プレバイオティックオリゴ糖６−ケストースを得るための新規フルクトフラノシダーゼ活性
本発明は、プレバイオティックオリゴ糖６−ケストースを得るための新規フルクトフラノシダーゼ活性に関する。本発明の１つの目的は、シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（特にＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ７４１０、ＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株）の細胞外インベルターゼに関連した新規トランスフルクトシラーゼ活性であって、食品産業において広く使用されているプレバイオティックオリゴ糖、主として６−ケストースを得るために使用可能である、新規トランスフルクトシラーゼ活性をキャラクタライズすることである。本発明のもう１つの目的は、酵素製品を得るための方法、並びにフルクトフラノシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー産業に含まれ、特に、食料品、乳製品、育児食、及び動物用の餌における機能性成分として使用されるためのプレバイオティックオリゴ糖を得るべく供された、食品及び農業部門に含まれる。本発明はまた、医薬及び化粧品産業の分野にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は、自然界で最も豊富な生体物質であり、非常に多様な産業プロセスにおいて、出発物質として使用されており；それ故、それらの代謝に関与する酵素には、基礎的及び技術的の視点の双方から、多大な興味がもたれている。
【０００３】
食品の機能性成分としてのプレバイオティックオリゴ糖の分野は、この数年のうちに劇的に発展してきた。
【０００４】
用語、プレバイオティックは、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）及びロバートフロイド（Ｒｏｂｅｒｔｆｒｏｉｄ）により導入されたが、彼らはプレバイオティックを、１又は限られた群の細菌の、結腸における増殖及び／又は活性の選択的刺激により、宿主に有益な影響を及ぼす非消化性の食品成分として定義した。
【０００５】
欧州市場に対する主要なプレバイオティック分子は、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）である（サンギータ（Ｐ．Ｔ．Ｓａｎｇｅｅｔｈａ）、アームズ（Ｍ．Ｎ．Ａｒｍｓ）、プラプーラ（Ｓ．Ｇ．Ｐｒａｐｕｌｌａ）著、「フルクトイオリゴ糖の微生物産生、分析、及び適用における最近の傾向（Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、トレンズ・イン・フード・サイエンス・アンド・テクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．ｔｅｃｈｍｏｌ．）」、２００５年、第１６巻、ｐ．４４２−４５７）。これまでに記載されたフルクトオリゴ糖には、３つのタイプがある。最も知られているフルクトオリゴ糖（１Ｆシリーズ）は、現在販売されているものであって、β，２−１結合により、一端においてグルコース分子と結合されたフルクトース分子により形成され（ユーン（Ｊ．Ｗ．Ｙｕｎ）著、「フルクトオリゴ糖：発生、調製、及び適用（Ｆｒｃｕｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」、１９９６年、第１９巻、ｐ．１０７−１１７）、ＧＦｎと略記され、ｎは典型的には２と４の間に含まれる（ケストース、ニストース、及びフルクトシルニストース）。第２のタイプ（６Ｆシリーズ）のフルクトオリゴ糖は、フルクトース分子がβ，２−６結合により、非還元末端においてグルコースと結合されており、徹底研究中である。これらのＦＯＳ分子は、自然界では通常、高分子量ポリマーの形状（レバン）で検出される。ネオケストースは、フルクトースがスクロース中のグルコース単位へβ，２−６結合により結合されている三糖類であり、Ｇ６シリーズの第１の代表である（第３のタイプのＦＯＳ）。３つのタイプのＦＯＳは、上部腸管における消化に抵抗性があり、結腸の内在性細菌により代謝される。それらは、ビフィドバクテリアの増殖を刺激する能力を有することが示されてきた（ラオ（Ａ．Ｖ．Ｒａｏ）著、「腸管ビフィズス菌特異効果に対するイヌリン及びオリゴフルクトースの用量反応効果（Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｓｆｒｕｃｔｏｓｅ ｏｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）、ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリション（Ｊ．Ｎｕｔｒ．）」、１９９８年、第８０巻、ｐ．１４４２Ｓ−１４４５Ｓ）。ＦＯＳは、天然多糖（イヌリン、レバン、その他）の部分加水分解により、或いはスクロースからの酵素合成により取得可能である。双方の方法論により生成される、産物のプロフィール（特に平均重合度に関して）は、かなり異なっており、そのことがそれらの特性に影響を及ぼしている。
【０００６】
１Ｆシリーズのフルクトオリゴ糖についての、イヌリンからの加水分解経路によるか、又は、スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．９．）、β−フルクトフラノシダーゼ −インベルターゼ−（ＥＣ ３．２．１．２６）を用いることによる、及びさらにはレバンスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１０）による、合成経路による製造（トルヒージョ（Ｌ．Ｅ．Ｔｒｕｊｉｌｌｏ）ら著、「メチロトローフ酵母ピキア・パストリスにおいて発現されるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスのレバンスクラーゼによる、フルクトオリゴ糖の製造（Ｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ｌｅｖａｎｓｃｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．）」、２００１年、第２８巻、ｐ．１３９−１４４）が、記載されてきた。いくつかのインベルターゼを用いて達成された合成収率は、全オリゴ糖の４％を超えず、一方１−フルクトシルトランスフェラーゼでは、達成可能な収率はずっと高い（５０−６０％）（アントソバ（Ｍ．Ａｎｔｏｓｏｖａ）、ポラコビック（Ｍ．Ｐｏｌａｋｏｖｉｃ）著、「フルクトロシルトランスフェラーゼ：フルクトオリゴ糖の産生を触媒する酵素（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｏｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ケミカル・ペーパーズ（Ｃｈｅｍ．Ｐａｐ．）」、２００１年、第５５巻、ｐ．３５０−３５８）。１ＦシリーズのＦＯＳは、現在、合成機能において、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のβ−フルクトフラノシダーゼを、３−５単位の短鎖オリゴ糖の生成のために用いて、工業的に製造されている（バニーウエンブルク（Ｃ．Ｖａｎｎｉｅｅｕｗｎｂｕｒｇｈ）ら著、「高静水圧下のアスペルギルス・ニゲルフルクトシル−トランスフェラーゼによる糖転換の動態検査及び数学的モデル（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、バイオプロセス・アンド・バイオシステムズ・エンジニアリング（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓ．Ｅｎｇ．）」、２００２年、第２５巻、ｐ．１３−２０）。トランスフルクトシダーゼ活性をもつ他の酵素は、オーレオバシジウジム・プレランス（Ａｕｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、又はアスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のような菌類において記載されてきた（チェン（Ｃ．Ｓ．Ｃｈｉｅｎ）ら著、「フルクトオリゴ糖製造のための、細胞をグルテン中に閉じ込めることによるアスペルギルス・ジャポニクスの固定（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｓ ｂｙ ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｕｔｅｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー」、２００１年、第２９巻、ｐ．２５２−２５７）。
【０００７】
６Ｆシリーズの低分子量フルクトオリゴ糖は、レバンポリマーから酸加水分解により取得される。合成経路では、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼからの１−ケストース形成における、少数の生成物としての６ＦシリーズのＦＯＳ形成が報告されているにすぎない（ベカーズ（Ｍ．Ｂｅｋｅｒｓ）ら著、「ジモモナス・モビリス細胞外レバンスクラーゼのフルクトオリゴ糖及びレバン産生活性（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｌｅｖａｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｚｙｍｏｍｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、プロセス・バイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、２００２年、第３８巻、ｐ．７０１−７０６）。今日まで文献において参照された研究においては、酵母クサントフィロミケス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（ファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）とも呼ばれる）の、又はいくつかの菌類（例えば（ペニシリヌム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｍｕｎ）、固定細胞）（リー（Ｌｅｅ）ら著、「ペニシリヌム・シトリヌム細胞を用いた、スクロースからの新規フルクトオリゴ糖の酵素的製造のための反応経路（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｃｒｏｓｅ ｕｓｉｎｇ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｍｕｍ ｃｅｌｌｓ）、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、２００１年、第３９巻、ｐ．３３１−３３３；パーク（Ｐａｒｋ）ら著、「ペニシリヌム・シトリヌムの全細胞の固定による、新規フルクトオリゴ糖の連続的製造（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」、２００５年、第２７巻、ｐ．１２７−１３０）の全細胞が、６Ｇシリーズのフルクトオリゴ糖の製造に使用されている。特許は、マルトースから、マルト−及びイソオリゴ糖を生成することが可能な高スペクトルのトランスグリコシラーゼ活性をもつ、Ｘ．デンドロロウスの細胞外α−グルコシダーゼ（Ｐ２００４０２９９４、ＵＡＭ−ＣＳＩＣ）について、及び、６Ｇシリーズ（特にネオケストース）及び１Ｆ（特に１−ケストース）のフルクトオリゴ糖の形成が可能なトランスフルクトシダーゼ活性をもつ、この酵母の細胞外フルクトフラノシダーゼ（Ｐ２００５０１８７５，ＵＡＭ−ＣＳＩＣ）について出願されてきた。
【０００８】
ＦＯＳの、それを消費するヒトへの影響は、非常に多様であり得る：ロタウイルスにより引き起こされる下痢事例の減少；乳糖不耐性症の改善；糞便量の増加による便秘の管理；カルシウム吸収の増加、及び結果としての骨粗鬆症のリスク低減；大腸癌に関連するニトロレダクターゼのような、ある微生物酵素の突然変異誘発能の低減；脂質代謝異常に関連した疾患の予想される低減、その他。
【０００９】
酵母シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（デバリオミセス・オシデンタリス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）も）は、多様な有機化合物を炭素源として使用することができる（グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、クエン酸塩、エタノール、プルラン、デキストリン、その他）。バイオテクノロジーにおいては、この生物は、それが極めて効率的なデンプン分解システムを示し、そのことが、デンプンを主成分とする培地におけるその増殖を可能するという理由から使用されてきた（ＵＳＰ ４７９４１７５）。Ｓ．オシデンタリスは、ラクトースを主成分とする培地中で、インベルターゼ活性を発現及び分泌する（コスタグリオリ（Ｐ．Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌｉ）ら著、「シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼ分泌（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、バイオテクノロジー・レターズ」、１９９７年、第１９巻、ｐ．６２３−７）。該酵素は、スーパーロース（Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ）１２及びモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑに基づくデュアルＦＰＬＣシステムを用いて精製され（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「新規な工業用酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼの精製及びキャラクタリゼーション（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｙｅａｓｔ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、プレパラティブ・バイオケミストリー（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、１９８９年、第１９巻、ｐ．２９３−３１９）、かつコード遺伝子はシーケンスされた（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼをコードする遺伝子のクローニング及び配列分析（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｎｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、カレント・ジェネティクス（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．）」、１９８９年、第１６巻、ｐ．１４５−５２；配列番号Ｘ１７６０４）。ヌクレオチド配列から演繹されたアミノ酸配列は、５３３個のアミノ酸を有する（アクセス番号 Ｐ２４１３３）。それにもかかわらず、種々の基質に対するその活性、又はそのフルクトシルトランスフェラーゼ能に関係するデータは何ら入手されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プレバイオティックオリゴ糖の産業的重要性を考慮すれば、産業上実行可能であるそれらを取得するための、酵素及び方法を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、プレバイオティックオリゴ糖、主として６−ケストースを得るために有用な、シュワンニオミセス・オシデンタリスの細胞外インベルターゼに関連する、新規トランスフルクトシダーゼ活性のキャラクタリゼーションに関する。したがって、本発明の１つの観点は、トランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品を得るための方法であって、Ｓ．オクシデンタリス細胞を好適な培地及び条件において培養することを含んでなる方法に関する。通常の方法により、当業者は、Ｓ．オクシデンタリスの培養のための、培地と、ｐＨ、温度、及び攪拌といた条件とを選択するであろう。培養実施例は、以下に詳細に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
トランスフルクトシダーゼ活性は、スクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解する酵素、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ又はインベルターゼ（ＥＣ ３．２．１．２６）（ＩＵＢＭＢ酵素命名法、ＣＡＳ登録番号９００１−４２−７）の活性に関連する。
【００１３】
本発明の先行法の結果である粗酵素製品は、後続の分離又は精製の段階を必要することなく、オリゴ糖の取得に向けて産業的に使用されるべく準備されている。本発明の酵素対象は細胞外へ放出されるため、本発明の１つの特別の実施態様においては、方法はさらに、培地から及び／又は細胞から、酵素製品を回収する段階を含んでなる。したがって、Ｓ．オシデンタリス細胞の、フルクトフラノシダーゼ活性がそれに対し発現されてきた好適な培地を用いた懸濁物と、無細胞分画との双方が、本明細書における酵素製品として理解される。通常の方法により、当業者は、各産業プロセスに最も好適な出発酵素製品、すなわち、粗精製か、或いは、高又は低レベルの精製を選択するであろう。
【００１４】
本発明のもう１つの観点においては、Ｓ．オシデンタリス細胞は、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属する。インベルターゼ（フルクトフラノシダーゼ）活性をコードしている遺伝子のヌクレオチド配列は、先に公開されかつデータバンクに寄託された配列とは、著しい差異を示す。
【００１５】
本発明のもう１つの観点は、先に定義された方法により取得されたトランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品に関係する。本発明の酵素製品は、スクロース分解において非常に効率的であり、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースのようなオリゴ糖に対しても作用する。本発明の特別の実施態様においては、本発明の酵素製品は、フルクトフラノシダーゼ活性が、低い基質特異性を有し、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し作用することにおいてキャラクタライズされる。もう１つの実施態様においては、酵素製品のフルクトフラノシダーゼ活性は、５０℃では５と６の間のｐＨ範囲において、かつ４０と５５℃の間の温度範囲において、最大値を呈する。
【００１６】
フルクトフラノシダーゼ活性に加えて、本発明の酵素製品は、トランスフルクトシダーゼ活性を有する。１つの特別な実施態様においては、トランスフルクトシダーゼ活性から結果として生じる生成物は、６Ｆシリーズのフルクトオリゴ糖（特に６−ケストース）、及び、少数として、１Ｆシリーズのルクトオリゴ糖（特に１−ケストース）である。本発明のもう１つの観点は、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ、実質的に純粋な酵素を取得するための方法であって：（ａ）好適な培地及び条件におけるＳ．オシデンタリス細胞の培養により、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品を取得すること；（ｂ）培地から及び／又は細胞から、該酵素製品を回収すること；及び（ｃ）該酵素製品を、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素を得るまで精製すること、の段階を含んでなる方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素に関する。通常の精製法が、本発明の酵素を取得するために使用可能である。精製法の一例は、本明細書において詳細に記載されている。
【００１８】
本発明の酵素製品について示された基質特異性特性はまた、精製された酵素にもある。トランスフルクトシダーゼ活性もまた、精製された酵素の特徴である。
【００１９】
本発明の酵素製品及び酵素のポジティブな観点は、それらが多様な作用スペクトル及び高い比活性を有することであって、それらを、オリゴ糖の加水分解又は修飾のための好適な候補たらしめている。産業レベルにおけるもう１つの重要な観点は、該酵素が、高スクロース濃度の存在下での約５０℃の温度における、長い反応時間（例えば、１４４時間）を通じ安定であることである。
【００２０】
本発明は、産業上実行可能であるフルクトオリゴ糖、主として６−ケストースを取得するための方法を伝える。したがって、本発明のもう１つの観点は、オリゴ糖を取得するための方法であって、先に定義された酵素製品又は精製された酵素を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法に関する。通常の方法により、当業者は、この方法を行うための培地、基質、及び反応条件を選択するであろう。加えて、酵素、又は酵素の生産者、Ｓ．オシデンタリス細胞は、そのままで、或いは、担体物質へ物理的又は化学的に結合された、固定された様式で使用可能である。したがって、酵素又は細胞の再利用が可能となる。調製実施例は、本明細書において以下に包含される。
【００２１】
酵素のキャラクタリゼーション
Ａ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性の発現
フルクトフラノシダーゼ活性の産生は、ラクトースを補足された酵母用の培地中で増殖された、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９株の培養物中で分析された。培養は、ガラスフラスコ内で行われ、２８−３０℃の間をなす温度において、１８０−２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌を用いてインキュベートされた。最適の増殖条件は、２９℃及び２３５ｒｐｍであった。
【００２２】
無細胞分画は、２９℃及び２３５ｒｐｍにおいて増殖された、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養物の遠心分離により取得された（Ｆ−０）。フルクトフラノシダーゼ活性は、後に、種々の基質に対するグルコース放出を測定することによりアッセイされた。比色アッセイ及び標準的な方法論が使用された。放出されたグルコースは、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ共役反応を用いて定量された：０．４ｍｌの測定されるべき溶液は、０．１ｍｌのＡ：Ｂ（２０：１）溶液（Ａ：０．８５Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、０．４０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５中；Ｂ：０．６％ Ｏ−ジアニシジン）と混合された。それは３７℃で３０分間インキュベートされ、分光光度測定法により４５０ｎｍにおいて定量化された。標準グルコース曲線（０−１００μｇ／ｍｌ）が使用された。フルクトフラノシダーゼ活性単位は、記載された条件において測定されたグルコースのμｍｏｌ／ｍｌとして定義される。図１は、ＡＴＣＣ２６０７７株が使用され、アッセイがスクロースに対し行われる場合に得られた結果を示す。
【００２３】
Ｂ）培養及び無細胞分画の遠心分離後のＳ．オシデンタリスフルクトフラノシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
ラクトース培地：０．３％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、ディフコ（ＤＩＦＣＯ））、３．５％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ディフコ）、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＳＯ４、及び、炭素源としての２％ラクトース（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「新規な工業用酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼの精製及びキャラクタリゼーション、プレパラティブ・バイオケミストリー」、１９８９年、第１９巻、ｐ．２９３−３１９）中で、６６０ｎｍの光学密度ＯＤ８．３４まで増殖されたＳ．オシデンタリスの培養物の、遠心分離により得られた無細胞分画は、接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭＨＣｌ−トリスｐＨ７に対する透析を用いて濃縮され、種々の基質に対しアッセイされた。アッセイ結果は、表１に示されている。基質としてラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースが使用された場合、何ら活性は検出されなかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
Ｃ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素の精製
酵素の精製には、０．５８Ｕ／ｍｌのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ２リットルのＳ．オシデンタリス細胞外分画が開始用に用いられた。以下の方法が使用された：
１）接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭＨＣｌ−トリスｐＨ７（緩衝液Ａ）に対する透析を用いた、細胞外分画の濃縮。２３．２８Ｕ／ｍｌの活性をもつ３５ｍｌの濃縮物（Ｆ−１）が得られた。
２）ｐＨ７におけるイオン交換クロマトグラフィー。１０ｍｌの試料は、緩衝液Ａで平衡化された、２０ｍｌのＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）イオン交換カラムへ適用された。溶出は、０−２ＭのＮａＣｌ勾配を用いて行われた。０．２Ｍの塩において溶出された分画は、３．３０Ｕ／ｍｌの活性を示した。それは、２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５（緩衝液Ｂ）に対し、４℃で２時間透析された（Ｆ−２）。
３）ｐＨ５に対するイオン交換クロマトグラフィー。試料は、緩衝液Ｂで平衡化された、イオン交換ＤＥＡＥセファセルカラムへ適用され、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、及び０．５Ｍの塩の、不連続ＮａＣｌ勾配を用いて溶出された。先に示されたように測定されたフルクトフラノシダーゼ活性は、０．２Ｍの塩において溶出され、０．３３Ｕであった（Ｆ−３）。
【００２６】
精製は、各精製段階の後に存在するタンパク質（Ｆ−１、Ｆ−２、及びＦ−３）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルにおいて分析すること、及びクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで染色することにより測定された。得られた結果は、図２に示されている。
【００２７】
Ｄ）精製された酵素のフルクトフラノシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
記載された方法に従った、精製された酵素（Ｆ−３）の加水分解活性は、種々の基質に対しアッセイされた。最大活性レベルは、スクロースに対して得られる。ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、活性は観察されなかった。得られた結果は、表２にまとめられている。
【００２８】
【表２】
【００２９】
フルクトフラノシダーゼ活性は、種々のｐＨ及び温度においてアッセイされた。最大活性レベルは、５０℃では５及び６単位の間をなすｐＨ範囲において、及び４０と５５℃の温度において得られた。図３は、得られた結果を示す。
【００３０】
Ｅ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素をコードする遺伝子のキャラクタリゼーション
Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９のフルクトフラノシダーゼ活性をコードしている遺伝子（１．６ｋｂ）は、標準ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）、酵母のゲノムＤＮＡ、及び、既にデータベースに寄託された（アクセス番号Ｘ１７６０４の配列）該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の末端の配列に向けられたオリゴヌクレオチドを用いて増幅された。
【００３１】
分析された３つの酵母株における、増幅された遺伝物質の配列には、先に公開されたヌクレオチド配列に比較して著しい差異がある。配列番号１の識別配列をもつ演繹されたタンパク質は、先に記載された５３３個の代わりに５３５個のアミノ酸を有しており、公開されたものとは異なる、１５、４、１４、及び１アミノ酸からなる４つの配列を有する。図４は、データバンクに寄託されたフルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ）のアミノ酸配列（Ｐ２４１３３）と、本研究で得られたものとを比較して、得られた変化を示す。
【００３２】
Ｆ）Ｓ．オシデンタリスのＦ−１分画のトランスフルクトシダーゼ活性
限外濾過により得られた酵素濃縮物（Ｆ−１）のグリコシル基転移活性がアッセイされた。反応は、加水分解反応の損傷の中でのグリコシド結合の形成に有利にするための、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）と、約５Ｕ／ｍｌの反応混合物中の最終的な酵素活性とを用いて調製された。図５は、６時間の反応混合物のクロマトグラムを示す。Ｓ．オシデンタリスの酵素が、加水分解活性と転移活性とを一緒に示していることがわかる。一方で、フルクトース（ピーク１）及びグルコース（ピーク２）が、加水分解産物として形成される。他方で、２つの三糖類が得られる：ほとんどの三糖類（ピーク５）は、６−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→６）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］と同定され、もう一方の少数の三糖類（ピーク４）は１−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］と同定される。反応していなかったスクロースは、ピーク３に対応する。トランスグリコシレーション反応のスキームは、図６に示されている。
【００３３】
表３は、５０℃における２４時間の反応混合物中に存在する炭水化物の組成（ｇ／ｌで）を示す。６−ケストース／１−ケストースのモル比が、４及び６時間の反応の間に最大値３．３に達することが観察される。ＦＯＳ産生の最大ポイント（４時間）では、混合物中の全炭水化物に対し８．６％のＦＯＳのパーセントに相当する４３．６ｇ／ｌのＦＯＳが得られた。
【００３４】
【表３】
【００３５】
Ｇ）Ｓ．オシデンタリスの分画Ｆ−３のトランスフルクトシダーゼ活性
純粋な酵素（分画Ｆ−３）の、トランスグリコシレーション活性がアッセイされた。反応は、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）と、反応混合物中約０．５Ｕ／ｍｌの最終酵素活性とを用いて調製された。図７は、１４４時間の反応混合物のクロマトグラムを示す。得られた産物のプロフィールは、双方の場合に非常に類似していることが分かり、特に、得られた６−ケストース／１−ケストース比は３．３であった。
【００３６】
本研究においてキャラクタライズされた新規酵素は、５０℃で１４４時間の後に、なおトランスフルクトシダーゼ活性を保持している。１４４時間の反応の後、４２．６ｇ／ｌのＦＯＳが得られた。フルクトオリゴ糖の全パーセント（ｗ／ｗ）は、８．４％であり、この値は培地中の全重量に相当する。
【００３７】
記載及びクレームを通し、用語「含んでなる」及びその変形は、他の技術的特徴、添加物、成分、又は段階を排除することを意図しない。当業者には、本発明の他の目的、利益、及び特徴が、一部は記載から、また一部は本発明の実施から理解されるであろう。以下の詳細な説明、実施例、及び図面は、例証として呈示されているものであり、本発明を制限することを意図しない。
【実施例１】
【００３８】
最少培地で増殖された、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養全体を通じたフルクトフラノシダーゼの産生
フルクトフラノシダーゼの産生用には、ＡＴＣＣ２６０７７のＳ．オシデンタリス株はラクトース（ＭＭＬ）、スクロース（ＭＭＳ）、ラフィノース（ＭＭＲ）、及びグルコース（ＭＭＧ）を補足した、酵母用の１００ｍｌの最少培地中で培養された：０．７％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、ディフコ（ＤＩＦＣＯ）、及び対応する炭素源を以下のパーセントで：２％ラクトース、０．５％スクロース、０．２％ファフィノース、及び０．０５％グルコース。培養は、４０時間維持された。細胞増殖は、分光光度測定法により、６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）の光学密度における培養物の吸収に従って測定された。２５０ｍｌのガラスフラスコ、２９℃の温度、及び２３０ｒｐｍの定常の軌道攪拌が使用された。定常期は、ラクトース、スクロース、ラフィノース、及びグルコースをベースとする培地について、各々０．１１２、０．７５７、０．４５５、及び０．１６０のＯＤ６６０において到達された。
【実施例２】
【００３９】
最少培地上清による、スクロースからのグルコース産生のための酵素の使用
実施例１の培養上清は、細胞外酵素が検出される上清の、フルクトフラノシダーゼ活性の作用によるスクロースからのグルコース放出のために使用された。この目的のため、１００μｌの無細胞分画、０．４ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、及び０．５ｍｌの、同緩衝液中の１％スクロース（ｗ／ｖ）が混合され、４２℃において９０分間インキュベートされた。フルクトフラノシダーゼ活性は、培養の対数増殖期の最初から、定常期の最後まで観察された。最大活性レベル（ＭＭＬでは１０７ｍＵ／ｍｌ、ＭＭＧでは９．６ｍＵ／ｍｌ、ＭＭＳでは０．７８ｍＵ／ｍｌ、及びＭＭＲでは１．２ｍＵ／ｍｌ、）は、定常期において得られた。
【実施例３】
【００４０】
ラフィノースに富む培地中で増殖されたＳ．オシデンタリスの培養全体を通じたフルクトフラノシダーゼの産生
フルクトフラノシダーゼの産生用には、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７は、ラフィノースを補足された１００ｍｌの（ＹＥＰ）培地（ＹＥＰＲ）中で培養された：１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物（ディフコ）、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ディフコ）、０．２％（ｗ／ｖ）ラフィノース。２５０ｍｌのガラスフラスコ、３０℃の温度、及び２００ｒｐｍの定常の軌道攪拌が使用された。培養は、４８時間維持された。細胞増殖が行われ、先行実施例と同様に測定された。定常期は、２８時間の増殖において、２．２８のＯＤ６６０までに到達された。
【実施例４】
【００４１】
ラフィノースを用いた培地の上清による、スクロースからのグルコース産生のための酵素の使用
実施例３の培養上清は、実施例２と同様に、細胞外酵素が検出される上清の、フルクトフラノシダーゼ活性の作用によるスクロースからのグルコース放出のために使用された。測定可能なフルクトフラノシダーゼ活性のレベルは、培養の対数増殖期の半ばから、曲線の最後まで、約３０時間の培養にわたり得られた。最大活性レベル（０．３８２Ｕ／ｍｌ）は、２．２８のＯＤ６６０において得られた。
【実施例５】
【００４２】
５０及び６０℃におけるＳ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性の安定性
Ｓ．オシデンタリスの培養物の細胞外分画は、接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７に対する透析を用いて５７倍に濃縮された。２３．３Ｕ／ｍｌの活性をもつ酵素標品が得られた。標品は、５０及び６０℃において、種々の時間にわたり維持された。５０μｌの標品は、５−１０分ごとに採取された。スクロースに対するフルクトフラノシダーゼ活性は、実施例２と同様にして得られた全試料において測定された（５０℃、２０分間）。５０℃では４５及び１２０分後に、最初の活性の各々５０及び２０％が維持される。しかしながら、６０℃では、２及び５分後に、各々８０及び２５％の活性が維持されるにすぎない。
【実施例６】
【００４３】
Ｓ．オシデンタリスのゲノムＤＮＡを取得すること
Ｓ．オシデンタリスのＡＴＣＣ２０４９９株は、２％ラクトース（ＭＭＬ）を補足した酵母用の最少培地中で、２９℃で、２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌により、７．５８のＯＤ６６０ｎｍの光学密度間で培養された。ゲノムＤＮＡは、基本的に、先に記載された、サザンブロット分析用のゲノムＤＮＡ抽出プロトコル（ローズ（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ）ら著、「実習マニュアルのための酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年）に従って単離され、５０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌ−トリスｐＨ８．５中に再懸濁され、寒天ゲル（０．７％ｗ／ｖ）中で分析された。ＤＮＡの終濃度は、１００ｎｇ／μｌであった。
【実施例７】
【００４４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術によるフルクトフラノシダーゼ遺伝子の増幅
実施例６に記載された方法に従って得られたＤＮＡは、Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ）遺伝子（Ｘ１７６０４）を増幅するための鋳型として使用された。ＰＣＲ技術が用いられた。その目的のため、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、遺伝子Ｘ１７６０４に特異的配列、配列番号２及び配列番号３を用いてデザインされ、それらはＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限配列を各々包含する。各反応は：１．２５ＵのＴａｑＰｏｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、２．５μｌのこの酵素用の１０倍緩衝液、２．５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５μｌの４０ｍＭ ｄＮＴ、５μｌの実施例５に示されたように取得されたゲノムＤＮＡ、１．５μｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、及び、最終体積２５μｌとするまでのＨ２Ｏ、を包含する。この反応混合物は：ａ）９４℃で１０分間、ｂ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃１分間の３サイクル、ｃ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃１．５分間の３５サイクル、及びｄ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃６分間の１サイクルでインキュベートされた。生成物は、寒天ゲルにおいて分析された。遺伝子Ｘ１７６０４の予想サイズに対応する１．６ｋｂフラグメントが、約５０ｎｇ／μｌの濃度で増幅された。
【実施例８】
【００４５】
ＰＣＲにより増幅された産物のクローニング及びそのシーケンシング
実施例７に示されたように取得されたＰＣＲ産物は、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット１５０により精製され、ＥｃｏＲＶにより直鎖化されたノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）のｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクター（好ましくはブラントクローニング）中に包含された。熱ショックによる形質転換にコンピテントな大腸菌ＤＨ５αが使用され、選択はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ、及びＸ−Ｇａｌを用いたＬＢにおいて行われた。プラスミドＤＮＡは、キット：プロメガのＤＮＡ精製システム、ウィザード・プラス・ＳＶシステム（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて単離され、構築物はシーケンシングにより分析された。得られた配列は、アクセス番号Ｘ１７６０４の、記載されたものと比較された。遺伝コードを考慮することにより、コードされたタンパク質のアミノ酸配列が得られ、それは５３５個のアミノ酸で構成され、アクセス番号Ｐ２４１３３に記載されたものよりも１アミノ酸多かった。さらに、新規酵素活性の配列は、先に公開された配列（Ｐ２４１３３）と４つの領域において異なっている。図４に差異が示される。
【実施例９】
【００４６】
Ｓ．オシデンタリスの酵素濃縮物（Ｆ−１）により触媒される、スクロースからの５０℃におけるフルクトオリゴ糖の形成
０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中の、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）溶液が調製された。フルクトフラノシダーゼは、反応混合物中の終濃度５Ｕ／ｍｌまで添加された（１ユニットＵは、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中で、５０℃において、基質として１００ｇ／ｌのスクロースを用いた場合の、１分間当たりの還元糖の放出マイクロモルに相当する酵素活性である）。反応混合物は、５０℃において、７００ｒｐｍでの軌道攪拌を用いて２４時間インキュベートされた。アリコートは種々の時間に抽出され、酵素を不活化するべく８０℃で５分間インキュベートされ、水で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され、０．４５μｍのフィルタを具備したエッペンドルフチューブ内で、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、ＨＰＬＣ液体クロマトグラフィーにより分析された。形成された生成物のプロフィールは、図５に示されている。Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼは、転移活性（トランスフルクトシレーション）を有することが観察される。二つの三糖類が得られる：１つの主要な三糖類、６−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→６）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］、及び、１−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］として同定された、もう一方の少数の三糖類。ＦＯＳ産生の最大ポイント（４時間）では、系の組成は、フルクトース８．７％、グルコース１１．９％、スクロース７０．８％、１−ケストース２．０％、及び６−ケストース６．６％であった。
【実施例１０】
【００４７】
Ｓ．オシデンタリスの純粋な酵素（Ｆ−３）により触媒される、スクロースからの５０℃におけるフルクトオリゴ糖の形成
０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中の、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）溶液が調製された。フルクトフラノシダーゼは、反応混合物中の終濃度５Ｕ／ｍｌまで添加された（１ユニットＵは、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中で、５０℃において、基質として１００ｇ／ｌのスクロースを用いた場合の、１分間当たりの還元糖の放出マイクロモルに相当する酵素活性である）。反応混合物は、５０℃において、７００ｒｐｍでの軌道攪拌を用いて１４４時間インキュベートされた。アリコートは種々の時間に抽出され、酵素を不活化するべく８０℃で５分間インキュベートされ、水で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され、０．４５μｍのフィルタを具備したエッペンドルフチューブ内で、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、ＨＰＬＣ液体クロマトグラフィーにより分析された。形成された生成物のプロフィールは、図７に示されている。二つの三糖類が得られる：形成された主要な三糖類は、６−ケストースと同定され、もう一方の少数の三糖類は、１−ケストースと同定された。最終反応時間（１４４時間）では、系の組成は、フルクトース１２．７％、グルコース１４．８％、スクロース６４．１％、１−ケストース２．４％、及び６−ケストース５．９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養全体を通じた細胞外フルクトフラノシダーゼ活性の産生を示す図である。酵母は、２％ラクトース培地中で、２９℃において、２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌により７２時間増殖された。培養物の増殖は、ＯＤ６６０ｎｍで表されており（四角形）、細胞外培地中で測定されたＵ／ｍｌでのフルクトフラノシダーゼ活性（円形）は、示されている時間において達せられた。活性は、０．５％スクロースに対しアッセイされた。
【図２】精製全体を通じて存在するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）による分析の結果を示す図である。１ｍｌの、示された分画は、ＴＣＡ（１０％（ｗ／ｖ））で沈澱され、１０μｌの１．５Ｍ ＨＣｌ−トリスｐＨ７．５中に再懸濁され、８％ポリアクリルアミドゲルにおいて分析された。ゲルは、標準的な方法論に従って、クーマシーブルーで染色された。Ｍ：分子量マーカー；１、２及び３：各々Ｆ−１、Ｆ−２、及びＦ−３。
【図３】酵素活性を、ｐＨ及び温度の関数として示している図であり、対応する最大値を示している。アッセイは、スクロースに対し、純粋なタンパク質の溶液を用いて行われた。１００％は、５．５９Ｕ／ｍｌの活性に相当する。図３Ａ：フルクトフラノシダーゼ活性は、種々のｐＨ（３−９ｐＨ単位）において、アッセイ温度５０℃で、ｐＨ範囲３−４．５、５．０−７．５、及び８．０−９．０のための、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びＨＣｌ−トリス各緩衝液（それらの全てが１００ｍＭ）において測定された。図３Ｂ：温度アッセイ（３０−７０℃）は、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５中で行われた。
【図４】本研究において得られたＳ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７のフルクトフラノシダーゼの配列分析の結果を示す図である。先に記載されたタンパク質のアミノ酸 配列（Ｐ２４１３３）、及び本研究において得られたもの（Ｆｆａｓｅ）が示されている。
【図５】５１０ｇ／ｌの濃度のスクロースの、Ｓ．オシデンタリスの酵素製品（酵素濃縮物Ｆ−１）とのインキュベーションの後に得られた産物のプロフィールを示す図である。反応条件、ＨＰＬＣ分析条件、及び化合物名は、表３におけるものと同じである。クロマトグラフィー分析は６時間の反応に対応する。
【図６】Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼにより触媒されるトランスグリコシレーション反応のスキームを示す図である。
【図７】５１０ｇ／ｌの濃度のスクロースの、Ｓ．オシデンタリスの純粋な酵素（Ｆ−３）とのインキュベーションの後に得られた産物のプロフィールを示す図である。反応条件、ＨＰＬＣ分析条件、及び化合物名は、表３におけるものと同じである。クロマトグラフィー分析は１４４時間の反応に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー産業に含まれ、特に、食料品、乳製品、育児食、及び動物用の餌における機能性成分として使用されるためのプレバイオティックオリゴ糖を得るべく供された、食品及び農業部門に含まれる。本発明はまた、医薬及び化粧品産業の分野にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は、自然界で最も豊富な生体物質であり、非常に多様な産業プロセスにおいて、出発物質として使用されており；それ故、それらの代謝に関与する酵素には、基礎的及び技術的の視点の双方から、多大な興味がもたれている。
【０００３】
食品の機能性成分としてのプレバイオティックオリゴ糖の分野は、この数年のうちに劇的に発展してきた。
【０００４】
用語、プレバイオティックは、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）及びロバートフロイド（Ｒｏｂｅｒｔｆｒｏｉｄ）により導入されたが、彼らはプレバイオティックを、１又は限られた群の細菌の、結腸における増殖及び／又は活性の選択的刺激により、宿主に有益な影響を及ぼす非消化性の食品成分として定義した。
【０００５】
欧州市場に対する主要なプレバイオティック分子は、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）である（サンギータ（Ｐ．Ｔ．Ｓａｎｇｅｅｔｈａ）、アームズ（Ｍ．Ｎ．Ａｒｍｓ）、プラプーラ（Ｓ．Ｇ．Ｐｒａｐｕｌｌａ）著、「フルクトイオリゴ糖の微生物産生、分析、及び適用における最近の傾向（Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、トレンズ・イン・フード・サイエンス・アンド・テクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．ｔｅｃｈｍｏｌ．）」、２００５年、第１６巻、ｐ．４４２−４５７）。これまでに記載されたフルクトオリゴ糖には、３つのタイプがある。最も知られているフルクトオリゴ糖（１Ｆシリーズ）は、現在販売されているものであって、β，２−１結合により、一端においてグルコース分子と結合されたフルクトース分子により形成され（ユーン（Ｊ．Ｗ．Ｙｕｎ）著、「フルクトオリゴ糖：発生、調製、及び適用（Ｆｒｃｕｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」、１９９６年、第１９巻、ｐ．１０７−１１７）、ＧＦｎと略記され、ｎは典型的には２と４の間に含まれる（ケストース、ニストース、及びフルクトシルニストース）。第２のタイプ（６Ｆシリーズ）のフルクトオリゴ糖は、フルクトース分子がβ，２−６結合により、非還元末端においてグルコースと結合されており、徹底研究中である。これらのＦＯＳ分子は、自然界では通常、高分子量ポリマーの形状（レバン）で検出される。ネオケストースは、フルクトースがスクロース中のグルコース単位へβ，２−６結合により結合されている三糖類であり、Ｇ６シリーズの第１の代表である（第３のタイプのＦＯＳ）。３つのタイプのＦＯＳは、上部腸管における消化に抵抗性があり、結腸の内在性細菌により代謝される。それらは、ビフィドバクテリアの増殖を刺激する能力を有することが示されてきた（ラオ（Ａ．Ｖ．Ｒａｏ）著、「腸管ビフィズス菌特異効果に対するイヌリン及びオリゴフルクトースの用量反応効果（Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｓｆｒｕｃｔｏｓｅ ｏｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）、ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリション（Ｊ．Ｎｕｔｒ．）」、１９９８年、第８０巻、ｐ．１４４２Ｓ−１４４５Ｓ）。ＦＯＳは、天然多糖（イヌリン、レバン、その他）の部分加水分解により、或いはスクロースからの酵素合成により取得可能である。双方の方法論により生成される、産物のプロフィール（特に平均重合度に関して）は、かなり異なっており、そのことがそれらの特性に影響を及ぼしている。
【０００６】
１Ｆシリーズのフルクトオリゴ糖についての、イヌリンからの加水分解経路によるか、又は、スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．９．）、β−フルクトフラノシダーゼ −インベルターゼ−（ＥＣ ３．２．１．２６）を用いることによる、及びさらにはレバンスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１０）による、合成経路による製造（トルヒージョ（Ｌ．Ｅ．Ｔｒｕｊｉｌｌｏ）ら著、「メチロトローフ酵母ピキア・パストリスにおいて発現されるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスのレバンスクラーゼによる、フルクトオリゴ糖の製造（Ｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ｌｅｖａｎｓｃｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．）」、２００１年、第２８巻、ｐ．１３９−１４４）が、記載されてきた。いくつかのインベルターゼを用いて達成された合成収率は、全オリゴ糖の４％を超えず、一方１−フルクトシルトランスフェラーゼでは、達成可能な収率はずっと高い（５０−６０％）（アントソバ（Ｍ．Ａｎｔｏｓｏｖａ）、ポラコビック（Ｍ．Ｐｏｌａｋｏｖｉｃ）著、「フルクトロシルトランスフェラーゼ：フルクトオリゴ糖の産生を触媒する酵素（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｏｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ケミカル・ペーパーズ（Ｃｈｅｍ．Ｐａｐ．）」、２００１年、第５５巻、ｐ．３５０−３５８）。１ＦシリーズのＦＯＳは、現在、合成機能において、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のβ−フルクトフラノシダーゼを、３−５単位の短鎖オリゴ糖の生成のために用いて、工業的に製造されている（バニーウエンブルク（Ｃ．Ｖａｎｎｉｅｅｕｗｎｂｕｒｇｈ）ら著、「高静水圧下のアスペルギルス・ニゲルフルクトシル−トランスフェラーゼによる糖転換の動態検査及び数学的モデル（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、バイオプロセス・アンド・バイオシステムズ・エンジニアリング（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓ．Ｅｎｇ．）」、２００２年、第２５巻、ｐ．１３−２０）。トランスフルクトシダーゼ活性をもつ他の酵素は、オーレオバシジウジム・プレランス（Ａｕｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、又はアスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のような菌類において記載されてきた（チェン（Ｃ．Ｓ．Ｃｈｉｅｎ）ら著、「フルクトオリゴ糖製造のための、細胞をグルテン中に閉じ込めることによるアスペルギルス・ジャポニクスの固定（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｓ ｂｙ ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｕｔｅｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー」、２００１年、第２９巻、ｐ．２５２−２５７）。
【０００７】
６Ｆシリーズの低分子量フルクトオリゴ糖は、レバンポリマーから酸加水分解により取得される。合成経路では、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼからの１−ケストース形成における、少数の生成物としての６ＦシリーズのＦＯＳ形成が報告されているにすぎない（ベカーズ（Ｍ．Ｂｅｋｅｒｓ）ら著、「ジモモナス・モビリス細胞外レバンスクラーゼのフルクトオリゴ糖及びレバン産生活性（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｌｅｖａｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｚｙｍｏｍｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、プロセス・バイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、２００２年、第３８巻、ｐ．７０１−７０６）。今日まで文献において参照された研究においては、酵母クサントフィロミケス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（ファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）とも呼ばれる）の、又はいくつかの菌類（例えば（ペニシリヌム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｍｕｎ）、固定細胞）（リー（Ｌｅｅ）ら著、「ペニシリヌム・シトリヌム細胞を用いた、スクロースからの新規フルクトオリゴ糖の酵素的製造のための反応経路（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｃｒｏｓｅ ｕｓｉｎｇ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｍｕｍ ｃｅｌｌｓ）、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、２００１年、第３９巻、ｐ．３３１−３３３；パーク（Ｐａｒｋ）ら著、「ペニシリヌム・シトリヌムの全細胞の固定による、新規フルクトオリゴ糖の連続的製造（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」、２００５年、第２７巻、ｐ．１２７−１３０）の全細胞が、６Ｇシリーズのフルクトオリゴ糖の製造に使用されている。特許は、マルトースから、マルト−及びイソオリゴ糖を生成することが可能な高スペクトルのトランスグリコシラーゼ活性をもつ、Ｘ．デンドロロウスの細胞外α−グルコシダーゼ（Ｐ２００４０２９９４、ＵＡＭ−ＣＳＩＣ）について、及び、６Ｇシリーズ（特にネオケストース）及び１Ｆ（特に１−ケストース）のフルクトオリゴ糖の形成が可能なトランスフルクトシダーゼ活性をもつ、この酵母の細胞外フルクトフラノシダーゼ（Ｐ２００５０１８７５，ＵＡＭ−ＣＳＩＣ）について出願されてきた。
【０００８】
ＦＯＳの、それを消費するヒトへの影響は、非常に多様であり得る：ロタウイルスにより引き起こされる下痢事例の減少；乳糖不耐性症の改善；糞便量の増加による便秘の管理；カルシウム吸収の増加、及び結果としての骨粗鬆症のリスク低減；大腸癌に関連するニトロレダクターゼのような、ある微生物酵素の突然変異誘発能の低減；脂質代謝異常に関連した疾患の予想される低減、その他。
【０００９】
酵母シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（デバリオミセス・オシデンタリス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）も）は、多様な有機化合物を炭素源として使用することができる（グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、クエン酸塩、エタノール、プルラン、デキストリン、その他）。バイオテクノロジーにおいては、この生物は、それが極めて効率的なデンプン分解システムを示し、そのことが、デンプンを主成分とする培地におけるその増殖を可能するという理由から使用されてきた（ＵＳＰ ４７９４１７５）。Ｓ．オシデンタリスは、ラクトースを主成分とする培地中で、インベルターゼ活性を発現及び分泌する（コスタグリオリ（Ｐ．Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌｉ）ら著、「シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼ分泌（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、バイオテクノロジー・レターズ」、１９９７年、第１９巻、ｐ．６２３−７）。該酵素は、スーパーロース（Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ）１２及びモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑに基づくデュアルＦＰＬＣシステムを用いて精製され（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「新規な工業用酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼの精製及びキャラクタリゼーション（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｙｅａｓｔ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、プレパラティブ・バイオケミストリー（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、１９８９年、第１９巻、ｐ．２９３−３１９）、かつコード遺伝子はシーケンスされた（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼをコードする遺伝子のクローニング及び配列分析（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｎｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、カレント・ジェネティクス（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．）」、１９８９年、第１６巻、ｐ．１４５−５２；配列番号Ｘ１７６０４）。ヌクレオチド配列から演繹されたアミノ酸配列は、５３３個のアミノ酸を有する（アクセス番号 Ｐ２４１３３）。それにもかかわらず、種々の基質に対するその活性、又はそのフルクトシルトランスフェラーゼ能に関係するデータは何ら入手されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プレバイオティックオリゴ糖の産業的重要性を考慮すれば、産業上実行可能であるそれらを取得するための、酵素及び方法を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、プレバイオティックオリゴ糖、主として６−ケストースを得るために有用な、シュワンニオミセス・オシデンタリスの細胞外インベルターゼに関連する、新規トランスフルクトシダーゼ活性のキャラクタリゼーションに関する。したがって、本発明の１つの観点は、トランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品を得るための方法であって、Ｓ．オクシデンタリス細胞を好適な培地及び条件において培養することを含んでなる方法に関する。通常の方法により、当業者は、Ｓ．オクシデンタリスの培養のための、培地と、ｐＨ、温度、及び攪拌といた条件とを選択するであろう。培養実施例は、以下に詳細に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
トランスフルクトシダーゼ活性は、スクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解する酵素、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ又はインベルターゼ（ＥＣ ３．２．１．２６）（ＩＵＢＭＢ酵素命名法、ＣＡＳ登録番号９００１−４２−７）の活性に関連する。
【００１３】
本発明の先行法の結果である粗酵素製品は、後続の分離又は精製の段階を必要することなく、オリゴ糖の取得に向けて産業的に使用されるべく準備されている。本発明の酵素対象は細胞外へ放出されるため、本発明の１つの特別の実施態様においては、方法はさらに、培地から及び／又は細胞から、酵素製品を回収する段階を含んでなる。したがって、Ｓ．オシデンタリス細胞の、フルクトフラノシダーゼ活性がそれに対し発現されてきた好適な培地を用いた懸濁物と、無細胞分画との双方が、本明細書における酵素製品として理解される。通常の方法により、当業者は、各産業プロセスに最も好適な出発酵素製品、すなわち、粗精製か、或いは、高又は低レベルの精製を選択するであろう。
【００１４】
本発明のもう１つの観点においては、Ｓ．オシデンタリス細胞は、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属する。インベルターゼ（フルクトフラノシダーゼ）活性をコードしている遺伝子のヌクレオチド配列は、先に公開されかつデータバンクに寄託された配列とは、著しい差異を示す。
【００１５】
本発明のもう１つの観点は、先に定義された方法により取得されたトランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品に関係する。本発明の酵素製品は、スクロース分解において非常に効率的であり、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースのようなオリゴ糖に対しても作用する。本発明の特別の実施態様においては、本発明の酵素製品は、フルクトフラノシダーゼ活性が、低い基質特異性を有し、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し作用することにおいてキャラクタライズされる。もう１つの実施態様においては、酵素製品のフルクトフラノシダーゼ活性は、５０℃では５と６の間のｐＨ範囲において、かつ４０と５５℃の間の温度範囲において、最大値を呈する。
【００１６】
フルクトフラノシダーゼ活性に加えて、本発明の酵素製品は、トランスフルクトシダーゼ活性を有する。１つの特別な実施態様においては、トランスフルクトシダーゼ活性から結果として生じる生成物は、６Ｆシリーズのフルクトオリゴ糖（特に６−ケストース）、及び、少数として、１Ｆシリーズのルクトオリゴ糖（特に１−ケストース）である。本発明のもう１つの観点は、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ、実質的に純粋な酵素を取得するための方法であって：（ａ）好適な培地及び条件におけるＳ．オシデンタリス細胞の培養により、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ酵素製品を取得すること；（ｂ）培地から及び／又は細胞から、該酵素製品を回収すること；及び（ｃ）該酵素製品を、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素を得るまで精製すること、の段階を含んでなる方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ／トランスフルクトシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素に関する。通常の精製法が、本発明の酵素を取得するために使用可能である。精製法の一例は、本明細書において詳細に記載されている。
【００１８】
本発明の酵素製品について示された基質特異性特性はまた、精製された酵素にもある。トランスフルクトシダーゼ活性もまた、精製された酵素の特徴である。
【００１９】
本発明の酵素製品及び酵素のポジティブな観点は、それらが多様な作用スペクトル及び高い比活性を有することであって、それらを、オリゴ糖の加水分解又は修飾のための好適な候補たらしめている。産業レベルにおけるもう１つの重要な観点は、該酵素が、高スクロース濃度の存在下での約５０℃の温度における、長い反応時間（例えば、１４４時間）を通じ安定であることである。
【００２０】
本発明は、産業上実行可能であるフルクトオリゴ糖、主として６−ケストースを取得するための方法を伝える。したがって、本発明のもう１つの観点は、オリゴ糖を取得するための方法であって、先に定義された酵素製品又は精製された酵素を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法に関する。通常の方法により、当業者は、この方法を行うための培地、基質、及び反応条件を選択するであろう。加えて、酵素、又は酵素の生産者、Ｓ．オシデンタリス細胞は、そのままで、或いは、担体物質へ物理的又は化学的に結合された、固定された様式で使用可能である。したがって、酵素又は細胞の再利用が可能となる。調製実施例は、本明細書において以下に包含される。
【００２１】
酵素のキャラクタリゼーション
Ａ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性の発現
フルクトフラノシダーゼ活性の産生は、ラクトースを補足された酵母用の培地中で増殖された、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９株の培養物中で分析された。培養は、ガラスフラスコ内で行われ、２８−３０℃の間をなす温度において、１８０−２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌を用いてインキュベートされた。最適の増殖条件は、２９℃及び２３５ｒｐｍであった。
【００２２】
無細胞分画は、２９℃及び２３５ｒｐｍにおいて増殖された、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養物の遠心分離により取得された（Ｆ−０）。フルクトフラノシダーゼ活性は、後に、種々の基質に対するグルコース放出を測定することによりアッセイされた。比色アッセイ及び標準的な方法論が使用された。放出されたグルコースは、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ共役反応を用いて定量された：０．４ｍｌの測定されるべき溶液は、０．１ｍｌのＡ：Ｂ（２０：１）溶液（Ａ：０．８５Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、０．４０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５中；Ｂ：０．６％ Ｏ−ジアニシジン）と混合された。それは３７℃で３０分間インキュベートされ、分光光度測定法により４５０ｎｍにおいて定量化された。標準グルコース曲線（０−１００μｇ／ｍｌ）が使用された。フルクトフラノシダーゼ活性単位は、記載された条件において測定されたグルコースのμｍｏｌ／ｍｌとして定義される。図１は、ＡＴＣＣ２６０７７株が使用され、アッセイがスクロースに対し行われる場合に得られた結果を示す。
【００２３】
Ｂ）培養及び無細胞分画の遠心分離後のＳ．オシデンタリスフルクトフラノシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
ラクトース培地：０．３％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、ディフコ（ＤＩＦＣＯ））、３．５％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ディフコ）、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＳＯ４、及び、炭素源としての２％ラクトース（クライン（Ｒ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ）ら著、「新規な工業用酵母、シュワンニオミセス・オシデンタリスからのインベルターゼの精製及びキャラクタリゼーション、プレパラティブ・バイオケミストリー」、１９８９年、第１９巻、ｐ．２９３−３１９）中で、６６０ｎｍの光学密度ＯＤ８．３４まで増殖されたＳ．オシデンタリスの培養物の、遠心分離により得られた無細胞分画は、接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭＨＣｌ−トリスｐＨ７に対する透析を用いて濃縮され、種々の基質に対しアッセイされた。アッセイ結果は、表１に示されている。基質としてラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースが使用された場合、何ら活性は検出されなかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
Ｃ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素の精製
酵素の精製には、０．５８Ｕ／ｍｌのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ２リットルのＳ．オシデンタリス細胞外分画が開始用に用いられた。以下の方法が使用された：
１）接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭＨＣｌ−トリスｐＨ７（緩衝液Ａ）に対する透析を用いた、細胞外分画の濃縮。２３．２８Ｕ／ｍｌの活性をもつ３５ｍｌの濃縮物（Ｆ−１）が得られた。
２）ｐＨ７におけるイオン交換クロマトグラフィー。１０ｍｌの試料は、緩衝液Ａで平衡化された、２０ｍｌのＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）イオン交換カラムへ適用された。溶出は、０−２ＭのＮａＣｌ勾配を用いて行われた。０．２Ｍの塩において溶出された分画は、３．３０Ｕ／ｍｌの活性を示した。それは、２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５（緩衝液Ｂ）に対し、４℃で２時間透析された（Ｆ−２）。
３）ｐＨ５に対するイオン交換クロマトグラフィー。試料は、緩衝液Ｂで平衡化された、イオン交換ＤＥＡＥセファセルカラムへ適用され、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、及び０．５Ｍの塩の、不連続ＮａＣｌ勾配を用いて溶出された。先に示されたように測定されたフルクトフラノシダーゼ活性は、０．２Ｍの塩において溶出され、０．３３Ｕであった（Ｆ−３）。
【００２６】
精製は、各精製段階の後に存在するタンパク質（Ｆ−１、Ｆ−２、及びＦ−３）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルにおいて分析すること、及びクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで染色することにより測定された。得られた結果は、図２に示されている。
【００２７】
Ｄ）精製された酵素のフルクトフラノシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
記載された方法に従った、精製された酵素（Ｆ−３）の加水分解活性は、種々の基質に対しアッセイされた。最大活性レベルは、スクロースに対して得られる。ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、活性は観察されなかった。得られた結果は、表２にまとめられている。
【００２８】
【表２】
【００２９】
フルクトフラノシダーゼ活性は、種々のｐＨ及び温度においてアッセイされた。最大活性レベルは、５０℃では５及び６単位の間をなすｐＨ範囲において、及び４０と５５℃の温度において得られた。図３は、得られた結果を示す。
【００３０】
Ｅ）Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素をコードする遺伝子のキャラクタリゼーション
Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９のフルクトフラノシダーゼ活性をコードしている遺伝子（１．６ｋｂ）は、標準ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）、酵母のゲノムＤＮＡ、及び、既にデータベースに寄託された（アクセス番号Ｘ１７６０４の配列）該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の末端の配列に向けられたオリゴヌクレオチドを用いて増幅された。
【００３１】
分析された３つの酵母株における、増幅された遺伝物質の配列には、先に公開されたヌクレオチド配列に比較して著しい差異がある。配列番号１の識別配列をもつ演繹されたタンパク質は、先に記載された５３３個の代わりに５３５個のアミノ酸を有しており、公開されたものとは異なる、１５、４、１４、及び１アミノ酸からなる４つの配列を有する。図４は、データバンクに寄託されたフルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ）のアミノ酸配列（Ｐ２４１３３）と、本研究で得られたものとを比較して、得られた変化を示す。
【００３２】
Ｆ）Ｓ．オシデンタリスのＦ−１分画のトランスフルクトシダーゼ活性
限外濾過により得られた酵素濃縮物（Ｆ−１）のグリコシル基転移活性がアッセイされた。反応は、加水分解反応の損傷の中でのグリコシド結合の形成に有利にするための、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）と、約５Ｕ／ｍｌの反応混合物中の最終的な酵素活性とを用いて調製された。図５は、６時間の反応混合物のクロマトグラムを示す。Ｓ．オシデンタリスの酵素が、加水分解活性と転移活性とを一緒に示していることがわかる。一方で、フルクトース（ピーク１）及びグルコース（ピーク２）が、加水分解産物として形成される。他方で、２つの三糖類が得られる：ほとんどの三糖類（ピーク５）は、６−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→６）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］と同定され、もう一方の少数の三糖類（ピーク４）は１−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］と同定される。反応していなかったスクロースは、ピーク３に対応する。トランスグリコシレーション反応のスキームは、図６に示されている。
【００３３】
表３は、５０℃における２４時間の反応混合物中に存在する炭水化物の組成（ｇ／ｌで）を示す。６−ケストース／１−ケストースのモル比が、４及び６時間の反応の間に最大値３．３に達することが観察される。ＦＯＳ産生の最大ポイント（４時間）では、混合物中の全炭水化物に対し８．６％のＦＯＳのパーセントに相当する４３．６ｇ／ｌのＦＯＳが得られた。
【００３４】
【表３】
【００３５】
Ｇ）Ｓ．オシデンタリスの分画Ｆ−３のトランスフルクトシダーゼ活性
純粋な酵素（分画Ｆ−３）の、トランスグリコシレーション活性がアッセイされた。反応は、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）と、反応混合物中約０．５Ｕ／ｍｌの最終酵素活性とを用いて調製された。図７は、１４４時間の反応混合物のクロマトグラムを示す。得られた産物のプロフィールは、双方の場合に非常に類似していることが分かり、特に、得られた６−ケストース／１−ケストース比は３．３であった。
【００３６】
本研究においてキャラクタライズされた新規酵素は、５０℃で１４４時間の後に、なおトランスフルクトシダーゼ活性を保持している。１４４時間の反応の後、４２．６ｇ／ｌのＦＯＳが得られた。フルクトオリゴ糖の全パーセント（ｗ／ｗ）は、８．４％であり、この値は培地中の全重量に相当する。
【００３７】
記載及びクレームを通し、用語「含んでなる」及びその変形は、他の技術的特徴、添加物、成分、又は段階を排除することを意図しない。当業者には、本発明の他の目的、利益、及び特徴が、一部は記載から、また一部は本発明の実施から理解されるであろう。以下の詳細な説明、実施例、及び図面は、例証として呈示されているものであり、本発明を制限することを意図しない。
【実施例１】
【００３８】
最少培地で増殖された、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養全体を通じたフルクトフラノシダーゼの産生
フルクトフラノシダーゼの産生用には、ＡＴＣＣ２６０７７のＳ．オシデンタリス株はラクトース（ＭＭＬ）、スクロース（ＭＭＳ）、ラフィノース（ＭＭＲ）、及びグルコース（ＭＭＧ）を補足した、酵母用の１００ｍｌの最少培地中で培養された：０．７％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、ディフコ（ＤＩＦＣＯ）、及び対応する炭素源を以下のパーセントで：２％ラクトース、０．５％スクロース、０．２％ファフィノース、及び０．０５％グルコース。培養は、４０時間維持された。細胞増殖は、分光光度測定法により、６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）の光学密度における培養物の吸収に従って測定された。２５０ｍｌのガラスフラスコ、２９℃の温度、及び２３０ｒｐｍの定常の軌道攪拌が使用された。定常期は、ラクトース、スクロース、ラフィノース、及びグルコースをベースとする培地について、各々０．１１２、０．７５７、０．４５５、及び０．１６０のＯＤ６６０において到達された。
【実施例２】
【００３９】
最少培地上清による、スクロースからのグルコース産生のための酵素の使用
実施例１の培養上清は、細胞外酵素が検出される上清の、フルクトフラノシダーゼ活性の作用によるスクロースからのグルコース放出のために使用された。この目的のため、１００μｌの無細胞分画、０．４ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、及び０．５ｍｌの、同緩衝液中の１％スクロース（ｗ／ｖ）が混合され、４２℃において９０分間インキュベートされた。フルクトフラノシダーゼ活性は、培養の対数増殖期の最初から、定常期の最後まで観察された。最大活性レベル（ＭＭＬでは１０７ｍＵ／ｍｌ、ＭＭＧでは９．６ｍＵ／ｍｌ、ＭＭＳでは０．７８ｍＵ／ｍｌ、及びＭＭＲでは１．２ｍＵ／ｍｌ、）は、定常期において得られた。
【実施例３】
【００４０】
ラフィノースに富む培地中で増殖されたＳ．オシデンタリスの培養全体を通じたフルクトフラノシダーゼの産生
フルクトフラノシダーゼの産生用には、Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７は、ラフィノースを補足された１００ｍｌの（ＹＥＰ）培地（ＹＥＰＲ）中で培養された：１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物（ディフコ）、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（ディフコ）、０．２％（ｗ／ｖ）ラフィノース。２５０ｍｌのガラスフラスコ、３０℃の温度、及び２００ｒｐｍの定常の軌道攪拌が使用された。培養は、４８時間維持された。細胞増殖が行われ、先行実施例と同様に測定された。定常期は、２８時間の増殖において、２．２８のＯＤ６６０までに到達された。
【実施例４】
【００４１】
ラフィノースを用いた培地の上清による、スクロースからのグルコース産生のための酵素の使用
実施例３の培養上清は、実施例２と同様に、細胞外酵素が検出される上清の、フルクトフラノシダーゼ活性の作用によるスクロースからのグルコース放出のために使用された。測定可能なフルクトフラノシダーゼ活性のレベルは、培養の対数増殖期の半ばから、曲線の最後まで、約３０時間の培養にわたり得られた。最大活性レベル（０．３８２Ｕ／ｍｌ）は、２．２８のＯＤ６６０において得られた。
【実施例５】
【００４２】
５０及び６０℃におけるＳ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ活性の安定性
Ｓ．オシデンタリスの培養物の細胞外分画は、接線濾過システム（３０ｋＤａフィルタ）、及びそれに続く４℃の温度で２時間の、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７に対する透析を用いて５７倍に濃縮された。２３．３Ｕ／ｍｌの活性をもつ酵素標品が得られた。標品は、５０及び６０℃において、種々の時間にわたり維持された。５０μｌの標品は、５−１０分ごとに採取された。スクロースに対するフルクトフラノシダーゼ活性は、実施例２と同様にして得られた全試料において測定された（５０℃、２０分間）。５０℃では４５及び１２０分後に、最初の活性の各々５０及び２０％が維持される。しかしながら、６０℃では、２及び５分後に、各々８０及び２５％の活性が維持されるにすぎない。
【実施例６】
【００４３】
Ｓ．オシデンタリスのゲノムＤＮＡを取得すること
Ｓ．オシデンタリスのＡＴＣＣ２０４９９株は、２％ラクトース（ＭＭＬ）を補足した酵母用の最少培地中で、２９℃で、２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌により、７．５８のＯＤ６６０ｎｍの光学密度間で培養された。ゲノムＤＮＡは、基本的に、先に記載された、サザンブロット分析用のゲノムＤＮＡ抽出プロトコル（ローズ（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ）ら著、「実習マニュアルのための酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年）に従って単離され、５０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌ−トリスｐＨ８．５中に再懸濁され、寒天ゲル（０．７％ｗ／ｖ）中で分析された。ＤＮＡの終濃度は、１００ｎｇ／μｌであった。
【実施例７】
【００４４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術によるフルクトフラノシダーゼ遺伝子の増幅
実施例６に記載された方法に従って得られたＤＮＡは、Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ）遺伝子（Ｘ１７６０４）を増幅するための鋳型として使用された。ＰＣＲ技術が用いられた。その目的のため、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、遺伝子Ｘ１７６０４に特異的配列、配列番号２及び配列番号３を用いてデザインされ、それらはＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限配列を各々包含する。各反応は：１．２５ＵのＴａｑＰｏｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、２．５μｌのこの酵素用の１０倍緩衝液、２．５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５μｌの４０ｍＭ ｄＮＴ、５μｌの実施例５に示されたように取得されたゲノムＤＮＡ、１．５μｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、及び、最終体積２５μｌとするまでのＨ２Ｏ、を包含する。この反応混合物は：ａ）９４℃で１０分間、ｂ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃１分間の３サイクル、ｃ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃１．５分間の３５サイクル、及びｄ）９４℃１分間、５７℃１分間、及び７２℃６分間の１サイクルでインキュベートされた。生成物は、寒天ゲルにおいて分析された。遺伝子Ｘ１７６０４の予想サイズに対応する１．６ｋｂフラグメントが、約５０ｎｇ／μｌの濃度で増幅された。
【実施例８】
【００４５】
ＰＣＲにより増幅された産物のクローニング及びそのシーケンシング
実施例７に示されたように取得されたＰＣＲ産物は、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット１５０により精製され、ＥｃｏＲＶにより直鎖化されたノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）のｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクター（好ましくはブラントクローニング）中に包含された。熱ショックによる形質転換にコンピテントな大腸菌ＤＨ５αが使用され、選択はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ、及びＸ−Ｇａｌを用いたＬＢにおいて行われた。プラスミドＤＮＡは、キット：プロメガのＤＮＡ精製システム、ウィザード・プラス・ＳＶシステム（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて単離され、構築物はシーケンシングにより分析された。得られた配列は、アクセス番号Ｘ１７６０４の、記載されたものと比較された。遺伝コードを考慮することにより、コードされたタンパク質のアミノ酸配列が得られ、それは５３５個のアミノ酸で構成され、アクセス番号Ｐ２４１３３に記載されたものよりも１アミノ酸多かった。さらに、新規酵素活性の配列は、先に公開された配列（Ｐ２４１３３）と４つの領域において異なっている。図４に差異が示される。
【実施例９】
【００４６】
Ｓ．オシデンタリスの酵素濃縮物（Ｆ−１）により触媒される、スクロースからの５０℃におけるフルクトオリゴ糖の形成
０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中の、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）溶液が調製された。フルクトフラノシダーゼは、反応混合物中の終濃度５Ｕ／ｍｌまで添加された（１ユニットＵは、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中で、５０℃において、基質として１００ｇ／ｌのスクロースを用いた場合の、１分間当たりの還元糖の放出マイクロモルに相当する酵素活性である）。反応混合物は、５０℃において、７００ｒｐｍでの軌道攪拌を用いて２４時間インキュベートされた。アリコートは種々の時間に抽出され、酵素を不活化するべく８０℃で５分間インキュベートされ、水で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され、０．４５μｍのフィルタを具備したエッペンドルフチューブ内で、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、ＨＰＬＣ液体クロマトグラフィーにより分析された。形成された生成物のプロフィールは、図５に示されている。Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼは、転移活性（トランスフルクトシレーション）を有することが観察される。二つの三糖類が得られる：１つの主要な三糖類、６−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→６）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］、及び、１−ケストース［β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（２→１）−α−Ｄ−Ｇｌｕ］として同定された、もう一方の少数の三糖類。ＦＯＳ産生の最大ポイント（４時間）では、系の組成は、フルクトース８．７％、グルコース１１．９％、スクロース７０．８％、１−ケストース２．０％、及び６−ケストース６．６％であった。
【実施例１０】
【００４７】
Ｓ．オシデンタリスの純粋な酵素（Ｆ−３）により触媒される、スクロースからの５０℃におけるフルクトオリゴ糖の形成
０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中の、高濃度のスクロース（５１０ｇ／ｌ）溶液が調製された。フルクトフラノシダーゼは、反応混合物中の終濃度５Ｕ／ｍｌまで添加された（１ユニットＵは、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６中で、５０℃において、基質として１００ｇ／ｌのスクロースを用いた場合の、１分間当たりの還元糖の放出マイクロモルに相当する酵素活性である）。反応混合物は、５０℃において、７００ｒｐｍでの軌道攪拌を用いて１４４時間インキュベートされた。アリコートは種々の時間に抽出され、酵素を不活化するべく８０℃で５分間インキュベートされ、水で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され、０．４５μｍのフィルタを具備したエッペンドルフチューブ内で、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、ＨＰＬＣ液体クロマトグラフィーにより分析された。形成された生成物のプロフィールは、図７に示されている。二つの三糖類が得られる：形成された主要な三糖類は、６−ケストースと同定され、もう一方の少数の三糖類は、１−ケストースと同定された。最終反応時間（１４４時間）では、系の組成は、フルクトース１２．７％、グルコース１４．８％、スクロース６４．１％、１−ケストース２．４％、及び６−ケストース５．９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｓ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７の培養全体を通じた細胞外フルクトフラノシダーゼ活性の産生を示す図である。酵母は、２％ラクトース培地中で、２９℃において、２３５ｒｐｍの定常の軌道攪拌により７２時間増殖された。培養物の増殖は、ＯＤ６６０ｎｍで表されており（四角形）、細胞外培地中で測定されたＵ／ｍｌでのフルクトフラノシダーゼ活性（円形）は、示されている時間において達せられた。活性は、０．５％スクロースに対しアッセイされた。
【図２】精製全体を通じて存在するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）による分析の結果を示す図である。１ｍｌの、示された分画は、ＴＣＡ（１０％（ｗ／ｖ））で沈澱され、１０μｌの１．５Ｍ ＨＣｌ−トリスｐＨ７．５中に再懸濁され、８％ポリアクリルアミドゲルにおいて分析された。ゲルは、標準的な方法論に従って、クーマシーブルーで染色された。Ｍ：分子量マーカー；１、２及び３：各々Ｆ−１、Ｆ−２、及びＦ−３。
【図３】酵素活性を、ｐＨ及び温度の関数として示している図であり、対応する最大値を示している。アッセイは、スクロースに対し、純粋なタンパク質の溶液を用いて行われた。１００％は、５．５９Ｕ／ｍｌの活性に相当する。図３Ａ：フルクトフラノシダーゼ活性は、種々のｐＨ（３−９ｐＨ単位）において、アッセイ温度５０℃で、ｐＨ範囲３−４．５、５．０−７．５、及び８．０−９．０のための、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びＨＣｌ−トリス各緩衝液（それらの全てが１００ｍＭ）において測定された。図３Ｂ：温度アッセイ（３０−７０℃）は、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５中で行われた。
【図４】本研究において得られたＳ．オシデンタリスＡＴＣＣ２６０７７のフルクトフラノシダーゼの配列分析の結果を示す図である。先に記載されたタンパク質のアミノ酸 配列（Ｐ２４１３３）、及び本研究において得られたもの（Ｆｆａｓｅ）が示されている。
【図５】５１０ｇ／ｌの濃度のスクロースの、Ｓ．オシデンタリスの酵素製品（酵素濃縮物Ｆ−１）とのインキュベーションの後に得られた産物のプロフィールを示す図である。反応条件、ＨＰＬＣ分析条件、及び化合物名は、表３におけるものと同じである。クロマトグラフィー分析は６時間の反応に対応する。
【図６】Ｓ．オシデンタリスのフルクトフラノシダーゼにより触媒されるトランスグリコシレーション反応のスキームを示す図である。
【図７】５１０ｇ／ｌの濃度のスクロースの、Ｓ．オシデンタリスの純粋な酵素（Ｆ−３）とのインキュベーションの後に得られた産物のプロフィールを示す図である。反応条件、ＨＰＬＣ分析条件、及び化合物名は、表３におけるものと同じである。クロマトグラフィー分析は１４４時間の反応に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素製品を得るための方法であって、シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（デバリオミセス・オシデンタリス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）も）細胞を、ラクトースをベースとする酵母用の培地、２９℃の温度、及び２３５ｒｐｍの定常軌道攪拌において培養することを含んでなる方法。
【請求項２】
シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞を、種々の炭素供給源（ラクトース、スクロース、ラフィノース、グルコース）をベースとする酵母用の最少又は富化培地、２８と３０℃の間をなす温度、及び１８０と２３５ｒｐｍの間をなす定常軌道攪拌範囲において培養することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記培地から、及び／又は前記細胞から、酵素製品を回収する付加的な段階を含んでなる、請求項１及び２記載の方法。
【請求項４】
前記シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞が、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属している、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素製品。
【請求項６】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し低い基質特異性を有することを特徴とする、請求項５記載の酵素製品。
【請求項７】
ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、何らフルクトフラノシダーゼ活性をもたないことを特徴とする、請求項５及び６のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項８】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、５０℃では５と６単位の間のｐＨ範囲において、かつ４０から５５℃までの温度範囲において最大値を有する、請求項５乃至７のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項９】
１又は数個の糖質基質の存在下にトランスフルクトシダーゼ活性を有することを特徴とする、請求項５乃至８のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項１０】
前記糖質基質がフルクトオリゴ糖であることを特徴とする、請求項９記載の酵素製品。
【請求項１１】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、β−１，２、及びβ−２，６結合をもつフルクトオリゴ糖である、請求項１０記載の酵素製品。
【請求項１２】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、基本的に６−ケストース及び１−ケストースである、請求項１１記載の酵素製品。
【請求項１３】
オリゴ糖を取得するための方法であって、請求項５乃至１２のいずれかに定義された酵素製品を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法。
【請求項１４】
請求項１及び２記載の方法により得られた酵素製品から、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素を取得するための方法であって、前記酵素製品を、実質的に純粋な酵素を取得するまで精製する付加的な段階を含んでなる方法。
【請求項１５】
前記シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞が、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属している、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４及び１５のいずれかに定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素。
【請求項１７】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、低い基質特異性を有しており、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し作用することを特徴とする、請求項１６記載の酵素。
【請求項１８】
ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、何らフルクトフラノシダーゼ活性をもたないことを特徴とする、請求項１６及び１７のいずれかに記載の酵素。
【請求項１９】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、５０℃では５と６単位の間のｐＨ範囲において、かつ４０と５５℃の間の温度範囲において最大値を有する、請求項１６乃至１８のいずれかに記載の酵素。
【請求項２０】
１又は数個の糖質基質の存在下にトランスフルクトシダーゼ活性を有することを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれかに記載の酵素。
【請求項２１】
前記糖質基質がフルクトオリゴ糖であることを特徴とする、請求項２０記載の酵素。
【請求項２２】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、β−１，２、及びβ−２，６結合をもつオリゴ糖である、請求項２１記載の酵素。
【請求項２３】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、基本的に６−ケストース及び１−ケストースである、請求項２２記載の酵素。
【請求項２４】
そのアミノ酸配列、配列番号１により、及び、５３５個のアミノ酸を有することにより特徴づけられる、請求項１６乃至２３のいずれかに記載の酵素。
【請求項２５】
そのヌクレオチド配列、配列番号４により特徴づけられる、請求項１６乃至２４のいずれかに定義された酵素をコードしているＤＮＡ配列。
【請求項２６】
オリゴ糖を取得するための方法であって、請求項１６乃至２５のいずれかに定義された酵素を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法。
【請求項１】
フルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素製品を得るための方法であって、シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（デバリオミセス・オシデンタリス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）も）細胞を、ラクトースをベースとする酵母用の培地、２９℃の温度、及び２３５ｒｐｍの定常軌道攪拌において培養することを含んでなる方法。
【請求項２】
シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞を、種々の炭素供給源（ラクトース、スクロース、ラフィノース、グルコース）をベースとする酵母用の最少又は富化培地、２８と３０℃の間をなす温度、及び１８０と２３５ｒｐｍの間をなす定常軌道攪拌範囲において培養することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記培地から、及び／又は前記細胞から、酵素製品を回収する付加的な段階を含んでなる、請求項１及び２記載の方法。
【請求項４】
前記シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞が、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属している、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ酵素製品。
【請求項６】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し低い基質特異性を有することを特徴とする、請求項５記載の酵素製品。
【請求項７】
ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、何らフルクトフラノシダーゼ活性をもたないことを特徴とする、請求項５及び６のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項８】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、５０℃では５と６単位の間のｐＨ範囲において、かつ４０から５５℃までの温度範囲において最大値を有する、請求項５乃至７のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項９】
１又は数個の糖質基質の存在下にトランスフルクトシダーゼ活性を有することを特徴とする、請求項５乃至８のいずれかに記載の酵素製品。
【請求項１０】
前記糖質基質がフルクトオリゴ糖であることを特徴とする、請求項９記載の酵素製品。
【請求項１１】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、β−１，２、及びβ−２，６結合をもつフルクトオリゴ糖である、請求項１０記載の酵素製品。
【請求項１２】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、基本的に６−ケストース及び１−ケストースである、請求項１１記載の酵素製品。
【請求項１３】
オリゴ糖を取得するための方法であって、請求項５乃至１２のいずれかに定義された酵素製品を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法。
【請求項１４】
請求項１及び２記載の方法により得られた酵素製品から、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素を取得するための方法であって、前記酵素製品を、実質的に純粋な酵素を取得するまで精製する付加的な段階を含んでなる方法。
【請求項１５】
前記シュワンニオミセス・オシデンタリス細胞が、ＡＴＣＣ２６０７７、ＡＴＣＣ２６０７６、及びＡＴＣＣ２０４９９からなる群より選択される株に属している、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４及び１５のいずれかに定義された方法により取得可能な、フルクトフラノシダーゼ活性をもつ実質的に純粋な酵素。
【請求項１７】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、低い基質特異性を有しており、スクロース、１−ケストース、ニストース、及びラフィノースに対し作用することを特徴とする、請求項１６記載の酵素。
【請求項１８】
ラクトース、ロイクロース、ツラノース、又はパラチノースに対し、何らフルクトフラノシダーゼ活性をもたないことを特徴とする、請求項１６及び１７のいずれかに記載の酵素。
【請求項１９】
前記フルクトフラノシダーゼ活性が、５０℃では５と６単位の間のｐＨ範囲において、かつ４０と５５℃の間の温度範囲において最大値を有する、請求項１６乃至１８のいずれかに記載の酵素。
【請求項２０】
１又は数個の糖質基質の存在下にトランスフルクトシダーゼ活性を有することを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれかに記載の酵素。
【請求項２１】
前記糖質基質がフルクトオリゴ糖であることを特徴とする、請求項２０記載の酵素。
【請求項２２】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、β−１，２、及びβ−２，６結合をもつオリゴ糖である、請求項２１記載の酵素。
【請求項２３】
前記トランスフルクトシダーゼ活性から結果として得られる産物が、基本的に６−ケストース及び１−ケストースである、請求項２２記載の酵素。
【請求項２４】
そのアミノ酸配列、配列番号１により、及び、５３５個のアミノ酸を有することにより特徴づけられる、請求項１６乃至２３のいずれかに記載の酵素。
【請求項２５】
そのヌクレオチド配列、配列番号４により特徴づけられる、請求項１６乃至２４のいずれかに定義された酵素をコードしているＤＮＡ配列。
【請求項２６】
オリゴ糖を取得するための方法であって、請求項１６乃至２５のいずれかに定義された酵素を、１又は数個の糖質基質に対し作用させることを含んでなる方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５２１２４０（Ｐ２００９−５２１２４０Ａ）
【公表日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７９９３（Ｐ２００８−５４７９９３）
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００６９３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７４１８７
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０８１９１９２７）ユニバーシダッド オートノマ デ マドリッド (1)
【出願人】（５０８１９１７８７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００６９３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７４１８７
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０８１９１９２７）ユニバーシダッド オートノマ デ マドリッド (1)
【出願人】（５０８１９１７８７）
【Ｆターム（参考）】
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