プルーフリーディング・プライマー伸長
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むプライマー伸張反応であって、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、完全には相補しないプライマーを校正し、それによりその配列において変動を有しうる標的核酸の増幅及び検出を可能にする、反応を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明の背景
核酸増幅技術の開発は、遺伝子分析及びエンジニアリングサイエンスに革命を起こした。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば診断、法医学、又は他の適用の一部として標的核酸検出を促進するため、選択されるプライマー核酸を用いて特定の標的核酸を増幅するために頻繁に使用されている。プライマーは、通常、互いに向かって伸長するように設計されている対で機能して、選択される標的領域をカバーする。典型的ＰＣＲサイクルには、高温（例えば、８５℃以上）の変性ステップで二本鎖核酸の鎖が互いに別々になるステップ、低温（例えば、４５〜６５℃）アニーリングステップでプライマーが別々になった一本鎖とハイブリダイズするステップ、及び中温（例えば、７２℃位）伸長ステップで核酸ポリメラーゼが前記プライマーを伸長させるステップを含む。２種類の温度による熱サイクル手順も用いられる。これらは、一般に、高温変性ステップと低温アニール伸長ステップを含む。
【０００２】
ＰＣＲはまた、例えば、１９８７年７月２８日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国特許番号第４，６８３，１９５号、１９８７年７月２８日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国特許番号第４，６８３，２０２号、及び１９９０年１０月２３日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＵＳＩＮＧ Ａ ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ ＥＮＺＹＭＥ」と題された米国特許番号第４，９６５，１８８号を含めた多くの異なる米国特許に記載されている。さらに、ＰＣＲ関連技術もまた、例えば、Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｏｏｋｓ（１９９０）、Ｉｎｎｉｓ ｅｔら（編）、ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ ＰＣＲ、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｉｎｃ．（２００４）、及びＲａｐｌｅｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２００４）などの様々な他の刊行物に記載されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の簡単な概要
本発明はプライマー伸長反応の実施方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）鋳型核酸及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで：
ｉ．前記オリゴヌクレオチドが、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり；
ｉｉ．前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく；
ｉｉｉ．前記オリゴヌクレオチドには３’部分及び５’部分があり、ここで、前記３’部分は、前記修飾ヌクレオチドの３’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記５’部分は、前記修飾ヌクレオチドの５’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり；並びに
ｉｖ．前記オリゴヌクレオチドの３’部分が鋳型核酸に対して１００％の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの３’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され；そして
ｂ．前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる。
【０００４】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの３’部分は、校正前に鋳型核酸に対して７０〜１００％の相補性を持つ。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、生体サンプルからのものである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ウイルス又は細菌ゲノムからのものである。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ＤＮＡである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から５〜７ヌクレオチドの間に存在する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは：
１５〜４０ヌクレオチドの長さであり；
そのオリゴヌクレオチドの全長にわたって鋳型核酸に対して少なくとも７０％の相補性を持ち；及び／又は
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記ポリメラーゼは、熱可逆的共有結合修飾を含んでなるが、ここで、アルカリｐＨの水性緩衝液中、５０℃より高い温度でのインキュベーションが、共有結合修飾を逆戻りさせ、２０分未満で酵素活性の少なくとも二倍の上昇をもたらす。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ステップｂは、ポリメラーゼ連鎖反応を含んでなる。いくつかの実施形態において、ステップｂは、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、蛍光部分を含まない。
【０００９】
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬のうちの１以上を含んでなる反応混合物も提供する。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、オリゴヌクレオチドを含んでなり、前記オリゴヌクレオチドが核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは、蛍光部分を含まない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、鋳型核酸をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、デオキシヌクレオシド三リン酸をさらに含んでなる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１２】
本発明は、本明細書中に記載した試薬のうちの１以上を含んでなるキットをさらに包含する。いくつかの実施形態において、前記キットは、オリゴヌクレオチドを含んでなり、そのオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなるが、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは蛍光部分を含まない。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記キットは、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記キットは、デオキシヌクレオシド三リン酸をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ又は‐ＯＨ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、‐ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１５】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドも提供するが、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは蛍光部分を含まない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ又は‐ＯＨ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１７】
本発明はまた、生体サンプル中の生物学的実体の存在、不存在、又はその量の検出方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち；
ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、前記生物学的実体からの核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ；
ｃ．前記ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し；そして
ｄ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は存在若しくは不存在に相関させる、
を含んでなる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記定量ステップは、定量的リアルタイムＰＣＲを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記生物学的実体は、ウイルス、細菌、又は癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドとウイルス核酸の間に０、１、２、又は３つのミスマッチが存在するか否かに関係なく、オリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下でのステップを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、生物学的実体からの核酸と１つ以上のミスマッチがあり、そしてここで、前記ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記オリゴヌクレオチドを校正してポリヌクレオチド産物をもたらす、すなわち、そのポリヌクレオチド産物に完全な相補性をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記実施ステップは、そのうちの一部が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている１又は複数のポリメラーゼをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記実施ステップは、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているか、又は実質的に欠いているポリメラーゼを含まない。
【００２１】
定義
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」といった語句は、別段のはっきりと指示する文脈がない限り、複数の指示対象物も含む。
【００２２】
用語「核酸」とは、リボース核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマーに対応させることができるモノマーのポリマー、又はその類似体を指す。これには、ＲＮＡ及びＤＮＡのようなヌクレオチドポリマー、並びにその修飾形態、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ（商標））等が含まれる。ある適用において、前記核酸は、複数のモノマータイプを含むポリマー、例えばＲＮＡ及びＤＮＡサブユニットの両者であってもよい。核酸は、例えば、染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、アンプリコン、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ等であっても、又はそれを含んでもよい。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖であってもよい。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した任意の配列に加え、相補配列を任意に含んでなるか又はそれをコード化している。
【００２３】
核酸は、典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、通常、ホスホジエステル結合を含むであろうが、本明細書で概説するように、場合によっては、別の骨格を有する核酸類似体も含まれ、例えば、ホスホラミダイト（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；及びＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１９）、ホスホロチオアート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７及び米国特許番号第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ‐メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｃｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６；及びＣａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７）が含まれるがこれだけに限定されるものではない。
【００２４】
他の類似体核酸には、正電荷骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許番号第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、及び同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２及び３、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ及びＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、並びに米国特許番号第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、及びＣｈａｐｅｒｓ ６及び７、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ及びＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載のものを含む非リボース骨格が含まれる。数種の核酸類似体が、例えば、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５ページにも記載されている。前記リボース‐リン酸骨格のこのような修飾は、標識部分のような付加的部分の付加を促進するため、又は生理的環境におけるこのような分子の安定性と半減期を変えるためにおこなうことができる。
【００２５】
核酸に典型的に見られる天然の複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、核酸類似体にはまた、非天然複素環又は他の修飾ヌクレオチドを持つものが含まれ、それらの多くは本明細書で記載されるか又は別段に引用されている。特に、多くの非天然塩基は、さらに、例えばＳｅｅｌａら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１７９０、Ｇｒｅｉｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１‐９７６、及びＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８２：１６４０に記載されている。
【００２６】
さらに例示すると、融解温度（Ｔｍ）修飾剤として作用するヌクレオチドで使用される特定の塩基もまた任意に含まれる。たとえば、これらの一部には、７‐デアザプリン（例えば、７‐デアザグアニン、７‐デアザアデニン等）、ピラゾロ〔３，４‐ｄ〕ピリミジン、プロピニル‐ｄＮ（例えば、プロピニル‐ｄＵ、プロピニル‐ｄＣ等）等が含まれる。たとえば、１９９９年１１月２３日付けでＳｅｅｌａに対して交付された「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ７‐ＤＥＡＺＡ‐２´‐ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」と題された米国特許番号第５，９９０，３０３号を参照のこと。
【００２７】
他の代表的複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２‐アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、２‐アミノ‐６‐クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８‐アザ誘導体；アデニン、グアニン、２‐アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、２‐アミノ‐６‐クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７‐デアザ‐８‐アザ‐誘導体；６‐アザシトシン；５‐フルオロシトシン；５‐クロロシトシン；５‐ヨードシトシン；５‐ブロモシトシン；５‐メチルシトシン；５‐プロピルシトシン；５‐ブロモビニルウラシル；５‐フルオロウラシル；５‐クロロウラシル；５‐ヨードウラシル；５‐ブロモウラシル；５‐トリフルオロメチルウラシル；５‐メトキシメチルウラシル；５‐エチニルウラシル；５‐プロピオニルウラシル等が含まれる。
【００２８】
修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの他の例はまた、１９９６年１月１６日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ５‐ＰＲＯＰＹＮＹＬ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，４８４，９０８号、１９９７年７月８日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＴＲＩＰＬＥ‐ＨＥＬＩＸ ＡＮＤ ＤＯＵＢＬＥ‐ＨＥＬＩＸ ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，６４５，９８５号、１９９８年１１月３日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，８３０，６５３号、２００３年１０月２８日付けでＫｏｃｈｋｉｎｅらに対して交付された「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許番号第６，６３９，０５９号、２００１年１０月１６日付けでＳｋｏｕｖに対して交付された「ＯＮＥ ＳＴＥＰ ＳＡＭＰＬＥ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＯＭＰＬＥＸ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ」と題された米国特許番号第６，３０３，３１５号、及び２００３年５月１５日付けで公開されたＫｏｃｈｋｉｎｅらによる「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許公報番号第２００３／００９２９０５号にも記載されている。
【００２９】
「オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも６個の核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）、例えば、少なくとも８、１０、１２、又は１５個のモノマー単位を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、通常、そのオリゴヌクレオチドの最終的機能又は用途を含む様々な要因に依存している。典型的には、ヌクレオチド単量体は、そのような対イオンが存在している場合には、関連対イオン、例えばＨ+、ＮＨ4+、Ｎａ+等を含む、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリダート、ホスホルアミダート等を含めたホスホジエステル結合又はその類似体によって連結される。オリゴヌクレオチドは、既存の又は天然の配列の分離、ＤＮＡの複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローンニング及び制限消化、あるいは、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０‐９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９‐１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９‐１８６２のジエチルホスホラミデート法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５‐３１９１のトリエステル法；自動化合成方法；又は１９８４年７月３日付けでＣａｒｕｔｈｅｒｓらに対して交付された「ポリヌクレオチドの調製過程」と題された米国特許番号第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接的な化学合成、あるいは当業者に知られているその他の方法を含めたいずれかの好適な方法によって随意に調製されるが、これだけに限定されるものではない。
【００３０】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱（例えば、９０〜９５℃）に対して安定であり、熱耐性があり、そして二本鎖核酸の変性を達成するのに必要な、時間の温度上昇に晒された場合、続くプライマー伸長反応を達成するのに十分な活性を残し、且つ、不可逆的変性（不活性）状態にならない酵素を指す。核酸変性のために必要な加熱条件は、前記技術分野で周知であり、例えば、米国特許番号第４，５８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、及び同第４，９８５，１８８号に例示されている。本明細書で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）等の温度連鎖反応における使用に好適である。本明細書の目的のための「不可逆的変性」は、酵素活性の恒久的、且つ、完全な喪失を指す。熱安定性ポリメラーゼについて、酵素活性は、鋳型核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成させるのに適切な様式でのヌクレオチドの組み合わせの触媒を指す。好熱細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ａｑｕａｔｉｏｎｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス属ｓｐｓ１７、サーマス属Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３１】
「３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、核酸のほとんどの３’塩基を取り除くいくつかのポリメラーゼの活性を指す。この活性は、前記技術分野ではポリメラーゼの「プルーフリーディング」活性と呼ばれることもある。３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、ヌクレオチドの３’オリゴヌクレオチドのうちの１以上を、すなわち、連続した様式で取り除くことができる。そのヌクレオチドは、続いて、鋳型依存様式でヌクレオチドによって置き換えられ、その結果、オリゴヌクレオチドのそのヌクレオチドを「校正する」、すなわち、鋳型核酸に対して相補性を持たないヌクレオチドを鋳型に対して相補性を持つヌクレオチドで置き換える。
【００３２】
「３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている」は、天然サーモトガ・マリチマＤＮＡポリメラーゼの活性の３％以下（例えば、１％又は０．１％未満）である３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を指す。３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている代表的なポリメラーゼとしては、例えば、米国特許番号第７，１４８，０４９号に記載されているものが挙げられる。
【００３３】
「修飾ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムＤＮＡにおいて天然に起こらないヌクレオチド（例えば、合成ヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を指す。本明細書中でより詳細に記載されるとおり、ヌクレオチドのペントース糖部分の２’位に置換がある塩基は、ＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドをもたらす。「核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの３’末端又は３’末端から二番目の位置においても、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で取り除かれない修飾ヌクレオチドを指す。
【００３４】
修飾ヌクレオチドの「２’部分」は、核酸技術分野において一般的に使用される、ヌクレオチドの糖部分の２’炭素に連結された部分を指す。例えば、米国特許広報番号第２００６／００８８８５５５号及び同第２００７／０２１９３６１号を参照のこと。
【００３５】
少なくとも核酸セグメント（すなわち、少なくとも２つの隣接塩基）が逆平行会合によって結合して、又は他の核酸の少なくとも部分配列にハイブリダイズして二本鎖を形成するとき、核酸が別の核酸との関連で「相補性を持つ」。逆平行会合は、例えば、核酸内のヘアピンループの形態で分子内に、又は２つ以上の一本鎖核酸が互いにハイブリダイズするときなどで分子間に存在し得る。本発明との関連において、特定の配列（例えば、鋳型核酸）に対して「１００％の相補性を持つ」オリゴヌクレオチドに関して、そのオリゴヌクレオチドのそれぞれの塩基は、逆平行様式において特定の配列の対応する塩基に対して相補性を持つ。
【００３６】
天然の核酸中で一般的に見られない特定の塩基が、本発明の核酸に含んでもよいので、例えば、イノシン、７‐デアザグアニン、及び先に議論したものを含むことができる。いくつかの実施形態において、相補性は完全でない、すなわち、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうちの特定のパーセンテージだけが鋳型に対して相補性を持つことを示す「パーセント相補性」を持つ一方で、残りのヌクレオチドが相補性を持たない場合には、核酸は「実質的に相補性を持つ」。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の実質的に相補性を持つオリゴヌクレオチド（又はそれらの３’部分）は、鋳型核酸に対して１００％未満の相補性を持つ、例えば、鋳型に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の相補性を持つ。
【００３７】
例えば、いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド（又は、少なくとも前記オリゴヌクレオチドの３’部分）は、１、２、３、４、５、６つ、又はそれ以上の鋳型核酸とのミスマッチを持っている。鋳型核酸がオリゴヌクレオチド（又は指示された、その一部）より長い典型的な例において、ミスマッチ（又は相補性を持つヌクレオチド）のパーセンテージ又は数は、オリゴヌクレオチド（又は指示されたその一部）に対して相補性を持つヌクレオチドのうちで最も高い割合を持つ、オリゴヌクレオチド（又は指示されたその一部）と同じ長さの鋳型核酸の部分配列に関して測定される。
「プライマー伸長反応」は、核酸ポリメラーゼがプライマーの３’末端に鋳型特異的様式で１又は複数のヌクレオチドを付加する分子反応を指す。伸長は、プライマーの３’末端への最初のヌクレオチドの付加を指すだけではなく、伸長されたプライマーによって形成されるポリヌクレオチドのさらなるあらゆる伸長もまた含む。
【００３８】
酵素の「熱可逆的な共有結合修飾」は、本明細書中で使用される場合、酵素が最初は室温にて実質的に不活性であるが、より高い温度（例えば、５０℃超）にて化学（例えば、共有結合）修飾が除去されるような酵素の可逆的な化学修飾を指す。熱可逆的な共有結合不活性化の例としては、例えば、酸無水物を用いた反応によって達成される、リジン残基の化学修飾が挙げられる（ＥＰ ０ ９６２ ５２６を参照のこと）。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「生体サンプル」は、（例えば細菌、ウイルス、組織生検などに由来する）核酸を含む又は含むと推定される任意の物質を指す。前記サンプルは、当業者に知られているいずれかの手段によって得られる。かかるサンプルは、１体の個体又は複数の個体から単離された、組織量若しくは液体量、又はその精製画分量であり得、例えば、皮膚、血漿、血清、全血、髄液、唾液、腹水、リンパ液、房水又は硝子体液、滑液、尿、涙、血球、血液生成物、精液、精漿、膣液、肺の滲出液、漿膜液、器官、気管支肺胞洗浄液、腫瘍、パラフィン包埋組織などが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。サンプルとしてはまた、これだけに限定されるものではないが、細胞培養培地中での細胞培養から生じる条件培地、組み換え細胞、細胞成分等を含む、インビトロ細胞培養の構成要素及び成分が挙げられる。核酸は、当技術分野で周知の手順によって生体サンプルから得られる。
【００４０】
本発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、プライマー伸長反応により標的（すなわち、鋳型）核酸の検出を可能にするが、ここで、前記反応の１又は複数のプライマーは、増幅され、そして検出されるべき標的核酸に対して完全に相補性を持つか、又は完全に相補性を持つというわけではない。本願発明は、例えば、関連配列の多様性が標的配列にあるかもしれない様々な標的の増幅及び検出のためのプライマーの設計において有用である。例として、本発明はウイルス病原体を検出するのに使用でき、ここで、前記ウイルス病原体には、潜在的ウイルスゲノムの大部分若しくはすべてを増幅する単一の又は少数のセットのプライマーを設計するのを困難又は不可能にするのに十分なほどそのゲノムに変動がある。標的又は鋳型核酸はまた、他の起源、例えば、細菌ゲノムに由来することもある。
【００４１】
本発明は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性と呼ばれることもある）を有する熱安定性ポリメラーゼが、増幅に使用される１又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーが標的にとって完全な相補性を持つわけではないいくらかの変動があり得る標的配列、例えば、鋳型を増幅するのに使用される定量的な増幅反応を提供する。ＰＣＲの条件は、プライマーが標的に対して特異性を維持するが、それでもなお、（単数若しくは複数の）プライマーと鋳型の間の相補性の多少の変動（例えば、１、２、３個のミスマッチ）を許容するように設定され得る。これらの条件下のポリメラーゼは、得られた増幅産物が標的配列に対して完全な相補性を持つようにオリゴヌクレオチドを校正するだろう。もちろん、プライマーはまた、（例えば、クローニング、配列タグ付与、標識などのための）相補性を持たないプライマーの５’末端に１又は複数のヌクレオチドを含有することもできることは理解され、そして「完全な相補性を持つ」によって、得られた反応産物はプライマーと鋳型の間に存在するあらゆる内部又は３’ミスマッチを含まないが、それでも、その機能が標的とのハイブリダイゼーション以外である５’非相補性ヌクレオチドを含み得ることが意味されていることも理解される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲ産物は、単純なプライマー伸長反応（すなわち、プライマーが１又は２つのヌクレオチドだけで伸長される反応）だけではない。例えば、いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲ産物は、産物内に組み込まれもするオリゴヌクレオチド配列自体をカウントに入れずに、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記反応は２以上ポリメラーゼを含む。場合により、少なくとも１つのポリメラーゼは、実質的に３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。そのような場合、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているポリメラーゼと比較した３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼの量の比は変化することがある。例えば、いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼの量は、活性を実質的に欠いているポリメラーゼの量より少ない、すなわち、いくつかの実施形態において、その比は、１：２より少ない、１：３、１：４、又は１：１０（活性を持っている／活性を実質的に欠いている）。あるいは、いくつかの実施形態において、前記反応におけるポリメラーゼの量は実質的に等しく、そしていくつかの実施形態において、活性を実質的に欠いているものに比べてエキソヌクレアーゼ活性を持っているより多くのポリメラーゼが存在する。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸の量は、例えば、定量的な増幅を使用することによって定量される。所望された情報が、その配列が示されていない病原菌、微生物、癌細胞などの存在又は不存在を示す可能性のある可変鋳型の存在と量である場合、任意に、前記定量が、オリゴヌクレオチドプライマーと鋳型の間のミスマッチの存在又は不存在に関係なく実施される。一旦測定されれば、鋳型の存在又は量を、鋳型の起源である生物学的実体、すなわち、ウイルス、微生物、癌細胞などの存在又は量に相関させることができる。
【００４５】
本発明はまた、プライマー伸長反応においてプライマーとしての役割を果たすオリゴヌクレオチドを提供する。３’‐５’活性によるプライマーの分解のために起こり得る特異性の欠如をもたらすため、通常、プライマー伸長反応は３’‐５エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用を伴わないが、本発明は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１の酵素、例えば、ポリメラーゼの包含をおこなう。しかしながら、プライマーの分解を防ぐために、いくつかの実施形態において、本発明は、プライマー・オリゴヌクレオチドの中央への修飾ヌクレオチドの包含をおこなう。修飾ヌクレオチドは３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれることができないので、プライマーの３’部分だけが３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって校正され得る。これが、プライマーの５’非分解部分との多少の特異性の維持を可能にし、そのため、プライマーと潜在的可変鋳型の３’部分の間に起こるかもしれない最初のミスマッチにもかかわらず、プライマーのハイブリダイゼーションと伸長を可能にする。
【００４６】
ＩＩ．修飾ヌクレオチド
本発明は、（鋳型へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションがその鋳型と修飾ヌクレオチドのミスマッチをもたらす）鋳型の存在下、修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に存在するときに、塩基が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドの実質的な分解を妨げるのであれば、あらゆるタイプの修飾ヌクレオチドの使用をおこなう。
【００４７】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドには、修飾された２’位がある（すなわち、ここで、２’位は‐Ｈ（ＤＮＡ）ではない）。前記修飾ヌクレオチドは、以下の：２’アミノ、２’Ｏ‐メチル、２’ＯＨ（リボ）、２’Ｏ‐ホスファート、及び２’ホスホロチオアートを包含するが、これだけに限定されるものではない。
【００４８】
ＩＩＩ．本発明のオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応における使用のために便利なあらゆる長さのものであることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも８ヌクレオチドの長さであり、そしてオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端に存在することのない修飾ヌクレオチドを任意に含んでなる。修飾ヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、３’及び５’部分に関して説明されることができ、ここで、前記３’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの３’側のヌクレオチドを指し、そして前記５’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの５’側のヌクレオチドを指す。本明細書中に記載したような修飾ヌクレオチドは別として、オリゴヌクレオチド内の残りのヌクレオチドとしては、天然若しくは合成ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）、又はその組み合わせが挙げられる。しかしながら、一般に、ヌクレオチドの３’部分は、ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除くことができないヌクレオチドを含まないであろう。
【００４９】
オリゴヌクレオチドの５’部分は、配列のいずれかである。例えば、オリゴヌクレオチドの５’部分は、プライマー伸長反応において標的（鋳型）核酸に（単独で、又は３’部分のいくつか又はすべてと組み合わせて）ハイブリダイズするように設計されることができる。いくつかの実施形態において、標的核酸に多少の変動がある場合（例えば、ウイルス又は細菌ゲノム）、５’部分は、少なくとも部分的に保存されている標的配列の領域にハイブリダイズするように設計されることができる。このことは、例えば、標的に対して相当数の相補性ヌクレオチドを持つように、例えば、標的核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の相補性を持つように５’部分を設計することによって達成できる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの５’部分の長さ（すなわち、ヌクレオチドの数）は、プライマー伸長のために便利なあらゆる長さであることができる。いくつかの実施形態において、５’部分は、少なくとも３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、又はそれ以上である。例えば、いくつかの実施形態において、５’部分には、６〜５０ヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜２０、８〜２０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、１５〜４０、２０〜４０ヌクレオチドの長さがある。
【００５１】
オリゴヌクレオチドの３’部分もまた、プライマー伸長反応に有用なあらゆる長さのものであることができる。３’部分はポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって校正される可能性があるので、いくつかの実施形態において、３’部分は、５’部分に比べてプライマー伸長反応の特異性を制御するのに小さな役割しか果たさない。よって、いくつかの実施形態において、３’部分の長さは、５’部分よりさらに短いであろう。よって、例えば、いくつかの実施形態において、３’部分には、１〜１５ヌクレオチドの長さ、例えば、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜８、２〜５、３〜１０、３〜８ヌクレオチドの長さがある。いくつかの実施形態において、３’部分には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さがある。
【００５２】
任意に、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識され得るか、又は共有結合若しくは他の方法で連結されたその他の残基を持つ。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識物を包含しない。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識を包含しない。本発明のオリゴヌクレオチドが標識されているいずれかの実施形態において、あらゆる標識物が使用され得る。所望であれば、オリゴヌクレオチドには、例えば、分光分析、光化学、生化学、免疫化学、化学、又は他の技術によって検出可能な標識を組み込むことができる。例示すると、有用な標識物としては、放射性同位元素、蛍光色素、電子稠密薬、（ＥＬＩＳＡｓで一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、又は抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質が挙げられる。これらの多くと他の標識物が、さらに本明細書中に記載されており、及び／又は別の形で前記技術分野で知られている。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、標識物は蛍光色素又はフルオロフォアである。通常、ある特定のフルオロフォアは、より短い波長の光を吸収した後に、特定の波長の光を出すことができる。特定のフルオロフォアが出す光の波長は、そのフルオロフォアに特徴的である。よって、特定のフルオロフォアは、より短い波長の光を用いたそのフルオロフォアの励起後に適切な波長の光を検出することによって検出できる。蛍光標識としては、負に帯電した色素、例えば、フルオレセイン・ファミリーの色素など、又は電荷が中性の色素、例えば、カルボキシローダミン・ファミリーの色素など、又は正に帯電した色素、例えば、シアニン・ファミリーの色素やローダミン・ファミリーの色素などを挙げることができる。本発明で利用可能な他のファミリーの色素としては、例えば、ポリハロフルオレセイン‐ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン‐ファミリーの色素、クマリン‐ファミリーの色素、オキサジン‐ファミリーの色素、チアジン‐ファミリーの色素、スクアレン‐ファミリーの色素、キレート化ランタニド‐ファミリーの色素、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素、及びＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素などが挙げられる。フルオレセイン・ファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、及びＺＯＥなどが挙げられる。カルボキシローダミン・ファミリーの色素としては、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡなどが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されているのに対し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）から市販されている。シアニン・ファミリーの色素としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７などが挙げられ、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されている。
【００５４】
ＩＶ．３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するあらゆるポリメラーゼが、本明細書中に記載したように使用できる。（熱安定性ポリメラーゼを含めた）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する代表的なポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリチマ（Ｔｍａ［Ｔｍａ Ｄ３２３Ａ Ｅ３２５Ａを含むが、これだけに限定されるものではない］、ＵｌＴｍａ、Ｔｍａ２５など［例えば、米国特許番号第６，２２８，６２８号を参照のこと］）、Ｔｍａ／Ｚ０５キメラ（例えば、Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと）、ピロディクティウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（Ｐｏｃ）［形態１と２］及びピロディクティウム・アビッシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐａｂ）［形態１と２］を含めたピロディクティウム属、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）（Ｔａｆ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５５】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を含む他のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばエッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ‐ＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ、通称Ｖｅｎｔ ＆ Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）；パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）；パイロコッカス属ＫＯＤ１株；サーモコッカス属ＴＹ；サーモコッカス属９°Ｎ‐７；メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）；バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）（Ｂｃａ）；スルフォロバス・アシドカルダニウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）；サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）；メタノバクテリウム・サーモオートトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）；サーモコッカス・グルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（ＲＡＳ Ｔｇｏ）が挙げられる。
【００５６】
追加的な市販の３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとしては：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（例えば、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）含有Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びパイロコッカス属ＧＢ‐Ｄポリメラーゼ由来の３’‐５’エキソヌクレアーゼ含有ＤＮＡポリメラーゼ；古細菌サーモコッカス・ジリジイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ）由来のＰｆｘ５０（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス属ＫＯＤ株由来のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｑｉａｇｅｎ（例えば、ＨｏｔＳｔａｒ（商標）とＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ（商標））、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＥＸＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＡｒｃｈａｅＭａｘｘ（登録商標）ポリメラーゼ増強因子）によって販売されているものが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。また、米国特許番号第５，７４７，２９８号も参照のこと。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼには、そのポリメラーゼが改善された活性を持つような天然ポリメラーゼの修飾形態を含む。例えば、いくつかの実施形態において、前記ポリメラーゼは、蛍光標識されたヌクレオチドが、最も密接に関連した天然ポリメラーゼと比較して無標識ヌクレオチドと比べて減弱された差別しか受けずに取り込まれるように修飾される。例えば、米国特許広報番号第２００３／０１５２９８８号に記載の「４位」におけるアミノ酸の修飾が、差別を減弱するのに使用される。他の有効な突然変異は、例えば、米国特許番号第７，１４８，０４９号に記載されている。
【００５８】
Ｖ．可逆的化学修飾
いくつかの実施形態において、本発明に使用するポリメラーゼには、ポリメラーゼがＤＮＡを変性するのに十分な温度まで、例えば、少なくとも６０℃、そして一般に約８０〜９５℃まで加熱されるまでそのポリメラーゼが実質的に減弱された活性を有するような可逆的修飾が含まれる。そのような修飾は、例えば、常温における核酸基質の非特異的伸長又は分解を予防するのに有用である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、酵素の活性は、酵素と阻害試薬の間の反応によって可逆的に防がれ、それが酵素の活性のすべて、又はほとんどすべて（例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％）の損失をもたらす。前記阻害試薬は、阻害が高温で可逆的であるように選ばれる。いくつかの実施形態において、前記阻害試薬は、上述の熱安定酵素のうちの１つを阻害することができる抗体である。任意に、抗体を使用する代わりに、前記酵素は、そのポリメラーゼの可逆的化学修飾をもたらす別の阻害試薬によって阻害できる。本発明に記載されているとおり、熱安定酵素の可逆的不活性化は、リジン残基の化学修飾によっておこなうことができる。例えば、リジンの化学修飾は、酸無水物によって実施できる（例えば、ＥＰ ０ ９６２ ５２６、米国特許番号第５，７７３，２５８号を参照のこと）。しかしながら、他のアミノ酸残基の化学修飾は、好適な特徴を有する修飾タンパク質をもたらすことができる。可逆的な様式でアミノ基と反応する多くの化合物が、文献に記載された。
【００６０】
例えば、アミノ基は、トリフルオロアセチル化（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ及びＡｎｆｉｎｓｅｎ、１９６２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：４１０を参照のこと）、アミジノ化（Ｈｕｎｔｅｒ及びＬｕｄｗｉｇ、１９６２、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８４：３４９１を参照のこと）、マレイル化（Ｂｕｔｌｅｒら、１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０３：７８を参照のこと）、アセトアセチル化（Ｍａｒｚｏｔｔｏら、１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６：５１７及びＭａｒｚｏｔｔｏら、１９６８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５４：４５０を参照のこと）、テトラフルオロスクシニル化（Ｂｒａｕｎｉｔｚｅｒら、１９６８、Ｈｏｐｐｅ‐Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４９：２６５を参照のこと）、及びシトラコニル化（Ｄｉｘｏｎ及びＰｅｒｈａｍ、１９６８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２‐３１４；並びにＨａｂｅｅｂ及びＡｔａｓｓｉ、１９７０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９（２５）：４９３９‐４９４４を参照のこと）により可逆的に修飾された。
【００６１】
リジン残基のε‐アミノ基の化学修飾のための代表的な試薬は、ジカルボン酸無水物である。米国特許番号第５，７７３，２５８号；米国特許広報番号第２００４／０１１５６３９号を参照のこと。そのため、いくつかの実施形態において、可逆的修飾ポリメラーゼは、酵素と修飾試薬の混合物の反応によって作製される。ここで上述の反応は、約２５℃未満の温度にてアルカリ性ｐＨでおこなわれ、ここで、上述の試薬は、以下の一般式：
【００６２】
【化１】
【００６３】
｛式中、Ｒ1及びＲ2は、水素又は有機基であり、それらは連結されていてもよい。｝又は以下の一般式：
【００６４】
【化２】
【００６５】
｛式中、Ｒ1及びＲ2は、有機基であって、それらは連結されていてもよく、そして水素は、シス配置である。｝
によって表されるジカルボン酸無水物であり、そしてここで、上述の反応は、酵素活性の事実上完全な不活性化をもたらす。
【００６６】
前記有機基は、炭素‐炭素結合によって、又は炭素‐ヘテロ原子結合、例えば炭素‐酸素、炭素‐窒素、若しくは炭素‐硫黄結合を通して、環に直接取り付けられてもよい。前記有機基は、例えば３，４，５，６‐テトラヒドロフタル酸無水物のように互いに連結して環構造を形成してもよい。
【００６７】
典型的な試薬の例としては、無水マレイン酸；置換された無水マレイン酸、例えばシトラコン酸無水物、シス‐アコニット酸無水物、及び２，３‐ジメチルマレイン酸無水物；エキソ‐シス‐３，６‐エンドオキソ‐Δ4‐テトラヒドロフタル酸無水物；並びに３，４，５，６‐テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられる。これらの試薬は、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、又はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．（Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）から市販されている。
【００６８】
Ｖ．鋳型核酸
標的核酸は、生体又は合成起源に由来することができる。標的は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。一般に、アンプリコンが作り出される場合には、アンプリコンはＤＮＡで構成されるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドもまた増幅産物に組み込まれ得る。当業者がＲＮＡを検出することを望む場合には、増幅工程は、通常、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を含めた逆転写の使用を伴うであろう。
【００６９】
具体的な標的配列としては、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボＢ１９ウイルス、エプスタイン‐バール・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス、及びクンジンウイルス）、細菌の核酸（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ミコバクテリア、真菌核酸、又は動物若しくは植物からの核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記標的核酸は、動物（例えば、ヒト）核酸であるか、又は動物（例えば、ヒト）のサンプル（すなわち、ウイルス又は他の病原菌核酸は、動物生検検体、血液サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、唾液などからのサンプル中に存在している可能性がある）に由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、例えば、疾患（例えば、癌、糖尿病など）に関連する変異を含む可能性があるヒト遺伝領域である。
【００７０】
ＶＩ．プライマー伸長反応
プライマー伸長反応条件は、一般に、オリゴヌクレオチドと標的の間にいくつかのミスマッチがあっても、全体でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするように設計されている。当業者は、プライマーとプローブの融解温度を決定でき、そして増幅温度がオリゴヌクレオチド・アニーリングのために十分低い温度、なおかつ、所望の量のプライマー特異性を達成するのに十分高い温度を許容するように制御できることを理解するであろう。
【００７１】
プライマー伸長に好適な条件は前記技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲を参照のこと。また、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）も参照のこと。一般に、プライマーを、標的核酸にアニールさせて、すなわち、ハイブリダイズさせて、プライマー‐鋳型複合体を形成させる。プライマー‐鋳型複合体を、好適な環境中、ＤＮＡポリメラーゼ及び遊離ヌクレオチドと接触させて、プライマーの３’末端への１又は複数のヌクレオチドの付加を可能にし、その結果、標的核酸に対して相補性を持つ伸長プライマーを生じさせる。本明細書中で議論したとおり、プライマーの伸長前に、オリゴヌクレオチドの３’部分の１又は複数のヌクレオチドが、ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって切り取られる。
【００７２】
プライマーは、例えば、１又は複数のヌクレオチド類似体を包含することができる。加えて、遊離ヌクレオチドは、通常のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識ヌクレオチド）、又はその混合物である。いくつかの変形形態において、プライマー伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対を使用した核酸増幅に好適な条件はまた、前記技術分野でも知られている（例えば、ＰＣＲ増幅法）。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲；Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲；ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９を参照のこと。その他の排他的ではない実施形態において、プライマー伸長反応はＲＮＡ鋳型の逆転写を含んでなる（例えば、ＲＴ‐ＰＣＲ）。例えば、改良された伸長速度、又はその他の形で改善されたプライマー伸長反応、例えば比較的短いインキュベーション時間でそういったポリメラーゼ伸長反応を実施する能力を可能にする、本突然変異ポリメラーゼの使用は、酵素濃度を下げ、及び／又は産物収量を増やす。
【００７３】
いくつかの実施形態において、側面に位置するが、標的ＳＮＰ位置に直接ハイブリダイズしないプライマーが、標的ＳＮＰ位置に隣接する（すなわち、標的ＳＮＰ部位から１、２、３つ、又はそれ以上のヌクレオチドの範囲内の）領域にプライマーがハイブリダイズするプライマー伸長反応に使用される。プライマー伸長反応中、特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が標的ＳＮＰ部位に存在していた場合に、プライマーは、通常、標的ＳＮＰ部位を通過して伸長することができないので、ＳＮＰ対立遺伝子が標的ＳＮＰ部位に存在していることを判断するためにプライマー伸長産物が検出され得る。例えば、特定のｄｄＮＴＰｓは、ｄｄＮＴＰが伸長産物に組み込まれた時点でプライマー伸長を終わらせるためにプライマー伸長反応に使用できる（例えば、プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物の３’最末端にｄｄＮＴＰを含有し、そしてそこでは、そのｄｄＮＴＰが検出されるべきＳＮＰのヌクレオチドである）。
【００７４】
特定の実施形態において、ＰＣＲ反応は、熱安定性酵素を用いる自動プロセスとして実施される。このプロセスにおいて、反応混合物は、変性ステップ、プローブ（及び任意に、プライマー）アニーリングステップ、そして開裂と置換がプライマー依存性鋳型伸長と同時に起こる合成ステップを通してサイクルさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、システムを用いて実施される。任意に、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から市販されているもののようなサーマルサイクラーは熱安定性酵素を用いた使用のために設計されており、これらを利用することもできる。
【００７５】
標的核酸へのプライマー又はプローブのハイブリダイゼーションは、適切なハイブリダイゼーション条件を選択することによって達成できる。オリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドの安定性は、通常、プライマー／プローブと標的核酸との間でのみ安定で検出可能なハイブリッドが形成されるような、アッセイ及び洗浄条件が適合するように選択される。１又は複数の異なるアッセイパラメータの操作により、特定のハイブリダイゼーションアッセイの正確な感度と特異性が決定される。
【００７６】
より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ，ＰＮＡ、又はＤＮＡ，ＲＮＡ及びＰＮＡの組み合わせの相補性塩基間でのハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度、緩衝液組成等において変動する広範囲の様々な条件下で起こる。これらの条件とそれらを適用するための方法の例は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｖｏｌ．２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ、前掲に記載されている。ハイブリダイゼーションは、一般に、約０℃〜約７０℃の間で、約１分〜約１時間の期間で起こり、ハイブリダイズさせる配列の性質とその長さに依存している。しかし、ハイブリダイゼーションが秒又は時間の単位で、反応条件に応じて起こり得ることは認識されている。例示すると、２種類の２０ｍｅｒの混合物についての典型的なハイブリダイゼーション条件は、その混合物を６８℃に置き、続いて室温（２２℃）まで５分間冷却し、又は２マイクロリットルで非常に低い温度、例えば２℃などで冷却する。核酸間のハイブリダイゼーションは、例えばＴｒｉｓ‐ＥＤＴＡ（ＴＥ）、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ及びＨＥＰＥＳなどの緩衝液、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ、ＣａＣｌ2）、又は他の水溶液、試薬及び化学物質を用いて促進することもできる。これらの試薬の例としては、例えば、Ｒｅｃ Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｅ．コリ一本鎖結合タンパク質及び主要な又はマイナーな核酸溝結合タンパク質などの一本鎖結合タンパク質が挙げられる。このような試薬及び化学物質の他の例としては、二価イオン、多価イオン及び、例えば、エチジウムブロマイド、アクチノマイシンＤ、ソラレン、及びアンゲリシンなどの相互作用物質が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＰＣＲを含めた）プライマー伸長反応は、「リアルタイム」で観察され、そしてそれは任意に定量的である。例えば、Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００４），Ｉｎｎｉｓら（編）を参照のこと。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許番号第６，１８０，３４９号；同第６，０３３，８５４号；及び同第５，９７２，６０２号、並びに、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６（１９９６）９９５‐１００１；ＤｅＧｒａｖｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４（２００３）１０６‐１０，１１２‐５；Ｄｅｉｍａｎ Ｂ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２）：１６３‐７９（２００２）に開示されている。
【００７８】
試料中の特定のＲＮＡの量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドのランオフ転写から標準曲線を作成することもできる。標準曲線は、アッセイにおいて用いられる初期ｃＤＮＡ濃度に関連する、リアルタイムＰＣＲで測定された閾値（Ｃｔ）値を用いて作成することもできる。加えて、標準曲線は、標準ポリヌクレオチド（例えば、前もって定量された配列）に関して作成することもできる。このことは、比較目的のための標準の量に対する生体サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化を可能にする。例えば、Ｔｈｅ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（Ｊ．Ｌａｒｒｉｃｋ（編）１９９７）を参照のこと。
【００７９】
プライマー伸長（増幅を含む）産物の検出のためのあらゆる方法が使用できる。いくつかの実施形態において、反応産物に特異的に結合した（すなわち、ハイブリダイズした）標識核酸プローブが、産物の蓄積を検出するのに使用される。増幅産物の検出のための１つの方法が、（例えば、ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ４８ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いた）５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイである。例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６‐７２８０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３７６１‐３７６６（１９９３）；米国特許番号第６，２１４，９７９号；同第５，８０４，３７５号；同第５，４８７，９７２号；及び同第５，２１０，０１５号を参照のこと。このアッセイは、増幅反応中の二重標識蛍光発生プローブのハイブリダイゼーション、そして開裂によって特定のＰＣＲ産物の蓄積を検出する。蛍光発生プローブは、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素の両方で標識された（例えば、所望の標的核酸又はその相補体にハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドからなり得る。ＰＣＲ中に、このプローブは、それが増幅されているセグメントにハイブリダイズした場合に、ＤＮＡポリメラーゼの５’‐ヌクレアーゼ活性によって開裂され、開裂されるのはその場合のみである。プローブの開裂によって、レポーター色素の蛍光強度の増加が生じる。
【００８０】
エネルギー移動の使用に依存する増幅産物を検出する別の方法は、Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３‐３０９（１９９６））によって記載された「分子ビーコンプローブ」法であり、これはまた、米国特許番号第５，１１９，８０１号及び同第５，３１２，７２８号の対象でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用する。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端（５’又は３’ 末端のいずれか）には、供与体フルオロフォアがあり、もう一方の末端には、受容体部分がある。Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒの方法の場合、この受容体部分はクエンチャーである、つまり、供与体によって放出されたエネルギーを受容体が吸収するが、このとき、それ自身は蛍光を発しない。よって、ビーコンがヘアピン（閉じた）構造にある場合には供与体フルオロフォアの蛍光がクエンチされるが、ビーコンが開いた構造にある場合、供与体フルオロフォアの蛍光は検出可能である。ＰＣＲで使用される場合、ハイブリダイズしないままのものは蛍光を発しないが、ＰＣＲ産物の鎖の一つにハイブリダイズした分子ビーコンプローブは、「開いた構造」であり、蛍光が検出される（Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３‐３０６（１９９６）。その結果、ＰＣＲ産物の量が増加すると蛍光の量が増加し、そのため、ＰＣＲの進行の尺度として用いられ得る。
【００８１】
リアルタイムＰＣＲ法に有用な他のタイプのプローブとしては、Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｃ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）製の「単標識」及び「二重標識」形式で利用可能なＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブが挙げられる。また、Ｂａｔｅｓら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２（５）：２７５‐２８０（２００１）も参照のこと。当業者は、他の定量的増幅の方法もまた利用可能であることを認識しているであろう。
【００８２】
ＶＩＩ．反応混合物
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬の反応混合物を提供する。反応混合物は、例えば、ポリメラーゼ３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなることができる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明の反応混合物に任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。
【００８３】
任意に、反応混合物はまた、生体サンプル（例えば、生物体からの核酸）も含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、鋳型核酸を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの３’部分は、鋳型核酸に対して７０〜１００％の相補性を持つか、そうでなければ、本明細書中に記載した鋳型に対して相補性を持つ。
【００８４】
ＶＩＩＩ．キット
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬のうちの１つ又は複数を含んでなるキットも提供する。いくつかの実施形態において、前記キットは、例えば、ポリメラーゼ３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明のキットに任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。本発明のキットは、任意に、取扱説明書を含むことができる。そういった取扱説明書は、紙、（例えば、ＣＤ‐ＲＯＭ又はＤＶＤによる）電子的なもの、又は他の形態であることができる。
【００８５】
ＩＸ．システム
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のプライマー伸長反応を実施する、及び／又はその結果を検出するための統合システムを提供する。前記システムには、特に、プライマー伸長反応の結果を導き出す手段にアルゴリズム、及び／又は電子的に保存された情報（例えば、回収された蛍光データ、伸長産物に関する予定された選択肢など）を含んでなる場合、回収されたデータを解釈し、そして分析する計装と手段を含むことができる。前記統合システムの各部分は、機能的に相互接続されることができ、場合によっては、物理的に接続されることができる。いくつかの実施形態において、前記統合システムは、自動化されていて、そこでは、分析開始後に操作者によるサンプル又は計装に関していずれの操作も必要としない。
【００８６】
本発明のシステムは、計装を含むことができる。例えば、本発明は、例えば、蛍光検出器（例えば、分光蛍光光度計）などの検出装置を含むことができる。単数又は複数の検出装置が、例えば、蛍光の変化として計測される場合には、例えば、プライマー伸長反応を観察又は計測するために本発明に関連して使用されることがある。検出装置は、アッセイの高速大量処理を容易にするためにマルチウェルプレート・リーダーの形をとることがある。
【００８７】
いくつかの実施形態において、前記統合システムは、反応物の温度を制御する目的のために、温度サイクリングデバイス又はサーモサイクラーを含む。いくつかの実施形態において、温度サイクリングデバイスと検出装置は、温度サイクリングと発光検出（例えば、蛍光検出）が同じデバイス内でおこなわれる統合装置である。
【００８８】
検出装置、例えば分光蛍光光度計は、分光光度計の操作パラメーター（例えば、励起波長、及び／又は検出される発光波長）を制御する、及び／又は検出装置から回収されたデータ（例えば、増幅サイクル中の蛍光測定値）の記憶のためにコンピューターに接続されている。前記コンピューターはまた、システムの温度変化の温度、タイミング、及び／又は速度を制御するために、温度サイクリングデバイスに稼動できるように接続されてもよい。前記統合コンピュータはまた、検出装置から回収されたデータを（電子的に）分析する「相関モジュール」を含むこともできる。いくつかの実施形態において、前記相関モジュールは、例えば、可能性のある出力に関するデータベースを用いて作成されたデータを比較することによって、作成されたデータ、例えば、ウイルス若しくは他の病原菌の存在又は不存在を判断する、検出されるべきＳＮＰ若しくは他の潜在的標的の存在又は不存在、の分析のためのコンピュータプログラムを含んでなる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、検出装置は、例えば（例えば、容器中、固体支持体上などで）あるアッセイシステムの別の成分中又はそれに近接して産生された検出可能シグナルを検出するための構造となっている。任意に利用されるか又は使用のために適応させた好適なシグナル検出装置は、本明細書中では、例えば、蛍光、リン光、放射能、吸光度、屈折率、発光、質量などを検出する。検出装置は、任意に、例えば、あるアッセイステップの実行の開始時点、及び／又は終了時点からの１つ又は複数のシグナルを観察する。たとえば、検出装置は、任意に、位置的に“リアルタイム”な結果に相当する複数の光シグナルを観察する。例示的な検出装置又はセンサーとしては、光増倍管、ＣＣＤアレイ、光センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセンサー、伝導度センサー、走査型検出装置などが挙げられる。本発明の方法を実施する際に任意に利用されるさらに具体的な例示的な検出装置としては、例えば、共鳴光分散検出装置、発光分光器、蛍光分光器、リン光分光器、発光分光器、分光光度計、光度計などが挙げられる。検出装置はまた、例えば、Ｓｋｏｏｇら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第５版、Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８）及びＣｕｒｒｅｌｌ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）にも記載されている。
【００９０】
本発明のシステムにはまた、通常、システムの１又は複数のコンポーネント（例えば、検出装置、熱調節器、流体移動コンポーネント等）と稼動できるように接続されたコントローラーが含まれ、前記コンポーネントの稼動を制御する。さらに詳細に述べると、コントローラーは、例えば、検出装置からのデータの受け取る、容器中の温度を生じる及び／又は制御する、選択された容器への又はそれからの流体の流れを生じる及び／又は制御する等、のために利用される別々の又は統合されたシステムコンポーネントとして広く含まれている。コントローラー及び／又は他のシステムコンポーネントは、任意に、適当にプログラミングされたプロセッサー、コンピュータ、デジタルデバイス又は他の情報家電（例えば、必要に応じて、アナログからデジタル又はデジタルからアナログへのコンバーターを含む）と結合され、それは、事前にプログラミングされたか又はユーザー入力指示に従ってこれらの機器の稼動を指示し、これらの機器からデータ及び情報を受け取り、及びこの情報を解釈し、操作しかつユーザーに報告するように作動する。適切なコントローラーは、広く前記技術分野で公知であり、さまざまな商業的な供給業者から入手可能である。
【００９１】
コントローラー又はコンピュータはいずれも任意にモニターを含み、それは、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ等）等であることが多い。コンピュータ回路はボックス内に収められていることが多く、それには、例えば、マイクロプロセッサー、メモリ、インターフェイス回路等といった多数の集積回路チップが含まれる。前記ボックスはまた、任意に、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、例えば書き込み可能なＣＤ‐ＲＯＭのような大容量リムーバブルドライブ、及び他の一般的な周辺機器要素が含まれる。例えばキーボード又はマウスなどの入力デバイスは、任意に、ユーザーからの入力のために提供される。これらのコンポーネントは、さらに下文で例示される。
【００９２】
前記コンピューターは、通常、例えば、ＧＵＩにおいてパラメータフィールドセットへのユーザー入力の形態、又は、例えば、様々な異なる具体的操作のために事前にプログラミングされたプログラム済指示の形態のいずれかにおいて、ユーザー指示を受け取るための適切なソフトウェアを含む。次に、前記ソフトウェアは、これらの指示を適切な言語に変換し、１又は複数のコントローラーの稼動を指示し、所望の操作をおこなう。次に、コンピューターは、例えば、システム内部のセンサー／検出装置からデータを受け取り、このデータを解釈し、ユーザーが理解できるフォーマットでそれを提供するか、又はこのデータを用いて重量尺度等から得た流体重量データに対応して流体流れ制御器を制御することなどさらなるコントローラー指示を開始する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ミスマッチ校正に関する略図を提供する。プライマー配列の中の２つのＴ（下線）は標的に対するミスマッチである。ＤＮＡポリメラーゼは、それを伸長する前にプライマー上のミスマッチを取り除く。プライマーは、プライマー配列内の２’アミノ修飾によってさらに酵素的分解から保護される。この過程は、その標的に完全に一致するプライマーを作り出す。
【図２Ａ】実施例で使用したプライマー（配列番号１〜４）及び鋳型（配列番号５〜８）を提供する。
【図２Ｂ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（左のパネル）又は３’‐５’ エキソヌクレアーゼ活性を持っている（右のパネル）ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応におけるマッチ及びミスマッチ・プライマーに関してサイクル数の関数として産物の蓄積を例示する。
【図２Ｃ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼを含む反応に関するＣｔの平均差を例示する。
【図３】異なる酵素及びベンジル化プライマーの有無に関係するマッチ及びミスマッチ・プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【図４Ａ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（「なし」）ポリメラーゼだけを使用した、又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼのかなりの量をさらに含む、ＨＩＶ標的配列向けのマッチ（Ａ）及びミスマッチ（Ｂ）プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【図４Ｂ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（「なし」）ポリメラーゼだけを使用した、又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼのかなりの量をさらに含む、ＨＩＶ標的配列向けのマッチ（Ａ）及びミスマッチ（Ｂ）プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【実施例】
【００９４】
ＰＣＲ及びＲＴ／ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼは、一般に、プライマーの３’末端付近にミスマッチを含んでいて標的を増幅するのが困難である傾向がある。残念ながら、これは、例えば、ＨＩＶやＨＣＶの診断アッセイにおける標的など顕著な配列不均一性を有する標的に関してよく観察される。３’末端においてミスマッチを誤伸長してしまうＤＮＡポリメラーゼの能力低下は、プライマーがアルキル化によって修飾されているとき、よりいっそう顕著である。プライマーのアルキル化はプライマー／二量体効果を低減するが（例えば、米国特許番号第６，００１，６１１号；同第６，７９４，１４２号を参照のこと）、しかし、本発明の方法はアルキル化プライマーを用いることなく実施される。これらの末端ミスマッチの影響を最小限にする１つの方法論が、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長する前にミスマッチを完全に取り除くことである。我々は、ミスマッチ不耐性を緩和するために修飾された３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を評価し、そしてプルーフリーディング活性を欠いている酵素とそれらを比較した。ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性は、プライマー配列内の２’アミノ修飾塩基の使用によって妨げることができる。我々は、プルーフリーディング分解の所望の程度を提供するようにこれらのブロック基を有するプライマーを設計した。末端から二番目の塩基（すべてのプルーフリーディングを妨げるため）又は３’末端の潜在的ミスマッチの上流（３’末端のプルーフリーディングを可能にするが、酵素がさらにオリゴヌクレオチドを分解しないようにするため）において２’アミノ修飾を用いてプライマーを設計した。これらの研究の結果は、プルーフリーディング活性はＤＮＡポリメラーゼがこれらのミスマッチ標的を効率的に増幅することを可能にすることを実証している。よって、我々は、オリゴヌクレオチドプライマーの下での配列不均一性によって検証される増幅系の性能を改善するためのアプローチを実証した。
【００９５】
キメラＤＮＡポリメラーゼ、ＣＳ５を、サーマス属Ｚ０５からの５’‐３’エキソヌクレアーゼドメインと、サーモトガ・マリチマからの３’‐５’エキソヌクレアーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼドメインを組み合わせることによって作製した。Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと。このＤＮＡポリメラーゼを、約１０％のプルーフリーディング活性を保有するＣＳ５Ｌ（突然変異Ｌ３２９Ａを持つＣＳ５）及びプルーフリーディングを欠いているＣＳ６を用いた、弱化プルーフリーディング活性を有するキメラ変異ＤＮＡポリメラーゼのコレクションの作製のために使用した。Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと。突然変異誘発の第２ラウンドでは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの存在下、用意されたＭ１３ＤＮＡ鋳型において改善された伸長速度を有する酵素を選択した。ＣＳ５Ｌ突然変異体のうちのいくつかが、長い高感度ＲＴ／ＰＣＲを実施する能力を示した。最も有望な突然変異体は、Ｄ６４０Ｇであった。我々は、これらの突然変異体をＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ骨格から野性型Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼドメインに移した。Ｔｍａ６Ｄ及びＴｍａＬＤ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ６４０Ｇ「高速伸長因子」突然変異を含むが、Ｔｍａ６Ｄはプルーフリーディング活性を欠き、そしてＴｍａＬＤはプルーフリーディング活性が減少した。同様に、我々は、相同Ｄ６４０Ｇ ＤＮＡポリメラーゼドメイン変異をＣＳ５からＺ０５に移した（Ｄ５８０Ｇ）。
【００９６】
ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性は、プライマー配列内の２’アミノ修飾塩基の使用によって制限される。プライマーを、末端から二番目の塩基（プルーフリーディングを完全に妨げるため）、又は３’末端の潜在的ミスマッチの上流であるプライマーのＮ−６位（限定されたプルーフリーディングを可能にするため）のいずれかに２’アミノ修飾を用いて設計した。これらのプライマーを、２’アミノ修飾を含まないアルキル化プライマーと比較した。プライマーの３’末端のミスマッチによって引き起こされた性能低下を緩和するために、修飾されたプルーフリーディング活性を有する酵素の使用と、新しいＤＮＡポリメラーゼの使用を評価した。
【００９７】
酵素活性
図１は、ミスマッチ校正に関する略図を提供する。プライマー配列の中の２つのＴは標的に対するミスマッチである。ＤＮＡポリメラーゼは、それを伸長する前にプライマー上のミスマッチを取り除く。プライマーは、プライマー配列内の２’アミノ修飾によってさらに酵素的分解から保護される。この過程は、その標的に完全に一致するプライマーを作り出す。
【００９８】
マッチ及びミスマッチ標的のＲＴ／ＰＣＲ
図２Ａは、ＨＩＶのＧＡＧ領域の増幅に使用したプライマーと鋳型を示している。図２Ｂは、（３’部分の）完全に一致した転写産物又はミスマッチ転写産物（Ｔ９７５９９‐１）のいずれかを使用した１５分間のＲＴステップによるＨＩＶ ＲＴ／ＰＣＲ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）の結果を示している。ＲＴプライマー上の２’アミノ修飾は、末端から二番目の位置（−１）、又はプライマー３’末端からＮ−６位に存在した。
【００９９】
Ｔｍａ６Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ（プルーフリーディング活性なし）では、２’アミノ修飾プライマー（−１と−６）を用いたミスマッチ標的に関して〜８Ｃｔの遅延があった。プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＴｍａＬＤでは、−１位２’アミノ修飾プライマーを用いたミスマッチ標的に関しては〜６サイクルの遅延があるが、−６位アミノ修飾プライマー（２’アミノ基はミスマッチの上流）を用いると遅延は１サイクルより少なかった。Ｃｔの差もまた、図２Ｃに例示されている。
【０１００】
アルキル修飾プライマーを用いた増幅
３’末端のミスマッチを伸長する難しさは、（より大きいＣｔ遅延を引き起こす）プライマーがベンジル基で修飾されているときに深刻になる。図３を参照のこと。Ｔｍａ６Ｄ ＤＮＡポリメラーゼは、ベンジル化プライマーと共にミスマッチ標的を使用することで〜１５サイクルの遅延を示すのに対して、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＴｍａＬＤは＜１サイクルの遅延しか示さなかった。ＴｍａＬ ＤＮＡポリメラーゼ（同様にプルーフリーディング酵素）は、ミスマッチ標的に関して〜７サイクルの遅延を示す。これらの結果は、プルーフリーディング活性がミスマッチ標的の増幅の改善に関与し、そしてＴｍａのＤ６４０Ｇ突然変異がさらにそれを改善したことを示唆している。これらの結果は、アルキル化プライマーがＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性によって分解されることを裏付けている。
【０１０１】
ＨＩＶ‐１ＭＭＸに添加されたプルーフリーディング酵素
プルーフリーディング酵素ＣＳ５Ｇ又はＣＳ５ＧＬを、ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶ‐１試験の製品版Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ中に混入した。０．１ＵのＣＳ５Ｇ又は１ＵのＣＳ５ＧＬ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを加えたとき、好ましい結果を得た。図４Ａ及び４Ｂを参照のこと。ミスマッチ標的Ｔ９７５９９‐１を使用して、０．１ＵのＣＳ５Ｇ又は１ＵのＣＳ５ＧＬ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかの添加は、単独のＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、８．５〜１１．６サイクル早いＣｔを示した。定量標準（ＱＳ）は、それぞれ２．１〜３．９サイクル早いＣｔを示した。よって、プルーフリーディング酵素の添加は、このミスマッチ転写産物に関してより正確なコピー数測定につながる。マッチ標的であるＥＦ０２１を用いると、結果は、添加が定量におけるわずかな変化しか引き起こさなかったことを示した。
【０１０２】
結論
我々は、ミスマッチ鋳型によって検証される増幅系の性能を改善する多様なアプローチを実証した。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴｍａＬＤ）のプルーフリーディング活性が、プライマーの３’末端にミスマッチを持つ標的を首尾よく増幅することを示した。プルーフリーディングの程度を制限した、すなわち、プライマー配列の末端から二番目の位置に２’アミノ修飾ヌクレオチドを持つプライマーを使用したとき、増幅は、非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを使用したかのように振る舞った（Ｔｍａ６Ｄと同程度）。しかしながら、２’アミノ修飾形態をミスマッチの上流に配置したとき、ミスマッチを通過して２’アミノ基の１塩基前までの分解が、その標的と完全に一致したプライマーを可能にし、その結果、増幅が改善された。
【０１０３】
アルキル修飾が、（より大きなＣｔ遅延を引き起こして）３’‐ミスマッチを伸長する難しさを深刻にする。これらの結果は、プルーフリーディング活性が、ミスマッチ標的の増幅を改善するのに関与し、そしてＴｍａ（Ｚ０５のＤ５８０Ｇ）のＤ６４０Ｇ突然変異がさらにそれを改善したことを示唆している。これらの結果は、ベンジル化プライマーがＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性によって分解されることを裏付けている。
【０１０４】
現在のＺ０５ベースのウイルスＴａｑＭａｎ試験へのプルーフリーディング酵素の添加は、オリゴヌクレオチドプライマーの下の配列不均一性によって検証される既存の増幅系における性能改善の解決策となる可能性がある。
【０１０５】
Ｔｍａ及びＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼで特徴とされる特異的突然変異は、ミスマッチ鋳型が生じるとき、アルキル化プライマーを使用したシステムにおいて二重の利益をもたらすことができる。Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ６４０Ｇ突然変異、及びＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ５８０位の突然変異（例えば、Ｚ０５Ｄなどの）は３’修飾プライマーの伸長を改善するので、ミスマッチ耐性を改善する。
【０１０６】
本明細書中に記載した実施例及び実施形態が例示目的のためだけに存在すること、そしてそれを考慮した様々な修飾形態又は変更が当業者に示され、且つ、本出願の要旨と添付の請求項の範囲の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
【背景技術】
【０００１】
本発明の背景
核酸増幅技術の開発は、遺伝子分析及びエンジニアリングサイエンスに革命を起こした。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば診断、法医学、又は他の適用の一部として標的核酸検出を促進するため、選択されるプライマー核酸を用いて特定の標的核酸を増幅するために頻繁に使用されている。プライマーは、通常、互いに向かって伸長するように設計されている対で機能して、選択される標的領域をカバーする。典型的ＰＣＲサイクルには、高温（例えば、８５℃以上）の変性ステップで二本鎖核酸の鎖が互いに別々になるステップ、低温（例えば、４５〜６５℃）アニーリングステップでプライマーが別々になった一本鎖とハイブリダイズするステップ、及び中温（例えば、７２℃位）伸長ステップで核酸ポリメラーゼが前記プライマーを伸長させるステップを含む。２種類の温度による熱サイクル手順も用いられる。これらは、一般に、高温変性ステップと低温アニール伸長ステップを含む。
【０００２】
ＰＣＲはまた、例えば、１９８７年７月２８日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国特許番号第４，６８３，１９５号、１９８７年７月２８日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国特許番号第４，６８３，２０２号、及び１９９０年１０月２３日付けでＭｕｌｌｉｓらに交付された「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ，ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＵＳＩＮＧ Ａ ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ ＥＮＺＹＭＥ」と題された米国特許番号第４，９６５，１８８号を含めた多くの異なる米国特許に記載されている。さらに、ＰＣＲ関連技術もまた、例えば、Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｏｏｋｓ（１９９０）、Ｉｎｎｉｓ ｅｔら（編）、ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ ＰＣＲ、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｉｎｃ．（２００４）、及びＲａｐｌｅｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２００４）などの様々な他の刊行物に記載されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の簡単な概要
本発明はプライマー伸長反応の実施方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）鋳型核酸及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで：
ｉ．前記オリゴヌクレオチドが、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり；
ｉｉ．前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく；
ｉｉｉ．前記オリゴヌクレオチドには３’部分及び５’部分があり、ここで、前記３’部分は、前記修飾ヌクレオチドの３’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記５’部分は、前記修飾ヌクレオチドの５’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり；並びに
ｉｖ．前記オリゴヌクレオチドの３’部分が鋳型核酸に対して１００％の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの３’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され；そして
ｂ．前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる。
【０００４】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの３’部分は、校正前に鋳型核酸に対して７０〜１００％の相補性を持つ。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、生体サンプルからのものである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ウイルス又は細菌ゲノムからのものである。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ＤＮＡである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から５〜７ヌクレオチドの間に存在する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは：
１５〜４０ヌクレオチドの長さであり；
そのオリゴヌクレオチドの全長にわたって鋳型核酸に対して少なくとも７０％の相補性を持ち；及び／又は
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記ポリメラーゼは、熱可逆的共有結合修飾を含んでなるが、ここで、アルカリｐＨの水性緩衝液中、５０℃より高い温度でのインキュベーションが、共有結合修飾を逆戻りさせ、２０分未満で酵素活性の少なくとも二倍の上昇をもたらす。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ステップｂは、ポリメラーゼ連鎖反応を含んでなる。いくつかの実施形態において、ステップｂは、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、蛍光部分を含まない。
【０００９】
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬のうちの１以上を含んでなる反応混合物も提供する。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、オリゴヌクレオチドを含んでなり、前記オリゴヌクレオチドが核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは、蛍光部分を含まない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、鋳型核酸をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、デオキシヌクレオシド三リン酸をさらに含んでなる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１２】
本発明は、本明細書中に記載した試薬のうちの１以上を含んでなるキットをさらに包含する。いくつかの実施形態において、前記キットは、オリゴヌクレオチドを含んでなり、そのオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなるが、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは蛍光部分を含まない。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記キットは、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記キットは、デオキシヌクレオシド三リン酸をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ又は‐ＯＨ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、‐ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１５】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドも提供するが、ここで、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドは蛍光部分を含まない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、１５〜４０ヌクレオチドの長さがある。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、２’位に‐Ｈ又は‐ＯＨ以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる。
【００１７】
本発明はまた、生体サンプル中の生物学的実体の存在、不存在、又はその量の検出方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち；
ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、前記生物学的実体からの核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ；
ｃ．前記ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し；そして
ｄ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は存在若しくは不存在に相関させる、
を含んでなる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記定量ステップは、定量的リアルタイムＰＣＲを含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記生物学的実体は、ウイルス、細菌、又は癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドとウイルス核酸の間に０、１、２、又は３つのミスマッチが存在するか否かに関係なく、オリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下でのステップを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、生物学的実体からの核酸と１つ以上のミスマッチがあり、そしてここで、前記ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記オリゴヌクレオチドを校正してポリヌクレオチド産物をもたらす、すなわち、そのポリヌクレオチド産物に完全な相補性をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記実施ステップは、そのうちの一部が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている１又は複数のポリメラーゼをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記実施ステップは、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているか、又は実質的に欠いているポリメラーゼを含まない。
【００２１】
定義
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」といった語句は、別段のはっきりと指示する文脈がない限り、複数の指示対象物も含む。
【００２２】
用語「核酸」とは、リボース核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマーに対応させることができるモノマーのポリマー、又はその類似体を指す。これには、ＲＮＡ及びＤＮＡのようなヌクレオチドポリマー、並びにその修飾形態、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ（商標））等が含まれる。ある適用において、前記核酸は、複数のモノマータイプを含むポリマー、例えばＲＮＡ及びＤＮＡサブユニットの両者であってもよい。核酸は、例えば、染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、アンプリコン、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ等であっても、又はそれを含んでもよい。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖であってもよい。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した任意の配列に加え、相補配列を任意に含んでなるか又はそれをコード化している。
【００２３】
核酸は、典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、通常、ホスホジエステル結合を含むであろうが、本明細書で概説するように、場合によっては、別の骨格を有する核酸類似体も含まれ、例えば、ホスホラミダイト（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；及びＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１９）、ホスホロチオアート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７及び米国特許番号第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ‐メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｃｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６；及びＣａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７）が含まれるがこれだけに限定されるものではない。
【００２４】
他の類似体核酸には、正電荷骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許番号第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、及び同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２及び３、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ及びＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、並びに米国特許番号第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、及びＣｈａｐｅｒｓ ６及び７、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ及びＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載のものを含む非リボース骨格が含まれる。数種の核酸類似体が、例えば、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５ページにも記載されている。前記リボース‐リン酸骨格のこのような修飾は、標識部分のような付加的部分の付加を促進するため、又は生理的環境におけるこのような分子の安定性と半減期を変えるためにおこなうことができる。
【００２５】
核酸に典型的に見られる天然の複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、核酸類似体にはまた、非天然複素環又は他の修飾ヌクレオチドを持つものが含まれ、それらの多くは本明細書で記載されるか又は別段に引用されている。特に、多くの非天然塩基は、さらに、例えばＳｅｅｌａら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１７９０、Ｇｒｅｉｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１‐９７６、及びＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８２：１６４０に記載されている。
【００２６】
さらに例示すると、融解温度（Ｔｍ）修飾剤として作用するヌクレオチドで使用される特定の塩基もまた任意に含まれる。たとえば、これらの一部には、７‐デアザプリン（例えば、７‐デアザグアニン、７‐デアザアデニン等）、ピラゾロ〔３，４‐ｄ〕ピリミジン、プロピニル‐ｄＮ（例えば、プロピニル‐ｄＵ、プロピニル‐ｄＣ等）等が含まれる。たとえば、１９９９年１１月２３日付けでＳｅｅｌａに対して交付された「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ７‐ＤＥＡＺＡ‐２´‐ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」と題された米国特許番号第５，９９０，３０３号を参照のこと。
【００２７】
他の代表的複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２‐アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、２‐アミノ‐６‐クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８‐アザ誘導体；アデニン、グアニン、２‐アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、２‐アミノ‐６‐クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７‐デアザ‐８‐アザ‐誘導体；６‐アザシトシン；５‐フルオロシトシン；５‐クロロシトシン；５‐ヨードシトシン；５‐ブロモシトシン；５‐メチルシトシン；５‐プロピルシトシン；５‐ブロモビニルウラシル；５‐フルオロウラシル；５‐クロロウラシル；５‐ヨードウラシル；５‐ブロモウラシル；５‐トリフルオロメチルウラシル；５‐メトキシメチルウラシル；５‐エチニルウラシル；５‐プロピオニルウラシル等が含まれる。
【００２８】
修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの他の例はまた、１９９６年１月１６日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ５‐ＰＲＯＰＹＮＹＬ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，４８４，９０８号、１９９７年７月８日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＴＲＩＰＬＥ‐ＨＥＬＩＸ ＡＮＤ ＤＯＵＢＬＥ‐ＨＥＬＩＸ ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，６４５，９８５号、１９９８年１１月３日付けでＦｒｏｅｈｌｅｒらに対して交付された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」と題された米国特許番号第５，８３０，６５３号、２００３年１０月２８日付けでＫｏｃｈｋｉｎｅらに対して交付された「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許番号第６，６３９，０５９号、２００１年１０月１６日付けでＳｋｏｕｖに対して交付された「ＯＮＥ ＳＴＥＰ ＳＡＭＰＬＥ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＯＭＰＬＥＸ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ」と題された米国特許番号第６，３０３，３１５号、及び２００３年５月１５日付けで公開されたＫｏｃｈｋｉｎｅらによる「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許公報番号第２００３／００９２９０５号にも記載されている。
【００２９】
「オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも６個の核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）、例えば、少なくとも８、１０、１２、又は１５個のモノマー単位を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、通常、そのオリゴヌクレオチドの最終的機能又は用途を含む様々な要因に依存している。典型的には、ヌクレオチド単量体は、そのような対イオンが存在している場合には、関連対イオン、例えばＨ+、ＮＨ4+、Ｎａ+等を含む、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリダート、ホスホルアミダート等を含めたホスホジエステル結合又はその類似体によって連結される。オリゴヌクレオチドは、既存の又は天然の配列の分離、ＤＮＡの複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローンニング及び制限消化、あるいは、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０‐９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９‐１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９‐１８６２のジエチルホスホラミデート法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５‐３１９１のトリエステル法；自動化合成方法；又は１９８４年７月３日付けでＣａｒｕｔｈｅｒｓらに対して交付された「ポリヌクレオチドの調製過程」と題された米国特許番号第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接的な化学合成、あるいは当業者に知られているその他の方法を含めたいずれかの好適な方法によって随意に調製されるが、これだけに限定されるものではない。
【００３０】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱（例えば、９０〜９５℃）に対して安定であり、熱耐性があり、そして二本鎖核酸の変性を達成するのに必要な、時間の温度上昇に晒された場合、続くプライマー伸長反応を達成するのに十分な活性を残し、且つ、不可逆的変性（不活性）状態にならない酵素を指す。核酸変性のために必要な加熱条件は、前記技術分野で周知であり、例えば、米国特許番号第４，５８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、及び同第４，９８５，１８８号に例示されている。本明細書で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）等の温度連鎖反応における使用に好適である。本明細書の目的のための「不可逆的変性」は、酵素活性の恒久的、且つ、完全な喪失を指す。熱安定性ポリメラーゼについて、酵素活性は、鋳型核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成させるのに適切な様式でのヌクレオチドの組み合わせの触媒を指す。好熱細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ａｑｕａｔｉｏｎｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス属ｓｐｓ１７、サーマス属Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３１】
「３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、核酸のほとんどの３’塩基を取り除くいくつかのポリメラーゼの活性を指す。この活性は、前記技術分野ではポリメラーゼの「プルーフリーディング」活性と呼ばれることもある。３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、ヌクレオチドの３’オリゴヌクレオチドのうちの１以上を、すなわち、連続した様式で取り除くことができる。そのヌクレオチドは、続いて、鋳型依存様式でヌクレオチドによって置き換えられ、その結果、オリゴヌクレオチドのそのヌクレオチドを「校正する」、すなわち、鋳型核酸に対して相補性を持たないヌクレオチドを鋳型に対して相補性を持つヌクレオチドで置き換える。
【００３２】
「３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている」は、天然サーモトガ・マリチマＤＮＡポリメラーゼの活性の３％以下（例えば、１％又は０．１％未満）である３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を指す。３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている代表的なポリメラーゼとしては、例えば、米国特許番号第７，１４８，０４９号に記載されているものが挙げられる。
【００３３】
「修飾ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムＤＮＡにおいて天然に起こらないヌクレオチド（例えば、合成ヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を指す。本明細書中でより詳細に記載されるとおり、ヌクレオチドのペントース糖部分の２’位に置換がある塩基は、ＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドをもたらす。「核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの３’末端又は３’末端から二番目の位置においても、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で取り除かれない修飾ヌクレオチドを指す。
【００３４】
修飾ヌクレオチドの「２’部分」は、核酸技術分野において一般的に使用される、ヌクレオチドの糖部分の２’炭素に連結された部分を指す。例えば、米国特許広報番号第２００６／００８８８５５５号及び同第２００７／０２１９３６１号を参照のこと。
【００３５】
少なくとも核酸セグメント（すなわち、少なくとも２つの隣接塩基）が逆平行会合によって結合して、又は他の核酸の少なくとも部分配列にハイブリダイズして二本鎖を形成するとき、核酸が別の核酸との関連で「相補性を持つ」。逆平行会合は、例えば、核酸内のヘアピンループの形態で分子内に、又は２つ以上の一本鎖核酸が互いにハイブリダイズするときなどで分子間に存在し得る。本発明との関連において、特定の配列（例えば、鋳型核酸）に対して「１００％の相補性を持つ」オリゴヌクレオチドに関して、そのオリゴヌクレオチドのそれぞれの塩基は、逆平行様式において特定の配列の対応する塩基に対して相補性を持つ。
【００３６】
天然の核酸中で一般的に見られない特定の塩基が、本発明の核酸に含んでもよいので、例えば、イノシン、７‐デアザグアニン、及び先に議論したものを含むことができる。いくつかの実施形態において、相補性は完全でない、すなわち、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうちの特定のパーセンテージだけが鋳型に対して相補性を持つことを示す「パーセント相補性」を持つ一方で、残りのヌクレオチドが相補性を持たない場合には、核酸は「実質的に相補性を持つ」。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の実質的に相補性を持つオリゴヌクレオチド（又はそれらの３’部分）は、鋳型核酸に対して１００％未満の相補性を持つ、例えば、鋳型に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の相補性を持つ。
【００３７】
例えば、いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド（又は、少なくとも前記オリゴヌクレオチドの３’部分）は、１、２、３、４、５、６つ、又はそれ以上の鋳型核酸とのミスマッチを持っている。鋳型核酸がオリゴヌクレオチド（又は指示された、その一部）より長い典型的な例において、ミスマッチ（又は相補性を持つヌクレオチド）のパーセンテージ又は数は、オリゴヌクレオチド（又は指示されたその一部）に対して相補性を持つヌクレオチドのうちで最も高い割合を持つ、オリゴヌクレオチド（又は指示されたその一部）と同じ長さの鋳型核酸の部分配列に関して測定される。
「プライマー伸長反応」は、核酸ポリメラーゼがプライマーの３’末端に鋳型特異的様式で１又は複数のヌクレオチドを付加する分子反応を指す。伸長は、プライマーの３’末端への最初のヌクレオチドの付加を指すだけではなく、伸長されたプライマーによって形成されるポリヌクレオチドのさらなるあらゆる伸長もまた含む。
【００３８】
酵素の「熱可逆的な共有結合修飾」は、本明細書中で使用される場合、酵素が最初は室温にて実質的に不活性であるが、より高い温度（例えば、５０℃超）にて化学（例えば、共有結合）修飾が除去されるような酵素の可逆的な化学修飾を指す。熱可逆的な共有結合不活性化の例としては、例えば、酸無水物を用いた反応によって達成される、リジン残基の化学修飾が挙げられる（ＥＰ ０ ９６２ ５２６を参照のこと）。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「生体サンプル」は、（例えば細菌、ウイルス、組織生検などに由来する）核酸を含む又は含むと推定される任意の物質を指す。前記サンプルは、当業者に知られているいずれかの手段によって得られる。かかるサンプルは、１体の個体又は複数の個体から単離された、組織量若しくは液体量、又はその精製画分量であり得、例えば、皮膚、血漿、血清、全血、髄液、唾液、腹水、リンパ液、房水又は硝子体液、滑液、尿、涙、血球、血液生成物、精液、精漿、膣液、肺の滲出液、漿膜液、器官、気管支肺胞洗浄液、腫瘍、パラフィン包埋組織などが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。サンプルとしてはまた、これだけに限定されるものではないが、細胞培養培地中での細胞培養から生じる条件培地、組み換え細胞、細胞成分等を含む、インビトロ細胞培養の構成要素及び成分が挙げられる。核酸は、当技術分野で周知の手順によって生体サンプルから得られる。
【００４０】
本発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、プライマー伸長反応により標的（すなわち、鋳型）核酸の検出を可能にするが、ここで、前記反応の１又は複数のプライマーは、増幅され、そして検出されるべき標的核酸に対して完全に相補性を持つか、又は完全に相補性を持つというわけではない。本願発明は、例えば、関連配列の多様性が標的配列にあるかもしれない様々な標的の増幅及び検出のためのプライマーの設計において有用である。例として、本発明はウイルス病原体を検出するのに使用でき、ここで、前記ウイルス病原体には、潜在的ウイルスゲノムの大部分若しくはすべてを増幅する単一の又は少数のセットのプライマーを設計するのを困難又は不可能にするのに十分なほどそのゲノムに変動がある。標的又は鋳型核酸はまた、他の起源、例えば、細菌ゲノムに由来することもある。
【００４１】
本発明は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性と呼ばれることもある）を有する熱安定性ポリメラーゼが、増幅に使用される１又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーが標的にとって完全な相補性を持つわけではないいくらかの変動があり得る標的配列、例えば、鋳型を増幅するのに使用される定量的な増幅反応を提供する。ＰＣＲの条件は、プライマーが標的に対して特異性を維持するが、それでもなお、（単数若しくは複数の）プライマーと鋳型の間の相補性の多少の変動（例えば、１、２、３個のミスマッチ）を許容するように設定され得る。これらの条件下のポリメラーゼは、得られた増幅産物が標的配列に対して完全な相補性を持つようにオリゴヌクレオチドを校正するだろう。もちろん、プライマーはまた、（例えば、クローニング、配列タグ付与、標識などのための）相補性を持たないプライマーの５’末端に１又は複数のヌクレオチドを含有することもできることは理解され、そして「完全な相補性を持つ」によって、得られた反応産物はプライマーと鋳型の間に存在するあらゆる内部又は３’ミスマッチを含まないが、それでも、その機能が標的とのハイブリダイゼーション以外である５’非相補性ヌクレオチドを含み得ることが意味されていることも理解される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲ産物は、単純なプライマー伸長反応（すなわち、プライマーが１又は２つのヌクレオチドだけで伸長される反応）だけではない。例えば、いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲ産物は、産物内に組み込まれもするオリゴヌクレオチド配列自体をカウントに入れずに、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記反応は２以上ポリメラーゼを含む。場合により、少なくとも１つのポリメラーゼは、実質的に３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。そのような場合、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているポリメラーゼと比較した３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼの量の比は変化することがある。例えば、いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼの量は、活性を実質的に欠いているポリメラーゼの量より少ない、すなわち、いくつかの実施形態において、その比は、１：２より少ない、１：３、１：４、又は１：１０（活性を持っている／活性を実質的に欠いている）。あるいは、いくつかの実施形態において、前記反応におけるポリメラーゼの量は実質的に等しく、そしていくつかの実施形態において、活性を実質的に欠いているものに比べてエキソヌクレアーゼ活性を持っているより多くのポリメラーゼが存在する。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸の量は、例えば、定量的な増幅を使用することによって定量される。所望された情報が、その配列が示されていない病原菌、微生物、癌細胞などの存在又は不存在を示す可能性のある可変鋳型の存在と量である場合、任意に、前記定量が、オリゴヌクレオチドプライマーと鋳型の間のミスマッチの存在又は不存在に関係なく実施される。一旦測定されれば、鋳型の存在又は量を、鋳型の起源である生物学的実体、すなわち、ウイルス、微生物、癌細胞などの存在又は量に相関させることができる。
【００４５】
本発明はまた、プライマー伸長反応においてプライマーとしての役割を果たすオリゴヌクレオチドを提供する。３’‐５’活性によるプライマーの分解のために起こり得る特異性の欠如をもたらすため、通常、プライマー伸長反応は３’‐５エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用を伴わないが、本発明は、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１の酵素、例えば、ポリメラーゼの包含をおこなう。しかしながら、プライマーの分解を防ぐために、いくつかの実施形態において、本発明は、プライマー・オリゴヌクレオチドの中央への修飾ヌクレオチドの包含をおこなう。修飾ヌクレオチドは３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれることができないので、プライマーの３’部分だけが３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって校正され得る。これが、プライマーの５’非分解部分との多少の特異性の維持を可能にし、そのため、プライマーと潜在的可変鋳型の３’部分の間に起こるかもしれない最初のミスマッチにもかかわらず、プライマーのハイブリダイゼーションと伸長を可能にする。
【００４６】
ＩＩ．修飾ヌクレオチド
本発明は、（鋳型へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションがその鋳型と修飾ヌクレオチドのミスマッチをもたらす）鋳型の存在下、修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に存在するときに、塩基が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドの実質的な分解を妨げるのであれば、あらゆるタイプの修飾ヌクレオチドの使用をおこなう。
【００４７】
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドには、修飾された２’位がある（すなわち、ここで、２’位は‐Ｈ（ＤＮＡ）ではない）。前記修飾ヌクレオチドは、以下の：２’アミノ、２’Ｏ‐メチル、２’ＯＨ（リボ）、２’Ｏ‐ホスファート、及び２’ホスホロチオアートを包含するが、これだけに限定されるものではない。
【００４８】
ＩＩＩ．本発明のオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応における使用のために便利なあらゆる長さのものであることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも８ヌクレオチドの長さであり、そしてオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端に存在することのない修飾ヌクレオチドを任意に含んでなる。修飾ヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、３’及び５’部分に関して説明されることができ、ここで、前記３’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの３’側のヌクレオチドを指し、そして前記５’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの５’側のヌクレオチドを指す。本明細書中に記載したような修飾ヌクレオチドは別として、オリゴヌクレオチド内の残りのヌクレオチドとしては、天然若しくは合成ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）、又はその組み合わせが挙げられる。しかしながら、一般に、ヌクレオチドの３’部分は、ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除くことができないヌクレオチドを含まないであろう。
【００４９】
オリゴヌクレオチドの５’部分は、配列のいずれかである。例えば、オリゴヌクレオチドの５’部分は、プライマー伸長反応において標的（鋳型）核酸に（単独で、又は３’部分のいくつか又はすべてと組み合わせて）ハイブリダイズするように設計されることができる。いくつかの実施形態において、標的核酸に多少の変動がある場合（例えば、ウイルス又は細菌ゲノム）、５’部分は、少なくとも部分的に保存されている標的配列の領域にハイブリダイズするように設計されることができる。このことは、例えば、標的に対して相当数の相補性ヌクレオチドを持つように、例えば、標的核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の相補性を持つように５’部分を設計することによって達成できる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの５’部分の長さ（すなわち、ヌクレオチドの数）は、プライマー伸長のために便利なあらゆる長さであることができる。いくつかの実施形態において、５’部分は、少なくとも３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、又はそれ以上である。例えば、いくつかの実施形態において、５’部分には、６〜５０ヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜２０、８〜２０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、１５〜４０、２０〜４０ヌクレオチドの長さがある。
【００５１】
オリゴヌクレオチドの３’部分もまた、プライマー伸長反応に有用なあらゆる長さのものであることができる。３’部分はポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって校正される可能性があるので、いくつかの実施形態において、３’部分は、５’部分に比べてプライマー伸長反応の特異性を制御するのに小さな役割しか果たさない。よって、いくつかの実施形態において、３’部分の長さは、５’部分よりさらに短いであろう。よって、例えば、いくつかの実施形態において、３’部分には、１〜１５ヌクレオチドの長さ、例えば、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜８、２〜５、３〜１０、３〜８ヌクレオチドの長さがある。いくつかの実施形態において、３’部分には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さがある。
【００５２】
任意に、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識され得るか、又は共有結合若しくは他の方法で連結されたその他の残基を持つ。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識物を包含しない。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識を包含しない。本発明のオリゴヌクレオチドが標識されているいずれかの実施形態において、あらゆる標識物が使用され得る。所望であれば、オリゴヌクレオチドには、例えば、分光分析、光化学、生化学、免疫化学、化学、又は他の技術によって検出可能な標識を組み込むことができる。例示すると、有用な標識物としては、放射性同位元素、蛍光色素、電子稠密薬、（ＥＬＩＳＡｓで一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、又は抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質が挙げられる。これらの多くと他の標識物が、さらに本明細書中に記載されており、及び／又は別の形で前記技術分野で知られている。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、標識物は蛍光色素又はフルオロフォアである。通常、ある特定のフルオロフォアは、より短い波長の光を吸収した後に、特定の波長の光を出すことができる。特定のフルオロフォアが出す光の波長は、そのフルオロフォアに特徴的である。よって、特定のフルオロフォアは、より短い波長の光を用いたそのフルオロフォアの励起後に適切な波長の光を検出することによって検出できる。蛍光標識としては、負に帯電した色素、例えば、フルオレセイン・ファミリーの色素など、又は電荷が中性の色素、例えば、カルボキシローダミン・ファミリーの色素など、又は正に帯電した色素、例えば、シアニン・ファミリーの色素やローダミン・ファミリーの色素などを挙げることができる。本発明で利用可能な他のファミリーの色素としては、例えば、ポリハロフルオレセイン‐ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン‐ファミリーの色素、クマリン‐ファミリーの色素、オキサジン‐ファミリーの色素、チアジン‐ファミリーの色素、スクアレン‐ファミリーの色素、キレート化ランタニド‐ファミリーの色素、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素、及びＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素などが挙げられる。フルオレセイン・ファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、及びＺＯＥなどが挙げられる。カルボキシローダミン・ファミリーの色素としては、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡなどが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されているのに対し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）から市販されている。シアニン・ファミリーの色素としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７などが挙げられ、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されている。
【００５４】
ＩＶ．３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するあらゆるポリメラーゼが、本明細書中に記載したように使用できる。（熱安定性ポリメラーゼを含めた）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する代表的なポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリチマ（Ｔｍａ［Ｔｍａ Ｄ３２３Ａ Ｅ３２５Ａを含むが、これだけに限定されるものではない］、ＵｌＴｍａ、Ｔｍａ２５など［例えば、米国特許番号第６，２２８，６２８号を参照のこと］）、Ｔｍａ／Ｚ０５キメラ（例えば、Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと）、ピロディクティウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（Ｐｏｃ）［形態１と２］及びピロディクティウム・アビッシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐａｂ）［形態１と２］を含めたピロディクティウム属、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）（Ｔａｆ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５５】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を含む他のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばエッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ‐ＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ、通称Ｖｅｎｔ ＆ Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）；パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）；パイロコッカス属ＫＯＤ１株；サーモコッカス属ＴＹ；サーモコッカス属９°Ｎ‐７；メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）；バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）（Ｂｃａ）；スルフォロバス・アシドカルダニウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）；サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）；メタノバクテリウム・サーモオートトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）；サーモコッカス・グルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（ＲＡＳ Ｔｇｏ）が挙げられる。
【００５６】
追加的な市販の３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとしては：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（例えば、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）含有Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びパイロコッカス属ＧＢ‐Ｄポリメラーゼ由来の３’‐５’エキソヌクレアーゼ含有ＤＮＡポリメラーゼ；古細菌サーモコッカス・ジリジイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ）由来のＰｆｘ５０（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス属ＫＯＤ株由来のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｑｉａｇｅｎ（例えば、ＨｏｔＳｔａｒ（商標）とＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ（商標））、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＥＸＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＡｒｃｈａｅＭａｘｘ（登録商標）ポリメラーゼ増強因子）によって販売されているものが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。また、米国特許番号第５，７４７，２９８号も参照のこと。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼには、そのポリメラーゼが改善された活性を持つような天然ポリメラーゼの修飾形態を含む。例えば、いくつかの実施形態において、前記ポリメラーゼは、蛍光標識されたヌクレオチドが、最も密接に関連した天然ポリメラーゼと比較して無標識ヌクレオチドと比べて減弱された差別しか受けずに取り込まれるように修飾される。例えば、米国特許広報番号第２００３／０１５２９８８号に記載の「４位」におけるアミノ酸の修飾が、差別を減弱するのに使用される。他の有効な突然変異は、例えば、米国特許番号第７，１４８，０４９号に記載されている。
【００５８】
Ｖ．可逆的化学修飾
いくつかの実施形態において、本発明に使用するポリメラーゼには、ポリメラーゼがＤＮＡを変性するのに十分な温度まで、例えば、少なくとも６０℃、そして一般に約８０〜９５℃まで加熱されるまでそのポリメラーゼが実質的に減弱された活性を有するような可逆的修飾が含まれる。そのような修飾は、例えば、常温における核酸基質の非特異的伸長又は分解を予防するのに有用である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、酵素の活性は、酵素と阻害試薬の間の反応によって可逆的に防がれ、それが酵素の活性のすべて、又はほとんどすべて（例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％）の損失をもたらす。前記阻害試薬は、阻害が高温で可逆的であるように選ばれる。いくつかの実施形態において、前記阻害試薬は、上述の熱安定酵素のうちの１つを阻害することができる抗体である。任意に、抗体を使用する代わりに、前記酵素は、そのポリメラーゼの可逆的化学修飾をもたらす別の阻害試薬によって阻害できる。本発明に記載されているとおり、熱安定酵素の可逆的不活性化は、リジン残基の化学修飾によっておこなうことができる。例えば、リジンの化学修飾は、酸無水物によって実施できる（例えば、ＥＰ ０ ９６２ ５２６、米国特許番号第５，７７３，２５８号を参照のこと）。しかしながら、他のアミノ酸残基の化学修飾は、好適な特徴を有する修飾タンパク質をもたらすことができる。可逆的な様式でアミノ基と反応する多くの化合物が、文献に記載された。
【００６０】
例えば、アミノ基は、トリフルオロアセチル化（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ及びＡｎｆｉｎｓｅｎ、１９６２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：４１０を参照のこと）、アミジノ化（Ｈｕｎｔｅｒ及びＬｕｄｗｉｇ、１９６２、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８４：３４９１を参照のこと）、マレイル化（Ｂｕｔｌｅｒら、１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０３：７８を参照のこと）、アセトアセチル化（Ｍａｒｚｏｔｔｏら、１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６：５１７及びＭａｒｚｏｔｔｏら、１９６８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５４：４５０を参照のこと）、テトラフルオロスクシニル化（Ｂｒａｕｎｉｔｚｅｒら、１９６８、Ｈｏｐｐｅ‐Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４９：２６５を参照のこと）、及びシトラコニル化（Ｄｉｘｏｎ及びＰｅｒｈａｍ、１９６８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２‐３１４；並びにＨａｂｅｅｂ及びＡｔａｓｓｉ、１９７０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９（２５）：４９３９‐４９４４を参照のこと）により可逆的に修飾された。
【００６１】
リジン残基のε‐アミノ基の化学修飾のための代表的な試薬は、ジカルボン酸無水物である。米国特許番号第５，７７３，２５８号；米国特許広報番号第２００４／０１１５６３９号を参照のこと。そのため、いくつかの実施形態において、可逆的修飾ポリメラーゼは、酵素と修飾試薬の混合物の反応によって作製される。ここで上述の反応は、約２５℃未満の温度にてアルカリ性ｐＨでおこなわれ、ここで、上述の試薬は、以下の一般式：
【００６２】
【化１】
【００６３】
｛式中、Ｒ1及びＲ2は、水素又は有機基であり、それらは連結されていてもよい。｝又は以下の一般式：
【００６４】
【化２】
【００６５】
｛式中、Ｒ1及びＲ2は、有機基であって、それらは連結されていてもよく、そして水素は、シス配置である。｝
によって表されるジカルボン酸無水物であり、そしてここで、上述の反応は、酵素活性の事実上完全な不活性化をもたらす。
【００６６】
前記有機基は、炭素‐炭素結合によって、又は炭素‐ヘテロ原子結合、例えば炭素‐酸素、炭素‐窒素、若しくは炭素‐硫黄結合を通して、環に直接取り付けられてもよい。前記有機基は、例えば３，４，５，６‐テトラヒドロフタル酸無水物のように互いに連結して環構造を形成してもよい。
【００６７】
典型的な試薬の例としては、無水マレイン酸；置換された無水マレイン酸、例えばシトラコン酸無水物、シス‐アコニット酸無水物、及び２，３‐ジメチルマレイン酸無水物；エキソ‐シス‐３，６‐エンドオキソ‐Δ4‐テトラヒドロフタル酸無水物；並びに３，４，５，６‐テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられる。これらの試薬は、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、又はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．（Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）から市販されている。
【００６８】
Ｖ．鋳型核酸
標的核酸は、生体又は合成起源に由来することができる。標的は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。一般に、アンプリコンが作り出される場合には、アンプリコンはＤＮＡで構成されるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドもまた増幅産物に組み込まれ得る。当業者がＲＮＡを検出することを望む場合には、増幅工程は、通常、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を含めた逆転写の使用を伴うであろう。
【００６９】
具体的な標的配列としては、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボＢ１９ウイルス、エプスタイン‐バール・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス、及びクンジンウイルス）、細菌の核酸（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ミコバクテリア、真菌核酸、又は動物若しくは植物からの核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記標的核酸は、動物（例えば、ヒト）核酸であるか、又は動物（例えば、ヒト）のサンプル（すなわち、ウイルス又は他の病原菌核酸は、動物生検検体、血液サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、唾液などからのサンプル中に存在している可能性がある）に由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、例えば、疾患（例えば、癌、糖尿病など）に関連する変異を含む可能性があるヒト遺伝領域である。
【００７０】
ＶＩ．プライマー伸長反応
プライマー伸長反応条件は、一般に、オリゴヌクレオチドと標的の間にいくつかのミスマッチがあっても、全体でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするように設計されている。当業者は、プライマーとプローブの融解温度を決定でき、そして増幅温度がオリゴヌクレオチド・アニーリングのために十分低い温度、なおかつ、所望の量のプライマー特異性を達成するのに十分高い温度を許容するように制御できることを理解するであろう。
【００７１】
プライマー伸長に好適な条件は前記技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲を参照のこと。また、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）も参照のこと。一般に、プライマーを、標的核酸にアニールさせて、すなわち、ハイブリダイズさせて、プライマー‐鋳型複合体を形成させる。プライマー‐鋳型複合体を、好適な環境中、ＤＮＡポリメラーゼ及び遊離ヌクレオチドと接触させて、プライマーの３’末端への１又は複数のヌクレオチドの付加を可能にし、その結果、標的核酸に対して相補性を持つ伸長プライマーを生じさせる。本明細書中で議論したとおり、プライマーの伸長前に、オリゴヌクレオチドの３’部分の１又は複数のヌクレオチドが、ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって切り取られる。
【００７２】
プライマーは、例えば、１又は複数のヌクレオチド類似体を包含することができる。加えて、遊離ヌクレオチドは、通常のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識ヌクレオチド）、又はその混合物である。いくつかの変形形態において、プライマー伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対を使用した核酸増幅に好適な条件はまた、前記技術分野でも知られている（例えば、ＰＣＲ増幅法）。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲；Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲；ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９を参照のこと。その他の排他的ではない実施形態において、プライマー伸長反応はＲＮＡ鋳型の逆転写を含んでなる（例えば、ＲＴ‐ＰＣＲ）。例えば、改良された伸長速度、又はその他の形で改善されたプライマー伸長反応、例えば比較的短いインキュベーション時間でそういったポリメラーゼ伸長反応を実施する能力を可能にする、本突然変異ポリメラーゼの使用は、酵素濃度を下げ、及び／又は産物収量を増やす。
【００７３】
いくつかの実施形態において、側面に位置するが、標的ＳＮＰ位置に直接ハイブリダイズしないプライマーが、標的ＳＮＰ位置に隣接する（すなわち、標的ＳＮＰ部位から１、２、３つ、又はそれ以上のヌクレオチドの範囲内の）領域にプライマーがハイブリダイズするプライマー伸長反応に使用される。プライマー伸長反応中、特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が標的ＳＮＰ部位に存在していた場合に、プライマーは、通常、標的ＳＮＰ部位を通過して伸長することができないので、ＳＮＰ対立遺伝子が標的ＳＮＰ部位に存在していることを判断するためにプライマー伸長産物が検出され得る。例えば、特定のｄｄＮＴＰｓは、ｄｄＮＴＰが伸長産物に組み込まれた時点でプライマー伸長を終わらせるためにプライマー伸長反応に使用できる（例えば、プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物の３’最末端にｄｄＮＴＰを含有し、そしてそこでは、そのｄｄＮＴＰが検出されるべきＳＮＰのヌクレオチドである）。
【００７４】
特定の実施形態において、ＰＣＲ反応は、熱安定性酵素を用いる自動プロセスとして実施される。このプロセスにおいて、反応混合物は、変性ステップ、プローブ（及び任意に、プライマー）アニーリングステップ、そして開裂と置換がプライマー依存性鋳型伸長と同時に起こる合成ステップを通してサイクルさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、システムを用いて実施される。任意に、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から市販されているもののようなサーマルサイクラーは熱安定性酵素を用いた使用のために設計されており、これらを利用することもできる。
【００７５】
標的核酸へのプライマー又はプローブのハイブリダイゼーションは、適切なハイブリダイゼーション条件を選択することによって達成できる。オリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドの安定性は、通常、プライマー／プローブと標的核酸との間でのみ安定で検出可能なハイブリッドが形成されるような、アッセイ及び洗浄条件が適合するように選択される。１又は複数の異なるアッセイパラメータの操作により、特定のハイブリダイゼーションアッセイの正確な感度と特異性が決定される。
【００７６】
より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ，ＰＮＡ、又はＤＮＡ，ＲＮＡ及びＰＮＡの組み合わせの相補性塩基間でのハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度、緩衝液組成等において変動する広範囲の様々な条件下で起こる。これらの条件とそれらを適用するための方法の例は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｖｏｌ．２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ、前掲に記載されている。ハイブリダイゼーションは、一般に、約０℃〜約７０℃の間で、約１分〜約１時間の期間で起こり、ハイブリダイズさせる配列の性質とその長さに依存している。しかし、ハイブリダイゼーションが秒又は時間の単位で、反応条件に応じて起こり得ることは認識されている。例示すると、２種類の２０ｍｅｒの混合物についての典型的なハイブリダイゼーション条件は、その混合物を６８℃に置き、続いて室温（２２℃）まで５分間冷却し、又は２マイクロリットルで非常に低い温度、例えば２℃などで冷却する。核酸間のハイブリダイゼーションは、例えばＴｒｉｓ‐ＥＤＴＡ（ＴＥ）、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ及びＨＥＰＥＳなどの緩衝液、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ、ＣａＣｌ2）、又は他の水溶液、試薬及び化学物質を用いて促進することもできる。これらの試薬の例としては、例えば、Ｒｅｃ Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｅ．コリ一本鎖結合タンパク質及び主要な又はマイナーな核酸溝結合タンパク質などの一本鎖結合タンパク質が挙げられる。このような試薬及び化学物質の他の例としては、二価イオン、多価イオン及び、例えば、エチジウムブロマイド、アクチノマイシンＤ、ソラレン、及びアンゲリシンなどの相互作用物質が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＰＣＲを含めた）プライマー伸長反応は、「リアルタイム」で観察され、そしてそれは任意に定量的である。例えば、Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００４），Ｉｎｎｉｓら（編）を参照のこと。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許番号第６，１８０，３４９号；同第６，０３３，８５４号；及び同第５，９７２，６０２号、並びに、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６（１９９６）９９５‐１００１；ＤｅＧｒａｖｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４（２００３）１０６‐１０，１１２‐５；Ｄｅｉｍａｎ Ｂ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２）：１６３‐７９（２００２）に開示されている。
【００７８】
試料中の特定のＲＮＡの量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドのランオフ転写から標準曲線を作成することもできる。標準曲線は、アッセイにおいて用いられる初期ｃＤＮＡ濃度に関連する、リアルタイムＰＣＲで測定された閾値（Ｃｔ）値を用いて作成することもできる。加えて、標準曲線は、標準ポリヌクレオチド（例えば、前もって定量された配列）に関して作成することもできる。このことは、比較目的のための標準の量に対する生体サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化を可能にする。例えば、Ｔｈｅ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（Ｊ．Ｌａｒｒｉｃｋ（編）１９９７）を参照のこと。
【００７９】
プライマー伸長（増幅を含む）産物の検出のためのあらゆる方法が使用できる。いくつかの実施形態において、反応産物に特異的に結合した（すなわち、ハイブリダイズした）標識核酸プローブが、産物の蓄積を検出するのに使用される。増幅産物の検出のための１つの方法が、（例えば、ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ４８ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いた）５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイである。例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６‐７２８０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３７６１‐３７６６（１９９３）；米国特許番号第６，２１４，９７９号；同第５，８０４，３７５号；同第５，４８７，９７２号；及び同第５，２１０，０１５号を参照のこと。このアッセイは、増幅反応中の二重標識蛍光発生プローブのハイブリダイゼーション、そして開裂によって特定のＰＣＲ産物の蓄積を検出する。蛍光発生プローブは、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素の両方で標識された（例えば、所望の標的核酸又はその相補体にハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドからなり得る。ＰＣＲ中に、このプローブは、それが増幅されているセグメントにハイブリダイズした場合に、ＤＮＡポリメラーゼの５’‐ヌクレアーゼ活性によって開裂され、開裂されるのはその場合のみである。プローブの開裂によって、レポーター色素の蛍光強度の増加が生じる。
【００８０】
エネルギー移動の使用に依存する増幅産物を検出する別の方法は、Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３‐３０９（１９９６））によって記載された「分子ビーコンプローブ」法であり、これはまた、米国特許番号第５，１１９，８０１号及び同第５，３１２，７２８号の対象でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用する。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端（５’又は３’ 末端のいずれか）には、供与体フルオロフォアがあり、もう一方の末端には、受容体部分がある。Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒの方法の場合、この受容体部分はクエンチャーである、つまり、供与体によって放出されたエネルギーを受容体が吸収するが、このとき、それ自身は蛍光を発しない。よって、ビーコンがヘアピン（閉じた）構造にある場合には供与体フルオロフォアの蛍光がクエンチされるが、ビーコンが開いた構造にある場合、供与体フルオロフォアの蛍光は検出可能である。ＰＣＲで使用される場合、ハイブリダイズしないままのものは蛍光を発しないが、ＰＣＲ産物の鎖の一つにハイブリダイズした分子ビーコンプローブは、「開いた構造」であり、蛍光が検出される（Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３‐３０６（１９９６）。その結果、ＰＣＲ産物の量が増加すると蛍光の量が増加し、そのため、ＰＣＲの進行の尺度として用いられ得る。
【００８１】
リアルタイムＰＣＲ法に有用な他のタイプのプローブとしては、Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｃ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）製の「単標識」及び「二重標識」形式で利用可能なＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブが挙げられる。また、Ｂａｔｅｓら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２（５）：２７５‐２８０（２００１）も参照のこと。当業者は、他の定量的増幅の方法もまた利用可能であることを認識しているであろう。
【００８２】
ＶＩＩ．反応混合物
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬の反応混合物を提供する。反応混合物は、例えば、ポリメラーゼ３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなることができる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明の反応混合物に任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。
【００８３】
任意に、反応混合物はまた、生体サンプル（例えば、生物体からの核酸）も含んでなる。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、鋳型核酸を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの３’部分は、鋳型核酸に対して７０〜１００％の相補性を持つか、そうでなければ、本明細書中に記載した鋳型に対して相補性を持つ。
【００８４】
ＶＩＩＩ．キット
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬のうちの１つ又は複数を含んでなるキットも提供する。いくつかの実施形態において、前記キットは、例えば、ポリメラーゼ３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明のキットに任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。本発明のキットは、任意に、取扱説明書を含むことができる。そういった取扱説明書は、紙、（例えば、ＣＤ‐ＲＯＭ又はＤＶＤによる）電子的なもの、又は他の形態であることができる。
【００８５】
ＩＸ．システム
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のプライマー伸長反応を実施する、及び／又はその結果を検出するための統合システムを提供する。前記システムには、特に、プライマー伸長反応の結果を導き出す手段にアルゴリズム、及び／又は電子的に保存された情報（例えば、回収された蛍光データ、伸長産物に関する予定された選択肢など）を含んでなる場合、回収されたデータを解釈し、そして分析する計装と手段を含むことができる。前記統合システムの各部分は、機能的に相互接続されることができ、場合によっては、物理的に接続されることができる。いくつかの実施形態において、前記統合システムは、自動化されていて、そこでは、分析開始後に操作者によるサンプル又は計装に関していずれの操作も必要としない。
【００８６】
本発明のシステムは、計装を含むことができる。例えば、本発明は、例えば、蛍光検出器（例えば、分光蛍光光度計）などの検出装置を含むことができる。単数又は複数の検出装置が、例えば、蛍光の変化として計測される場合には、例えば、プライマー伸長反応を観察又は計測するために本発明に関連して使用されることがある。検出装置は、アッセイの高速大量処理を容易にするためにマルチウェルプレート・リーダーの形をとることがある。
【００８７】
いくつかの実施形態において、前記統合システムは、反応物の温度を制御する目的のために、温度サイクリングデバイス又はサーモサイクラーを含む。いくつかの実施形態において、温度サイクリングデバイスと検出装置は、温度サイクリングと発光検出（例えば、蛍光検出）が同じデバイス内でおこなわれる統合装置である。
【００８８】
検出装置、例えば分光蛍光光度計は、分光光度計の操作パラメーター（例えば、励起波長、及び／又は検出される発光波長）を制御する、及び／又は検出装置から回収されたデータ（例えば、増幅サイクル中の蛍光測定値）の記憶のためにコンピューターに接続されている。前記コンピューターはまた、システムの温度変化の温度、タイミング、及び／又は速度を制御するために、温度サイクリングデバイスに稼動できるように接続されてもよい。前記統合コンピュータはまた、検出装置から回収されたデータを（電子的に）分析する「相関モジュール」を含むこともできる。いくつかの実施形態において、前記相関モジュールは、例えば、可能性のある出力に関するデータベースを用いて作成されたデータを比較することによって、作成されたデータ、例えば、ウイルス若しくは他の病原菌の存在又は不存在を判断する、検出されるべきＳＮＰ若しくは他の潜在的標的の存在又は不存在、の分析のためのコンピュータプログラムを含んでなる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、検出装置は、例えば（例えば、容器中、固体支持体上などで）あるアッセイシステムの別の成分中又はそれに近接して産生された検出可能シグナルを検出するための構造となっている。任意に利用されるか又は使用のために適応させた好適なシグナル検出装置は、本明細書中では、例えば、蛍光、リン光、放射能、吸光度、屈折率、発光、質量などを検出する。検出装置は、任意に、例えば、あるアッセイステップの実行の開始時点、及び／又は終了時点からの１つ又は複数のシグナルを観察する。たとえば、検出装置は、任意に、位置的に“リアルタイム”な結果に相当する複数の光シグナルを観察する。例示的な検出装置又はセンサーとしては、光増倍管、ＣＣＤアレイ、光センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセンサー、伝導度センサー、走査型検出装置などが挙げられる。本発明の方法を実施する際に任意に利用されるさらに具体的な例示的な検出装置としては、例えば、共鳴光分散検出装置、発光分光器、蛍光分光器、リン光分光器、発光分光器、分光光度計、光度計などが挙げられる。検出装置はまた、例えば、Ｓｋｏｏｇら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第５版、Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８）及びＣｕｒｒｅｌｌ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）にも記載されている。
【００９０】
本発明のシステムにはまた、通常、システムの１又は複数のコンポーネント（例えば、検出装置、熱調節器、流体移動コンポーネント等）と稼動できるように接続されたコントローラーが含まれ、前記コンポーネントの稼動を制御する。さらに詳細に述べると、コントローラーは、例えば、検出装置からのデータの受け取る、容器中の温度を生じる及び／又は制御する、選択された容器への又はそれからの流体の流れを生じる及び／又は制御する等、のために利用される別々の又は統合されたシステムコンポーネントとして広く含まれている。コントローラー及び／又は他のシステムコンポーネントは、任意に、適当にプログラミングされたプロセッサー、コンピュータ、デジタルデバイス又は他の情報家電（例えば、必要に応じて、アナログからデジタル又はデジタルからアナログへのコンバーターを含む）と結合され、それは、事前にプログラミングされたか又はユーザー入力指示に従ってこれらの機器の稼動を指示し、これらの機器からデータ及び情報を受け取り、及びこの情報を解釈し、操作しかつユーザーに報告するように作動する。適切なコントローラーは、広く前記技術分野で公知であり、さまざまな商業的な供給業者から入手可能である。
【００９１】
コントローラー又はコンピュータはいずれも任意にモニターを含み、それは、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ等）等であることが多い。コンピュータ回路はボックス内に収められていることが多く、それには、例えば、マイクロプロセッサー、メモリ、インターフェイス回路等といった多数の集積回路チップが含まれる。前記ボックスはまた、任意に、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、例えば書き込み可能なＣＤ‐ＲＯＭのような大容量リムーバブルドライブ、及び他の一般的な周辺機器要素が含まれる。例えばキーボード又はマウスなどの入力デバイスは、任意に、ユーザーからの入力のために提供される。これらのコンポーネントは、さらに下文で例示される。
【００９２】
前記コンピューターは、通常、例えば、ＧＵＩにおいてパラメータフィールドセットへのユーザー入力の形態、又は、例えば、様々な異なる具体的操作のために事前にプログラミングされたプログラム済指示の形態のいずれかにおいて、ユーザー指示を受け取るための適切なソフトウェアを含む。次に、前記ソフトウェアは、これらの指示を適切な言語に変換し、１又は複数のコントローラーの稼動を指示し、所望の操作をおこなう。次に、コンピューターは、例えば、システム内部のセンサー／検出装置からデータを受け取り、このデータを解釈し、ユーザーが理解できるフォーマットでそれを提供するか、又はこのデータを用いて重量尺度等から得た流体重量データに対応して流体流れ制御器を制御することなどさらなるコントローラー指示を開始する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ミスマッチ校正に関する略図を提供する。プライマー配列の中の２つのＴ（下線）は標的に対するミスマッチである。ＤＮＡポリメラーゼは、それを伸長する前にプライマー上のミスマッチを取り除く。プライマーは、プライマー配列内の２’アミノ修飾によってさらに酵素的分解から保護される。この過程は、その標的に完全に一致するプライマーを作り出す。
【図２Ａ】実施例で使用したプライマー（配列番号１〜４）及び鋳型（配列番号５〜８）を提供する。
【図２Ｂ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（左のパネル）又は３’‐５’ エキソヌクレアーゼ活性を持っている（右のパネル）ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応におけるマッチ及びミスマッチ・プライマーに関してサイクル数の関数として産物の蓄積を例示する。
【図２Ｃ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼを含む反応に関するＣｔの平均差を例示する。
【図３】異なる酵素及びベンジル化プライマーの有無に関係するマッチ及びミスマッチ・プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【図４Ａ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（「なし」）ポリメラーゼだけを使用した、又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼのかなりの量をさらに含む、ＨＩＶ標的配列向けのマッチ（Ａ）及びミスマッチ（Ｂ）プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【図４Ｂ】３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている（「なし」）ポリメラーゼだけを使用した、又は３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているポリメラーゼのかなりの量をさらに含む、ＨＩＶ標的配列向けのマッチ（Ａ）及びミスマッチ（Ｂ）プライマーの平均Ｃｔ値を例示する。
【実施例】
【００９４】
ＰＣＲ及びＲＴ／ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼは、一般に、プライマーの３’末端付近にミスマッチを含んでいて標的を増幅するのが困難である傾向がある。残念ながら、これは、例えば、ＨＩＶやＨＣＶの診断アッセイにおける標的など顕著な配列不均一性を有する標的に関してよく観察される。３’末端においてミスマッチを誤伸長してしまうＤＮＡポリメラーゼの能力低下は、プライマーがアルキル化によって修飾されているとき、よりいっそう顕著である。プライマーのアルキル化はプライマー／二量体効果を低減するが（例えば、米国特許番号第６，００１，６１１号；同第６，７９４，１４２号を参照のこと）、しかし、本発明の方法はアルキル化プライマーを用いることなく実施される。これらの末端ミスマッチの影響を最小限にする１つの方法論が、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長する前にミスマッチを完全に取り除くことである。我々は、ミスマッチ不耐性を緩和するために修飾された３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を評価し、そしてプルーフリーディング活性を欠いている酵素とそれらを比較した。ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性は、プライマー配列内の２’アミノ修飾塩基の使用によって妨げることができる。我々は、プルーフリーディング分解の所望の程度を提供するようにこれらのブロック基を有するプライマーを設計した。末端から二番目の塩基（すべてのプルーフリーディングを妨げるため）又は３’末端の潜在的ミスマッチの上流（３’末端のプルーフリーディングを可能にするが、酵素がさらにオリゴヌクレオチドを分解しないようにするため）において２’アミノ修飾を用いてプライマーを設計した。これらの研究の結果は、プルーフリーディング活性はＤＮＡポリメラーゼがこれらのミスマッチ標的を効率的に増幅することを可能にすることを実証している。よって、我々は、オリゴヌクレオチドプライマーの下での配列不均一性によって検証される増幅系の性能を改善するためのアプローチを実証した。
【００９５】
キメラＤＮＡポリメラーゼ、ＣＳ５を、サーマス属Ｚ０５からの５’‐３’エキソヌクレアーゼドメインと、サーモトガ・マリチマからの３’‐５’エキソヌクレアーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼドメインを組み合わせることによって作製した。Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと。このＤＮＡポリメラーゼを、約１０％のプルーフリーディング活性を保有するＣＳ５Ｌ（突然変異Ｌ３２９Ａを持つＣＳ５）及びプルーフリーディングを欠いているＣＳ６を用いた、弱化プルーフリーディング活性を有するキメラ変異ＤＮＡポリメラーゼのコレクションの作製のために使用した。Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１２７８６‐１２７９５（２００６）を参照のこと。突然変異誘発の第２ラウンドでは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの存在下、用意されたＭ１３ＤＮＡ鋳型において改善された伸長速度を有する酵素を選択した。ＣＳ５Ｌ突然変異体のうちのいくつかが、長い高感度ＲＴ／ＰＣＲを実施する能力を示した。最も有望な突然変異体は、Ｄ６４０Ｇであった。我々は、これらの突然変異体をＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ骨格から野性型Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼドメインに移した。Ｔｍａ６Ｄ及びＴｍａＬＤ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ６４０Ｇ「高速伸長因子」突然変異を含むが、Ｔｍａ６Ｄはプルーフリーディング活性を欠き、そしてＴｍａＬＤはプルーフリーディング活性が減少した。同様に、我々は、相同Ｄ６４０Ｇ ＤＮＡポリメラーゼドメイン変異をＣＳ５からＺ０５に移した（Ｄ５８０Ｇ）。
【００９６】
ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性は、プライマー配列内の２’アミノ修飾塩基の使用によって制限される。プライマーを、末端から二番目の塩基（プルーフリーディングを完全に妨げるため）、又は３’末端の潜在的ミスマッチの上流であるプライマーのＮ−６位（限定されたプルーフリーディングを可能にするため）のいずれかに２’アミノ修飾を用いて設計した。これらのプライマーを、２’アミノ修飾を含まないアルキル化プライマーと比較した。プライマーの３’末端のミスマッチによって引き起こされた性能低下を緩和するために、修飾されたプルーフリーディング活性を有する酵素の使用と、新しいＤＮＡポリメラーゼの使用を評価した。
【００９７】
酵素活性
図１は、ミスマッチ校正に関する略図を提供する。プライマー配列の中の２つのＴは標的に対するミスマッチである。ＤＮＡポリメラーゼは、それを伸長する前にプライマー上のミスマッチを取り除く。プライマーは、プライマー配列内の２’アミノ修飾によってさらに酵素的分解から保護される。この過程は、その標的に完全に一致するプライマーを作り出す。
【００９８】
マッチ及びミスマッチ標的のＲＴ／ＰＣＲ
図２Ａは、ＨＩＶのＧＡＧ領域の増幅に使用したプライマーと鋳型を示している。図２Ｂは、（３’部分の）完全に一致した転写産物又はミスマッチ転写産物（Ｔ９７５９９‐１）のいずれかを使用した１５分間のＲＴステップによるＨＩＶ ＲＴ／ＰＣＲ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）の結果を示している。ＲＴプライマー上の２’アミノ修飾は、末端から二番目の位置（−１）、又はプライマー３’末端からＮ−６位に存在した。
【００９９】
Ｔｍａ６Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ（プルーフリーディング活性なし）では、２’アミノ修飾プライマー（−１と−６）を用いたミスマッチ標的に関して〜８Ｃｔの遅延があった。プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＴｍａＬＤでは、−１位２’アミノ修飾プライマーを用いたミスマッチ標的に関しては〜６サイクルの遅延があるが、−６位アミノ修飾プライマー（２’アミノ基はミスマッチの上流）を用いると遅延は１サイクルより少なかった。Ｃｔの差もまた、図２Ｃに例示されている。
【０１００】
アルキル修飾プライマーを用いた増幅
３’末端のミスマッチを伸長する難しさは、（より大きいＣｔ遅延を引き起こす）プライマーがベンジル基で修飾されているときに深刻になる。図３を参照のこと。Ｔｍａ６Ｄ ＤＮＡポリメラーゼは、ベンジル化プライマーと共にミスマッチ標的を使用することで〜１５サイクルの遅延を示すのに対して、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＴｍａＬＤは＜１サイクルの遅延しか示さなかった。ＴｍａＬ ＤＮＡポリメラーゼ（同様にプルーフリーディング酵素）は、ミスマッチ標的に関して〜７サイクルの遅延を示す。これらの結果は、プルーフリーディング活性がミスマッチ標的の増幅の改善に関与し、そしてＴｍａのＤ６４０Ｇ突然変異がさらにそれを改善したことを示唆している。これらの結果は、アルキル化プライマーがＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性によって分解されることを裏付けている。
【０１０１】
ＨＩＶ‐１ＭＭＸに添加されたプルーフリーディング酵素
プルーフリーディング酵素ＣＳ５Ｇ又はＣＳ５ＧＬを、ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶ‐１試験の製品版Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ中に混入した。０．１ＵのＣＳ５Ｇ又は１ＵのＣＳ５ＧＬ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを加えたとき、好ましい結果を得た。図４Ａ及び４Ｂを参照のこと。ミスマッチ標的Ｔ９７５９９‐１を使用して、０．１ＵのＣＳ５Ｇ又は１ＵのＣＳ５ＧＬ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかの添加は、単独のＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、８．５〜１１．６サイクル早いＣｔを示した。定量標準（ＱＳ）は、それぞれ２．１〜３．９サイクル早いＣｔを示した。よって、プルーフリーディング酵素の添加は、このミスマッチ転写産物に関してより正確なコピー数測定につながる。マッチ標的であるＥＦ０２１を用いると、結果は、添加が定量におけるわずかな変化しか引き起こさなかったことを示した。
【０１０２】
結論
我々は、ミスマッチ鋳型によって検証される増幅系の性能を改善する多様なアプローチを実証した。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴｍａＬＤ）のプルーフリーディング活性が、プライマーの３’末端にミスマッチを持つ標的を首尾よく増幅することを示した。プルーフリーディングの程度を制限した、すなわち、プライマー配列の末端から二番目の位置に２’アミノ修飾ヌクレオチドを持つプライマーを使用したとき、増幅は、非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを使用したかのように振る舞った（Ｔｍａ６Ｄと同程度）。しかしながら、２’アミノ修飾形態をミスマッチの上流に配置したとき、ミスマッチを通過して２’アミノ基の１塩基前までの分解が、その標的と完全に一致したプライマーを可能にし、その結果、増幅が改善された。
【０１０３】
アルキル修飾が、（より大きなＣｔ遅延を引き起こして）３’‐ミスマッチを伸長する難しさを深刻にする。これらの結果は、プルーフリーディング活性が、ミスマッチ標的の増幅を改善するのに関与し、そしてＴｍａ（Ｚ０５のＤ５８０Ｇ）のＤ６４０Ｇ突然変異がさらにそれを改善したことを示唆している。これらの結果は、ベンジル化プライマーがＤＮＡポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性によって分解されることを裏付けている。
【０１０４】
現在のＺ０５ベースのウイルスＴａｑＭａｎ試験へのプルーフリーディング酵素の添加は、オリゴヌクレオチドプライマーの下の配列不均一性によって検証される既存の増幅系における性能改善の解決策となる可能性がある。
【０１０５】
Ｔｍａ及びＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼで特徴とされる特異的突然変異は、ミスマッチ鋳型が生じるとき、アルキル化プライマーを使用したシステムにおいて二重の利益をもたらすことができる。Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ６４０Ｇ突然変異、及びＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ５８０位の突然変異（例えば、Ｚ０５Ｄなどの）は３’修飾プライマーの伸長を改善するので、ミスマッチ耐性を改善する。
【０１０６】
本明細書中に記載した実施例及び実施形態が例示目的のためだけに存在すること、そしてそれを考慮した様々な修飾形態又は変更が当業者に示され、且つ、本出願の要旨と添付の請求項の範囲の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー伸長反応の実施方法であって、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）鋳型核酸及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで：
ｉ．前記オリゴヌクレオチドが、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり；
ｉｉ．前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく；
ｉｉｉ．前記オリゴヌクレオチドには３’部分と５’部分があり、ここで、当該３’部分が、前記修飾ヌクレオチドの３’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記５’部分が、前記修飾ヌクレオチドの５’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり；並びに
ｉｖ．前記オリゴヌクレオチドの３’部分が鋳型核酸に対して１００％の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの３’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され；そして
ｂ．前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドが、蛍光部分を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドを含んでなる反応混合物であって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、当該修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記反応混合物。
【請求項６】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項５に記載の反応混合物。
【請求項７】
鋳型核酸をさらに含んでなる、請求項５又は６に記載の反応混合物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドを含んでなるキットであって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記修飾ヌクレオチドが、３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、またオリゴヌクレオチドの３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記キット。
【請求項９】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、Ｏ‐メチル、‐ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
生体サンプル中の生物学的実体の有無、又は量の検出方法であって、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち；
ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、生物学的実体由来の核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ；
ｃ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し；そして
ｄ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は有無に相関させる、
を含んでなる前記方法。
【請求項１３】
前記定量ステップが、定量的リアルタイムＰＣＲを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲが、オリゴヌクレオチドとウイルス核酸の間に０、１、２、又は３つのミスマッチが存在するか否かに関係なくオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下でのステップを含んでなり、そしてここで、前記オリゴヌクレオチドには、生物学的実体からの核酸との１つ又は複数のミスマッチがあり、且つ、ここで、前記ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が前記オリゴヌクレオチドを校正して、ポリヌクレオチド産物に対して完全な相補性を持つポリヌクレオチド産物をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記実施ステップが、そのうちの一部が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている１つ又は複数のポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
プライマー伸長反応の実施方法であって、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）鋳型核酸及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで：
ｉ．前記オリゴヌクレオチドが、３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり；
ｉｉ．前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく；
ｉｉｉ．前記オリゴヌクレオチドには３’部分と５’部分があり、ここで、当該３’部分が、前記修飾ヌクレオチドの３’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記５’部分が、前記修飾ヌクレオチドの５’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり；並びに
ｉｖ．前記オリゴヌクレオチドの３’部分が鋳型核酸に対して１００％の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの３’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され；そして
ｂ．前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、Ｏ‐メチル、ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２〜１０ヌクレオチドの間に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドが、蛍光部分を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドを含んでなる反応混合物であって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、当該修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、また３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記反応混合物。
【請求項６】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項５に記載の反応混合物。
【請求項７】
鋳型核酸をさらに含んでなる、請求項５又は６に記載の反応混合物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドを含んでなるキットであって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記修飾ヌクレオチドが、３’又は５’末端ヌクレオチドではなく、またオリゴヌクレオチドの３’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記キット。
【請求項９】
３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から３〜１０ヌクレオチドの間に存在する、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、Ｏ‐メチル、‐ＯＨ、Ｏ‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される２’部分を含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
生体サンプル中の生物学的実体の有無、又は量の検出方法であって、以下のステップ：
ａ．オリゴヌクレオチドを、（ｉ）生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び（ｉｉ）３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち；
ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、生物学的実体由来の核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ；
ｃ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し；そして
ｄ．ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は有無に相関させる、
を含んでなる前記方法。
【請求項１３】
前記定量ステップが、定量的リアルタイムＰＣＲを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲが、オリゴヌクレオチドとウイルス核酸の間に０、１、２、又は３つのミスマッチが存在するか否かに関係なくオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下でのステップを含んでなり、そしてここで、前記オリゴヌクレオチドには、生物学的実体からの核酸との１つ又は複数のミスマッチがあり、且つ、ここで、前記ポリメラーゼの３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性が前記オリゴヌクレオチドを校正して、ポリヌクレオチド産物に対して完全な相補性を持つポリヌクレオチド産物をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記実施ステップが、そのうちの一部が３’‐５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている１つ又は複数のポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５３０３０１（Ｐ２０１１−５３０３０１Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２４２１（Ｐ２０１１−５２２４２１）
【出願日】平成２１年８月８日（２００９．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００５７７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７９３２
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月８日（２００９．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００５７７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７９３２
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]