ヘモグロビンの測定方法および測定用キット
【課題】ヘモグロビンの測定方法において、検体中に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定する方法、およびそのためのキットを提供すること。
【解決手段】本発明の検体中のヘモグロビンを測定する方法は、検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および、該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；を包含し、該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【解決手段】本発明の検体中のヘモグロビンを測定する方法は、検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および、該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；を包含し、該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれるヘモグロビンの測定方法に関する。詳細には、主として工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用したヘモグロビンの免疫学的測定方法ならびに免疫学的測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などの各種検査において、検体中のヘモグロビンの測定方法として、例えば、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を試験紙にて検出する方法がある。また、ヒトヘモグロビンを特異的に認識する抗体を用いる免疫学的測定方法として、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法が挙げられる。中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。
【０００３】
以前から大腸癌の一次スクリーニング検査として、便中のヘモグロビンの検出および測定が行われている。現在、大腸癌のスクリーニング検査として、糞便中のヘモグロビンについての大規模な検査システムが構築されている。また、近年、歯周病の早期診断のためスクリーニング検査として、唾液中のヘモグロビンの検出および測定が行われている（非特許文献１、特許文献１および２）。
【０００４】
しかし、従来のヘモグロビンの測定用の試薬を用いて唾液中のヘモグロビンを測定する場合、希釈倍率に応じた濃度を測定できない検体がある。また、唾液検体にヘモグロビンを添加してヘモグロビン濃度を測定する場合に、本来期待される濃度よりもはるかに低いヘモグロビン濃度としてしか測定できない検体が、かなりの頻度で存在する。このため、従来の測定試薬を用いて唾液中に漏出しているヘモグロビンを測定すると、真の値とは異なる濃度として測定される。したがって、歯周病のスクリーニング検査として正しい結果を得ることができない。
【０００５】
また、糞便中のヘモグロビンを測定する際にも、一部の便検体において希釈倍率に応じた濃度が測定できない。
【０００６】
これらは、ヘモグロビンの測定に影響を及ぼす何らかの測定干渉物質（以下、ヘモグロビン測定干渉物質という場合がある）が、唾液および糞便に含まれるためであると考えられる。
【特許文献１】特開２００５−２０１７６８号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８１５号公報
【非特許文献１】飯沼克弘ら、医学検査，2008年，57巻，6号，926-928頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ヘモグロビンの測定方法において、検体中に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定する方法、およびそのためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、検体中のヘモグロビンの測定時にヘモグロビンとＳＨ基を含む化学物質とを共存させることによって、検体に含まれる被測定物質であるヘモグロビンをより正確に測定する。
【０００９】
本発明は、検体中のヘモグロビンを測定する方法を提供し、該方法は、
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；
を包含し、
該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【００１０】
１つの実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、上記検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む。
【００１１】
さらなる実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬および前記希釈用溶液の少なくとも一方は、上記ＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記ＳＨ基を含む化学物質は、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、および無水グルタル酸からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記被測定調製物は、上記ＳＨ基を含む化学物質を０.０１〜１０ｍＭの終濃度になるような濃度で含む。
【００１４】
１つの実施態様では、上記検体は、唾液または糞便である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含有する。
【００１６】
１つの実施態様では、上記微小粒子は、ラテックスまたは金属コロイドである。
【００１７】
１つの実施態様では、上記金属は、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１８】
本発明はまた、ヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットを提供し、
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【００１９】
本発明はさらに、希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットを提供し、
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方は、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ヘモグロビン測定干渉物質を含むと考えられる唾液や糞便などの検体において、ヘモグロビンをより正確に測定することができる。例えば、唾液中のヘモグロビンの測定には、唾液中に含まれるヘモグロビン測定干渉物質が障害となっていたが、本発明により正確な測定が可能である。また、例えば、糞便中のヘモグロビンを測定する際にも、糞便中に含まれるヘモグロビン測定干渉物質が障害となっていたが、本発明によれば正確な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（検体）
本発明において、測定に供する被測定物質であるヘモグロビンを含む検体としては、唾液、尿、糞便、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
【００２２】
（被測定調製物）
本発明において、被測定調製物とは、上記検体に、必要に応じて希釈用溶液などを添加した後、以下で説明する測定用試薬を加えて、吸光度測定などの測定に供される状態にされた調製物をいう。本発明においては、被測定調製物中には、以下で説明するＳＨ基を含む化学物質が存在する。
【００２３】
（ＳＨ基を含む化学物質）
ＳＨ基を含む化学物質としては、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、無水グルタル酸などが挙げられる。ＳＨ基を含む化学物質は、被測定調製物中に含まれていれば、どの段階で検体に添加されてもよい。ＳＨ基を含む化学物質は、例えば、以下で説明するヘモグロビン測定試薬に含有され得るか、あるいは希釈用溶液を用いる場合には、ヘモグロビン測定試薬および希釈用溶液の少なくとも一方に含有され得る。ＳＨ基を含む化学物質は、被測定調製物中の濃度（終濃度）が、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．０３〜３ｍＭになるような濃度で含有される。
【００２４】
（希釈用溶液）
ヘモグロビンを含む検体は、必要に応じて希釈用溶液で適宜希釈してもよい。本発明の方法に使用される希釈用溶液は、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。この希釈用溶液は、検体を保存あるいは希釈する目的で用いられ得る。また、希釈用溶液は、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含んでもよい。
【００２５】
緩衝剤は、検体の種類に応じて適宜選択される。例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））などのグッド緩衝液が好適に用いられる。緩衝剤のｐＨは、例えば、２〜１０である。希釈用溶液中の緩衝剤の濃度は、被測定調製物中の濃度で、好ましくは１０〜４００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭである。
【００２６】
塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩が挙げられる。これらは、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。これらの無機塩類の希釈用溶液中の濃度は、例えば、被測定調製物中の濃度で１〜２０質量／容量％である。
【００２７】
希釈用溶液に含まれ得るその他の成分としては、例えば、トリトンＸ−１００などの界面活性剤、動物血清、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、有機酸類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡなどのキレート剤、各種動物由来のアルブミンなどが挙げられる。これらの成分の濃度は当業者により適宜決定される。
【００２８】
（ヘモグロビン測定試薬）
本発明において、ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質という場合がある）を含む。特異的結合物質としては、例えば、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体（抗ヘモグロビン抗体）が挙げられる。抗体は、ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００２９】
ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質は、ヘモグロビンとの結合が検出可能であるように、例えば、免疫測定試薬として通常使用され得る微小粒子に結合されていることが好ましい。
【００３０】
使用される微小粒子は、免疫測定試薬として通常使用され得る微小粒子であればよく、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、またはこれらの混合物（金−白金、金−銀、鉄−白金、パラジウム−白金などの混合物）が用いられる。中でも金コロイド粒子が、一般的に利用され易いため、好ましく用いられる。これらの金属コロイド粒子は、市販品を用いてもよいし、当業者が通常用いる方法により調製してもよい。金属コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００３１】
上記特異的結合物質（例えば、抗ヘモグロビン抗体）が結合された微小粒子は、上記微小粒子に、抗ヘモグロビン抗体を当業者が通常用いる方法により結合させるかまたは吸着させることによって得られる。例えば、調製金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの抗ヘモグロビン抗体を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離などを行うことにより、抗ヘモグロビン抗体が結合された目的の抗体結合金コロイド粒子を得ることができる。得られた抗体結合金コロイド粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは、通常４．５〜９．５、好ましくは５．５〜８．５の範囲である。抗ヘモグロビン抗体が結合された微小粒子（抗体結合微粒子）の濃度は、例えば、被測定調製物中の濃度で０．０２５〜０．５質量／容量％であり得る。
【００３２】
本発明の方法に使用されるヘモグロビン測定試薬は、以下で説明する測定手順に応じて、第１試薬と第２試薬とから構成されてもよい。
【００３３】
例えば、第１試薬は、上記希釈用溶液と同様に、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。また、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含み得る。
【００３４】
また、第２試薬は、上記のヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含み、必要に応じてその他の成分を含み得る。この第２試薬は、例えば、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を第１試薬に用いる緩衝剤に添加することによって得られる。
【００３５】
この第２試薬に含まれ得る微小粒子以外の成分としては、例えば、緩衝剤、塩、凝集促進剤などが挙げられる。上記希釈用溶液と同様に、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。また、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含み得る。これらの成分の濃度は当業者により適宜決定される。
【００３６】
（ヘモグロビンの測定方法）
本発明のヘモグロビンの測定方法は、検体中のヘモグロビンを測定する方法、好ましくは免疫学的に測定する方法であり、検体にヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程を包含する。必要に応じて、ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む。
【００３７】
本発明の方法においては、ヘモグロビン測定試薬に、必要に応じてヘモグロビン測定試薬または希釈用溶液の少なくとも一方に、ＳＨ基を含む化学物質が含有されているため、被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【００３８】
本発明のヘモグロビンの測定方法を、希釈用溶液を用い、ヘモグロビン測定試薬が第１試薬と第２試薬とから構成され、そして第２試薬がヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含む場合を例に挙げて、具体的に説明する。
【００３９】
この場合、検体中のヘモグロビンを測定する方法は、
検体に、希釈用溶液を添加する工程；
希釈された検体に、緩衝剤を含む第１試薬を添加する工程；
ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含む第２試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中における該微小粒子の凝集反応を測定する工程；
を包含し、
ここで、希釈用溶液、第１試薬、および第２試薬の少なくとも１つは、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。ＳＨ基を含む化学物質は、いずれか１つにのみ含まれていてもよく、あるいはいずれか２つまたはすべてに含まれていてもよい。
【００４０】
この方法では、ヘモグロビンが、ラテックスや金コロイドなどの微小粒子上の抗体と結合することにより、ヘモグロビンの濃度依存的に凝集反応を生じるので、その程度を機械的に、例えば、吸光度変化として測定することができる。
【００４１】
より具体的には、本発明の方法は、例えば、以下のように行われる：ヘモグロビンを含む検体をそのまま、あるいは希釈用溶液で適切に希釈した後、緩衝剤を含む第１試薬と混合し、次いでヘモグロビンを特異的に認識する抗体結合微小粒子を添加して混合することにより、ヘモグロビン濃度依存的に凝集反応を生じさせる。微小粒子として金コロイドを用いる場合は、この凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化とヘモグロビンの量との関係を表す検量線に当てはめることにより、検体中の濃度を容易に求めることができる。なお、吸光度変化が一定値未満であれば陰性、一定値以上であれば陽性と設定して判定を行うことにより、定性および半定量をすることも可能である。
【００４２】
金コロイドを用いる場合、反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜５８０ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５５０ｎｍである。一波長測定の場合は、上記二波長測定の場合の第一波長または第二波長のいずれか一方の波長領域の波長で測定することができる。本発明の方法において吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。
【００４３】
上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置、便潜血専用機などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置や便潜血専用機での測定に適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。
【００４４】
本発明によれば、ヘモグロビンの測定用キットが提供される。このキットは、ヘモグロビン測定試薬を含み、このヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質（例えば、抗ヘモグロビン抗体）およびＳＨ基を含む化学物質を含有する。あるいは、このキットは、さらに希釈用溶液を含んでいてもよく、この場合、希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方が、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。あるいは、ヘモグロビン測定試薬は、上記のように第１試薬と第２試薬とから構成されてもよい。
【００４５】
上記のキット中の試薬および溶液は、どのような形態で提供されてもよく、それぞれ個別に密封包装されて提供されることが好ましい。上記キットは、検量線作成用の被測定物質の標準品、使用時に各物質を溶解して適切な濃度の溶液を調製するための緩衝液、使用説明書など含んでいてもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１：ＳＨ基を含む化学物質の添加効果の検討）
試薬中にＳＨ基を含む化学物質である１−チオグリセリンを含む場合の効果を、ヘモグロビン添加回収試験によって確認した。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００４８】
（１）唾液希釈物の調製
１０人分の唾液を採取し、それぞれの唾液１ｍＬあたり４０００ｎｇおよび８０００ｎｇのヘモグロビンを添加した。測定時に、唾液および各ヘモグロビン添加唾液を、免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトＮＳ−ＰｌｕｓＣ」（アルフレッサファーマ株式会社）の専用採便容器である採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で２０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００４９】
（２）第１試薬の調製
免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトＮＳ−ＰｌｕｓＣ」（アルフレッサファーマ株式会社）の専用試薬であるネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、１−チオグリセリンを１ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００５０】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００５１】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００５２】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００５３】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率（２０）を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００５４】
また、比較のために、１−チオグリセリンを含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を表１に示す。ヘモグロビンの添加により理論上期待される測定値（表１での理論値）を１００％とした場合、実際に測定された値（表１での測定値）を回収率として計算した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１において、検体番号１の唾液検体は、ＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬を用いた場合（比較例）の測定値は４４１ｎｇ／ｍＬであった。唾液１ｍＬあたり４０００ｎｇのヘモグロビンを添加すると、理論上４４４１ｎｇ／ｍＬの測定値が期待されるが、実際の測定値は、２７６４ｎｇ／ｍＬであった。この場合、回収率は（２７６４／４４４１）×１００＝６２％となった。また、８０００ｎｇのヘモグロビン添加検体では４７８０ｎｇ／ｍＬであり、回収率は５７％であった。同様に他の検体においても回収率を求めたところ、ＳＨ基を含む化学物質無添加の場合には、最大でも７７％であった。このように、比較例の全ての検体において添加したヘモグロビン量から期待される値を大幅に下回る測定値となった。このことはＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬を用いて唾液中のヘモグロビンを測定すると、検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定することができないことを示している。
【００５７】
これに対して、ＳＨ基を含む化学物質を添加した試薬を用いて同じ検体群を測定すると（実施例）、ほぼ理論値通りの測定値が得られ、回収率も最小で９２％、最大でも１１１％となった。このように、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、検体中のヘモグロビン濃度をより正確に測定することが可能となった。これは、ＳＨ基を含む化学物質により、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されるためと考えられる。
【００５８】
（実施例２：種々のＳＨ基を含む化学物質の検討）
種々のＳＨ基を含む化学物質について、その効果の確認を行った。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００５９】
（１）唾液希釈物の調製
唾液を採取し、採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で１０倍、２０倍、および４０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００６０】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、それぞれ１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン（ＮＡＣ）、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、または無水グルタル酸を１ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００６１】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００６２】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００６３】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００６４】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００６５】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を図１に示す。
【００６６】
図１からわかるように、１０倍から４０倍まで希釈した唾液を、ＳＨ基を含む化学物質を添加していない試薬を用いて測定した場合、希釈倍率が低いほど測定値の減少がみられた。これは、唾液の希釈倍率が低い場合、唾液中に含まれる測定干渉物質の濃度が高いため、その影響をより強く受けたことを示唆する。
【００６７】
一方、図１に示すように、ＳＨ基を含む化学物質を１ｍＭの濃度になるように加えた試薬を用いて唾液中のヘモグロビンの濃度を測定すると、ＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬で測定した場合に比べ、いずれの化学物質を添加した試薬でも測定値の上昇が見られた。さらに希釈倍率による測定値の差も小さくなっていた。したがって、検体中のヘモグロビン濃度をより正確に測定できた。これは、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されるためと考えられる。
【００６８】
（実施例３：ＳＨ基を含む化学物質の濃度の検討）
ＳＨ基を含む化学物質の有効濃度を検討するために、第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度を変化させて測定値への影響を検討した。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００６９】
（１）希釈検体の調製
唾液を採取し、採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で２０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００７０】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、１−チオグリセリンを０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および４ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００７１】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００７２】
第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度が０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および４ｍＭである場合、以下の（４）に従って、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を混合した最終反応系（被測定調製物）中の１−チオグリセリン濃度は、それぞれ０．０９、０．１８、０．３６、０．７１、１．４３、および２．８６ｍＭである。
【００７３】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００７４】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００７５】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率（２０）を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００７６】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を図２に示す。
【００７７】
その結果、いずれの濃度の１−チオグリセリンの場合も、ヘモグロビン測定値はほぼ同様の値であった。一方、図２に示すように、１−チオグリセリン無添加の第１試薬（図２ではＳＨ基を含む化学物質が０ｍＭ）を用いた場合は、１−チオグリセリンを含む試薬を用いた場合に比べ、測定値が大幅に低下した。
【００７８】
このことから、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されると考えられる。このように、１−チオグリセリンは、第１試薬中では０．１２５〜４ｍＭ（被測定調製物中では０．０９〜２．８６ｍＭ）の濃度で有効であることを確認した。
【００７９】
（実施例４：糞便検体（糞便懸濁液）におけるＳＨ基を含む化学物質の効果の検討）
糞便検体について、ＳＨ基を含む化学物質の効果を検討した。以下のようにして、糞便懸濁液、第１試薬、および第２試薬を調製し、糞便検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００８０】
（１）糞便検体（糞便懸濁液）の調製
糞便を採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）で採便し、ヘモグロビン測定用の糞便懸濁液を調製した。この糞便懸濁液を採便容器Ａ中の便溶解液で段階的に希釈して、複数の糞便懸濁液希釈物を調製した。
【００８１】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を１ｍＭおよび１−チオグリセリンを２ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００８２】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００８３】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記糞便懸濁液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００８４】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、糞便懸濁液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００８５】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記糞便懸濁液希釈物について同様の操作で測定した。結果を図３に示す。
【００８６】
図３から明らかなように、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１ｍＭおよび１−チオグリセリンを２ｍＭ含む試薬を用いて、段階的に希釈した糞便懸濁液希釈物を測定すると、良好な希釈直線性が得られた。しかし、これらのＳＨ基を含む化学物質を添加していない試薬を第１試薬として用いて測定すると、希釈直線性は得られなかった。このことから、測定試薬にジチオトレイトール（ＤＴＴ）と１−チオグリセリンとを加えることにより、糞便中に含まれる測定干渉物質の影響が排除されて、糞便検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の方法によれば、ヘモグロビンの測定時にヘモグロビンとＳＨ基を含む化学物質とを共存させるため、ヘモグロビンをより正確に測定することができる。このため、例えば、歯周病のスクリーニング検査としての唾液中のヘモグロビン検査において、唾液成分に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、唾液中のヘモグロビンの濃度を正確に測定できる。また、例えば、大腸癌のスクリーニング検査としての糞便中のヘモグロビン検査においても、糞便成分に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、糞便中のヘモグロビンの濃度を正確に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】種々のＳＨ基を含む化学物質を含む試薬を用いた場合の、唾液希釈物の希釈倍率とヘモグロビン濃度の測定値との関係を示すグラフである。
【図２】第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度と唾液中のヘモグロビン測定値との関係を示すグラフである。
【図３】ＳＨ基を含む化学物質を含むまたは含まない試薬を用いた場合の、糞便懸濁液の濃度とヘモグロビン濃度の測定値との関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれるヘモグロビンの測定方法に関する。詳細には、主として工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用したヘモグロビンの免疫学的測定方法ならびに免疫学的測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などの各種検査において、検体中のヘモグロビンの測定方法として、例えば、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を試験紙にて検出する方法がある。また、ヒトヘモグロビンを特異的に認識する抗体を用いる免疫学的測定方法として、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法が挙げられる。中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。
【０００３】
以前から大腸癌の一次スクリーニング検査として、便中のヘモグロビンの検出および測定が行われている。現在、大腸癌のスクリーニング検査として、糞便中のヘモグロビンについての大規模な検査システムが構築されている。また、近年、歯周病の早期診断のためスクリーニング検査として、唾液中のヘモグロビンの検出および測定が行われている（非特許文献１、特許文献１および２）。
【０００４】
しかし、従来のヘモグロビンの測定用の試薬を用いて唾液中のヘモグロビンを測定する場合、希釈倍率に応じた濃度を測定できない検体がある。また、唾液検体にヘモグロビンを添加してヘモグロビン濃度を測定する場合に、本来期待される濃度よりもはるかに低いヘモグロビン濃度としてしか測定できない検体が、かなりの頻度で存在する。このため、従来の測定試薬を用いて唾液中に漏出しているヘモグロビンを測定すると、真の値とは異なる濃度として測定される。したがって、歯周病のスクリーニング検査として正しい結果を得ることができない。
【０００５】
また、糞便中のヘモグロビンを測定する際にも、一部の便検体において希釈倍率に応じた濃度が測定できない。
【０００６】
これらは、ヘモグロビンの測定に影響を及ぼす何らかの測定干渉物質（以下、ヘモグロビン測定干渉物質という場合がある）が、唾液および糞便に含まれるためであると考えられる。
【特許文献１】特開２００５−２０１７６８号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８１５号公報
【非特許文献１】飯沼克弘ら、医学検査，2008年，57巻，6号，926-928頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ヘモグロビンの測定方法において、検体中に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定する方法、およびそのためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、検体中のヘモグロビンの測定時にヘモグロビンとＳＨ基を含む化学物質とを共存させることによって、検体に含まれる被測定物質であるヘモグロビンをより正確に測定する。
【０００９】
本発明は、検体中のヘモグロビンを測定する方法を提供し、該方法は、
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；
を包含し、
該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【００１０】
１つの実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、上記検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む。
【００１１】
さらなる実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬および前記希釈用溶液の少なくとも一方は、上記ＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記ＳＨ基を含む化学物質は、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、および無水グルタル酸からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記被測定調製物は、上記ＳＨ基を含む化学物質を０.０１〜１０ｍＭの終濃度になるような濃度で含む。
【００１４】
１つの実施態様では、上記検体は、唾液または糞便である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含有する。
【００１６】
１つの実施態様では、上記微小粒子は、ラテックスまたは金属コロイドである。
【００１７】
１つの実施態様では、上記金属は、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１８】
本発明はまた、ヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットを提供し、
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【００１９】
本発明はさらに、希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットを提供し、
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方は、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ヘモグロビン測定干渉物質を含むと考えられる唾液や糞便などの検体において、ヘモグロビンをより正確に測定することができる。例えば、唾液中のヘモグロビンの測定には、唾液中に含まれるヘモグロビン測定干渉物質が障害となっていたが、本発明により正確な測定が可能である。また、例えば、糞便中のヘモグロビンを測定する際にも、糞便中に含まれるヘモグロビン測定干渉物質が障害となっていたが、本発明によれば正確な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（検体）
本発明において、測定に供する被測定物質であるヘモグロビンを含む検体としては、唾液、尿、糞便、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
【００２２】
（被測定調製物）
本発明において、被測定調製物とは、上記検体に、必要に応じて希釈用溶液などを添加した後、以下で説明する測定用試薬を加えて、吸光度測定などの測定に供される状態にされた調製物をいう。本発明においては、被測定調製物中には、以下で説明するＳＨ基を含む化学物質が存在する。
【００２３】
（ＳＨ基を含む化学物質）
ＳＨ基を含む化学物質としては、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、無水グルタル酸などが挙げられる。ＳＨ基を含む化学物質は、被測定調製物中に含まれていれば、どの段階で検体に添加されてもよい。ＳＨ基を含む化学物質は、例えば、以下で説明するヘモグロビン測定試薬に含有され得るか、あるいは希釈用溶液を用いる場合には、ヘモグロビン測定試薬および希釈用溶液の少なくとも一方に含有され得る。ＳＨ基を含む化学物質は、被測定調製物中の濃度（終濃度）が、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．０３〜３ｍＭになるような濃度で含有される。
【００２４】
（希釈用溶液）
ヘモグロビンを含む検体は、必要に応じて希釈用溶液で適宜希釈してもよい。本発明の方法に使用される希釈用溶液は、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。この希釈用溶液は、検体を保存あるいは希釈する目的で用いられ得る。また、希釈用溶液は、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含んでもよい。
【００２５】
緩衝剤は、検体の種類に応じて適宜選択される。例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））などのグッド緩衝液が好適に用いられる。緩衝剤のｐＨは、例えば、２〜１０である。希釈用溶液中の緩衝剤の濃度は、被測定調製物中の濃度で、好ましくは１０〜４００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭである。
【００２６】
塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩が挙げられる。これらは、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。これらの無機塩類の希釈用溶液中の濃度は、例えば、被測定調製物中の濃度で１〜２０質量／容量％である。
【００２７】
希釈用溶液に含まれ得るその他の成分としては、例えば、トリトンＸ−１００などの界面活性剤、動物血清、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、有機酸類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡなどのキレート剤、各種動物由来のアルブミンなどが挙げられる。これらの成分の濃度は当業者により適宜決定される。
【００２８】
（ヘモグロビン測定試薬）
本発明において、ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質という場合がある）を含む。特異的結合物質としては、例えば、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体（抗ヘモグロビン抗体）が挙げられる。抗体は、ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００２９】
ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質は、ヘモグロビンとの結合が検出可能であるように、例えば、免疫測定試薬として通常使用され得る微小粒子に結合されていることが好ましい。
【００３０】
使用される微小粒子は、免疫測定試薬として通常使用され得る微小粒子であればよく、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、またはこれらの混合物（金−白金、金−銀、鉄−白金、パラジウム−白金などの混合物）が用いられる。中でも金コロイド粒子が、一般的に利用され易いため、好ましく用いられる。これらの金属コロイド粒子は、市販品を用いてもよいし、当業者が通常用いる方法により調製してもよい。金属コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００３１】
上記特異的結合物質（例えば、抗ヘモグロビン抗体）が結合された微小粒子は、上記微小粒子に、抗ヘモグロビン抗体を当業者が通常用いる方法により結合させるかまたは吸着させることによって得られる。例えば、調製金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの抗ヘモグロビン抗体を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離などを行うことにより、抗ヘモグロビン抗体が結合された目的の抗体結合金コロイド粒子を得ることができる。得られた抗体結合金コロイド粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは、通常４．５〜９．５、好ましくは５．５〜８．５の範囲である。抗ヘモグロビン抗体が結合された微小粒子（抗体結合微粒子）の濃度は、例えば、被測定調製物中の濃度で０．０２５〜０．５質量／容量％であり得る。
【００３２】
本発明の方法に使用されるヘモグロビン測定試薬は、以下で説明する測定手順に応じて、第１試薬と第２試薬とから構成されてもよい。
【００３３】
例えば、第１試薬は、上記希釈用溶液と同様に、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。また、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含み得る。
【００３４】
また、第２試薬は、上記のヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含み、必要に応じてその他の成分を含み得る。この第２試薬は、例えば、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を第１試薬に用いる緩衝剤に添加することによって得られる。
【００３５】
この第２試薬に含まれ得る微小粒子以外の成分としては、例えば、緩衝剤、塩、凝集促進剤などが挙げられる。上記希釈用溶液と同様に、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。また、必要に応じて、ＳＨ基を含む化学物質を含み得る。これらの成分の濃度は当業者により適宜決定される。
【００３６】
（ヘモグロビンの測定方法）
本発明のヘモグロビンの測定方法は、検体中のヘモグロビンを測定する方法、好ましくは免疫学的に測定する方法であり、検体にヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程を包含する。必要に応じて、ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む。
【００３７】
本発明の方法においては、ヘモグロビン測定試薬に、必要に応じてヘモグロビン測定試薬または希釈用溶液の少なくとも一方に、ＳＨ基を含む化学物質が含有されているため、被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される。
【００３８】
本発明のヘモグロビンの測定方法を、希釈用溶液を用い、ヘモグロビン測定試薬が第１試薬と第２試薬とから構成され、そして第２試薬がヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含む場合を例に挙げて、具体的に説明する。
【００３９】
この場合、検体中のヘモグロビンを測定する方法は、
検体に、希釈用溶液を添加する工程；
希釈された検体に、緩衝剤を含む第１試薬を添加する工程；
ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含む第２試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中における該微小粒子の凝集反応を測定する工程；
を包含し、
ここで、希釈用溶液、第１試薬、および第２試薬の少なくとも１つは、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。ＳＨ基を含む化学物質は、いずれか１つにのみ含まれていてもよく、あるいはいずれか２つまたはすべてに含まれていてもよい。
【００４０】
この方法では、ヘモグロビンが、ラテックスや金コロイドなどの微小粒子上の抗体と結合することにより、ヘモグロビンの濃度依存的に凝集反応を生じるので、その程度を機械的に、例えば、吸光度変化として測定することができる。
【００４１】
より具体的には、本発明の方法は、例えば、以下のように行われる：ヘモグロビンを含む検体をそのまま、あるいは希釈用溶液で適切に希釈した後、緩衝剤を含む第１試薬と混合し、次いでヘモグロビンを特異的に認識する抗体結合微小粒子を添加して混合することにより、ヘモグロビン濃度依存的に凝集反応を生じさせる。微小粒子として金コロイドを用いる場合は、この凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化とヘモグロビンの量との関係を表す検量線に当てはめることにより、検体中の濃度を容易に求めることができる。なお、吸光度変化が一定値未満であれば陰性、一定値以上であれば陽性と設定して判定を行うことにより、定性および半定量をすることも可能である。
【００４２】
金コロイドを用いる場合、反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜５８０ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５５０ｎｍである。一波長測定の場合は、上記二波長測定の場合の第一波長または第二波長のいずれか一方の波長領域の波長で測定することができる。本発明の方法において吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。
【００４３】
上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置、便潜血専用機などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置や便潜血専用機での測定に適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。
【００４４】
本発明によれば、ヘモグロビンの測定用キットが提供される。このキットは、ヘモグロビン測定試薬を含み、このヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質（例えば、抗ヘモグロビン抗体）およびＳＨ基を含む化学物質を含有する。あるいは、このキットは、さらに希釈用溶液を含んでいてもよく、この場合、希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方が、ＳＨ基を含む化学物質を含有する。あるいは、ヘモグロビン測定試薬は、上記のように第１試薬と第２試薬とから構成されてもよい。
【００４５】
上記のキット中の試薬および溶液は、どのような形態で提供されてもよく、それぞれ個別に密封包装されて提供されることが好ましい。上記キットは、検量線作成用の被測定物質の標準品、使用時に各物質を溶解して適切な濃度の溶液を調製するための緩衝液、使用説明書など含んでいてもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１：ＳＨ基を含む化学物質の添加効果の検討）
試薬中にＳＨ基を含む化学物質である１−チオグリセリンを含む場合の効果を、ヘモグロビン添加回収試験によって確認した。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００４８】
（１）唾液希釈物の調製
１０人分の唾液を採取し、それぞれの唾液１ｍＬあたり４０００ｎｇおよび８０００ｎｇのヘモグロビンを添加した。測定時に、唾液および各ヘモグロビン添加唾液を、免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトＮＳ−ＰｌｕｓＣ」（アルフレッサファーマ株式会社）の専用採便容器である採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で２０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００４９】
（２）第１試薬の調製
免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトＮＳ−ＰｌｕｓＣ」（アルフレッサファーマ株式会社）の専用試薬であるネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、１−チオグリセリンを１ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００５０】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００５１】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００５２】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００５３】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率（２０）を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００５４】
また、比較のために、１−チオグリセリンを含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を表１に示す。ヘモグロビンの添加により理論上期待される測定値（表１での理論値）を１００％とした場合、実際に測定された値（表１での測定値）を回収率として計算した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１において、検体番号１の唾液検体は、ＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬を用いた場合（比較例）の測定値は４４１ｎｇ／ｍＬであった。唾液１ｍＬあたり４０００ｎｇのヘモグロビンを添加すると、理論上４４４１ｎｇ／ｍＬの測定値が期待されるが、実際の測定値は、２７６４ｎｇ／ｍＬであった。この場合、回収率は（２７６４／４４４１）×１００＝６２％となった。また、８０００ｎｇのヘモグロビン添加検体では４７８０ｎｇ／ｍＬであり、回収率は５７％であった。同様に他の検体においても回収率を求めたところ、ＳＨ基を含む化学物質無添加の場合には、最大でも７７％であった。このように、比較例の全ての検体において添加したヘモグロビン量から期待される値を大幅に下回る測定値となった。このことはＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬を用いて唾液中のヘモグロビンを測定すると、検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定することができないことを示している。
【００５７】
これに対して、ＳＨ基を含む化学物質を添加した試薬を用いて同じ検体群を測定すると（実施例）、ほぼ理論値通りの測定値が得られ、回収率も最小で９２％、最大でも１１１％となった。このように、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、検体中のヘモグロビン濃度をより正確に測定することが可能となった。これは、ＳＨ基を含む化学物質により、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されるためと考えられる。
【００５８】
（実施例２：種々のＳＨ基を含む化学物質の検討）
種々のＳＨ基を含む化学物質について、その効果の確認を行った。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００５９】
（１）唾液希釈物の調製
唾液を採取し、採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で１０倍、２０倍、および４０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００６０】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、それぞれ１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン（ＮＡＣ）、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、または無水グルタル酸を１ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００６１】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００６２】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００６３】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００６４】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００６５】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を図１に示す。
【００６６】
図１からわかるように、１０倍から４０倍まで希釈した唾液を、ＳＨ基を含む化学物質を添加していない試薬を用いて測定した場合、希釈倍率が低いほど測定値の減少がみられた。これは、唾液の希釈倍率が低い場合、唾液中に含まれる測定干渉物質の濃度が高いため、その影響をより強く受けたことを示唆する。
【００６７】
一方、図１に示すように、ＳＨ基を含む化学物質を１ｍＭの濃度になるように加えた試薬を用いて唾液中のヘモグロビンの濃度を測定すると、ＳＨ基を含む化学物質無添加の試薬で測定した場合に比べ、いずれの化学物質を添加した試薬でも測定値の上昇が見られた。さらに希釈倍率による測定値の差も小さくなっていた。したがって、検体中のヘモグロビン濃度をより正確に測定できた。これは、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されるためと考えられる。
【００６８】
（実施例３：ＳＨ基を含む化学物質の濃度の検討）
ＳＨ基を含む化学物質の有効濃度を検討するために、第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度を変化させて測定値への影響を検討した。以下のようにして、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００６９】
（１）希釈検体の調製
唾液を採取し、採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）の便溶解液で２０倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
【００７０】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、１−チオグリセリンを０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および４ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００７１】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００７２】
第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度が０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および４ｍＭである場合、以下の（４）に従って、唾液希釈物、第１試薬、および第２試薬を混合した最終反応系（被測定調製物）中の１−チオグリセリン濃度は、それぞれ０．０９、０．１８、０．３６、０．７１、１．４３、および２．８６ｍＭである。
【００７３】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記唾液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００７４】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、唾液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００７５】
得られたヘモグロビンの濃度に対して測定前に唾液検体を希釈した倍率（２０）を乗じて、元の唾液検体中のヘモグロビン濃度を求めた。
【００７６】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記唾液検体について同様の操作で測定した。結果を図２に示す。
【００７７】
その結果、いずれの濃度の１−チオグリセリンの場合も、ヘモグロビン測定値はほぼ同様の値であった。一方、図２に示すように、１−チオグリセリン無添加の第１試薬（図２ではＳＨ基を含む化学物質が０ｍＭ）を用いた場合は、１−チオグリセリンを含む試薬を用いた場合に比べ、測定値が大幅に低下した。
【００７８】
このことから、測定試薬にＳＨ基を含む化学物質を加えたことにより、唾液中に含まれる測定干渉物質の影響が緩和されると考えられる。このように、１−チオグリセリンは、第１試薬中では０．１２５〜４ｍＭ（被測定調製物中では０．０９〜２．８６ｍＭ）の濃度で有効であることを確認した。
【００７９】
（実施例４：糞便検体（糞便懸濁液）におけるＳＨ基を含む化学物質の効果の検討）
糞便検体について、ＳＨ基を含む化学物質の効果を検討した。以下のようにして、糞便懸濁液、第１試薬、および第２試薬を調製し、糞便検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
【００８０】
（１）糞便検体（糞便懸濁液）の調製
糞便を採便容器Ａ（アルフレッサファーマ株式会社）で採便し、ヘモグロビン測定用の糞便懸濁液を調製した。この糞便懸濁液を採便容器Ａ中の便溶解液で段階的に希釈して、複数の糞便懸濁液希釈物を調製した。
【００８１】
（２）第１試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ１試薬に対して、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を１ｍＭおよび１−チオグリセリンを２ｍＭの濃度になるように加え、これを第１試薬とした。
【００８２】
（３）第２試薬の調製
ネスコートヘモＰｌｕｓ（アルフレッサファーマ株式会社）のＲ２試薬をそのまま第２試薬とした。
【００８３】
（４）ヘモグロビン濃度の測定
上記糞便懸濁液希釈物１２μＬと、第１試薬１３０μＬとを混合し、３７℃にて約５分間保持した。次いで、第２試薬４０μＬを加えて混合し、３７℃にて保持しながら、日立７１７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３４の２ポイント測定を行って、２ポイント間の吸光度の差を求めた。
【００８４】
予め、既知濃度ヘモグロビン溶液を、上記と同様の操作で測定し、ヘモグロビン濃度と２ポイント間の吸光度差の検量線を作成した。検体を測定することで得られた吸光度の差をこの検量線と比較することにより、糞便懸濁液希釈物中に含まれるヘモグロビンの濃度を求めた。
【００８５】
また、比較のために、ＳＨ基を含む化学物質を含まないネスコートヘモＰｌｕｓのＲ１試薬を第１試薬として用いて、上記糞便懸濁液希釈物について同様の操作で測定した。結果を図３に示す。
【００８６】
図３から明らかなように、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１ｍＭおよび１−チオグリセリンを２ｍＭ含む試薬を用いて、段階的に希釈した糞便懸濁液希釈物を測定すると、良好な希釈直線性が得られた。しかし、これらのＳＨ基を含む化学物質を添加していない試薬を第１試薬として用いて測定すると、希釈直線性は得られなかった。このことから、測定試薬にジチオトレイトール（ＤＴＴ）と１−チオグリセリンとを加えることにより、糞便中に含まれる測定干渉物質の影響が排除されて、糞便検体中のヘモグロビン濃度を正確に測定することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の方法によれば、ヘモグロビンの測定時にヘモグロビンとＳＨ基を含む化学物質とを共存させるため、ヘモグロビンをより正確に測定することができる。このため、例えば、歯周病のスクリーニング検査としての唾液中のヘモグロビン検査において、唾液成分に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、唾液中のヘモグロビンの濃度を正確に測定できる。また、例えば、大腸癌のスクリーニング検査としての糞便中のヘモグロビン検査においても、糞便成分に含まれる測定干渉物質の影響を受けずに、糞便中のヘモグロビンの濃度を正確に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】種々のＳＨ基を含む化学物質を含む試薬を用いた場合の、唾液希釈物の希釈倍率とヘモグロビン濃度の測定値との関係を示すグラフである。
【図２】第１試薬中の１−チオグリセリンの濃度と唾液中のヘモグロビン測定値との関係を示すグラフである。
【図３】ＳＨ基を含む化学物質を含むまたは含まない試薬を用いた場合の、糞便懸濁液の濃度とヘモグロビン濃度の測定値との関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のヘモグロビンを測定する方法であって、
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；
を包含し、
該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される、
方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、前記検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘモグロビン測定試薬および前記希釈用溶液の少なくとも一方が、前記ＳＨ基を含む化学物質を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＨ基を含む化学物質が、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、および無水グルタル酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記被測定調製物が、前記ＳＨ基を含む化学物質を０.０１〜１０ｍＭの終濃度になるような濃度で含む、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記検体が、唾液または糞便である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含有する、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小粒子が、ラテックスまたは金属コロイドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記金属が、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびＳＨ基を含む化学物質を含有する、
キット。
【請求項１１】
希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方が、ＳＨ基を含む化学物質を含有する、
キット。
【請求項１】
検体中のヘモグロビンを測定する方法であって、
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程；および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程；
を包含し、
該被測定調製物中に、ＳＨ基を含む化学物質が含有される、
方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、前記検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘモグロビン測定試薬および前記希釈用溶液の少なくとも一方が、前記ＳＨ基を含む化学物質を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＨ基を含む化学物質が、１−チオグリセリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、および無水グルタル酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記被測定調製物が、前記ＳＨ基を含む化学物質を０.０１〜１０ｍＭの終濃度になるような濃度で含む、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記検体が、唾液または糞便である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含有する、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小粒子が、ラテックスまたは金属コロイドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記金属が、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびＳＨ基を含む化学物質を含有する、
キット。
【請求項１１】
希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方が、ＳＨ基を含む化学物質を含有する、
キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１１７２４４（Ｐ２０１０−１１７２４４Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９０６５５（Ｐ２００８−２９０６５５）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
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