＡとして働かないように化学修飾が施されており、ＲＮＡａｓｅを含まない水、ここではＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネイト）処理水に溶解させて使用した。
【００２３】
（比較例１）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒａ５（ＧＡＢＡＡ受容体α５サブユニット）遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−１Ｆ：５′−ＡＡＣＡＵＡＧＡＣＡＡＣＵＵＣＡＧＡＡＵＵＡＧＧＧ：配列番号（５））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−１Ｒ：５′−ＣＣＣＵＡＡＵＵＣＵＧＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＵＧＵＵ：配列番号（６））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は実施例１の場合と同様の市販品（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
【００２４】
（比較例２）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒａ５遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒａ５化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−２Ｆ：５′−ＵＵＡＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＵＵＵＣＡＵＣＵＵＵＣＣ：配列番号（７））とアンチセンスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒａ５化学合成オリゴヌクレオチドＧａ５−ｃ−２Ｒ：５′−ＧＧＡＡＡＧＡＵＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣＧＧＵＵＵＡＡ：配列番号（８））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様とした。
【００２５】
（比較例３）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ２遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−１Ｆ：５′−ＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＵＧＵＣＵＵＡＣＡＡ：配列番号（９））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−１Ｒ：５′−ＵＵＧＵＡＡＧＡＣＡＧＣＣＵＣＵＵＧＵＣＵＣＵＣＣ：配列番号（１０））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２６】
（比較例４）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ２遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒｂ２化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−２Ｆ：５′−ＣＣＧＵＡＵＧＡＵＵＣＧＡＵＵＧＣＡＵＣＣＣＧＡＵ：配列番号（１１））とアンチセンスＲＮＡ鎖（Ｇａｂｒｂ２化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ２−ｃ−２Ｒ：５′−ＡＵＣＧＧＧＡＵＧＣＡＡＵＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＧＧ：配列番号（１２））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２７】
（比較例５）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ３遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−１Ｆ：５′−ＵＣＡＣＣＵＵＣＧＧＧＡＧＡＣＵＣＵＡＣＣＣＡＡＡ：配列番号（１３））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−１Ｒ：５′−ＵＵＵＧＧＧＵＡＧＡＧＵＣＵＣＣＣＧＡＡＧＧＵＧＡ：配列番号（１４））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２８】
（比較例６）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｂ３遺伝子を標的とする２５塩基長センスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−２Ｆ：５′−ＵＧＧＵＵＵＧＣＵＧＣＧＣＵＣＡＧＡＧＣＧＵＡＡＡ：配列番号（１５））とアンチセンスＲＮＡ鎖（化学合成オリゴヌクレオチドＧｂ３−ｃ−２Ｒ：５′−ＵＵＵＡＣＧＣＵＣＵＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＡ：配列番号（１６））から成る二本鎖ＲＮＡを用いた。他の点は比較例１の場合と同様である。
【００２９】
〔１−２．プリオン感染哺乳動物細胞及び二本鎖ＲＮＡの導入、細胞培養系〕
プリオン感染哺乳動物細胞として、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を用い、実験１−１で得た実施例１、比較例１乃至６の各二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入を行った。培養液には１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、細胞培養は、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベータ内に培養フラスコ又はプレートを静置することにより行なった（以降、細胞培養条件共通）。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈して細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に２ｍＬずつ注入し、翌日にリポソーム系トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２．０μＬ／穴（ウェル）、実施例１、比較例１乃至６の各ｓｉＲＮＡを２０ｎＭの濃度となるように添加混合した混合液を各穴に添加、培養することによって細胞に二本鎖ＲＮＡを導入した。なお、二本鎖ＲＮＡを添加することなく、リポソーム系トランスフェクション試薬のみを加えて、実施例、比較例の場合と同様に培養し対照とした。二本鎖ＲＮＡの導入翌日に培地（培養液）を交換し、導入後三日目に培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］を洗浄液として細胞を洗浄した後、洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００３０】
〔１−３．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量（発現量）確認試験〕
実験１−２．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、リシス液［ｌｙｓｉｓ液：０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ ＮＰ−４０（商品名、和光純薬工業（株） オクチルフェニルエーテル）、残部ＰＢＳ］０．５ｍＬを用いて細胞を溶解し、軽く遠心分離して高分子核酸を除いた。
【００３１】
プロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）産生量確認用サンプルの調製は、高分子核酸除去細胞溶解液にトリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（ＰＫ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎ ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＭＳＦ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて蛋白質分解反応を停止させた。蛋白質分解処理した細胞溶解液に核酸分離用シリカとして市販されているＦＯＧ（（商品名）、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を滅菌水（オートクレーブ滅菌蒸留水）で２５０倍希釈したシリカ懸濁液１０μＬを加え遠心分離（２０，０００×ｇ、２０分間）してシリカを沈殿させ上清を除いた。この沈殿全量に対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー２０μＬを加えて懸濁し、９５℃１０分間の熱変性後にイシカワ、ドウウラ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの方法［イシカワ Ｋ．、ドウウラ Ｋ．ら、ジャーナル オブ ジェネラル ヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２００４年、８５巻、１７８５−１７９０頁］に準じて１５％ トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でプロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈））、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製、（２００００倍希釈））、化学発光検出試薬（アマシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名））を使用してプリオン蛋白質の検出を行った。
【００３２】
総プリオン蛋白質（Ｔｏｔａｌ ＰｒＰ）産生量確認用サンプルの調製は、ＰｒＰｒｅｓと同様に高分子核酸を除いた細胞溶解液に５倍濃度のサンプルバッファーを４分の１容加えて９５℃５分間の熱変性後１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法で各蛋白を検出した。細胞培養乃至電気泳動における蛋白質量の指標となる（正常）コントロールとしてのβ−アクチン（Ａｃｔｉｎ）、及びグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）についても、総プリオン蛋白質産生量確認用サンプルの調製と同様に各サンプル調製を行なった後、１０％又は１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法で各蛋白を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈））、β−Ａｃｔｉｎに対するモノクローナル抗体（ｓｉｇｍａ社製）、ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製、（２００００倍希釈））、化学発光検出試薬（アマシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名））を使用して各蛋白質の検出を行った。
【００３３】
〔１−４．Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量確認試験〕
実験１−２．において、実施例１の二本鎖ＲＮＡを導入して得られた回収細胞及び対照回収細胞（各ウェル毎）につき、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの発現量及びＰｒＰ ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。各回収細胞についてＲＮＡ抽出試薬（Ｉｓｏｇｅｎ（商品名）、株式会社ニッポンジーン社製）を使用して総ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ）の抽出を行い、抽出した総ＲＮＡの２μｇを鋳型に、ランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写酵素ＲＴａｓｅを含むｃＤＮＡ合成試薬キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（商品名）、タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、Ｇａｂｒｂ１遺伝子特異的プライマー、又はプリオン（ＰｒＰ）遺伝子特異的プライマーを用い、ＤＮＡポリメラーゼ、検出用色素を含むリアルタイム定量ＰＣＲ用試薬キット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ７３００型、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。Ｇａｂｒｂ１遺伝子特異的プライマーとしては、Ｇａｂｒｂ１プライマｒＧｂ１−１Ｆ：５′−ＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧ：配列番号（１７）、及びＧａｂｒｂ１プライマｒＧｂ１−１Ｒ：５′−ＧＧＣＡＴＧＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴ：配列番号（１８）を用いた。ＰｒＰ遺伝子特異的プライマーとしては、ＰｒＰプライマｒＰｒＰ−１Ｆ：５′−ＡＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＡ：配列番号（１９）、及びＰｒＰプライマｒＰｒＰ−１Ｒ：５′−ＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧ：配列番号（２０）を用いた。内部標準としてβ−アクチンを用いた。β−アクチン遺伝子特異的プライマーとして、ａｃｔｉｎ−Ｆ：５′−ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡ：配列番号（２１）、及びａｃｔｉｎ−Ｒ：５′−ＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＴＴ：配列番号（２２）を用いた。
【００３４】
〔実験１の結果〕
実施例１の二本鎖ＲＮＡをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験１−３．の結果を図１に、また、実験１−４による結果を図２に示した。比較例１乃至６の二本鎖ＲＮＡをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験１−３．の結果を夫々図３乃至５に示した。図１、２から、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ２０ｎＭのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によってＲＮＡｉが誘導され、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ発現量が減少すること、また、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量が増加し、総ＰｒＰ蛋白質産生量も増加するが、ＰｒＰｒｅｓ産生量は顕著に減少することが確認された。一方、図３乃至５から、比較例１、２のＧａｂｒａ５遺伝子（図３）、比較例３、４のＧａｂｒｂ２遺伝子（図４）、比較例５、６のＧａｂｒｂ３遺伝子（図５）を夫々標的とする二本鎖ＲＮＡ２０ｎＭのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によっては、いずれもＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することはなく、ＧＡＢＡＡ受容体α５サブユニット、β２サブユニット、β３サブユニットは、ＰｒＰｒｅｓ産生に関与しないことが確認された。
【００３５】
［実験２：発現ベクターを用いたＲＮＡｉによる検討］
〔２−１．標的配列及び発現ベクター〕
（実施例２）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）系のヒトＨ１プロモーターを有するｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクター（ｐＢＡｓｉ−ｈＨ１（商品名）、タカラバイオ社製）におけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られた（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧｂ１−ｖ−１を用いた。発現ベクターＧｂ１−ｖ−１に挿入する合成ＤＮＡは、マウスＧａｂｒｂ１（ＮＭ＿００８０６９：配列番号（１））の塩基配列における第６６３番（Ｇ）〜６８３番（Ｇ）に一部変異を加えた２１塩基長の標的配列（センスＤＮＡ鎖）、このセンスＤＮＡ鎖に相補的な標的配列（アンチセンスＤＮＡ鎖）、５′末端にライゲーション用のクローニングサイト、センスＤＮＡ鎖とアンチセンスＤＮＡ鎖との間にヘアピンループ配列、３′端にターミネーター配列を配置した（Ｔｏｐ鎖）Ｇｂ１−ｖ−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＴＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２３））と、このＧｂ１−ｖ−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇｂ１−ｖ−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＧ：配列番号（２４））とした。標的配列の設計は、タカラバイオ株式会社Ｗｅｂサイト内にある設計プログラムを利用して、他の遺伝子と重複せず、安定したヘアピンループを形成する配列を選定した。Ｇｂ１−ｖ−１Ｆ、Ｇｂ１−ｖ−１Ｒの化学合成は、シグマ社に製造委託した。得られた合成ＤＮＡ Ｇｂ１−ｖ−１ＦとＧｂ１−ｖ−１Ｒを混合し９５度に加熱してから徐冷してアニーリングさせた後、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにアニーリング済合成ＤＮＡを挿入、ライゲーションし、発現ベクターＧｂ１−ｖ−１を得た。合成ＤＮＡを挿入したプラスミド（発現ベクターＧｂ１−ｖ−１）を大腸菌で増幅後、精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商品名）、Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミド（発現ベクターＧｂ１−ｖ−１）を回収した。
【００３６】
（実施例３）
Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、標的配列（センスＤＮＡ鎖）が異なる他は実施例２の場合と同様にして得た発現ベクターＧｂ１−ｖ−２を用いた。発現ベクターＧｂ１−ｖ−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇｂ１−ｖ−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２５））と、このＧｂ１−ｖ−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇｂ１−ｖ−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧ：配列番号（２６））とした。
【００３７】
（比較例７）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｄ（ＧＡＢＡＡ受容体δサブユニット）遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧａｂｒｄ−１を用いた。この発現ベクターＧａｂｒｄ−１は、実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られる。発現ベクターＧａｂｒｄ−１に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｄ−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２７））と、このＧａｂｒｄ−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｄ−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＧ：配列番号（２８））とした。他の事項は実施例２の場合と同様とした。
【００３８】
（比較例８）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｄ遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する発現ベクターＧａｂｒｄ−２を用いた。実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に挿入され、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡが比較例７と異なる以外は比較例７と同様とした。発現ベクターＧａｂｒｄ−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｄ−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＣＴＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（２９））と、このＧａｂｒｄ−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｄ−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧ：配列番号（３０））とした。
【００３９】
（比較例９）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｇ２（ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット）遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターＧａｂｒｇ２−１を用いた。この発現ベクターＧａｂｒｇ２−１は、実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡを挿入し得られる。発現ベクターＧａｂｒｇ２−１に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｇ２−１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（３１））と、このＧａｂｒｇ２−１Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｇ２−１Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＣＣＡＧＧＴＧ：配列番号（３２））とした。他の事項は実施例２の場合と同様とした。
【００４０】
（比較例１０）
ＧＡＢＡＡ受容体のβ１以外のサブユニットの発現を阻害的に調節する物質として、Ｇａｂｒｇ２遺伝子を標的とし、細胞内に導入されてＲＮＡｉを誘導する発現ベクターＧａｂｒｇ２−２を用いた。実施例２の場合と同様のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドベクターにおけるプロモーター下流に挿入され、ヘアピン型ＲＮＡを発現させる合成ＤＮＡが比較例９と異なる以外は比較例９と同様とした。発現ベクターＧａｂｒｇ２−２に挿入する合成ＤＮＡは、（Ｔｏｐ鎖）Ｇａｂｒｇ２−２Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ：配列番号（３３））と、このＧａｂｒｇ２−２Ｆに相補的な（Ｂｏｔｔｏｍ鎖）Ｇａｂｒｇ２−２Ｒ（５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＧ：配列番号（３４））とした。
【００４１】
〔２−２．プリオン感染哺乳動物細胞及び発現ベクターの導入、細胞培養系〕
プリオン感染哺乳動物細胞として、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を用い、実験２−１．で得た実施例２、３、比較例７乃至１０の各（ｓｉＲＮＡ）発現ベクターの導入を行った。培養液には１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、細胞培養は、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベータ内に培養フラスコ又はプレートを静置することにより行なった（以降、細胞培養条件共通）。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈して細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に２ｍＬずつ注入し、翌日にリポソーム系トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１．５μＬ／穴（ウェル）、実施例２、３、比較例７乃至１０の各発現ベクター（ベクター型ｓｉＲＮＡ）を０．４μｇ／穴となるよう添加混合した混合液を各穴に添加、培養することによって細胞に各発現ベクターを導入した。なお、空のプラスミドベクターを０．４μｇ／穴加えて、実施例、比較例の場合と同様に培養し対照（Ｍｏｃｋ）とした。発現ベクターの導入翌日に培地（培養液）を交換し、導入後三日目に培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］を洗浄液として細胞を洗浄した後、洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００４２】
〔２−３．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量確認試験〕
実験２−２．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−３．の場合と同様にして、異常型プリオン蛋白質産生量、総プリオン蛋白質産生量を確認する試験を行なった。
【００４３】
〔２−４．Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量確認試験〕
実験２−２．において、実施例２、３の発現ベクターを導入して得られた回収細胞及び対照回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−４．の場合と同様にしてＧａｂｒｂ１ ｍＲＮＡの発現量及びＰｒＰ ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００４４】
〔実験２の結果〕
実施例２、３の発現ベクターをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験２−３．の結果を図６に、また、実験２−４による結果を図７に示した。比較例７乃至１０の発現ベクターをＳｃＮ２ａ細胞に導入した場合における実験２−３．の結果を、夫々、図８、９に示した。図６、７に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によってＲＮＡｉが誘導され、Ｇａｂｒｂ１ ｍＲＮＡ発現量が減少すること、また、ＰｒＰ ｍＲＮＡ発現量は大きな変動はなく（２〜３割増加）、総ＰｒＰ蛋白質産生量も殆んど変動を認めないが、ＰｒＰｒｅｓ産生量はＧａｂｒｂ１メッセージ量に応じて減少することが確認された。また、図８、９に示した結果から、比較例７、８のＧａｂｒｄ遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡ、並びに比較例９、１０のＧａｂｒｇ２遺伝子を標的とするベクター型ｓｉＲＮＡのプリオン感染哺乳動物細胞への導入によっては、ＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することはなく、ＧＡＢＡＡ受容体δサブユニット、並びにγ２サブユニットは、ＰｒＰｒｅｓ産生に関与しないことが確認された。
【００４５】
〔実験３：有機化合物を用いた検討〕
〔３−１．ＧＡＢＡＡ受容体関連有機化合物の添加培養試験〕
（実施例４）
Ｇａｂｒｂ１の作用又はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として、Ｇａｂｒｂ１に選択的に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の一つであるサリチリデンサリチルヒドラジド（Ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ：ＳＣＳ、Ｔｏｃｒｉｓ社製）を用いた。また、プリオン感染哺乳動物細胞としては、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞を使用した。１０％牛胎児血清を加えたＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞培養６穴プレート（底面積９．７ｃｍ２）に１ｍＬずつ注入して、薬剤（ＳＣＳ）を０、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１０００ｎＭの各濃度になるように添加した。細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）でコンフルエントに達したＳｃＮ２ａ細胞を１５％に希釈し２ｍＬずつ注入して３日間培養した。培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ７．４］で細胞を洗浄して洗浄液を十分に除いて各ウェル毎に細胞を回収した。
【００４６】
（比較例１１）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアンタゴニストであるピクロトキシン（Ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４７】
（比較例１２）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるイソグバシン塩酸塩（Ｉｓｏｇｕｖａｃｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４８】
（比較例１３）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるムシモール（Ｍｕｓｃｉｍｏｌ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００４９】
（比較例１４）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストである無水エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ（９９．５％）、ナカライテスク社製）を用い、添加濃度を０、０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、３ｐｐｍ、１０ｐｐｍとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５０】
（比較例１５）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるペントバルビタール（Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ、大日本製薬社製、（商品名：ネンブタール））を用い、添加濃度を０、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５１】
（比較例１６）
添加薬剤としてＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ、シグマ社製）を用い、添加濃度を０、５μＭ、５０μＭ、５００μＭ、５０００μＭとした以外は実施例４と同様にして添加培養試験を行なった。
【００５２】
〔３−２．異常型プリオン蛋白質、総プリオン蛋白質産生量確認試験〕
実験３−１．で得た回収細胞（各ウェル毎）につき、実験１−３．の場合と同様にして、異常型プリオン蛋白質産生量、総プリオン蛋白質産生量を確認する試験を行なった。
【００５３】
〔実験３の結果〕
実施例４の薬剤を用いた場合における実験３−２．の結果を図１０に示した。また、比較例１１乃至比較例１６の薬剤を用いた場合における実験３−２．（異常型プリオン蛋白質の産生量）の結果を夫々、図１１乃至図１６に示した。図１０に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の作用又はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質として実施例４の薬剤を用いることにより、ＰｒＰｒｅｓ産生量が減少することが確認された。また、図１１乃至１６に示した結果から、Ｇａｂｒｂ１に選択的に作用するものではないＧＡＢＡＡ受容体のアンタゴニスト、アゴニストである比較例１１乃至１６のような薬剤を用いてもＰｒＰｒｅｓ産生量は減少しないことが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有することを特徴とするプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項２】
前記Ｇａｂｒｂ１調節物質が、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であることを特徴とする請求項１に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターが、サリチリデンサリチルヒドラジド及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項２に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項４】
前記Ｇａｂｒｂ１調節物質が、細胞内に導入されてＲＮＡ干渉を誘導しＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡ発現量を低下させる二本鎖ＲＮＡ又は発現ベクターであることを特徴とする請求項１に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項５】
前記二本鎖ＲＮＡが、配列番号（３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものであることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項６】
前記発現ベクターが、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成ることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項７】
前記発現ベクターが、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成ることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項８】
プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、ＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いることを特徴とする異常プリオン蛋白質発現抑制方法。
【請求項１】
ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）を標的とし、Ｇａｂｒｂ１の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を有効成分として含有することを特徴とするプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項２】
前記Ｇａｂｒｂ１調節物質が、Ｇａｂｒｂ１に結合するＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーター（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であることを特徴とする請求項１に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡＡ受容体アロステリックモジュレーターが、サリチリデンサリチルヒドラジド及びその薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項２に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項４】
前記Ｇａｂｒｂ１調節物質が、細胞内に導入されてＲＮＡ干渉を誘導しＧａｂｒｂ１のｍＲＮＡ発現量を低下させる二本鎖ＲＮＡ又は発現ベクターであることを特徴とする請求項１に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項５】
前記二本鎖ＲＮＡが、配列番号（３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｆと配列番号（４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｃ−Ｒとを用いて二本鎖としたものであることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項６】
前記発現ベクターが、配列番号（２３）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｆと配列番号（２４）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−１Ｒとを含んで成ることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項７】
前記発現ベクターが、配列番号（２５）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｆと配列番号（２６）の塩基配列を有するＧｂ１−ｖ−２Ｒとを含んで成ることを特徴とする請求項４に記載のプリオン病の予防及び／又は治療用薬。
【請求項８】
プリオン感染哺乳動物細胞における異常プリオン蛋白質の発現を抑制する方法であって、ＧＡＢＡＡ 受容体サブユニットβ１（Ｇａｂｒｂ１）の発現又は作用、或はＧａｂｒｂ１を含むＧＡＢＡＡ受容体の作用を阻害的に調節するＧａｂｒｂ１調節物質を用いることを特徴とする異常プリオン蛋白質発現抑制方法。
【図２】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−２０９０４０（Ｐ２０１０−２０９０４０Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５９４６８（Ｐ２００９−５９４６８）
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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