プロスタグランジンＥ２産生促進剤
【課題】クローン病治療剤、ＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用なＰＧＥ２産生促進剤を提供する。
【解決手段】黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤、ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤、並びに前記プロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤及び非ステロイド系抗炎症剤の副作用低減剤。
【解決手段】黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤、ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤、並びに前記プロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤及び非ステロイド系抗炎症剤の副作用低減剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロスタグランジンＥ２産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸でのプロスタグランジンＥ２（以下「ＰＧＥ２」という。）及びＰＧＥ２産生酵素であるシクロオキシゲナーゼ（以下「ＣＯＸ」という。）の役割については近年考え方が変化してきている。
【０００３】
元来、ＰＧＥ２は単なる炎症性メディエーターとしての捉え方であり、炎症部位においてはＰＧＥ２を抑制することで治癒すると考えられてきた。その考え方で進められてきたのがＣＯＸ阻害剤の開発である。しかし、ＣＯＸ阻害剤には副作用として胃や小腸粘膜の潰瘍が認められることがわかってきた。そこで更にＣＯＸの２つのアイソザイムそれぞれに特異的な阻害剤が開発された。その結果、ＣＯＸ−２阻害剤であれば、胃粘膜傷害を抑制できることがわかってきた。しかし、ＣＯＸ−２阻害剤であっても、依然として小腸粘膜潰瘍はほとんど抑制できなかった。そこで近年、これまでとは異なるＰＧＥ２の役割が知られるようになってきた。すなわち、小腸粘膜においてＰＧＥ２は炎症性メディエーターではなく、逆に、粘膜保護作用を持つＩＬ−１０などのサイトカイン産生等の免疫反応を含めた、腸粘膜の恒常性維持を制御するキー物質であるということである（非特許文献１）。
【０００４】
ＣＯＸ−２阻害剤又は非ステロイド系抗炎症剤（以下「ＮＳＡＩＤ」という。）によるクローン病様の腸病変がリウマチなどでＮＳＡＩＤを連用している患者の６０〜７０％に認められているという報告（非特許文献２）もあり、またＮＳＡＩＤの使用は他の原因による炎症性腸疾患の増悪因子としてもよく知られている。ＮＳＡＩＤの副作用のうち胃潰瘍（症状が見えやすくわかりやすい）がほぼ解決した現在、ＮＳＡＩＤによる腸障害が今後注目されてくると考えられ、その場合の市場は非常に大きなものとなってくる可能性がある。
【０００５】
このように、新たにわかってきたＰＧＥ２の腸粘膜保護作用に着目して開発された物質はほとんど知られていない。
【０００６】
一方、黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子からなる漢方処方である黄連解毒湯は、ＣＯＸ−２活性を抑制して大腸の前癌病変の発生を抑制することが報告されているが（非特許文献３；特許文献１）、小腸粘膜におけるＰＧＥ２産生に対する効果については知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開平８−３３７５３５号公報
【非特許文献１】Digestive Diseases and Sciences, 47, 84-89 (2002)
【非特許文献２】Gastroenterology, 104, 1832-1847 (1993)
【非特許文献３】Cancer Letters, 157, 9-14 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、クローン病治療剤、ＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用なＰＧＥ２産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するＰＧＥ２産生促進剤。
（２）黄連解毒湯を含有する前記（１）に記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（３）ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するＰＧＥ２産生促進剤。
（４）更に、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（５）小腸粘膜におけるＰＧＥ２の産生を促進させる前記（１）〜（４）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤を含有するＮＳＡＩＤの副作用低減剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、クローン病治療剤、ＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用なＰＧＥ２産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤の有効成分としては、黄連、黄柏、黄ごんもしくはこれらの抽出物、又はベルベリン、コプチシン又はベルベリン及びコプチシンの少なくともいずれかを含有する植物もしくはその抽出物を含むものであれば特に制限はなく、これらは単独で又は混合して用いることができる。
【００１２】
また、黄連、黄柏、黄ごん又はこれらの抽出物を構成生薬に含む混合生薬又はその抽出物、例えば黄連解毒湯、三黄瀉心湯、乙字湯、大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡加竜骨牡蛎湯、半夏瀉心湯、半夏白朮天麻湯、七物降下湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、五淋散、温清飲、清上防風湯、防風通聖散、女神散、柴陥湯、竜胆瀉肝湯、柴胡清肝湯、二朮湯、清肺湯、竹・温胆湯、滋陰降火湯、柴朴湯、辛夷清肺湯、小柴胡湯加桔梗石膏、清心・子飲、黄連湯、三物黄・湯、清暑益気湯等を用いてもよく、好ましくは黄連解毒湯、半夏瀉心湯、温清飲が好ましく、特に黄連解毒湯が好ましい。
【００１３】
ベルベリン及びコプチシンの少なくともいずれかを含有する植物としては、前記のオウレン、キハダの他、アキカラマツ、イヌザンショウ、エンゴサク、ナツメ、サネブトナツメ、ヒイラギナンテン、ヒドラスチスコン、ヒナゲシ、メギ、ヤマブキソウなどが挙げられる。
【００１４】
前記の抽出物としては、例えば水、エタノール、アセトン、エーテル又はこれらの混合物のような各種溶剤による抽出物が挙げられるが、水抽出物を用いることが好ましい。具体的な抽出物の調製例としては、前記生薬を８〜２０倍量の熱水で抽出し、得られた抽出液を濾過する方法が挙げられる。この抽出物は必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末として用いることができる。
【００１５】
ベルベリン及びコプチシンは公知化合物であり、前記のオウレン、キハダ等を適宜抽出操作に付すことにより得ることができる。
【００１６】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、ＰＧＥ２産生促進効果の点で、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００１７】
パルマチンも公知化合物であり、オウレン、キハダ等を適宜抽出操作に付すことにより得ることができる。パルマチンを含有する植物としては、前記のオウレン、キハダの他、コロンボ、チョウセンゴヨウ、ヒイラギナンテン、メギなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、小腸粘膜におけるＰＧＥ２の産生を促進させる効果を有し、クローン病治療剤（特に、小腸粘膜障害の改善）及びＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用である。前記ＮＳＡＩＤとしては特に制限はなく、例えばアスピリン（アセチルサリチル酸）、インドメタシン、イブプロフェン、フェニルブタゾン、サラゾスルファピリジン、メサラジンが挙げられ、これらの副作用としては、例えば小腸粘膜障害、気管支喘息等が挙げられる。
【００１９】
以下、本発明のＰＧＥ２産生促進剤の投与量及び製剤化について説明する。
前記の有効成分はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び人に投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２０】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で有効成分の重量として５００ｍｇ〜３ｇを１日数回に分けての服用が適当である。
【００２１】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。
【００２２】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。それぞれの具体例は以下に示すごとくである。
【００２３】
［結合剤］
デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。
【００２４】
［崩壊剤］
デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。
【００２５】
［界面活性剤］
ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０。
【００２６】
［滑沢剤］
タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール。
【００２７】
［流動性促進剤］
軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム。
【００２８】
また、本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。
【００２９】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で有効成分の重量として１日５０〜３００ｍｇまでの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。
【００３０】
この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。
【００３１】
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【実施例】
【００３２】
以下、製造例、実施例及び製剤例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
［製造例１］黄連解毒湯の抽出物の製造
生薬を切裁し、黄連解毒湯の原料生薬１７ｋｇ（黄連４ｋｇ、黄柏３ｋｇ、黄ごん６ｋｇ及び山梔子４ｋｇ）を秤量・調合し、約１２倍量の精製水に加え、撹拌しながら９５〜１００℃に昇温させ、昇温後、約６０分間抽出した。抽出終了後、抽出液を固液分離し、分離液を減圧濃縮した後、噴霧乾燥により１．５ｋｇの黄連解毒湯乾燥エキス粉末とした。
【００３４】
［製造例２］黄連の抽出物の製造
黄連２５ｇに２．５リットルの精製水を加え、ほぼ半量になるまで煎出を行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液を得た。濾液を室温まで冷却した後、噴霧乾燥して乾燥エキス粉末を得た。
【００３５】
［製造例３］黄柏の抽出物の製造
黄柏１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、１００℃で１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、噴霧乾燥して１５００ｇの乾燥エキス粉末を得た。
【００３６】
［製造例４］黄ごんの抽出物の製造
黄ごん１００ｇに２リットルの精製水を添加し、約半量になるまで煮沸した後濾過し、得られた濾液を濃縮した後、噴霧乾燥を行い乾燥エキス粉末を得た。
【００３７】
［製造例５］山梔子の抽出物の製造
山梔子２００ｇを細切し、土瓶に入れ、蒸留水１２リットルを加え、１００℃で１時間）煮沸した。抽出液を濾過後、減圧濃縮し、噴霧乾燥し、褐色粉末状の抽出エキス５３ｇを得た。
【００３８】
［実施例１］黄連解毒湯による生存率の増加
ＳＰＦ飼育の７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２５匹を用いた。黄連解毒湯（以下「ＯＧＴ」という。）は製造例１で製造したエキス粉末を用いた。
【００３９】
２４時間絶食した翌日、１回目のインドメタシン投与を実施し、それと同時に摂餌を再開し、この日をｄａｙ０（ｔｉｍｅ０）とした。インドメタシンは２０ｍｇ／ｋｇを１日１回２４時間間隔で２回皮下投与した。ＯＧＴ群は試験開始日よりＯＧＴを２％の割合でＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌に混ぜ投与を行い、Ｃｏｎｔｒｏｌ群はＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌のみを投与した。摂餌量から計算したところ２％混餌ＯＧＴのＯＧＴ投与量は２〜３ｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当した。結果を図１に示す。
【００４０】
ＯＧＴはインドメタシン誘発小腸炎による個体死を有意に抑制し、治療効果を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００５、ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群においては特にｄａｙ２〜３という初期に死亡する動物が多かった。
【００４１】
また、ＯＧＴ投与量を変えて２％、１％又は０．５％混餌したとき、ｄａｙ９での 生存率はそれぞれ８５％、７０％、６５％であり（このときＯＧＴ非投与Ｃｏｎｔｒｏｌ群は２０％）、投与量依存的にＯＧＴの作用が認められた。
【００４２】
［実施例２］ＯＧＴの投与時期の変更による影響
ＯＧＴの投与時期を変えて生存率に対する影響を検討した。
実施例１と同様にインドメタシンを投与し、ＯＧＴ投与時期を変更した（Ｎ＝１０匹）。結果を図２に示す。
【００４３】
ｄａｙ０〜３の期間投与した時で１００％、絶食前に３日間（ｄａｙ−４〜−１）与えたときも７０％の生存率であった。
【００４４】
ＯＧＴは炎症誘導初期に効果を示していることから、炎症が激しい急性期における治療効果を有する。また、腸炎誘導前の投与により効果を示していることから予防効果も有し、クローン病の既往歴を有する患者にＯＧＴを投与することにより、クローン病の再発を防止できると考えられる。
【００４５】
［実施例３］ＯＧＴの腸組織への作用
ＯＧＴの腸組織への作用を観察した。
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与した。インドメタシンの最初の投与より６０時間後のマウスの小腸を摘出し、１５％中性ホルマリン固定後、長さ５ｍｍ程度に輪状に細切し３０〜４０個の腸管切片を作成し、常法に従いパラフィンブロックを作製して病理組織標本をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。結果を図３に示す。
【００４６】
インドメタシンの投与により小腸に筋層まで達する潰瘍が形成された。ＯＧＴ投与により潰瘍面積及び潰瘍数は減少し、また潰瘍が発生していても、潰瘍部では絨毛の欠落は認められたものの固有層から筋層にかけ保存されており、軽度であった。すなわち、ＯＧＴは生存率だけでなく小腸潰瘍の悪化を防いだ。
【００４７】
［実施例４］ＯＧＴによる小腸潰瘍改善の評価
ＯＧＴによる小腸潰瘍改善を様々な指標で評価した。
（Ａ）潰瘍数
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与した（Ｎ＝５）。初回のインドメタシン投与後１２、２４、３６、４８及び５４時間の小腸を摘出し、腸間膜付着部に沿って切開し、腸管全体が平らになるようにろ紙に貼り付けて１５％中性ホルマリンで２日以上固定した。その後、生理食塩水を入れた透明ビニール袋に小腸を移して密封し、実体顕微鏡にて巨視的に顕微鏡で観察し、小腸全体の潰瘍の数を計数し、各群の一匹当たりの平均を求めた。結果を図４（Ａ）に示す。
【００４８】
（Ｂ）潰瘍面積
（Ａ）の標本からImage Processor for Analytical Pathology（住化テクノサービス株式会社）に潰瘍画像を取り込み、手動で面積を算定し各群の一匹当たりの平均を示した。結果を図４（Ｂ）に示す。
【００４９】
（Ｃ）潰瘍グレード
（Ｂ）の算定終了後の小腸全長をロール状に巻いた後、パラフィン包埋・ＨＥ染色を行い、組織検査を実施し、以下に示す潰瘍グレードごとの潰瘍数を計測し、各群の一匹当たりの平均を示した。結果を図４（Ｃ）に示す。
グレード１：絨毛上皮あるいは絨毛から陰窩にかけて壊死・脱落した場合
グレード２：粘膜から粘膜固有層まで壊死・脱落した場合
グレード３：粘膜から粘膜筋板まで壊死・脱落した場合
グレード４：粘膜から粘膜下組織まで壊死・脱落した場合
グレード５：粘膜から筋層まで壊死・脱落した場合（穿孔性を含む）
【００５０】
１匹当たりの潰瘍数、潰瘍面積ともＯＧＴ投与により有意に改善された。潰瘍グレードは投与３６時間後のグレード分布を有意に改善した（ｐ＜０．０１，Mann-Whitney’s U test）。その他の時間についても改善傾向が認められた。
【００５１】
［実施例５］インドメタシン誘発小腸障害における小腸ＰＧＥ２産生能低下に対するＯＧＴの作用
インドメタシン投与後の小腸粘膜におけるＰＧＥ２産生能の変化を検討した。
【００５２】
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与し、１２、２４、３６、４８及び５４時間後のマウスを麻酔下で脱血死させ、小腸を摘出し、生理食塩水で洗浄後、脂肪を除去し、腸間膜の接着部に沿って縦に切り開いた（Ｎ＝５、但し、Ｃｏｎｔｒｏｌの５４時間後のみＮ＝４）。
【００５３】
組織中のＰＧＥ２産生能はArch. Int. Pharmacodyn, 316, 114-123 (1992)及びGastroenterology, 115, 874-882 (1998)に従い、単位組織量（１００ｍｇ）当たりに産生されるＰＧＥ２量として測定した。すなわち、小腸粘膜を筋層からヘラで剥離後、粘膜はそのまま丁寧に混合、筋層ははさみで細切し混合した後、タイロード溶液中で３７℃で５分インキュベートした後、氷上で３０秒ポリトロンにてホモジナイズし、１００００ｒｐｍで１５分遠心し、上清を採取した。その上清中のＰＧＥ２量をＥＩＡ ｋｉｔ（Cayman Chemical Company）にて測定した。
【００５４】
インドメタシン投与により粘膜及び筋層のＰＧＥ２産生能は減少したが、ＯＧＴの投与により粘膜のＰＧＥ２産生能の減少を有意に抑制した。筋層は有意差は認められなかったが産生能の減少を抑制する傾向が認められた。結果を図５に示す。
【００５５】
［実施例６］正常マウスの小腸ＰＧＥ２産生能に対するＯＧＴの作用
ＳＰＦ飼育の７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス５匹を２４時間絶食させた後、ＯＧＴを２％の割合でＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌に混ぜ投与を行った。ＯＧＴ投与４８時間後のマウスより小腸を摘出し、実施例５と同様にＰＧＥ２産生能を検討した。結果を図６に示す。
【００５６】
ＯＧＴは正常動物においても腸組織の粘膜に特異的にＰＧＥ２産生能を増加させた。インドメタシンによる産生能の減少を抑制するというよりも、予め粘膜でＰＧＥ２産生能を増やすことにより予防的効果を示すことが示唆された。
【００５７】
これら正常動物におけるＰＧＥ２産生能は実施例５でわかるようにインドメタシン投与により著しく減少してしまい、実施例５で示したＯＧＴによるＰＧＥ２産生能の増加は正常動物に比べると僅かの量である。しかし、ＰＧＥ２による消化管粘膜改善作用には閾値があることが知られており（British Journal of Pharmacology, 124, 1385-1394 (1998)）、たとえ僅かの量でも適切な部位で適切な量の発現があることが重要であるといわれている。
【００５８】
［実施例７］粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２及びサイトカイン産生の検討
（Ａ）実施例６と同様にＯＧＴを投与したマウスより粘膜固有層単核球をNature Medicine 5, 900-906 (1999)及びThe Journal of Immunology, 145, 68-77 (1990)に従い調製した。
【００５９】
すなわち、常法に従い腸間膜・脂肪・パイエル板と上皮細胞・粘膜上皮間リンパ球を除去した残りの小腸断片をコラゲナーゼ１２０ｕ／ｍｌ入りの２％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２５ｍｌ中で３７℃、７５分インキュベートし、その上清と、腸残渣を丁寧にすりつぶして１００μｍのメッシュを通した溶液をあわせ、それを２０００ｒｐｍで遠心して得られた沈殿を粗精製粘膜固有層単核球とした。更に、その分画を７５％／４０％ Ｐｅｒｃｏｌｌにて密度勾配遠心して中間層に得られた画分を精製粘膜固有層単核球とした。精製粘膜固有層単核球を１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＬＰＳ１μｇ／ｍｌで刺激し３７℃で２４時間培養した。結果を図７（Ａ）に示す。
【００６０】
ＯＧＴの投与により精製粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生が増加し、またＩＬ−１０が増加、ＩＬ−１βが減少した。
（Ｂ）実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与し４８時間後のマウスより粘膜固有層単核球を調製した。インドメタシン投与条件では精製粘膜固有層単核球は得られた細胞数が少なかったため、Ｐｅｒｃｏｌｌで精製する前の粗精製粘膜固有層単核球を用いた。培養条件は前記（Ａ）と同様に行った。結果を図７（Ｂ）に示す。
【００６１】
インドメタシン投与後の粗精製粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生はＯＧＴ投与により増加した。また、粘膜保護的に作用するといわれるＩＬ−１０の産生も増加していたが、炎症性サイトカインの１つであるＩＬ−１βの産生はＯＧＴの投与により減少した。
【００６２】
以上からＯＧＴは粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生を増加させ、サイトカイン産生を制御することにより粘膜保護的に働くことが示唆された。
【００６３】
［実施例８］ＯＧＴ構成生薬によるインドメタシン誘発個体死に対する作用
ＯＧＴ構成生薬である黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子によるインドメタシン誘発個体死に対する作用を検討した。黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子としては、それぞれ製造例２〜５で製造したエキス粉末を用いた。
【００６４】
実施例１と同様にインドメタシンを投与した。各構成生薬は２％で実施例１と同様に混餌投与した。結果を表１に示す。黄連、黄柏及び黄ごんにＯＧＴと同様の個体死抑制作用が認められた。
【００６５】
［実施例９］ベルベリン、コプチシン等によるインドメタシン誘発個体死に対する作用
実施例１と同様にインドメタシンを投与した。各成分はＯＧＴ２％中に含まれる成分１倍量を、それぞれ単独投与、又はベルベリン及びコプチシン、もしくはベルベリン及びパルマチンを併用して投与した。結果を表１に示す。その結果、ベルベリンまたはコプチシン単独でも有効であったが、ベルベリンをコプチシン又はパルマチンと併用した場合に特に有効であることがわかった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
［実施例１０］粘膜ＰＧＥ２産生能に対する成分の作用の検討
（１）実施例７と同様にインドメタシン非投与・投与したマウスにベルベリンをＯＧＴ２％中に含まれると思われる２倍量（0.14% in diet）投与した投与した小腸粘膜のＰＧＥ２産生能を測定した。その結果、ベルベリン非投与群に対して、インドメタシン非投与では１．２７倍に、インドメタシン投与では１．３２倍にＰＧＥ２産生能が増加していることがわかった。
【００６８】
（２）実施例７と同様にインドメタシン非投与・投与したマウスにコプチシンをＯＧＴ２％中に含まれると思われる２倍量(0.14%)（以下同様）、又はベルベリン２倍量(0.14％)とコプチシン２倍量(0.014%)を同時に投与した小腸粘膜のＰＧＥ２産生能を測定した。その結果、コプチシン単独ではＰＧＥ２産生能の増加が認められなかったが、ベルベリン・コプチシン併用投与群においては、ベルベリン・コプチシン非投与群に対して、インドメタシン非投与では１．３７２倍に、インドメタシン投与では１．１７２倍にＰＧＥ２産生能が増加していることがわかった。
【００６９】
これらの結果より、ベルベリンなどのイソキノリチジン系アルカロイドに粘膜ＰＧＥ２産生能増加作用があるが、それらは単一の成分で投与するよりも併用投与した方が効果が高いことが判明した。
以下、本発明のＰＧＥ２産生促進剤の製剤例を挙げる。
【００７０】
［製剤例１］黄連解毒湯のカプセル剤の製造
製造例１により製造した黄連解毒湯の乾燥エキス粉末５００ｍｇを硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００７１】
［製剤例２］黄連のカプセル剤の製造
製造例２により得た黄連の乾燥エキス粉末５００ｍｇを硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００７２】
［製剤例３］黄柏の錠剤の製造
製造例３により得た黄柏の乾燥エキス粉末２５０ｇを結晶セルロース４７ｇ及びステアリン酸マグネシウム３ｇと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径９ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。本錠剤１錠中には、黄柏の乾燥エキス粉末を２５０ｍｇ含有する。
【００７３】
［製剤例４］
（１）結晶セルロース ８４．５ｇ
（２）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５ｇ
（４）ベルベリン １０ｇ
計 １００ｇ
【００７４】
前記の処方に従って（１）、（４）及び（２）の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）及び（２）の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。
【００７５】
この錠剤一錠には、ベルベリン２０ｍｇが含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服用する。
【００７６】
［製剤例５］
（１）結晶セルロース ７９．５ｇ
（２）１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液 ５０ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５ｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ
（５）コプチシン １０ｇ
計 １４５ｇ
【００７７】
前記の処方に従って（１）、（２）及び（５）を均一に混合し、常法により捏和し、押し出し造粒機により造粒し、乾燥・解砕した後、（３）及び（４）を混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。この錠剤一錠には、コプチシン２０ｍｇが含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服用する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】インドメタシン誘発小腸炎による個体死に対する黄連解毒湯（ＯＧＴ）の効果を示す図である。 ○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図２】インドメタシン誘発小腸炎による個体死に対する黄連解毒湯（ＯＧＴ）の効果の投与時期の変更による影響を示す図である。 ○ コントロール □ ｄａｙ−４〜−１ ＯＧＴ × ｄａｙ０〜３ ＯＧＴ
【図３】黄連解毒湯（ＯＧＴ）の腸組織への作用を示す図である。
【図４】黄連解毒湯（ＯＧＴ）による小腸潰瘍改善を様々な指標（潰瘍数（Ａ）、潰瘍面積（Ｂ）及び潰瘍グレード（Ｃ））で評価した結果を示す図である。○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図５】インドメタシンによる小腸粘膜（Ａ）及び筋層（Ｂ）におけるＰＧＥ２産生低下に対するＯＧＴの作用を示す図である。 ○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図６】正常マウスの小腸ＰＧＥ２産生能に対するＯＧＴの作用を示す図である。
【図７】粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２及びサイトカイン産生の検討結果を示す図である。 Ｎｏｒｍａｌ インドメタシン非投与，Ｃｏｎｔｒｏｌ インドメタシン投与
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロスタグランジンＥ２産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸でのプロスタグランジンＥ２（以下「ＰＧＥ２」という。）及びＰＧＥ２産生酵素であるシクロオキシゲナーゼ（以下「ＣＯＸ」という。）の役割については近年考え方が変化してきている。
【０００３】
元来、ＰＧＥ２は単なる炎症性メディエーターとしての捉え方であり、炎症部位においてはＰＧＥ２を抑制することで治癒すると考えられてきた。その考え方で進められてきたのがＣＯＸ阻害剤の開発である。しかし、ＣＯＸ阻害剤には副作用として胃や小腸粘膜の潰瘍が認められることがわかってきた。そこで更にＣＯＸの２つのアイソザイムそれぞれに特異的な阻害剤が開発された。その結果、ＣＯＸ−２阻害剤であれば、胃粘膜傷害を抑制できることがわかってきた。しかし、ＣＯＸ−２阻害剤であっても、依然として小腸粘膜潰瘍はほとんど抑制できなかった。そこで近年、これまでとは異なるＰＧＥ２の役割が知られるようになってきた。すなわち、小腸粘膜においてＰＧＥ２は炎症性メディエーターではなく、逆に、粘膜保護作用を持つＩＬ−１０などのサイトカイン産生等の免疫反応を含めた、腸粘膜の恒常性維持を制御するキー物質であるということである（非特許文献１）。
【０００４】
ＣＯＸ−２阻害剤又は非ステロイド系抗炎症剤（以下「ＮＳＡＩＤ」という。）によるクローン病様の腸病変がリウマチなどでＮＳＡＩＤを連用している患者の６０〜７０％に認められているという報告（非特許文献２）もあり、またＮＳＡＩＤの使用は他の原因による炎症性腸疾患の増悪因子としてもよく知られている。ＮＳＡＩＤの副作用のうち胃潰瘍（症状が見えやすくわかりやすい）がほぼ解決した現在、ＮＳＡＩＤによる腸障害が今後注目されてくると考えられ、その場合の市場は非常に大きなものとなってくる可能性がある。
【０００５】
このように、新たにわかってきたＰＧＥ２の腸粘膜保護作用に着目して開発された物質はほとんど知られていない。
【０００６】
一方、黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子からなる漢方処方である黄連解毒湯は、ＣＯＸ−２活性を抑制して大腸の前癌病変の発生を抑制することが報告されているが（非特許文献３；特許文献１）、小腸粘膜におけるＰＧＥ２産生に対する効果については知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開平８−３３７５３５号公報
【非特許文献１】Digestive Diseases and Sciences, 47, 84-89 (2002)
【非特許文献２】Gastroenterology, 104, 1832-1847 (1993)
【非特許文献３】Cancer Letters, 157, 9-14 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、クローン病治療剤、ＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用なＰＧＥ２産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するＰＧＥ２産生促進剤。
（２）黄連解毒湯を含有する前記（１）に記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（３）ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するＰＧＥ２産生促進剤。
（４）更に、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（５）小腸粘膜におけるＰＧＥ２の産生を促進させる前記（１）〜（４）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＰＧＥ２産生促進剤を含有するＮＳＡＩＤの副作用低減剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、クローン病治療剤、ＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用なＰＧＥ２産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤の有効成分としては、黄連、黄柏、黄ごんもしくはこれらの抽出物、又はベルベリン、コプチシン又はベルベリン及びコプチシンの少なくともいずれかを含有する植物もしくはその抽出物を含むものであれば特に制限はなく、これらは単独で又は混合して用いることができる。
【００１２】
また、黄連、黄柏、黄ごん又はこれらの抽出物を構成生薬に含む混合生薬又はその抽出物、例えば黄連解毒湯、三黄瀉心湯、乙字湯、大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡加竜骨牡蛎湯、半夏瀉心湯、半夏白朮天麻湯、七物降下湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、五淋散、温清飲、清上防風湯、防風通聖散、女神散、柴陥湯、竜胆瀉肝湯、柴胡清肝湯、二朮湯、清肺湯、竹・温胆湯、滋陰降火湯、柴朴湯、辛夷清肺湯、小柴胡湯加桔梗石膏、清心・子飲、黄連湯、三物黄・湯、清暑益気湯等を用いてもよく、好ましくは黄連解毒湯、半夏瀉心湯、温清飲が好ましく、特に黄連解毒湯が好ましい。
【００１３】
ベルベリン及びコプチシンの少なくともいずれかを含有する植物としては、前記のオウレン、キハダの他、アキカラマツ、イヌザンショウ、エンゴサク、ナツメ、サネブトナツメ、ヒイラギナンテン、ヒドラスチスコン、ヒナゲシ、メギ、ヤマブキソウなどが挙げられる。
【００１４】
前記の抽出物としては、例えば水、エタノール、アセトン、エーテル又はこれらの混合物のような各種溶剤による抽出物が挙げられるが、水抽出物を用いることが好ましい。具体的な抽出物の調製例としては、前記生薬を８〜２０倍量の熱水で抽出し、得られた抽出液を濾過する方法が挙げられる。この抽出物は必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末として用いることができる。
【００１５】
ベルベリン及びコプチシンは公知化合物であり、前記のオウレン、キハダ等を適宜抽出操作に付すことにより得ることができる。
【００１６】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、ＰＧＥ２産生促進効果の点で、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００１７】
パルマチンも公知化合物であり、オウレン、キハダ等を適宜抽出操作に付すことにより得ることができる。パルマチンを含有する植物としては、前記のオウレン、キハダの他、コロンボ、チョウセンゴヨウ、ヒイラギナンテン、メギなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、小腸粘膜におけるＰＧＥ２の産生を促進させる効果を有し、クローン病治療剤（特に、小腸粘膜障害の改善）及びＮＳＡＩＤの副作用低減剤等として有用である。前記ＮＳＡＩＤとしては特に制限はなく、例えばアスピリン（アセチルサリチル酸）、インドメタシン、イブプロフェン、フェニルブタゾン、サラゾスルファピリジン、メサラジンが挙げられ、これらの副作用としては、例えば小腸粘膜障害、気管支喘息等が挙げられる。
【００１９】
以下、本発明のＰＧＥ２産生促進剤の投与量及び製剤化について説明する。
前記の有効成分はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び人に投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２０】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で有効成分の重量として５００ｍｇ〜３ｇを１日数回に分けての服用が適当である。
【００２１】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。
【００２２】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。それぞれの具体例は以下に示すごとくである。
【００２３】
［結合剤］
デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。
【００２４】
［崩壊剤］
デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。
【００２５】
［界面活性剤］
ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０。
【００２６】
［滑沢剤］
タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール。
【００２７】
［流動性促進剤］
軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム。
【００２８】
また、本発明のＰＧＥ２産生促進剤は、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。
【００２９】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で有効成分の重量として１日５０〜３００ｍｇまでの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。
【００３０】
この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。
【００３１】
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【実施例】
【００３２】
以下、製造例、実施例及び製剤例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
［製造例１］黄連解毒湯の抽出物の製造
生薬を切裁し、黄連解毒湯の原料生薬１７ｋｇ（黄連４ｋｇ、黄柏３ｋｇ、黄ごん６ｋｇ及び山梔子４ｋｇ）を秤量・調合し、約１２倍量の精製水に加え、撹拌しながら９５〜１００℃に昇温させ、昇温後、約６０分間抽出した。抽出終了後、抽出液を固液分離し、分離液を減圧濃縮した後、噴霧乾燥により１．５ｋｇの黄連解毒湯乾燥エキス粉末とした。
【００３４】
［製造例２］黄連の抽出物の製造
黄連２５ｇに２．５リットルの精製水を加え、ほぼ半量になるまで煎出を行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液を得た。濾液を室温まで冷却した後、噴霧乾燥して乾燥エキス粉末を得た。
【００３５】
［製造例３］黄柏の抽出物の製造
黄柏１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、１００℃で１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、噴霧乾燥して１５００ｇの乾燥エキス粉末を得た。
【００３６】
［製造例４］黄ごんの抽出物の製造
黄ごん１００ｇに２リットルの精製水を添加し、約半量になるまで煮沸した後濾過し、得られた濾液を濃縮した後、噴霧乾燥を行い乾燥エキス粉末を得た。
【００３７】
［製造例５］山梔子の抽出物の製造
山梔子２００ｇを細切し、土瓶に入れ、蒸留水１２リットルを加え、１００℃で１時間）煮沸した。抽出液を濾過後、減圧濃縮し、噴霧乾燥し、褐色粉末状の抽出エキス５３ｇを得た。
【００３８】
［実施例１］黄連解毒湯による生存率の増加
ＳＰＦ飼育の７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２５匹を用いた。黄連解毒湯（以下「ＯＧＴ」という。）は製造例１で製造したエキス粉末を用いた。
【００３９】
２４時間絶食した翌日、１回目のインドメタシン投与を実施し、それと同時に摂餌を再開し、この日をｄａｙ０（ｔｉｍｅ０）とした。インドメタシンは２０ｍｇ／ｋｇを１日１回２４時間間隔で２回皮下投与した。ＯＧＴ群は試験開始日よりＯＧＴを２％の割合でＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌に混ぜ投与を行い、Ｃｏｎｔｒｏｌ群はＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌のみを投与した。摂餌量から計算したところ２％混餌ＯＧＴのＯＧＴ投与量は２〜３ｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当した。結果を図１に示す。
【００４０】
ＯＧＴはインドメタシン誘発小腸炎による個体死を有意に抑制し、治療効果を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００５、ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群においては特にｄａｙ２〜３という初期に死亡する動物が多かった。
【００４１】
また、ＯＧＴ投与量を変えて２％、１％又は０．５％混餌したとき、ｄａｙ９での 生存率はそれぞれ８５％、７０％、６５％であり（このときＯＧＴ非投与Ｃｏｎｔｒｏｌ群は２０％）、投与量依存的にＯＧＴの作用が認められた。
【００４２】
［実施例２］ＯＧＴの投与時期の変更による影響
ＯＧＴの投与時期を変えて生存率に対する影響を検討した。
実施例１と同様にインドメタシンを投与し、ＯＧＴ投与時期を変更した（Ｎ＝１０匹）。結果を図２に示す。
【００４３】
ｄａｙ０〜３の期間投与した時で１００％、絶食前に３日間（ｄａｙ−４〜−１）与えたときも７０％の生存率であった。
【００４４】
ＯＧＴは炎症誘導初期に効果を示していることから、炎症が激しい急性期における治療効果を有する。また、腸炎誘導前の投与により効果を示していることから予防効果も有し、クローン病の既往歴を有する患者にＯＧＴを投与することにより、クローン病の再発を防止できると考えられる。
【００４５】
［実施例３］ＯＧＴの腸組織への作用
ＯＧＴの腸組織への作用を観察した。
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与した。インドメタシンの最初の投与より６０時間後のマウスの小腸を摘出し、１５％中性ホルマリン固定後、長さ５ｍｍ程度に輪状に細切し３０〜４０個の腸管切片を作成し、常法に従いパラフィンブロックを作製して病理組織標本をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。結果を図３に示す。
【００４６】
インドメタシンの投与により小腸に筋層まで達する潰瘍が形成された。ＯＧＴ投与により潰瘍面積及び潰瘍数は減少し、また潰瘍が発生していても、潰瘍部では絨毛の欠落は認められたものの固有層から筋層にかけ保存されており、軽度であった。すなわち、ＯＧＴは生存率だけでなく小腸潰瘍の悪化を防いだ。
【００４７】
［実施例４］ＯＧＴによる小腸潰瘍改善の評価
ＯＧＴによる小腸潰瘍改善を様々な指標で評価した。
（Ａ）潰瘍数
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与した（Ｎ＝５）。初回のインドメタシン投与後１２、２４、３６、４８及び５４時間の小腸を摘出し、腸間膜付着部に沿って切開し、腸管全体が平らになるようにろ紙に貼り付けて１５％中性ホルマリンで２日以上固定した。その後、生理食塩水を入れた透明ビニール袋に小腸を移して密封し、実体顕微鏡にて巨視的に顕微鏡で観察し、小腸全体の潰瘍の数を計数し、各群の一匹当たりの平均を求めた。結果を図４（Ａ）に示す。
【００４８】
（Ｂ）潰瘍面積
（Ａ）の標本からImage Processor for Analytical Pathology（住化テクノサービス株式会社）に潰瘍画像を取り込み、手動で面積を算定し各群の一匹当たりの平均を示した。結果を図４（Ｂ）に示す。
【００４９】
（Ｃ）潰瘍グレード
（Ｂ）の算定終了後の小腸全長をロール状に巻いた後、パラフィン包埋・ＨＥ染色を行い、組織検査を実施し、以下に示す潰瘍グレードごとの潰瘍数を計測し、各群の一匹当たりの平均を示した。結果を図４（Ｃ）に示す。
グレード１：絨毛上皮あるいは絨毛から陰窩にかけて壊死・脱落した場合
グレード２：粘膜から粘膜固有層まで壊死・脱落した場合
グレード３：粘膜から粘膜筋板まで壊死・脱落した場合
グレード４：粘膜から粘膜下組織まで壊死・脱落した場合
グレード５：粘膜から筋層まで壊死・脱落した場合（穿孔性を含む）
【００５０】
１匹当たりの潰瘍数、潰瘍面積ともＯＧＴ投与により有意に改善された。潰瘍グレードは投与３６時間後のグレード分布を有意に改善した（ｐ＜０．０１，Mann-Whitney’s U test）。その他の時間についても改善傾向が認められた。
【００５１】
［実施例５］インドメタシン誘発小腸障害における小腸ＰＧＥ２産生能低下に対するＯＧＴの作用
インドメタシン投与後の小腸粘膜におけるＰＧＥ２産生能の変化を検討した。
【００５２】
実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与し、１２、２４、３６、４８及び５４時間後のマウスを麻酔下で脱血死させ、小腸を摘出し、生理食塩水で洗浄後、脂肪を除去し、腸間膜の接着部に沿って縦に切り開いた（Ｎ＝５、但し、Ｃｏｎｔｒｏｌの５４時間後のみＮ＝４）。
【００５３】
組織中のＰＧＥ２産生能はArch. Int. Pharmacodyn, 316, 114-123 (1992)及びGastroenterology, 115, 874-882 (1998)に従い、単位組織量（１００ｍｇ）当たりに産生されるＰＧＥ２量として測定した。すなわち、小腸粘膜を筋層からヘラで剥離後、粘膜はそのまま丁寧に混合、筋層ははさみで細切し混合した後、タイロード溶液中で３７℃で５分インキュベートした後、氷上で３０秒ポリトロンにてホモジナイズし、１００００ｒｐｍで１５分遠心し、上清を採取した。その上清中のＰＧＥ２量をＥＩＡ ｋｉｔ（Cayman Chemical Company）にて測定した。
【００５４】
インドメタシン投与により粘膜及び筋層のＰＧＥ２産生能は減少したが、ＯＧＴの投与により粘膜のＰＧＥ２産生能の減少を有意に抑制した。筋層は有意差は認められなかったが産生能の減少を抑制する傾向が認められた。結果を図５に示す。
【００５５】
［実施例６］正常マウスの小腸ＰＧＥ２産生能に対するＯＧＴの作用
ＳＰＦ飼育の７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス５匹を２４時間絶食させた後、ＯＧＴを２％の割合でＡＩＮ−９３Ｍ粉末餌に混ぜ投与を行った。ＯＧＴ投与４８時間後のマウスより小腸を摘出し、実施例５と同様にＰＧＥ２産生能を検討した。結果を図６に示す。
【００５６】
ＯＧＴは正常動物においても腸組織の粘膜に特異的にＰＧＥ２産生能を増加させた。インドメタシンによる産生能の減少を抑制するというよりも、予め粘膜でＰＧＥ２産生能を増やすことにより予防的効果を示すことが示唆された。
【００５７】
これら正常動物におけるＰＧＥ２産生能は実施例５でわかるようにインドメタシン投与により著しく減少してしまい、実施例５で示したＯＧＴによるＰＧＥ２産生能の増加は正常動物に比べると僅かの量である。しかし、ＰＧＥ２による消化管粘膜改善作用には閾値があることが知られており（British Journal of Pharmacology, 124, 1385-1394 (1998)）、たとえ僅かの量でも適切な部位で適切な量の発現があることが重要であるといわれている。
【００５８】
［実施例７］粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２及びサイトカイン産生の検討
（Ａ）実施例６と同様にＯＧＴを投与したマウスより粘膜固有層単核球をNature Medicine 5, 900-906 (1999)及びThe Journal of Immunology, 145, 68-77 (1990)に従い調製した。
【００５９】
すなわち、常法に従い腸間膜・脂肪・パイエル板と上皮細胞・粘膜上皮間リンパ球を除去した残りの小腸断片をコラゲナーゼ１２０ｕ／ｍｌ入りの２％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２５ｍｌ中で３７℃、７５分インキュベートし、その上清と、腸残渣を丁寧にすりつぶして１００μｍのメッシュを通した溶液をあわせ、それを２０００ｒｐｍで遠心して得られた沈殿を粗精製粘膜固有層単核球とした。更に、その分画を７５％／４０％ Ｐｅｒｃｏｌｌにて密度勾配遠心して中間層に得られた画分を精製粘膜固有層単核球とした。精製粘膜固有層単核球を１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＬＰＳ１μｇ／ｍｌで刺激し３７℃で２４時間培養した。結果を図７（Ａ）に示す。
【００６０】
ＯＧＴの投与により精製粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生が増加し、またＩＬ−１０が増加、ＩＬ−１βが減少した。
（Ｂ）実施例１と同様にインドメタシン及びＯＧＴを投与し４８時間後のマウスより粘膜固有層単核球を調製した。インドメタシン投与条件では精製粘膜固有層単核球は得られた細胞数が少なかったため、Ｐｅｒｃｏｌｌで精製する前の粗精製粘膜固有層単核球を用いた。培養条件は前記（Ａ）と同様に行った。結果を図７（Ｂ）に示す。
【００６１】
インドメタシン投与後の粗精製粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生はＯＧＴ投与により増加した。また、粘膜保護的に作用するといわれるＩＬ−１０の産生も増加していたが、炎症性サイトカインの１つであるＩＬ−１βの産生はＯＧＴの投与により減少した。
【００６２】
以上からＯＧＴは粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２産生を増加させ、サイトカイン産生を制御することにより粘膜保護的に働くことが示唆された。
【００６３】
［実施例８］ＯＧＴ構成生薬によるインドメタシン誘発個体死に対する作用
ＯＧＴ構成生薬である黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子によるインドメタシン誘発個体死に対する作用を検討した。黄連、黄柏、黄ごん及び山梔子としては、それぞれ製造例２〜５で製造したエキス粉末を用いた。
【００６４】
実施例１と同様にインドメタシンを投与した。各構成生薬は２％で実施例１と同様に混餌投与した。結果を表１に示す。黄連、黄柏及び黄ごんにＯＧＴと同様の個体死抑制作用が認められた。
【００６５】
［実施例９］ベルベリン、コプチシン等によるインドメタシン誘発個体死に対する作用
実施例１と同様にインドメタシンを投与した。各成分はＯＧＴ２％中に含まれる成分１倍量を、それぞれ単独投与、又はベルベリン及びコプチシン、もしくはベルベリン及びパルマチンを併用して投与した。結果を表１に示す。その結果、ベルベリンまたはコプチシン単独でも有効であったが、ベルベリンをコプチシン又はパルマチンと併用した場合に特に有効であることがわかった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
［実施例１０］粘膜ＰＧＥ２産生能に対する成分の作用の検討
（１）実施例７と同様にインドメタシン非投与・投与したマウスにベルベリンをＯＧＴ２％中に含まれると思われる２倍量（0.14% in diet）投与した投与した小腸粘膜のＰＧＥ２産生能を測定した。その結果、ベルベリン非投与群に対して、インドメタシン非投与では１．２７倍に、インドメタシン投与では１．３２倍にＰＧＥ２産生能が増加していることがわかった。
【００６８】
（２）実施例７と同様にインドメタシン非投与・投与したマウスにコプチシンをＯＧＴ２％中に含まれると思われる２倍量(0.14%)（以下同様）、又はベルベリン２倍量(0.14％)とコプチシン２倍量(0.014%)を同時に投与した小腸粘膜のＰＧＥ２産生能を測定した。その結果、コプチシン単独ではＰＧＥ２産生能の増加が認められなかったが、ベルベリン・コプチシン併用投与群においては、ベルベリン・コプチシン非投与群に対して、インドメタシン非投与では１．３７２倍に、インドメタシン投与では１．１７２倍にＰＧＥ２産生能が増加していることがわかった。
【００６９】
これらの結果より、ベルベリンなどのイソキノリチジン系アルカロイドに粘膜ＰＧＥ２産生能増加作用があるが、それらは単一の成分で投与するよりも併用投与した方が効果が高いことが判明した。
以下、本発明のＰＧＥ２産生促進剤の製剤例を挙げる。
【００７０】
［製剤例１］黄連解毒湯のカプセル剤の製造
製造例１により製造した黄連解毒湯の乾燥エキス粉末５００ｍｇを硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００７１】
［製剤例２］黄連のカプセル剤の製造
製造例２により得た黄連の乾燥エキス粉末５００ｍｇを硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００７２】
［製剤例３］黄柏の錠剤の製造
製造例３により得た黄柏の乾燥エキス粉末２５０ｇを結晶セルロース４７ｇ及びステアリン酸マグネシウム３ｇと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径９ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。本錠剤１錠中には、黄柏の乾燥エキス粉末を２５０ｍｇ含有する。
【００７３】
［製剤例４］
（１）結晶セルロース ８４．５ｇ
（２）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５ｇ
（４）ベルベリン １０ｇ
計 １００ｇ
【００７４】
前記の処方に従って（１）、（４）及び（２）の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）及び（２）の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。
【００７５】
この錠剤一錠には、ベルベリン２０ｍｇが含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服用する。
【００７６】
［製剤例５］
（１）結晶セルロース ７９．５ｇ
（２）１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液 ５０ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５ｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ
（５）コプチシン １０ｇ
計 １４５ｇ
【００７７】
前記の処方に従って（１）、（２）及び（５）を均一に混合し、常法により捏和し、押し出し造粒機により造粒し、乾燥・解砕した後、（３）及び（４）を混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。この錠剤一錠には、コプチシン２０ｍｇが含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服用する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】インドメタシン誘発小腸炎による個体死に対する黄連解毒湯（ＯＧＴ）の効果を示す図である。 ○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図２】インドメタシン誘発小腸炎による個体死に対する黄連解毒湯（ＯＧＴ）の効果の投与時期の変更による影響を示す図である。 ○ コントロール □ ｄａｙ−４〜−１ ＯＧＴ × ｄａｙ０〜３ ＯＧＴ
【図３】黄連解毒湯（ＯＧＴ）の腸組織への作用を示す図である。
【図４】黄連解毒湯（ＯＧＴ）による小腸潰瘍改善を様々な指標（潰瘍数（Ａ）、潰瘍面積（Ｂ）及び潰瘍グレード（Ｃ））で評価した結果を示す図である。○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図５】インドメタシンによる小腸粘膜（Ａ）及び筋層（Ｂ）におけるＰＧＥ２産生低下に対するＯＧＴの作用を示す図である。 ○ コントロール（ＯＧＴ非投与） ● ＯＧＴ
【図６】正常マウスの小腸ＰＧＥ２産生能に対するＯＧＴの作用を示す図である。
【図７】粘膜固有層単核球からのＰＧＥ２及びサイトカイン産生の検討結果を示す図である。 Ｎｏｒｍａｌ インドメタシン非投与，Ｃｏｎｔｒｏｌ インドメタシン投与
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項２】
黄連解毒湯を含有する請求項１記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項３】
ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項４】
更に、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項５】
小腸粘膜におけるプロスタグランジンＥ２の産生を促進させる請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有する非ステロイド系抗炎症剤の副作用低減剤。
【請求項１】
黄連、黄柏、黄ごん及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項２】
黄連解毒湯を含有する請求項１記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項３】
ベルベリン、コプチシン及びこれらの少なくともいずれかを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有するプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項４】
更に、パルマチン及びパルマチンを含有する植物及びその抽出物から選ばれる少なくとも１種を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項５】
小腸粘膜におけるプロスタグランジンＥ２の産生を促進させる請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有するクローン病治療剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロスタグランジンＥ２産生促進剤を含有する非ステロイド系抗炎症剤の副作用低減剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−２２３９７１（Ｐ２００７−２２３９７１Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４８７８８（Ｐ２００６−４８７８８）
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（０００００３６６５）株式会社ツムラ (43)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（０００００３６６５）株式会社ツムラ (43)
【Ｆターム（参考）】
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