プロテインＡ融合ポリペプチドの製造に利用するＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法
【課題】
本発明は、ブレビバチルス属細菌を用いた、効率の良いポリペプチドの分泌発現方法の提供を課題とする。
【解決手段】
プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に所望のポリペプチドを連結した融合生成物を、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させる。本発明に従えば、所望のポリペプチドを含む融合生成物を効率良く生産でき、また、融合領域の有する親和性を利用して、当該融合生成物を培養液から簡便に精製できる。
本発明は、ブレビバチルス属細菌を用いた、効率の良いポリペプチドの分泌発現方法の提供を課題とする。
【解決手段】
プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に所望のポリペプチドを連結した融合生成物を、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させる。本発明に従えば、所望のポリペプチドを含む融合生成物を効率良く生産でき、また、融合領域の有する親和性を利用して、当該融合生成物を培養液から簡便に精製できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用して、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインもしくはその部分的配列と、所望するポリペプチドとの融合ポリペプチドを製造する際に利用するＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法に関する。本発明のＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、または形質転換体を用いることにより、ブレビバチルス属細菌を使用して、産業上有用なポリペプチドを効率良く製造する事が可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組換え技術の進歩により、各種の生物起源から得られたＤＮＡを発現ベクターに連結し、適当な宿主細胞に導入することで、当該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを生産出来るようになった。この遺伝子組換え技術の有効性から、現在までに様々な微生物を宿主とする数多くの宿主ベクター系が開発され、特に大腸菌および酵母を利用した系が確立されている（非特許文献１）。
【０００３】
近年、鵜高らにより開発されたブレビバチルス・ブレビスを用いた遺伝子組換えポリペプチドの発現系は、ヒト上皮細胞増殖因子を、その生理活性を保持した状態で培養液中に大量に分泌発現できることが知られている（非特許文献１、２）。このブレビバチルス属細菌を用いたポリペプチド発現系は、宿主菌由来の細胞壁蛋白質であるＭＷＰのプロモーター、シャイン・ダルガノ配列および、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターに、成熟型ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結し発現させることで、様々なポリペプチドの直接分泌発現を可能とする（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系は、汎用なポリペプチド生産系として確立されてはいない。なぜならば、ブレビバチルス属細菌によるポリペプチドの分泌発現は、その所望するポリペプチドの性質や特性により発現量が大きく左右されるからである。すなわち原核生物由来で、ジスルフィド結合が存在しない、または少ないポリペプチドは比較的高い生産性が期待できるが、真核生物の分泌ポリペプチドのように複雑な高次構造を有するポリペプチドの分泌発現では、ヒト上皮細胞増殖因子やマグロ成長ホルモンなど一部の例外を除き、生産性が極めて低い（非特許文献２）。複雑な高次構造を有するポリペプチドに対する発現障害は、大腸菌や酵母などの他の微生物を宿主とした場合にも度々認められ、現在、発現障害を改善するために様々な方法が提案されている。
【０００５】
効果的な方法として、所望するポリペプチドを融合ポリペプチドの形態で生産する方法（融合発現法）が提案されている。例えば、大腸菌の場合、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、分子シャペロン（ＤＮＡＪ，ＤＮＡＫ）、またはヒスチジンタグ（６から１０残基程度のヒスチジン残基）等を、所望のポリペプチドのＮ末端、またはＣ末端へ結合させることにより、発現量を向上させる方法が開発されている（非特許文献１）。
【０００６】
また、プロテインＡが有する親和性を精製工程で利用し、所望のポリペプチドの分離、精製を容易にする方法も開発されている(特許文献１)。具体的には、免疫グロブリンに対する親和性を有するプロテインＡとの融合生成物として、所望のポリペプチドを大腸菌またはスタフィロコッカス属細菌等の微生物宿主において発現させ、その融合生成物の精製工程において、プロテインＡが有する親和性を利用して所望のポリペプチドを分離、精製する。
【０００７】
ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、所望のポリペプチドの生産性を向上させる方法として、（１）融合領域として数アミノ酸残基を用い、耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる方法（特許文献２）、（２）ブレビバチルス・ブレビス４７株由来の細胞壁蛋白質のＮ末端から数十アミノ酸残基を融合領域として用い、ヒト成長ホルモンまたはヒトプロインシュリンを融合発現させる方法（特許文献３、４）、（３）カビ由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を融合領域として用い、抗体Ｌ鎖を融合発現させる方法（特許文献５）が知られている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ８４０３１０３号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−１２９５７６号公報
【特許文献３】特開平１１−３４１９９１号公報
【特許文献４】特開２００３−７９３７９号公報
【特許文献５】特開平１１−７５８７９号公報
【非特許文献１】塚越規弘編著，「組換えタンパク質生産法 生物化学実験法」，学会出版センター，２００１年
【非特許文献２】Ｕｄａｋａら，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３年，第２１７巻，２３−３３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般的に、融合ポリペプチドの発現量は、所望のポリペプチドの構造やアミノ酸配列と融合領域との相性に大きく左右され、選択した融合領域が適当でない場合、融合ポリペプチドの大量発現に結びつかないことが知られている。また、上記（１）から（３）で開示された融合領域では、それらが有する親和性を精製工程に利用することができず、所望の融合生成物の分離、精製を簡略化することができない。従って、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系において、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の提供を一つの課題とする。さらに、当該融合ペプチド領域を利用した、ブレビバチルス属細菌による有用ポリペプチドの製造方法の提供を一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、所望のポリペプチドを連結した融合生成物を、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させることにより、上記課題が解決されることを見いだした。本発明は、以下の内容を含む１または複数の特徴を有する。
【００１１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、さらに、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列と作動可能に連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列に関する。 また、本発明は、当該ＤＮＡ配列を含むベクター、および、当該ベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換して得られる形質転換体に関する。さらに、本発明は、当該形質転換体を培養し、培地中に分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系では著しく発現効率が低かったポリペプチドを、融合ポリペプチドとして大量に培養液中へ分泌発現させることが可能となった。さらに、抗体（免疫グロブリンＧ）などを固定化した担体を用いることにより、所望のポリペプチドを含む当該融合ポリペプチドを、培養液から簡便に分離精製することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１４】
１．ＤＮＡ配列およびポリペプチド
本発明の第一の実施形態は、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、０または１以上のアミノ酸配列を介して所望のポリペプチドを連結した融合ポリペプチドを、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させる機能を有するＤＮＡ配列である。詳細には、本発明の実施形態としてのＤＮＡ配列は、（ａ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター、（ｂ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャイン・ダルガノ配列、（ｃ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、の３つの構成要素からなり、かつ、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を互いに作動可能となるよう連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列である。
【００１５】
ここで、本発明における「作動可能となるよう連結せしめる」との記載は、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素がブレビバチルス属細菌内で機能することにより、所望のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが分泌発現するよう、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を必要に応じて適当なＤＮＡを介して（またはＤＮＡを介さず）連結せしめることを意味する。本発明における「作動可能となるよう連結」する概念には、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素に加えて、エンハンサー等を含む各種の調節エレメントまたは制御因子を連結する場合も含まれる。それら調節エレメントまたは制御因子の種類は、宿主によって変わり得ることは当業者に周知の事項である。
【００１６】
本発明において用いられる「プロモーター」は、ブレビバチルス属細菌において作動可能であるプロモーターであればいかなる生物由来のプロモーターでもよい。好ましくはブレビバチルス属細菌由来のプロモーターが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビス又はブレビバチルス・チョウシネンシス由来の細胞壁蛋白質のプロモーターが良く、更に好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のプロモーターが良い。
【００１７】
本発明において用いられる「シャイン・ダルガノ配列」は、ブレビバチルス属細菌において機能する塩基配列であればいかなる原核生物種に由来するものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシャイン・ダルガノ配列が良く、さらに好ましくはブレビバチルス・ブレビスまたはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質をコードしているＤＮＡの上流に存在するシャイン・ダルガノ配列が良い。更により好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、又はブレビバチルス・チョウシネンシス細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））をコードする蛋白質のシャイン・ダルガノ配列が良い。ここでいうシャイン・ダルガノ配列とは、原核生物のｍＲＮＡにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列であり、プリン塩基に富んだ約３から９塩基の配列である。
【００１８】
本発明において用いられる「シグナルペプチド」は、ブレビバチルス属細菌内で発現させた際、そのＣ末端側に連結されたポリペプチドを細胞外に分泌させる機能を有するペプチドであればいかなる生物種由来のものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシグナルペプチドが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）またはｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、さらにブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質（ＨＷＰ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のシグナルペプチドが良い。また天然の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良した配列でも良い。具体的には、前記ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）のシグナルペプチドＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａに、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ｘ）−Ａｒｇ（ｘ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ａｌａ（ｘ）−Ｓｅｒ（ｘ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、中の（ｘ）部分で示すアミノ酸配列のように塩基性や疎水性アミノ酸残基を付加したシグナルペプチドを用いても良い。さらに、本発明において使用するプロテインＡが本来有するシグナルペプチド配列を使用しても良い。
【００１９】
本発明において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、好ましくはスタフィロコッカス属細菌由来のプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインであり、より好ましくは、図１（配列表の配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） ＣＯＷＡＮＩ株
由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインである。しかし、本明細書において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」なる用語は上記に限定されず、スタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインと、それらドメインのいずれかと類似の構造および機能を有する分子すべてを包含する。具体的には、図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮ１株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列に、１アミノ酸以上の置換、欠失、または挿入を施して得られ、かつ、本発明のＤＮＡ配列の構成要素の１つである融合領域として用いた場合に、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する変異体は、本明細書において用いられる用語「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」に包含される。このような変異体は、図１（配列番号１、２）にて示されるアミノ酸配列および塩基配列情報を基に、当業者であれば容易に作製、もしくは自然界より探索することができる。
【００２０】
また、本発明において融合領域として使用される「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する限り、その個数および順列において何ら制限されるものでない。図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインを例として説明すると、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣの任意の１ドメインを使用しても良いし、任意の２ドメインの順列として得られる２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、任意の３ドメインの順列として得られる１２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、同様に４以上のドメインの順列として得られる配列のうちの１つを使用しても良い。好ましくは、Ｅドメイン（図２、３参照）、Ｅ、Ｄドメインをこの順で連結したもの（図４、５参照）、および、Ｅ、Ｄ、Ａドメインをこの順で連結したもの（図６、７参照）が良い。
【００２１】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」とは、０または１以上のアミノ酸配列からなるペプチドを意味し、本発明のＤＮＡ配列がコードする融合ポリペプチド中に、当該リンカーが実質的に含まれないことをも意味する。当該リンカーを構成するアミノ酸配列に特に制限はないが、当該リンカー中に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を配置することにより、融合生成物から所望のポリペプチドを切り離す工程を容易にすることができる。
【００２２】
本発明において用いられる「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」とは、化学的もしくは酵素的にポリペプチドを切断する際、切断箇所として特異的に認識されるアミノ酸配列を指す。化学的なポリペプチド切断法としては、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または蟻酸を使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｍｅｔ］、［Ａｓｎ−Ｇｌｙ、−Ｌｅｕ、またはＡｌａ］、［Ａｓｐ−Ｐｒｏ］を配置するのが好ましい。酵素的なポリペプチド切断方法としては、例えば、コラゲナーゼ、キモシン、カリクレインＢ、エンテロキナーゼ、トロンビン、ファクターＸａ、またはＴＥＶペプチダーゼを使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸残基）］、［Ｍｅｔ−Ｐｈｅ］、［Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ（Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸残基）］、［（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ（ｎ＝２−４）］、［Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］、［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］、［Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］を配置するのが好ましい。
【００２３】
また、所望するポリペプチド自体の切断が問題とならなければ、より特異性の低いペプチダーゼ等を使用しても良い。具体的には、真核生物または原核生物由来のセリンペプチダーゼやシグナルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、カルボキシルペプチダーゼ、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システインペプチダーゼ、グルタミン酸ペプチダーゼ、金属ペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼのファミリーに属するペプチダーゼ群が利用できる。さらに、上記ペプチダーゼのアミノ酸配列を置換、欠失、付加、または変異導入することで基質特異性を改変させたペプチダーゼを利用することも可能である。
【００２４】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、分離精製用のタグとして使用され得るアミノ酸配列を配置することもできる。「分離精製用のタグ」とは、ポリペプチドの精製を容易にするために付加される、特定物質に対する親和性を有するペプチドを意味し、その具体例としては、ニッケルメタルに対し親和性を有するヒスチジンが複数連結した構造のもの、またはアミロースに対し親和性を有するマルトース結合ポリペプチド等が挙げられる。本発明では前者が好適に用いられ、より好適には６個のヒスチジンの連続配列が用いられる。
【００２５】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、前記「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」、または前記「分離精製用のタグ」のいずれか１つを配置してもよいし、両者を任意の順序で同時に配置してもよい。ただし、所望のポリペプチドから不要な融合領域を極力切除したい場合は、前記「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」の最もＣ末端側に「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」を配置することが好ましい。
【００２６】
本発明における「所望のポリペプチド」としては、例えば、各種の酵素類、ヒト成長ホルモン等のホルモン類、各種の血漿蛋白質類、各種のサイトカイン類、免疫グロブリンＧのＬ鎖、Ｆｄ鎖等の部分抗体、一本鎖抗体等の修飾抗体などが挙げられる。
【００２７】
２．ベクター
本発明の第二の実施形態は、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含むベクターである。本発明の第二の実施形態において用いられるベクターは、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能であればいかなるものでも良いが、好ましくは、ｐＨＹ５００（特開平２‐３１６８２号公報）、ｐＮＵ２００（日本農芸化学会誌６１，６６９‐６７６（１９８７））、ｐＮＨ３２６（図８参照）（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８：５２５−５３１．（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７７：７４５−７４９（１９９５））、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミド（特許第２７２７３９１号）、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２‐２３８５６９号公報）、またはこれらいずれかの誘導体が良い。ただし、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を、ブレビバチルス属細菌の染色体へ組込むことを目的とするベクターの場合、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能である必要はなく、このようなベクターも、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含む限り、本発明に包含される。
【００２８】
３．形質転換体
本発明の第三の実施形態は、本発明の第二の実施形態であるベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体である。本発明の第三の実施形態において用いられるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォーモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・インボカツス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、またはブレビバチルス・サーモルベル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）等が挙げられる。ブレビバチルス・ブレビス、またはブレビバチルス・チョウシネンシスが好ましく、ブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株がより好ましい。また生産量の向上などの目的に応じて上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高分泌発現株のような変異株を使用しても良い。
【００２９】
ブレビバチルス属細菌の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５６：１１３０−１１３４（１９８３））、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ５３：３０９９−３１００（１９８９））、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：２０２−２０３（１９９７））により実施することができる。
【００３０】
４．ポリペプチド製造方法
本発明の第四の実施形態は、本発明の第三の実施形態である形質転換体を培養し、当該形質転換体から分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法である。
【００３１】
当該形質転換体の培養に用いる培地は、当該形質転換体が所望のポリペプチドを効率良く分泌発現できる培地であれば特に制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロールなどの炭素源や、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの窒素源を使用することができ、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン、亜鉛、鉄等の無機塩類が必要に応じて添加される。さらに、栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。培養温度は１５−４２℃、好ましくは約２８−３７℃であり、通気および攪拌により好気的に培養を行うことが望ましいが、もし必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００３２】
当該形質転換体から分泌された、所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、当該形質転換体の培養液から回収、精製することができる。例えば、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー等の手法を利用できる。
【００３３】
特に、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、その分子内にプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列を有しているため、適当な担体に固定化された免疫グロブリンＧ、例えば免疫グロブリンＧセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）等を用いることで、効率良く精製され得る。
【００３４】
また、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に精製用タグを含みうる。この場合、当該箇所に配置した精製用タグを利用して、当該ポリペプチドを精製することも可能である。例えば、精製用タグとしてヒスチジンの連続配列を配置した場合、ニッケルＮＴＡカラム等を用いて精製することが可能である。
【００３５】
さらに、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を含みうる。この場合、当該箇所に配置したアミノ酸配列に応じた方法により、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。例えば、部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列として［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］を配置した場合、ファクターＸａを用いて、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。このような切断反応は、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドの精製工程中のいかなる段階で実施しても良い。切断反応後の所望のポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、さらに精製することができる。
【００３６】
上記のような本発明の各実施形態を利用することで、これまでブレビバチルス属細菌では効率的に生産できなかったポリペプチドを、極めて効率良く生産することが可能となった。従って、本発明の実施形態は、産業上有用なポリペプチドを製造する上で、非常に有用である。
【実施例】
【００３７】
以下に参考例、実施例、図面に基づいて本発明の実施例を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは云うまでもない。本発明に関連する技術分野の当業者は、本発明の説明の範囲内で以下の実施例の変形を認め実行することができる。したがって、そのような変形は、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【００３８】
本発明の実施例の実行にあたり、発現ＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 （１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 刊（米国）。 （２） 村松正實 編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。
（実施例１）プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ配列の単離
スタフィロコッカス・アウレウス Ｃｏｗａｎ Ｉ株を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．２％、グルコース １％、魚肉エキス ０．５％、ｐＨ７．０）を用いて、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄を行った。菌体を再度トリス−塩酸緩衝液にて懸濁後１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出およびエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。公知のプロテインＡの塩基配列（配列番号１）に基づき、上記で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ −３’（配列番号１６）、５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１７）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１８））を用い、ＰＣＲ法により、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡをそれぞれ増幅した。配列番号１５は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号１６は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１７は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１８は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００３９】
また、同様に、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡの３’側に６残基のヒスチジンを付加して増幅する場合は、上記ゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ−３’ （配列番号１９）、 ５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２０）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２１））を用いた。配列番号１９は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２０は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２１は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４０】
得られたＤＮＡ断片は制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。一方、発現ベクターｐＮＨ３２６（図８）（配列番号２２、２３）もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
（実施例２）プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの構築
実施例１にて、制限酵素処理したＤＮＡ断片および発現ベクターｐＮＨ３２６をＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、各免疫グロブリン結合ドメインを有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２、配列番号３および４参照）、ｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３、配列番号５および６参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４、配列番号７および８参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤ（図５、配列番号９および１０参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６、配列番号１１および１２参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７、配列番号１３および１４参照）を構築した。
（実施例３）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターの作成
プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するために、ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖（軽鎖）遺伝子（配列番号２４、２５）の発現を行った。ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、米国特許５６９８１９５号記載の抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の遺伝子配列に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号２７）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号２７は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４１】
この増幅されたヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号２６における上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。この抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片とプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ（図９Ａ）（配列番号２８、２９）を構築した。
（実施例４）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターの作成
上記、抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ遺伝子を有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するため発現ベクターの構築を行った。抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は上記の抗ＴＮＦα抗体Ｈ鎖の遺伝子配列（配列番号３０、３１）に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡ −３’ （配列番号３２）と５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡ−３’（配列番号３３）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号３２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号３３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４２】
この増幅された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号３２の上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。このヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４）およびｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩを用い消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と各プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図９Ｂ、配列番号３４および３５参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図９Ｃ、配列番号３６および３７参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図９Ｄ、配列番号３８および３９参照）を構築した。
（実施例５）抗ヒトＴＮＦα抗体鎖のＬ鎖またはＦｄ鎖単独発現ベクターの作成
プロテインＡ融合型と従来からの目的とするポリペプチド単独で発現させる方法（融合型でない方法）とのポリペプチド発現能を比較検討するため、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖鎖単独発現ベクター、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターを構築した。抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４０）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号４１）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４０は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４３】
また抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４２）と５’− ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧ −３’（配列番号４３）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４４】
Ｌ鎖およびＦｄ鎖をコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化した。発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理によりそれぞれ脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター、および、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌ（図１０Ａ、配列番号４４および４５）、ｐＮＨ３２６−Ｆｄ（図１０Ｂ、配列番号４６および４７）を構築した。
【００４５】
（実施例６）プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの作成
上記抗体以外のポリペプチドに対する本発明の効果を示すために、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを用いプロテインＡ融合発現試験を行った。ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，５９５６−５９６０ （１９８４））を鋳型とし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ−３’ （配列番号４８）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ−３’ （配列番号４９）を用いて、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ増幅した。配列番号４８は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４９は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４６】
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。また発現ベクターとなるｐＰｒｏＡ３Ｅも同様に制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のヒト成長ホルモンＤＮＡ断片とｐＰｒｏＡ３Ｅ発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ （図１１Ａ）（配列番号５０、５１）を構築した。
【００４７】
（実施例７）ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの構築
本発明の有効性を示すため、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、および、特許文献５、６で開示されたブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰを融合部分に用いたＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターを構築した。ヒト成長ホルモン単独発現ベクターを構築するため、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ −３’ （配列番号５２）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ −３’ （配列番号５３）を用い、先述のプラスミドｐＧＨ−Ｌ９を鋳型として、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを増幅した。配列番号５２は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５３は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４８】
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨ（図１１Ｂ）（配列番号５４、５５）を構築した。一方、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターとしては、特許文献５の実施例１および実施例４に記載の方法に従い、ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６ （図１１Ｃ）を構築した。
【００４９】
（実施例８）各発現ベクターを有する形質転換体の作成
実施例２から７で構築した、プロテインＡ融合発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ、ｐＰｒｏＡ４Ｅ、ｐＮＨ３２６）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｌ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｆｄ）、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−ｈＧＨ）、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６）を、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。
【００５０】
（実施例９）抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖の分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体、およびそれらの対照となるベクターｐＮＨ３２６を有する形質転換体の各々を、６０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを添加した３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にて、３０℃で２日間振とう培養した。当該培養液から遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，３分間）により菌体を除去し、得られた培養上清各５μｌを定法に従い処理した後、１０−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。電気泳動後、当該ゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色し、ポリペプチドのバンドを検出した（図１２および、図１３Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【００５１】
図１２は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したものであり、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５２】
図１３は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖［（図１３Ａ） プロテインＡ（Ｅドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｂ） プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｃ） プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合Ｆｄ鎖］を示す。細い矢印は抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株から、発現された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の移動度を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン４は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン５および６は、プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン７は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン８および９は、プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５３】
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、およびプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図１３Ａ参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図１３Ｂ参照）、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図１３Ｃ参照）を有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は飛躍的に上昇した。また、３種類のプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、およびｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体における、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量を比較すると、融合領域として使用するプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインの数を増やす程、融合ポリペプチドの発現量が顕著に増加していた（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ参照）。
【００５４】
（実施例１０）ヒト成長ホルモンの分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、およびヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体の各々を、実施例９と同様に培養した。ただし、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体の培養のみ、培地に添加する薬剤を、ネオマイシン６０ｍｇ／Ｌに替えて、エリスロマイシン１０ｍｇ／Ｌとした。そして、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１４）。
【００５５】
図１４は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られたプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株、およびヒト成長ホルモン単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１はヒト成長ホルモン単独発現株からの培養液５μｌ、レーン２はＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌ、レーン３はプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５６】
実験の結果、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体におけるヒト成長ホルモンの発現は極めて少量であったが、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、および、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体の培養液上清には大量のヒト成長ホルモンが分泌生産されていた（図１４参照）。
【００５７】
（実施例１１）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターの作成
実施例３で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５‘−ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５６）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の前半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５６は、ｓｃＦｖ（single chain variable fragments）の前半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。ｓｃＦｖは、一般的に、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるVHおよびVLで構成される可変領域（Fv）を、フレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントである。
【００５８】
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＮ末端に、ファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇからなる配列が付加されるよう、プライマーを設計した。同様に、実施例４で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号５７）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５８）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の後半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号５７は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５８は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００５９】
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＣ末端に、ヒスチジン６残基が付加されるよう、プライマーを設計した。そして、これら２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により連結し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。
【００６０】
作製したＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、実施例２で作製したプロテインＡ融合発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩ部位にそれぞれ挿入し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ（図１５Ａ）（配列番号５９、６０）、およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ（図１５Ｂ）（配列番号６１、６２）を構築した。
【００６１】
（実施例１２）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターの作成
オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号２６）に替えて、オリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’（配列番号４１）を用いる以外は実施例１１と同様の操作を行い、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００６２】
作製したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化した後、発現ベクターｐＮＨ３２６のマルチクローニングサイトに存在するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖ（図１５Ｃ）（配列番号６３、６４）を構築した。
【００６３】
（実施例１３）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の分泌発現
実施例１１にて得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ、および、実施例１２にて得られた抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。次に、これらの形質転換体を実施例９と同様に培養し、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１６）。
【００６４】
図１６は、ＣＢＢ染色による、実施例１３で得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株、および抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８，２０ｋＤａ）を示す。レーン１および２は各々抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の培養液５μｌ、レーン３および４は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌ、レーン５および６は各々プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを泳動したものである。
【００６５】
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ、ならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は飛躍的に上昇した。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】スタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株のプロテインＡの塩基配列とアミノ酸配列図である。番号はアミノ酸残基数を示す。
【図２】プロテインＡ（Ｅドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥはプロテインＡ免疫グロブリン結合Ｅドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図３】実施例２に記載のプロテインＡ（Ｅドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥはプロテインＡ免疫グロブリン結合Ｅドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図４】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図５】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図６】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤＡの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤＡはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤＡドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図７】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤＡの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤＡはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤＡドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図８】実施例２に記載のブレビバチルス・ブレビスポリペプチド分泌発現ベクターｐＮＨ３２６の構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】実施例３および実施例４に記載のプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター（Ａ） ｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ、およびプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクター（Ｂ） ｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、（Ｃ） ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄおよび（Ｄ） ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ−Ｆｄの構造を示す。
【図１０】実施例５に記載の抗ヒトＴＮＦα抗体鎖単独発現ベクター（Ａ） ｐＮＨ３２６−Ｌ、（Ｂ） ｐＮＨ３２６‐Ｆｄの構造を示す。
【図１１】実施例６および７記載のプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（Ａ） ｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ、（Ｂ） ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨ、および（Ｃ） ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５、の構造を示す。
【図１２】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株との発現量の比較を示す図である。
【００６７】
【図１３】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株との発現量の比較を示す図である。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖［（図１３Ａ） プロテインＡ（Ｅドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｂ） プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｃ） プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合Ｆｄ鎖］を示す。細い矢印は抗ヒトＴＮＦα抗体鎖単独発現株から、発現された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の移動度を示す。
【図１４】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られたプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株、およびヒト成長ホルモン単独発現株との発現量の比較を示す図である。
【図１５】実施例１１で作製したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクター（Ａ）ｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ、（Ｂ）ｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ、および実施例１２で作製した抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクター（Ｃ）ｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖの構造を示す。
【図１６】ＣＢＢ染色による、実施例１３で得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株、および抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８，２０ｋＤａ）を示す。レーン１および２は各々抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の培養液５μｌを、レーン３および４は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを、レーン５および６は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを泳動した。
【符号の説明】
【００６８】
ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ：制限酵素。
【００６９】
ＭＷＰ：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質。
【００７０】
Ｐ５：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質（ＭＷＰ）のプロモーター５。
【００７１】
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ：ヘヤピンループ翻訳終結領域。
【００７２】
Ｒｅｐ：ｐＵＢ１１０由来の複製起点。
【００７３】
Ｎｍ：ネオマイシン耐性遺伝子。
【００７４】
ＳＤ１およびＳＤ２：シャイン・ダルガノ配列。
【００７５】
ＶＬ：Ｌ鎖可変領域。
【００７６】
ＣＬ：Ｌ鎖定常領域。
【００７７】
ＶＨ：Ｈ鎖可変領域。
【００７８】
ＣＨ１：Ｈ鎖定常領域。
【００７９】
ｈ：ヒンジ領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用して、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインもしくはその部分的配列と、所望するポリペプチドとの融合ポリペプチドを製造する際に利用するＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法に関する。本発明のＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、または形質転換体を用いることにより、ブレビバチルス属細菌を使用して、産業上有用なポリペプチドを効率良く製造する事が可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組換え技術の進歩により、各種の生物起源から得られたＤＮＡを発現ベクターに連結し、適当な宿主細胞に導入することで、当該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを生産出来るようになった。この遺伝子組換え技術の有効性から、現在までに様々な微生物を宿主とする数多くの宿主ベクター系が開発され、特に大腸菌および酵母を利用した系が確立されている（非特許文献１）。
【０００３】
近年、鵜高らにより開発されたブレビバチルス・ブレビスを用いた遺伝子組換えポリペプチドの発現系は、ヒト上皮細胞増殖因子を、その生理活性を保持した状態で培養液中に大量に分泌発現できることが知られている（非特許文献１、２）。このブレビバチルス属細菌を用いたポリペプチド発現系は、宿主菌由来の細胞壁蛋白質であるＭＷＰのプロモーター、シャイン・ダルガノ配列および、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターに、成熟型ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結し発現させることで、様々なポリペプチドの直接分泌発現を可能とする（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系は、汎用なポリペプチド生産系として確立されてはいない。なぜならば、ブレビバチルス属細菌によるポリペプチドの分泌発現は、その所望するポリペプチドの性質や特性により発現量が大きく左右されるからである。すなわち原核生物由来で、ジスルフィド結合が存在しない、または少ないポリペプチドは比較的高い生産性が期待できるが、真核生物の分泌ポリペプチドのように複雑な高次構造を有するポリペプチドの分泌発現では、ヒト上皮細胞増殖因子やマグロ成長ホルモンなど一部の例外を除き、生産性が極めて低い（非特許文献２）。複雑な高次構造を有するポリペプチドに対する発現障害は、大腸菌や酵母などの他の微生物を宿主とした場合にも度々認められ、現在、発現障害を改善するために様々な方法が提案されている。
【０００５】
効果的な方法として、所望するポリペプチドを融合ポリペプチドの形態で生産する方法（融合発現法）が提案されている。例えば、大腸菌の場合、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、分子シャペロン（ＤＮＡＪ，ＤＮＡＫ）、またはヒスチジンタグ（６から１０残基程度のヒスチジン残基）等を、所望のポリペプチドのＮ末端、またはＣ末端へ結合させることにより、発現量を向上させる方法が開発されている（非特許文献１）。
【０００６】
また、プロテインＡが有する親和性を精製工程で利用し、所望のポリペプチドの分離、精製を容易にする方法も開発されている(特許文献１)。具体的には、免疫グロブリンに対する親和性を有するプロテインＡとの融合生成物として、所望のポリペプチドを大腸菌またはスタフィロコッカス属細菌等の微生物宿主において発現させ、その融合生成物の精製工程において、プロテインＡが有する親和性を利用して所望のポリペプチドを分離、精製する。
【０００７】
ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、所望のポリペプチドの生産性を向上させる方法として、（１）融合領域として数アミノ酸残基を用い、耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる方法（特許文献２）、（２）ブレビバチルス・ブレビス４７株由来の細胞壁蛋白質のＮ末端から数十アミノ酸残基を融合領域として用い、ヒト成長ホルモンまたはヒトプロインシュリンを融合発現させる方法（特許文献３、４）、（３）カビ由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を融合領域として用い、抗体Ｌ鎖を融合発現させる方法（特許文献５）が知られている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ８４０３１０３号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−１２９５７６号公報
【特許文献３】特開平１１−３４１９９１号公報
【特許文献４】特開２００３−７９３７９号公報
【特許文献５】特開平１１−７５８７９号公報
【非特許文献１】塚越規弘編著，「組換えタンパク質生産法 生物化学実験法」，学会出版センター，２００１年
【非特許文献２】Ｕｄａｋａら，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３年，第２１７巻，２３−３３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般的に、融合ポリペプチドの発現量は、所望のポリペプチドの構造やアミノ酸配列と融合領域との相性に大きく左右され、選択した融合領域が適当でない場合、融合ポリペプチドの大量発現に結びつかないことが知られている。また、上記（１）から（３）で開示された融合領域では、それらが有する親和性を精製工程に利用することができず、所望の融合生成物の分離、精製を簡略化することができない。従って、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系において、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の提供を一つの課題とする。さらに、当該融合ペプチド領域を利用した、ブレビバチルス属細菌による有用ポリペプチドの製造方法の提供を一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、所望のポリペプチドを連結した融合生成物を、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させることにより、上記課題が解決されることを見いだした。本発明は、以下の内容を含む１または複数の特徴を有する。
【００１１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、さらに、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列と作動可能に連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列に関する。 また、本発明は、当該ＤＮＡ配列を含むベクター、および、当該ベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換して得られる形質転換体に関する。さらに、本発明は、当該形質転換体を培養し、培地中に分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系では著しく発現効率が低かったポリペプチドを、融合ポリペプチドとして大量に培養液中へ分泌発現させることが可能となった。さらに、抗体（免疫グロブリンＧ）などを固定化した担体を用いることにより、所望のポリペプチドを含む当該融合ポリペプチドを、培養液から簡便に分離精製することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１４】
１．ＤＮＡ配列およびポリペプチド
本発明の第一の実施形態は、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、０または１以上のアミノ酸配列を介して所望のポリペプチドを連結した融合ポリペプチドを、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させる機能を有するＤＮＡ配列である。詳細には、本発明の実施形態としてのＤＮＡ配列は、（ａ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター、（ｂ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャイン・ダルガノ配列、（ｃ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、の３つの構成要素からなり、かつ、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を互いに作動可能となるよう連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列である。
【００１５】
ここで、本発明における「作動可能となるよう連結せしめる」との記載は、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素がブレビバチルス属細菌内で機能することにより、所望のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが分泌発現するよう、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を必要に応じて適当なＤＮＡを介して（またはＤＮＡを介さず）連結せしめることを意味する。本発明における「作動可能となるよう連結」する概念には、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素に加えて、エンハンサー等を含む各種の調節エレメントまたは制御因子を連結する場合も含まれる。それら調節エレメントまたは制御因子の種類は、宿主によって変わり得ることは当業者に周知の事項である。
【００１６】
本発明において用いられる「プロモーター」は、ブレビバチルス属細菌において作動可能であるプロモーターであればいかなる生物由来のプロモーターでもよい。好ましくはブレビバチルス属細菌由来のプロモーターが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビス又はブレビバチルス・チョウシネンシス由来の細胞壁蛋白質のプロモーターが良く、更に好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のプロモーターが良い。
【００１７】
本発明において用いられる「シャイン・ダルガノ配列」は、ブレビバチルス属細菌において機能する塩基配列であればいかなる原核生物種に由来するものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシャイン・ダルガノ配列が良く、さらに好ましくはブレビバチルス・ブレビスまたはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質をコードしているＤＮＡの上流に存在するシャイン・ダルガノ配列が良い。更により好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、又はブレビバチルス・チョウシネンシス細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））をコードする蛋白質のシャイン・ダルガノ配列が良い。ここでいうシャイン・ダルガノ配列とは、原核生物のｍＲＮＡにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列であり、プリン塩基に富んだ約３から９塩基の配列である。
【００１８】
本発明において用いられる「シグナルペプチド」は、ブレビバチルス属細菌内で発現させた際、そのＣ末端側に連結されたポリペプチドを細胞外に分泌させる機能を有するペプチドであればいかなる生物種由来のものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシグナルペプチドが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）またはｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、さらにブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質（ＨＷＰ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のシグナルペプチドが良い。また天然の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良した配列でも良い。具体的には、前記ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）のシグナルペプチドＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａに、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ｘ）−Ａｒｇ（ｘ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ａｌａ（ｘ）−Ｓｅｒ（ｘ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、中の（ｘ）部分で示すアミノ酸配列のように塩基性や疎水性アミノ酸残基を付加したシグナルペプチドを用いても良い。さらに、本発明において使用するプロテインＡが本来有するシグナルペプチド配列を使用しても良い。
【００１９】
本発明において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、好ましくはスタフィロコッカス属細菌由来のプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインであり、より好ましくは、図１（配列表の配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） ＣＯＷＡＮＩ株
由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインである。しかし、本明細書において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」なる用語は上記に限定されず、スタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインと、それらドメインのいずれかと類似の構造および機能を有する分子すべてを包含する。具体的には、図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮ１株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列に、１アミノ酸以上の置換、欠失、または挿入を施して得られ、かつ、本発明のＤＮＡ配列の構成要素の１つである融合領域として用いた場合に、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する変異体は、本明細書において用いられる用語「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」に包含される。このような変異体は、図１（配列番号１、２）にて示されるアミノ酸配列および塩基配列情報を基に、当業者であれば容易に作製、もしくは自然界より探索することができる。
【００２０】
また、本発明において融合領域として使用される「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する限り、その個数および順列において何ら制限されるものでない。図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインを例として説明すると、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣの任意の１ドメインを使用しても良いし、任意の２ドメインの順列として得られる２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、任意の３ドメインの順列として得られる１２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、同様に４以上のドメインの順列として得られる配列のうちの１つを使用しても良い。好ましくは、Ｅドメイン（図２、３参照）、Ｅ、Ｄドメインをこの順で連結したもの（図４、５参照）、および、Ｅ、Ｄ、Ａドメインをこの順で連結したもの（図６、７参照）が良い。
【００２１】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」とは、０または１以上のアミノ酸配列からなるペプチドを意味し、本発明のＤＮＡ配列がコードする融合ポリペプチド中に、当該リンカーが実質的に含まれないことをも意味する。当該リンカーを構成するアミノ酸配列に特に制限はないが、当該リンカー中に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を配置することにより、融合生成物から所望のポリペプチドを切り離す工程を容易にすることができる。
【００２２】
本発明において用いられる「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」とは、化学的もしくは酵素的にポリペプチドを切断する際、切断箇所として特異的に認識されるアミノ酸配列を指す。化学的なポリペプチド切断法としては、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または蟻酸を使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｍｅｔ］、［Ａｓｎ−Ｇｌｙ、−Ｌｅｕ、またはＡｌａ］、［Ａｓｐ−Ｐｒｏ］を配置するのが好ましい。酵素的なポリペプチド切断方法としては、例えば、コラゲナーゼ、キモシン、カリクレインＢ、エンテロキナーゼ、トロンビン、ファクターＸａ、またはＴＥＶペプチダーゼを使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸残基）］、［Ｍｅｔ−Ｐｈｅ］、［Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ（Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸残基）］、［（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ（ｎ＝２−４）］、［Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］、［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］、［Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］を配置するのが好ましい。
【００２３】
また、所望するポリペプチド自体の切断が問題とならなければ、より特異性の低いペプチダーゼ等を使用しても良い。具体的には、真核生物または原核生物由来のセリンペプチダーゼやシグナルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、カルボキシルペプチダーゼ、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システインペプチダーゼ、グルタミン酸ペプチダーゼ、金属ペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼのファミリーに属するペプチダーゼ群が利用できる。さらに、上記ペプチダーゼのアミノ酸配列を置換、欠失、付加、または変異導入することで基質特異性を改変させたペプチダーゼを利用することも可能である。
【００２４】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、分離精製用のタグとして使用され得るアミノ酸配列を配置することもできる。「分離精製用のタグ」とは、ポリペプチドの精製を容易にするために付加される、特定物質に対する親和性を有するペプチドを意味し、その具体例としては、ニッケルメタルに対し親和性を有するヒスチジンが複数連結した構造のもの、またはアミロースに対し親和性を有するマルトース結合ポリペプチド等が挙げられる。本発明では前者が好適に用いられ、より好適には６個のヒスチジンの連続配列が用いられる。
【００２５】
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、前記「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」、または前記「分離精製用のタグ」のいずれか１つを配置してもよいし、両者を任意の順序で同時に配置してもよい。ただし、所望のポリペプチドから不要な融合領域を極力切除したい場合は、前記「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」の最もＣ末端側に「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」を配置することが好ましい。
【００２６】
本発明における「所望のポリペプチド」としては、例えば、各種の酵素類、ヒト成長ホルモン等のホルモン類、各種の血漿蛋白質類、各種のサイトカイン類、免疫グロブリンＧのＬ鎖、Ｆｄ鎖等の部分抗体、一本鎖抗体等の修飾抗体などが挙げられる。
【００２７】
２．ベクター
本発明の第二の実施形態は、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含むベクターである。本発明の第二の実施形態において用いられるベクターは、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能であればいかなるものでも良いが、好ましくは、ｐＨＹ５００（特開平２‐３１６８２号公報）、ｐＮＵ２００（日本農芸化学会誌６１，６６９‐６７６（１９８７））、ｐＮＨ３２６（図８参照）（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８：５２５−５３１．（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７７：７４５−７４９（１９９５））、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミド（特許第２７２７３９１号）、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２‐２３８５６９号公報）、またはこれらいずれかの誘導体が良い。ただし、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を、ブレビバチルス属細菌の染色体へ組込むことを目的とするベクターの場合、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能である必要はなく、このようなベクターも、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含む限り、本発明に包含される。
【００２８】
３．形質転換体
本発明の第三の実施形態は、本発明の第二の実施形態であるベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体である。本発明の第三の実施形態において用いられるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォーモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・インボカツス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、またはブレビバチルス・サーモルベル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）等が挙げられる。ブレビバチルス・ブレビス、またはブレビバチルス・チョウシネンシスが好ましく、ブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株がより好ましい。また生産量の向上などの目的に応じて上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高分泌発現株のような変異株を使用しても良い。
【００２９】
ブレビバチルス属細菌の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５６：１１３０−１１３４（１９８３））、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ５３：３０９９−３１００（１９８９））、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：２０２−２０３（１９９７））により実施することができる。
【００３０】
４．ポリペプチド製造方法
本発明の第四の実施形態は、本発明の第三の実施形態である形質転換体を培養し、当該形質転換体から分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法である。
【００３１】
当該形質転換体の培養に用いる培地は、当該形質転換体が所望のポリペプチドを効率良く分泌発現できる培地であれば特に制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロールなどの炭素源や、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの窒素源を使用することができ、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン、亜鉛、鉄等の無機塩類が必要に応じて添加される。さらに、栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。培養温度は１５−４２℃、好ましくは約２８−３７℃であり、通気および攪拌により好気的に培養を行うことが望ましいが、もし必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００３２】
当該形質転換体から分泌された、所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、当該形質転換体の培養液から回収、精製することができる。例えば、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー等の手法を利用できる。
【００３３】
特に、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、その分子内にプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列を有しているため、適当な担体に固定化された免疫グロブリンＧ、例えば免疫グロブリンＧセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）等を用いることで、効率良く精製され得る。
【００３４】
また、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に精製用タグを含みうる。この場合、当該箇所に配置した精製用タグを利用して、当該ポリペプチドを精製することも可能である。例えば、精製用タグとしてヒスチジンの連続配列を配置した場合、ニッケルＮＴＡカラム等を用いて精製することが可能である。
【００３５】
さらに、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を含みうる。この場合、当該箇所に配置したアミノ酸配列に応じた方法により、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。例えば、部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列として［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］を配置した場合、ファクターＸａを用いて、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。このような切断反応は、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドの精製工程中のいかなる段階で実施しても良い。切断反応後の所望のポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、さらに精製することができる。
【００３６】
上記のような本発明の各実施形態を利用することで、これまでブレビバチルス属細菌では効率的に生産できなかったポリペプチドを、極めて効率良く生産することが可能となった。従って、本発明の実施形態は、産業上有用なポリペプチドを製造する上で、非常に有用である。
【実施例】
【００３７】
以下に参考例、実施例、図面に基づいて本発明の実施例を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは云うまでもない。本発明に関連する技術分野の当業者は、本発明の説明の範囲内で以下の実施例の変形を認め実行することができる。したがって、そのような変形は、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【００３８】
本発明の実施例の実行にあたり、発現ＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 （１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 刊（米国）。 （２） 村松正實 編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。
（実施例１）プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ配列の単離
スタフィロコッカス・アウレウス Ｃｏｗａｎ Ｉ株を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．２％、グルコース １％、魚肉エキス ０．５％、ｐＨ７．０）を用いて、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄を行った。菌体を再度トリス−塩酸緩衝液にて懸濁後１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出およびエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。公知のプロテインＡの塩基配列（配列番号１）に基づき、上記で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ −３’（配列番号１６）、５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１７）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１８））を用い、ＰＣＲ法により、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡをそれぞれ増幅した。配列番号１５は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号１６は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１７は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１８は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００３９】
また、同様に、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡの３’側に６残基のヒスチジンを付加して増幅する場合は、上記ゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ−３’ （配列番号１９）、 ５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２０）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２１））を用いた。配列番号１９は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２０は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２１は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４０】
得られたＤＮＡ断片は制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。一方、発現ベクターｐＮＨ３２６（図８）（配列番号２２、２３）もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
（実施例２）プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの構築
実施例１にて、制限酵素処理したＤＮＡ断片および発現ベクターｐＮＨ３２６をＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、各免疫グロブリン結合ドメインを有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２、配列番号３および４参照）、ｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３、配列番号５および６参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４、配列番号７および８参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤ（図５、配列番号９および１０参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６、配列番号１１および１２参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７、配列番号１３および１４参照）を構築した。
（実施例３）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターの作成
プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するために、ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖（軽鎖）遺伝子（配列番号２４、２５）の発現を行った。ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、米国特許５６９８１９５号記載の抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の遺伝子配列に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号２７）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号２７は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４１】
この増幅されたヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号２６における上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。この抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片とプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ（図９Ａ）（配列番号２８、２９）を構築した。
（実施例４）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターの作成
上記、抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ遺伝子を有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するため発現ベクターの構築を行った。抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は上記の抗ＴＮＦα抗体Ｈ鎖の遺伝子配列（配列番号３０、３１）に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡ −３’ （配列番号３２）と５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡ−３’（配列番号３３）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号３２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号３３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４２】
この増幅された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号３２の上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。このヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４）およびｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩを用い消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と各プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図９Ｂ、配列番号３４および３５参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図９Ｃ、配列番号３６および３７参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図９Ｄ、配列番号３８および３９参照）を構築した。
（実施例５）抗ヒトＴＮＦα抗体鎖のＬ鎖またはＦｄ鎖単独発現ベクターの作成
プロテインＡ融合型と従来からの目的とするポリペプチド単独で発現させる方法（融合型でない方法）とのポリペプチド発現能を比較検討するため、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖鎖単独発現ベクター、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターを構築した。抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４０）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号４１）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４０は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４３】
また抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４２）と５’− ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧ −３’（配列番号４３）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４４】
Ｌ鎖およびＦｄ鎖をコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化した。発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理によりそれぞれ脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター、および、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌ（図１０Ａ、配列番号４４および４５）、ｐＮＨ３２６−Ｆｄ（図１０Ｂ、配列番号４６および４７）を構築した。
【００４５】
（実施例６）プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの作成
上記抗体以外のポリペプチドに対する本発明の効果を示すために、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを用いプロテインＡ融合発現試験を行った。ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，５９５６−５９６０ （１９８４））を鋳型とし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ−３’ （配列番号４８）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ−３’ （配列番号４９）を用いて、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ増幅した。配列番号４８は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４９は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４６】
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。また発現ベクターとなるｐＰｒｏＡ３Ｅも同様に制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のヒト成長ホルモンＤＮＡ断片とｐＰｒｏＡ３Ｅ発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ （図１１Ａ）（配列番号５０、５１）を構築した。
【００４７】
（実施例７）ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの構築
本発明の有効性を示すため、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、および、特許文献５、６で開示されたブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰを融合部分に用いたＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターを構築した。ヒト成長ホルモン単独発現ベクターを構築するため、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ −３’ （配列番号５２）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ −３’ （配列番号５３）を用い、先述のプラスミドｐＧＨ−Ｌ９を鋳型として、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを増幅した。配列番号５２は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５３は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００４８】
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨ（図１１Ｂ）（配列番号５４、５５）を構築した。一方、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターとしては、特許文献５の実施例１および実施例４に記載の方法に従い、ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６ （図１１Ｃ）を構築した。
【００４９】
（実施例８）各発現ベクターを有する形質転換体の作成
実施例２から７で構築した、プロテインＡ融合発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ、ｐＰｒｏＡ４Ｅ、ｐＮＨ３２６）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｌ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｆｄ）、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−ｈＧＨ）、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６）を、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。
【００５０】
（実施例９）抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖の分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体、およびそれらの対照となるベクターｐＮＨ３２６を有する形質転換体の各々を、６０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを添加した３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にて、３０℃で２日間振とう培養した。当該培養液から遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，３分間）により菌体を除去し、得られた培養上清各５μｌを定法に従い処理した後、１０−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。電気泳動後、当該ゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色し、ポリペプチドのバンドを検出した（図１２および、図１３Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【００５１】
図１２は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したものであり、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５２】
図１３は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖［（図１３Ａ） プロテインＡ（Ｅドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｂ） プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｃ） プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合Ｆｄ鎖］を示す。細い矢印は抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株から、発現された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の移動度を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン４は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン５および６は、プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン７は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン８および９は、プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５３】
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、およびプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図１３Ａ参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図１３Ｂ参照）、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図１３Ｃ参照）を有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は飛躍的に上昇した。また、３種類のプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、およびｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体における、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量を比較すると、融合領域として使用するプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインの数を増やす程、融合ポリペプチドの発現量が顕著に増加していた（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ参照）。
【００５４】
（実施例１０）ヒト成長ホルモンの分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、およびヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体の各々を、実施例９と同様に培養した。ただし、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体の培養のみ、培地に添加する薬剤を、ネオマイシン６０ｍｇ／Ｌに替えて、エリスロマイシン１０ｍｇ／Ｌとした。そして、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１４）。
【００５５】
図１４は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られたプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株、およびヒト成長ホルモン単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１はヒト成長ホルモン単独発現株からの培養液５μｌ、レーン２はＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌ、レーン３はプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。
【００５６】
実験の結果、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体におけるヒト成長ホルモンの発現は極めて少量であったが、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、および、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体の培養液上清には大量のヒト成長ホルモンが分泌生産されていた（図１４参照）。
【００５７】
（実施例１１）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターの作成
実施例３で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５‘−ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５６）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の前半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５６は、ｓｃＦｖ（single chain variable fragments）の前半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。ｓｃＦｖは、一般的に、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるVHおよびVLで構成される可変領域（Fv）を、フレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントである。
【００５８】
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＮ末端に、ファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇからなる配列が付加されるよう、プライマーを設計した。同様に、実施例４で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号５７）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５８）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の後半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号５７は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５８は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００５９】
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＣ末端に、ヒスチジン６残基が付加されるよう、プライマーを設計した。そして、これら２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により連結し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。
【００６０】
作製したＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、実施例２で作製したプロテインＡ融合発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩ部位にそれぞれ挿入し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ（図１５Ａ）（配列番号５９、６０）、およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ（図１５Ｂ）（配列番号６１、６２）を構築した。
【００６１】
（実施例１２）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターの作成
オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号２６）に替えて、オリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’（配列番号４１）を用いる以外は実施例１１と同様の操作を行い、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
【００６２】
作製したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化した後、発現ベクターｐＮＨ３２６のマルチクローニングサイトに存在するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖ（図１５Ｃ）（配列番号６３、６４）を構築した。
【００６３】
（実施例１３）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の分泌発現
実施例１１にて得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ、および、実施例１２にて得られた抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。次に、これらの形質転換体を実施例９と同様に培養し、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１６）。
【００６４】
図１６は、ＣＢＢ染色による、実施例１３で得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株、および抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８，２０ｋＤａ）を示す。レーン１および２は各々抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の培養液５μｌ、レーン３および４は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌ、レーン５および６は各々プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを泳動したものである。
【００６５】
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ、ならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は飛躍的に上昇した。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】スタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株のプロテインＡの塩基配列とアミノ酸配列図である。番号はアミノ酸残基数を示す。
【図２】プロテインＡ（Ｅドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥはプロテインＡ免疫グロブリン結合Ｅドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図３】実施例２に記載のプロテインＡ（Ｅドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥはプロテインＡ免疫グロブリン結合Ｅドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図４】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図５】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図６】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤＡの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ３ＥＤＡはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤＡドメインの後、ヒスチジンタグを有する。
【図７】実施例２に記載のプロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤＡの構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。分泌発現ベクターｐＰｒｏＡ４ＥＤＡはプロテインＡ免疫グロブリン結合ＥＤＡドメインの後、ヒスチジンタグを含まない。
【図８】実施例２に記載のブレビバチルス・ブレビスポリペプチド分泌発現ベクターｐＮＨ３２６の構造とそのマルチクローニングサイト付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】実施例３および実施例４に記載のプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター（Ａ） ｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ、およびプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクター（Ｂ） ｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、（Ｃ） ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄおよび（Ｄ） ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ−Ｆｄの構造を示す。
【図１０】実施例５に記載の抗ヒトＴＮＦα抗体鎖単独発現ベクター（Ａ） ｐＮＨ３２６−Ｌ、（Ｂ） ｐＮＨ３２６‐Ｆｄの構造を示す。
【図１１】実施例６および７記載のプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（Ａ） ｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ、（Ｂ） ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨ、および（Ｃ） ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５、の構造を示す。
【図１２】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株との発現量の比較を示す図である。
【００６７】
【図１３】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株との発現量の比較を示す図である。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖［（図１３Ａ） プロテインＡ（Ｅドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｂ） プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｃ） プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合Ｆｄ鎖］を示す。細い矢印は抗ヒトＴＮＦα抗体鎖単独発現株から、発現された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の移動度を示す。
【図１４】ＣＢＢ染色による、実施例８で得られたプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株、およびヒト成長ホルモン単独発現株との発現量の比較を示す図である。
【図１５】実施例１１で作製したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクター（Ａ）ｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ、（Ｂ）ｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ、および実施例１２で作製した抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクター（Ｃ）ｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖの構造を示す。
【図１６】ＣＢＢ染色による、実施例１３で得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株、および抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８，２０ｋＤａ）を示す。レーン１および２は各々抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の培養液５μｌを、レーン３および４は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを、レーン５および６は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを泳動した。
【符号の説明】
【００６８】
ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ：制限酵素。
【００６９】
ＭＷＰ：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質。
【００７０】
Ｐ５：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質（ＭＷＰ）のプロモーター５。
【００７１】
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ：ヘヤピンループ翻訳終結領域。
【００７２】
Ｒｅｐ：ｐＵＢ１１０由来の複製起点。
【００７３】
Ｎｍ：ネオマイシン耐性遺伝子。
【００７４】
ＳＤ１およびＳＤ２：シャイン・ダルガノ配列。
【００７５】
ＶＬ：Ｌ鎖可変領域。
【００７６】
ＣＬ：Ｌ鎖定常領域。
【００７７】
ＶＨ：Ｈ鎖可変領域。
【００７８】
ＣＨ１：Ｈ鎖定常領域。
【００７９】
ｈ：ヒンジ領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、さらに、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列と作動可能に連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記任意のアミノ酸配列からなるリンカー中に、部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列が、部位特異的プロテアーゼ、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または、蟻酸により切断され得るアミノ酸配列である、請求項２記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記任意のアミノ酸配列からなるリンカー中に、複数のヒスチジン残基からなる分離精製用タグをさらに含む、請求項１から３記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
前記ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターである、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
前記プロテインＡがスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来である、請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体。
【請求項９】
前記ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株、ブレビバチルス・ブレビス４７‐５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１株またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１‐ＯＫ株、並びにこれら由来の変異株からなる群より選択される、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８または９記載の形質転換体を培養し、培地中に分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含む融合ポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記所望のポリペプチドが、部分抗体あるいは一本鎖抗体である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記所望のポリペプチドが、哺乳類の成長ホルモンである請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかに記載の製造方法によって得られるポリペプチド。
【請求項１】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、さらに、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列と作動可能に連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記任意のアミノ酸配列からなるリンカー中に、部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列が、部位特異的プロテアーゼ、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または、蟻酸により切断され得るアミノ酸配列である、請求項２記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記任意のアミノ酸配列からなるリンカー中に、複数のヒスチジン残基からなる分離精製用タグをさらに含む、請求項１から３記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
前記ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターである、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
前記プロテインＡがスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来である、請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体。
【請求項９】
前記ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株、ブレビバチルス・ブレビス４７‐５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１株またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１‐ＯＫ株、並びにこれら由来の変異株からなる群より選択される、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８または９記載の形質転換体を培養し、培地中に分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含む融合ポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記所望のポリペプチドが、部分抗体あるいは一本鎖抗体である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記所望のポリペプチドが、哺乳類の成長ホルモンである請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかに記載の製造方法によって得られるポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１５】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１５】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【公開番号】特開２００６−３２０２２０（Ｐ２００６−３２０２２０Ａ）
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４４５２９（Ｐ２００５−１４４５２９）
【出願日】平成１７年５月１７日（２００５．５．１７）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（０００１２０２０５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１７日（２００５．５．１７）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（０００１２０２０５）
【Ｆターム（参考）】
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