プロナーゼからのトリプシンの単離および精製の方法ならびにそれらの使用
【課題】一回のアフィニティークロマトグラフィー工程におけるプロナーゼからのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の単離および精製の方法ならびに精製したＳＧＴの使用を提供する。
【解決手段】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼよりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を単離する方法は、このプロナーゼを、アミジン、グアナジン（ｇｕａｎａｄｉｎｅ）、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、および該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出する工程を包含する。
【解決手段】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼよりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を単離する方法は、このプロナーゼを、アミジン、グアナジン（ｇｕａｎａｄｉｎｅ）、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、および該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出する工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一回のアフィニティークロマトグラフィー工程におけるプロナーゼからのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の単離および精製の方法ならびに精製したＳＧＴの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
トリプシンは、広範囲の哺乳動物の消化管中に存在するセリンプロテアーゼである。トリプシンの機能は、ペプチド結合の加水分解性切断であり、従って大きなタンパク質のサイズを減少させ、そしてそのタンパク質を他のプロテアーゼによってさらに分解されることを可能にする。トリプシンは、生物工学的適用、特に哺乳動物細胞の培養において使用される。哺乳動物細胞の培養においては、トリプシンは、大きい細胞凝集物を崩壊させるため、またはマイクロキャリアもしくは培養プレートのような表面から細胞を除去するためのツールとして役立つ。トリプシンはまた、非トリプシン感受性バイオポリマーのプロセシングにおいて、酵素を分解するタンパク質として使用される。その周知の特異性のため、トリプシンはまた、分析プロセスおよび調製用プロセスの両方において選択的なタンパク質切断ツールとして使用される。トリプシンは、多数の特異的または非特異的プロテアーゼインヒビターによって不活化または阻害され得、それらの多くは、セルピンファミリーに属する。生物工学的適用において最も幅広く使用されるトリプシンインヒビターは、ダイズ由来のトリプシンインヒビターである。これらのトリプシンインヒビターの大部分は非常に特異的であるので、それらは他の夾雑プロテアーゼに対して不活性である。
【０００３】
トリプシンは、様々な動物種の十二指腸腺より代表的に調製され、そして異なる程度の純度まで精製される。トリプシンの精製は、多数の異なる生化学的プロセス（沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる）により行われ得る。予め精製したウシトリプシン（Ｉ型）は、不溶性キャリア上に固定されたベンズアミジンに結合し、そして高濃度のグアニジンもしくはアルギニンにより、または溶離剤のｐＨを下げることにより溶出され得ることが示されている（Ｅｌｌｏｕａｌｉら １９９１．Ｃｈｒｏｍｓｙｍｐ．２２１５：２５５−２６５）。トリプシンを得る哺乳動物の膵臓はまた、セリンプロテアーゼキモトリプシンを含んでおり、このキモトリプシンは、その生理化学的特性（アミジン誘導体との相互作用およびアミジン誘導体に対する親和性を含む）が、トリプシンと非常に類似する。結果として、これら２つのタンパク質は、分離することが困難である。従って、精製法に応じて、精製したトリプシン調製物は、様々な量の夾雑酵素、特にキモトリプシンを含み得る。さらに、哺乳動物由来のトリプシンは、外来因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）を含み得る。ＴＳＥ因子の作用が発見されており、そしてそれらはヒトに伝染する可能性があるので、ヒトが使用するために医薬品を提供する生物工学プロセスにおけるヒトまたは動物由来の材料の使用に関して継続した議論がなされている。
【０００４】
プロナーゼ（微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（Ｓ．ｇ．）由来のプロテアーゼ）は、動物組織より調製されたトリプシンの市販代用物である。プロナーゼは、組織からの初代細胞培養物の調製のために、そして表面、マイクロキャリア細胞培養物からの細胞の剥離のために、そして無血清培地における懸濁状態でのＶＥＲＯ細胞の増殖のために使用されている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ １９６６．Ｅｘｐｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．４３：２３４−２３６；Ｍａｎｏｕｓｏｓら １９８０．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ １６：５０７−５１５，Ｌｉｔｗｉｎ １９９２．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎ．１０：１６９−１７４）。その作用の正確な機構は、分からない。プロナーゼは、異なる酵素の混合物であることが知られており、この酵素としては、様々な型のエンドペプチダーゼ（セリンおよびメタロプロテアーゼ）、エクソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼ）、中性プロテアーゼ、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ならびに中性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０００５】
酵素処理後、トリプシンの活性は、ウシ胎仔血清の添加によって通常中和される。このウシ胎仔血清は、多数の特異的プロテアーゼインヒビターおよび非特異的プロテアーゼインヒビターを含む。しかしながら、ワクチンおよび治療タンパク質の生成に使用される細胞培養培地においては、血清およびタンパク質（特に哺乳動物源由来の）を含まない培地が好ましい。従って、無血清培地（あらゆるトリプシンインヒビター活性を欠く）の使用は、新しいインヒビター活性源を同定することを必要とする。プロナーゼが様々なプロテアーゼの混合物であるため、プロテアーゼ活性の阻害は、異なるインヒビターの混合物を必要とし、非常に複雑かつ高価なプロセスをもたらす。従って、プロナーゼの使用に起因するタンパク質負荷および無血清培養物におけるインヒビターの組成は、哺乳動物由来のトリプシンおよび特異的なトリプシンインヒビターを使用する培養物と比較して非常に高くなる。さらに、培養培地へのプロナーゼの添加はまた、培地中により多いタンパク質が存在するため、精製プロセスに悪影響を与える。
【０００６】
プロナーゼのトリプシン様活性は、一般的にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）として知られ、ウシトリプシンに対して約３３％の配列同一性を示す（Ｏｌａｆｓｏｎら １９７５．Ｂｉｏｃｈｅｍ １４：１１６８−１１７７）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンは、異なる型のイオン交換樹脂を使用するクロマトグラフ技術によって精製されている。これらの方法は、代表的に、安定したマトリックスを使用し、溶出の間、リガンドが生成物中に流出するという問題を最小限に押さえる。しかしながら、これらの方法は、比較的低い選択性を有し、＜１０の範囲の精製係数をもたらす。結果として、高い度合いの純度を達成するために、いくつかの工程が組み合わされなければならず、それらの工程は、次に、トリプシンの自己消化およびそれによる活性の損失を引き起こし得る。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ上でのイオン交換クロマトグラフィーによる精製は、イオン交換カラム上での再クロマトグラフィーにより行われるさらなる精製と共に、Ｊｕｒａｓｅｋら（１９７１．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１９５−１２０１）およびＯｌａｆｓｏｎら（１９７５ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：１１６８−１１７７；１９７５ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：１１６１−１１６７）により記載される。Ｍｉｙａｔａら（１９９１．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １６：３９−４３）は、ＳＧＴを精製するための３工程陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを記載する。ＳＧＴは、ＰＡＧＥ中で単一バンドとして移動することが見出されており、約３０，０００の分子量を有し、そしてＢＡＥＥアッセイにより測定された場合、ウシトリプシンよりも高いエステラーゼ活性を有する。しかしながら、３工程クロマトグラフィー精製法により精製されたＳＧＴでさえ、カルボキシペプチダーゼＢ様活性が、わずかに混入していることが見出された。
【０００７】
ＳＧＴはまた、ＳＧＴの非常に特異的なリガンドとしてサルミンのトリプシン消化より生じたオリゴペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、プロナーゼから精製されている。ＨＣｌによるプロナーゼ中のプロテアーゼ混合物からのトリプシン様活性の溶出は、精製されたＳＧＴを示したが、しかしながらそのＳＧＴは、カルボキシペプチダーゼＢ様活性が混入していることが見出された（Ｋａｓｅｉら １９７５．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８．：６５３−６６２；Ｙｏｋｏｓａｗａら １９７６．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：７５７−７６３）。分析のみを目的として、ＳＧＴはまた、リガンドとしてベンズアミジンを使用したアフィノフォレーシス（ａｆｆｉｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって、プロナーゼから分離された（Ｓｈｉｍｕｒａら １９８２．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１６１５−１６２２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
プロナーゼの活性トリプシン様機能の単離および分離のための単純な大規模法の必要性が存在する。これは、制御されたシステムを細胞培養法で使用することを可能にし、そしてヒトの病原体の夾雑物の危険性を持たない、微生物源からの規定された活性のフラクションを提供する。
【０００９】
細胞の繁殖／増殖、バイオマス生成および生成物生成プロセスの間、細胞培養培地の添加物由来の夾雑を避ける必要性もまた存在する。細胞培養培地中のタンパク質負荷の減少は、高純度のタンパク質生成物を従来の精製法を用いて生成することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、プロナーゼから精製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の単離のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
高い比活性を有する精製されたＳＧＴの調製物を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１２】
生物工学プロセスにおいて、精製されたＳＧＴの使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
精製されたＳＧＴを真核細胞のバイオマスの生成に使用するための使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１４】
ウイルスまたはウイルス抗原の生成のために、精製されたＳＧＴの使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】
精製されたＳＧＴのみを用いて継代および継代培養された細胞を用いた生物学的生成物の生成のために、精製されたＳＧＴの使用を提供することもまた、本発明の目的である。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼよりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を単離する方法であって、該方法は、前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン（ｇｕａｎａｄｉｎｅ）、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、および該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出する工程、を包含する、方法。
（項目２）
前記溶離剤が、グアナジンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記溶離剤が、アルギニンである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記アルギニンが、０．５〜１．２Ｍの間の濃度にある、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記溶離液が、約ｐＨ４．０と約ｐＨ９．０との間の範囲のｐＨを有する、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記アフィニティー部分が、ベンズアミジンである、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記溶離液が、約０．１Ｍと約１Ｍとの間の濃度の無機塩を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ＳＧＴが、０．５Ｍ〜１．２Ｍのアルギニンを含有する溶液中に得られ、そして該ＳＧＴが、少なくとも９５％の純度を有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
精製された前記ＳＧＴから溶離剤を除去する工程をさらに含む、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
調製物が、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有する、ＳＧＴ精製調製物。
（項目１１）
少なくとも約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、そして、少なくとも９５％の純度を有する、項目１０に記載のＳＧＴ精製調製物。
（項目１２）
前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、およびを該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出させる工程、を包含する方法を用いて得られた、項目１０に記載の調製物。
（項目１３）
生物プロセスにおける、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目１４）
細胞のバイオマスを生成するための方法であって、該方法は、細胞の培養物を提供する工程、項目１０に記載の調製物を使用して該細胞を継代および継代培養する工程、および該細胞増殖させてバイオマスにする工程、を包含する、方法。
（項目１５）
前記細胞が、無血清培地中で増殖される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ウイルスまたはウイルス抗原を生成するのための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞が、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞を増殖させてバイオマスにする工程、該バイオマスの細胞にウイルスを感染させる工程、および該細胞をインキュベートして該ウイルスを増殖する工程、を包含する、方法。
（項目１７）
ウイルスまたはウイルス抗原を生成するための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞に、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ロタウイルス科の群より選択されるウイルスを感染させる工程、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有するＳＧＴ精製調製物を添加して該ウイルスを活性化する工程、および生成した前記ウイルスを収集する工程、を包含する、方法。
（項目１８）
前記生成されたウイルスを精製する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１７に記載の方法によって得られた、ウイルスまたはウイルス抗原調製物。
（項目２０）
組換え細胞から組換え産物を生成するための方法であって、該方法は、組換え細胞の細胞培養物バイオマスを提供する工程であって、該細胞が、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養された工程、組換え産物が生成される条件下で前記細胞を培養する工程、および生成された組換え産物を収集する工程、を包含する、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法によって得られた、組換え産物。
（項目２２）
血清もタンパク質も含まない培地中で増殖させたバイオマスであって、該バイオマスは、項目１０に記載の精製ＳＧＴを用いて継代および継代培養され、そして哺乳動物由来のトリプシンの使用により同一の条件下で培養した細胞培養物と比較して、総プロテアーゼタンパク質負荷が、少なくとも７５％低減される、バイオマス。
（項目２３）
ウイルスまたはウイルス抗原の精製プロセスにおける、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目２４）
ワクチン生成のためにウイルスを生成するための、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目２５）
プロタンパク質からのタンパク質の活性化のための、項目１０に記載の調製物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：実施例１Ａに記載のイオン交換クロマトグラフィーからの溶出物およびレーン２：実施例１Ｂに記載のアフィニティークロマトグラフィーより１Ｍアルギニンで溶出後の精製されたＳＧＴ。
【図２】図２は、精製されていないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼおよび精製されたＳＧＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：精製されていないプロナーゼ、レーン２：アフィニティークロマトグラフィーの素通り画分、およびレーン３：アフィニティークロマトグラフィーおよび１Ｍアルギニンでの溶出後の精製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンを示す。
【図３】図３は、アフィニティークロマトグラフィーおよび１Ｍアルギニンでの溶出後の精製されたＳＧＴの、異なる２つのロットのウエスタンブロット解析を示す。
【図４】図４は、精製ＳＧＴの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の大規模精製の単純な方法を提供することである。本発明の方法は、ＳＧＴの大規模精製に有用であり、そして生理学的に受容可能な溶離剤を利用するいくつかの実施形態において、様々な生物工学プロセスにすぐに使用できる安定したＳＧＴ調製物を提供する。
【００１８】
一つの実施形態において、本発明は、１回のクロマトグラフィー工程によりＳＧＴを単離する方法に関する。この方法は、プロナーゼを、固定化したアフィニティー部分（例えば、アミジン、グアニジン、またはアミン含有種）に接触させる工程およびアフィニティー部分として使用される同じ分類の化合物のメンバーを有するカラムから選択的にトリプシンを溶出する工程を用いる。溶離剤は、ＳＧＴに関して、キャリアに固定化されたアフィニティー部分に対する競合物として作用する。従って、いくつかの実施形態において、溶離剤は、ＳＧＴに対して、アフィニティー部分よりも高いアフィニティーを有するように選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態に従って、プロナーゼを、アミジンを含有する固定化されたアフィニティーカラムと接触させる。本明細書中で使用される場合、用語「アミジン」としては、アミジンおよびその誘導体（例えば、ここでアミジノ窒素（＝ＮＨ）に結合した水素原子は、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基により置換される）が挙げられる。これらの実施形態において、アミジンは以下の構造を有する：
【００２０】
【化１】
ここで、はめこみ「Ｃ」を有する円は、カラムまたは他の固体支持体の成分を表す。記号Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、それぞれ、Ｈ、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基より独立して選択されたメンバーである。Ｒ３は、存在しても存在しなくてもよく、そして上に示した基（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（Ｈを除く）のいずれかを有し得る。代表的なアミジン誘導体としては、置換ベンズアミジンまたは非置換ベンズアミジン種が挙げられる。使用され得るアミジンとしては、塩酸ベンズアミジン；ｐ−アミノベンズアミジンジヒドロクロライド；ビス（５−アミジノ−２−ベンズイミダゾリル）−メタン；ａ，ａ’−ビス（４−アミジノ−２−ヨードフェニル）−ｐ−キシレン；１，２−ビス（５−アミジノ−２−ベンゾフラニル）−エタン；および６−アミジノ−２−（４−アミジノフェニル）−ベンゾ−［β］チオフェンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
他の例示的な実施形態において、アフィニティー部分は、グアニジンである。本明細書中で使用される場合、用語「グアニジン」としては、グアニジンおよびその誘導体（例えば、ここでアミジノ窒素（＝ＮＨ）に結合した水素原子は、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基により置換される）が挙げられる。これらの実施形態において、グアニジン誘導体は、以下の構造を有する：
【００２２】
【化２】
ここで、はめこみ「Ｃ」を有する円は、カラムまたは他の固体支持体の成分を表す。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、Ｈ、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換ヘテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基より独立して選択されたメンバーを表す。Ｒ３は、存在しても存在しなくてもよく、そして上に示した基（Ｈを除く）のいずれかを有し得る。代表的なグアニジン含有種としては、グアニジノ酢酸およびその誘導体、置換グアニジノ安息香酸または非置換グアニジノ安息香酸、アルギニンならびにそれらのアナログ（例えば、カルボキシ基またはα−アミノ基で誘導される）が挙げられる。
【００２３】
さらに他の例示的な実施形態において、アフィニティー部分は、アミン含有種である。本発明の実施において有用な例示的なアミン含有種としては、アミノ酸およびアミノ酸アナログ（例えば、カルボキシ基またはα−アミノ基で誘導体化される）が挙げられる。本発明において有用な代表的なアミノ酸は、リジン、その誘導体、ε−アミノカプロン酸などである。
【００２４】
用語「アルキル」は、単独でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれらの組み合わせを意味し、これらは、完全不飽和、一不飽和または多価不飽和であり、そして指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１〜１０個の炭素原子を意味する）、２価ラジカルおよび多価ラジカルを含み得る。
【００２５】
「アルキル」は、本明細書中で使用される場合、「アルキレン」基を含む。用語「アルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、アルカン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で例示されるが、これに限定されない）由来の２価のラジカルを意味し、そして以下に「ヘテロアルキレン」として記載される基をさらに含む。代表的に、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、本発明においては、１０個またはそれより少ない炭素原子を含むアルキル（またはアルキレン）基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、一般的には８個またはそれより少ない炭素原子を有する。
【００２６】
用語「ヘテロアルキル」は、単独で、または別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、安定した直鎖もしくは分枝鎖、または示した数の炭素原子およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され得、そして窒素へテロ原子は、必要に応じて四級化され得る）からなる、環状炭化水素ラジカル、もしくはそれらの組み合わせを意味する。
【００２７】
用語「アリール」は、特に明記しない限り、単一環または互いに縮合されたか、もしくは共有結合的に連結された、複数環（好ましくは１〜３環）であり得る、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択された１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）であって、ここで、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され、そして窒素原子は、必要に応じて四級化される、アリール基をいう。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通じて分子の残部に結合され得る。上記のアリール環系およびヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下に記載される受容可能な置換基の群より選択される。
【００２８】
上記のように、溶離剤は、使用されるアフィニティー部分と同じであるか、または使用されるアフィニティー部分のアナログである。代表的に、溶離剤は、ＳＧＴに対して、カラム上のアフィニティー部分より高いアフィニティーを有する。いくつかの実施形態において、溶離剤はアルギニンである。溶離液中の溶離剤（例えば、アルギニン）の濃度は、通常、少なくとも約０．５Ｍである。溶離液中の約０．５Ｍと約１．２Ｍとの間の濃度は、高純度を有するＳＧＴの調製物を提供することが見出されている。最も好ましい濃度は、約０．８Ｍと約１．０Ｍとの間の濃度である。本発明の方法により得た収率は、先行技術のイオン交換クロマトグラフィー法に比べて高い。
【００２９】
提供された方法において、ＳＧＴは様々なプロテアーゼの混合物より選択的に精製される。このプロテアーゼのうちいくつか（特にキモトリプシン）は、公知の方法で分離することが難しい、類似した生理化学的特性を有する。しかしながら、溶離液中に約０．５Ｍと約１．２Ｍとの間の濃度のアルギニンを使用する本発明の方法を用いて、ＳＧＴはプロナーゼ混合物中の他のプロテアーゼから選択的に分離される。
【００３０】
溶離液は、溶離剤としてアルギニンを代表的に含有し、そして約ｐＨ４．０と約ｐＨ９．０との間（好ましくは、約ｐＨ５．０と約ｐＨ７．０との間）のｐＨを有し得る。使用され得る別のアミジン誘導体アナログとしては、アルギニンのアナログ（例えば、分子のカルボキシル末端に修飾を有するアルギニンのアナログ）（例えば、Ｋａｓａｉ，Ｋ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５９７，３−１８を参照のこと）；Ｃ末端アミノ酸としてアルギニンを含有するペプチド（例えば、ロイペプチン、ペプスタチン）（例えば、Ｋａｓａｉ、前出を参照のこと）；リジンまたはリジンのアナログおよびＣ末端アミノ酸としてリジンを含有するペプチド；スルファメトキサゾラムおよびその誘導体（例えば、Ｗｕ，Ｘ．およびＬｉｕ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １０，２２８−２３２を参照のこと）；ベンズアミジンおよびｍ位ならびに／またはｐ位に修飾を有するそのアナログ；ならびにグアニジンおよびその誘導体（例えば、Ｅｌｌｏｕａｌｉ，ら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５４８，２５−２６５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
溶離液は、無機塩をさらに含有し得る。無機塩は、ナトリウム、リン酸または硫酸由来の塩であり得る。一般的に、ナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ）が好ましい。無機塩は、約０．１Ｍと約１Ｍとの間の濃度であり得る。溶離剤において、約０．５Ｍと約１．０Ｍとの間の濃度が好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィーカラムで都合よく行われる。アフィニティー部分が結合され得る任意のマトリックスは、アフィニティーキャリアとして使用され得る。このようなマトリックスまたはキャリアは、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、多孔性粒子または多孔性ビーズ（例えば、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、あるいはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（Ｔｏｓｏｈａａｓ））またはセルロース、デキストラン、アクリルレートもしくはシリケートに基づく他のキャリアより選択され得る。
【００３３】
本発明の方法において、プロナーゼは好ましくは可溶化される。可溶化剤は、緩衝液であり得、ここで、緩衝溶液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、または硫酸緩衝液であり得る。必要に応じて、緩衝液は、塩（例えば、ナトリウム塩）を含有し得る。緩衝液は、好ましくは約６．０と約８．０との間のｐＨを有する。プロナーゼは、キャリアマトリックスと接触させられ、そしてＳＧＴは競合的溶離（代表的には、アルギニンを用いる）によって選択的に溶出される。
【００３４】
溶離剤としてアルギニンを利用する場合、本方法で得られた精製ＳＧＴは、約０．５Ｍ〜約１．２Ｍのアルギニンを含有する溶液中に存在する。本実施形態の長所は、溶液中の溶離剤（例えば、アルギニン）の安定化特性のため、安定剤が添加されなくてもよいことである。従って、精製ＳＧＴは、液体中のさらなる安定剤なしで保存され得る。本方法で得られたＳＧＴは、少なくとも約９５％の純度、好ましくは少なくとも約９８％の純度を有し、そして他のどの酵素（例えば、キモトリプシン）も本質的に含まない。
【００３５】
溶離剤が生理学的に受容可能ではない、いくつかの実施形態において、溶離剤は精製ＳＧＴから除去される。任意の多数の標準方法が、この目的に使用される。このような方法としては、透析法、または適切な分子量カットオフを有するメンブレンを使用し、溶離剤が通り抜けることを可能にするが、一方ＳＧＴは保持物中に遅延される限外濾過法が挙げられる。このようなメンブレンは、周知であり、再生セルロース、ＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホンなどから製造され得る。分子の相違（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親和性など）を利用する、様々なクロマトグラフィー技術もまた、都合よく使用される。他の方法としては、溶離剤またはＳＧＴのいずれかの沈殿が挙げられ、そしてＳＧＴと比べて、異なる溶離剤の溶解特性に依存する。一般的に、高親和性溶離剤が使用される場合、溶離剤が除去され得る前に、溶離剤がＳＧＴから最初に分離されねばならない。これは、周囲のパラメーター（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、誘電率など）を変えることにより、代表的に行われる。このような方法はまた、当該分野において周知である。
【００３６】
本発明はさらに、少なくとも約９５％の純度を有する精製ＳＧＴの調製物を提供する。しばしば、精製調製物は、少なくとも０．６Ｍのアルギニンの濃度のアルギニンを含有する。本発明のＳＧＴ調製物は、１ｍｇのタンパク質あたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有する。好ましくは、この比活性は、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも４０×１０３Ｕである。
【００３７】
本発明の調製物は、約０．５Ｍ〜約１．２Ｍの間のアルギニンの溶液中、室温で少なくとも２週間および４℃で少なくとも４週間、代表的に安定である。より長期の保存のため、調製物は凍結されつづけ得るか、または凍結乾燥され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「安定な」は、アフィニティーキャリアからの溶出により直接得られた最初のＳＧＴ調製物の比活性の減少が、室温で２４時間につき、５％未満であることを意味する。
【００３９】
「ＳＧＴ精製調製物」は、ウエスタンブロットアッセイおよびＨＰＬＣにより測定された場合、少なくとも約９５％の純度を有する調製物を意味する。ＳＧＴの純度はまた、調製物の残存キモトリプシン活性により測定され得る。調製物中に存在し得る残存キモトリプシン活性は、キモトリプシン特異的な酵素試験により測定される。これらの分析は、例えば、実施例１に記載されるように実行され得る。この試験結果が、調製物中に検出可能なキモトリプシン活性がないことを示す場合、この調製物は、キモトリプシン活性がないと規定される。
【００４０】
「比活性」は、多数の方法により測定され得る。一つの例は、特定のトリプシン活性試験（例えば、特異的基質（例えば、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）またはＮ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（Ｓ２２２）についてのエステラーゼ活性）である。これらのアッセイは、例えば、実施例１および実施例２に記載されるように実行される。
【００４１】
「特異性」は、トリプシン特異的インヒビターによる精製ＳＧＴの特異的な阻害を意味する。トリプシンインヒビターは、植物源または動物源由来（例えば、ダイズ由来のトリプシンインヒビターまたはニワトリの卵白由来のトリプシンインヒビター）であり得る。
【００４２】
全ての酵素アッセイに対するコントロールとして、ブタ供給源またはウシ供給源由来の精製された市販のトリプシンが使用され得る。
【００４３】
生理学的に受容可能な溶離液（例えば、アルギニン）を使用する場合、高度に精製されたＳＧＴ調製物を得るために１回クロマトグラフィー工程のみが必要とされるため、本発明の方法は、効率的かつ単純である。調製物は、溶離剤中で安定であり、そして酵素活性の有意な減少なしに溶液中で保存され得る。この方法を用いて、良好な収率で、比活性が高く、かつ純度が高い精製ＳＧＴが得られる。
【００４４】
本発明は、アフィニティー部分（例えば、ベンズアミジン）に酵素を選択的に吸着させ、そしてアフィニティー部分のアナログ（例えば、アルギニン）を用いた競合的な溶出によって、インタクトなＳＧＴを溶出させることによりＳＧＴを精製する方法を提供する。非常に穏やかな方法である競合的な溶出を使用して、リガンド（例えば、ベンズアミジン）が、最終産物に入ることが回避される。さらに、大過剰の溶離剤（例えば、アルギニン）は、調製および保存の間の自己消化を回避することで、酵素の自己触媒活性を阻害し、そして安定した精製産物を維持する。別の長所は、アルギニンは大部分の細胞培養プロセスまたは精製プロセスと十分に適合性であるため、最終産物が生物工学プロセスにおけるその意図された目的に直接使用され得ることである。
【００４５】
本発明に従って作製される最終精製産物の生理学的特徴は、例えば、細胞培養技術、タンパク質精製プロセスまたはトリプシンが使用される任意の他のプロセスにおける最終精製産物の直接使用を可能にする。非常に類似した作用の様態および特異性のため、ＳＧＴは、実質的に全ての生物工学的適用において、哺乳動物トリプシンの代替物として使用され得る。精製され、高度に均一となった場合、この酵素は周知のトリプシンインヒビターによって完全に阻害され得る。
【００４６】
本発明の別の局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、生物プロセス（例えば、細胞培養、ウイルス活性化または精製）において使用される。例えば、精製されたＳＧＴは、マトリックスからの真核細胞の剥離に使用され、そして必要に応じてさらに、その細胞の継代および継代培養、または発酵槽中での接種に使用される。本発明のＳＧＴは、細胞の増殖および／または脊椎動物細胞の細胞培養バイオマスの生成に使用され得る。
【００４７】
本発明のＳＧＴはまた、細胞バイオマスの生成、または培養プレート、Ｒｏｕｘフラスコ、ローラーボトルもしくはマイクロキャリア培養での表面依存性真核細胞の継代に使用され得る。培養物は、層からの細胞の懸濁、組織からの細胞の単離および分離、または初代細胞培養物の調製のための単層培養物、マイクロキャリア培養物であり得る。脊椎動物細胞は、動物組織（例えば、器官）由来の任意の細胞、初代細胞由来の任意の細胞または連続細胞株由来の細胞であり得る。初代細胞は、サル腎臓、ハムスター腎臓、イヌ腎臓、卵巣または初代細胞培養物の生成に有用であると知られている他の器官であり得る。連続細胞株由来の細胞の例は、ＶＥＲＯ；ＣＶ−１、ＣＨＯ；ＢＨＫ；ＭＤＣＫ；ＭＲＣ−５、ＭＤＢＫ、ＷＩ−３８であり、形質転換細胞、トランスフェクト細胞および組換え細胞を含む。
【００４８】
細胞は、好ましくは無血清培地中で培養されそして増殖される。その培地は、最少培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２、およびＫｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０−９６８）に記載されるような当該分野で公知の他の最少培地）であり得る。最も好ましくは、細胞は、ＷＯ ９６／１５２１３、ＷＯ ００／０３００またはＷＯ ０１／２３５２７に記載されるような無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖され得、そのためにこの最少培地には酵母抽出物またはダイズペプトンが補充され得る。
【００４９】
本発明の別の局面に従って、精製ＳＧＴは、ウイルスまたはウイルス抗原の生成に使用される。この方法は、本発明の精製されたＳＧＴを使用して細胞を継代および継代培養することにより、細胞培養物を提供する工程、細胞を増殖させてバイオマスにする工程および細胞にウイルスを感染する工程を包含する。細胞は、好ましくは無血清培地または無血清かつ無タンパク質の培地中で培養されそして増殖される。
【００５０】
本発明により提供される方法は、細胞のバイオマスおよびウイルス生成プロセスを組み合わせており、ここで全ての工程は培地中のあらゆる哺乳動物由来源（例えば、血清またはタンパク質）を回避する条件下で実行される。さらに、継代および継代培養の間、細胞培養物中のＳＧＴの高い比活性に起因して、タンパク質負荷は減らされ得る。従って本方法は、混入タンパク質の全体的タンパク質負荷を有意に減少させる。
【００５１】
本発明に使用され得るウイルスの例は、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイルス科、アレナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ライノウイルス科およびレオウイルス科ならびにアデノウイルス科というウイルス科の群のウイルスであり、好ましくは、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、ロタ（Ｒｏｔａ）ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉｃａｌ）ウイルス、ワクシニアウイルスおよび組換えワクシニアウイルス、単純疱疹ウイルス、ＴＢＥＶ、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスならびにこれらのキメラの群より選択されるウイルスである。所望のウイルスの増殖のため、適切な宿主細胞およびこの宿主に感受性のウイルスの選択の方法は、周知である。細胞は、上記のような細胞から選択され得る。
【００５２】
特定の実施形態に従って、精製ＳＧＴは、ウイルスまたはウイルス抗原の生成に使用される。ここでウイルスはプロテアーゼにより活性化される。このようなウイルスは、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ロタウイルス科の群から選択されたウイルスである。この方法は、細胞培養物を提供する工程であって、ここで細胞は本発明の精製されたＳＧＴを使用して継代および継代培養される、工程、この細胞にパラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ロタウイルス科の群より選択されたウイルスを感染させる工程、ウイルスを精製ＳＧＴと接触させてウイルスを活性化する工程、ウイルスを増殖させる工程および生成させたウイルスを回収する工程を包含する。
【００５３】
細胞の継代および継代培養のため、本発明の精製ＳＧＴは、細胞培養型、培養体積または培地体積、および培養プロセスで使用される精製ＳＧＴの比活性に依存して、約４μｇと約１０００μｇとの間の量で、添加される。静置培養のために添加されるタンパク質の量は、約４μｇ／１５０ｃｍ２〜約５０μｇ／１５０ｃｍ２の範囲であり得、ローラーボトルのために添加されるタンパク質の量は、約５０μｇ／８５０ｃｍ２〜約１００μｇ／８５０ｃｍ２の範囲であり得、そしてマイクロキャリア培養のために添加されるタンパク質の量は、１ｍｇのタンパク質あたり約２６×１０３Ｕの比活性を有するＳＧＴ調製物を含む培地１リットルあたり約１０００μｇ〜約２０００μｇの範囲であり得る。最適な継代および継代培養の条件に必要とされるプロナーゼ／タンパク質の最少量を決定することは、当業者の知識内である。本発明の精製ＳＧＴの使用の長所は、（ｉ）動物源由来のタンパク質を回避すること、および（ｉｉ）従来の細胞培養物（ここで、動物源由来のトリプシンが使用される）と比較して少なくとも５倍〜少なくとも２５倍の間のＳＧＴの高い比活性に起因して、タンパク質負荷を減少させること、である。
【００５４】
本発明の一つの局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖される細胞バイオマスの生成に使用され、ここでこのバイオマスは、精製ＳＧＴを使用て継代および継代培養され、そして総プロテアーゼタンパク質負荷は、哺乳動物由来のトリプシンを使用して同一の条件下で培養された細胞培養物と比較して、少なくとも７５％まで減少される。
【００５５】
ウイルスの活性化に関し、本発明の精製ＳＧＴは、使用される精製ＳＧＴの比活性に依存して、培養容量（ｃｍ２またはｃｍ３）について約１０μｇ〜５００μｇの総タンパク質量で使用され得る。記載された実施例に従うこと、および少なくとも２×１０４Ｕ／ｍｇの特定の比活性を有する精製ＳＧＴの必要とされる総タンパク質量を、最適なウイルス比活性およびさらなるウイルス増殖に適応させることは、当業者の知識内である。
【００５６】
精製ＳＧＴ調製物を継代および継代培養および必要に応じてウイルス活性化に使用することにより、バイオマス生成およびウイルス増殖プロセスに由来するタンパク質負荷は、従来法で得られた細胞培養物と比較して、少なくとも７５％までに、好ましくは少なくとも９０％減らされ得る。
【００５７】
記載した方法により、ウイルスまたはウイルス抗原調製物が得られる。ここで、細胞および細胞培養培地に由来する混入タンパク質の総タンパク質負荷は、類似の条件下で、哺乳動物由来のトリプシンを使用して培養された従来の細胞培養物を使用して得られた調製物と比較して、少なくとも７５％まで減らされる。
【００５８】
本発明の精製ＳＧＴを使用して細胞を培養し、そして必要に応じてウイルスを活性化する上記のような方法は、生成したウイルスを精製する工程をさらに包含し得る。低負荷の混入タンパク質（産物／ウイルス特異的ではないタンパク質）に起因して、残存夾雑タンパク質は、さらなる精製により除去され得る。得られる精製ウイルス調製物は、免疫原性組成物（例えば、予防ワクチンまたは治療ワクチン）中でさらに処方され得る。
【００５９】
本発明の別の局面に従って、精製ＳＧＴは、精製プロセスにおいて使用される。広い範囲の精製法に関して、特異的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を使用して、混入タンパク質を分解し、次いでこのプロテアーゼは、さらなる精製工程（例えば、濾過、クロマトグラフィーまたは遠心分離）を使用して除去される。本発明の精製ＳＧＴは、精製ウイルス（例えば、ＨＡＶ）の調製の精製法において効率的に使用され得る。最適条件に必要とされる最小限の本発明の精製ＳＧＴを決定することは、当業者の知識内である。
【００６０】
本発明の精製ＳＧＴはまた、組換え細胞由来の組換え産物の生成に使用され得る。この使用は、外来性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の細胞培養物を提供する工程であって、ここでこの細胞は、本発明の精製ＳＧＴを用いて継代および継代培養される工程、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質が生成される条件下で細胞を培養する工程、および生成したこの組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質を回収する工程を包含する。細胞は、好ましくは無血清培地または無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖される。細胞は、組換えタンパク質を発現可能な、組換え細胞（例えば、組換えＣＨＯ細胞）であり得る。
【００６１】
記載した方法を用いて、組換え産物が得られる。ここで、細胞および細胞培養培地に由来する混入タンパク質の総タンパク質負荷は、同様の条件下で培養された、従来の細胞培養物を用いて、得られる調製物と比較して、少なくとも７５％減らされる。
【００６２】
別の局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、液体中で、または（例えば、米国特許第６，０１０，８４４号に記載されるような）不溶性キャリア上に固定化されてのいずれかにおいて、プロタンパク質の制御プロセシングのために使用されて、それらの成熟形態にされる。
【００６３】
本発明の精製ＳＧＴは、ＳＧＴのタンパク質分解性により消化され得る、タンパク質により夾雑された生物工学装置（例えば、濾過器、発酵槽など）の洗浄に使用され得る。
【００６４】
ここまで一般的に本発明を説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照して理解され得る。これらの実施例は、説明の目的のみで本明細書中に提供され、限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（プロナーゼからのＳｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンの精製）
（Ａ．イオン交換クロマトグラフィー）
３０ｇのプロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を緩衝液Ａ（０．０２ピリジン、ｐＨ ５．０）中に溶解し、終濃度４０ｍｇ／ｍｌのプロナーゼにする。２５ｍｌの溶液を、緩衝液Ａで平衡化した、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での陽イオン交換クロマトグラフィーに供する。室温で、カラム容量の５倍量の緩衝液Ａ（０．０２Ｍピリジン）および緩衝液Ｂ（０．７５Ｍピリジン、ｐＨ
５．０）を用いた直線勾配を使用し、溶出を行う。
【００６６】
回収した画分を、１：１０の割合（例えば、１００μｇのタンパク質あたり１ｍｇのダイズインヒビター）で画分のサンプルとダイズインヒビターとを有する混合し、その後にＳ２２２を用いて、クロマトグラフィー基質をアッセイすることにより、阻害特性に関して試験する。その結果を、１分間あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）として表す。ダイズインヒビターに対して最も高い阻害活性を有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析し、そしてクーマシーで染色する（図１、レーン１）。
【００６７】
トリプシン活性を、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＣａＣｌ２中、２５℃）を用いた色素形成アッセイにより測定し、そして１分間あたりのΔ吸光度単位を測定する。コントロール基準として、１３×１０３Ｕ／ｍｇの比活性を有するブタのトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を使用する。比活性は、１ｍｇのタンパク質あたりのトリプシン酵素活性の単位として定義される。その結果を、表１に示す。
【００６８】
キモトリプシン活性を、３−カルボキシメトキシプロピオニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−チロシン−ｐ−ノトロアニリン（ｎｏｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）塩酸塩（Ｓ−２５８６、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いた色素形成アッセイにより測定する。その結果を、１分間あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）と表す。
【００６９】
【表１】
表１は、ダイズインヒビターを用いた阻害試験で測定された場合、トリプシン様活性を有するタンパク質を含む画分が、プロナーゼより約１０倍高い比活性、および約７０％の回収率にて、イオン交換クロマトグラフィーで精製され得ることを示す。しかしながら、このタンパク質は不安定であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドではなく様々なバンドを示す。これは、このタンパク質の断片化および自己切断を示す（図１、レーン１）。
【００７０】
（Ｂ．固定化されたベンズアミジンでのアフィニティークロマトグラフィー）
緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）で平衡化したＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ速流（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに４０ｍｌのプロナーゼ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ、緩衝液Ａ）を負荷する。溶出を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ベンズアミジン塩酸塩ｐＨ７．０）、緩衝液Ｃ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．６Ｍアルギニン、ｐＨ５．５）または緩衝液Ｄ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍアルギニン、ｐＨ５．５）を用いて行う。
【００７１】
回収した画分を、阻害特性に関してはダイズインヒビターを用いて、ならびにトリプシン活性およびキモトリプシン活性については、実施例１Ａに記載されるように試験する。比活性を、タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性の単位として測定する。
【００７２】
【表２】
表２にまとめた結果は、ベンズアミジンを用いた競合溶出により、プロナーゼの精製トリプシン様活性の６０％を、高い比活性で回収したことを示す。しかしながら、精製トリプシン様プロテアーゼを含む画分は、好ましくはさらに精製され、そして細胞培養増殖またはヒトにおける適用のための生物製剤の生成を含むプロセスでの使用の前に、ベンズアミジンが除去される。
【００７３】
【表３】
表３の結果から見られ得るように、０．６Ｍのアルギニンを含有する緩衝液を使用する場合、プロナーゼの最初のトリプシン様活性の約６３％が回収されるのに対し、１Ｍのアルギニンを含有する緩衝液を用いると、プロナーゼの最初のトリプシン様活性の約７１％が回収される。アルギニンを用いてベンズアミジンアフィニティーキャリアから溶出された精製ＳＧＴもまた、イオン交換クロマトグラフィーまたはベンズアミジンキャリアからのベンズアミジンを用いた溶出により得られたＳＧＴと比較して、より高い比活性を有する。さらに、上昇したモル濃度のアルギニンを含有する緩衝液を使用する場合、より高い純度かつより高い比活性の産物が得られる。
【００７４】
未精製のＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼサンプル、アフィニティークロマトグラフィーカラムの素通り画分サンプルおよび１Ｍアルギニンで溶出した精製ＳＧＴサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（図２）。
【００７５】
ダイズインヒビターに対し、最も高い阻害活性を有する画分のサンプルを、モルモット由来の抗ＳＧＴ血清を用いたウエスタンブロットによりさらに解析する（図３）。ＳＧＴの純度を、分析逆相ＨＰＬＣを用いて測定する。ここで、精製ＳＧＴを逆相カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−５Ｃ１８−１５０×２ｍｍ）に負荷し、そして直線勾配のアセトニトリルで溶出する。逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムは、図４に示される。純度は、総ピーク面積に対する主要ピークの関係として示される。逆相ＨＰＬＣの精製ＳＧＴは、９５％より高い純度を示した。クロマトグラムは、ＳＧＴに相当する鋭いピークを示す。オンラインＨＰＬＣ−エレクトロスコーピー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）イオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用し、精製ＳＧＴの分子量を測定する。従って、クロマトグラムの主要ピークは、２３０９６．５Ｄの分子量を有し、この分子量は、理論上の質量である２３０９９Ｄと非常に一致する。このデータは、さらに正確なＮ末端（ＮＨ２−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ｍ−Ｖ−）の評価によりさらに確認される。
【００７６】
ベンズアミジンでの１工程アフィニティークロマトグラフィーにより精製され、そしてアルギニンで溶出された、精製トリプシン様プロテアーゼは、アルギニン溶液中で安定である。精製産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示し、そして図１（レーン２）に見られ得るような低分子量ポリペプチドとなる顕著な断片化を有しはしないが、イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＳＧＴは、断片化されて、図１（レーン１）に見られるような低分子量ポリペプチドとなる。
【００７７】
アルギニンを用いた競合溶出によるアフィニティークロマトグラフィー精製法は、少なくとも９５％の純度の精製ＳＧＴを生じ、この精製ＳＧＴは、ＳＤＳ／ウエスタンブロットおよびＨＰＬＣにより示されるように、インタクトでかつ安定である。加えて、この精製ＳＧＴは、他のプロテアーゼ活性、特定のキモトリプシン、エンドトキシンおよびプロセスに関連した不純物（例えば、ベンズアミジン）を実質的に含まない。ＳＧＴ精製調製物中の高濃度アルギニンに起因して、ＳＧＴは、室温で少なくとも２週間安定であり、そして自己触媒活性も、産物の不安定性も、ＳＧＴ分解産物の増加も、比活性の損失もないことを示す。０．５Ｍ〜１．２Ｍ（ｐＨ２とｐＨ１０との間のｐＨ）のアルギニン溶液中で安定化されたＳＧＴ調製物は、大部分の生物プロセスにおいて生理学的に受容可能であり、そしてさらなるプロセス（例えば、タンパク質、ウイルスの活性化）のため、または以下に記載するような精製法においてすぐに使用される。
【００７８】
（実施例２）
（哺乳動物細胞の細胞培養に使用されるブタトリプシンおよび精製ＳＧＴの酵素活性の測）
各酵素のタンパク質含有量およびエステラーゼ活性を、ブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）、プロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、および実施例１Ｂに従い、ベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでのアフィニティークロマトグラフィーおよび０．６Ｍのアルギニンを用いた溶出によって得られた精製ＳＧＴの基質として、ＢＡＥＥ（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル）を使用して測定する。この実験およびさらなる実験の結果を表４にまとめる。
【００７９】
【表４】
（実施例３）
（無血清かつ無タンパク質のＶＥＲＯ細胞の継代および継代培養のための総タンパク質負荷の測定）
継代数１２４で、呼称ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄより得た、ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル、Ｃｅｒｃｏｐｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ、腎臓）を、無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。細胞を、Ｋｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０−９６８，ＷＯ ９６／１５２３１、または米国特許第６，１００，０６１号）に記載されるように、無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖するように適応させる。無血清培地中での増殖のために、無機塩類、アミノ酸、重炭酸ナトリウム（２ｇ／ｌ）および酵母抽出物またはダイズ抽出物（０．１〜１０ ｇ／ｌ）を補充された基本的なＤＭＥＭ ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地を使用する。作業細胞バンクを、動物由来の培地組成物を全く使用せずに調製する。
【００８０】
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物と１：１の比で混合したＤＭＥＭ培地中で培養したＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）の一つのアンプルを、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した無血清培地中に再懸濁する。
【００８１】
１μｇと１０，０００μｇとの間の異なるタンパク質濃度のブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）、プロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）および実施例２で測定されるような比活性を有する精製ＳＧＴを、Ｔフラスコの静置培養物、ローラーボトル中の細胞またはマイクロキャリアに結合した細胞に添加する。完全な細胞剥離そしてその後接着（継代培養）培養に必要であるトリプシン、プロナーゼおよび精製ＳＧＴの総タンパク質の量を、表５に示す。
【００８２】
表５は、精製ＳＧＴを用いた場合、細胞剥離および細胞継代のためのプロテアーゼの総タンパク質負荷は、トリプシンを用いた場合に必要とされる量と比較して、静置培養において４％に減少し、ローラーボトルにおいて１７％に減少し、そしてマイクロキャリア培養系においては２０％に減少した。
【００８３】
【表５】
（実施例４）
（細胞増殖に関する哺乳動物由来トリプシン、プロナーゼおよび精製ＳＧＴの比較）
小規模ベースで、静置培養（Ｔフラスコ）およびマイクロキャリア培養（Ｃｙｔｏｄｅｘ３（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において増殖させたＶｅｒｏ細胞の細胞剥離特性および増殖特性を比較する。ＶＥＲＯ細胞を、上記のように無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。
【００８４】
ＶＥＲＯ細胞を、Ｔフラスコ中またはマイクロキャリア上のいずれかにおいて、増殖させる（３７℃、５〜１０％のＣＯ２濃度）。継代培養を、実施例４において測定したように、ブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）およびプロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を、Ｔフラスコ中では１００μｇの最終量にて用いて、そしてマイクロキャリア培養中では５０００μｇにて用いて行う。２．６×１０４Ｕ／ｍｇの比活性を有する精製ＳＧＴを、Ｔフラスコ培養物には４μｇの最終量で、そしてマイクロキャリア培養物中には１０００μｇで添加する。細胞接着および細胞増殖を、目視検査および非接着細胞のカウントにより測定し、そして増殖活性として表す。表６は、Ｔフラスコ中またはマイクロキャリア上のいずれかで増殖させたＶＥＲＯ細胞の総量の％において表された増殖活性を示す。
【００８５】
【表６】
表６に示されるように、粗製プロナーゼは無血清培地中で増殖させたＶｅｒｏ細胞の十分な反復移入を可能にしないのに対し、精製ＳＧＴは、ブタトリプシンと同様に有効であるが、有意に減少した最終タンパク質負荷を有する。
【００８６】
（実施例５）
（精製ＳＧＴを用いたＶｅｒｏ細胞におけるウイルス抗原生成）
（５．１ ローラーボトル中のインフルエンザウイルスおよびウイルス生成のインビボ活性化）
２種類のＶｅｒｏ培養物を、ローラーボトル中で増殖させ、１単位あたり約２×１０８の最終細胞密度のコンフルーエンシーにする。培養物に０．０１のｍ．ｏ．ｉ．にてインフルエンザウイルスＮａｎｃｈａｎｇ Ａ／Ｈ３Ｎ２株を感染させる。ブタトリプシン（総タンパク質量：５００μｇ）または精製ＳＧＴ（総タンパク質量：５０μｇ）を、インフルエンザウイルスのインビボ活性化のために添加する。この添加は、ウイルス増殖をさらに可能にする。４８時間後の培養物における赤血球凝集活性を測定する。
【００８７】
【表７】
表７に示されたデータは、効率的なインフルエンザウイルスのインビボ活性化およびウイルス増殖に関しては、哺乳動物由来トリプシンと比べて、精製ＳＧＴの総タンパク質量の約１／１０が必要とされることを示す。従って、精製ＳＧＴの使用は、インビボ活性化工程の間の総タンパク質負荷において９０％の減少を可能にし、そして哺乳動物由来のトリプシンと比較した場合、Ｖｅｒｏ細胞において同様のインフルエンザウイルス増殖を産生した。
【００８８】
（５．２ 無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞におけるインフルエンザウイルス抗原の大規模生成およびウイルスの活性化のための精製ＳＧＴの使用）
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物と１：１の比で混合したＤＭＥＭ培地中で培養したＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）の一つのアンプルを、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した無血清培地中に再懸濁する。規定の継代数を有するＶｅｒｏ細胞を液体窒素より解凍し、そしてｒｏｕｘおよびローラーボトル中で継代し、１．５リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。細胞を３７℃で６〜８日間増殖させる。培養条件である酸素飽和度の２０％±１０％およびｐＨの７．１±ｐＨ０．２ならびに攪拌速度の３０〜６０ｒｐｍを制御する。最終細胞密度である１．５（１．０〜２．０）×１０６細胞／ｍｌに到達後、細胞を精製ＳＧＴ（１ｍｇ／ｌ）により剥離し、そして２．５ｇ／ｌのマイクロキャリア濃度（Ｃｙｔｏｄｅｘ ＩＩＩ（登録商標），Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を有する１０リットルのバイオリアクターに移す。細胞数を細胞のトリプシン処理により測定し、そしてＣＡＳＹ（登録商標）細胞カウンターでカウントする。細胞をコンフルエントな培養条件下で培養し、１．０〜１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を有するバイオマスに達する。
【００８９】
バイオマスにインフルエンザウイルスＮａｎｃｈａｎｇ株またはＴｅｘａｓ−３６のいずれかを感染させる。ウイルス増殖のプロセス中、さらなるインフルエンザウイルスの溶菌性感染サイクルの間、１５０μｇ／リットルの濃度の精製ＳＧＴの添加によりウイルスを活性化する。表８は、７２時間後、ＨＡＵ／ｍｌにより測定された場合の、インフルエンザウイルス生成を要約する。
【００９０】
【表８】
表８に示されるような結果に従い、継代および継代培養されかつ精製ＳＧＴを用いてスケールアップされたＶｅｒｏ細胞は、大規模バイオリアクター中で効率的に増殖し、そしてインフルエンザウイルスを生成した。
【００９１】
（実施例６）
（無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞において増殖により得られたインフルエンザウイルス抗原の純度およびウイルスの活性化のためのＳＧＴまたはトリプシンの使用）
Ｖｅｒｏ細胞の２つの並行細胞培養物を増殖し、実施例５．２に記載したようなバイオマスにする。これにより、ひとつをトリプシンを用いて継代および継代培養し、そしてひとつを精製ＳＧＴを用いて、ｒｏｕｘおよびローラーボトル中で継代および継代培養し、１．５リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。最終細胞密度である１．５（１．０〜２．０）×１０６細胞／ｍｌに到達後、細胞を精製ＳＧＴまたはトリプシンにより剥離し、そして２．５ｇ／ｌのマイクロキャリア濃度を有する１０リットルのバイオリアクターに移す。１．０〜１．５×１０６／ｍｌの細胞密度に到達することによってコンフルエントな培養条件に到達した後、バイオマスにインフルエンザウイルスＴｅｘａｓ−３６株を感染させる（ｍ．ｏ．ｉ． ０．０１）。ウイルスの活性化に関して、精製ＳＧＴまたはトリプシンを各細胞培養物に添加する。ウイルス増殖プロセスの終わりに、ウイルスを含む、澄んだ上澄み収集物をスクロース勾配による超遠心分離法で精製する。スクロース勾配精製抗原の純度は、タンパク質に対する抗原の比により測定される。赤血球凝集素の濃度を、Ｗｏｏｄら（１９７７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５：２３７−２４７）により記載されるような、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）で測定し、そしてその結果をＡ／Ｔｅｘａｓ−３６株に対して、７２時間後に比較する。その結果を表９にまとめる。
【００９２】
【表９】
精製ＳＧＴを用いて継代され、そしてスケールアップされたＶｅｒｏ細胞より得られたインフルエンザウイルス調製物は、より低いタンパク質混入を有するウイルス抗原の生成を可能にした。これらの結果は、単純な最初の精製工程後、トリプシンの使用と比較して、より高い純度のウイルス調製物が得られることを示す。さらに、４５％の容積測定のバイオリアクター生産性（リアクター容量あたりの総ＳＲＤとして表される）における増加が得られた。
【００９３】
（実施例７）
（Ａ型肝炎ウイルスの生成）
（７．１ 無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞上のＨＡＶ抗原の生成）
細菌プラスミドｐＨＡＶ／７にクローン化された弱毒化株ＨＭ１７５／７のゲノムの完全長ｃＤＮＡ（Ｃｏｈｅｎら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０３５−３０３９）を使用し、インビトロ転写により完全長ゲノムＲＮＡを調製する。無血清かつ無タンパク質の、３４℃のＶＥＲＯ細胞に、インビトロで転写したＨＡＶ ＲＮＡをトランスフェクトして、外来因子を含まないＨＡＶ ＨＭ１７５／７のウイルスストックを生成する。ＶＥＲＯ細胞バイオマスを実施例５．２に従って調製する。
【００９４】
ＨＡＶ ＨＭ１７５／７ウイルスの大規模生成のため、１×１０１１個の細胞のバイオマスでのＶＥＲＯ細胞培養物を、マイクロキャリア上に播種し、そして３７℃、無血清培地条件下、１００ｌの発酵槽中で増殖させる。温度を３４℃に下げ、そして次の醗酵サイクルの間、細胞数を８〜１０倍増加させる。細胞に０．０１〜０．１のｍ．ｏ．ｉ．で、ＨＡＶを、最後の醗酵槽中で感染させる。３４℃で、３５０日まで、感染した細胞の増殖を、細胞培養培地の持続性潅流を用いて行い得る。ウイルス抗原が培地中に検出される場合、ウイルスを含む上清を収集し、４℃で保存する。細胞培養上清の収集を、感染後３５〜４５日目に始める。
【００９５】
（７．２ ＨＡＶ収集物の精製および精製ＨＡＶの特徴付け）
実施例７．１の細胞培養上清のＨＡＶ収集物を、Ｐｒｏｓｔａｋ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ ２００ Ｋでの限外濾過により１００倍濃縮し、続いて緩衝液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ ８．０、０．０１％ Ｔｗｅｅｎに交換して、ダイアフィルトレーション工程（Ｐｒｏｓｔａｋ ２００ Ｋ，Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）を行う。調製物中に存在し得る、残留した宿主細胞の核酸を、１０００Ｕ／ｌの濃度（１ｍＭ ＭｇＣｌ２中に溶解）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）として市販（Ｂｅｎｚｏｎ ＰｈａｒｍａＡ／Ｓ））とともに、３時間室温でダイアフィルトレーション残留物（Ｄｉａｒｅｔｅｎａｔｅ）をインキュベーションすることにより除去する。続いて、０．５〜５Ｕ／ｍｌの濃度での精製Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を添加し、残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を室温で２４時間さらにインキュベートする。宿主細胞夾雑物（すなわち、核酸および／またはタンパク質）を、緩衝液として２０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いる１００Ｋメンブランでのダイアフィルトレーションにより除去する。
【００９６】
少なくとも１０００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌのＨＡＶ抗原を含むサンプルを各濾過工程の間に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして銀染色をして総タンパク質を可視化するかまたはウエスタンブロット分析により分析してＨＡＶ特異的抗原を定量する。ＨＡＶ特異的抗原を、ＨＡＶカプシドタンパク質に特異的な抗血清を用いてウエスタンブロット分析により同定する。ＨＡＶ前駆体タンパク質が精製プロセスの間に除去されることが示され得る。ＨＡＶ特異的ポリペプチドは、細胞培養上清の出発物質中で検出され、そのポリペプチドは精製ＳＧＴの処理後のダイアフィルトレーション残留物中に存在しないが、ＨＡＶ特異的カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、プロテアーゼ処理による影響を受けない。このポリペプチドは、銀染色およびウエスタンブロットによる異なる中間体の分析は、精製ＳＧＴを用いたプロテアーゼ処理精製手順の有効性を明らかに証明する。
【００９７】
ＶＥＲＯ細胞タンパク質に対して生じた抗血清を用いたウエスタンブロット分析は、出発物質および精製において、主に高い分子量ＶＥＲＯタンパク質の広範囲の中間体が検出可能であることを示した。しかし、最終残留物において、微量なＶＥＲＯ細胞タンパク質夾雑物のみが検出可能である。これは、ＨＡＶ生成プロセスおよび精製プロセスの間、高純度ＳＧＴでの処理が、ＶＥＲＯ細胞タンパク質混入物およびＨＡＶ前駆体ポリペプチドを効率的に分解することを示す。
【００９８】
（実施例８）
（固定化された精製ＳＧＴによる、トロンビンへのプロトロンビンの活性化、およびアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの回収）
精製ＳＧＴ（１ｇの湿ったゲルあたり１００ｍｇタンパク質）をアガロースゲル（ゲル１ｍｌあたり５０００ ＢＡＥＥ Ｕ ＳＧＴ）と結合させる。ガラスカラムに０．１ｍｌの固定化ＳＧＴ−アガロースを充填し、そして組換えプロトロンビンを米国特許第６，０１０，８４４号に記載される、同一の条件下で固定化ＳＧＴに供する。米国特許第６，０１０，８４４号に記載される方法に従い、トロンビンを単離および調製する。この方法は、本明細書中に参考として援用される。
【００９９】
上記の実施例は、本発明の説明のために提供され、その範囲を限定することはない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許請求の範囲により包含される。本明細書中に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一回のアフィニティークロマトグラフィー工程におけるプロナーゼからのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の単離および精製の方法ならびに精製したＳＧＴの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
トリプシンは、広範囲の哺乳動物の消化管中に存在するセリンプロテアーゼである。トリプシンの機能は、ペプチド結合の加水分解性切断であり、従って大きなタンパク質のサイズを減少させ、そしてそのタンパク質を他のプロテアーゼによってさらに分解されることを可能にする。トリプシンは、生物工学的適用、特に哺乳動物細胞の培養において使用される。哺乳動物細胞の培養においては、トリプシンは、大きい細胞凝集物を崩壊させるため、またはマイクロキャリアもしくは培養プレートのような表面から細胞を除去するためのツールとして役立つ。トリプシンはまた、非トリプシン感受性バイオポリマーのプロセシングにおいて、酵素を分解するタンパク質として使用される。その周知の特異性のため、トリプシンはまた、分析プロセスおよび調製用プロセスの両方において選択的なタンパク質切断ツールとして使用される。トリプシンは、多数の特異的または非特異的プロテアーゼインヒビターによって不活化または阻害され得、それらの多くは、セルピンファミリーに属する。生物工学的適用において最も幅広く使用されるトリプシンインヒビターは、ダイズ由来のトリプシンインヒビターである。これらのトリプシンインヒビターの大部分は非常に特異的であるので、それらは他の夾雑プロテアーゼに対して不活性である。
【０００３】
トリプシンは、様々な動物種の十二指腸腺より代表的に調製され、そして異なる程度の純度まで精製される。トリプシンの精製は、多数の異なる生化学的プロセス（沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる）により行われ得る。予め精製したウシトリプシン（Ｉ型）は、不溶性キャリア上に固定されたベンズアミジンに結合し、そして高濃度のグアニジンもしくはアルギニンにより、または溶離剤のｐＨを下げることにより溶出され得ることが示されている（Ｅｌｌｏｕａｌｉら １９９１．Ｃｈｒｏｍｓｙｍｐ．２２１５：２５５−２６５）。トリプシンを得る哺乳動物の膵臓はまた、セリンプロテアーゼキモトリプシンを含んでおり、このキモトリプシンは、その生理化学的特性（アミジン誘導体との相互作用およびアミジン誘導体に対する親和性を含む）が、トリプシンと非常に類似する。結果として、これら２つのタンパク質は、分離することが困難である。従って、精製法に応じて、精製したトリプシン調製物は、様々な量の夾雑酵素、特にキモトリプシンを含み得る。さらに、哺乳動物由来のトリプシンは、外来因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）を含み得る。ＴＳＥ因子の作用が発見されており、そしてそれらはヒトに伝染する可能性があるので、ヒトが使用するために医薬品を提供する生物工学プロセスにおけるヒトまたは動物由来の材料の使用に関して継続した議論がなされている。
【０００４】
プロナーゼ（微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（Ｓ．ｇ．）由来のプロテアーゼ）は、動物組織より調製されたトリプシンの市販代用物である。プロナーゼは、組織からの初代細胞培養物の調製のために、そして表面、マイクロキャリア細胞培養物からの細胞の剥離のために、そして無血清培地における懸濁状態でのＶＥＲＯ細胞の増殖のために使用されている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ １９６６．Ｅｘｐｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．４３：２３４−２３６；Ｍａｎｏｕｓｏｓら １９８０．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ １６：５０７−５１５，Ｌｉｔｗｉｎ １９９２．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎ．１０：１６９−１７４）。その作用の正確な機構は、分からない。プロナーゼは、異なる酵素の混合物であることが知られており、この酵素としては、様々な型のエンドペプチダーゼ（セリンおよびメタロプロテアーゼ）、エクソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼ）、中性プロテアーゼ、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ならびに中性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０００５】
酵素処理後、トリプシンの活性は、ウシ胎仔血清の添加によって通常中和される。このウシ胎仔血清は、多数の特異的プロテアーゼインヒビターおよび非特異的プロテアーゼインヒビターを含む。しかしながら、ワクチンおよび治療タンパク質の生成に使用される細胞培養培地においては、血清およびタンパク質（特に哺乳動物源由来の）を含まない培地が好ましい。従って、無血清培地（あらゆるトリプシンインヒビター活性を欠く）の使用は、新しいインヒビター活性源を同定することを必要とする。プロナーゼが様々なプロテアーゼの混合物であるため、プロテアーゼ活性の阻害は、異なるインヒビターの混合物を必要とし、非常に複雑かつ高価なプロセスをもたらす。従って、プロナーゼの使用に起因するタンパク質負荷および無血清培養物におけるインヒビターの組成は、哺乳動物由来のトリプシンおよび特異的なトリプシンインヒビターを使用する培養物と比較して非常に高くなる。さらに、培養培地へのプロナーゼの添加はまた、培地中により多いタンパク質が存在するため、精製プロセスに悪影響を与える。
【０００６】
プロナーゼのトリプシン様活性は、一般的にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）として知られ、ウシトリプシンに対して約３３％の配列同一性を示す（Ｏｌａｆｓｏｎら １９７５．Ｂｉｏｃｈｅｍ １４：１１６８−１１７７）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンは、異なる型のイオン交換樹脂を使用するクロマトグラフ技術によって精製されている。これらの方法は、代表的に、安定したマトリックスを使用し、溶出の間、リガンドが生成物中に流出するという問題を最小限に押さえる。しかしながら、これらの方法は、比較的低い選択性を有し、＜１０の範囲の精製係数をもたらす。結果として、高い度合いの純度を達成するために、いくつかの工程が組み合わされなければならず、それらの工程は、次に、トリプシンの自己消化およびそれによる活性の損失を引き起こし得る。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ上でのイオン交換クロマトグラフィーによる精製は、イオン交換カラム上での再クロマトグラフィーにより行われるさらなる精製と共に、Ｊｕｒａｓｅｋら（１９７１．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１９５−１２０１）およびＯｌａｆｓｏｎら（１９７５ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：１１６８−１１７７；１９７５ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：１１６１−１１６７）により記載される。Ｍｉｙａｔａら（１９９１．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １６：３９−４３）は、ＳＧＴを精製するための３工程陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを記載する。ＳＧＴは、ＰＡＧＥ中で単一バンドとして移動することが見出されており、約３０，０００の分子量を有し、そしてＢＡＥＥアッセイにより測定された場合、ウシトリプシンよりも高いエステラーゼ活性を有する。しかしながら、３工程クロマトグラフィー精製法により精製されたＳＧＴでさえ、カルボキシペプチダーゼＢ様活性が、わずかに混入していることが見出された。
【０００７】
ＳＧＴはまた、ＳＧＴの非常に特異的なリガンドとしてサルミンのトリプシン消化より生じたオリゴペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、プロナーゼから精製されている。ＨＣｌによるプロナーゼ中のプロテアーゼ混合物からのトリプシン様活性の溶出は、精製されたＳＧＴを示したが、しかしながらそのＳＧＴは、カルボキシペプチダーゼＢ様活性が混入していることが見出された（Ｋａｓｅｉら １９７５．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８．：６５３−６６２；Ｙｏｋｏｓａｗａら １９７６．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：７５７−７６３）。分析のみを目的として、ＳＧＴはまた、リガンドとしてベンズアミジンを使用したアフィノフォレーシス（ａｆｆｉｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって、プロナーゼから分離された（Ｓｈｉｍｕｒａら １９８２．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１６１５−１６２２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
プロナーゼの活性トリプシン様機能の単離および分離のための単純な大規模法の必要性が存在する。これは、制御されたシステムを細胞培養法で使用することを可能にし、そしてヒトの病原体の夾雑物の危険性を持たない、微生物源からの規定された活性のフラクションを提供する。
【０００９】
細胞の繁殖／増殖、バイオマス生成および生成物生成プロセスの間、細胞培養培地の添加物由来の夾雑を避ける必要性もまた存在する。細胞培養培地中のタンパク質負荷の減少は、高純度のタンパク質生成物を従来の精製法を用いて生成することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、プロナーゼから精製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の単離のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
高い比活性を有する精製されたＳＧＴの調製物を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１２】
生物工学プロセスにおいて、精製されたＳＧＴの使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
精製されたＳＧＴを真核細胞のバイオマスの生成に使用するための使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１４】
ウイルスまたはウイルス抗原の生成のために、精製されたＳＧＴの使用を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】
精製されたＳＧＴのみを用いて継代および継代培養された細胞を用いた生物学的生成物の生成のために、精製されたＳＧＴの使用を提供することもまた、本発明の目的である。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼよりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を単離する方法であって、該方法は、前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン（ｇｕａｎａｄｉｎｅ）、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、および該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出する工程、を包含する、方法。
（項目２）
前記溶離剤が、グアナジンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記溶離剤が、アルギニンである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記アルギニンが、０．５〜１．２Ｍの間の濃度にある、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記溶離液が、約ｐＨ４．０と約ｐＨ９．０との間の範囲のｐＨを有する、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記アフィニティー部分が、ベンズアミジンである、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記溶離液が、約０．１Ｍと約１Ｍとの間の濃度の無機塩を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ＳＧＴが、０．５Ｍ〜１．２Ｍのアルギニンを含有する溶液中に得られ、そして該ＳＧＴが、少なくとも９５％の純度を有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
精製された前記ＳＧＴから溶離剤を除去する工程をさらに含む、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
調製物が、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有する、ＳＧＴ精製調製物。
（項目１１）
少なくとも約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、そして、少なくとも９５％の純度を有する、項目１０に記載のＳＧＴ精製調製物。
（項目１２）
前記プロナーゼを、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される固定化されたアフィニティー部分と接触させる工程、およびを該固定化されたアフィニティー部分から、アミジン、グアナジン、またはアミン含有種からなる群より選択される溶離剤を含む溶離液を用いて該ＳＧＴを選択的に溶出させる工程、を包含する方法を用いて得られた、項目１０に記載の調製物。
（項目１３）
生物プロセスにおける、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目１４）
細胞のバイオマスを生成するための方法であって、該方法は、細胞の培養物を提供する工程、項目１０に記載の調製物を使用して該細胞を継代および継代培養する工程、および該細胞増殖させてバイオマスにする工程、を包含する、方法。
（項目１５）
前記細胞が、無血清培地中で増殖される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ウイルスまたはウイルス抗原を生成するのための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞が、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞を増殖させてバイオマスにする工程、該バイオマスの細胞にウイルスを感染させる工程、および該細胞をインキュベートして該ウイルスを増殖する工程、を包含する、方法。
（項目１７）
ウイルスまたはウイルス抗原を生成するための方法であって、該方法は、細胞の細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養される、工程、該細胞に、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ロタウイルス科の群より選択されるウイルスを感染させる工程、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有するＳＧＴ精製調製物を添加して該ウイルスを活性化する工程、および生成した前記ウイルスを収集する工程、を包含する、方法。
（項目１８）
前記生成されたウイルスを精製する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１７に記載の方法によって得られた、ウイルスまたはウイルス抗原調製物。
（項目２０）
組換え細胞から組換え産物を生成するための方法であって、該方法は、組換え細胞の細胞培養物バイオマスを提供する工程であって、該細胞が、項目１０に記載の調製物を使用して継代および継代培養された工程、組換え産物が生成される条件下で前記細胞を培養する工程、および生成された組換え産物を収集する工程、を包含する、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法によって得られた、組換え産物。
（項目２２）
血清もタンパク質も含まない培地中で増殖させたバイオマスであって、該バイオマスは、項目１０に記載の精製ＳＧＴを用いて継代および継代培養され、そして哺乳動物由来のトリプシンの使用により同一の条件下で培養した細胞培養物と比較して、総プロテアーゼタンパク質負荷が、少なくとも７５％低減される、バイオマス。
（項目２３）
ウイルスまたはウイルス抗原の精製プロセスにおける、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目２４）
ワクチン生成のためにウイルスを生成するための、項目１０に記載の調製物の使用。
（項目２５）
プロタンパク質からのタンパク質の活性化のための、項目１０に記載の調製物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：実施例１Ａに記載のイオン交換クロマトグラフィーからの溶出物およびレーン２：実施例１Ｂに記載のアフィニティークロマトグラフィーより１Ｍアルギニンで溶出後の精製されたＳＧＴ。
【図２】図２は、精製されていないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼおよび精製されたＳＧＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：精製されていないプロナーゼ、レーン２：アフィニティークロマトグラフィーの素通り画分、およびレーン３：アフィニティークロマトグラフィーおよび１Ｍアルギニンでの溶出後の精製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンを示す。
【図３】図３は、アフィニティークロマトグラフィーおよび１Ｍアルギニンでの溶出後の精製されたＳＧＴの、異なる２つのロットのウエスタンブロット解析を示す。
【図４】図４は、精製ＳＧＴの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）の大規模精製の単純な方法を提供することである。本発明の方法は、ＳＧＴの大規模精製に有用であり、そして生理学的に受容可能な溶離剤を利用するいくつかの実施形態において、様々な生物工学プロセスにすぐに使用できる安定したＳＧＴ調製物を提供する。
【００１８】
一つの実施形態において、本発明は、１回のクロマトグラフィー工程によりＳＧＴを単離する方法に関する。この方法は、プロナーゼを、固定化したアフィニティー部分（例えば、アミジン、グアニジン、またはアミン含有種）に接触させる工程およびアフィニティー部分として使用される同じ分類の化合物のメンバーを有するカラムから選択的にトリプシンを溶出する工程を用いる。溶離剤は、ＳＧＴに関して、キャリアに固定化されたアフィニティー部分に対する競合物として作用する。従って、いくつかの実施形態において、溶離剤は、ＳＧＴに対して、アフィニティー部分よりも高いアフィニティーを有するように選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態に従って、プロナーゼを、アミジンを含有する固定化されたアフィニティーカラムと接触させる。本明細書中で使用される場合、用語「アミジン」としては、アミジンおよびその誘導体（例えば、ここでアミジノ窒素（＝ＮＨ）に結合した水素原子は、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基により置換される）が挙げられる。これらの実施形態において、アミジンは以下の構造を有する：
【００２０】
【化１】
ここで、はめこみ「Ｃ」を有する円は、カラムまたは他の固体支持体の成分を表す。記号Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、それぞれ、Ｈ、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基より独立して選択されたメンバーである。Ｒ３は、存在しても存在しなくてもよく、そして上に示した基（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（Ｈを除く）のいずれかを有し得る。代表的なアミジン誘導体としては、置換ベンズアミジンまたは非置換ベンズアミジン種が挙げられる。使用され得るアミジンとしては、塩酸ベンズアミジン；ｐ−アミノベンズアミジンジヒドロクロライド；ビス（５−アミジノ−２−ベンズイミダゾリル）−メタン；ａ，ａ’−ビス（４−アミジノ−２−ヨードフェニル）−ｐ−キシレン；１，２−ビス（５−アミジノ−２−ベンゾフラニル）−エタン；および６−アミジノ−２−（４−アミジノフェニル）−ベンゾ−［β］チオフェンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
他の例示的な実施形態において、アフィニティー部分は、グアニジンである。本明細書中で使用される場合、用語「グアニジン」としては、グアニジンおよびその誘導体（例えば、ここでアミジノ窒素（＝ＮＨ）に結合した水素原子は、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換へテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基により置換される）が挙げられる。これらの実施形態において、グアニジン誘導体は、以下の構造を有する：
【００２２】
【化２】
ここで、はめこみ「Ｃ」を有する円は、カラムまたは他の固体支持体の成分を表す。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、Ｈ、置換アルキル基または非置換アルキル基、置換へテロアルキル基または非置換ヘテロアルキル基、置換アリール基または非置換アリール基、および置換へテロアリール基または非置換へテロアリール基より独立して選択されたメンバーを表す。Ｒ３は、存在しても存在しなくてもよく、そして上に示した基（Ｈを除く）のいずれかを有し得る。代表的なグアニジン含有種としては、グアニジノ酢酸およびその誘導体、置換グアニジノ安息香酸または非置換グアニジノ安息香酸、アルギニンならびにそれらのアナログ（例えば、カルボキシ基またはα−アミノ基で誘導される）が挙げられる。
【００２３】
さらに他の例示的な実施形態において、アフィニティー部分は、アミン含有種である。本発明の実施において有用な例示的なアミン含有種としては、アミノ酸およびアミノ酸アナログ（例えば、カルボキシ基またはα−アミノ基で誘導体化される）が挙げられる。本発明において有用な代表的なアミノ酸は、リジン、その誘導体、ε−アミノカプロン酸などである。
【００２４】
用語「アルキル」は、単独でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれらの組み合わせを意味し、これらは、完全不飽和、一不飽和または多価不飽和であり、そして指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１〜１０個の炭素原子を意味する）、２価ラジカルおよび多価ラジカルを含み得る。
【００２５】
「アルキル」は、本明細書中で使用される場合、「アルキレン」基を含む。用語「アルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、アルカン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で例示されるが、これに限定されない）由来の２価のラジカルを意味し、そして以下に「ヘテロアルキレン」として記載される基をさらに含む。代表的に、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、本発明においては、１０個またはそれより少ない炭素原子を含むアルキル（またはアルキレン）基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、一般的には８個またはそれより少ない炭素原子を有する。
【００２６】
用語「ヘテロアルキル」は、単独で、または別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、安定した直鎖もしくは分枝鎖、または示した数の炭素原子およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され得、そして窒素へテロ原子は、必要に応じて四級化され得る）からなる、環状炭化水素ラジカル、もしくはそれらの組み合わせを意味する。
【００２７】
用語「アリール」は、特に明記しない限り、単一環または互いに縮合されたか、もしくは共有結合的に連結された、複数環（好ましくは１〜３環）であり得る、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択された１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）であって、ここで、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され、そして窒素原子は、必要に応じて四級化される、アリール基をいう。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通じて分子の残部に結合され得る。上記のアリール環系およびヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下に記載される受容可能な置換基の群より選択される。
【００２８】
上記のように、溶離剤は、使用されるアフィニティー部分と同じであるか、または使用されるアフィニティー部分のアナログである。代表的に、溶離剤は、ＳＧＴに対して、カラム上のアフィニティー部分より高いアフィニティーを有する。いくつかの実施形態において、溶離剤はアルギニンである。溶離液中の溶離剤（例えば、アルギニン）の濃度は、通常、少なくとも約０．５Ｍである。溶離液中の約０．５Ｍと約１．２Ｍとの間の濃度は、高純度を有するＳＧＴの調製物を提供することが見出されている。最も好ましい濃度は、約０．８Ｍと約１．０Ｍとの間の濃度である。本発明の方法により得た収率は、先行技術のイオン交換クロマトグラフィー法に比べて高い。
【００２９】
提供された方法において、ＳＧＴは様々なプロテアーゼの混合物より選択的に精製される。このプロテアーゼのうちいくつか（特にキモトリプシン）は、公知の方法で分離することが難しい、類似した生理化学的特性を有する。しかしながら、溶離液中に約０．５Ｍと約１．２Ｍとの間の濃度のアルギニンを使用する本発明の方法を用いて、ＳＧＴはプロナーゼ混合物中の他のプロテアーゼから選択的に分離される。
【００３０】
溶離液は、溶離剤としてアルギニンを代表的に含有し、そして約ｐＨ４．０と約ｐＨ９．０との間（好ましくは、約ｐＨ５．０と約ｐＨ７．０との間）のｐＨを有し得る。使用され得る別のアミジン誘導体アナログとしては、アルギニンのアナログ（例えば、分子のカルボキシル末端に修飾を有するアルギニンのアナログ）（例えば、Ｋａｓａｉ，Ｋ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５９７，３−１８を参照のこと）；Ｃ末端アミノ酸としてアルギニンを含有するペプチド（例えば、ロイペプチン、ペプスタチン）（例えば、Ｋａｓａｉ、前出を参照のこと）；リジンまたはリジンのアナログおよびＣ末端アミノ酸としてリジンを含有するペプチド；スルファメトキサゾラムおよびその誘導体（例えば、Ｗｕ，Ｘ．およびＬｉｕ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １０，２２８−２３２を参照のこと）；ベンズアミジンおよびｍ位ならびに／またはｐ位に修飾を有するそのアナログ；ならびにグアニジンおよびその誘導体（例えば、Ｅｌｌｏｕａｌｉ，ら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５４８，２５−２６５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
溶離液は、無機塩をさらに含有し得る。無機塩は、ナトリウム、リン酸または硫酸由来の塩であり得る。一般的に、ナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ）が好ましい。無機塩は、約０．１Ｍと約１Ｍとの間の濃度であり得る。溶離剤において、約０．５Ｍと約１．０Ｍとの間の濃度が好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィーカラムで都合よく行われる。アフィニティー部分が結合され得る任意のマトリックスは、アフィニティーキャリアとして使用され得る。このようなマトリックスまたはキャリアは、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、多孔性粒子または多孔性ビーズ（例えば、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、あるいはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（Ｔｏｓｏｈａａｓ））またはセルロース、デキストラン、アクリルレートもしくはシリケートに基づく他のキャリアより選択され得る。
【００３３】
本発明の方法において、プロナーゼは好ましくは可溶化される。可溶化剤は、緩衝液であり得、ここで、緩衝溶液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、または硫酸緩衝液であり得る。必要に応じて、緩衝液は、塩（例えば、ナトリウム塩）を含有し得る。緩衝液は、好ましくは約６．０と約８．０との間のｐＨを有する。プロナーゼは、キャリアマトリックスと接触させられ、そしてＳＧＴは競合的溶離（代表的には、アルギニンを用いる）によって選択的に溶出される。
【００３４】
溶離剤としてアルギニンを利用する場合、本方法で得られた精製ＳＧＴは、約０．５Ｍ〜約１．２Ｍのアルギニンを含有する溶液中に存在する。本実施形態の長所は、溶液中の溶離剤（例えば、アルギニン）の安定化特性のため、安定剤が添加されなくてもよいことである。従って、精製ＳＧＴは、液体中のさらなる安定剤なしで保存され得る。本方法で得られたＳＧＴは、少なくとも約９５％の純度、好ましくは少なくとも約９８％の純度を有し、そして他のどの酵素（例えば、キモトリプシン）も本質的に含まない。
【００３５】
溶離剤が生理学的に受容可能ではない、いくつかの実施形態において、溶離剤は精製ＳＧＴから除去される。任意の多数の標準方法が、この目的に使用される。このような方法としては、透析法、または適切な分子量カットオフを有するメンブレンを使用し、溶離剤が通り抜けることを可能にするが、一方ＳＧＴは保持物中に遅延される限外濾過法が挙げられる。このようなメンブレンは、周知であり、再生セルロース、ＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホンなどから製造され得る。分子の相違（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親和性など）を利用する、様々なクロマトグラフィー技術もまた、都合よく使用される。他の方法としては、溶離剤またはＳＧＴのいずれかの沈殿が挙げられ、そしてＳＧＴと比べて、異なる溶離剤の溶解特性に依存する。一般的に、高親和性溶離剤が使用される場合、溶離剤が除去され得る前に、溶離剤がＳＧＴから最初に分離されねばならない。これは、周囲のパラメーター（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、誘電率など）を変えることにより、代表的に行われる。このような方法はまた、当該分野において周知である。
【００３６】
本発明はさらに、少なくとも約９５％の純度を有する精製ＳＧＴの調製物を提供する。しばしば、精製調製物は、少なくとも０．６Ｍのアルギニンの濃度のアルギニンを含有する。本発明のＳＧＴ調製物は、１ｍｇのタンパク質あたり少なくとも約２５×１０３Ｕの比活性を有する。好ましくは、この比活性は、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも４０×１０３Ｕである。
【００３７】
本発明の調製物は、約０．５Ｍ〜約１．２Ｍの間のアルギニンの溶液中、室温で少なくとも２週間および４℃で少なくとも４週間、代表的に安定である。より長期の保存のため、調製物は凍結されつづけ得るか、または凍結乾燥され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「安定な」は、アフィニティーキャリアからの溶出により直接得られた最初のＳＧＴ調製物の比活性の減少が、室温で２４時間につき、５％未満であることを意味する。
【００３９】
「ＳＧＴ精製調製物」は、ウエスタンブロットアッセイおよびＨＰＬＣにより測定された場合、少なくとも約９５％の純度を有する調製物を意味する。ＳＧＴの純度はまた、調製物の残存キモトリプシン活性により測定され得る。調製物中に存在し得る残存キモトリプシン活性は、キモトリプシン特異的な酵素試験により測定される。これらの分析は、例えば、実施例１に記載されるように実行され得る。この試験結果が、調製物中に検出可能なキモトリプシン活性がないことを示す場合、この調製物は、キモトリプシン活性がないと規定される。
【００４０】
「比活性」は、多数の方法により測定され得る。一つの例は、特定のトリプシン活性試験（例えば、特異的基質（例えば、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）またはＮ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（Ｓ２２２）についてのエステラーゼ活性）である。これらのアッセイは、例えば、実施例１および実施例２に記載されるように実行される。
【００４１】
「特異性」は、トリプシン特異的インヒビターによる精製ＳＧＴの特異的な阻害を意味する。トリプシンインヒビターは、植物源または動物源由来（例えば、ダイズ由来のトリプシンインヒビターまたはニワトリの卵白由来のトリプシンインヒビター）であり得る。
【００４２】
全ての酵素アッセイに対するコントロールとして、ブタ供給源またはウシ供給源由来の精製された市販のトリプシンが使用され得る。
【００４３】
生理学的に受容可能な溶離液（例えば、アルギニン）を使用する場合、高度に精製されたＳＧＴ調製物を得るために１回クロマトグラフィー工程のみが必要とされるため、本発明の方法は、効率的かつ単純である。調製物は、溶離剤中で安定であり、そして酵素活性の有意な減少なしに溶液中で保存され得る。この方法を用いて、良好な収率で、比活性が高く、かつ純度が高い精製ＳＧＴが得られる。
【００４４】
本発明は、アフィニティー部分（例えば、ベンズアミジン）に酵素を選択的に吸着させ、そしてアフィニティー部分のアナログ（例えば、アルギニン）を用いた競合的な溶出によって、インタクトなＳＧＴを溶出させることによりＳＧＴを精製する方法を提供する。非常に穏やかな方法である競合的な溶出を使用して、リガンド（例えば、ベンズアミジン）が、最終産物に入ることが回避される。さらに、大過剰の溶離剤（例えば、アルギニン）は、調製および保存の間の自己消化を回避することで、酵素の自己触媒活性を阻害し、そして安定した精製産物を維持する。別の長所は、アルギニンは大部分の細胞培養プロセスまたは精製プロセスと十分に適合性であるため、最終産物が生物工学プロセスにおけるその意図された目的に直接使用され得ることである。
【００４５】
本発明に従って作製される最終精製産物の生理学的特徴は、例えば、細胞培養技術、タンパク質精製プロセスまたはトリプシンが使用される任意の他のプロセスにおける最終精製産物の直接使用を可能にする。非常に類似した作用の様態および特異性のため、ＳＧＴは、実質的に全ての生物工学的適用において、哺乳動物トリプシンの代替物として使用され得る。精製され、高度に均一となった場合、この酵素は周知のトリプシンインヒビターによって完全に阻害され得る。
【００４６】
本発明の別の局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、生物プロセス（例えば、細胞培養、ウイルス活性化または精製）において使用される。例えば、精製されたＳＧＴは、マトリックスからの真核細胞の剥離に使用され、そして必要に応じてさらに、その細胞の継代および継代培養、または発酵槽中での接種に使用される。本発明のＳＧＴは、細胞の増殖および／または脊椎動物細胞の細胞培養バイオマスの生成に使用され得る。
【００４７】
本発明のＳＧＴはまた、細胞バイオマスの生成、または培養プレート、Ｒｏｕｘフラスコ、ローラーボトルもしくはマイクロキャリア培養での表面依存性真核細胞の継代に使用され得る。培養物は、層からの細胞の懸濁、組織からの細胞の単離および分離、または初代細胞培養物の調製のための単層培養物、マイクロキャリア培養物であり得る。脊椎動物細胞は、動物組織（例えば、器官）由来の任意の細胞、初代細胞由来の任意の細胞または連続細胞株由来の細胞であり得る。初代細胞は、サル腎臓、ハムスター腎臓、イヌ腎臓、卵巣または初代細胞培養物の生成に有用であると知られている他の器官であり得る。連続細胞株由来の細胞の例は、ＶＥＲＯ；ＣＶ−１、ＣＨＯ；ＢＨＫ；ＭＤＣＫ；ＭＲＣ−５、ＭＤＢＫ、ＷＩ−３８であり、形質転換細胞、トランスフェクト細胞および組換え細胞を含む。
【００４８】
細胞は、好ましくは無血清培地中で培養されそして増殖される。その培地は、最少培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２、およびＫｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０−９６８）に記載されるような当該分野で公知の他の最少培地）であり得る。最も好ましくは、細胞は、ＷＯ ９６／１５２１３、ＷＯ ００／０３００またはＷＯ ０１／２３５２７に記載されるような無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖され得、そのためにこの最少培地には酵母抽出物またはダイズペプトンが補充され得る。
【００４９】
本発明の別の局面に従って、精製ＳＧＴは、ウイルスまたはウイルス抗原の生成に使用される。この方法は、本発明の精製されたＳＧＴを使用して細胞を継代および継代培養することにより、細胞培養物を提供する工程、細胞を増殖させてバイオマスにする工程および細胞にウイルスを感染する工程を包含する。細胞は、好ましくは無血清培地または無血清かつ無タンパク質の培地中で培養されそして増殖される。
【００５０】
本発明により提供される方法は、細胞のバイオマスおよびウイルス生成プロセスを組み合わせており、ここで全ての工程は培地中のあらゆる哺乳動物由来源（例えば、血清またはタンパク質）を回避する条件下で実行される。さらに、継代および継代培養の間、細胞培養物中のＳＧＴの高い比活性に起因して、タンパク質負荷は減らされ得る。従って本方法は、混入タンパク質の全体的タンパク質負荷を有意に減少させる。
【００５１】
本発明に使用され得るウイルスの例は、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイルス科、アレナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ライノウイルス科およびレオウイルス科ならびにアデノウイルス科というウイルス科の群のウイルスであり、好ましくは、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、ロタ（Ｒｏｔａ）ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉｃａｌ）ウイルス、ワクシニアウイルスおよび組換えワクシニアウイルス、単純疱疹ウイルス、ＴＢＥＶ、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスならびにこれらのキメラの群より選択されるウイルスである。所望のウイルスの増殖のため、適切な宿主細胞およびこの宿主に感受性のウイルスの選択の方法は、周知である。細胞は、上記のような細胞から選択され得る。
【００５２】
特定の実施形態に従って、精製ＳＧＴは、ウイルスまたはウイルス抗原の生成に使用される。ここでウイルスはプロテアーゼにより活性化される。このようなウイルスは、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ロタウイルス科の群から選択されたウイルスである。この方法は、細胞培養物を提供する工程であって、ここで細胞は本発明の精製されたＳＧＴを使用して継代および継代培養される、工程、この細胞にパラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ロタウイルス科の群より選択されたウイルスを感染させる工程、ウイルスを精製ＳＧＴと接触させてウイルスを活性化する工程、ウイルスを増殖させる工程および生成させたウイルスを回収する工程を包含する。
【００５３】
細胞の継代および継代培養のため、本発明の精製ＳＧＴは、細胞培養型、培養体積または培地体積、および培養プロセスで使用される精製ＳＧＴの比活性に依存して、約４μｇと約１０００μｇとの間の量で、添加される。静置培養のために添加されるタンパク質の量は、約４μｇ／１５０ｃｍ２〜約５０μｇ／１５０ｃｍ２の範囲であり得、ローラーボトルのために添加されるタンパク質の量は、約５０μｇ／８５０ｃｍ２〜約１００μｇ／８５０ｃｍ２の範囲であり得、そしてマイクロキャリア培養のために添加されるタンパク質の量は、１ｍｇのタンパク質あたり約２６×１０３Ｕの比活性を有するＳＧＴ調製物を含む培地１リットルあたり約１０００μｇ〜約２０００μｇの範囲であり得る。最適な継代および継代培養の条件に必要とされるプロナーゼ／タンパク質の最少量を決定することは、当業者の知識内である。本発明の精製ＳＧＴの使用の長所は、（ｉ）動物源由来のタンパク質を回避すること、および（ｉｉ）従来の細胞培養物（ここで、動物源由来のトリプシンが使用される）と比較して少なくとも５倍〜少なくとも２５倍の間のＳＧＴの高い比活性に起因して、タンパク質負荷を減少させること、である。
【００５４】
本発明の一つの局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖される細胞バイオマスの生成に使用され、ここでこのバイオマスは、精製ＳＧＴを使用て継代および継代培養され、そして総プロテアーゼタンパク質負荷は、哺乳動物由来のトリプシンを使用して同一の条件下で培養された細胞培養物と比較して、少なくとも７５％まで減少される。
【００５５】
ウイルスの活性化に関し、本発明の精製ＳＧＴは、使用される精製ＳＧＴの比活性に依存して、培養容量（ｃｍ２またはｃｍ３）について約１０μｇ〜５００μｇの総タンパク質量で使用され得る。記載された実施例に従うこと、および少なくとも２×１０４Ｕ／ｍｇの特定の比活性を有する精製ＳＧＴの必要とされる総タンパク質量を、最適なウイルス比活性およびさらなるウイルス増殖に適応させることは、当業者の知識内である。
【００５６】
精製ＳＧＴ調製物を継代および継代培養および必要に応じてウイルス活性化に使用することにより、バイオマス生成およびウイルス増殖プロセスに由来するタンパク質負荷は、従来法で得られた細胞培養物と比較して、少なくとも７５％までに、好ましくは少なくとも９０％減らされ得る。
【００５７】
記載した方法により、ウイルスまたはウイルス抗原調製物が得られる。ここで、細胞および細胞培養培地に由来する混入タンパク質の総タンパク質負荷は、類似の条件下で、哺乳動物由来のトリプシンを使用して培養された従来の細胞培養物を使用して得られた調製物と比較して、少なくとも７５％まで減らされる。
【００５８】
本発明の精製ＳＧＴを使用して細胞を培養し、そして必要に応じてウイルスを活性化する上記のような方法は、生成したウイルスを精製する工程をさらに包含し得る。低負荷の混入タンパク質（産物／ウイルス特異的ではないタンパク質）に起因して、残存夾雑タンパク質は、さらなる精製により除去され得る。得られる精製ウイルス調製物は、免疫原性組成物（例えば、予防ワクチンまたは治療ワクチン）中でさらに処方され得る。
【００５９】
本発明の別の局面に従って、精製ＳＧＴは、精製プロセスにおいて使用される。広い範囲の精製法に関して、特異的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を使用して、混入タンパク質を分解し、次いでこのプロテアーゼは、さらなる精製工程（例えば、濾過、クロマトグラフィーまたは遠心分離）を使用して除去される。本発明の精製ＳＧＴは、精製ウイルス（例えば、ＨＡＶ）の調製の精製法において効率的に使用され得る。最適条件に必要とされる最小限の本発明の精製ＳＧＴを決定することは、当業者の知識内である。
【００６０】
本発明の精製ＳＧＴはまた、組換え細胞由来の組換え産物の生成に使用され得る。この使用は、外来性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の細胞培養物を提供する工程であって、ここでこの細胞は、本発明の精製ＳＧＴを用いて継代および継代培養される工程、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質が生成される条件下で細胞を培養する工程、および生成したこの組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質を回収する工程を包含する。細胞は、好ましくは無血清培地または無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖される。細胞は、組換えタンパク質を発現可能な、組換え細胞（例えば、組換えＣＨＯ細胞）であり得る。
【００６１】
記載した方法を用いて、組換え産物が得られる。ここで、細胞および細胞培養培地に由来する混入タンパク質の総タンパク質負荷は、同様の条件下で培養された、従来の細胞培養物を用いて、得られる調製物と比較して、少なくとも７５％減らされる。
【００６２】
別の局面に従って、本発明の精製ＳＧＴは、液体中で、または（例えば、米国特許第６，０１０，８４４号に記載されるような）不溶性キャリア上に固定化されてのいずれかにおいて、プロタンパク質の制御プロセシングのために使用されて、それらの成熟形態にされる。
【００６３】
本発明の精製ＳＧＴは、ＳＧＴのタンパク質分解性により消化され得る、タンパク質により夾雑された生物工学装置（例えば、濾過器、発酵槽など）の洗浄に使用され得る。
【００６４】
ここまで一般的に本発明を説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照して理解され得る。これらの実施例は、説明の目的のみで本明細書中に提供され、限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（プロナーゼからのＳｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンの精製）
（Ａ．イオン交換クロマトグラフィー）
３０ｇのプロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を緩衝液Ａ（０．０２ピリジン、ｐＨ ５．０）中に溶解し、終濃度４０ｍｇ／ｍｌのプロナーゼにする。２５ｍｌの溶液を、緩衝液Ａで平衡化した、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での陽イオン交換クロマトグラフィーに供する。室温で、カラム容量の５倍量の緩衝液Ａ（０．０２Ｍピリジン）および緩衝液Ｂ（０．７５Ｍピリジン、ｐＨ
５．０）を用いた直線勾配を使用し、溶出を行う。
【００６６】
回収した画分を、１：１０の割合（例えば、１００μｇのタンパク質あたり１ｍｇのダイズインヒビター）で画分のサンプルとダイズインヒビターとを有する混合し、その後にＳ２２２を用いて、クロマトグラフィー基質をアッセイすることにより、阻害特性に関して試験する。その結果を、１分間あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）として表す。ダイズインヒビターに対して最も高い阻害活性を有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析し、そしてクーマシーで染色する（図１、レーン１）。
【００６７】
トリプシン活性を、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＣａＣｌ２中、２５℃）を用いた色素形成アッセイにより測定し、そして１分間あたりのΔ吸光度単位を測定する。コントロール基準として、１３×１０３Ｕ／ｍｇの比活性を有するブタのトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を使用する。比活性は、１ｍｇのタンパク質あたりのトリプシン酵素活性の単位として定義される。その結果を、表１に示す。
【００６８】
キモトリプシン活性を、３−カルボキシメトキシプロピオニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−チロシン−ｐ−ノトロアニリン（ｎｏｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）塩酸塩（Ｓ−２５８６、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いた色素形成アッセイにより測定する。その結果を、１分間あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）と表す。
【００６９】
【表１】
表１は、ダイズインヒビターを用いた阻害試験で測定された場合、トリプシン様活性を有するタンパク質を含む画分が、プロナーゼより約１０倍高い比活性、および約７０％の回収率にて、イオン交換クロマトグラフィーで精製され得ることを示す。しかしながら、このタンパク質は不安定であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドではなく様々なバンドを示す。これは、このタンパク質の断片化および自己切断を示す（図１、レーン１）。
【００７０】
（Ｂ．固定化されたベンズアミジンでのアフィニティークロマトグラフィー）
緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）で平衡化したＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ速流（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに４０ｍｌのプロナーゼ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ、緩衝液Ａ）を負荷する。溶出を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ベンズアミジン塩酸塩ｐＨ７．０）、緩衝液Ｃ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．６Ｍアルギニン、ｐＨ５．５）または緩衝液Ｄ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍアルギニン、ｐＨ５．５）を用いて行う。
【００７１】
回収した画分を、阻害特性に関してはダイズインヒビターを用いて、ならびにトリプシン活性およびキモトリプシン活性については、実施例１Ａに記載されるように試験する。比活性を、タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性の単位として測定する。
【００７２】
【表２】
表２にまとめた結果は、ベンズアミジンを用いた競合溶出により、プロナーゼの精製トリプシン様活性の６０％を、高い比活性で回収したことを示す。しかしながら、精製トリプシン様プロテアーゼを含む画分は、好ましくはさらに精製され、そして細胞培養増殖またはヒトにおける適用のための生物製剤の生成を含むプロセスでの使用の前に、ベンズアミジンが除去される。
【００７３】
【表３】
表３の結果から見られ得るように、０．６Ｍのアルギニンを含有する緩衝液を使用する場合、プロナーゼの最初のトリプシン様活性の約６３％が回収されるのに対し、１Ｍのアルギニンを含有する緩衝液を用いると、プロナーゼの最初のトリプシン様活性の約７１％が回収される。アルギニンを用いてベンズアミジンアフィニティーキャリアから溶出された精製ＳＧＴもまた、イオン交換クロマトグラフィーまたはベンズアミジンキャリアからのベンズアミジンを用いた溶出により得られたＳＧＴと比較して、より高い比活性を有する。さらに、上昇したモル濃度のアルギニンを含有する緩衝液を使用する場合、より高い純度かつより高い比活性の産物が得られる。
【００７４】
未精製のＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロナーゼサンプル、アフィニティークロマトグラフィーカラムの素通り画分サンプルおよび１Ｍアルギニンで溶出した精製ＳＧＴサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（図２）。
【００７５】
ダイズインヒビターに対し、最も高い阻害活性を有する画分のサンプルを、モルモット由来の抗ＳＧＴ血清を用いたウエスタンブロットによりさらに解析する（図３）。ＳＧＴの純度を、分析逆相ＨＰＬＣを用いて測定する。ここで、精製ＳＧＴを逆相カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−５Ｃ１８−１５０×２ｍｍ）に負荷し、そして直線勾配のアセトニトリルで溶出する。逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムは、図４に示される。純度は、総ピーク面積に対する主要ピークの関係として示される。逆相ＨＰＬＣの精製ＳＧＴは、９５％より高い純度を示した。クロマトグラムは、ＳＧＴに相当する鋭いピークを示す。オンラインＨＰＬＣ−エレクトロスコーピー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）イオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用し、精製ＳＧＴの分子量を測定する。従って、クロマトグラムの主要ピークは、２３０９６．５Ｄの分子量を有し、この分子量は、理論上の質量である２３０９９Ｄと非常に一致する。このデータは、さらに正確なＮ末端（ＮＨ２−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ｍ−Ｖ−）の評価によりさらに確認される。
【００７６】
ベンズアミジンでの１工程アフィニティークロマトグラフィーにより精製され、そしてアルギニンで溶出された、精製トリプシン様プロテアーゼは、アルギニン溶液中で安定である。精製産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示し、そして図１（レーン２）に見られ得るような低分子量ポリペプチドとなる顕著な断片化を有しはしないが、イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＳＧＴは、断片化されて、図１（レーン１）に見られるような低分子量ポリペプチドとなる。
【００７７】
アルギニンを用いた競合溶出によるアフィニティークロマトグラフィー精製法は、少なくとも９５％の純度の精製ＳＧＴを生じ、この精製ＳＧＴは、ＳＤＳ／ウエスタンブロットおよびＨＰＬＣにより示されるように、インタクトでかつ安定である。加えて、この精製ＳＧＴは、他のプロテアーゼ活性、特定のキモトリプシン、エンドトキシンおよびプロセスに関連した不純物（例えば、ベンズアミジン）を実質的に含まない。ＳＧＴ精製調製物中の高濃度アルギニンに起因して、ＳＧＴは、室温で少なくとも２週間安定であり、そして自己触媒活性も、産物の不安定性も、ＳＧＴ分解産物の増加も、比活性の損失もないことを示す。０．５Ｍ〜１．２Ｍ（ｐＨ２とｐＨ１０との間のｐＨ）のアルギニン溶液中で安定化されたＳＧＴ調製物は、大部分の生物プロセスにおいて生理学的に受容可能であり、そしてさらなるプロセス（例えば、タンパク質、ウイルスの活性化）のため、または以下に記載するような精製法においてすぐに使用される。
【００７８】
（実施例２）
（哺乳動物細胞の細胞培養に使用されるブタトリプシンおよび精製ＳＧＴの酵素活性の測）
各酵素のタンパク質含有量およびエステラーゼ活性を、ブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）、プロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、および実施例１Ｂに従い、ベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでのアフィニティークロマトグラフィーおよび０．６Ｍのアルギニンを用いた溶出によって得られた精製ＳＧＴの基質として、ＢＡＥＥ（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル）を使用して測定する。この実験およびさらなる実験の結果を表４にまとめる。
【００７９】
【表４】
（実施例３）
（無血清かつ無タンパク質のＶＥＲＯ細胞の継代および継代培養のための総タンパク質負荷の測定）
継代数１２４で、呼称ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄより得た、ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル、Ｃｅｒｃｏｐｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ、腎臓）を、無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。細胞を、Ｋｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０−９６８，ＷＯ ９６／１５２３１、または米国特許第６，１００，０６１号）に記載されるように、無血清かつ無タンパク質の培地中で増殖するように適応させる。無血清培地中での増殖のために、無機塩類、アミノ酸、重炭酸ナトリウム（２ｇ／ｌ）および酵母抽出物またはダイズ抽出物（０．１〜１０ ｇ／ｌ）を補充された基本的なＤＭＥＭ ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地を使用する。作業細胞バンクを、動物由来の培地組成物を全く使用せずに調製する。
【００８０】
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物と１：１の比で混合したＤＭＥＭ培地中で培養したＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）の一つのアンプルを、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した無血清培地中に再懸濁する。
【００８１】
１μｇと１０，０００μｇとの間の異なるタンパク質濃度のブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）、プロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）および実施例２で測定されるような比活性を有する精製ＳＧＴを、Ｔフラスコの静置培養物、ローラーボトル中の細胞またはマイクロキャリアに結合した細胞に添加する。完全な細胞剥離そしてその後接着（継代培養）培養に必要であるトリプシン、プロナーゼおよび精製ＳＧＴの総タンパク質の量を、表５に示す。
【００８２】
表５は、精製ＳＧＴを用いた場合、細胞剥離および細胞継代のためのプロテアーゼの総タンパク質負荷は、トリプシンを用いた場合に必要とされる量と比較して、静置培養において４％に減少し、ローラーボトルにおいて１７％に減少し、そしてマイクロキャリア培養系においては２０％に減少した。
【００８３】
【表５】
（実施例４）
（細胞増殖に関する哺乳動物由来トリプシン、プロナーゼおよび精製ＳＧＴの比較）
小規模ベースで、静置培養（Ｔフラスコ）およびマイクロキャリア培養（Ｃｙｔｏｄｅｘ３（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において増殖させたＶｅｒｏ細胞の細胞剥離特性および増殖特性を比較する。ＶＥＲＯ細胞を、上記のように無血清かつ無タンパク質の培地中で培養する。
【００８４】
ＶＥＲＯ細胞を、Ｔフラスコ中またはマイクロキャリア上のいずれかにおいて、増殖させる（３７℃、５〜１０％のＣＯ２濃度）。継代培養を、実施例４において測定したように、ブタトリプシン（純粋グレード、ＩＸ型、結晶化、Ｓｉｇｍａ）およびプロナーゼ（純粋グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を、Ｔフラスコ中では１００μｇの最終量にて用いて、そしてマイクロキャリア培養中では５０００μｇにて用いて行う。２．６×１０４Ｕ／ｍｇの比活性を有する精製ＳＧＴを、Ｔフラスコ培養物には４μｇの最終量で、そしてマイクロキャリア培養物中には１０００μｇで添加する。細胞接着および細胞増殖を、目視検査および非接着細胞のカウントにより測定し、そして増殖活性として表す。表６は、Ｔフラスコ中またはマイクロキャリア上のいずれかで増殖させたＶＥＲＯ細胞の総量の％において表された増殖活性を示す。
【００８５】
【表６】
表６に示されるように、粗製プロナーゼは無血清培地中で増殖させたＶｅｒｏ細胞の十分な反復移入を可能にしないのに対し、精製ＳＧＴは、ブタトリプシンと同様に有効であるが、有意に減少した最終タンパク質負荷を有する。
【００８６】
（実施例５）
（精製ＳＧＴを用いたＶｅｒｏ細胞におけるウイルス抗原生成）
（５．１ ローラーボトル中のインフルエンザウイルスおよびウイルス生成のインビボ活性化）
２種類のＶｅｒｏ培養物を、ローラーボトル中で増殖させ、１単位あたり約２×１０８の最終細胞密度のコンフルーエンシーにする。培養物に０．０１のｍ．ｏ．ｉ．にてインフルエンザウイルスＮａｎｃｈａｎｇ Ａ／Ｈ３Ｎ２株を感染させる。ブタトリプシン（総タンパク質量：５００μｇ）または精製ＳＧＴ（総タンパク質量：５０μｇ）を、インフルエンザウイルスのインビボ活性化のために添加する。この添加は、ウイルス増殖をさらに可能にする。４８時間後の培養物における赤血球凝集活性を測定する。
【００８７】
【表７】
表７に示されたデータは、効率的なインフルエンザウイルスのインビボ活性化およびウイルス増殖に関しては、哺乳動物由来トリプシンと比べて、精製ＳＧＴの総タンパク質量の約１／１０が必要とされることを示す。従って、精製ＳＧＴの使用は、インビボ活性化工程の間の総タンパク質負荷において９０％の減少を可能にし、そして哺乳動物由来のトリプシンと比較した場合、Ｖｅｒｏ細胞において同様のインフルエンザウイルス増殖を産生した。
【００８８】
（５．２ 無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞におけるインフルエンザウイルス抗原の大規模生成およびウイルスの活性化のための精製ＳＧＴの使用）
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物と１：１の比で混合したＤＭＥＭ培地中で培養したＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）の一つのアンプルを、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した無血清培地中に再懸濁する。規定の継代数を有するＶｅｒｏ細胞を液体窒素より解凍し、そしてｒｏｕｘおよびローラーボトル中で継代し、１．５リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。細胞を３７℃で６〜８日間増殖させる。培養条件である酸素飽和度の２０％±１０％およびｐＨの７．１±ｐＨ０．２ならびに攪拌速度の３０〜６０ｒｐｍを制御する。最終細胞密度である１．５（１．０〜２．０）×１０６細胞／ｍｌに到達後、細胞を精製ＳＧＴ（１ｍｇ／ｌ）により剥離し、そして２．５ｇ／ｌのマイクロキャリア濃度（Ｃｙｔｏｄｅｘ ＩＩＩ（登録商標），Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を有する１０リットルのバイオリアクターに移す。細胞数を細胞のトリプシン処理により測定し、そしてＣＡＳＹ（登録商標）細胞カウンターでカウントする。細胞をコンフルエントな培養条件下で培養し、１．０〜１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を有するバイオマスに達する。
【００８９】
バイオマスにインフルエンザウイルスＮａｎｃｈａｎｇ株またはＴｅｘａｓ−３６のいずれかを感染させる。ウイルス増殖のプロセス中、さらなるインフルエンザウイルスの溶菌性感染サイクルの間、１５０μｇ／リットルの濃度の精製ＳＧＴの添加によりウイルスを活性化する。表８は、７２時間後、ＨＡＵ／ｍｌにより測定された場合の、インフルエンザウイルス生成を要約する。
【００９０】
【表８】
表８に示されるような結果に従い、継代および継代培養されかつ精製ＳＧＴを用いてスケールアップされたＶｅｒｏ細胞は、大規模バイオリアクター中で効率的に増殖し、そしてインフルエンザウイルスを生成した。
【００９１】
（実施例６）
（無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞において増殖により得られたインフルエンザウイルス抗原の純度およびウイルスの活性化のためのＳＧＴまたはトリプシンの使用）
Ｖｅｒｏ細胞の２つの並行細胞培養物を増殖し、実施例５．２に記載したようなバイオマスにする。これにより、ひとつをトリプシンを用いて継代および継代培養し、そしてひとつを精製ＳＧＴを用いて、ｒｏｕｘおよびローラーボトル中で継代および継代培養し、１．５リットルのバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成する。最終細胞密度である１．５（１．０〜２．０）×１０６細胞／ｍｌに到達後、細胞を精製ＳＧＴまたはトリプシンにより剥離し、そして２．５ｇ／ｌのマイクロキャリア濃度を有する１０リットルのバイオリアクターに移す。１．０〜１．５×１０６／ｍｌの細胞密度に到達することによってコンフルエントな培養条件に到達した後、バイオマスにインフルエンザウイルスＴｅｘａｓ−３６株を感染させる（ｍ．ｏ．ｉ． ０．０１）。ウイルスの活性化に関して、精製ＳＧＴまたはトリプシンを各細胞培養物に添加する。ウイルス増殖プロセスの終わりに、ウイルスを含む、澄んだ上澄み収集物をスクロース勾配による超遠心分離法で精製する。スクロース勾配精製抗原の純度は、タンパク質に対する抗原の比により測定される。赤血球凝集素の濃度を、Ｗｏｏｄら（１９７７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５：２３７−２４７）により記載されるような、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）で測定し、そしてその結果をＡ／Ｔｅｘａｓ−３６株に対して、７２時間後に比較する。その結果を表９にまとめる。
【００９２】
【表９】
精製ＳＧＴを用いて継代され、そしてスケールアップされたＶｅｒｏ細胞より得られたインフルエンザウイルス調製物は、より低いタンパク質混入を有するウイルス抗原の生成を可能にした。これらの結果は、単純な最初の精製工程後、トリプシンの使用と比較して、より高い純度のウイルス調製物が得られることを示す。さらに、４５％の容積測定のバイオリアクター生産性（リアクター容量あたりの総ＳＲＤとして表される）における増加が得られた。
【００９３】
（実施例７）
（Ａ型肝炎ウイルスの生成）
（７．１ 無血清かつ無タンパク質の培地で増殖させた細胞上のＨＡＶ抗原の生成）
細菌プラスミドｐＨＡＶ／７にクローン化された弱毒化株ＨＭ１７５／７のゲノムの完全長ｃＤＮＡ（Ｃｏｈｅｎら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０３５−３０３９）を使用し、インビトロ転写により完全長ゲノムＲＮＡを調製する。無血清かつ無タンパク質の、３４℃のＶＥＲＯ細胞に、インビトロで転写したＨＡＶ ＲＮＡをトランスフェクトして、外来因子を含まないＨＡＶ ＨＭ１７５／７のウイルスストックを生成する。ＶＥＲＯ細胞バイオマスを実施例５．２に従って調製する。
【００９４】
ＨＡＶ ＨＭ１７５／７ウイルスの大規模生成のため、１×１０１１個の細胞のバイオマスでのＶＥＲＯ細胞培養物を、マイクロキャリア上に播種し、そして３７℃、無血清培地条件下、１００ｌの発酵槽中で増殖させる。温度を３４℃に下げ、そして次の醗酵サイクルの間、細胞数を８〜１０倍増加させる。細胞に０．０１〜０．１のｍ．ｏ．ｉ．で、ＨＡＶを、最後の醗酵槽中で感染させる。３４℃で、３５０日まで、感染した細胞の増殖を、細胞培養培地の持続性潅流を用いて行い得る。ウイルス抗原が培地中に検出される場合、ウイルスを含む上清を収集し、４℃で保存する。細胞培養上清の収集を、感染後３５〜４５日目に始める。
【００９５】
（７．２ ＨＡＶ収集物の精製および精製ＨＡＶの特徴付け）
実施例７．１の細胞培養上清のＨＡＶ収集物を、Ｐｒｏｓｔａｋ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ ２００ Ｋでの限外濾過により１００倍濃縮し、続いて緩衝液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ ８．０、０．０１％ Ｔｗｅｅｎに交換して、ダイアフィルトレーション工程（Ｐｒｏｓｔａｋ ２００ Ｋ，Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）を行う。調製物中に存在し得る、残留した宿主細胞の核酸を、１０００Ｕ／ｌの濃度（１ｍＭ ＭｇＣｌ２中に溶解）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）として市販（Ｂｅｎｚｏｎ ＰｈａｒｍａＡ／Ｓ））とともに、３時間室温でダイアフィルトレーション残留物（Ｄｉａｒｅｔｅｎａｔｅ）をインキュベーションすることにより除去する。続いて、０．５〜５Ｕ／ｍｌの濃度での精製Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）を添加し、残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を室温で２４時間さらにインキュベートする。宿主細胞夾雑物（すなわち、核酸および／またはタンパク質）を、緩衝液として２０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いる１００Ｋメンブランでのダイアフィルトレーションにより除去する。
【００９６】
少なくとも１０００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌのＨＡＶ抗原を含むサンプルを各濾過工程の間に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして銀染色をして総タンパク質を可視化するかまたはウエスタンブロット分析により分析してＨＡＶ特異的抗原を定量する。ＨＡＶ特異的抗原を、ＨＡＶカプシドタンパク質に特異的な抗血清を用いてウエスタンブロット分析により同定する。ＨＡＶ前駆体タンパク質が精製プロセスの間に除去されることが示され得る。ＨＡＶ特異的ポリペプチドは、細胞培養上清の出発物質中で検出され、そのポリペプチドは精製ＳＧＴの処理後のダイアフィルトレーション残留物中に存在しないが、ＨＡＶ特異的カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、プロテアーゼ処理による影響を受けない。このポリペプチドは、銀染色およびウエスタンブロットによる異なる中間体の分析は、精製ＳＧＴを用いたプロテアーゼ処理精製手順の有効性を明らかに証明する。
【００９７】
ＶＥＲＯ細胞タンパク質に対して生じた抗血清を用いたウエスタンブロット分析は、出発物質および精製において、主に高い分子量ＶＥＲＯタンパク質の広範囲の中間体が検出可能であることを示した。しかし、最終残留物において、微量なＶＥＲＯ細胞タンパク質夾雑物のみが検出可能である。これは、ＨＡＶ生成プロセスおよび精製プロセスの間、高純度ＳＧＴでの処理が、ＶＥＲＯ細胞タンパク質混入物およびＨＡＶ前駆体ポリペプチドを効率的に分解することを示す。
【００９８】
（実施例８）
（固定化された精製ＳＧＴによる、トロンビンへのプロトロンビンの活性化、およびアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの回収）
精製ＳＧＴ（１ｇの湿ったゲルあたり１００ｍｇタンパク質）をアガロースゲル（ゲル１ｍｌあたり５０００ ＢＡＥＥ Ｕ ＳＧＴ）と結合させる。ガラスカラムに０．１ｍｌの固定化ＳＧＴ−アガロースを充填し、そして組換えプロトロンビンを米国特許第６，０１０，８４４号に記載される、同一の条件下で固定化ＳＧＴに供する。米国特許第６，０１０，８４４号に記載される方法に従い、トロンビンを単離および調製する。この方法は、本明細書中に参考として援用される。
【００９９】
上記の実施例は、本発明の説明のために提供され、その範囲を限定することはない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許請求の範囲により包含される。本明細書中に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２６８７９９（Ｐ２０１０−２６８７９９Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４６８９８（Ｐ２０１０−１４６８９８）
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【分割の表示】特願２００３−５５１２９６（Ｐ２００３−５５１２９６）の分割
【原出願日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．１０）
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【分割の表示】特願２００３−５５１２９６（Ｐ２００３−５５１２９６）の分割
【原出願日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．１０）
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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