プロリン残基の突然変異誘発により低減したアレルゲン性を有するイネ科のグループ５アレルゲンの変異体
本発明は、Poaceae（イネ科）のグループ６アレルゲンの組み換え変異体であって、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性と同時に、実質的に保持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする前記変異体の、調製および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Poaceae（イネ科）のグループ５アレルゲンの組み換え変異体の調製および使用に関し、これは、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性と同時に、実質的に保持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする。
これらの低アレルギー性アレルゲン変異体を、草花粉アレルギーの患者に対する特定の免疫療法（減感作）または、草花粉アレルギーの発症を予防するための予防的処置に用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ（Timothy grass）（Phleum pratense）のアレルゲンPhl p 6の変異体であって、２９、３０、５７、７９位のプロリンが単独または組み合わせで突然変異した前記変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
１型アレルギーは世界的に重要である。先進工業国の人口の最大２０％が、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病状を患っている。
これらのアレルギーは、種々の源、例えば樹木や草（花粉）、真菌（胞子）、ダニ（排泄物）、ネコまたはイヌなどにより引き起こされる。アレルゲン源は空気中に直接放出されるか（花粉、胞子）、またはディーゼルすす粒子（花粉）もしくはハウスダスト（ダニ排泄物、皮膚粒子、毛髪）に結合して空気中に到達する。アレルギー誘発物質は空中に存在するため、空気アレルゲンなる用語も用いられる。
【０００３】
１型アレルギー誘発物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介して取り込まれると、これらのアレルゲンは、感作された人の肥満細胞の表面に結合しているＩｇＥ分子と反応する。これらのＩｇＥ分子がアレルゲンによって互いに架橋されると、エフェクター細胞によるメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの分泌が起こり、それに対応したアレルギー症状が生じる。
１型アレルギー患者の最大４０％は、イネ科の花粉抽出物に特定のＩｇＥ反応性を示す（Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322；D’Amato et al., 1998, Allergy 53: 567-578；Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002）。イネ科（Poaceae）は１００００種以上を含んでおり、これまでにその２０種を超える種がアレルギー症状を誘発することが知られている（Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107；Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126）。
【０００４】
アレルギー誘発性のイネ科の多くは、イチゴツナギ（Pooideae）亜科に属する。野生型として存在する草種、例えばHolcus lanatus（シラゲカヤ（velvet grass））、Phalaris aquatica（カナリーグラス（canary grass））、Anthoxanthum odoratum（ハルガヤ（sweet vernal grass））、Dactylis glomerata（カモガヤ（orchard grass））、Festuca pratensis （メドウフェスク（meadow fescue））、Poa pratensis（ケンタッキーブルーグラス（Kentucky blue grass））またはLolium perenne（ライグラス（rye grass））などに加えて、栽培用穀類、例えばTriticum aestivum（コムギ）、Secale cereale（ライ麦）およびHordeum vulgare（オオムギ）なども、この亜科に属することが知られている。
イチゴツナギ種の中でアレルゲンに関して最も調査されてきたのは、オオアワガエリ（Phelum pratense）であり、これは野草として世界中に広がっており、牧草および耐寒性の飼料として商業的な役割も果たしている。
【０００５】
アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する個々のアレルゲン分子の、人口における相対的な頻度に依存して、主要アレルゲンと副次的アレルゲンが分類される。
オオアワガエリの６種のアレルゲンは、主要アレルゲンとみなされる：Phl p 1（Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796）、Phl p 5（Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307；Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109）、Phl p 6（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54）、Phl p 2/3（Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3): 299-304）、Phl p 4（Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268；Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294；Nandy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 337(2): 563-70）およびPhl p 13（Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402）。
【０００６】
Phl p 6については早くも１９７８年に最初の記述がなされた。オオアワガエリ花粉から精製された「Ａｇ１９」と呼ばれるタンパク質画分は、約１５ｋＤａの大きさのアレルゲンを含有し、これはのちに、公式のアレルゲンの学名で分類され、Phl p 6として存続した（Loewenstein, 1978, Allergy 33: 30-41；WHO/ IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee, www.allergen.org）。Phl p 6反応性ＩｇＥ抗体は草花粉アレルギー患者の約７０％に検出されるため、Phl p 6は主要アレルゲンとして分類されている（Rossi et al., 2001, Allergy, 56: 1180-85；Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9）。
【０００７】
草花粉抽出物からのアレルゲンの物理化学的調査により、一次配列の異なる２種のタンパク質変異体が検出された（Blume et al., 2004, Proteomics 4: 1366-71）。これらのアイソフォームは、オオアワガエリ花粉の発現ライブラリに同定されている２腫のｃＤＮＡ配列に起因し、WHO/IUIS名称Phl p 6.0101（GenBank：Z27082.1；UniProt：P43215；図１５および図１６または配列番号３および配列番号４を参照、プロペプチドは図１９または配列番号９を参照；Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59）およびPhl p 6.0102（GenBank：Y16955；UniProt：O65868；図３および図４または配列番号１および配列番号２を参照、プロペプチドは図２０または配列番号１０を参照；Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9）を有する。シグナルペプチドは別として、これらタンパク質はそれぞれ１１０個のアミノ酸からなり、２つの位置のみで異なり（成熟Phl p 6.0101から開始してVal 14→IleおよびArg 95→His）、これは５Ｄａの分子量の差をもたらしている（Phl p 6.0102の１１７８５Ｄａと比較して、Phl p 6.0101は１１７９０Ｄａ、図１）。
【０００８】
Poaceae科の他のイネ科種、特にイチゴツナギ亜科の花粉は、オオアワガエリのアレルゲンと相同な主要アレルゲンを含み得る。複数種にわたって生じるかかるアレルゲンを、アレルゲン群としてまとめる。かかる関連アレルゲンの高い構造的相同性は、究極的には類似のアミノ酸配列に基づいており、分子とＩｇＥ抗体との相応する高い交差反応性を引き起こす（Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17）。オオアワガエリの主要アレルゲンとアレルギー的に反応するアトピー性の人は、イネ科の別の関連種の１つによって最初に感作することができると知られている。最終的に、この交差反応性は、１つのイネ科の種による感作は、他の関連するイネ科によるアレルギー反応を誘発するのに十分であることを意味し得る。
Phl p 6と交差反応性であるグループ６アレルゲンは既に、ケンタッキーブルーグラス（Poa pratensis）の花粉に、タンパク質レベルで検出されている（Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9；Niederberger et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101 (2): 258-264）。
【０００９】
グループ６アレルゲン間の相互の交差反応性に加えて、グループ５の主要アレルゲンとの交差反応性も知られている。Phl p 6のポリペプチド鎖は、約２６〜２８ｋＤａのサイズを有するPhl p 5のＮ末端領域と大きな類似性を示す（図１、図２）。アレルゲンは、共通のオリジナル遺伝子に起因すると考えられる（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59）。両方のタンパク質はαヘリックスの二次構造を形成するが、しかしβ畳み込みシート構造は形成しない。Ｘ線構造解析により、Phl p 6の４つのαヘリックスが畳まれて特徴的ヘリックス束を形成することが示され（RCSB Protein Data Bank entry: 1NLX; Fedorov et al., 2003；図１）、これはPhl p 5の断片にも検出される構造である（Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181；Maglio et al., 2002, Protein Engineering 15: 635-642；Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450）。アレルゲン間の類似性は、いくつかのPhl p 5反応性ＩｇＥ抗体もまた、Phl p 6に結合するという効果を有する（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54；Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107）。
【００１０】
特定の免疫療法（ＳＩＴ）または減感作は、アレルギーの治療的処置への有効なアプローチとされている（(Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339；Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562)；Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:S25-85；James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088）。
【００１１】
天然のアレルゲン抽出物を漸増用量で患者に皮下注射するという古典的な治療形態である注射療法（ＳＣＩＴ）は、およそ１００年間成功して用いられてきた。この療法において、アレルギー患者の免疫系は繰り返しアレルゲンと直面し、免疫系の再プログラミングと同時に、アレルゲンへの耐性がもたらされる。抗原提示細胞がアレルゲン調製物から抗原を取り込んだ後、ペプチドが細胞表面上で抗原に提示される。いわゆるＴ細胞エピトープを含有するいくつかの特定ペプチドが、抗原特異的Ｔ細胞により認識される。この結合は、特に、調節機能を有する種々のタイプのＴ細胞の発達をもたらす。ＳＩＴの間、調節Ｔ細胞応答は以下をもたらす：アレルゲンの耐性、ＴＨ２サイトカインの下方制御、ＴＨ１／ＴＨ２平衡の回復、アレルゲン特異的ＩｇＥの抑制、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１およびＩｇＡ抗体の誘導、エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球および好酸球）の抑制、および炎症組織の再生（Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119 (4):780-789；Larche et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771）。Ｔ細胞エピトープはこのように、減感作の場合にアレルゲン調製物の治療作用に対して決定的に重要である。
【００１２】
ＩｇＥレベルおよびＴ細胞レベルでも存在するイネ科の主要アレルゲンの交差反応性のため、１つの代表的なイネ科の種のアレルゲン抽出物による治療の成功で、通常は十分である（Malling et al., 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 9-35；Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85）。
皮下的免疫療法のほかに、アレルゲンまたはアレルゲン誘導体を経口粘膜を介して取り込む舌下治療形態が、注射療法の代替として臨床試験にかけられ使用されている（James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088）。
さらなる可能性は、関連するアレルゲンをコードする、発現可能なＤＮＡによる処置である（免疫療法的ワクチン接種）。免疫反応のアレルゲン特異的影響の実験的証拠が、げっ歯類において、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により提供された（Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2 (5):540-544；Weiss et al., 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139: 332-345）。
【００１３】
これら治療形態の全てにおいて、アレルギー反応またはアナフィラキシーショックまでもの根本的リスクが存在する（Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156）。これらのリスクを最小化するために、アレルゴイドの形態の画期的な調製物が用いられている。これは、未処置の抽出物と比べてＩｇＥ反応性は顕著に低減されているが、同じＴ細胞反応性を有する、化学的に修飾されたアレルゲン抽出物である（Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339；Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157）。
治療の最適化は、組み換え法により調製したアレルゲンにより可能である。患者の個別の感作パターンに任意に適合された、組み換え法により調製された高度に純粋なアレルゲンの規定されたカクテルは、天然のアレルゲン源からの抽出物の代わりに用いることができ、これは後者が、種々のアレルゲン以外に、比較的多数の免疫原性の、しかし非アレルゲン性の付随タンパク質を含有するためである。組み換えアレルゲンを用いた初期の臨床研究が既に実施され、成功している（Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116: 608-613；Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119: 826-830）。
【００１４】
組み換え発現産物による安全な減感作をもたらし得る、現実的な可能性は、治療に必須のＴ細胞エピトープを損なうことなくＩｇＥエピトープを修飾した、突然変異した組み換えアレルゲンによって、具体的に提供されている（Schramm et al. 1999, J. Immunol. 162:2406-2414）。これらの低アレルギー性タンパク質は、ＳＩＴの間にＩｇＥに促進された望ましくない副作用の確率を増加させることなく、比較的高用量で用いることができる。
過去に、このような低減したＩｇＥ結合を有する「低アレルギー性」変異体が、多くの空気アレルゲン（特に花粉およびハウスダストダニアレルゲン）および食物アレルゲンについて公開されている。非修飾アレルゲンのＤＮＡに基づく組み換えＤＮＡの調製および発現を、特に、断片化、オリゴマー化、欠失、点突然変異、またはアレルゲンの個別の部分（section）の組み換え（ＤＮＡシャフリング）によって行うことが可能である（Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5-14；Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161）。
【００１５】
イネ科のグループ６アレルゲンについては、今日まで単一突然変異の戦略についてのみ刊行されており、ここでは、成熟Phl p 6のアミノ酸１〜３０をコードする最初の９０個のヌクレオチドが欠失している。分子はヒスチジン融合分子として発現され、その免疫学的特性について精製および調査された。Ｎ末端の欠失は、ＩｇＥ結合の低減をもたらし、好塩基性顆粒球によって刺激される能力の低減をもたらした（Vrtala et al., 2007, J. Immunol. 179: 1730-1739）。後の論文において、同じ分子をPhl p 2の組み換え変異体に結合して、ハイブリッド分子を得た（Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389: 925-933）。他のアレルゲンについて記載されたような点突然変異に基づく突然変異戦略は、グループ６草花粉アレルゲンについては未だ発表されていない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明が基づく目的は、タンパク質およびＤＮＡレベルでの、Poaceaeのグループ６アレルゲンの新規な変異体であって、低減したＩｇＥ反応性と同時にＴ細胞反応性の実質的な保持を特徴とし、したがって治療的および予防的な特定の免疫療法および免疫療法的ＤＮＡワクチン接種に好適な、前記変異体を提供することである。
【００１７】
発明の説明
驚くべきことには、アラインメントにおいて(in an alignment)野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独または組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの変異体は、野生型アレルゲンと比べて低減したＩｇＥ反応性と同時に、Ｔリンパ球との実質的に保持された反応性を有しており、したがって低アレルギー性であることが見出された。
したがって本発明は、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独または組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体に関する。
特に好適なのは、プロリンが欠失または置換されていることを特徴とする、本発明のアレルゲン変異体である。
【００１８】
好ましいのは、イチゴツナギ亜科からのグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体、好ましくはPoodaeおよびTriticodaeの群から、好ましくはPhleum pratense、Holcus lanatus、Phalaris aquatica、Anthoxanthum odoratum、Dactylis glomerata、Lolium perenne、Poa pratensis、Festuca pratensis、Hordeum vulgare、Secale cerealeおよびTriticum aestivumにより表されるものからの、前記変異体である。これらは好ましくは、Triticum aestivum、Secale cerealeおよびHordeum vulgareからのTri a 6、Sec c 6およびHor v 6の本発明の低アレルギー性変異体である。特に好ましいのは、Poodaeのグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体である。これらグループ６アレルゲンは好ましくは、Phleum pratense、Lolium perenne、Poa pratensis、Holcus lanatusおよびPhalaris aquaticaからのPhl p 6、Poa p 6、 Hol p 6、Lol p 6およびPha a 6であり、極めて特に好ましくはPoa p 6およびPhl p 6、特にPhl p 6である。上記アレルゲンの全ての天然のアイソマー、多形体、および変異体ならびにこれらの前駆体タンパク質もまた、本発明による。
【００１９】
本発明の低アレルギー性変異体において、突然変異したプロリンは、好ましくはアラインメントにおいて成熟Phl p 6.0101もしくはその変異体（配列番号４、配列番号７、配列番号８）の、または成熟Phl p 6.0102（配列番号２）の、特に好ましくは成熟Phl p 6.0102のアミノ酸配列における、２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するものである。
プロリンがタンパク質構造に影響を及ぼし得ることは知られていたが、アレルゲンの低アレルギー性突然変異体産生のための開始点としてのプロリン残基の特定の点突然変異は、ハウスダストダニDermatophaogides farinaeのグループ２主要アレルゲン（Der f 2、プロリン残基のアラニンによる置き換え）について調査されたのみであった（Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656）。しかし、ＩｇＥ結合能および好塩基性細胞を刺激する能力は、３種の点突然変異体の場合はわずかにのみ低減され、一方、別の３種は非修飾アレルゲンと同様の挙動であった。Der f 2の場合のプロリン突然変異はしたがって、アレルゲン性の非常に弱い低減、または低減なしを示した。プロリン交換突然変異による低アレルギー性突然変異体調製のためのさらなる戦略は、公開されていない。したがって当業者は、プロリン突然変異体がアレルゲンの低アレルギー性突然変異体産生のための開始点として成功することを期待していなかった。
【００２０】
さらに、これまで任意のアレルゲンで、プロリン残基の特定の欠失が発現産物の全ＩｇＥ結合能にどのように影響するか、およびアレルギー関連エフェクター細胞の活性化にどのような効果が生じるかについては、検討されていなかった。
Phl p 6またはその２つのアイソフォーム（Phl p 6.0101、GenBank：Z27082.1、UniProt: P43215；Phl p 6.0102, GenBank：Y16955、UniProt：O65868）のアミノ酸配列は、７個のプロリン残基を含む（図１）。アミノ酸位置２９、３０、５７、７９および１０１のプロリンは、αヘリックスの開始または終了部に直に存在するか、またはタンパク質表面の形成に関与する（図２）。６１位のプロリン残基は、第３ヘリックスの一部であり、プロリン１０８は、Ｃ末端近くに局在する。
【００２１】
Phl p 6アイソフォームPhl p 6.0101（配列番号４）およびPhl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列から開始して、組み合え非修飾野生型アレルゲン（rPhl p 6 wt；図４）および遺伝子工学により修飾された本発明の変異体を調製する。下記の調製方法と同様にして、本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲン、例えばPoa p 6の、野生型タンパク質および低アレルギー性変異体も調製することができる。そのために、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンを、好ましくは置換または欠失により、単独または組み合わせで突然変異させた。
【００２２】
本発明のアレルゲン変異体は、クローニングされたＤＮＡ配列から、遺伝子工学法の支援により調製すべきである。本発明の調製方法は、関連する実験室手順および刊行物、例えばE.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989などから、当業者には知られている。
グループ６アレルゲンについて記載した変異に加えて、例えば低アレルゲン性を増強するために、他の位置でのさらなる修飾も当然可能である。これらの修飾は、例えば、アミノ酸挿入、欠失、置き換え、およびタンパク質を断片に切断すること、およびタンパク質またはそれらの断片の、他のタンパク質またはペプチドとの融合、および同一タンパク質または断片の融合を介した多量体などであることができる。
【００２３】
本発明の断片は、好ましくは２０〜１０９個のアミノ酸を、好ましくは３０〜１００個のアミノ酸を、特に好ましくは４０〜９０個のアミノ酸を含有する。本発明の変異体はさらに、例えば図１８、１９および２０（配列番号８、配列番号９、配列番号１０）に示すように、前駆体タンパク質、例えばProPhl p6を、前の天然または人工シグナル配列と共に含む。本発明に含まれるのはさらに、Ｎ末端またはＣ末端融合タグ（例えば、図５および６に示すＨｉｓタグ、ＭＢＰタグ、発現制御配列等）を有する融合タンパク質、ハイブリッド分子、例えば他のアレルゲンもしくはその低アレルギー性変異体との融合、または任意の所望の順序での断片の融合である。さらに、本発明の変異体はまた、関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、好ましくは関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも９０％の、特に好ましくは関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、相同配列も含む（多形体（ＳＮＰ）、アイソフォーム）。これらの変異体において、１または数個のアミノ酸は好ましくは保存的に置き換えられ、例えば極性アミノ酸が別の極性アミノ酸に置換され、または中性アミノ酸が別の中性アミノ酸に置換されており、しかし、非保存的置き換えによる変異体もまた本発明による。多量体は好ましくは、リンカー配列によって結合されたか、または直接融合による、本発明の低アレルギー性変異体の二量体または三量体を含む。
【００２４】
かかる変異体の例は、図１７および図１８に示すように、Phl p 6.0101の変異体（配列番号７、配列番号８）であり、ここで本発明の作用に関連しない個々のアミノ酸は置き換えられているか、またはＮ末端の３個のアミノ酸もしくはＮ末端にシグナルペプチドを有するそれらの前駆体配列等を欠いている。本発明の変異体のさらなる例は、多形変異体であり、例えば２つのアイソマーPhl p 6.0101およびPhl p 6.0102それ自体、さらに、１または２以上のアミノ酸が置き換えられた変異体、Ｎおよび／またはＣ末端での１または２以上のアミノ酸の除外、またはアミノ酸配列内の対応する欠失ギャップを有する変異体である。同様に本発明に含まれるのは、単一または複数アミノ酸の、種々の位置における個別の挿入、あるいはアミノ酸配列内の１つの位置におけるか、またはＮおよび／またはＣ末端における、１つの群としての挿入を有する変異体である。
【００２５】
本発明はしたがって、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、これが本発明の低アレルギー性変異体の断片もしくは変異体、または本発明の１または２以上の低アレルギー性変異体の多量体であることを特徴とするもの、または本発明の１または２以上の低アレルギー性変異体またはそれらの断片、変異体もしくは多量体が、組み換え融合タンパク質の構成要素であることを特徴とするものにも関する。
さらに、本発明は、本発明の低アレルギー性変異体をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００２６】
本発明はさらに、発現制御配列に機能的に結合しているタイプの本発明のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクターに関する。発現制御配列とは、例えば、プロモーターまたは配列部分であって、これの支援により標的タンパク質の発現が影響され、標的遺伝子に機能的に結合しているが、必ずしも標的遺伝子の直近傍に局在している必要はない、前記プロモーターまたは配列部分を意味するものとする。
本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子または本発明の発現ベクターによって形質転換された、非ヒト宿主生物に関する。
【００２７】
本発明は、本発明の低アレルギー性変異体を、本発明の非ヒト宿主生物の培養および該培養物からの対応するアレルゲン変異体の単離によって、調製するための方法に関する。
好適な非ヒト宿主生物は、原核または真核の単細胞または多細胞生物、例えば細菌または酵母であることができる。本発明による好ましい宿主生物は、大腸菌である。
１つまたは隣接する２つのプロリンの欠失の、Phl p 6のＩｇＥ結合能への影響は、プロリン２９＋３０、プロリン５７、プロリン７９、およびプロリン１０１を欠失することよって調査することができる。Phl p 6野生型タンパク質において、これらのプロリンはαヘリックスの初めまたは終わりのループ領域に局在する（図１；図２）。プロリン６１およびプロリン１０８は修飾されないのが好ましく、なぜならば、対応する変異体が重要な効果を示さないからである。本発明のイネ科の別のグループ６アレルゲン、例えばPoa p 6の、対応する相同的位置でのプロリン突然変異のＩｇＥ結合能への影響を、同様にして調査することができる。
【００２８】
より迅速な高収率精製のために、これらの調査用のコーディングＤＮＡを、Ｎ末端ヘキサヒスチジン融合成分をコードする配列によって提供する（＋６Ｈｉｓ）（図５、配列番号５；図６、配列番号６）。本発明のタグなし変異体および、医薬目的のために用いることができる野生型タンパク質も、標準方法により同様に精製して、Ｈｉｓタグタンパク質による結果を確認する。
例えば、タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、rPhl p 6 d[P79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P101] + 6Hisをコードする配列を、対応して調製する。配列は、全ての既知の真核および原核発現系において、好ましくは大腸菌において、発現することができる。タンパク質は続いて、溶解性のモノマーとして、標準法により精製される。最後に、純度を変性ポリアクリルアミドゲル中での分析によりチェックする（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（図７）。
【００２９】
屈折計（ＲＩ検出器）および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ検出器）が連結された分析ゲルろ過（ＳＥＣ）により、溶出されたタンパク質の分子量のオンライン決定が可能である（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法）。
このように、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩによるrPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、rPhl p 6 d[P79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P101] + 6Hisの分析は、これらの本発明の変異体が、溶液中で純粋モノマー形態であることを示す（図８、表１）。
本発明の組み換え変異体のＩｇＥ結合能は、タンパク質をニトロセルロース膜上に固定化し、臨床的に定義された草花粉アレルギー患者の個々の血清のＩｇＥ抗体と直面させる方法（ストリップ試験）により決定することができる。アレルゲン変異体／抗体複合体を続いて酵素反応により着色する（図９）。
【００３０】
この方法において、変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは、試験した全ての血清と、非修飾のアレルゲンと同様の良好なＩｇＥ結合を示す（図９）。これから、プロリン１０１の欠失はPhl p 6のＩｇＥ結合能に重要な影響を有さないことがわかる。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6HisのＩｇＥ結合能は、異なる草花粉アレルギー患者の血清で異なっている。これは、ＩｇＥ抗体の親和性およびエピトープ特異性に関する、個々のアレルギー患者のＩｇＥ集団の組成（composition of the IgE population）における変化のためである。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、ほとんどの血清に対して、非修飾のrPhl p 6 wt + 6Hisと比べて大幅に低減したＩｇＥ反応性を示す。しかし、全体での最小のＩｇＥ結合は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの場合に観察される（図９）。
【００３１】
本発明の組み換え変異体は、さらに、それらのヒトＩｇＥ抗体への結合能について、ＩｇＥ阻害試験（ＥＡＳＴ）により調査することができる。この方法において、アレルゲン／ＩｇＥ相互作用は溶液中で調査でき、これにより、例えば膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、除外することが可能となる。
この例において、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6HisへのＩｇＥ結合を通したストリップ試験法で大きく異なっていた草花粉アレルギー患者の２種の血清を選択した。血清Ｐ３２は、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへのいまだに検出可能なＩｇＥ結合を示す血清の群（「Ａ」群）を表し、一方血清Ｐ８２は、検出可能な反応性を有さない血清の群の代表として選択される（「Ｂ」群）（図９、図１４）。
【００３２】
この試験法を用いて、非修飾rPhl p 6 wt + 6Hisと比較して、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの低減されたＩｇＥ結合能を、ストリップ試験の結果と整合して確認することができる（図１０）。
ストリップ試験法の結果はしたがって、ＩｇＥエピトープの部分的マスキングに起因するのではなく、代わりに、溶解タンパク質の低減したＩｇＥ結合能を正確に反映する。
変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは全濃度範囲において、血清Ｐ３２を用いた野生型アレルゲンのそれに対応するＩｇＥ結合能を示す（図１０）。血清Ｐ８２を使用すると、低いＩｇＥ結合が低いタンパク質濃度においてのみ観察され、一方高い濃度においては、ＩｇＥ結合は再度野生型のそれに対応する（図１０）。
【００３３】
Phl p 6のＩｇＥ結合能の低減はしたがって、原理的には、プロリン残基１０１の欠失によっても可能であるが、しかしこの効果は明らかに非常に小さく、ストリップ試験では全く検出できず、ＩｇＥ阻害試験では低い濃度においてのみ検出可能である（図９、図１０）。
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの低減したＩｇＥ結合能は、対照的に、ストリップ試験法においてはほとんどのアレルギー患者血清で容易に検出でき、ＩｇＥ阻害試験においては調査した濃度範囲全体で与えられる（図９、図１０）。
これは基本的に、グループ６アレルゲンのプロリン残基の欠失は、ＩｇＥ結合能を低減させられることを証明する。一方、一定のプロリンの欠失のみが、関連するＩｇＥ結合低減をもたらす。
【００３４】
臨床的に定義された草花粉アレルギー患者の好塩基性顆粒球を用いた試験により、本発明の変異体の低減したＩｇＥ結合能の、ヒトエフェクター細胞の活性化への効果をin vitroで調査することができる。
試験に用いる顆粒球は、アレルギー患者、本例ではアレルギー患者Ｐ２１の全血から単離する。このアレルギー患者は、ストリップ試験法において、ＩｇＥ抗体がrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへの検出可能な結合を示すアレルギー患者を表す（「Ａ」群、図９、１４）。
【００３５】
同じ濃度での、組み換え野生型アレルゲンおよび本発明の変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、およびPhl p 6 d[P79] + 6His rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisにおいて、本発明の変異体は、膜結合性ＩｇＥ抗体へのより低い結合を示し、結果として、好塩基性顆粒球の顕著に低下した活性化を示す（図１１）。
したがって結果は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの機能的に低減したアレルゲン性を確認する。こうしてこの試験により、Phl p 6のこれら２つの領域のプロリン突然変異が、少なくとも幾人かのアレルギー患者において、ＩｇＥ結合能も低減させることを確認できる。
したがって本発明はさらに、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で突然変異した、前記変異体に関する。
【００３６】
本発明は好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で変異した、Phl p 6またはPoa p 6の低アレルギー性変異体に関する。
本発明は特に好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で突然変異した、Phl p 6の低アレルギー性変異体に関する。
したがって特に好ましいのは、アラインメントにおいて成熟Phl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で除去された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体である。
【００３７】
本発明はさらに好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で除去された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体に関する。
また、本発明はさらに、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが個別に置換された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体に関する。ここで、プロリンは例としてはロイシン（Ｌ）により置き換えられる。しかし本発明により、本発明のプロリンは任意のアミノ酸で置き換えることができる。
【００３８】
特に、低アレルギー性変異体rPhl p 6 d[P29]、rPhl p 6 d[P30]、rPhl p 6 d[P29, 30]、rPhl p 6 d[P57]、rPhl p 6 d[P79]、rPhl p 6 P29L、rPhl p 6 P30L、rPhl p 6 P29L、P30L、rPhl p 6 P57LおよびrPhl p 6 P79L等、および以下に記載の全ての本発明の低アレルギー性変異体を含むものは、本発明によるものであり、ここで番号付けはPhl p 6の配列、特に成熟Phl p 6.0102に従う。
さらに、これらの例はPhl p 6の変異体に限定されず、特にPoa p 6および全ての他のイネ科のグループ６アレルゲンにも関する。
【００３９】
さらに、グループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体のいまだに検出可能なＩｇＥ結合能は、プロリン突然変異の組み合わせによってさらに低減可能である。したがって、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの大幅に低減されたＩｇＥ結合と、ＩｇＥ結合能もプロリン５７および７９の欠失により部分的に低減可能であるという事実によって、組み合わせの突然変異を含む核酸が産生される。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6HisのＤＮＡに基づき、５７および７９位のプロリンを欠失するか、またはアミノ酸ロイシンに変換する。
したがって、タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6HisならびにrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6Hisをコードする配列を調製する。これらの変異体は、Phl p 6のαヘリックスを結合する２つのループにプロリン突然変異を有するタンパク質をコードする（図２）。
【００４０】
さらに、３つのループ領域にプロリン突然変異を有するアレルゲン変異体を産生するために、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6Hisをコードする核酸を調製する（図２）。既に上述したように、配列は好ましくは大腸菌に発現され、タンパク質は標準法により精製される。
純度は同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩにより調査する（図１２、図１３）。本発明の全てのタンパク質は、したがって、高い純度および溶解性で調製することができる。
【００４１】
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法は、二量体を形成する特性について、上記突然変異体の顕著な差を明らかにする（図１３、表２）。タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6Hisについて決定された分子量は、二量体形成への明らかな傾向を示す。タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6Hisは、モノマー形態のみで検出される（表２）。この結果から、プロリン７９でなく、プロリン５７の位置の修飾が、二量体化傾向が誘発されるような様式でrPhl p 6 d[P29, 30]を修飾すると結論付けることができる。
ＩｇＥ結合能のストリップ試験による決定は驚くべきことに、rPhl p 6 d[P29, 30]へのＩｇＥの検出可能な結合を有する「Ａ」群のアレルギー患者の血清は、最適化変異体への顕著に低減されたＩｇＥ結合を実際に有することが示される（図１４）。プロリン５７および７９が欠失されたか、別のアミノ酸により置き換えられたかは明らかに、二量体形成能力と同様に、ＩｇＥ結合能の低減に対してほとんど影響を有さない。したがって、プロリンのグループ２９、３０、５７および７９からの複数アミノ酸残基の修飾が同時に存在することは、ＩｇＥ結合をさらに大きく低減させることが示される。
【００４２】
本発明はしたがってさらに、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体に関する。好ましいのは、欠失を通した、および他のアミノ酸による置換を通した、突然変異である。任意のアミノ酸を、ここでプロリンによる置き換え用に選択することができる。
本発明は好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、Phl p 6またはPoa p 6の低アレルギー性変異体に関する。
【００４３】
本発明は特に好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、Phl p 6の低アレルギー性変異体に関する。
特に好ましいのは、アラインメントにおいて成熟Phl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体である。
特に好ましいのは、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで除去された、本発明の低アレルギー性変異体である。特に好ましいのはまた、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで置換された、本発明の低アレルギー性変異体である。
【００４４】
さらに、特に好ましいのは、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで除去された、および／または置換された、本発明の低アレルギー性変異体である。特に、低アレルギー性変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57]、rPhl p 6 d[29, 30, 79], rPhl p 6 d[29, 30, 57, 79]、rPhl p 6 d[P29, 57]、rPhl p 6 d[P30, 57]、rPhl p 6 d[29, 79]、rPhl p 6 d[30, 79]、rPhl p 6 d[29, 57, 79]、rPhl p 6 d[30, 57, 79]、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L、rPhl p 6 d[29, 30] P79L、rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L、rPhl p 6 d[P29] P30L、rPhl p 6 d[P30] P29L、rPhl p 6 d[P57] P29L P30L、rPhl p 6 d[P79] P29L P30L、rPhl p 6 d[P57, 79] P29L P30L、rPhl p 6 P29L P30L P57L、rPhl p 6 P29L P30L P79L、rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L等、および下に記載の本発明の全ての低アレルギー性変異体はしたがって本発明によるものであり、ここで番号付けは、Phl p 6、特に成熟Phl p 6.0102の配列に従う。
【００４５】
ここで、プロリンは例としては、ロイシン（Ｌ）によって置き換えられる。しかし本発明により、本発明のプロリンは、任意のアミノ酸で置き換えることができる。したがって、本発明の１または２以上のプロリンが別のアミノ酸により置換された上記の全ての低アレルギー性変異体は、本発明によるものである。さらに、これらの例はPhl p 6の変異体に限定されず、特にPoa p 6および全ての他のイネ科のグループ６アレルゲンにも関する。しかし特に好ましいのは、Phleum pratenseのPhl p 6、特にPhl p 6.0102に基づく、本発明の全ての上記の低アレルギー性変異体である。
【００４６】
Ｔヘルパーリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の分解プロセスを通して形成され、ＡＰＣの表面でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示されるアレルゲンのペプチド断片と反応する。ペプチドは一般に１３〜１８アミノ酸の長さを有するが、しかしまた、側方が開いているＭＨＣクラス２結合部位のためこれより長くてもよい。ペプチドとＭＨＣクラス分子との主要な接触点は、約７〜１０個のアミノ酸のコア配列中に見出される。Ｔヘルパーリンパ球のアレルゲン特異的活性化は、その増殖および機能的分化の必要条件である（例えばＴｒｅｇ、ＴＨ１およびＴＨ２）。アレルゲンまたはアレルゲン変異体の、アレルゲン特異的Ｔリンパ球を刺激する能力は、その治療的有効性の鍵とみなされている。
Phl p 6またはPhl p 6.0102に基づき産生され、本明細書に記載される全てのアレルゲン変異体は、実験において、重要なＴ細胞エピトープの実質的な保持を示す。
【００４７】
したがって、プロリン残基の修飾を通して新規なタンパク質特性を有する、イネ科のグループ６アレルゲンの変異体が、初めて記載される。関与するプロリン残基はループ領域に局在する。一定のプロリン残基の修飾のみが新規な変異体をもたらし、これは、低減されたＩｇＥ反応性およびＴ細胞反応性の実質的な保持により識別され、したがって、治療的および予防的な特定の免疫療法に好適である。対応するＤＮＡ分子は、免疫療法的ワクチン接種に好適である。
本発明はしたがって、薬剤(medicament)としての、本発明の記載のアレルゲン変異体、ＤＮＡ分子および組み換え発現ベクターに関する。
【００４８】
本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子および組み換え発現ベクター、または本発明の薬剤は、特に、疾患および病気の予防および／または処置のために用いることができる。本発明の薬剤は、１型アレルギーの処置および／または予防に、すなわち、Poaceae種のグループ６アレルゲンがその誘発に関与する草花粉アレルギーを有する患者の特定の免疫療法（低感作）に、または草花粉アレルギーの予防的免疫療法に、特に好適である。本発明のＤＮＡ分子および組み換え発現ベクターは、対応する免疫療法的および免疫予防的ＤＮＡワクチン接種に用いることができる。
本発明はまた、少なくとも１種の本発明の低アレルギー性変異体の、その誘発にイネ科のグループ６アレルゲンが原因的に関与する１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための、薬剤の調製のための使用に関する。
【００４９】
また本発明によるのは、少なくとも１種の本発明のＤＮＡ分子、および／または本発明の組み換え発現ベクター、ならびに全ての比率でのその混合物の、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種のための薬剤の調製のための使用である。
本発明はさらに、少なくとも１種の本発明の低アレルギー性変異体、少なくとも１種の本発明のＤＮＡ分子、および／または少なくとも１種の本発明の組み換え発現ベクター、ならびに全ての比率でのその混合物、および任意にさらに賦形剤および／または助剤を含む、１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための医薬製剤に関する。
【００５０】
特に、本発明の医薬製剤は、イネ科のグループ６アレルゲンがその誘発に原因的に関与する、１型アレルギーの予防および／または治療的処置に好適である。
本発明の意義における医薬製剤は、ヒトの医学または獣医学における治療剤として用いることができ、したがってヒトおよび動物、とくに哺乳類に、例えばサル、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスなどに投与することができ、ヒトまたは動物の身体の治療的処置において、上述の疾患と闘うことにおいて、用いることができる。これらはさらに、診断剤または試薬としても用いることができる。
【００５１】
本発明による製剤または薬剤を使用する場合、本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクターは、一般に、既知の市販の製剤と同様に用い、好ましくは、０．００１〜５００ｍｇの用量で、低アレルギー性変異体の場合は維持相において用量あたり約１〜５００μｇ、好ましくは５〜２００μｇで用いる。製剤は、１日当たり１回または複数回投与可能であり、例えば１日２回、３回、または４回である。用量は典型的には、用量増加相においては維持用量まで増加させる。種々の用量増加および維持スキームがこの目的のために可能である。皮下の免疫療法（ＳＣＩＴ）の場合、例えば、これらには以下を含むことができる：短期間療法（季節的病訴の開始前に限定数の注射、典型的には４〜７回の注射）、シーズン前療法（花粉の季節の前に治療を開始、典型的には、増加相の間は毎週注射、および花粉の季節の始まりまで維持用量にて毎月の注射）、または通年療法（典型的には、１６週間までの毎週注射による用量増加相に続いて、維持用量での毎月の注射、必要に応じて花粉の季節の間は低減した用量）。水性または固体の製剤（錠剤、ウェファー等）による舌下の免疫療法の場合、療法は、用量増加相有りまたは無しで導入することができる。治療は、年間を通して毎日用量で実施するのが好ましいが、しかし、シーズン前に実施したり、または他の適用スキームで実施することもできる（例えば、２日目毎、毎週、毎月）。
【００５２】
表現「有効量」とは、薬剤または医薬活性化合物の量であって、生物学的または医学的応答を、例えば研究者または医者により求められるかまたは目的とされる組織、系、動物またはヒトにおいて引き起こす、前記薬剤または医薬活性化合物の量を意味する。
さらに、表現「治療的有効量」とは、この量を受領しない対応する対象と比較して、次の結果を有する量である：疾患、症候群、病気、病訴、疾病の改善された処置、治癒、予防または除去、または副作用の予防、または疾患、病訴もしくは疾病の進行の低減。用語「治療有効量」はまた、正常な生理機能を増加させるのに有効な量も包含する。
【００５３】
薬剤は、任意の所望の好適な経路を介した投与に適応可能であり、例えば、経口（舌下錠または舌下を含む）、直腸内、肺、鼻腔、局所的（舌下錠、舌下または経皮を含む）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、経静脈または皮内を含む）経路である。かかる薬剤は、薬学分野で知られた全てのプロセスを用いて、例えば活性化合物を賦形剤（単数または複数）または助剤（単数または複数）と組み合わせることにより、調製可能である。
【００５４】
非経口使用に好適なのは、特に、液剤、好ましくは油性液剤または水溶液、さらに懸濁剤、乳濁剤またはインプラントである。本発明のアレルゲン変異体はまた、凍結乾燥することができ、得られた凍結乾燥物は、例えば注射製剤の調製に用いられる。示した製剤は滅菌することができ、および／またはアジュバントを、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝物質および／または複数のさらなる活性化合物などを含んでよい。さらに、デポー製剤も、本発明のアレルゲン変異体の対応する処方により、例えば水酸化アルミニウム、リン酸カルシウムまたはチロシンなどへの吸着により、得ることができる。
【００５５】
好適な賦形剤は、非経口投与に好適であり、本発明のグループ６アレルゲン変異体と反応しない、有機または無機物質である。その例としては、次のような賦形剤である：水、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリン、またはワセリン。
非経口投与は、本発明の薬剤の投与に好適であるのが好ましい。非経口投与の場合、静脈内、皮下、皮内、リンパ管内投与が特に好ましい。静脈内投与の場合、注射は、直接または輸液への添加により行うことができる。
【００５６】
非経口投与に適合された薬剤としては水性および非水性無菌注射溶液を含み、これは抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および溶解剤を含有し、それにより製剤は処置されるレシピエントの血液に対して等張性となり、また、水性もしくは非水性の無菌懸濁液を含み、これは懸濁剤および増粘剤を含有してよい。製剤は、例えば密封アンプルおよびバイアルなどの単一用量または複数用量の容器で投与することができ、フリーズドライ（freeze-dried）（凍結乾燥（lipophilised））状態で保存され、これは、例えば注射目的の場合、水などの無菌の担体溶液を使用の直前に添加することのみが必要であることを意味する。処方に従って調製される注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
必要に応じて、本発明の製剤または薬剤は、１または２以上のさらなる活性化合物および／または１または２以上の作用エンハンサー（アジュバント）を含んでよい。
【００５７】
したがって本発明はさらに、さらなる活性化合物および／または助剤を含む、医薬製剤に関する。本発明は好ましくは、さらなる活性化合物がアレルゲンまたはそれらの変異体であることを特徴とする、本発明の医薬製剤に関する。好適なさらなる活性化合物の例は他のアレルゲンであり、特に、イネ科のアレルゲン、特に好ましくは、イチゴツナギ亜科からのアレルゲン、好ましくはPoodaeおよびTriticodaeの群からの、好ましくはPhleum pratense、Holcus lanatus、Phalaris aquatica、Dactylis glomerata、Lolium perenne、Poa pratensis、Hordeum vulgare、Secale cerealeおよびTriticum aestivumによって表され、例えば、グループ１、２、３、４、５、６、７、１０、１２または１３のアレルゲンおよびそれらの変異体であり、例えば、低アレルギー性変異体、断片、多量体、ハイブリッド分子または組み換え融合タンパク質である。本発明はさらに、少なくとも１種のさらなる助剤を、特に好ましくはいわゆるアジュバントを含む、医薬製剤に関する。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ、Toll様受容体のアクチベーター、例えばリポ多糖体およびＣｐＧオリゴヌクレオチド、ビタミンＤ３、マイコバクテリア抗原および寄生虫（例えば住血吸虫またはフィラリア）からの分子、例えばシスタチンまたはＥＳ−６２である。
【００５８】
本発明はまた、次の個別パックからなる（キット）にも関する：
ａ）本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクターの有効量を含有する、本発明の医薬製剤、
ｂ）さらなる医薬活性化合物および／またはアジュバントの有効量を含有する、医薬製剤。
セットは、好適な容器、例えば箱または紙箱、個別のボトル、バッグ、またはアンプルなどを含む。セットは例えば、各々が、有効量の本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクター、および溶解形態または凍結乾燥形態のさらなる医薬活性化合物を含有する本発明の製剤を含む、個別のアンプルを含んでよい。
【００５９】
さらなる態様なしでも、当業者は上述の記載を最も広い範囲で用いることができると考えられる。したがって好ましい態様は、説明的開示としてのみ見なされるべきであって、決して限定的ではない。
以下の例はしたがって、本発明を限定することなく説明することを意図する。別の指示がない限り、パーセントのデータは重量パーセントを意味する。全ての温度は摂氏で表される。「慣用の操作」：最終産物の構成に応じ、必要に応じて水を加え、ｐＨは必要に応じて２〜１０の間に調製する。
【００６０】
以下の本発明の低アレルギー性変異体は、生物工学的方法により調製され、特徴付けられた。しかし、物質の調製および特徴付けはまた、当業者により別の方法によっても実施することができる。例えば、本発明の低アレルギー性変異体はまた、化学的に合成可能である。さらに本発明は、以下に記載の本発明の低アレルギー性変異体にも関する。
【００６１】
例１：１つのループ領域にプロリン欠失を有するPhl p 6の変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6Hisおよび rPhl p 6 d[P79] + 6Hisの調製およびその免疫学的特徴付けを、以下に記載する。組み換え非修飾アレルゲン（rPhl p 6 wt + 6His）を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００６２】
遺伝子工学による作成：
変異体をコードするＤＮＡを、長いオーバーラップＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合およびＰＣＲ標準法によるＤＮＡ増幅により、合成する。コドンを、粒子の濃度をＲＩ検出器により決定し、粒子による光散乱をＭＡＬＳ検出器により記録するように選択する（Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240:155-166）。溶出粒子の平均質量を、これらのデータから約５％の精度で計算することができる。モノマー、二量体その他多量体および凝集物を、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩで検出可能である。
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ分析において、それぞれが単一のピークで溶出するタンパク質は、天然の条件下で純粋なモノマー形態であることが明らかとなる（図８；表１）。
【００６３】
【表１】
タンパク質濃度のオンライン決定は、OptilabrEX屈折率検出器（ＲＩ）（Wyatt, Santa Barbara, USA）を用いて行った。粒子による光散乱は、MiniDAWN Treos多角度検出器（Wyatt）を用いて決定した。粒子質量は、屈折率増分を０．１８０ｍｌ／ｇとして、デバイ形式（Debeye formalism）によるASTRA 5.3.2.17ソフトウェア（Wyatt）を用いて計算した。ＳＥＣカラム：Superdex 200 GL 10/ 300（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）。溶出液：２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２および１５０ｍＭのＮａＣｌ。
【００６４】
推定アミノ酸配列は、成熟Phl p 6.0102のそれに基づく（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。これらのオリゴヌクレオチドは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。これらのＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。
【００６５】
発現および精製：
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現を、大腸菌（Top 10株；Invitrogen）において行う。rPhl p 6 wt + 6 Hisおよび変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。ＩＭＡＣ溶出物からの組み換えタンパク質を続いて濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示される（図７）。
【００６６】
分析ゲルろ過（ＳＥＣ）により、タンパク種の固有の流体力学半径に基づく分離が可能である。分子量のオンライン決定は、屈折計（ＲＩ検出器）と多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ検出器）とをクロマトグラフィーシステムに連結することにより、実現可能である（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法）。この方法において、測定時に与えられた。
不溶性タンパク質凝集物の不在は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（光度計：Ultrospec 5300pro UV/VIS; GE Healthcare）によってもチェックする。
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法においては、タンパク質溶液の吸収スペクトルを２４０〜８００ｎｍの波長範囲で記録する。タンパク質溶液中の不溶性凝集物は、＞３００ｎｍの波長範囲で吸収し、一方、高度に溶解性のタンパク質はこの範囲では吸収しない。波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的である。本発明のタンパク質はしたがって、天然条件下で溶解性かつ高度に純粋であり、モノマーである。
【００６７】
低減したＩｇＥ結合の証拠：
アレルギー患者の血清からの特定のＩｇＥの反応性を決定する簡単な試験方法は、ストリップ試験である。この方法を用いて、比較的多数のアレルギー患者の血清を同時に調査することができる。
この目的のために、同じ濃度で同じ量の試験物質を、一緒に非変性条件下で１片のニトロセルロース膜に結合させる。一連のかかる膜片を、異なるアレルギー患者の血清を用いて同時にインキュベートすることができる。洗浄ステップの後、特異的に結合したＩｇＥ抗体を、抗ヒトＩｇＥ／アルカリホスファターゼ複合体によって促進される呈色反応により、膜上で可視化する。
【００６８】
１８の個々の草花粉アレルギー患者の血清を用いたPhl p 6変異体の結果を、図９に示す。重要な対照として、最初に、ヒスチジン融合成分有りまたは無しの組み換えアレルゲンのＩｇＥ結合を調査する。両方のタンパク質は、同じＩｇＥ結合能を示す。したがって試験に用いたＮ末端ヒスチジン融合成分もまた、ＩｇＥのPhl p 6への結合を妨害しない。
変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは、試験した全ての血清に対して、非修飾アレルゲンと同様の良好なＩｇＥ結合を示す（図９）。これから、プロリン１０１の欠失は、Phl p 6のＩｇＥ結合能に重要な影響を及ぼさないことがわかる。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6Hisおよび rPhl p 6 d[P79] + 6HisのＩｇＥ結合は、異なる草花粉アレルギー患者の血清において、異なっている。これは、ＩｇＥ抗体の親和性およびエピトープ特異性に関する、個々のアレルギー患者のＩｇＥ集団の組成における変化のためである。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、非修飾rPhl p 6 wt + 6Hisと比べて、ほとんどの血清に対して顕著に低減したＩｇＥ反応性を示す。しかし、全体での最小のＩｇＥ結合は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの場合に観察される（図９）。
【００６９】
溶解した試験物質のＩｇＥ結合能の調査を、ＥＡＳＴ阻害試験（酵素アレルゲン吸着試験）により実施する。この方法において、アレルゲン／ＩｇＥ相互作用は溶液中で調査でき、例えば膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、除外することが可能となる。
ＥＡＳＴ阻害試験を以下のように実施する。マイクロタイタープレートをアレルゲンで、ここではrPhl p 6 wt + 6Hisで被覆する。非結合のアレルゲン分子を洗浄して除去した後、プレートをウシ血清アルブミンでブロックして、後の非特異的結合を防ぐ。個別の血清としてのアレルギー患者のＩｇＥ抗体を好適な希釈中で、アレルゲンで被覆したマイクロタイタープレートと共にインキュベートした。アレルゲンに結合したＩｇＥ抗体の量を、抗ｈＩｇＧ／アルカリホスファターゼ複合体を用いた基質の反応によって着色された最終産物を得ることにより、光度分析的に定量する。
【００７０】
ＩｇＥ抗体の結合は、溶解性アレルゲンまたは試験される物質（組み換え修飾アレルゲン）により、物質特異的に、濃度の関数として阻害される。
Phl p 6の組み換えアレルゲン変異体による、図１０に示すＩｇＥ阻害試験結果は、プロリン残基P[29, 30]、P57およびP79の欠失が、Phl p 6の低減したＩｇＥ結合能をもたらすことを示す。変異体d[P29, 30]のＩｇＥ結合能は、d[P57]または d[P79]のそれよりも顕著に低い。低い阻害作用は、ＩｇＥエピトープの欠如を示す。突然変異体d[P101]は、草花粉アレルギー患者Ｐ３２の血清に対して改変されたＩｇＥ結合を示さず、血清Ｐ８２とわずかにのみ低減した結合を示し、これは、再度、高い阻害剤濃度での野生型のそれとほぼ同様である。
【００７１】
機能的アレルゲン性の低減の証拠：
エフェクター細胞の膜結合性ＩｇＥの架橋における突然変異体の機能的作用と、その活性化を、続いてin vitroで調査する。
好塩基球活性化試験のために、草花粉アレルギー患者のヘパリン化全血を、種々の濃度の試験物質を用いてインキュベートする。アレルギー性物質は、好塩基性顆粒球の高親和性ＩｇＥ受容体に関連する、特定のＩｇＥ抗体に結合することができる。アレルゲン分子により引き起こされるＩｇＥ／受容体複合体の架橋はシグナル伝達をもたらし、これは、エフェクター細胞の脱顆粒化をもたらし、したがってin vivoでアレルギー反応を引き起こす。
【００７２】
好塩基性免疫細胞のアレルゲンに誘発された活性化は、表面タンパク質（ＣＤ２０３ｃ）の発現の定量化とＩｇＥ−受容体の架橋のシグナル伝達により、in vitroで決定することができる（Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744）。細胞上で発現される表面タンパク質の数および細胞プールの活性化細胞のパーセンテージの値は、蛍光標識したモノクローナル抗体の表面タンパク質への結合および続く蛍光活性化フローサイトメトリによる解析により、高感度で測定される。
本例の試験に用いる顆粒球は、アレルギー患者Ｐ２１の全血から単離する。このアレルギー患者は、ストリップ試験法において、そのＩｇＥ抗体がrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへの検出可能な結合を示すアレルギー患者を表す（グループ「Ａ」）。
【００７３】
非修飾の組み換えアレルゲンおよびrPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisの同一濃度において、後者は両方のドナーの場合に、膜結合性ＩｇＥ抗体への低い結合を示し、その結果、好塩基性顆粒球の大幅に低減された活性化を示す(図１１)。
したがって、結果は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisの機能的に低減されたアレルゲン性を確認する。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、ドナーＰ２１の場合に、好塩基性細胞の明らかに低減された活性化を示す。したがって、この試験により、Phl p 6のこれら２つの領域におけるプロリン突然変異もまた、少なくとも幾人かのアレルギー患者においてＩｇＥ結合能を低減させることが確認できる。
【００７４】
変異体のＴ細胞反応性：
Ｔ細胞反応性を調査するために、草花粉アレルギー患者のオリゴクローナルＴ細胞系を、非修飾アレルゲンによる刺激を用いて従来法により確立する。増殖試験において、異なるＴ細胞系を基準のアレルゲンrPhl p 6 wtおよび修飾組み換えアレルゲン変異体で刺激する。増殖率を、［３Ｈ］チミジンの組み込みにより従来法によって決定する。
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[79] + 6Hisで、非修飾アレルゲンによる増殖と同程度に、調査するＴ細胞系に刺激を与える。重要なＴ細胞エピトープの保持を、これから結論付けることができる。
【００７５】
例２：複数のループ領域におけるプロリン欠失の組み合わせを有するPhl p 6の変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisの調製および免疫学的特徴付けを、Phl p 6野生型（IUISエントリーPhl p 6.0102）の２９、３０；５７および７９のアミノ酸位置に対応するプロリン欠失の組み合わせを持つ、Poaceaeのグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体についての例を用いて、以下に記載する。欠失プロリン残基はここで、Phl p 6と相同な２または３のループ領域に位置することができる。Phl p 6野生型アイソマーPhl p 6.0101（GenBank：Z27082.1、UniProt： P43215）の対応する低アレルギー性変異体を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００７６】
推定アミノ酸配列が、成熟Phl p 6.0102のそれに基づくようにコドンを選択する（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。オリゴヌクレオチドは好ましくは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。ＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。しかし、その他の標準発現ベクターも使用することができる。
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現は、全ての標準の真核および原核発現系で行うことができ、発現は好ましくは大腸菌にて行う（Top10株；Invitrogen）。変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。組み換えタンパク質を続いてＩＭＡＣ溶出物から濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
【００７７】
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示された(図１２)。
タンパク質を天然条件下で調査する分析ＳＥＣは、タンパク質が１つのピークで溶出することを示す。高分子量凝集物は検出されない（図１３）。ＭＡＬＳ／ＲＩによる分子量のオンライン決定で、rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisは純粋にモノマー形態であり、一方溶出されたrPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6Hisはモノマーと二量体の混合物を表すとの結果が導かれる（図１３；表２）。しかし、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により記録された両タンパク質の波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的なものである。
したがって、両方のタンパク質は天然条件下で溶解性で、純粋であり、沈殿とならず、したがってその特異的ＩｇＥ結合能の正確な分析のための重要な前提条件を満たしている。
【００７８】
【表２】
タンパク質濃度のオンライン決定は、OptilabrEX屈折率検出器（ＲＩ）（Wyatt, Santa Barbara, USA）を用いて行った。粒子による光散乱は、MiniDAWN Treos多角度検出器（Wyatt）を用いて決定した。粒子質量は、屈折率増分を０．１８０ｍｌ／ｇとして、デバイ形式によるASTRA 5.3.2.17ソフトウェア（Wyatt）を用いて計算した。ＳＥＣカラム：Superdex 200 GL 10/ 300（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）。溶出液：２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２および１５０ｍＭのＮａＣｌ。
【００７９】
低減したＩｇＥ結合の証拠：
１８の個別の草花粉アレルギー患者の血清を用いたrPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, P79] + 6Hisのストリップ試験の結果を図１４に示す。驚くべきことには、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30]への検出可能なＩｇＥ結合をいまだに有しているアレルギー患者の血清は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisに対して、大幅に低減されたＩｇＥ反応性を有することが明らかである（グループ「Ａ」：血清２１、３２、８３、１３７等）。
したがって、Phl p 6のＩｇＥ結合能は、ただ１つのループ領域のプロリン残基の欠失を介するよりも、種々のループ領域からのプロリンの複数の組み合わされた欠失によって、さらに低減可能であることが明らかに示される。
変異体のＴ細胞反応性：
変異体は、調査したＴ細胞系の増殖を、非修飾アレルゲンと同程度に刺激する。重要なＴ細胞エピトープの保持がこれから結論付けられる。
【００８０】
例３：複数のループ領域におけるプロリン点突然変異の組み合わせを有するPhl p 6ｓの変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisの調製および免疫学的特徴付けを、Phl p 6野生型（IUISエントリーPhl p 6.0102）の２９、３０、５７および７９のアミノ酸位置に対応するプロリン点突然変異の組み合わせを持つ、Poaceaeのグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体についての例を用いて、以下に記載する。プロリン残基は任意のアミノ酸に変換することができる。Phl p 6野生型アイソマーPhl p 6.0101（GenBank：Z27082.1、UniProt： P43215）の対応する低アレルギー性変異体を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００８１】
推定アミノ酸配列が、成熟Phl p 6.0102のそれに基づくようにコドンを選択する（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。オリゴヌクレオチドは好ましくは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。
ＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。しかし、その他の標準発現ベクターも使用することができる。
【００８２】
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現は、全ての標準の真核および原核発現系で行うことができ、発現は好ましくは大腸菌にて行う（Top10株；Invitrogen）。変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。組み換えタンパク質を続いてＩＭＡＣ溶出物から濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示される（図１２)。
【００８３】
タンパク質を天然条件下で調査する分析ＳＥＣにより、タンパク質は１つのピークで溶出することを示す。高分子量凝集物は検出されない（図１３）。ＭＡＬＳ／ＲＩによる分子量のオンライン決定で、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6Hisは純粋にモノマー形態であり、一方溶出されたrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6Hisはモノマーと二量体の混合物を表すとの結果が導かれる。rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisは主として二量体形態である（図１３；表２）。
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により記録された全てのタンパク質の波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的なものである。したがって、３種類のタンパク質は天然条件下で溶解性で、純粋であり、沈殿とならず、したがってその特異的ＩｇＥ結合能の正確な分析のための重要な前提条件を満たしている。
【００８４】
低減されたＩｇＥ結合の証拠：
１８の個別の草花粉アレルギー患者の血清を用いたrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisのストリップ試験の結果を図１２に示す。
驚くべきことには、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30]への検出可能なＩｇＥ結合をいまだに有しているアレルギー患者の血清は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisに対して、大幅に低減されたＩｇＥ反応性を有することが明らかである（グループ「Ａ」：血清２１、３２、８３、１３７等）。
したがって、Phl p 6のＩｇＥ結合能は、ただ１つのループ領域のプロリン残基の点突然変異を介するよりも、種々のループ領域からのプロリンの複数の組み合わされた点突然変異によって、さらに低減可能であることが明らかに示される。
【００８５】
変異体のＴ細胞反応性：
変異体は、調査したＴ細胞系の増殖を、非修飾アレルゲンと同程度に刺激する。重要なＴ細胞エピトープの保持がこれから結論付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、オオアワガエリのグループ６およびグループ５アレルゲンの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、Phl p 6の３Ｄ構造のワーキングモデルを示す。
【図３】図３は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0102）；ｃＤＮＡ配列（GenBankエントリー：Y16955；３３０ｐｂ）；配列番号１を示す。
【図４】図４は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0102）；推定アミノ酸配列（UniProtKBエントリー：O65868；１１０ａａ）；配列番号２を示す。
【図５】図５は、Ｎ末端ヒスチジン融合成分；ＤＮＡ配列（３３ｂｐ）；配列番号５を示す。
【００８７】
【図６】図６は、Ｎ末端ヒスチジン融合成分；アミノ酸配列（１１ａａ）；配列番号６を示す。
【図７】図７は、組み換えPhl p 6野生型およびループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体の純度制御を示す。
【図８】図８は、ループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の分子量決定を示す。
【図９】図９は、ループにプロリン欠失を有する固定化されたPhl p 6変異体のＩｇＥ結合を示す。
【図１０】図１０は、ループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体のＩｇＥ阻害試験を示す。
【００８８】
【図１１】図１１は、個々のループにおける突然変異を有するプロリン突然変異体の機能的アレルゲン性についての試験を示す。
【図１２】図１２は、２または３のループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の純度を示す。
【図１３】図１３は、２または３のループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の分子量決定を示す。
【図１４】図１４は、組み換えPhl p 6野生型および１、２または３のループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体のＩｇＥ結合を示す。
【図１５】図１５は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0101）；ｃＤＮＡ配列（GenBankエントリー：Z27082.1；３３０ｂｐ）；配列番号３を示す。
【００８９】
【図１６】図１６は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0101）；推定アミノ酸配列（UniProtKBエントリー：P43215；１１０ａａ）；配列番号４を示す。
【図１７】図１７は、Phl p 6.0101の変異体（UniProtKBエントリーO65869；１０７ａａ）；配列番号７を示す。
【図１８】図１８は、我々独自の配列決定による、Phl p 6.0101の変異体（プロペプチド含む）。（プロペプチド成分およびＹ〜Ｈ変異体は太字イタリック体）；配列番号８を示す。
【図１９】図１９は、ro Phl p 6.0101（P43215）（プロペプチド成分は太字イタリック体）；配列番号９を示す。
【図２０】図２０は、Pro Phl p 6.0102（O65868）（プロペプチド成分は太字イタリック体）；配列番号１０を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Poaceae（イネ科）のグループ５アレルゲンの組み換え変異体の調製および使用に関し、これは、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性と同時に、実質的に保持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする。
これらの低アレルギー性アレルゲン変異体を、草花粉アレルギーの患者に対する特定の免疫療法（減感作）または、草花粉アレルギーの発症を予防するための予防的処置に用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ（Timothy grass）（Phleum pratense）のアレルゲンPhl p 6の変異体であって、２９、３０、５７、７９位のプロリンが単独または組み合わせで突然変異した前記変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
１型アレルギーは世界的に重要である。先進工業国の人口の最大２０％が、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病状を患っている。
これらのアレルギーは、種々の源、例えば樹木や草（花粉）、真菌（胞子）、ダニ（排泄物）、ネコまたはイヌなどにより引き起こされる。アレルゲン源は空気中に直接放出されるか（花粉、胞子）、またはディーゼルすす粒子（花粉）もしくはハウスダスト（ダニ排泄物、皮膚粒子、毛髪）に結合して空気中に到達する。アレルギー誘発物質は空中に存在するため、空気アレルゲンなる用語も用いられる。
【０００３】
１型アレルギー誘発物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介して取り込まれると、これらのアレルゲンは、感作された人の肥満細胞の表面に結合しているＩｇＥ分子と反応する。これらのＩｇＥ分子がアレルゲンによって互いに架橋されると、エフェクター細胞によるメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの分泌が起こり、それに対応したアレルギー症状が生じる。
１型アレルギー患者の最大４０％は、イネ科の花粉抽出物に特定のＩｇＥ反応性を示す（Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322；D’Amato et al., 1998, Allergy 53: 567-578；Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002）。イネ科（Poaceae）は１００００種以上を含んでおり、これまでにその２０種を超える種がアレルギー症状を誘発することが知られている（Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107；Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126）。
【０００４】
アレルギー誘発性のイネ科の多くは、イチゴツナギ（Pooideae）亜科に属する。野生型として存在する草種、例えばHolcus lanatus（シラゲカヤ（velvet grass））、Phalaris aquatica（カナリーグラス（canary grass））、Anthoxanthum odoratum（ハルガヤ（sweet vernal grass））、Dactylis glomerata（カモガヤ（orchard grass））、Festuca pratensis （メドウフェスク（meadow fescue））、Poa pratensis（ケンタッキーブルーグラス（Kentucky blue grass））またはLolium perenne（ライグラス（rye grass））などに加えて、栽培用穀類、例えばTriticum aestivum（コムギ）、Secale cereale（ライ麦）およびHordeum vulgare（オオムギ）なども、この亜科に属することが知られている。
イチゴツナギ種の中でアレルゲンに関して最も調査されてきたのは、オオアワガエリ（Phelum pratense）であり、これは野草として世界中に広がっており、牧草および耐寒性の飼料として商業的な役割も果たしている。
【０００５】
アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する個々のアレルゲン分子の、人口における相対的な頻度に依存して、主要アレルゲンと副次的アレルゲンが分類される。
オオアワガエリの６種のアレルゲンは、主要アレルゲンとみなされる：Phl p 1（Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796）、Phl p 5（Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307；Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109）、Phl p 6（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54）、Phl p 2/3（Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3): 299-304）、Phl p 4（Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268；Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294；Nandy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 337(2): 563-70）およびPhl p 13（Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402）。
【０００６】
Phl p 6については早くも１９７８年に最初の記述がなされた。オオアワガエリ花粉から精製された「Ａｇ１９」と呼ばれるタンパク質画分は、約１５ｋＤａの大きさのアレルゲンを含有し、これはのちに、公式のアレルゲンの学名で分類され、Phl p 6として存続した（Loewenstein, 1978, Allergy 33: 30-41；WHO/ IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee, www.allergen.org）。Phl p 6反応性ＩｇＥ抗体は草花粉アレルギー患者の約７０％に検出されるため、Phl p 6は主要アレルゲンとして分類されている（Rossi et al., 2001, Allergy, 56: 1180-85；Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9）。
【０００７】
草花粉抽出物からのアレルゲンの物理化学的調査により、一次配列の異なる２種のタンパク質変異体が検出された（Blume et al., 2004, Proteomics 4: 1366-71）。これらのアイソフォームは、オオアワガエリ花粉の発現ライブラリに同定されている２腫のｃＤＮＡ配列に起因し、WHO/IUIS名称Phl p 6.0101（GenBank：Z27082.1；UniProt：P43215；図１５および図１６または配列番号３および配列番号４を参照、プロペプチドは図１９または配列番号９を参照；Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59）およびPhl p 6.0102（GenBank：Y16955；UniProt：O65868；図３および図４または配列番号１および配列番号２を参照、プロペプチドは図２０または配列番号１０を参照；Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9）を有する。シグナルペプチドは別として、これらタンパク質はそれぞれ１１０個のアミノ酸からなり、２つの位置のみで異なり（成熟Phl p 6.0101から開始してVal 14→IleおよびArg 95→His）、これは５Ｄａの分子量の差をもたらしている（Phl p 6.0102の１１７８５Ｄａと比較して、Phl p 6.0101は１１７９０Ｄａ、図１）。
【０００８】
Poaceae科の他のイネ科種、特にイチゴツナギ亜科の花粉は、オオアワガエリのアレルゲンと相同な主要アレルゲンを含み得る。複数種にわたって生じるかかるアレルゲンを、アレルゲン群としてまとめる。かかる関連アレルゲンの高い構造的相同性は、究極的には類似のアミノ酸配列に基づいており、分子とＩｇＥ抗体との相応する高い交差反応性を引き起こす（Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17）。オオアワガエリの主要アレルゲンとアレルギー的に反応するアトピー性の人は、イネ科の別の関連種の１つによって最初に感作することができると知られている。最終的に、この交差反応性は、１つのイネ科の種による感作は、他の関連するイネ科によるアレルギー反応を誘発するのに十分であることを意味し得る。
Phl p 6と交差反応性であるグループ６アレルゲンは既に、ケンタッキーブルーグラス（Poa pratensis）の花粉に、タンパク質レベルで検出されている（Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9；Niederberger et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101 (2): 258-264）。
【０００９】
グループ６アレルゲン間の相互の交差反応性に加えて、グループ５の主要アレルゲンとの交差反応性も知られている。Phl p 6のポリペプチド鎖は、約２６〜２８ｋＤａのサイズを有するPhl p 5のＮ末端領域と大きな類似性を示す（図１、図２）。アレルゲンは、共通のオリジナル遺伝子に起因すると考えられる（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59）。両方のタンパク質はαヘリックスの二次構造を形成するが、しかしβ畳み込みシート構造は形成しない。Ｘ線構造解析により、Phl p 6の４つのαヘリックスが畳まれて特徴的ヘリックス束を形成することが示され（RCSB Protein Data Bank entry: 1NLX; Fedorov et al., 2003；図１）、これはPhl p 5の断片にも検出される構造である（Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181；Maglio et al., 2002, Protein Engineering 15: 635-642；Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450）。アレルゲン間の類似性は、いくつかのPhl p 5反応性ＩｇＥ抗体もまた、Phl p 6に結合するという効果を有する（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54；Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107）。
【００１０】
特定の免疫療法（ＳＩＴ）または減感作は、アレルギーの治療的処置への有効なアプローチとされている（(Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339；Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562)；Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:S25-85；James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088）。
【００１１】
天然のアレルゲン抽出物を漸増用量で患者に皮下注射するという古典的な治療形態である注射療法（ＳＣＩＴ）は、およそ１００年間成功して用いられてきた。この療法において、アレルギー患者の免疫系は繰り返しアレルゲンと直面し、免疫系の再プログラミングと同時に、アレルゲンへの耐性がもたらされる。抗原提示細胞がアレルゲン調製物から抗原を取り込んだ後、ペプチドが細胞表面上で抗原に提示される。いわゆるＴ細胞エピトープを含有するいくつかの特定ペプチドが、抗原特異的Ｔ細胞により認識される。この結合は、特に、調節機能を有する種々のタイプのＴ細胞の発達をもたらす。ＳＩＴの間、調節Ｔ細胞応答は以下をもたらす：アレルゲンの耐性、ＴＨ２サイトカインの下方制御、ＴＨ１／ＴＨ２平衡の回復、アレルゲン特異的ＩｇＥの抑制、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１およびＩｇＡ抗体の誘導、エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球および好酸球）の抑制、および炎症組織の再生（Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119 (4):780-789；Larche et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771）。Ｔ細胞エピトープはこのように、減感作の場合にアレルゲン調製物の治療作用に対して決定的に重要である。
【００１２】
ＩｇＥレベルおよびＴ細胞レベルでも存在するイネ科の主要アレルゲンの交差反応性のため、１つの代表的なイネ科の種のアレルゲン抽出物による治療の成功で、通常は十分である（Malling et al., 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 9-35；Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85）。
皮下的免疫療法のほかに、アレルゲンまたはアレルゲン誘導体を経口粘膜を介して取り込む舌下治療形態が、注射療法の代替として臨床試験にかけられ使用されている（James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088）。
さらなる可能性は、関連するアレルゲンをコードする、発現可能なＤＮＡによる処置である（免疫療法的ワクチン接種）。免疫反応のアレルゲン特異的影響の実験的証拠が、げっ歯類において、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により提供された（Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2 (5):540-544；Weiss et al., 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139: 332-345）。
【００１３】
これら治療形態の全てにおいて、アレルギー反応またはアナフィラキシーショックまでもの根本的リスクが存在する（Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156）。これらのリスクを最小化するために、アレルゴイドの形態の画期的な調製物が用いられている。これは、未処置の抽出物と比べてＩｇＥ反応性は顕著に低減されているが、同じＴ細胞反応性を有する、化学的に修飾されたアレルゲン抽出物である（Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339；Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157）。
治療の最適化は、組み換え法により調製したアレルゲンにより可能である。患者の個別の感作パターンに任意に適合された、組み換え法により調製された高度に純粋なアレルゲンの規定されたカクテルは、天然のアレルゲン源からの抽出物の代わりに用いることができ、これは後者が、種々のアレルゲン以外に、比較的多数の免疫原性の、しかし非アレルゲン性の付随タンパク質を含有するためである。組み換えアレルゲンを用いた初期の臨床研究が既に実施され、成功している（Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116: 608-613；Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119: 826-830）。
【００１４】
組み換え発現産物による安全な減感作をもたらし得る、現実的な可能性は、治療に必須のＴ細胞エピトープを損なうことなくＩｇＥエピトープを修飾した、突然変異した組み換えアレルゲンによって、具体的に提供されている（Schramm et al. 1999, J. Immunol. 162:2406-2414）。これらの低アレルギー性タンパク質は、ＳＩＴの間にＩｇＥに促進された望ましくない副作用の確率を増加させることなく、比較的高用量で用いることができる。
過去に、このような低減したＩｇＥ結合を有する「低アレルギー性」変異体が、多くの空気アレルゲン（特に花粉およびハウスダストダニアレルゲン）および食物アレルゲンについて公開されている。非修飾アレルゲンのＤＮＡに基づく組み換えＤＮＡの調製および発現を、特に、断片化、オリゴマー化、欠失、点突然変異、またはアレルゲンの個別の部分（section）の組み換え（ＤＮＡシャフリング）によって行うことが可能である（Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5-14；Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161）。
【００１５】
イネ科のグループ６アレルゲンについては、今日まで単一突然変異の戦略についてのみ刊行されており、ここでは、成熟Phl p 6のアミノ酸１〜３０をコードする最初の９０個のヌクレオチドが欠失している。分子はヒスチジン融合分子として発現され、その免疫学的特性について精製および調査された。Ｎ末端の欠失は、ＩｇＥ結合の低減をもたらし、好塩基性顆粒球によって刺激される能力の低減をもたらした（Vrtala et al., 2007, J. Immunol. 179: 1730-1739）。後の論文において、同じ分子をPhl p 2の組み換え変異体に結合して、ハイブリッド分子を得た（Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389: 925-933）。他のアレルゲンについて記載されたような点突然変異に基づく突然変異戦略は、グループ６草花粉アレルゲンについては未だ発表されていない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明が基づく目的は、タンパク質およびＤＮＡレベルでの、Poaceaeのグループ６アレルゲンの新規な変異体であって、低減したＩｇＥ反応性と同時にＴ細胞反応性の実質的な保持を特徴とし、したがって治療的および予防的な特定の免疫療法および免疫療法的ＤＮＡワクチン接種に好適な、前記変異体を提供することである。
【００１７】
発明の説明
驚くべきことには、アラインメントにおいて(in an alignment)野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独または組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの変異体は、野生型アレルゲンと比べて低減したＩｇＥ反応性と同時に、Ｔリンパ球との実質的に保持された反応性を有しており、したがって低アレルギー性であることが見出された。
したがって本発明は、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独または組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体に関する。
特に好適なのは、プロリンが欠失または置換されていることを特徴とする、本発明のアレルゲン変異体である。
【００１８】
好ましいのは、イチゴツナギ亜科からのグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体、好ましくはPoodaeおよびTriticodaeの群から、好ましくはPhleum pratense、Holcus lanatus、Phalaris aquatica、Anthoxanthum odoratum、Dactylis glomerata、Lolium perenne、Poa pratensis、Festuca pratensis、Hordeum vulgare、Secale cerealeおよびTriticum aestivumにより表されるものからの、前記変異体である。これらは好ましくは、Triticum aestivum、Secale cerealeおよびHordeum vulgareからのTri a 6、Sec c 6およびHor v 6の本発明の低アレルギー性変異体である。特に好ましいのは、Poodaeのグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体である。これらグループ６アレルゲンは好ましくは、Phleum pratense、Lolium perenne、Poa pratensis、Holcus lanatusおよびPhalaris aquaticaからのPhl p 6、Poa p 6、 Hol p 6、Lol p 6およびPha a 6であり、極めて特に好ましくはPoa p 6およびPhl p 6、特にPhl p 6である。上記アレルゲンの全ての天然のアイソマー、多形体、および変異体ならびにこれらの前駆体タンパク質もまた、本発明による。
【００１９】
本発明の低アレルギー性変異体において、突然変異したプロリンは、好ましくはアラインメントにおいて成熟Phl p 6.0101もしくはその変異体（配列番号４、配列番号７、配列番号８）の、または成熟Phl p 6.0102（配列番号２）の、特に好ましくは成熟Phl p 6.0102のアミノ酸配列における、２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するものである。
プロリンがタンパク質構造に影響を及ぼし得ることは知られていたが、アレルゲンの低アレルギー性突然変異体産生のための開始点としてのプロリン残基の特定の点突然変異は、ハウスダストダニDermatophaogides farinaeのグループ２主要アレルゲン（Der f 2、プロリン残基のアラニンによる置き換え）について調査されたのみであった（Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656）。しかし、ＩｇＥ結合能および好塩基性細胞を刺激する能力は、３種の点突然変異体の場合はわずかにのみ低減され、一方、別の３種は非修飾アレルゲンと同様の挙動であった。Der f 2の場合のプロリン突然変異はしたがって、アレルゲン性の非常に弱い低減、または低減なしを示した。プロリン交換突然変異による低アレルギー性突然変異体調製のためのさらなる戦略は、公開されていない。したがって当業者は、プロリン突然変異体がアレルゲンの低アレルギー性突然変異体産生のための開始点として成功することを期待していなかった。
【００２０】
さらに、これまで任意のアレルゲンで、プロリン残基の特定の欠失が発現産物の全ＩｇＥ結合能にどのように影響するか、およびアレルギー関連エフェクター細胞の活性化にどのような効果が生じるかについては、検討されていなかった。
Phl p 6またはその２つのアイソフォーム（Phl p 6.0101、GenBank：Z27082.1、UniProt: P43215；Phl p 6.0102, GenBank：Y16955、UniProt：O65868）のアミノ酸配列は、７個のプロリン残基を含む（図１）。アミノ酸位置２９、３０、５７、７９および１０１のプロリンは、αヘリックスの開始または終了部に直に存在するか、またはタンパク質表面の形成に関与する（図２）。６１位のプロリン残基は、第３ヘリックスの一部であり、プロリン１０８は、Ｃ末端近くに局在する。
【００２１】
Phl p 6アイソフォームPhl p 6.0101（配列番号４）およびPhl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列から開始して、組み合え非修飾野生型アレルゲン（rPhl p 6 wt；図４）および遺伝子工学により修飾された本発明の変異体を調製する。下記の調製方法と同様にして、本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲン、例えばPoa p 6の、野生型タンパク質および低アレルギー性変異体も調製することができる。そのために、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンを、好ましくは置換または欠失により、単独または組み合わせで突然変異させた。
【００２２】
本発明のアレルゲン変異体は、クローニングされたＤＮＡ配列から、遺伝子工学法の支援により調製すべきである。本発明の調製方法は、関連する実験室手順および刊行物、例えばE.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989などから、当業者には知られている。
グループ６アレルゲンについて記載した変異に加えて、例えば低アレルゲン性を増強するために、他の位置でのさらなる修飾も当然可能である。これらの修飾は、例えば、アミノ酸挿入、欠失、置き換え、およびタンパク質を断片に切断すること、およびタンパク質またはそれらの断片の、他のタンパク質またはペプチドとの融合、および同一タンパク質または断片の融合を介した多量体などであることができる。
【００２３】
本発明の断片は、好ましくは２０〜１０９個のアミノ酸を、好ましくは３０〜１００個のアミノ酸を、特に好ましくは４０〜９０個のアミノ酸を含有する。本発明の変異体はさらに、例えば図１８、１９および２０（配列番号８、配列番号９、配列番号１０）に示すように、前駆体タンパク質、例えばProPhl p6を、前の天然または人工シグナル配列と共に含む。本発明に含まれるのはさらに、Ｎ末端またはＣ末端融合タグ（例えば、図５および６に示すＨｉｓタグ、ＭＢＰタグ、発現制御配列等）を有する融合タンパク質、ハイブリッド分子、例えば他のアレルゲンもしくはその低アレルギー性変異体との融合、または任意の所望の順序での断片の融合である。さらに、本発明の変異体はまた、関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、好ましくは関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも９０％の、特に好ましくは関連するグループ６野生型アレルゲンと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、相同配列も含む（多形体（ＳＮＰ）、アイソフォーム）。これらの変異体において、１または数個のアミノ酸は好ましくは保存的に置き換えられ、例えば極性アミノ酸が別の極性アミノ酸に置換され、または中性アミノ酸が別の中性アミノ酸に置換されており、しかし、非保存的置き換えによる変異体もまた本発明による。多量体は好ましくは、リンカー配列によって結合されたか、または直接融合による、本発明の低アレルギー性変異体の二量体または三量体を含む。
【００２４】
かかる変異体の例は、図１７および図１８に示すように、Phl p 6.0101の変異体（配列番号７、配列番号８）であり、ここで本発明の作用に関連しない個々のアミノ酸は置き換えられているか、またはＮ末端の３個のアミノ酸もしくはＮ末端にシグナルペプチドを有するそれらの前駆体配列等を欠いている。本発明の変異体のさらなる例は、多形変異体であり、例えば２つのアイソマーPhl p 6.0101およびPhl p 6.0102それ自体、さらに、１または２以上のアミノ酸が置き換えられた変異体、Ｎおよび／またはＣ末端での１または２以上のアミノ酸の除外、またはアミノ酸配列内の対応する欠失ギャップを有する変異体である。同様に本発明に含まれるのは、単一または複数アミノ酸の、種々の位置における個別の挿入、あるいはアミノ酸配列内の１つの位置におけるか、またはＮおよび／またはＣ末端における、１つの群としての挿入を有する変異体である。
【００２５】
本発明はしたがって、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、これが本発明の低アレルギー性変異体の断片もしくは変異体、または本発明の１または２以上の低アレルギー性変異体の多量体であることを特徴とするもの、または本発明の１または２以上の低アレルギー性変異体またはそれらの断片、変異体もしくは多量体が、組み換え融合タンパク質の構成要素であることを特徴とするものにも関する。
さらに、本発明は、本発明の低アレルギー性変異体をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００２６】
本発明はさらに、発現制御配列に機能的に結合しているタイプの本発明のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクターに関する。発現制御配列とは、例えば、プロモーターまたは配列部分であって、これの支援により標的タンパク質の発現が影響され、標的遺伝子に機能的に結合しているが、必ずしも標的遺伝子の直近傍に局在している必要はない、前記プロモーターまたは配列部分を意味するものとする。
本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子または本発明の発現ベクターによって形質転換された、非ヒト宿主生物に関する。
【００２７】
本発明は、本発明の低アレルギー性変異体を、本発明の非ヒト宿主生物の培養および該培養物からの対応するアレルゲン変異体の単離によって、調製するための方法に関する。
好適な非ヒト宿主生物は、原核または真核の単細胞または多細胞生物、例えば細菌または酵母であることができる。本発明による好ましい宿主生物は、大腸菌である。
１つまたは隣接する２つのプロリンの欠失の、Phl p 6のＩｇＥ結合能への影響は、プロリン２９＋３０、プロリン５７、プロリン７９、およびプロリン１０１を欠失することよって調査することができる。Phl p 6野生型タンパク質において、これらのプロリンはαヘリックスの初めまたは終わりのループ領域に局在する（図１；図２）。プロリン６１およびプロリン１０８は修飾されないのが好ましく、なぜならば、対応する変異体が重要な効果を示さないからである。本発明のイネ科の別のグループ６アレルゲン、例えばPoa p 6の、対応する相同的位置でのプロリン突然変異のＩｇＥ結合能への影響を、同様にして調査することができる。
【００２８】
より迅速な高収率精製のために、これらの調査用のコーディングＤＮＡを、Ｎ末端ヘキサヒスチジン融合成分をコードする配列によって提供する（＋６Ｈｉｓ）（図５、配列番号５；図６、配列番号６）。本発明のタグなし変異体および、医薬目的のために用いることができる野生型タンパク質も、標準方法により同様に精製して、Ｈｉｓタグタンパク質による結果を確認する。
例えば、タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、rPhl p 6 d[P79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P101] + 6Hisをコードする配列を、対応して調製する。配列は、全ての既知の真核および原核発現系において、好ましくは大腸菌において、発現することができる。タンパク質は続いて、溶解性のモノマーとして、標準法により精製される。最後に、純度を変性ポリアクリルアミドゲル中での分析によりチェックする（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（図７）。
【００２９】
屈折計（ＲＩ検出器）および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ検出器）が連結された分析ゲルろ過（ＳＥＣ）により、溶出されたタンパク質の分子量のオンライン決定が可能である（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法）。
このように、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩによるrPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、rPhl p 6 d[P79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P101] + 6Hisの分析は、これらの本発明の変異体が、溶液中で純粋モノマー形態であることを示す（図８、表１）。
本発明の組み換え変異体のＩｇＥ結合能は、タンパク質をニトロセルロース膜上に固定化し、臨床的に定義された草花粉アレルギー患者の個々の血清のＩｇＥ抗体と直面させる方法（ストリップ試験）により決定することができる。アレルゲン変異体／抗体複合体を続いて酵素反応により着色する（図９）。
【００３０】
この方法において、変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは、試験した全ての血清と、非修飾のアレルゲンと同様の良好なＩｇＥ結合を示す（図９）。これから、プロリン１０１の欠失はPhl p 6のＩｇＥ結合能に重要な影響を有さないことがわかる。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6HisのＩｇＥ結合能は、異なる草花粉アレルギー患者の血清で異なっている。これは、ＩｇＥ抗体の親和性およびエピトープ特異性に関する、個々のアレルギー患者のＩｇＥ集団の組成（composition of the IgE population）における変化のためである。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、ほとんどの血清に対して、非修飾のrPhl p 6 wt + 6Hisと比べて大幅に低減したＩｇＥ反応性を示す。しかし、全体での最小のＩｇＥ結合は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの場合に観察される（図９）。
【００３１】
本発明の組み換え変異体は、さらに、それらのヒトＩｇＥ抗体への結合能について、ＩｇＥ阻害試験（ＥＡＳＴ）により調査することができる。この方法において、アレルゲン／ＩｇＥ相互作用は溶液中で調査でき、これにより、例えば膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、除外することが可能となる。
この例において、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6HisへのＩｇＥ結合を通したストリップ試験法で大きく異なっていた草花粉アレルギー患者の２種の血清を選択した。血清Ｐ３２は、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへのいまだに検出可能なＩｇＥ結合を示す血清の群（「Ａ」群）を表し、一方血清Ｐ８２は、検出可能な反応性を有さない血清の群の代表として選択される（「Ｂ」群）（図９、図１４）。
【００３２】
この試験法を用いて、非修飾rPhl p 6 wt + 6Hisと比較して、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの低減されたＩｇＥ結合能を、ストリップ試験の結果と整合して確認することができる（図１０）。
ストリップ試験法の結果はしたがって、ＩｇＥエピトープの部分的マスキングに起因するのではなく、代わりに、溶解タンパク質の低減したＩｇＥ結合能を正確に反映する。
変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは全濃度範囲において、血清Ｐ３２を用いた野生型アレルゲンのそれに対応するＩｇＥ結合能を示す（図１０）。血清Ｐ８２を使用すると、低いＩｇＥ結合が低いタンパク質濃度においてのみ観察され、一方高い濃度においては、ＩｇＥ結合は再度野生型のそれに対応する（図１０）。
【００３３】
Phl p 6のＩｇＥ結合能の低減はしたがって、原理的には、プロリン残基１０１の欠失によっても可能であるが、しかしこの効果は明らかに非常に小さく、ストリップ試験では全く検出できず、ＩｇＥ阻害試験では低い濃度においてのみ検出可能である（図９、図１０）。
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの低減したＩｇＥ結合能は、対照的に、ストリップ試験法においてはほとんどのアレルギー患者血清で容易に検出でき、ＩｇＥ阻害試験においては調査した濃度範囲全体で与えられる（図９、図１０）。
これは基本的に、グループ６アレルゲンのプロリン残基の欠失は、ＩｇＥ結合能を低減させられることを証明する。一方、一定のプロリンの欠失のみが、関連するＩｇＥ結合低減をもたらす。
【００３４】
臨床的に定義された草花粉アレルギー患者の好塩基性顆粒球を用いた試験により、本発明の変異体の低減したＩｇＥ結合能の、ヒトエフェクター細胞の活性化への効果をin vitroで調査することができる。
試験に用いる顆粒球は、アレルギー患者、本例ではアレルギー患者Ｐ２１の全血から単離する。このアレルギー患者は、ストリップ試験法において、ＩｇＥ抗体がrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへの検出可能な結合を示すアレルギー患者を表す（「Ａ」群、図９、１４）。
【００３５】
同じ濃度での、組み換え野生型アレルゲンおよび本発明の変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His、およびPhl p 6 d[P79] + 6His rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisにおいて、本発明の変異体は、膜結合性ＩｇＥ抗体へのより低い結合を示し、結果として、好塩基性顆粒球の顕著に低下した活性化を示す（図１１）。
したがって結果は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisの機能的に低減したアレルゲン性を確認する。こうしてこの試験により、Phl p 6のこれら２つの領域のプロリン突然変異が、少なくとも幾人かのアレルギー患者において、ＩｇＥ結合能も低減させることを確認できる。
したがって本発明はさらに、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で突然変異した、前記変異体に関する。
【００３６】
本発明は好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で変異した、Phl p 6またはPoa p 6の低アレルギー性変異体に関する。
本発明は特に好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で突然変異した、Phl p 6の低アレルギー性変異体に関する。
したがって特に好ましいのは、アラインメントにおいて成熟Phl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で除去された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体である。
【００３７】
本発明はさらに好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが単独で除去された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体に関する。
また、本発明はさらに、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが個別に置換された、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体に関する。ここで、プロリンは例としてはロイシン（Ｌ）により置き換えられる。しかし本発明により、本発明のプロリンは任意のアミノ酸で置き換えることができる。
【００３８】
特に、低アレルギー性変異体rPhl p 6 d[P29]、rPhl p 6 d[P30]、rPhl p 6 d[P29, 30]、rPhl p 6 d[P57]、rPhl p 6 d[P79]、rPhl p 6 P29L、rPhl p 6 P30L、rPhl p 6 P29L、P30L、rPhl p 6 P57LおよびrPhl p 6 P79L等、および以下に記載の全ての本発明の低アレルギー性変異体を含むものは、本発明によるものであり、ここで番号付けはPhl p 6の配列、特に成熟Phl p 6.0102に従う。
さらに、これらの例はPhl p 6の変異体に限定されず、特にPoa p 6および全ての他のイネ科のグループ６アレルゲンにも関する。
【００３９】
さらに、グループ６アレルゲンの本発明の低アレルギー性変異体のいまだに検出可能なＩｇＥ結合能は、プロリン突然変異の組み合わせによってさらに低減可能である。したがって、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの大幅に低減されたＩｇＥ結合と、ＩｇＥ結合能もプロリン５７および７９の欠失により部分的に低減可能であるという事実によって、組み合わせの突然変異を含む核酸が産生される。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6HisのＤＮＡに基づき、５７および７９位のプロリンを欠失するか、またはアミノ酸ロイシンに変換する。
したがって、タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6HisならびにrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6Hisをコードする配列を調製する。これらの変異体は、Phl p 6のαヘリックスを結合する２つのループにプロリン突然変異を有するタンパク質をコードする（図２）。
【００４０】
さらに、３つのループ領域にプロリン突然変異を有するアレルゲン変異体を産生するために、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6Hisをコードする核酸を調製する（図２）。既に上述したように、配列は好ましくは大腸菌に発現され、タンパク質は標準法により精製される。
純度は同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩにより調査する（図１２、図１３）。本発明の全てのタンパク質は、したがって、高い純度および溶解性で調製することができる。
【００４１】
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法は、二量体を形成する特性について、上記突然変異体の顕著な差を明らかにする（図１３、表２）。タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6Hisについて決定された分子量は、二量体形成への明らかな傾向を示す。タンパク質rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6Hisは、モノマー形態のみで検出される（表２）。この結果から、プロリン７９でなく、プロリン５７の位置の修飾が、二量体化傾向が誘発されるような様式でrPhl p 6 d[P29, 30]を修飾すると結論付けることができる。
ＩｇＥ結合能のストリップ試験による決定は驚くべきことに、rPhl p 6 d[P29, 30]へのＩｇＥの検出可能な結合を有する「Ａ」群のアレルギー患者の血清は、最適化変異体への顕著に低減されたＩｇＥ結合を実際に有することが示される（図１４）。プロリン５７および７９が欠失されたか、別のアミノ酸により置き換えられたかは明らかに、二量体形成能力と同様に、ＩｇＥ結合能の低減に対してほとんど影響を有さない。したがって、プロリンのグループ２９、３０、５７および７９からの複数アミノ酸残基の修飾が同時に存在することは、ＩｇＥ結合をさらに大きく低減させることが示される。
【００４２】
本発明はしたがってさらに、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体に関する。好ましいのは、欠失を通した、および他のアミノ酸による置換を通した、突然変異である。任意のアミノ酸を、ここでプロリンによる置き換え用に選択することができる。
本発明は好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、Phl p 6またはPoa p 6の低アレルギー性変異体に関する。
【００４３】
本発明は特に好ましくは、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、Phl p 6の低アレルギー性変異体に関する。
特に好ましいのは、アラインメントにおいて成熟Phl p 6.0102（配列番号２）のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが組み合わせで突然変異した、イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体である。
特に好ましいのは、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで除去された、本発明の低アレルギー性変異体である。特に好ましいのはまた、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで置換された、本発明の低アレルギー性変異体である。
【００４４】
さらに、特に好ましいのは、プロリン２９、３０、５７、７９が組み合わせで除去された、および／または置換された、本発明の低アレルギー性変異体である。特に、低アレルギー性変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57]、rPhl p 6 d[29, 30, 79], rPhl p 6 d[29, 30, 57, 79]、rPhl p 6 d[P29, 57]、rPhl p 6 d[P30, 57]、rPhl p 6 d[29, 79]、rPhl p 6 d[30, 79]、rPhl p 6 d[29, 57, 79]、rPhl p 6 d[30, 57, 79]、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L、rPhl p 6 d[29, 30] P79L、rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L、rPhl p 6 d[P29] P30L、rPhl p 6 d[P30] P29L、rPhl p 6 d[P57] P29L P30L、rPhl p 6 d[P79] P29L P30L、rPhl p 6 d[P57, 79] P29L P30L、rPhl p 6 P29L P30L P57L、rPhl p 6 P29L P30L P79L、rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L等、および下に記載の本発明の全ての低アレルギー性変異体はしたがって本発明によるものであり、ここで番号付けは、Phl p 6、特に成熟Phl p 6.0102の配列に従う。
【００４５】
ここで、プロリンは例としては、ロイシン（Ｌ）によって置き換えられる。しかし本発明により、本発明のプロリンは、任意のアミノ酸で置き換えることができる。したがって、本発明の１または２以上のプロリンが別のアミノ酸により置換された上記の全ての低アレルギー性変異体は、本発明によるものである。さらに、これらの例はPhl p 6の変異体に限定されず、特にPoa p 6および全ての他のイネ科のグループ６アレルゲンにも関する。しかし特に好ましいのは、Phleum pratenseのPhl p 6、特にPhl p 6.0102に基づく、本発明の全ての上記の低アレルギー性変異体である。
【００４６】
Ｔヘルパーリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の分解プロセスを通して形成され、ＡＰＣの表面でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示されるアレルゲンのペプチド断片と反応する。ペプチドは一般に１３〜１８アミノ酸の長さを有するが、しかしまた、側方が開いているＭＨＣクラス２結合部位のためこれより長くてもよい。ペプチドとＭＨＣクラス分子との主要な接触点は、約７〜１０個のアミノ酸のコア配列中に見出される。Ｔヘルパーリンパ球のアレルゲン特異的活性化は、その増殖および機能的分化の必要条件である（例えばＴｒｅｇ、ＴＨ１およびＴＨ２）。アレルゲンまたはアレルゲン変異体の、アレルゲン特異的Ｔリンパ球を刺激する能力は、その治療的有効性の鍵とみなされている。
Phl p 6またはPhl p 6.0102に基づき産生され、本明細書に記載される全てのアレルゲン変異体は、実験において、重要なＴ細胞エピトープの実質的な保持を示す。
【００４７】
したがって、プロリン残基の修飾を通して新規なタンパク質特性を有する、イネ科のグループ６アレルゲンの変異体が、初めて記載される。関与するプロリン残基はループ領域に局在する。一定のプロリン残基の修飾のみが新規な変異体をもたらし、これは、低減されたＩｇＥ反応性およびＴ細胞反応性の実質的な保持により識別され、したがって、治療的および予防的な特定の免疫療法に好適である。対応するＤＮＡ分子は、免疫療法的ワクチン接種に好適である。
本発明はしたがって、薬剤(medicament)としての、本発明の記載のアレルゲン変異体、ＤＮＡ分子および組み換え発現ベクターに関する。
【００４８】
本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子および組み換え発現ベクター、または本発明の薬剤は、特に、疾患および病気の予防および／または処置のために用いることができる。本発明の薬剤は、１型アレルギーの処置および／または予防に、すなわち、Poaceae種のグループ６アレルゲンがその誘発に関与する草花粉アレルギーを有する患者の特定の免疫療法（低感作）に、または草花粉アレルギーの予防的免疫療法に、特に好適である。本発明のＤＮＡ分子および組み換え発現ベクターは、対応する免疫療法的および免疫予防的ＤＮＡワクチン接種に用いることができる。
本発明はまた、少なくとも１種の本発明の低アレルギー性変異体の、その誘発にイネ科のグループ６アレルゲンが原因的に関与する１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための、薬剤の調製のための使用に関する。
【００４９】
また本発明によるのは、少なくとも１種の本発明のＤＮＡ分子、および／または本発明の組み換え発現ベクター、ならびに全ての比率でのその混合物の、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種のための薬剤の調製のための使用である。
本発明はさらに、少なくとも１種の本発明の低アレルギー性変異体、少なくとも１種の本発明のＤＮＡ分子、および／または少なくとも１種の本発明の組み換え発現ベクター、ならびに全ての比率でのその混合物、および任意にさらに賦形剤および／または助剤を含む、１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための医薬製剤に関する。
【００５０】
特に、本発明の医薬製剤は、イネ科のグループ６アレルゲンがその誘発に原因的に関与する、１型アレルギーの予防および／または治療的処置に好適である。
本発明の意義における医薬製剤は、ヒトの医学または獣医学における治療剤として用いることができ、したがってヒトおよび動物、とくに哺乳類に、例えばサル、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスなどに投与することができ、ヒトまたは動物の身体の治療的処置において、上述の疾患と闘うことにおいて、用いることができる。これらはさらに、診断剤または試薬としても用いることができる。
【００５１】
本発明による製剤または薬剤を使用する場合、本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクターは、一般に、既知の市販の製剤と同様に用い、好ましくは、０．００１〜５００ｍｇの用量で、低アレルギー性変異体の場合は維持相において用量あたり約１〜５００μｇ、好ましくは５〜２００μｇで用いる。製剤は、１日当たり１回または複数回投与可能であり、例えば１日２回、３回、または４回である。用量は典型的には、用量増加相においては維持用量まで増加させる。種々の用量増加および維持スキームがこの目的のために可能である。皮下の免疫療法（ＳＣＩＴ）の場合、例えば、これらには以下を含むことができる：短期間療法（季節的病訴の開始前に限定数の注射、典型的には４〜７回の注射）、シーズン前療法（花粉の季節の前に治療を開始、典型的には、増加相の間は毎週注射、および花粉の季節の始まりまで維持用量にて毎月の注射）、または通年療法（典型的には、１６週間までの毎週注射による用量増加相に続いて、維持用量での毎月の注射、必要に応じて花粉の季節の間は低減した用量）。水性または固体の製剤（錠剤、ウェファー等）による舌下の免疫療法の場合、療法は、用量増加相有りまたは無しで導入することができる。治療は、年間を通して毎日用量で実施するのが好ましいが、しかし、シーズン前に実施したり、または他の適用スキームで実施することもできる（例えば、２日目毎、毎週、毎月）。
【００５２】
表現「有効量」とは、薬剤または医薬活性化合物の量であって、生物学的または医学的応答を、例えば研究者または医者により求められるかまたは目的とされる組織、系、動物またはヒトにおいて引き起こす、前記薬剤または医薬活性化合物の量を意味する。
さらに、表現「治療的有効量」とは、この量を受領しない対応する対象と比較して、次の結果を有する量である：疾患、症候群、病気、病訴、疾病の改善された処置、治癒、予防または除去、または副作用の予防、または疾患、病訴もしくは疾病の進行の低減。用語「治療有効量」はまた、正常な生理機能を増加させるのに有効な量も包含する。
【００５３】
薬剤は、任意の所望の好適な経路を介した投与に適応可能であり、例えば、経口（舌下錠または舌下を含む）、直腸内、肺、鼻腔、局所的（舌下錠、舌下または経皮を含む）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、経静脈または皮内を含む）経路である。かかる薬剤は、薬学分野で知られた全てのプロセスを用いて、例えば活性化合物を賦形剤（単数または複数）または助剤（単数または複数）と組み合わせることにより、調製可能である。
【００５４】
非経口使用に好適なのは、特に、液剤、好ましくは油性液剤または水溶液、さらに懸濁剤、乳濁剤またはインプラントである。本発明のアレルゲン変異体はまた、凍結乾燥することができ、得られた凍結乾燥物は、例えば注射製剤の調製に用いられる。示した製剤は滅菌することができ、および／またはアジュバントを、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝物質および／または複数のさらなる活性化合物などを含んでよい。さらに、デポー製剤も、本発明のアレルゲン変異体の対応する処方により、例えば水酸化アルミニウム、リン酸カルシウムまたはチロシンなどへの吸着により、得ることができる。
【００５５】
好適な賦形剤は、非経口投与に好適であり、本発明のグループ６アレルゲン変異体と反応しない、有機または無機物質である。その例としては、次のような賦形剤である：水、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリン、またはワセリン。
非経口投与は、本発明の薬剤の投与に好適であるのが好ましい。非経口投与の場合、静脈内、皮下、皮内、リンパ管内投与が特に好ましい。静脈内投与の場合、注射は、直接または輸液への添加により行うことができる。
【００５６】
非経口投与に適合された薬剤としては水性および非水性無菌注射溶液を含み、これは抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および溶解剤を含有し、それにより製剤は処置されるレシピエントの血液に対して等張性となり、また、水性もしくは非水性の無菌懸濁液を含み、これは懸濁剤および増粘剤を含有してよい。製剤は、例えば密封アンプルおよびバイアルなどの単一用量または複数用量の容器で投与することができ、フリーズドライ（freeze-dried）（凍結乾燥（lipophilised））状態で保存され、これは、例えば注射目的の場合、水などの無菌の担体溶液を使用の直前に添加することのみが必要であることを意味する。処方に従って調製される注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
必要に応じて、本発明の製剤または薬剤は、１または２以上のさらなる活性化合物および／または１または２以上の作用エンハンサー（アジュバント）を含んでよい。
【００５７】
したがって本発明はさらに、さらなる活性化合物および／または助剤を含む、医薬製剤に関する。本発明は好ましくは、さらなる活性化合物がアレルゲンまたはそれらの変異体であることを特徴とする、本発明の医薬製剤に関する。好適なさらなる活性化合物の例は他のアレルゲンであり、特に、イネ科のアレルゲン、特に好ましくは、イチゴツナギ亜科からのアレルゲン、好ましくはPoodaeおよびTriticodaeの群からの、好ましくはPhleum pratense、Holcus lanatus、Phalaris aquatica、Dactylis glomerata、Lolium perenne、Poa pratensis、Hordeum vulgare、Secale cerealeおよびTriticum aestivumによって表され、例えば、グループ１、２、３、４、５、６、７、１０、１２または１３のアレルゲンおよびそれらの変異体であり、例えば、低アレルギー性変異体、断片、多量体、ハイブリッド分子または組み換え融合タンパク質である。本発明はさらに、少なくとも１種のさらなる助剤を、特に好ましくはいわゆるアジュバントを含む、医薬製剤に関する。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ、Toll様受容体のアクチベーター、例えばリポ多糖体およびＣｐＧオリゴヌクレオチド、ビタミンＤ３、マイコバクテリア抗原および寄生虫（例えば住血吸虫またはフィラリア）からの分子、例えばシスタチンまたはＥＳ−６２である。
【００５８】
本発明はまた、次の個別パックからなる（キット）にも関する：
ａ）本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクターの有効量を含有する、本発明の医薬製剤、
ｂ）さらなる医薬活性化合物および／またはアジュバントの有効量を含有する、医薬製剤。
セットは、好適な容器、例えば箱または紙箱、個別のボトル、バッグ、またはアンプルなどを含む。セットは例えば、各々が、有効量の本発明の低アレルギー性変異体、ＤＮＡ分子または組み換え発現ベクター、および溶解形態または凍結乾燥形態のさらなる医薬活性化合物を含有する本発明の製剤を含む、個別のアンプルを含んでよい。
【００５９】
さらなる態様なしでも、当業者は上述の記載を最も広い範囲で用いることができると考えられる。したがって好ましい態様は、説明的開示としてのみ見なされるべきであって、決して限定的ではない。
以下の例はしたがって、本発明を限定することなく説明することを意図する。別の指示がない限り、パーセントのデータは重量パーセントを意味する。全ての温度は摂氏で表される。「慣用の操作」：最終産物の構成に応じ、必要に応じて水を加え、ｐＨは必要に応じて２〜１０の間に調製する。
【００６０】
以下の本発明の低アレルギー性変異体は、生物工学的方法により調製され、特徴付けられた。しかし、物質の調製および特徴付けはまた、当業者により別の方法によっても実施することができる。例えば、本発明の低アレルギー性変異体はまた、化学的に合成可能である。さらに本発明は、以下に記載の本発明の低アレルギー性変異体にも関する。
【００６１】
例１：１つのループ領域にプロリン欠失を有するPhl p 6の変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6Hisおよび rPhl p 6 d[P79] + 6Hisの調製およびその免疫学的特徴付けを、以下に記載する。組み換え非修飾アレルゲン（rPhl p 6 wt + 6His）を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００６２】
遺伝子工学による作成：
変異体をコードするＤＮＡを、長いオーバーラップＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合およびＰＣＲ標準法によるＤＮＡ増幅により、合成する。コドンを、粒子の濃度をＲＩ検出器により決定し、粒子による光散乱をＭＡＬＳ検出器により記録するように選択する（Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240:155-166）。溶出粒子の平均質量を、これらのデータから約５％の精度で計算することができる。モノマー、二量体その他多量体および凝集物を、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩで検出可能である。
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ分析において、それぞれが単一のピークで溶出するタンパク質は、天然の条件下で純粋なモノマー形態であることが明らかとなる（図８；表１）。
【００６３】
【表１】
タンパク質濃度のオンライン決定は、OptilabrEX屈折率検出器（ＲＩ）（Wyatt, Santa Barbara, USA）を用いて行った。粒子による光散乱は、MiniDAWN Treos多角度検出器（Wyatt）を用いて決定した。粒子質量は、屈折率増分を０．１８０ｍｌ／ｇとして、デバイ形式（Debeye formalism）によるASTRA 5.3.2.17ソフトウェア（Wyatt）を用いて計算した。ＳＥＣカラム：Superdex 200 GL 10/ 300（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）。溶出液：２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２および１５０ｍＭのＮａＣｌ。
【００６４】
推定アミノ酸配列は、成熟Phl p 6.0102のそれに基づく（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。これらのオリゴヌクレオチドは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。これらのＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。
【００６５】
発現および精製：
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現を、大腸菌（Top 10株；Invitrogen）において行う。rPhl p 6 wt + 6 Hisおよび変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。ＩＭＡＣ溶出物からの組み換えタンパク質を続いて濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示される（図７）。
【００６６】
分析ゲルろ過（ＳＥＣ）により、タンパク種の固有の流体力学半径に基づく分離が可能である。分子量のオンライン決定は、屈折計（ＲＩ検出器）と多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ検出器）とをクロマトグラフィーシステムに連結することにより、実現可能である（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法）。この方法において、測定時に与えられた。
不溶性タンパク質凝集物の不在は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（光度計：Ultrospec 5300pro UV/VIS; GE Healthcare）によってもチェックする。
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法においては、タンパク質溶液の吸収スペクトルを２４０〜８００ｎｍの波長範囲で記録する。タンパク質溶液中の不溶性凝集物は、＞３００ｎｍの波長範囲で吸収し、一方、高度に溶解性のタンパク質はこの範囲では吸収しない。波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的である。本発明のタンパク質はしたがって、天然条件下で溶解性かつ高度に純粋であり、モノマーである。
【００６７】
低減したＩｇＥ結合の証拠：
アレルギー患者の血清からの特定のＩｇＥの反応性を決定する簡単な試験方法は、ストリップ試験である。この方法を用いて、比較的多数のアレルギー患者の血清を同時に調査することができる。
この目的のために、同じ濃度で同じ量の試験物質を、一緒に非変性条件下で１片のニトロセルロース膜に結合させる。一連のかかる膜片を、異なるアレルギー患者の血清を用いて同時にインキュベートすることができる。洗浄ステップの後、特異的に結合したＩｇＥ抗体を、抗ヒトＩｇＥ／アルカリホスファターゼ複合体によって促進される呈色反応により、膜上で可視化する。
【００６８】
１８の個々の草花粉アレルギー患者の血清を用いたPhl p 6変異体の結果を、図９に示す。重要な対照として、最初に、ヒスチジン融合成分有りまたは無しの組み換えアレルゲンのＩｇＥ結合を調査する。両方のタンパク質は、同じＩｇＥ結合能を示す。したがって試験に用いたＮ末端ヒスチジン融合成分もまた、ＩｇＥのPhl p 6への結合を妨害しない。
変異体rPhl p 6 d[P101] + 6Hisは、試験した全ての血清に対して、非修飾アレルゲンと同様の良好なＩｇＥ結合を示す（図９）。これから、プロリン１０１の欠失は、Phl p 6のＩｇＥ結合能に重要な影響を及ぼさないことがわかる。変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6Hisおよび rPhl p 6 d[P79] + 6HisのＩｇＥ結合は、異なる草花粉アレルギー患者の血清において、異なっている。これは、ＩｇＥ抗体の親和性およびエピトープ特異性に関する、個々のアレルギー患者のＩｇＥ集団の組成における変化のためである。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、非修飾rPhl p 6 wt + 6Hisと比べて、ほとんどの血清に対して顕著に低減したＩｇＥ反応性を示す。しかし、全体での最小のＩｇＥ結合は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisの場合に観察される（図９）。
【００６９】
溶解した試験物質のＩｇＥ結合能の調査を、ＥＡＳＴ阻害試験（酵素アレルゲン吸着試験）により実施する。この方法において、アレルゲン／ＩｇＥ相互作用は溶液中で調査でき、例えば膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、除外することが可能となる。
ＥＡＳＴ阻害試験を以下のように実施する。マイクロタイタープレートをアレルゲンで、ここではrPhl p 6 wt + 6Hisで被覆する。非結合のアレルゲン分子を洗浄して除去した後、プレートをウシ血清アルブミンでブロックして、後の非特異的結合を防ぐ。個別の血清としてのアレルギー患者のＩｇＥ抗体を好適な希釈中で、アレルゲンで被覆したマイクロタイタープレートと共にインキュベートした。アレルゲンに結合したＩｇＥ抗体の量を、抗ｈＩｇＧ／アルカリホスファターゼ複合体を用いた基質の反応によって着色された最終産物を得ることにより、光度分析的に定量する。
【００７０】
ＩｇＥ抗体の結合は、溶解性アレルゲンまたは試験される物質（組み換え修飾アレルゲン）により、物質特異的に、濃度の関数として阻害される。
Phl p 6の組み換えアレルゲン変異体による、図１０に示すＩｇＥ阻害試験結果は、プロリン残基P[29, 30]、P57およびP79の欠失が、Phl p 6の低減したＩｇＥ結合能をもたらすことを示す。変異体d[P29, 30]のＩｇＥ結合能は、d[P57]または d[P79]のそれよりも顕著に低い。低い阻害作用は、ＩｇＥエピトープの欠如を示す。突然変異体d[P101]は、草花粉アレルギー患者Ｐ３２の血清に対して改変されたＩｇＥ結合を示さず、血清Ｐ８２とわずかにのみ低減した結合を示し、これは、再度、高い阻害剤濃度での野生型のそれとほぼ同様である。
【００７１】
機能的アレルゲン性の低減の証拠：
エフェクター細胞の膜結合性ＩｇＥの架橋における突然変異体の機能的作用と、その活性化を、続いてin vitroで調査する。
好塩基球活性化試験のために、草花粉アレルギー患者のヘパリン化全血を、種々の濃度の試験物質を用いてインキュベートする。アレルギー性物質は、好塩基性顆粒球の高親和性ＩｇＥ受容体に関連する、特定のＩｇＥ抗体に結合することができる。アレルゲン分子により引き起こされるＩｇＥ／受容体複合体の架橋はシグナル伝達をもたらし、これは、エフェクター細胞の脱顆粒化をもたらし、したがってin vivoでアレルギー反応を引き起こす。
【００７２】
好塩基性免疫細胞のアレルゲンに誘発された活性化は、表面タンパク質（ＣＤ２０３ｃ）の発現の定量化とＩｇＥ−受容体の架橋のシグナル伝達により、in vitroで決定することができる（Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744）。細胞上で発現される表面タンパク質の数および細胞プールの活性化細胞のパーセンテージの値は、蛍光標識したモノクローナル抗体の表面タンパク質への結合および続く蛍光活性化フローサイトメトリによる解析により、高感度で測定される。
本例の試験に用いる顆粒球は、アレルギー患者Ｐ２１の全血から単離する。このアレルギー患者は、ストリップ試験法において、そのＩｇＥ抗体がrPhl p 6 d[P29, 30] + 6Hisへの検出可能な結合を示すアレルギー患者を表す（グループ「Ａ」）。
【００７３】
非修飾の組み換えアレルゲンおよびrPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisの同一濃度において、後者は両方のドナーの場合に、膜結合性ＩｇＥ抗体への低い結合を示し、その結果、好塩基性顆粒球の大幅に低減された活性化を示す(図１１)。
したがって、結果は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6Hisの機能的に低減されたアレルゲン性を確認する。変異体rPhl p 6 d[P57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[P79] + 6Hisは、ドナーＰ２１の場合に、好塩基性細胞の明らかに低減された活性化を示す。したがって、この試験により、Phl p 6のこれら２つの領域におけるプロリン突然変異もまた、少なくとも幾人かのアレルギー患者においてＩｇＥ結合能を低減させることが確認できる。
【００７４】
変異体のＴ細胞反応性：
Ｔ細胞反応性を調査するために、草花粉アレルギー患者のオリゴクローナルＴ細胞系を、非修飾アレルゲンによる刺激を用いて従来法により確立する。増殖試験において、異なるＴ細胞系を基準のアレルゲンrPhl p 6 wtおよび修飾組み換えアレルゲン変異体で刺激する。増殖率を、［３Ｈ］チミジンの組み込みにより従来法によって決定する。
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[79] + 6Hisで、非修飾アレルゲンによる増殖と同程度に、調査するＴ細胞系に刺激を与える。重要なＴ細胞エピトープの保持を、これから結論付けることができる。
【００７５】
例２：複数のループ領域におけるプロリン欠失の組み合わせを有するPhl p 6の変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisの調製および免疫学的特徴付けを、Phl p 6野生型（IUISエントリーPhl p 6.0102）の２９、３０；５７および７９のアミノ酸位置に対応するプロリン欠失の組み合わせを持つ、Poaceaeのグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体についての例を用いて、以下に記載する。欠失プロリン残基はここで、Phl p 6と相同な２または３のループ領域に位置することができる。Phl p 6野生型アイソマーPhl p 6.0101（GenBank：Z27082.1、UniProt： P43215）の対応する低アレルギー性変異体を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００７６】
推定アミノ酸配列が、成熟Phl p 6.0102のそれに基づくようにコドンを選択する（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。オリゴヌクレオチドは好ましくは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。ＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。しかし、その他の標準発現ベクターも使用することができる。
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現は、全ての標準の真核および原核発現系で行うことができ、発現は好ましくは大腸菌にて行う（Top10株；Invitrogen）。変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。組み換えタンパク質を続いてＩＭＡＣ溶出物から濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
【００７７】
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示された(図１２)。
タンパク質を天然条件下で調査する分析ＳＥＣは、タンパク質が１つのピークで溶出することを示す。高分子量凝集物は検出されない（図１３）。ＭＡＬＳ／ＲＩによる分子量のオンライン決定で、rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisは純粋にモノマー形態であり、一方溶出されたrPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6Hisはモノマーと二量体の混合物を表すとの結果が導かれる（図１３；表２）。しかし、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により記録された両タンパク質の波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的なものである。
したがって、両方のタンパク質は天然条件下で溶解性で、純粋であり、沈殿とならず、したがってその特異的ＩｇＥ結合能の正確な分析のための重要な前提条件を満たしている。
【００７８】
【表２】
タンパク質濃度のオンライン決定は、OptilabrEX屈折率検出器（ＲＩ）（Wyatt, Santa Barbara, USA）を用いて行った。粒子による光散乱は、MiniDAWN Treos多角度検出器（Wyatt）を用いて決定した。粒子質量は、屈折率増分を０．１８０ｍｌ／ｇとして、デバイ形式によるASTRA 5.3.2.17ソフトウェア（Wyatt）を用いて計算した。ＳＥＣカラム：Superdex 200 GL 10/ 300（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）。溶出液：２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２および１５０ｍＭのＮａＣｌ。
【００７９】
低減したＩｇＥ結合の証拠：
１８の個別の草花粉アレルギー患者の血清を用いたrPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, P79] + 6Hisのストリップ試験の結果を図１４に示す。驚くべきことには、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30]への検出可能なＩｇＥ結合をいまだに有しているアレルギー患者の血清は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6Hisに対して、大幅に低減されたＩｇＥ反応性を有することが明らかである（グループ「Ａ」：血清２１、３２、８３、１３７等）。
したがって、Phl p 6のＩｇＥ結合能は、ただ１つのループ領域のプロリン残基の欠失を介するよりも、種々のループ領域からのプロリンの複数の組み合わされた欠失によって、さらに低減可能であることが明らかに示される。
変異体のＴ細胞反応性：
変異体は、調査したＴ細胞系の増殖を、非修飾アレルゲンと同程度に刺激する。重要なＴ細胞エピトープの保持がこれから結論付けられる。
【００８０】
例３：複数のループ領域におけるプロリン点突然変異の組み合わせを有するPhl p 6ｓの変異体
変異体rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisの調製および免疫学的特徴付けを、Phl p 6野生型（IUISエントリーPhl p 6.0102）の２９、３０、５７および７９のアミノ酸位置に対応するプロリン点突然変異の組み合わせを持つ、Poaceaeのグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体についての例を用いて、以下に記載する。プロリン残基は任意のアミノ酸に変換することができる。Phl p 6野生型アイソマーPhl p 6.0101（GenBank：Z27082.1、UniProt： P43215）の対応する低アレルギー性変異体を同様に調製して調査し、および本発明のイネ科の他のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体およびそれらの野生型タンパク質、特にPoa p 6もまた、同様に調製して調査することができる。
【００８１】
推定アミノ酸配列が、成熟Phl p 6.0102のそれに基づくようにコドンを選択する（図３、図４）。プロリン欠失についての突然変異を、ＰＣＲ反応でプロリンについて対応するコドンが欠如している特定のオリゴヌクレオチドを用いて導入する。オリゴヌクレオチドは好ましくは、推定タンパク質が、５’末端においてヘキサヒスチジン融合成分を有するように選択する（図５、図６）。
ＤＮＡを、発現ベクターpTrcHis2 Topo（Invitrogen, Carlsbad, USA）にトポイソメラーゼ反応によりライゲートする。ＤＮＡの正確さを配列決定により確認する。しかし、その他の標準発現ベクターも使用することができる。
【００８２】
組み換えヒスチジン融合タンパク質の発現は、全ての標準の真核および原核発現系で行うことができ、発現は好ましくは大腸菌にて行う（Top10株；Invitrogen）。変異体を、Ｎ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリックス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ；材料：HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）への特異的結合により最初に精製する。組み換えタンパク質を続いてＩＭＡＣ溶出物から濃縮し、ゲルろ過を行う（材料：Superdex 75; GE Healthcare）。
生化学的分析：
調製したタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと続くクーマシー染色により最初にチェックする。分析により、全てのタンパク質の非常に高い純度が示される（図１２)。
【００８３】
タンパク質を天然条件下で調査する分析ＳＥＣにより、タンパク質は１つのピークで溶出することを示す。高分子量凝集物は検出されない（図１３）。ＭＡＬＳ／ＲＩによる分子量のオンライン決定で、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6Hisは純粋にモノマー形態であり、一方溶出されたrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6Hisはモノマーと二量体の混合物を表すとの結果が導かれる。rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisは主として二量体形態である（図１３；表２）。
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により記録された全てのタンパク質の波長スペクトルは、高い溶解性を有するタンパク質に典型的なものである。したがって、３種類のタンパク質は天然条件下で溶解性で、純粋であり、沈殿とならず、したがってその特異的ＩｇＥ結合能の正確な分析のための重要な前提条件を満たしている。
【００８４】
低減されたＩｇＥ結合の証拠：
１８の個別の草花粉アレルギー患者の血清を用いたrPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisのストリップ試験の結果を図１２に示す。
驚くべきことには、ストリップ試験においてrPhl p 6 d[P29, 30]への検出可能なＩｇＥ結合をいまだに有しているアレルギー患者の血清は、変異体rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His、rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6HisおよびrPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6Hisに対して、大幅に低減されたＩｇＥ反応性を有することが明らかである（グループ「Ａ」：血清２１、３２、８３、１３７等）。
したがって、Phl p 6のＩｇＥ結合能は、ただ１つのループ領域のプロリン残基の点突然変異を介するよりも、種々のループ領域からのプロリンの複数の組み合わされた点突然変異によって、さらに低減可能であることが明らかに示される。
【００８５】
変異体のＴ細胞反応性：
変異体は、調査したＴ細胞系の増殖を、非修飾アレルゲンと同程度に刺激する。重要なＴ細胞エピトープの保持がこれから結論付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、オオアワガエリのグループ６およびグループ５アレルゲンの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、Phl p 6の３Ｄ構造のワーキングモデルを示す。
【図３】図３は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0102）；ｃＤＮＡ配列（GenBankエントリー：Y16955；３３０ｐｂ）；配列番号１を示す。
【図４】図４は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0102）；推定アミノ酸配列（UniProtKBエントリー：O65868；１１０ａａ）；配列番号２を示す。
【図５】図５は、Ｎ末端ヒスチジン融合成分；ＤＮＡ配列（３３ｂｐ）；配列番号５を示す。
【００８７】
【図６】図６は、Ｎ末端ヒスチジン融合成分；アミノ酸配列（１１ａａ）；配列番号６を示す。
【図７】図７は、組み換えPhl p 6野生型およびループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体の純度制御を示す。
【図８】図８は、ループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の分子量決定を示す。
【図９】図９は、ループにプロリン欠失を有する固定化されたPhl p 6変異体のＩｇＥ結合を示す。
【図１０】図１０は、ループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体のＩｇＥ阻害試験を示す。
【００８８】
【図１１】図１１は、個々のループにおける突然変異を有するプロリン突然変異体の機能的アレルゲン性についての試験を示す。
【図１２】図１２は、２または３のループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の純度を示す。
【図１３】図１３は、２または３のループにプロリン突然変異を有するPhl p 6変異体の分子量決定を示す。
【図１４】図１４は、組み換えPhl p 6野生型および１、２または３のループにプロリン欠失を有するPhl p 6変異体のＩｇＥ結合を示す。
【図１５】図１５は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0101）；ｃＤＮＡ配列（GenBankエントリー：Z27082.1；３３０ｂｐ）；配列番号３を示す。
【００８９】
【図１６】図１６は、Phl p 6 wt（IUISエントリーPhl p 6.0101）；推定アミノ酸配列（UniProtKBエントリー：P43215；１１０ａａ）；配列番号４を示す。
【図１７】図１７は、Phl p 6.0101の変異体（UniProtKBエントリーO65869；１０７ａａ）；配列番号７を示す。
【図１８】図１８は、我々独自の配列決定による、Phl p 6.0101の変異体（プロペプチド含む）。（プロペプチド成分およびＹ〜Ｈ変異体は太字イタリック体）；配列番号８を示す。
【図１９】図１９は、ro Phl p 6.0101（P43215）（プロペプチド成分は太字イタリック体）；配列番号９を示す。
【図２０】図２０は、Pro Phl p 6.0102（O65868）（プロペプチド成分は太字イタリック体）；配列番号１０を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが、単独または組み合わせで突然変異した、前記変異体。
【請求項２】
グループ６アレルゲンがPhl p 6であることを特徴とする、請求項１に記載の低アレルギー性変異体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の低アレルギー性変異体であって、これが、請求項１または２に記載の低アレルギー性変異体の断片もしくは変異体、または請求項１または２に記載の１または２以上の低アレルギー性変異体の多量体であることを特徴とするか、または、請求項１または２に記載の１または２以上の低アレルギー性変異体、またはそれらの断片、変異体もしくは多量体が、組み換え融合タンパク質の構成要素であることを特徴とする、前記変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体をコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項５】
発現制御配列に機能的に結合した請求項４に記載のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡ分子または請求項５に記載の組み換え発現ベクターにより形質転換された、非ヒト宿主生物。
【請求項７】
請求項６に記載の非ヒト宿主生物の培養および培養物からの対応するアレルゲン変異体の単離による、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体を調製する方法。
【請求項８】
薬剤としての、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体。
【請求項９】
薬剤としての、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
薬剤としての、請求項５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
少なくとも１種の請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体の、その誘発にイネ科のグループ６アレルゲンが原因的に関与する１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための薬剤の調製のための使用。
【請求項１２】
少なくとも１種の請求項４に記載のＤＮＡ分子および／または請求項５に記載の組み換え発現ベクターの、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種用の薬剤の調製のための使用。
【請求項１３】
少なくとも１種の請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体、少なくとも１種の請求項４に記載のＤＮＡ分子、および／または少なくとも１種の請求項５に記載の組み換え発現ベクター、および任意にさらなる活性化合物および／または助剤を含む、１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための医薬製剤。
【請求項１４】
さらなる活性化合物が、イネ科のアレルゲンまたはそれらの変異体であることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１】
イネ科（Poaceae）のグループ６アレルゲンの低アレルギー性変異体であって、アラインメントにおいて野生型Phl p 6のアミノ酸配列における２９、３０、５７、７９位のプロリンに対応するプロリンが、単独または組み合わせで突然変異した、前記変異体。
【請求項２】
グループ６アレルゲンがPhl p 6であることを特徴とする、請求項１に記載の低アレルギー性変異体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の低アレルギー性変異体であって、これが、請求項１または２に記載の低アレルギー性変異体の断片もしくは変異体、または請求項１または２に記載の１または２以上の低アレルギー性変異体の多量体であることを特徴とするか、または、請求項１または２に記載の１または２以上の低アレルギー性変異体、またはそれらの断片、変異体もしくは多量体が、組み換え融合タンパク質の構成要素であることを特徴とする、前記変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体をコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項５】
発現制御配列に機能的に結合した請求項４に記載のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡ分子または請求項５に記載の組み換え発現ベクターにより形質転換された、非ヒト宿主生物。
【請求項７】
請求項６に記載の非ヒト宿主生物の培養および培養物からの対応するアレルゲン変異体の単離による、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体を調製する方法。
【請求項８】
薬剤としての、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体。
【請求項９】
薬剤としての、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
薬剤としての、請求項５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
少なくとも１種の請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体の、その誘発にイネ科のグループ６アレルゲンが原因的に関与する１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための薬剤の調製のための使用。
【請求項１２】
少なくとも１種の請求項４に記載のＤＮＡ分子および／または請求項５に記載の組み換え発現ベクターの、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種用の薬剤の調製のための使用。
【請求項１３】
少なくとも１種の請求項１〜３のいずれか一項に記載の低アレルギー性変異体、少なくとも１種の請求項４に記載のＤＮＡ分子、および／または少なくとも１種の請求項５に記載の組み換え発現ベクター、および任意にさらなる活性化合物および／または助剤を含む、１型アレルギーの予防および／または治療的処置のための医薬製剤。
【請求項１４】
さらなる活性化合物が、イネ科のアレルゲンまたはそれらの変異体であることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１３−５１６９６１（Ｐ２０１３−５１６９６１Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８３４９（Ｐ２０１２−５４８３４９）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００７７４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５７８２
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００７７４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５７８２
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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