ベクターによる遺伝子改変型樹状細胞を用いた抗体作製方法
【課題】 好適なベクターによって遺伝子改変された樹状細胞を動物に免疫して、抗体を産生させる新規抗体作製技術を提供する。
【解決手段】 ベクターを介して所定の遺伝子を導入した遺伝子改変型樹状細胞を、マウスなどの動物に免疫することにより、モノクローナル抗体などの抗体を産生するように工夫した抗体作製方法を提供する。前記樹状細胞は、例えば、前記ベクターを介して、造血幹細胞などの幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させた樹状細胞を利用することができる。
【解決手段】 ベクターを介して所定の遺伝子を導入した遺伝子改変型樹状細胞を、マウスなどの動物に免疫することにより、モノクローナル抗体などの抗体を産生するように工夫した抗体作製方法を提供する。前記樹状細胞は、例えば、前記ベクターを介して、造血幹細胞などの幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させた樹状細胞を利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法などの分野で活用できる抗体作製技術に関する。より詳しくは、ベクターによって遺伝子改変された樹状細胞を動物に免疫して抗体を産生させる新規抗体作製技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫系は、微生物の感染防御、異物の無害化と除去、他の個体の細胞の拒絶、変異細胞や老廃組織の除去などに関与している。この免疫系を利用する治療方法（免疫療法）が、近年、検討あるいは提案されている。例えば、非特異的免疫賦活剤を用いた治療、サイトカイン療法、養子免疫療法、モノクローナル抗体療法、ワクチン療法、遺伝子治療などを挙げることができる。
【０００３】
また、免疫療法において、近年、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を活用する医療技術が提案されている。例えば、癌治療の開発過程で考案された「ミサイル療法」と称される治療法が知られている。癌に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体を作製して、このモノクローナル抗体に癌細胞を殺す抗癌剤やリシンなどの毒素を結合させて、全身的あるいは局所的に投与すると、当該抗体がミサイルのように癌細胞を集中的に攻撃する。このようなモノクローナル抗体の作用機序を利用するミサイル療法は、癌に特異的かつ効果的な治療方法の一つとして研究開発が進んでいる。その他、モノクローナル抗体は、腫瘍細胞等の分離・分析、臨床診断に係わる技術などにも利用されている。
【０００４】
このモノクローナル抗体の作製に係わる基本技術は、１９７５年、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｏｅｈｌｅｒが、マウスのＢ細胞とＢ細胞由来の腫瘍細胞株を融合させ、抗体産生をしつつ増殖できる融合細胞株（ハイブリドーマ）を作製することに成功したことに始まる。この増殖した融合細胞株は、単一のクローンであるから、均一な蛋白質（免疫グロブリン）である抗体（即ち、モノクローナル抗体）を産生する。現在のモノクローナル抗体作製技術は、（１）細胞を免疫原として用いる方法と、（２）精製した蛋白やペプチドを免疫原とする方法と、に大別することができる。
【０００５】
次に、免疫応答において重要な役割を果たすリンパ球は、抗体を産生するＢ細胞（Ｂ ｃｅｌｌ）とこのＢ細胞を補助するＴ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ）に大別できる。前記Ｂ細胞は、細胞表面に免疫グロブリンのレセプターを持つのに対して、Ｔ細胞は、それを持たず、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）が提示する抗原を、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）により認識し、この抗原刺激により活性化される。
【０００６】
この抗原提示細胞として、マクロファージやＢ細胞などの他に、「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、略称ＤＣ）」が知られている。この樹状細胞は、樹皮状の細胞突起を有することからその名前の由来があり、リンパ組織・表皮内・粘膜内などに存在する。この樹状細胞は、未熟な段階で外来抗原をエンドサイトーシスによって取り込んで成熟樹状細胞に分化すると考えられている。成熟樹状細胞は、食作用（貪食機能）が殆どなく、付着性も乏しいが、ＭＨＣクラスＩとＩＩ分子とともに抗原を細胞表面に表出して、抗原提示細胞としての役割を果す。Ｔ細胞の抗原レセプターは、樹状細胞上の主要組織適合抗原（ＭＨＣ分子）とその抗原（分解された抗原ペプチド）との複合体に反応することで抗原を認識し、これによってＴ細胞は活性化される。
【０００７】
哺乳動物などの細胞に対して目的の遺伝子を導入するときに、種々のウイルスベクターが用いられる。しかし、前記樹状細胞に対して効率よく目的の遺伝子を導入し、かつその発現量を安定的に維持できる好適なベクターが、未だ提供されていない。このため、目的の抗原ペプチドを樹状細胞に提示させるために、該抗原ペプチドそれ自体を樹状細胞に添加する方法を採用することが考えられるが、この方法では、抗原提示に適した抗原ペプチドが、ＭＨＣの違いにより各人で異なり、最適なものを選択することが難しい。
【０００８】
ここで、樹状細胞を用いた免疫療法に係わる技術的思想が開示された先行技術文献として、例えば、特許文献１がある。この特許文献１には、正常細胞では精巣特異的に発現し、癌細胞株では広範にその発現が観察された新規癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子ｃＤＮＡを得て、これを、癌の免疫療法に用いるために、ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子のｃＤＮＡ発現ベクターを大腸菌に導入した組み換え細胞において発現させたＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、癌患者から得られる単球由来の未熟樹状細胞と精製したＫＵ−ＥＭ−１ペプチドとを混合した後、未熟樹状細胞を成熟させる。そして、治療剤としての成熟樹状細胞を大腿部に皮下注射し、患者血清中のＫＵ−ＥＭ−１抗体の存在を検出することにより、癌の診断を行うという技術が開示されている。即ち、この先行技術は、目的の抗ペプチドを樹状細胞に導入する方法を採用している。
【０００９】
また、特許文献２には、免疫応答誘導樹状細胞の調整方法に係わる技術が開示されている。この先行技術は、特定の抗原と該抗原に対する抗体との免疫複合体を用いて樹状細胞を処理し、樹状細胞上のイムノグロブリンＦｃレセプターを介して該免疫複合体を細胞内に取り込ませ、抗原特異的に免疫応答を誘導することができる樹状細胞を調製する。この調製された樹状細胞を免疫賦活化剤として利用し、また、免疫複合体を感作させた樹状細胞を用いてその抗体価を測定することにより、免疫不全症の診断をする。
【００１０】
特許文献３には、樹状細胞を利用して得られた抗腫瘍抗体が開示されている。より具体的には、哺乳動物の体液性免疫に傾く腫瘍細胞と樹状細胞とを細胞融合して得た融合細胞を哺乳動物に接種して、該哺乳動物の体液性免疫応答によって抗腫瘍抗体を産生する技術が開示されている。
【特許文献１】 特開２００４−１２１０５１号公報。
【特許文献２】 特開２００１−０６１４６９号公報。
【特許文献３】 特開２００３−２２６７００号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のモノクローナル抗体の作成技術は、（１）細胞を免疫原として用いる方法と、（２）精製した蛋白やペプチドを免疫原とする方法と、に大別することができる。
【００１２】
（１）の方法は、目的の抗原を高次構造（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）で認識できるモノクローナル抗体の作製が可能であるという利点を有する一方、目的外の抗原分子に対する抗体を多数誘導してしまうという欠点がある。
【００１３】
（２）の方法では、目的の抗原を高次構造で認識できるモノクローナル抗体が取得することが難しく、可溶化困難な抗体分子が誘導される場合があり、また、免疫原となる蛋白やペプチドの準備にも手間がかかるなどの欠点を抱えている。このため、モノクローナル抗体作製に係わる新規技術が、基礎医学、臨床研究及び治療技術の方面などから特に強く要望されている。
【００１４】
そこで、本発明は、免疫療法などの分野で活用できる作業容易な新規抗体作製技術、より詳しくは、好適なベクターによって遺伝子改変された樹状細胞を動物に免疫して、抗体を産生させる新規抗体作製技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、まず、ベクターを介して所定の遺伝子を導入した樹状細胞を動物に免疫することにより抗体を産生する抗体作製方法を提供する。この樹状細胞は、例えば、ベクターを介して、幹細胞、とりわけ造血幹細胞又は胚性幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させて得られた樹状細胞を利用できる。ベクターは、本発明の解釈において狭く限定されないが、好適には、例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる。
【００１６】
作製目的となる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはこのポリクローナル抗体から選択された特定のモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体は、例えば、腫瘍を縮小させるような遮断抗体（阻止抗体）を挙げることができる。
【００１７】
樹状細胞を免疫する動物は、哺乳動物、一例を挙げれば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、羊、鶏などであり、特に、モノクローナル抗体を作製する場合では、マウス、特に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、好適に利用できる。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、抗体産生に重要なＴ細胞（Ｔｈ２）が、他のマウスより有意に多く、また、このため、融合するミエローマもそのほとんどがＢＡＬＢ／ｃマウス由来である。
【００１８】
本発明に関連する主要な技術用語を、以下説明する。
【００１９】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、目的の遺伝子を運搬して、該遺伝子を細胞に導入する運び屋として機能するＤＮＡであり、一般に、プラスミドやバクテリオファージが用いられる。
【００２０】
「レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）」は、ＲＮＡ型ウイルスの一つで、細胞膜と同様の脂質二重層の外膜を持つ球型ウイルスである。このレトロウイルスは、種々の動物細胞に感染性が高く、高効率で宿主染色体に挿入されるため、ベクターとして有用である。
【００２１】
「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、略称ＤＣ）」は、皮膚、気道粘膜、消化管粘膜などの常に抗原の曝露を受ける臓器に存在する細胞で、樹皮状あるいは星型の形状を呈する細胞である。この樹状細胞は、生体内で最も強い抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）であり、樹状細胞が未熟な段階で抗原を取り込んで抗原ペプチドに消化し、ＭＨＣ分子にそれを結合させてＴ細胞に抗原提示し、このＴ細胞を介した細胞性免疫を誘導する。
【００２２】
「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、分化した機能を営む細胞のもとになる細胞であり、自己複製能と分化能を持つ細胞として定義される。「造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、赤血球、白血球、血小板、単球、マクロファージ、マスト細胞などの起源となる幹細胞であり、大部分は骨髄中に存在し、抹消血中にもある程度存在する。「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、ＥＳ細胞とも称され、発生的全能性を持つ幹細胞であり、受精卵が分化して胎児に発展するまでの胚の初期段階から得られ、多能性幹細胞とも呼ばれる。
【００２３】
「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、単クローン性抗体とも称され、単一クローンの抗体産生細胞（例えば、抗体産生細胞と骨髄腫細胞のハイブリドーマ）から産生される抗体であって、一次構造が均一である。
【００２４】
「ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、多クローン性抗体とも称され、種々の異なったクローンの抗体産生細胞が産生する抗体分子の集合体であり、構造が不均一である。単一な抗原を動物に免疫しても、抗原分子の抗原決定基に対する特異性や親和性の異なる抗体が産生される。
【００２５】
「遮断抗体（阻止抗体、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、リンパ球と抗原との特異的結合を遮断（阻止）する働きを示す抗体である。リンパ球の機能を遮断（阻止）することにより、同種移植組織片や移植腫瘍の生着を促進する。
【００２６】
「ＢＡＬＢ／ｃマウス」は、元来は、Ｂａｇｇが維持していたアルビノマウスで、１９３２年にＳｎｅｌｌに渡った後、ＢＡＬＢ／ｃと命名された。このＢＡＬＢ／ｃマウスの自然発症腫瘍は比較的低発で、免疫・モノクローナル抗体研究やスクリーニング等の分野で高頻度に使用されている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、免疫原となる蛋白やペプチドを調整し、作製する必要がないので、モノクローナル抗体などの抗体を簡易な方法で、効率よく大量に作製することができる。
【実施例１】
【００２８】
＜レトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐの作製＞。
【００２９】
レトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐ（以下、単に「ｐＤΔＮｓａｐ」という。）を作製するため、ｐＧＣｓａｐ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ，ＭＳＣＶ）の３’ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に存在するｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ（以下「ＮＣＲ」）を含むＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメント（３１４ｂｐ）を、ｐＢＳのＣｌａＩ−ＳａｃＩにクローニングした。前記ＮＣＲは、抑制性転写因子であるＹＹ１が結合する部位であり、このＹＹ１の結合によってクロマチンの構造が変化し、下流遺伝子の発現が低下する。なお、ｐＧＣｓａｐ（ＭＳＣＶ）の詳細については、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１２：３５−４４，２００１）で示されている。
【００３０】
ここで、前記ＮＣＲは、抑制性転写因子であるＹＹ１の結合配列（Ａ ｏｒ ＣＣＡＴＮＴＴＴ；Ｎは任意の塩基）を有し、そのベクター上の配列はＣＣＡＴＴＴＴである。
【００３１】
次に、抑制性転写因子ＹＹ１結合部位へ変異を入れるために、添付した図１に示すように、結合部位（ＣＣＡＴＴＴＴ）に制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＣＴＴａｔｔｔｔｇｃａａｇｇｃａｔｇｇａａａ）を作製し、ａｎｔｉｓｅｎｓｅをその上流に作製した（ａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｃｃａａａｃｃｔａｃ）。この図１に示されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をｌｉｇａｔｉｏｎすることにより、前記ＮＣＲに変異を有するＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントを作製した。
【００３２】
前記手順により得られたＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ｐＧＣＤＮｓａｐのＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントと入れ換えることにより、目的のレトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐを作製した。前記ｐＧＣＤＮｓａｐは、ＰＣＣ４ ｃｅｌｌ−ｐａｓｓａｇｅｄ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ由来のＬＴＲと、ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）にｄｌ５８７ｒｅｖ由来のＰＢＳと、また、ＮＣＲを含む７１ｂｐが欠如した３’ＬＴＲを有する（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８２：９５３−９６０，２００２）。
【００３３】
ｐＧＣＤＮｓａｐとｐＤΔＮｓａｐの違いは、ＹＹ１結合阻止のために、ＮＣＲを欠失させたか（ｐＧＣＤＮｓａｐ）、あるいは変異を入れたか（ｐＤΔＮｓａｐ）かの違いによる。これは、ＮＣＲを欠失した際、フラグメント内に転写因子であるＮＦＡＴの結合部位もあり、これにより一部の細胞で導入遺伝子の発現低下が認められたためである。ｐＤΔＮｓａｐでは、ＹＹ１結合部位にのみ変異を入れ、ＮＦＡＴ結合部位は残存している。
【００３４】
このようにして得られたレトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐの配列構造を図２に、同ｐＤΔＮｓａｐの全塩基配列を添付の「配列表」に、それぞれ示す。なお、Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅは、ウイルスの複製開始点であり、ここに、ｔＲＮＡが結合することでウイルスの複製が開始する。ＮＣＲは、抑制性転写因子（ｆａｃｔｏｒ Ａ）の結合部位で、この転写因子が結合することで、下流の遺伝子発現が低下する。
【００３５】
次に、パッケージング細胞株として、Ｍｕｌｌｉｇａｎ博士（ハーバード大学医学部）より供与された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ（ＶＳＶ−Ｇ）を産生する２９３ｇｐｇを使用した（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１１４００−１１４０６，１９９６）。
【００３６】
このＶＳＶ−Ｇは、強い細胞毒性を有するため、その発現はテトラサイクリン薬剤誘導系（ｔｅｔ−ｏｆｆ）によって制御されている。この２９３ｇｐｇを、１０％ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＭＯＲＥＧＡＴＥ）、１％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、２ｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、１ｇ／ｍｌ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて培養した。
【００３７】
ウイルス産生には、上記ｐＤΔＮｓａｐを導入した２９３ｇｐｇ細胞を、ＰＢＳで洗浄し、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）を含まない１０％ＦＳＣ／ＤＭＥＭ培地に交換することにより、ＶＳＶ−Ｇの発現を誘導した。これらウイルス上清を用いて、リコンビナントレトロウイルス標的細胞に感染させた。
【００３８】
＜抗原をコードする遺伝子を導入した樹状細胞の作製＞。
【００３９】
「造血幹細胞」を用いた実施例（図３参照）。マウス由来の骨髄単核球にビオチン結合抗分化抗原抗体混合液（抗ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｍａｃｌ、Ｔｅｒ１１９モノクローナル抗体）を反応させ、ストレプトアビジン結合磁気ビーズに結合させた後、ＭＰＣ（磁気スタンド、ベリタス）にて、分化細胞を取り除いた。
【００４０】
浮遊細胞を再び、ＦＩＴＣ結合ｃ−ＫＩＴ抗体あるいはＦＩＴＣ結合Ｓｃａ１抗体に反応させた後、ＭＡＣＳ用ＦＩＴＣ磁気ビーズ、並びに磁気ビーズカラム（第一化学薬品製）にて、造血前駆細胞（ｃ−ＫＩＴ陽性あるいはＳｃａ１陽性ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞）を分取した。
【００４１】
これら造血前駆細胞を、サイトカインであるＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、トロンボポイエチン存在下で倍養し後、上記ウイルス上清（ＤΔＮｓａｐＯＶＡ）を用いて、オバアルブミン（以下「ＯＶＡ」）遺伝子を導入した。その後、ＧＭ−ＳＣＦとＩＬ−４（各々１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、培養を続け、浮遊細胞を取り除くことによって、成熟顆粒球を取り除いた。
【００４２】
培養開始後、１０〜１２日目に、フラスコの底にある接着細胞塊を、樹状細胞（ＤＣ）として回収した。これら樹状細胞の膜表面のマーカーは、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩが強陽性であるので、成熟樹状細胞と考えられた。このように、本実施例の手法によって、多数の成熟樹状細胞を効率よく産生させ、回収することができた。以上の実験により、前記ベクターを介して幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させることによって、樹状細胞を作製できることが検証できた。
【００４３】
図３Ａは、マウスより造血前駆細胞を免疫ビーズにて回収（ＦＡＣＳにてｃ−ＫＩＴ陽性ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞が８０％）したことを示す図（図面代用写真）であり、同図Ｂは、回収した前記造血前駆細胞に、レトロウイルスベクター（ＧＣＤＮｓａｍＯＶＡ／ＥＧＦＰ）を用いて、ＯＶＡ遺伝子を導入する手順を模式的に示す図であり、同図Ｃは、それをサイトカイン（ＩＬ−４、ＧＭ−ＳＣＦ）にて樹状細胞に分化誘導できたことを証明する図面代用写真群である。得られた樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ、ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０が強陽性であり、ＥＧＦＰで見た遺伝子導入率は、８５．４％であった。
【００４４】
なお、胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」）の継代時に、上記したレトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐを、１００μｌと１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を添加して、遺伝子をＥＳ細胞に導入し、これら遺伝子導入ＥＳ細胞を、造血系サイトカイン（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ３など）、あるいはストローマ細胞株上で培養することによって、造血系幹細胞に分化誘導することができた。このように、ＥＳ細胞から分化誘導した造血系幹細胞からも、樹状細胞を誘導することもできると考えられる。
【００４５】
＜動物への免疫と抗体産生＞。
【００４６】
前記実施例で得られた成熟樹状細胞１×１０６個を、２〜６週の間隔で、皮下に３〜４回、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。その結果、マウス血清中に、ＯＶＡに対する抗体（ポリクローナル抗体）を検出することができた（図４参照）。
【００４７】
これらマウスの脾細胞を、マウスミエローマ株（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリチレングリコール法にて融合してハイブリドーマを作製したところ、４３クローン中１クローン、あるいは９６クローン中１クローンが、ＯＶＡに対する抗体を産生するハイブリドーマを、公知のＥＬＩＳＡ法によって、確認することができた。
【００４８】
ここで、図４に基づいて、「動物への免疫と抗体産生」について再度説明すると、前述のＯＶＡ発現樹状細胞（ＯＶＡ−ＤＣ）を、マウスの皮下に２〜６週にかけ、３〜４回免疫し（図４中の矢印参照）、その際、アジュバントは使用しなかった。それらマウス血清中のＯＶＡに対する抗体（抗ＯＶＡ抗体）を、公知のＥＬＩＳＡ法にて測定して確認した。図４に示す右側のグラフでは、免疫したマウスである３匹（ＢＡＬＢ／ｃ＃１−３）と対照区としてＢ６マウスを用いたもの（Ｂ６ ＯＶＡ）と免疫していないＢＡＬＢ／ｃ（ｕｎｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）を示している。これらマウスから脾細胞を回収して、ミエローマ細胞株（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合し、ハイブリドーマ（７Ｂ４）を作製した。
【００４９】
得られた抗体を、マウス、あるいはヒトＨＥＲ２発現腫瘍を移植したマウスに投与し、腫瘍を縮小させるような抗体（即ち、遮断抗体）を探索することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、例えば、（１）抗体作製時の煩雑な操作の軽減、（２）種間で蛋白質の塩基配列にあまり違いがない抗原に対する抗体の作製、（３）マウスでのマウスに対する抗体作製など自己反応性抗体の作製、（４）機能抗体（遮断抗体）の作製により受動免疫療法（抗体療法）が可能となるため、ウイルス感染症（ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、麻疹、風疹、水痘、など）、良性・悪性腫瘍、リウマチなどの自己免疫性疾患などに臨床応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】 本発明で利用できるプライマーセットを説明するための図である。
【図２】 レトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐの配列構造を示す図である。
【図３】 抗原をコードする遺伝子を導入した樹状細胞の作製に係わる手順と結果を示す図である。
【図４】 動物への免疫と抗体産生に係わる手順と結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法などの分野で活用できる抗体作製技術に関する。より詳しくは、ベクターによって遺伝子改変された樹状細胞を動物に免疫して抗体を産生させる新規抗体作製技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫系は、微生物の感染防御、異物の無害化と除去、他の個体の細胞の拒絶、変異細胞や老廃組織の除去などに関与している。この免疫系を利用する治療方法（免疫療法）が、近年、検討あるいは提案されている。例えば、非特異的免疫賦活剤を用いた治療、サイトカイン療法、養子免疫療法、モノクローナル抗体療法、ワクチン療法、遺伝子治療などを挙げることができる。
【０００３】
また、免疫療法において、近年、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を活用する医療技術が提案されている。例えば、癌治療の開発過程で考案された「ミサイル療法」と称される治療法が知られている。癌に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体を作製して、このモノクローナル抗体に癌細胞を殺す抗癌剤やリシンなどの毒素を結合させて、全身的あるいは局所的に投与すると、当該抗体がミサイルのように癌細胞を集中的に攻撃する。このようなモノクローナル抗体の作用機序を利用するミサイル療法は、癌に特異的かつ効果的な治療方法の一つとして研究開発が進んでいる。その他、モノクローナル抗体は、腫瘍細胞等の分離・分析、臨床診断に係わる技術などにも利用されている。
【０００４】
このモノクローナル抗体の作製に係わる基本技術は、１９７５年、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｏｅｈｌｅｒが、マウスのＢ細胞とＢ細胞由来の腫瘍細胞株を融合させ、抗体産生をしつつ増殖できる融合細胞株（ハイブリドーマ）を作製することに成功したことに始まる。この増殖した融合細胞株は、単一のクローンであるから、均一な蛋白質（免疫グロブリン）である抗体（即ち、モノクローナル抗体）を産生する。現在のモノクローナル抗体作製技術は、（１）細胞を免疫原として用いる方法と、（２）精製した蛋白やペプチドを免疫原とする方法と、に大別することができる。
【０００５】
次に、免疫応答において重要な役割を果たすリンパ球は、抗体を産生するＢ細胞（Ｂ ｃｅｌｌ）とこのＢ細胞を補助するＴ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ）に大別できる。前記Ｂ細胞は、細胞表面に免疫グロブリンのレセプターを持つのに対して、Ｔ細胞は、それを持たず、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）が提示する抗原を、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）により認識し、この抗原刺激により活性化される。
【０００６】
この抗原提示細胞として、マクロファージやＢ細胞などの他に、「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、略称ＤＣ）」が知られている。この樹状細胞は、樹皮状の細胞突起を有することからその名前の由来があり、リンパ組織・表皮内・粘膜内などに存在する。この樹状細胞は、未熟な段階で外来抗原をエンドサイトーシスによって取り込んで成熟樹状細胞に分化すると考えられている。成熟樹状細胞は、食作用（貪食機能）が殆どなく、付着性も乏しいが、ＭＨＣクラスＩとＩＩ分子とともに抗原を細胞表面に表出して、抗原提示細胞としての役割を果す。Ｔ細胞の抗原レセプターは、樹状細胞上の主要組織適合抗原（ＭＨＣ分子）とその抗原（分解された抗原ペプチド）との複合体に反応することで抗原を認識し、これによってＴ細胞は活性化される。
【０００７】
哺乳動物などの細胞に対して目的の遺伝子を導入するときに、種々のウイルスベクターが用いられる。しかし、前記樹状細胞に対して効率よく目的の遺伝子を導入し、かつその発現量を安定的に維持できる好適なベクターが、未だ提供されていない。このため、目的の抗原ペプチドを樹状細胞に提示させるために、該抗原ペプチドそれ自体を樹状細胞に添加する方法を採用することが考えられるが、この方法では、抗原提示に適した抗原ペプチドが、ＭＨＣの違いにより各人で異なり、最適なものを選択することが難しい。
【０００８】
ここで、樹状細胞を用いた免疫療法に係わる技術的思想が開示された先行技術文献として、例えば、特許文献１がある。この特許文献１には、正常細胞では精巣特異的に発現し、癌細胞株では広範にその発現が観察された新規癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子ｃＤＮＡを得て、これを、癌の免疫療法に用いるために、ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子のｃＤＮＡ発現ベクターを大腸菌に導入した組み換え細胞において発現させたＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、癌患者から得られる単球由来の未熟樹状細胞と精製したＫＵ−ＥＭ−１ペプチドとを混合した後、未熟樹状細胞を成熟させる。そして、治療剤としての成熟樹状細胞を大腿部に皮下注射し、患者血清中のＫＵ−ＥＭ−１抗体の存在を検出することにより、癌の診断を行うという技術が開示されている。即ち、この先行技術は、目的の抗ペプチドを樹状細胞に導入する方法を採用している。
【０００９】
また、特許文献２には、免疫応答誘導樹状細胞の調整方法に係わる技術が開示されている。この先行技術は、特定の抗原と該抗原に対する抗体との免疫複合体を用いて樹状細胞を処理し、樹状細胞上のイムノグロブリンＦｃレセプターを介して該免疫複合体を細胞内に取り込ませ、抗原特異的に免疫応答を誘導することができる樹状細胞を調製する。この調製された樹状細胞を免疫賦活化剤として利用し、また、免疫複合体を感作させた樹状細胞を用いてその抗体価を測定することにより、免疫不全症の診断をする。
【００１０】
特許文献３には、樹状細胞を利用して得られた抗腫瘍抗体が開示されている。より具体的には、哺乳動物の体液性免疫に傾く腫瘍細胞と樹状細胞とを細胞融合して得た融合細胞を哺乳動物に接種して、該哺乳動物の体液性免疫応答によって抗腫瘍抗体を産生する技術が開示されている。
【特許文献１】 特開２００４−１２１０５１号公報。
【特許文献２】 特開２００１−０６１４６９号公報。
【特許文献３】 特開２００３−２２６７００号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のモノクローナル抗体の作成技術は、（１）細胞を免疫原として用いる方法と、（２）精製した蛋白やペプチドを免疫原とする方法と、に大別することができる。
【００１２】
（１）の方法は、目的の抗原を高次構造（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）で認識できるモノクローナル抗体の作製が可能であるという利点を有する一方、目的外の抗原分子に対する抗体を多数誘導してしまうという欠点がある。
【００１３】
（２）の方法では、目的の抗原を高次構造で認識できるモノクローナル抗体が取得することが難しく、可溶化困難な抗体分子が誘導される場合があり、また、免疫原となる蛋白やペプチドの準備にも手間がかかるなどの欠点を抱えている。このため、モノクローナル抗体作製に係わる新規技術が、基礎医学、臨床研究及び治療技術の方面などから特に強く要望されている。
【００１４】
そこで、本発明は、免疫療法などの分野で活用できる作業容易な新規抗体作製技術、より詳しくは、好適なベクターによって遺伝子改変された樹状細胞を動物に免疫して、抗体を産生させる新規抗体作製技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、まず、ベクターを介して所定の遺伝子を導入した樹状細胞を動物に免疫することにより抗体を産生する抗体作製方法を提供する。この樹状細胞は、例えば、ベクターを介して、幹細胞、とりわけ造血幹細胞又は胚性幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させて得られた樹状細胞を利用できる。ベクターは、本発明の解釈において狭く限定されないが、好適には、例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる。
【００１６】
作製目的となる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはこのポリクローナル抗体から選択された特定のモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体は、例えば、腫瘍を縮小させるような遮断抗体（阻止抗体）を挙げることができる。
【００１７】
樹状細胞を免疫する動物は、哺乳動物、一例を挙げれば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、羊、鶏などであり、特に、モノクローナル抗体を作製する場合では、マウス、特に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、好適に利用できる。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、抗体産生に重要なＴ細胞（Ｔｈ２）が、他のマウスより有意に多く、また、このため、融合するミエローマもそのほとんどがＢＡＬＢ／ｃマウス由来である。
【００１８】
本発明に関連する主要な技術用語を、以下説明する。
【００１９】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、目的の遺伝子を運搬して、該遺伝子を細胞に導入する運び屋として機能するＤＮＡであり、一般に、プラスミドやバクテリオファージが用いられる。
【００２０】
「レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）」は、ＲＮＡ型ウイルスの一つで、細胞膜と同様の脂質二重層の外膜を持つ球型ウイルスである。このレトロウイルスは、種々の動物細胞に感染性が高く、高効率で宿主染色体に挿入されるため、ベクターとして有用である。
【００２１】
「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、略称ＤＣ）」は、皮膚、気道粘膜、消化管粘膜などの常に抗原の曝露を受ける臓器に存在する細胞で、樹皮状あるいは星型の形状を呈する細胞である。この樹状細胞は、生体内で最も強い抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）であり、樹状細胞が未熟な段階で抗原を取り込んで抗原ペプチドに消化し、ＭＨＣ分子にそれを結合させてＴ細胞に抗原提示し、このＴ細胞を介した細胞性免疫を誘導する。
【００２２】
「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、分化した機能を営む細胞のもとになる細胞であり、自己複製能と分化能を持つ細胞として定義される。「造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、赤血球、白血球、血小板、単球、マクロファージ、マスト細胞などの起源となる幹細胞であり、大部分は骨髄中に存在し、抹消血中にもある程度存在する。「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、ＥＳ細胞とも称され、発生的全能性を持つ幹細胞であり、受精卵が分化して胎児に発展するまでの胚の初期段階から得られ、多能性幹細胞とも呼ばれる。
【００２３】
「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、単クローン性抗体とも称され、単一クローンの抗体産生細胞（例えば、抗体産生細胞と骨髄腫細胞のハイブリドーマ）から産生される抗体であって、一次構造が均一である。
【００２４】
「ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、多クローン性抗体とも称され、種々の異なったクローンの抗体産生細胞が産生する抗体分子の集合体であり、構造が不均一である。単一な抗原を動物に免疫しても、抗原分子の抗原決定基に対する特異性や親和性の異なる抗体が産生される。
【００２５】
「遮断抗体（阻止抗体、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、リンパ球と抗原との特異的結合を遮断（阻止）する働きを示す抗体である。リンパ球の機能を遮断（阻止）することにより、同種移植組織片や移植腫瘍の生着を促進する。
【００２６】
「ＢＡＬＢ／ｃマウス」は、元来は、Ｂａｇｇが維持していたアルビノマウスで、１９３２年にＳｎｅｌｌに渡った後、ＢＡＬＢ／ｃと命名された。このＢＡＬＢ／ｃマウスの自然発症腫瘍は比較的低発で、免疫・モノクローナル抗体研究やスクリーニング等の分野で高頻度に使用されている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、免疫原となる蛋白やペプチドを調整し、作製する必要がないので、モノクローナル抗体などの抗体を簡易な方法で、効率よく大量に作製することができる。
【実施例１】
【００２８】
＜レトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐの作製＞。
【００２９】
レトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐ（以下、単に「ｐＤΔＮｓａｐ」という。）を作製するため、ｐＧＣｓａｐ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ，ＭＳＣＶ）の３’ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に存在するｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ（以下「ＮＣＲ」）を含むＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメント（３１４ｂｐ）を、ｐＢＳのＣｌａＩ−ＳａｃＩにクローニングした。前記ＮＣＲは、抑制性転写因子であるＹＹ１が結合する部位であり、このＹＹ１の結合によってクロマチンの構造が変化し、下流遺伝子の発現が低下する。なお、ｐＧＣｓａｐ（ＭＳＣＶ）の詳細については、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１２：３５−４４，２００１）で示されている。
【００３０】
ここで、前記ＮＣＲは、抑制性転写因子であるＹＹ１の結合配列（Ａ ｏｒ ＣＣＡＴＮＴＴＴ；Ｎは任意の塩基）を有し、そのベクター上の配列はＣＣＡＴＴＴＴである。
【００３１】
次に、抑制性転写因子ＹＹ１結合部位へ変異を入れるために、添付した図１に示すように、結合部位（ＣＣＡＴＴＴＴ）に制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＣＴＴａｔｔｔｔｇｃａａｇｇｃａｔｇｇａａａ）を作製し、ａｎｔｉｓｅｎｓｅをその上流に作製した（ａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｃｃａａａｃｃｔａｃ）。この図１に示されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をｌｉｇａｔｉｏｎすることにより、前記ＮＣＲに変異を有するＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントを作製した。
【００３２】
前記手順により得られたＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ｐＧＣＤＮｓａｐのＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントと入れ換えることにより、目的のレトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐを作製した。前記ｐＧＣＤＮｓａｐは、ＰＣＣ４ ｃｅｌｌ−ｐａｓｓａｇｅｄ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ由来のＬＴＲと、ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）にｄｌ５８７ｒｅｖ由来のＰＢＳと、また、ＮＣＲを含む７１ｂｐが欠如した３’ＬＴＲを有する（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８２：９５３−９６０，２００２）。
【００３３】
ｐＧＣＤＮｓａｐとｐＤΔＮｓａｐの違いは、ＹＹ１結合阻止のために、ＮＣＲを欠失させたか（ｐＧＣＤＮｓａｐ）、あるいは変異を入れたか（ｐＤΔＮｓａｐ）かの違いによる。これは、ＮＣＲを欠失した際、フラグメント内に転写因子であるＮＦＡＴの結合部位もあり、これにより一部の細胞で導入遺伝子の発現低下が認められたためである。ｐＤΔＮｓａｐでは、ＹＹ１結合部位にのみ変異を入れ、ＮＦＡＴ結合部位は残存している。
【００３４】
このようにして得られたレトロウイルスベクターｐＤΔＮｓａｐの配列構造を図２に、同ｐＤΔＮｓａｐの全塩基配列を添付の「配列表」に、それぞれ示す。なお、Ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅは、ウイルスの複製開始点であり、ここに、ｔＲＮＡが結合することでウイルスの複製が開始する。ＮＣＲは、抑制性転写因子（ｆａｃｔｏｒ Ａ）の結合部位で、この転写因子が結合することで、下流の遺伝子発現が低下する。
【００３５】
次に、パッケージング細胞株として、Ｍｕｌｌｉｇａｎ博士（ハーバード大学医学部）より供与された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ（ＶＳＶ−Ｇ）を産生する２９３ｇｐｇを使用した（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１１４００−１１４０６，１９９６）。
【００３６】
このＶＳＶ−Ｇは、強い細胞毒性を有するため、その発現はテトラサイクリン薬剤誘導系（ｔｅｔ−ｏｆｆ）によって制御されている。この２９３ｇｐｇを、１０％ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＭＯＲＥＧＡＴＥ）、１％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、２ｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、１ｇ／ｍｌ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて培養した。
【００３７】
ウイルス産生には、上記ｐＤΔＮｓａｐを導入した２９３ｇｐｇ細胞を、ＰＢＳで洗浄し、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）を含まない１０％ＦＳＣ／ＤＭＥＭ培地に交換することにより、ＶＳＶ−Ｇの発現を誘導した。これらウイルス上清を用いて、リコンビナントレトロウイルス標的細胞に感染させた。
【００３８】
＜抗原をコードする遺伝子を導入した樹状細胞の作製＞。
【００３９】
「造血幹細胞」を用いた実施例（図３参照）。マウス由来の骨髄単核球にビオチン結合抗分化抗原抗体混合液（抗ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｍａｃｌ、Ｔｅｒ１１９モノクローナル抗体）を反応させ、ストレプトアビジン結合磁気ビーズに結合させた後、ＭＰＣ（磁気スタンド、ベリタス）にて、分化細胞を取り除いた。
【００４０】
浮遊細胞を再び、ＦＩＴＣ結合ｃ−ＫＩＴ抗体あるいはＦＩＴＣ結合Ｓｃａ１抗体に反応させた後、ＭＡＣＳ用ＦＩＴＣ磁気ビーズ、並びに磁気ビーズカラム（第一化学薬品製）にて、造血前駆細胞（ｃ−ＫＩＴ陽性あるいはＳｃａ１陽性ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞）を分取した。
【００４１】
これら造血前駆細胞を、サイトカインであるＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、トロンボポイエチン存在下で倍養し後、上記ウイルス上清（ＤΔＮｓａｐＯＶＡ）を用いて、オバアルブミン（以下「ＯＶＡ」）遺伝子を導入した。その後、ＧＭ−ＳＣＦとＩＬ−４（各々１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、培養を続け、浮遊細胞を取り除くことによって、成熟顆粒球を取り除いた。
【００４２】
培養開始後、１０〜１２日目に、フラスコの底にある接着細胞塊を、樹状細胞（ＤＣ）として回収した。これら樹状細胞の膜表面のマーカーは、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩが強陽性であるので、成熟樹状細胞と考えられた。このように、本実施例の手法によって、多数の成熟樹状細胞を効率よく産生させ、回収することができた。以上の実験により、前記ベクターを介して幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させることによって、樹状細胞を作製できることが検証できた。
【００４３】
図３Ａは、マウスより造血前駆細胞を免疫ビーズにて回収（ＦＡＣＳにてｃ−ＫＩＴ陽性ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞が８０％）したことを示す図（図面代用写真）であり、同図Ｂは、回収した前記造血前駆細胞に、レトロウイルスベクター（ＧＣＤＮｓａｍＯＶＡ／ＥＧＦＰ）を用いて、ＯＶＡ遺伝子を導入する手順を模式的に示す図であり、同図Ｃは、それをサイトカイン（ＩＬ−４、ＧＭ−ＳＣＦ）にて樹状細胞に分化誘導できたことを証明する図面代用写真群である。得られた樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ、ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０が強陽性であり、ＥＧＦＰで見た遺伝子導入率は、８５．４％であった。
【００４４】
なお、胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」）の継代時に、上記したレトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐを、１００μｌと１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を添加して、遺伝子をＥＳ細胞に導入し、これら遺伝子導入ＥＳ細胞を、造血系サイトカイン（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ３など）、あるいはストローマ細胞株上で培養することによって、造血系幹細胞に分化誘導することができた。このように、ＥＳ細胞から分化誘導した造血系幹細胞からも、樹状細胞を誘導することもできると考えられる。
【００４５】
＜動物への免疫と抗体産生＞。
【００４６】
前記実施例で得られた成熟樹状細胞１×１０６個を、２〜６週の間隔で、皮下に３〜４回、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。その結果、マウス血清中に、ＯＶＡに対する抗体（ポリクローナル抗体）を検出することができた（図４参照）。
【００４７】
これらマウスの脾細胞を、マウスミエローマ株（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリチレングリコール法にて融合してハイブリドーマを作製したところ、４３クローン中１クローン、あるいは９６クローン中１クローンが、ＯＶＡに対する抗体を産生するハイブリドーマを、公知のＥＬＩＳＡ法によって、確認することができた。
【００４８】
ここで、図４に基づいて、「動物への免疫と抗体産生」について再度説明すると、前述のＯＶＡ発現樹状細胞（ＯＶＡ−ＤＣ）を、マウスの皮下に２〜６週にかけ、３〜４回免疫し（図４中の矢印参照）、その際、アジュバントは使用しなかった。それらマウス血清中のＯＶＡに対する抗体（抗ＯＶＡ抗体）を、公知のＥＬＩＳＡ法にて測定して確認した。図４に示す右側のグラフでは、免疫したマウスである３匹（ＢＡＬＢ／ｃ＃１−３）と対照区としてＢ６マウスを用いたもの（Ｂ６ ＯＶＡ）と免疫していないＢＡＬＢ／ｃ（ｕｎｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）を示している。これらマウスから脾細胞を回収して、ミエローマ細胞株（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合し、ハイブリドーマ（７Ｂ４）を作製した。
【００４９】
得られた抗体を、マウス、あるいはヒトＨＥＲ２発現腫瘍を移植したマウスに投与し、腫瘍を縮小させるような抗体（即ち、遮断抗体）を探索することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、例えば、（１）抗体作製時の煩雑な操作の軽減、（２）種間で蛋白質の塩基配列にあまり違いがない抗原に対する抗体の作製、（３）マウスでのマウスに対する抗体作製など自己反応性抗体の作製、（４）機能抗体（遮断抗体）の作製により受動免疫療法（抗体療法）が可能となるため、ウイルス感染症（ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、麻疹、風疹、水痘、など）、良性・悪性腫瘍、リウマチなどの自己免疫性疾患などに臨床応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】 本発明で利用できるプライマーセットを説明するための図である。
【図２】 レトロウイルスベクターであるｐＤΔＮｓａｐの配列構造を示す図である。
【図３】 抗原をコードする遺伝子を導入した樹状細胞の作製に係わる手順と結果を示す図である。
【図４】 動物への免疫と抗体産生に係わる手順と結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを介して所定の遺伝子を導入した樹状細胞を動物に免疫することにより抗体を産生する抗体作製方法。
【請求項２】
前記樹状細胞は、前記ベクターを介して幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させた樹状細胞であることを特徴とする請求項１記載の抗体作製方法。
【請求項３】
前記幹細胞は、造血幹細胞であることを特徴とする請求項２記載の抗体作製方法。
【請求項４】
前記ベクターは、レトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体作製方法。
【請求項５】
前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗体作製方法。
【請求項６】
前記動物は、ＢＡＬＢ／ｃマウスであることを特徴とする請求項５記載の抗体作製方法。
【請求項１】
ベクターを介して所定の遺伝子を導入した樹状細胞を動物に免疫することにより抗体を産生する抗体作製方法。
【請求項２】
前記樹状細胞は、前記ベクターを介して幹細胞に遺伝子導入して分化誘導させた樹状細胞であることを特徴とする請求項１記載の抗体作製方法。
【請求項３】
前記幹細胞は、造血幹細胞であることを特徴とする請求項２記載の抗体作製方法。
【請求項４】
前記ベクターは、レトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体作製方法。
【請求項５】
前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗体作製方法。
【請求項６】
前記動物は、ＢＡＬＢ／ｃマウスであることを特徴とする請求項５記載の抗体作製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１８７２１５（Ｐ２００６−１８７２１５Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３８２９２２（Ｐ２００４−３８２９２２）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１２月３日 日本免疫学会主催の「第３４回 日本免疫学会総会・学術集会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１２月３日 日本免疫学会主催の「第３４回 日本免疫学会総会・学術集会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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