プロモーターの乳管特異性評価方法
【課題】乳管を有する植物を使用し、ゴムノキ由来のプロモーターについて、その乳管特異性を評価する方法を提供する。
【解決手段】プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法。
【解決手段】プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴムノキの乳管特異的プロモーターの特定に好適な、プロモーターの乳管特異性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、特定の植物の乳管（ｌａｔｉｃｉｆｅｒ）と呼ばれる器官で生産された乳液から得られ、例えば、天然ゴムの主要生産樹種として、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が知られている。そして、その資源としての重要性から、天然ゴムは一層の生産性向上や高機能化が望まれている。そこで、乳液の生産性増進や高機能化を目的として、遺伝子組み換え技術の開発が検討されており、乳管で特異的に遺伝子発現を促す（乳管特異的）プロモーターの探索が行われている。乳管特異性が求められるのは、乳管以外の部位で遺伝子発現が促されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷をかけ、悪影響を及ぼす可能性があるからである。
【０００３】
しかし、ゴムノキは、再分化・形質転換の効率が低く、上記目的の達成に適さないことが知られている。そこで、ゴムノキ以外で、ゴムノキと同様に乳管を有する植物に対して、ゴムノキ由来のプロモーターを遺伝子組み換え技術で導入し、その前記植物での乳管特異性の有無を確認できれば、ゴムノキの乳管特異的プロモーターであるか否かを評価できると考えられ、非常に有用である。
【０００４】
上記のように、ゴムノキ由来のプロモーターを、乳管を有する植物に導入し、遺伝子発現部位を特定する技術としては、これまでにペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）を利用した技術が開示されている（非特許文献１参照）。ペリプロカは、ゴムノキと同様に乳管を有し、天然ゴムの原料となる乳液を生産する、ガガイモ科の半木本植物である。非特許文献１では、具体的には、パラゴムノキのＲＥＦプロモーターをクローニングし、ＧＵＳ遺伝子をマーカー遺伝子としたベクターを作製して、これをペリプロカへ導入し、ＧＵＳ活性を確認している
【非特許文献１】長井ら、第１１７回日本森林学会大会予稿集（２００７）ｐ５２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献１に記載の方法では、ＧＵＳ活性を染色により確認しており、ペリプロカの髄と師部でＧＵＳ活性の発現を確認できるが、染色が不鮮明で染色領域が髄と師部以外の広い領域に広がっており、ＧＵＳ遺伝子発現部位の精密な特定が困難であり、プロモーターの乳管特異性評価も困難であるという問題点があった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、乳管を有する植物を使用し、ゴムノキ由来のプロモーターについて、その乳管特異性を評価する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
本発明は、プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法を提供する。
本発明においては、主たる茎の長さが５ｃｍ以上である前記シュートにおける蛍光タンパク質の発現部位を確認することが好ましい。
本発明においては、前記シュートの節間の断面において、前記蛍光タンパク質の発現部位を確認することが好ましい。
本発明においては、前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質であることが好ましい。
本発明においては、前記形質転換体の作製をアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、乳管を有する植物を使用し、ゴムノキ由来のプロモーターについて、その乳管特異性を評価できる。再分化・形質転換の効率が低いゴムノキに対して、遺伝子組み換え技術を適用する必要がないので、乳管特異的プロモーターを効率的且つ高精度に特定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のプロモーターの乳管特異性評価方法は、プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とする。
ゴムノキは、再分化・形質転換の効率が低く、遺伝子組み換え技術を適用した、乳管特異的プロモーターの特定には適さない。本発明は、ゴムノキと同様に乳管を有し、同様の成分の乳液を算出し、再分化・形質転換の効率が高い植物として、ペリプロカを使用する。ペリプロカでプロモーターが乳管特異的であることを確認できれば、同様の構造を有するゴムノキでも乳管特異的であると判断できる。
このように本発明は、ペリプロカを使用することで、ゴムノキにおいてプロモーターが乳管特異的であるか否かを効率的且つ高精度に評価するものである。
【００１０】
本発明において、評価の対象となるプロモーターは、ゴムノキにおいて機能し得るプロモーターであれば特に限定されるものではない。なお、ゴムノキとしては、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、セアラゴムノキ、インドゴムノキ、パナマゴムノキ、グアユールゴムノキ、ゴムタンポポ、ラゴスゴムノキ、グッタペルガノキ、パラタゴムノキ、シス・チクル等が例示できる。
【００１１】
ペリプロカとは、アフリカ、欧州、北米、アジアなどに自生するガガイモ科ペリプロカ属に属する蔓性の低木であり、植物体を傷つけることで乳液を出すものである。具体的には、ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ グラエカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｇｒａｅｃａ）、ペリプロカ ラエヴィガタ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｌａｅｖｉｇａｔａ）等が例示できる。
【００１２】
ペリプロカの形質転換体を作製するためのベクターは、蛍光タンパク質のプロモーターとして機能するように、該蛍光タンパク質をコードする遺伝子の上流に、評価対象たるプロモーターを組み込んだベクターである。本発明においては、当該ベクターを導入したアグロバクテリウム属菌をカルス等に感染させるのが好ましい。
本発明において用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００１３】
評価対象たるプロモーター等を含むベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、評価対象たるプロモーター等を組み込んだ遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに、発現させる遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、プロモーター領域に評価対象とするプロモーターを組み込んだ標的遺伝子バイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。
【００１４】
このようにして作製したベクターを導入したアグロバクテリウム属菌を、常法により培養し増殖させることにより、カルス等に感染させるために必要な量を調製することができる。
【００１５】
ペリプロカの形質転換体は、例えば、前記ベクターを含む感染液に、ペリプロカの根、茎、葉又は花等の組織、あるいはカルス等の細胞を接触させた後、組織培養し、さらに抗生物質を含有する選択培地で培養することで作製できる。
例えば、所望のベクターをアグロバクテリウム属菌に導入して、これをペリプロカの組織又は細胞に接種するアグロバクテリウム法を適用することが好ましい。
【００１６】
組織や細胞は、殺菌又は滅菌してから組織培養に供する。殺菌又は滅菌は、公知の殺菌剤・滅菌剤を使用して行えば良く、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を使用するのが好ましい。
【００１７】
組織培養は、遮光条件下、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、好ましくは２〜４日程度、同じ組成の培地上で行えば良い。
選択培地での培養は、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２０日間で行う。培養温度は、上記組織培養の場合と同様で良い。
【００１８】
作製した形質転換体は、再分化培地上で培養し、シュートになるまで生育させれば良い。
【００１９】
蛍光タンパク質は、公知のもので良く、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＤｓＲｅｄ等の、通常タンパク質発現ベクター等に組み込んで用いられるいずれのものでも良いが、ＧＦＰが特に好適である。
【００２０】
評価対象であるプロモーターが、乳管特異的なプロモーターである場合には、蛍光タンパク質は、乳管が形成される程度にまでペリプロカの形質転換体が生育しないと発現しない。そこで、乳管が形成されているシュートにまで生育させた後に、蛍光タンパク質の発現部位を調べる。
なお、発現部位のサイズが小さいと、蛍光シグナルも検出し難い場合がある。このため、蛍光タンパク質の発現部位をより明確に特定できるよう、主たる茎の長さが好ましくは５ｃｍ以上、より好ましくは１０ｃｍ以上であるシュートを、蛍光タンパク質の発現部位の確認に供すると良い。
【００２１】
蛍光タンパク質の発現部位は、シュートの乳管が存在する部位であればどこを調べても良いが、蛍光タンパク質の発現量が多く、蛍光シグナルの検出が容易である点から、シュートの節間で行うのが好ましく、輪切りにしてその断面において行うのがより好ましい。
【実施例】
【００２２】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
＜ペリプロカの形質転換体、シュートの作製＞
図１に示すような、ＲＥＦプロモーター（ＲＥＦ ｐｒｏ）の下流にＧＦＰ遺伝子（ｓＧＦＰ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮＯＳ ｔｅｒ）をつないだＧＦＰ発現カセットと、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（ＮＯＳ ｐｒｏ）の下流にカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ ＩＩ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだカナマイシン耐性遺伝子発現用カセットと、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ ｐｒｏ）の下流にハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだハイグロマイシン耐性遺伝子発現用カセットとを有する発現ベクター（ＰＢＩｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ））を構築し、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に、感染させ、発現ベクター導入アグロバクテリウムを作製した。なお、図１中、「Ｉ」は、イントロンを意味する。
次いで、前記発現ベクター導入アグロバクテリウムを含む感染液に、ペリプロカ セピウムの茎を２分間接触させた後、これを培地で遮光条件下、２５℃で３日間培養した。
次いで、カナマイシン耐性選択培地で、さらに２５℃で１６時間日長培養して、２２の形質転換体を作製した。
そして形質転換体から、公知の方法に従ってＤＮＡを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で、ＧＦＰ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下の通りである。そして、アガロースゲル電気泳動により、増幅産物を検出した。この結果、作製された全ての形質転換体において、ペリプロカの組織には、ＲＥＦプロモーターとＧＦＰ遺伝子とを結合させた遺伝子が導入され、形質転換されていることを確認した。
（ＰＣＲ条件）
９５℃／５分 → （９５℃／１分 → ６０℃／１分 → ７４℃／２分）×３０サイクル → ４℃
【００２３】
＜発現量の確認＞
上記形質転換体を、再分化培地で生育長が約１０ｃｍのシュートにまで生育させ、検体とした。
得られた検体（下記（１））を使用し、下記検体（２）及び（３）と共に、公知の方法に従って全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた。
（１）上記の形質転換された２２検体のペリプロカ（ＲＥＦ−ＧＦＰ−１〜２２）
（２）カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＦＰ遺伝子とを結合させた遺伝子が導入されて形質転換された１検体のペリプロカ（３５Ｓ−ＧＦＰ）
（３）コントロールとして、形質転換されていない１検体のペリプロカ（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）
そして、ＧＦＰ遺伝子の発現量を、内部対照として、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割って補正した補正発現量を算出した。その結果を図２に示す。なお、リアルタイムＰＣＲの条件は以下の通りである。
（装置）
７３００ ＦＡＳＴ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ
（解析ソフトウエア）
７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
（検出試薬）
ＳＹＢＥＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
（ＰＣＲ条件）
５０℃／２分 → ９５℃／１０分 → （９５℃／１５秒 → ６０℃／１分）×４０サイクル → ９５℃／１５秒 → ６０℃／１分 → ９５℃／１５秒 → ９５℃／１５秒 → ６０℃／１５秒
【００２４】
＜組織観察＞
補正発現量が多かった検体（ＲＥＦ−ＧＦＰ−５、１１、１２、１５）について、シュートの節間部を輪切りし、その断面を顕微鏡で観察した。同様に、３５Ｓ−ＧＦＰ、Ｗｉｌｄｔｙｐｅについても観察した。この時の断面の画像を図３に示す。（ａ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の透過光観察画像、（ｂ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の蛍光観察画像、（ｃ）は３５Ｓ−ＧＦＰの透過光観察画像、（ｄ）は３５Ｓ−ＧＦＰの蛍光観察画像、（ｅ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの透過光観察画像、（ｆ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの蛍光観察画像である。観察条件は以下の通りである。
（顕微鏡）
Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ６００
（フィルター）
ＥＸ４６０−５００
ＤＭ５０５
ＢＡ ５１０−５６０
（ライト）
Ｎｉｋｏｎ ＩＮＴＥＮＳＬＩＧＨＴ Ｃ−ＨＧＦＩ
【００２５】
その結果、Ｗｉｌｄｔｙｐｅでは、自家蛍光以外に蛍光シグナルは検出されず、ＧＦＰが発現していないことが確認された。また、３５Ｓ−ＧＦＰでは、断面の広範囲に渡って蛍光シグナルが検出され、組織全体でＧＦＰが発現していることが確認された。これに対し、ＲＥＦ−ＧＦＰ−５では、髄、形成層の周囲の一部で蛍光シグナルが鮮明に検出された。髄で蛍光シグナルが検出されたことは、乳管でＧＦＰが発現していることを示すと考えられる。また、ＲＥＦタンパク質は、脂質を生産する細胞に存在することが知られており、形成層の周囲の一部で蛍光シグナルが検出されたことは、発現されたＲＥＦタンパク質が、師部にある脂質を作る柔細胞に移動していることを示すと考えられる。
以上より、ＲＥＦプロモーターは乳管特異的であると考えられ、ペリプロカを使用する本発明の評価方法が、乳管特異的プロモーターの特定に有効であることが確認された。
【００２６】
［比較例１］
発現ベクターとして、ＰＢＩｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）に代わり、ＲＥＦプロモーターの下流にＧＵＳタンパク質をコードするＧＵＳ遺伝子を組み込んだ発現ベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）を使用したこと以外は、実施例１と同様に、ペリプロカの形質転換体を作製した。得られた検体について、実施例１と同様に茎を輪切りして、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）を添加して常法により染色し、断面の染色部位を顕微鏡で確認した。この時の断面の画像を図４に示す。その結果、ペリプロカの髄と師部でＧＵＳ活性の発現を確認できたが、染色が不鮮明で染色領域が髄と師部以外の広い領域に広がっており、ＧＵＳタンパク質の発現部位を特定できなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、天然ゴムの生産性増進や高機能化に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１におけるペリプロカの形質転換に使用した発現ベクターを示す図である。
【図２】実施例１におけるＧＦＰ遺伝子の補正発現量を示すグラフである。
【図３】実施例１における、顕微鏡による検体の茎の断面画像であり、（ａ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の透過光観察画像、（ｂ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の蛍光観察画像、（ｃ）は３５Ｓ−ＧＦＰの透過光観察画像、（ｄ）は３５Ｓ−ＧＦＰの蛍光観察画像、（ｅ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの透過光観察画像、（ｆ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの蛍光観察画像である。
【図４】比較例１における、顕微鏡による検体の茎の断面の染色画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴムノキの乳管特異的プロモーターの特定に好適な、プロモーターの乳管特異性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、特定の植物の乳管（ｌａｔｉｃｉｆｅｒ）と呼ばれる器官で生産された乳液から得られ、例えば、天然ゴムの主要生産樹種として、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が知られている。そして、その資源としての重要性から、天然ゴムは一層の生産性向上や高機能化が望まれている。そこで、乳液の生産性増進や高機能化を目的として、遺伝子組み換え技術の開発が検討されており、乳管で特異的に遺伝子発現を促す（乳管特異的）プロモーターの探索が行われている。乳管特異性が求められるのは、乳管以外の部位で遺伝子発現が促されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷をかけ、悪影響を及ぼす可能性があるからである。
【０００３】
しかし、ゴムノキは、再分化・形質転換の効率が低く、上記目的の達成に適さないことが知られている。そこで、ゴムノキ以外で、ゴムノキと同様に乳管を有する植物に対して、ゴムノキ由来のプロモーターを遺伝子組み換え技術で導入し、その前記植物での乳管特異性の有無を確認できれば、ゴムノキの乳管特異的プロモーターであるか否かを評価できると考えられ、非常に有用である。
【０００４】
上記のように、ゴムノキ由来のプロモーターを、乳管を有する植物に導入し、遺伝子発現部位を特定する技術としては、これまでにペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）を利用した技術が開示されている（非特許文献１参照）。ペリプロカは、ゴムノキと同様に乳管を有し、天然ゴムの原料となる乳液を生産する、ガガイモ科の半木本植物である。非特許文献１では、具体的には、パラゴムノキのＲＥＦプロモーターをクローニングし、ＧＵＳ遺伝子をマーカー遺伝子としたベクターを作製して、これをペリプロカへ導入し、ＧＵＳ活性を確認している
【非特許文献１】長井ら、第１１７回日本森林学会大会予稿集（２００７）ｐ５２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献１に記載の方法では、ＧＵＳ活性を染色により確認しており、ペリプロカの髄と師部でＧＵＳ活性の発現を確認できるが、染色が不鮮明で染色領域が髄と師部以外の広い領域に広がっており、ＧＵＳ遺伝子発現部位の精密な特定が困難であり、プロモーターの乳管特異性評価も困難であるという問題点があった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、乳管を有する植物を使用し、ゴムノキ由来のプロモーターについて、その乳管特異性を評価する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
本発明は、プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法を提供する。
本発明においては、主たる茎の長さが５ｃｍ以上である前記シュートにおける蛍光タンパク質の発現部位を確認することが好ましい。
本発明においては、前記シュートの節間の断面において、前記蛍光タンパク質の発現部位を確認することが好ましい。
本発明においては、前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質であることが好ましい。
本発明においては、前記形質転換体の作製をアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、乳管を有する植物を使用し、ゴムノキ由来のプロモーターについて、その乳管特異性を評価できる。再分化・形質転換の効率が低いゴムノキに対して、遺伝子組み換え技術を適用する必要がないので、乳管特異的プロモーターを効率的且つ高精度に特定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のプロモーターの乳管特異性評価方法は、プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を調べることを特徴とする。
ゴムノキは、再分化・形質転換の効率が低く、遺伝子組み換え技術を適用した、乳管特異的プロモーターの特定には適さない。本発明は、ゴムノキと同様に乳管を有し、同様の成分の乳液を算出し、再分化・形質転換の効率が高い植物として、ペリプロカを使用する。ペリプロカでプロモーターが乳管特異的であることを確認できれば、同様の構造を有するゴムノキでも乳管特異的であると判断できる。
このように本発明は、ペリプロカを使用することで、ゴムノキにおいてプロモーターが乳管特異的であるか否かを効率的且つ高精度に評価するものである。
【００１０】
本発明において、評価の対象となるプロモーターは、ゴムノキにおいて機能し得るプロモーターであれば特に限定されるものではない。なお、ゴムノキとしては、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、セアラゴムノキ、インドゴムノキ、パナマゴムノキ、グアユールゴムノキ、ゴムタンポポ、ラゴスゴムノキ、グッタペルガノキ、パラタゴムノキ、シス・チクル等が例示できる。
【００１１】
ペリプロカとは、アフリカ、欧州、北米、アジアなどに自生するガガイモ科ペリプロカ属に属する蔓性の低木であり、植物体を傷つけることで乳液を出すものである。具体的には、ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ グラエカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｇｒａｅｃａ）、ペリプロカ ラエヴィガタ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｌａｅｖｉｇａｔａ）等が例示できる。
【００１２】
ペリプロカの形質転換体を作製するためのベクターは、蛍光タンパク質のプロモーターとして機能するように、該蛍光タンパク質をコードする遺伝子の上流に、評価対象たるプロモーターを組み込んだベクターである。本発明においては、当該ベクターを導入したアグロバクテリウム属菌をカルス等に感染させるのが好ましい。
本発明において用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００１３】
評価対象たるプロモーター等を含むベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、評価対象たるプロモーター等を組み込んだ遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに、発現させる遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、プロモーター領域に評価対象とするプロモーターを組み込んだ標的遺伝子バイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。
【００１４】
このようにして作製したベクターを導入したアグロバクテリウム属菌を、常法により培養し増殖させることにより、カルス等に感染させるために必要な量を調製することができる。
【００１５】
ペリプロカの形質転換体は、例えば、前記ベクターを含む感染液に、ペリプロカの根、茎、葉又は花等の組織、あるいはカルス等の細胞を接触させた後、組織培養し、さらに抗生物質を含有する選択培地で培養することで作製できる。
例えば、所望のベクターをアグロバクテリウム属菌に導入して、これをペリプロカの組織又は細胞に接種するアグロバクテリウム法を適用することが好ましい。
【００１６】
組織や細胞は、殺菌又は滅菌してから組織培養に供する。殺菌又は滅菌は、公知の殺菌剤・滅菌剤を使用して行えば良く、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を使用するのが好ましい。
【００１７】
組織培養は、遮光条件下、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、好ましくは２〜４日程度、同じ組成の培地上で行えば良い。
選択培地での培養は、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２０日間で行う。培養温度は、上記組織培養の場合と同様で良い。
【００１８】
作製した形質転換体は、再分化培地上で培養し、シュートになるまで生育させれば良い。
【００１９】
蛍光タンパク質は、公知のもので良く、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＤｓＲｅｄ等の、通常タンパク質発現ベクター等に組み込んで用いられるいずれのものでも良いが、ＧＦＰが特に好適である。
【００２０】
評価対象であるプロモーターが、乳管特異的なプロモーターである場合には、蛍光タンパク質は、乳管が形成される程度にまでペリプロカの形質転換体が生育しないと発現しない。そこで、乳管が形成されているシュートにまで生育させた後に、蛍光タンパク質の発現部位を調べる。
なお、発現部位のサイズが小さいと、蛍光シグナルも検出し難い場合がある。このため、蛍光タンパク質の発現部位をより明確に特定できるよう、主たる茎の長さが好ましくは５ｃｍ以上、より好ましくは１０ｃｍ以上であるシュートを、蛍光タンパク質の発現部位の確認に供すると良い。
【００２１】
蛍光タンパク質の発現部位は、シュートの乳管が存在する部位であればどこを調べても良いが、蛍光タンパク質の発現量が多く、蛍光シグナルの検出が容易である点から、シュートの節間で行うのが好ましく、輪切りにしてその断面において行うのがより好ましい。
【実施例】
【００２２】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
＜ペリプロカの形質転換体、シュートの作製＞
図１に示すような、ＲＥＦプロモーター（ＲＥＦ ｐｒｏ）の下流にＧＦＰ遺伝子（ｓＧＦＰ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮＯＳ ｔｅｒ）をつないだＧＦＰ発現カセットと、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（ＮＯＳ ｐｒｏ）の下流にカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ ＩＩ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだカナマイシン耐性遺伝子発現用カセットと、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ ｐｒｏ）の下流にハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだハイグロマイシン耐性遺伝子発現用カセットとを有する発現ベクター（ＰＢＩｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ））を構築し、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に、感染させ、発現ベクター導入アグロバクテリウムを作製した。なお、図１中、「Ｉ」は、イントロンを意味する。
次いで、前記発現ベクター導入アグロバクテリウムを含む感染液に、ペリプロカ セピウムの茎を２分間接触させた後、これを培地で遮光条件下、２５℃で３日間培養した。
次いで、カナマイシン耐性選択培地で、さらに２５℃で１６時間日長培養して、２２の形質転換体を作製した。
そして形質転換体から、公知の方法に従ってＤＮＡを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で、ＧＦＰ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下の通りである。そして、アガロースゲル電気泳動により、増幅産物を検出した。この結果、作製された全ての形質転換体において、ペリプロカの組織には、ＲＥＦプロモーターとＧＦＰ遺伝子とを結合させた遺伝子が導入され、形質転換されていることを確認した。
（ＰＣＲ条件）
９５℃／５分 → （９５℃／１分 → ６０℃／１分 → ７４℃／２分）×３０サイクル → ４℃
【００２３】
＜発現量の確認＞
上記形質転換体を、再分化培地で生育長が約１０ｃｍのシュートにまで生育させ、検体とした。
得られた検体（下記（１））を使用し、下記検体（２）及び（３）と共に、公知の方法に従って全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた。
（１）上記の形質転換された２２検体のペリプロカ（ＲＥＦ−ＧＦＰ−１〜２２）
（２）カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＦＰ遺伝子とを結合させた遺伝子が導入されて形質転換された１検体のペリプロカ（３５Ｓ−ＧＦＰ）
（３）コントロールとして、形質転換されていない１検体のペリプロカ（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）
そして、ＧＦＰ遺伝子の発現量を、内部対照として、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割って補正した補正発現量を算出した。その結果を図２に示す。なお、リアルタイムＰＣＲの条件は以下の通りである。
（装置）
７３００ ＦＡＳＴ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ
（解析ソフトウエア）
７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
（検出試薬）
ＳＹＢＥＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
（ＰＣＲ条件）
５０℃／２分 → ９５℃／１０分 → （９５℃／１５秒 → ６０℃／１分）×４０サイクル → ９５℃／１５秒 → ６０℃／１分 → ９５℃／１５秒 → ９５℃／１５秒 → ６０℃／１５秒
【００２４】
＜組織観察＞
補正発現量が多かった検体（ＲＥＦ−ＧＦＰ−５、１１、１２、１５）について、シュートの節間部を輪切りし、その断面を顕微鏡で観察した。同様に、３５Ｓ−ＧＦＰ、Ｗｉｌｄｔｙｐｅについても観察した。この時の断面の画像を図３に示す。（ａ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の透過光観察画像、（ｂ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の蛍光観察画像、（ｃ）は３５Ｓ−ＧＦＰの透過光観察画像、（ｄ）は３５Ｓ−ＧＦＰの蛍光観察画像、（ｅ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの透過光観察画像、（ｆ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの蛍光観察画像である。観察条件は以下の通りである。
（顕微鏡）
Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ６００
（フィルター）
ＥＸ４６０−５００
ＤＭ５０５
ＢＡ ５１０−５６０
（ライト）
Ｎｉｋｏｎ ＩＮＴＥＮＳＬＩＧＨＴ Ｃ−ＨＧＦＩ
【００２５】
その結果、Ｗｉｌｄｔｙｐｅでは、自家蛍光以外に蛍光シグナルは検出されず、ＧＦＰが発現していないことが確認された。また、３５Ｓ−ＧＦＰでは、断面の広範囲に渡って蛍光シグナルが検出され、組織全体でＧＦＰが発現していることが確認された。これに対し、ＲＥＦ−ＧＦＰ−５では、髄、形成層の周囲の一部で蛍光シグナルが鮮明に検出された。髄で蛍光シグナルが検出されたことは、乳管でＧＦＰが発現していることを示すと考えられる。また、ＲＥＦタンパク質は、脂質を生産する細胞に存在することが知られており、形成層の周囲の一部で蛍光シグナルが検出されたことは、発現されたＲＥＦタンパク質が、師部にある脂質を作る柔細胞に移動していることを示すと考えられる。
以上より、ＲＥＦプロモーターは乳管特異的であると考えられ、ペリプロカを使用する本発明の評価方法が、乳管特異的プロモーターの特定に有効であることが確認された。
【００２６】
［比較例１］
発現ベクターとして、ＰＢＩｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）に代わり、ＲＥＦプロモーターの下流にＧＵＳタンパク質をコードするＧＵＳ遺伝子を組み込んだ発現ベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）を使用したこと以外は、実施例１と同様に、ペリプロカの形質転換体を作製した。得られた検体について、実施例１と同様に茎を輪切りして、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）を添加して常法により染色し、断面の染色部位を顕微鏡で確認した。この時の断面の画像を図４に示す。その結果、ペリプロカの髄と師部でＧＵＳ活性の発現を確認できたが、染色が不鮮明で染色領域が髄と師部以外の広い領域に広がっており、ＧＵＳタンパク質の発現部位を特定できなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、天然ゴムの生産性増進や高機能化に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１におけるペリプロカの形質転換に使用した発現ベクターを示す図である。
【図２】実施例１におけるＧＦＰ遺伝子の補正発現量を示すグラフである。
【図３】実施例１における、顕微鏡による検体の茎の断面画像であり、（ａ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の透過光観察画像、（ｂ）はＲＥＦ−ＧＦＰ−５の蛍光観察画像、（ｃ）は３５Ｓ−ＧＦＰの透過光観察画像、（ｄ）は３５Ｓ−ＧＦＰの蛍光観察画像、（ｅ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの透過光観察画像、（ｆ）はＷｉｌｄｔｙｐｅの蛍光観察画像である。
【図４】比較例１における、顕微鏡による検体の茎の断面の染色画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、
評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、
シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項２】
主たる茎の長さが５ｃｍ以上である前記シュートにおける蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とする請求項１に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項３】
前記シュートの節間の断面において、前記蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とする請求項１又は２に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項５】
前記形質転換体の作製をアグロバクテリウム法で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項１】
プロモーターの乳管特異性を評価する方法であって、
評価対象であるプロモーターの下流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、ペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、
シュートまで生育した前記形質転換体における蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とするプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項２】
主たる茎の長さが５ｃｍ以上である前記シュートにおける蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とする請求項１に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項３】
前記シュートの節間の断面において、前記蛍光タンパク質の発現部位を確認することを特徴とする請求項１又は２に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【請求項５】
前記形質転換体の作製をアグロバクテリウム法で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーターの乳管特異性評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１１９３７３（Ｐ２０１０−１１９３７３Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９８８１５（Ｐ２００８−２９８８１５）
【出願日】平成２０年１１月２１日（２００８．１１．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム・省エネルギー技術開発プログラム／植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発／パラゴムノキのゴム生産制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２１日（２００８．１１．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム・省エネルギー技術開発プログラム／植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発／パラゴムノキのゴム生産制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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